CN112717205B - 一种利用动物源生物膜制备的口腔修复膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用动物源生物膜制备的口腔修复膜及其制备方法，将动物源生物膜原材料直接进行清洗、裁剪、去病毒、脱脂、脱蛋白、脱细胞后冻干形成胶原蛋白口腔修复膜材料。本发明利用的动物源生物膜材料优选为猪小肠，其原料来源丰富，价格低廉。本发明方法直接将生物膜材料进行一系列处理制备得到口腔修复膜材料，简化工艺操作流程，缩短产品制备周期，有利于产品大规模生产，提高产能。本发明试剂的清洗采用真空干燥结合超声震荡的方式，缩短制备时间，且生产出的膜柔软，贴合性好。另外，本发明方法采用交叠铺膜，克服小肠宽度不够的缺点，尺寸可任意调节，满足临床的各种需求，具有非常好的实用及经济价值。

Description

一种利用动物源生物膜制备的口腔修复膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种利用动物源生物膜制备的口腔修复膜及其制备方法。
背景技术
近年来，牙列缺损或缺失后的种植治疗已经成为常规的修复方法之一，种植义齿修复在临床上的应用越来越广泛，但种植牙修复成功的关键是缺失牙局部要有足够的牙槽骨存量或者是足够的牙槽骨增量，重度牙周炎等患者牙齿拔除后，随着时间的延长可出现牙龈等软组织的萎缩及牙槽嵴的吸收，而使拔牙区牙龈外形轮廓和牙槽骨丰满度受到影响，牙槽骨骨量丢失，骨宽度及高度降低，影响到后期义齿修复或种植体植入的效果，不利于患者后期缺失牙的修复。
不同细胞的特性、生长速度和迁移速率不尽相同，例如通常骨细胞生长缓慢，而牙周软组织中的成纤维细胞生长快，因此在骨修复过程中，若没有将这两类细胞有效隔离，就很容易出现成骨类细胞与成纤维细胞，在空间位置上的侵占，以及对营养物质利用上的争夺，进而出现竞争性抑制现象，导致骨细胞没有足够自由的空间和有效充足的营养来保持骨组织的正常生长。口腔修复膜是利用外科手术的方式将膜置于口腔软组织与骨缺损之间建立生物屏障，以此创造一个相对封闭的骨再生环境，选择性地阻挡迁移速度较快的成纤维细胞和上皮细胞进入骨缺损区，而同时又不妨碍伤口自然愈合的一种生物相容性材料。
口腔修复膜根据材料的可降解性可大致分为不可生物降解膜和可生物降解膜，不可生物降解膜由于其需要二次手术进行取出，增加患者痛苦和创伤机会，也容易出现口腔感染等并发症发生，已基本不适用于临床治疗。可生物降解膜不需二次手术取出，因此可有效减少患者痛苦和创伤机会，并且具有良好的生物相容性、可降解可吸收，能更长久地阻止牙龈软组织进入牙骨生长区，为牙骨缺损区域的新骨生长预留充足的再生空间，并引导成骨类细胞在骨缺损区生长成新骨，进而达到骨性愈合的目的。
现有技术中口腔修复膜材料产品的制备大多首先将生物材料使用酸、碱、盐、酶溶液等进行除杂、脱脂、盐析、离心、透析等操作进行提取胶原蛋白，然后与其他生物化学材料进行一系列生物化学交联处理制备得到口腔修复膜材料产品。例如，中国专利文献(CN104922732B)公布的一种口腔生物膜制备方法，从牛跟腱中提取I型胶原蛋白，然后配制成胶原乙酸溶胀液，加入硫酸软骨素，搅拌配制成胶原-硫酸软骨素浆液，经第一次真空冷冻干燥后利用压膜机压制成胶原复合薄膜，然后在两层胶原复合薄膜中喷涂一层胶原-硫酸软骨素浆液，放入到真空冷冻干燥机内进行第二次真空冷冻干燥，将第二次真空冷冻干燥后的胶原复合薄膜进行高温真空交联，得到胶原-硫酸软骨素复合口腔生物膜。再例如，中国专利文献(CN105688288B)公布的胶原基复合口腔修复膜材料及其制备方法，将Ⅰ型胶原溶解在缓冲液中，加入配制好的氧化羧甲基壳聚糖在37℃下进行热驱动Ⅰ型胶原自组装，然后冷冻干燥得到胶原基材料；再将该胶原基材料浸入交联剂溶液中进行交联，然后浸没于SBF溶液中，并添加微量聚丙烯酸(PAA)溶液，进行仿生矿化，经冷冻干燥、灭菌处理即得胶原基复合口腔修复膜材料。
然而，上述的口腔修复膜胶制备方法，其胶原蛋白的提取本身就操作复杂，而胶原蛋白提取后又需要与其他生物化学材料进行一系列复合交联、反复冷冻干燥才能最终得到口腔修复膜材料，整个生产制作周期长，工艺繁复，不利于产品的大规模批量生产。
发明内容
为了克服上述现有技术和产品的不足，本发明提供一种利用动物源生物膜制备的口腔修复膜及其制备方法，直接对动物源生物膜材料进行一系列处理制备得到口腔修复膜材料，无需胶原蛋白的提取，也不使用任何交联剂，不涉及物理化学交联过程，并且残留试剂的清洗步骤结合真空干燥和超声震荡清洗技术手段，能够大大减少生产操作流程，缩短生产周期，具体技术方案如下：
首先，本发明提供一种利用动物源生物膜制备的口腔修复膜，该口腔修复膜为采用动物源生物膜为原材料，直接进行清洗、裁剪、去病毒、脱脂、脱蛋白、脱细胞后冻干形成胶原蛋白膜制备而成。
优选的，前述的利用动物源生物膜制备的口腔修复膜，所述动物源生物膜原材料为猪小肠。
其次，本发明提供一种前述的利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)清洗：将冷冻的动物源生物膜原材料在常温下化冻，清洗；
(2)裁剪：将清洗后的动物源生物膜原材料裁剪成小段，并将小段从中间剪开，刮除粘膜层、肌膜层及浆膜层，使用纯化水反复冲洗，直至没有明显油脂；
(3)去病毒：配制NaOH溶液，将裁剪冲洗完的动物源生物膜原材料倒入配制好的NaOH溶液中，搅拌，浸泡，完成后捞出，并使用超声震荡清洗，至清洗液pH为中性；
(4)脱脂：配制三氯甲烷-甲醇混合溶液，将去病毒后的动物源生物膜原材料倒入混合溶液中，搅拌、超声震荡，完成后捞出，使用真空干燥箱真空脱除残留的三氯甲烷和甲醇；
(5)脱蛋白：配制十二烷基硫酸钠溶液，将脱脂后的动物源生物膜原材料倒入到十二烷基硫酸钠溶液中，搅拌、浸泡，完成后捞出，使用超声震荡清洗脱除十二烷基硫酸钠溶液残留；
(6)二次去病毒：配制NaOH溶液，将脱蛋白完成后的动物源生物膜原材料再次倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡，完成后捞出，用超声震荡清洗至清洗液pH为中性；
(7)脱细胞：配制双氧水溶液，将二次去病毒后的动物源生物膜原材料倒入双氧水溶液中，搅拌，浸泡，完成后捞出，使用超声震荡清洗去除残留的双氧水溶液；
(8)冻干：将脱细胞后的动物源生物膜原材料使用冻干机进行冻干；
(9)二次裁剪：将冻干后的生物膜按照产品所需规格裁剪成对应所需的尺寸；
(10)包装：将剪切后的生物膜装入包装袋，塑封；
(11)辐照灭菌：将包装好的产品进行辐照灭菌，即得到口腔修复膜成品。
作为优选的技术方案的，步骤(2)中，所述裁剪成小段的长度为10～20cm。
作为优选的技术方案的，步骤(3)和步骤(5)中，所述去病毒及二次去病毒配制的NaOH溶液浓度均为1～3mol/L；浸泡时间为1～4h；所述超声震荡清洗均为超声震荡30min，然后用纯化水清洗10min，且重复清洗10～20次。
作为优选的技术方案的，步骤(4)中，所述脱脂配制的三氯甲烷-甲醇混合溶液，三氯甲烷与甲醇的混合体积比为2～3:1；超声震荡时间为24～48h；真空干燥的时间为10～24h。
作为优选的技术方案的，步骤(5)中，所述脱蛋白配制的十二烷基硫酸钠溶液浓度为0.2～1％；浸泡时间为4～6h；所述超声震荡清洗为使用纯化水超声震荡清洗3～5h，且每隔30min捞出用纯化水清洗10min，脱除SDS溶液残留。
作为优选的技术方案的，步骤(7)中，所述脱细胞配制的双氧水溶液浓度为5～10％；浸泡时间为2～4h；所述超声震荡清洗为使用注射用水超声震荡清洗2h，且每30min更换一次注射用水。
前述的利用动物源生物膜材料制备口腔修复膜的方法，还包括铺膜和挤压步骤；所述铺膜为脱细胞后，将生物膜横竖交错叠加平铺于压板上，并根据不同规格平铺不同的层数，铺完后用微轮针在膜上扎出一定密度的微孔；所述挤压步骤为将生物膜平铺于压板之后，用挤压机挤压，加强膜与膜之间的贴合度。
作为优选的技术方案的，步骤(8)中，所述冻干操作为：先于-20℃下预冻16h；然后在压力为0.34Mpa、温度为-60℃条件下，冻干48h。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方法选用动物源生物膜材料，原料来源丰富，价格低廉。
(2)本发明方法直接对生物膜材料进行一系列处理制备得到口腔修复膜材料，无需胶原蛋白的提取，也不使用任何化学交联试剂，简化工艺操作流程，缩短产品制备周期，有利于产品大规模生产，提高产能。
(3)本发明方法试剂的清洗采用真空干燥结合超声震荡的方式，缩短制备流程所用时间，生产出的膜比常温挥发去除三氯甲烷柔软，贴合性好。
(4)本发明方法采用交叠铺膜，可以克服小肠本身宽度不够的缺点，使最终产品的尺寸可任意调节，满足临床的各种需求。同时，横竖交错铺膜降低交错铺膜带来的薄厚不均的影响。
(5)本发明方法铺膜的时候使用挤压机挤压铺好的膜，加强膜与膜之间的贴合度，克服每层膜之间分层的缺点。
(6)本发明方法采用微轮滚针铺膜，增加膜的吸水率同时不影响生物膜本身的机械性能。
附图说明
图1为本发明利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的胶原膜冻干后未裁剪照片；
图2为本发明实施例1中利用动物源生物膜制备的口腔修复膜照片；
图3为本发明实施例1中利用动物源生物膜制备的口腔修复膜照片；
图4为本发明实施例1中利用动物源生物膜制备的口腔修复膜照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1～3为利用动物源生物膜材料制备口腔修复膜，实施例4为效果例。
实施例1本实施例是利用动物源生物膜制备口腔修复膜，具体步骤如下：
(1)清洗：选用猪小肠常温下化冻，清洗。
(2)裁剪：使用酒精擦拭消毒过的手术剪刀将清洗后的动物源生物膜原材料裁剪成长10cm的小段，并将小段从中间剪开，刮除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜，然后再使用纯化水反复冲洗，直至没有油脂。
(3)去病毒：配制1mol/L的NaOH溶液，将上述裁剪后的膜材料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡4h，完成后捞出超声30min，然后用纯化水清洗10min，重复清洗10～20次，将清洗液pH洗至中性。
(4)脱脂：配制三氯甲烷:甲醇(V/V)＝2:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液，将上述去病毒得到的膜材料倒入三氯甲烷-甲醇混合溶液中摇床震荡48h，完成后将膜材料捞出，放入真空干燥烘箱内常温真空干燥12h，脱除残留的三氯甲烷、甲醇混合溶液。
(5)脱蛋白：配制0.2％的SDS溶液，将上述脱脂得到的膜材料倒入SDS溶液中超声震荡浸泡6h后捞出，再使用纯化水超声震荡清洗5h，其中每隔30min捞出用纯化水清洗10min，脱除SDS溶液残留。
(6)二次去病毒：配制1mol/L的NaOH溶液，将上述脱蛋白得到的膜材料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡1h，完成后捞出超声30min，然后用纯化水清洗10min，重复清洗10～20次，将清洗液pH洗至中性。
(7)脱细胞：配制5％的双氧水溶液，将上述二次去病毒得到的膜材料倒入双氧水溶液中，搅拌、浸泡4h后捞出，使用注射用水超声震荡清洗2h，每30min更换一次注射用水。
(8)铺膜：将上述脱细胞得到的生物膜原料横竖交错叠加平铺于不锈钢压板上，共铺10层，铺完后用微轮针在膜上扎出8～10个/cm2的微孔。
(9)挤压：用挤压机挤压铺完的生物膜。
(10)冻干：将挤压完成的生物膜原料使用冻干机进行冻干，条件为：-20℃下预冻16h，然后0.34Mpa、-60℃下冻干48h，如图1所示。
(11)二次裁剪：将冻干后的生物膜按照所需规格裁剪成40mm×60mm的长方形，如图2所示。
(12)包装：然后装入包装袋中，塑封。
(11)辐照灭菌：将包装好的产品用钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy，得到口腔修复膜成品。
实施例2本实施例也是利用动物源生物膜制备口腔修复膜，具体步骤如下：
(1)清洗：选用猪小肠常温下化冻，清洗，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜。
(2)裁剪：使用酒精擦拭消毒过的手术剪刀将肠粘膜下层组织膜裁剪成20cm的小段，使用纯化水反复冲洗，直至没有油脂。
(3)去病毒：配制3mol/L的NaOH溶液，将上述裁剪得到的膜材料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡1h，完成后捞出超声30min，然后用纯化水清洗10min，重复清洗10～20次，将清洗液pH洗至中性。
(4)脱脂：配制三氯甲烷:甲醇(V/V)＝3:1三氯甲烷-甲醇混合溶液，将上述去病毒得到的膜材料倒入三氯甲烷-甲醇混合溶液摇床震荡24h，完成后将膜材料捞出，放入真空干燥烘箱内常温真空干燥8h，脱除三氯甲烷、甲醇混合溶液残留。
(5)脱蛋白：配制0.8％的SDS溶液，将上述脱脂得到的膜材料倒入SDS溶液中超声震荡浸泡4h后捞出，再使用纯化水超声震荡清洗3h，其中每隔30min捞出用纯化水清洗10min，脱除SDS溶液残留。
(6)二次去病毒：配制3mol/L的NaOH溶液，将上述步骤得到的膜材料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡1h，完成后捞出超声30min，然后用纯化水清洗10min，重复清洗10～20次，将清洗液pH洗至中性。
(7)脱细胞：配制10％的双氧水溶液，将上述步骤得到的膜材料倒入双氧水溶液中，搅拌、浸泡2h后捞出，使用注射用水超声震荡清洗2h，每30min更换一次注射用水。
(8)铺膜：将上述脱细胞得到的生物膜原料横竖交错叠加平铺于不锈钢压板上，共7层，铺完后用微轮针在膜上扎出8～10个/cm2的微孔。
(9)挤压：用挤压机挤压铺完的生物膜。
(10)冻干：将挤压完成的生物膜原料使用冻干机进行冻干，条件为：-20℃下预冻16h，然后0.34Mpa、-60℃下冻干48h，如图1所示。
(11)二次裁剪：将冻干后的生物膜按照所需规格裁剪成20mm×25mm的长方形，如图3所示。
(12)包装：然后装入包装袋中，塑封。
(11)辐照灭菌：将包装好的产品用钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy，得到口腔修复膜成品。
实施例3本实施例同样是利用动物源生物膜制备口腔修复膜，具体步骤如下：
(1)清洗：选用猪小肠常温下化冻，清洗，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜。
(2)裁剪：使用酒精擦拭消毒过的手术剪刀将肠粘膜下层组织膜裁剪成12cm长的小段，使用纯化水反复冲洗，直至没有油脂。
(3)去病毒：然后配制1.5mol/L的NaOH溶液，将上述裁剪得到的膜材料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡2h，完成后捞出超声30min，然后用纯化水清洗10min，重复清洗10～20次，将清洗液pH洗至中性。
(4)脱脂：配制三氯甲烷:甲醇(V/V)＝2:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液，将上述去病毒得到的膜材料倒入三氯甲烷、甲醇混合溶液摇床震荡40h；完成后将膜材料捞出，放入真空干燥烘箱内常温真空干燥10h，脱除三氯甲烷、甲醇混合溶液残留。
(5)脱蛋白：配制1％的SDS溶液，将上述脱脂得到的膜材料倒入SDS溶液中超声震荡浸泡4h后捞出，其中每隔30min捞出用纯化水清洗10min，脱除SDS溶液残留。
(6)二次去病毒：配制1.5mol/L的NaOH溶液，将上述步骤得到的膜材料倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡1h，完成后捞出超声30min，然后用纯化水清洗10min，重复清洗10～20次，将清洗液pH洗至中性。
(7)脱细胞：配制8％的双氧水溶液，将上述二次去病毒得到的膜材料倒入双氧水溶液中，搅拌、浸泡2h后捞出，使用注射用水超声震荡清洗2h，每30min更换一次注射用水。
(8)铺膜：将上述脱细胞得到的生物膜原料横竖交错叠加平铺于不锈钢压板上，共4层，铺完后用微轮针在膜上扎出8～10个/cm2的微孔。
(9)挤压：用挤压机挤压铺完的生物膜。
(10)冻干：将挤压完成的生物膜原料使用冻干机进行冻干，条件为：-20℃下预冻16h，然后0.34Mpa、-60℃下冻干48h，如图1所示。
(11)二次裁剪：将冻干后的生物膜按照所需规格裁剪成13mm×15mm的长方形，如图4所示。
(12)包装：然后装入包装袋中，塑封。
(11)辐照灭菌：将包装好的产品用钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy，得到口腔修复膜成品。
对比例1：本实施例是采用现有方法，利用小肠粘膜下层经过脱细胞、脱脂制备的口腔修复膜，具体步骤如下：
(1)将小肠上层的浆膜层、粘膜上层机械刮除，只保留小肠粘膜下层；
(2)将小肠粘膜下层表面的的脂肪组织剔除，清洗表面异物，获得初步去脂后的小肠粘膜下层；
(3)将初步去脂后的小肠粘膜下层用5倍量的1M氢氧化钠浸泡1.0h，获得脱细胞小肠粘膜下层；
(4)用3份质量为所述脱细胞后的膜组织15倍的磷酸盐缓冲液分别对脱细胞小肠粘膜下层清洗，直至pH为6；
(5)将清洗完的膜组织浸泡在异丙醇中震荡脱脂3h,结束后用纯化水清洗；
(6)将脱脂完成的小肠粘膜下层平铺，放入干燥箱中43℃干燥2h，辐照，获得口腔修复膜，备用。
对比例2：本实施例也是采用现有方法利用新鲜牛跟腱制备的口腔修复膜，具体步骤如下：
(1)将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、筋膜及肌肉，切块，加入质量分数为10％的碳酸氢钠水溶液浸泡16h,取出后去离子水清洗、晾干得纯牛跟腱；
(2)将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的质量分数为5％的酸溶液中浸泡2-3h,取出后去离子水清洗，晾干；
(3)将晾干的牛跟腱在液氮中研磨成粉末；
(4)将粉末加入到醋酸-醋酸钠缓冲液中，同时加入牛跟腱粉末质量的0.6％的胃蛋白酶，搅拌均匀后，在36℃下搅拌，并酶解45h,然后加入牛跟腱粉末质量的50％的二巯基乙酸乙酯，在30℃下，震荡反应2.5h，最终得酶解液；
(5)将上述酶解液进行透析、盐析后得到胶原提取液；
(6)将胶原提取液溶解在质量分数为0.4％的醋酸溶液中，15℃均质150min，均质后的胶原浆液过150目筛网；
(7)过筛网后的胶原浆液在-0.5MPa的负压抽气，每隔5min晃动一次容器，直至距离页面20cm出，肉眼观察不到直径超过1mm的气泡，持续60min，得到除气泡的胶原浆液；
(8)将胶原浆液按0.7ml/cm2的量倒入至冻干容器中；
(9)倒入到冻干容器中的胶原浆液先在-40℃预冷冻，随后在0℃的条件下升华干燥，最后升温到20℃，直至干燥完成，得到胶原蛋白海绵；
(10)在5MPa的压力下将胶原海绵压薄；
(11)在交联压强为-0.1MPa、交联温度为120℃的条件下交联60h，得到口腔胶原膜，随后经过切割和包装后，经环氧乙烷灭菌后，得到最终成品，备用。
实施例4效果例
本实施例将实施例1～3中利用动物源生物膜材料制备的口腔修复膜与对比例1和2采用现有方法制备的口腔修复膜相比，具体如表1所示：
表1.各实施例制备的口腔修复膜性能对比
Figure BDA0002912363890000121
由上表可以看出，本发明方法利用动物源生物膜材料制备的口腔修复膜的贴合性吸水率、贴合性和机械强度明显优于同种工艺形成的对比例1。贴合性和对比例2相当，而但是对比例2的工艺是通过对提取的胶原蛋白进行交联、铺膜得到的，工艺复杂、使用了化学交联剂，影响产品的生物相容性和降解周期。本发明方法在保留小肠粘膜天然的三维结构和机械强度的同时通过增加吸水率使产品与皮肤可以很好地贴合，便于临床使用，同时吸水率的增加可以方便临床医生在使用时与其他药物结合使用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的制备方法，其特征在于：该口腔修复膜为采用动物源生物膜作为原材料，直接进行清洗、裁剪、去病毒、脱脂、脱蛋白、脱细胞后冻干形成的胶原蛋白膜制备而成；所述动物源生物膜原材料为猪小肠；具体制备步骤如下：
（1）清洗：将冷冻的动物源生物膜原材料在常温下化冻，清洗；
（2）裁剪：将清洗后的动物源生物膜原材料裁剪成小段，使用纯化水反复冲洗，直至没有明显油脂；
（3）去病毒：配制NaOH溶液，将裁剪冲洗完的动物源生物膜原材料倒入配制好的NaOH溶液中，搅拌，浸泡，完成后捞出，并使用超声震荡清洗，至清洗液pH为中性；
（4）脱脂：配制三氯甲烷-甲醇混合溶液，将去病毒后的动物源生物膜原材料倒入混合溶液中，搅拌、超声震荡，完成后捞出，使用真空干燥箱真空脱除残留的三氯甲烷和甲醇；所述脱脂配制的三氯甲烷-甲醇混合溶液，三氯甲烷与甲醇的混合体积比为2～3:1；超声震荡时间为24～48h；真空干燥的时间为10～24h；
（5）脱蛋白：配制十二烷基硫酸钠溶液，将脱脂后的动物源生物膜原材料倒入到十二烷基硫酸钠溶液中，搅拌、浸泡，完成后捞出，使用超声震荡清洗脱除十二烷基硫酸钠溶液残留；
（6）二次去病毒：配制NaOH溶液，将脱蛋白后的动物源生物膜原材料再次倒入NaOH溶液中，搅拌，浸泡，完成后捞出，用超声震荡清洗至清洗液pH为中性；
（7）脱细胞：配制双氧水溶液，将二次去病毒后的动物源生物膜原材料倒入双氧水溶液中，搅拌，浸泡，完成后捞出，使用超声震荡清洗去除残留的双氧水溶液；
（8）冻干：将脱细胞后的动物源生物膜原材料使用冻干机进行冻干；
（9）二次裁剪：将冻干后的生物膜按照产品所需规格裁剪成对应所需的尺寸；
（10）包装：将二次裁剪后的生物膜装入包装袋，塑封；
（11）辐照灭菌：将包装好的产品进行辐照灭菌，即得到口腔修复膜成品；
该口腔修复膜制备方法还包括铺膜和挤压步骤；所述铺膜为脱细胞后，将生物膜横竖交错叠加平铺于压板上，并根据不同规格平铺不同的层数，铺完后用微轮针在膜上扎出密度为8～10个/cm2的微孔；所述挤压步骤为将生物膜平铺于压板之后，用挤压机挤压，加强膜与膜之间的贴合度。
2.根据权利要求1所述的利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述裁剪成小段的长度为10～20cm。
3.根据权利要求1所述的利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的制备方法，其特征在于：步骤（3）和步骤（6）中，所述去病毒及二次去病毒配制的NaOH溶液浓度均为1～3mol/L；浸泡时间为1～4h；所述超声震荡清洗均为超声震荡30min，然后用纯化水清洗10min，且重复清洗10～20次。
4.根据权利要求1所述的利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述脱蛋白配制的十二烷基硫酸钠溶液浓度为0.2～1%；浸泡时间为4～6h；所述超声震荡清洗为使用纯化水超声震荡清洗3～5h，且每隔30min捞出用纯化水清洗10min，脱除SDS溶液残留。
5.根据权利要求1所述的利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的制备方法，其特征在于：步骤（7）中，所述脱细胞配制的双氧水溶液浓度为5～10%；浸泡时间为2～4h；所述超声震荡清洗为使用注射用水超声震荡清洗2h，且每30min更换一次注射用水。
6.根据权利要求1所述的利用动物源生物膜制备的口腔修复膜的制备方法，其特征在于：步骤（8）中，所述冻干操作为：先于-20℃下预冻16h；然后在压力为0.34Mpa、温度为-60℃条件下，冻干48h。
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