ES2931299T3 - Hidrogel de matriz extracelular (ECM) y fracción soluble del mismo para su utilización en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para reducir la proliferación de una célula tumoral, aumentar la apoptosis de una célula tumoral y/o disminuir la migración de una célula tumoral. Estos métodos incluyen poner en contacto la célula tumoral con una cantidad efectiva de ECM solubilizada o una fracción soluble de matriz extracelular (ECM), reduciendo así la proliferación de la célula tumoral, aumentando la apoptosis de la célula tumoral y/o disminuyendo la migración de la célula tumoral. . También se describen métodos para tratar a un sujeto con un tumor. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una fracción soluble de una MEC y un vehículo farmacéuticamente aceptable, tratando así el tumor en el sujeto. En ejemplos específicos no limitativos, (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Hidrogel de matriz extracelular (ECM) y fracción soluble del mismo para su utilización en el tratamiento del cáncer SECTOR

La presente invención se refiere al sector del cáncer, de manera específica, a la utilización de un hidrogel de matriz extracelular (ECM, extracellular matríx) solubilizado, y fracciones solubles del mismo, para el tratamiento del cáncer, tal como, pero sin limitarse a este, glioma.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los seres humanos después de la enfermedad coronaria en los Estados Unidos. En todo el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. Solo en los Estados Unidos, según lo informado por la Sociedad Estadounidense contra el Cáncer, el cáncer causa la muerte de más de medio millón de personas al año, con más de 1,2 millones de casos nuevos diagnosticados por año. La muerte por cáncer está aumentando; se predice que pronto el cáncer se convertirá en la principal causa de muerte en los Estados Unidos.

Los gliomas son tumores altamente invasivos y neurológicamente destructivos que son una de las principales causas de muerte por tumores cerebrales tanto en niños como en adultos. Los gliomas malignos rara vez experimentan metástasis fuera del sistema nervioso central, pero invaden de forma difusa el cerebro de un paciente afectado. El tratamiento de los gliomas cerebrales depende de la ubicación, el tipo de célula y el grado de malignidad. Habitualmente, el tratamiento implica una combinación de resección quirúrgica, quimioterapia sistémica y radioterapia. Sin embargo, debido a la naturaleza altamente infiltrativa de los gliomas y su quimiorresistencia intrínseca, el 80 % de los tumores recidivan. Por tanto, incluso con tratamiento, la mediana del tiempo de supervivencia de los pacientes con glioblastoma multiforme es inferior a 18 meses. Por tanto, existe la necesidad de agentes terapéuticos para tratar el cáncer, tal como el glioma.

La Patente WO 2010/056378 A2 da a conocer la utilización de un medio acondicionado con ECM para su utilización en el tratamiento del cáncer. No se da a conocer ni un hidrogel de ECM solubilizado ni una fracción soluble del mismo.

La Patente WO 2015/164728 A1 da a conocer el fraccionamiento de ECM, pero no da a conocer la utilización de un hidrogel de ECM solubilizado o una fracción soluble del mismo, para el tratamiento del cáncer.

CARACTERÍSTICAS

En el presente documento se da a conocer que una fracción soluble de un hidrogel de matriz extracelular (ECM) afecta la proliferación, apoptosis y migración de células tumorales, pero no de células no neoplásicas.

La presente invención reivindicada se refiere a un hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o a la fracción soluble del mismo y un portador aceptable farmacéuticamente, para su utilización en el tratamiento de un tumor en un sujeto. En ejemplos específicos no limitativos, el tumor es un glioma. En otros ejemplos específicos no limitativos, el hidrogel de ECM es un hidrogel de ECM de vejiga urinaria.

En otros ejemplos no limitativos, el tumor es un adenocarcinoma esofágico. En otros ejemplos específicos no limitativos, el hidrogel de ECM es un hidrogel de ECM esofágica.

En aún otras realizaciones, el tratamiento del tumor comprende reducir la proliferación de una célula tumoral, aumentar la apoptosis de una célula tumoral y/o disminuir la migración de una célula tumoral. El tratamiento puede incluir poner en contacto la célula tumoral con una cantidad eficaz de un hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado, reduciendo de este modo la proliferación de la célula tumoral, aumentando la apoptosis de la célula tumoral y/o disminuyendo la migración de la célula tumoral. En ejemplos específicos no limitativos, el tumor es un glioma. En otros ejemplos específicos no limitativos, el hidrogel de ECM es un hidrogel de ECM de vejiga urinaria o un hidrogel de submucosa de intestino delgado (SIS, small intestinal submucosa).

Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que prosigue con referencia a las figuras adjuntas.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

Figuras 1A-1B: Los bioarmazones de ECM solubilizados inhiben el crecimiento de células de glioma. (A) Se trataron células primarias de glioma humano de alto grado con armazones de ECM solubilizados con pepsina durante 48 horas. En comparación con los grupos de control sin tratamiento y con pepsina, el tratamiento de SIS y UBM (matriz de vejiga urinaria) dio como resultado una reducción destacada en la viabilidad celular. El efecto de la ECM solubilizada es específico del tejido, ya que ni la ECM de la dermis ni la testicular afectaron la viabilidad celular. (B) Se trataron células primarias de glioma humano con fracción soluble de SIS y UBM durante 24 horas. FIGURA 2: El hidrogel de ECM modula el fenotipo de las células cancerosas. El hidrogel de ECM solubilizado, de manera específica el hidrogel de matriz de vejiga urinaria (UBM, urinary bladder matrix), induce a las células cancerosas a formar “puentes celulares”, un fenotipo que es distinto del control negativo de pepsina y del medio. El fenotipo también es distinto del control positivo de TGFp, un inductor conocido de la migración de células cancerosas.

FIGURAS 3A-3D: El hidrogel de ECM solubilizado reduce la proliferación de adenocarcinoma esofágico. El ensayo de proliferación BrdU (Roche) muestra que el hidrogel de ECM solubilizado con pepsina, de manera específica el hidrogel de matriz de vejiga urinaria (UBM) y la ECM esofágica (eECM), disminuye la proliferación de células cancerosas de células epiteliales esofágicas (OE33, Sigma) en comparación con el control negativo de pepsina (C). eECM reduce otra célula cancerosa esofágica (SK-GT-4, Sigma) (D), la línea celular precursora del cáncer del esófago de Barrett (CP-A, Sigma) (B) y la línea celular normal (Het-1A, ATCC) en comparación con el control con pepsina (A). UBM no disminuye la proliferación de células SK-GT-4, CP-A o Het-1A (A, B, D) en comparación con el control con pepsina. Las células se privaron de alimento, se trataron durante 24 horas y se pulsaron con BrdU durante 24 horas. Los valores de absorbancia representan la incorporación de BrdU durante la fase S de la replicación, con valores de absorbancia más altos correspondientes a una mayor proliferación. Los experimentos se muestran para n = 3, con cuadruplicados técnicos.

FIGURAS 4A-4D: El hidrogel de ECM solubilizado aumenta la apoptosis de células de esófago de Barrett precursoras de cáncer. El efecto de la ECM solubilizada sobre la apoptosis se determinó utilizando citometría de flujo y una tinción dual de yoduro de propidio (PI, propidium iodide) y anexina V. Se muestra el factor multiplicador de cambio de las células apoptóticas tempranas y tardías con tratamiento con UBM o eECM en comparación con pepsina para Het-1A (A), C^p-A (B), ^o E33 (C) y SK-GT-4 (D). Para las células CP-A, el tratamiento con hidrogel de UBM aumentó la apoptosis tardía (p = 0,0095) en comparación con el control con pepsina, y el tratamiento con hidrogel de eECM tendió a aumentar la apoptosis tardía en comparación con el control con pepsina (p = 0,0756). El hidrogel de UBM y eECM no mostró diferencias para la apoptosis temprana o tardía en células Het-1A, OE33 o SK-GT-4 en comparación con el control con pepsina.

FIGURA 5: Diagrama esquemático que ilustra la metodología para la preparación de fracciones solubles y estructurales a partir de bioarmazones de ECM.

FIGURA 6: Los bioarmazones de ECM solubles no afectan el crecimiento de células no neoplásicas. La microglía fetal humana se trató con concentraciones crecientes de fracción soluble de UBM durante 24 horas.

FIGURA 7: Cuantificación del crecimiento celular después del tratamiento con fracción soluble de ECM. FIGURA 8: La fracción soluble de bioarmazones de ECM inhibe la migración de células de glioma. Ensayo de raspado (”scratch”). Se trataron células primarias de glioma humano de bajo grado (1119) con la fracción soluble de UBM. Después de 24 horas de tratamiento, las células mostraron una capacidad reducida para migrar en comparación con el control sin tratamiento.

FIGURA 9: La fracción soluble de bioarmazones de ECM y las MBV obtenidas de bioarmazones de ECM inhiben la viabilidad de las células de cáncer de esófago. El efecto de la fracción soluble de bioarmazones de ECM y las MBV sobre la viabilidad se evaluó mediante un ensayo de MTT. Las células OE33 y OE19 mostraron una disminución en la viabilidad con UBM SFF, MBV de colagenasa (cMBV) y MBV de elastasa (eMBV) en comparación con el control.

FIGURA 10. La fracción soluble de ECM de vejiga urinaria (UBM-SF) disminuyó de manera notable la viabilidad de las células de glioma. La UBM-SF fue más potente que la fracción soluble de la submucosa del intestino delgado (SIS-SF) o la fracción soluble de la ECM dérmica (dermis-SF).

FIGURA 11. Las ECM de diversas fuentes proporcionan distintas fracciones solubles.

FIGURAS 12A-12C. Ensayo de formación de colonias en agar blando, 16 horas (A), 56 horas (B) y 119 horas (C). La formación de colonias se inhibe de manera dependiente de la dosis in vitro.

FIGURA 13. Inmunocitoquímica para Erk1/2 y pErk1/2 en células 0319 después de 24 horas de tratamiento con 3X UBM-SF. La UBM-SF aumenta la señalización de ERK fosforilada en células de glioma 0319. La UBM-SF puede disminuir la proliferación de células de glioma a través de la vía MPAK/ERK.

FIGURAS 14A-14D. Ensayo de raspado, 0 horas (A), 24 horas (B), 48 horas (C) y 96 horas (D). La UBM-SF suprime la migración de células de glioma. La UBM-SF también es letal para las células de glioma.

FIGURA 15. Ensayo de quimiotaxis en cámara de Boyden, N = 4. En ausencia de nutrientes, las células de glioma migran hacia la UBM-SF. La migración de células de glioma se reduce drásticamente (casi no existe) una vez expuestas a UBM-SF.

FIGURAS 16A-16D. El hidrogel de ECM solubilizado inhibe la viabilidad de las células de cáncer de esófago. El efecto de la ECM solubilizada sobre la actividad metabólica de las células normales, de Barrett y EAC (adenorcarcinoma de esófago) se evaluó utilizando un ensayo de MTT. Las UBM y eECM no tuvieron ningún efecto sobre la actividad metabólica de la línea celular normal Het-1a (A) o la línea celular CP-A (B) en comparación con el control negativo con pepsina. La UBM disminuyó la actividad metabólica de las líneas celulares de cáncer epitelial esofágico OE33 (C) y SK-GT-4 (D) en comparación con el control negativo con pepsina.

FIGURA 17. Las UBM y eECM regulan por disminución las vías de señalización de las células de cáncer de esófago. Se utilizó un análisis de transcriptómica completo para identificar la firma genética de las células normales Het-1A y de las células de cáncer epitelial esofágico OE33 tratadas con UBM o eECM en comparación con el control negativo con pepsina durante 24 horas. Los genes que se expresaron de forma diferencial (definido como un factor de multiplicación de cambio mayor o menor que 2 veces con significación mediante ANOVA de una vía, p < 0,05) se analizaron utilizando un análisis de señalización de vías insesgado para identificar las principales vías de señalización. De manera destacada, las principales vías expresadas de forma diferencial reguladas por el tratamiento con UBM y eECM en comparación con el control negativo con pepsina están relacionadas con la progresión del cáncer. La eECM reguló por disminución la adhesión focal-PI3K-Akt-mTOR, el ciclo celular y la replicación del ADN, y reguló por incremento la autofagia (muerte controlada de células cancerosas), tal como se muestra mediante el análisis de transcriptómica completo y una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), con un efecto neto de regulación por disminución del fenotipo de células de cáncer esofágico.

FIGURA 18. Validación mediante qPCR del análisis transcriptómico completo. Los resultados mostrados en la figura 17 fueron validados utilizando qPCR.

FIGURAS 19A-19B. UBM y eECM regulan por disminución la fosforilación de AKT en OE33 y aumentan la fosforilación de AKT en Het-1A. Se realizó una transferencia Western sobre las células OE33 y Het-1A tratadas con pepsina, UBM y eECM durante 0, 6 o 24 horas para pAKT, un regulador positivo de la proliferación de células cancerosas, el metabolismo celular y la supervivencia celular. Las células OE33 y las células Het-1A no mostraron cambios en pAKT en el control con pepsina. Las células OE33 muestran una regulación por disminución en la expresión de pAKT con el tratamiento con UBM-ECM a las 24 horas y una regulación por disminución en la expresión de pAKT con el tratamiento con eECM a las 6 y 24 horas (figura 26A). Por el contrario, las células Het-1A mostraron una regulación por incremento en la expresión de pAKT con el tratamiento con UBM-ECM y eECM a las 6 y 24 horas (figura 26B). Se ha demostrado que PI3K-Akt-mTOR está regulada por incremento en muchos cánceres, incluida la progresión de BE (esófago de Barrett) a EAC. PI3K-Akt es una vía de señalización de EAC, pero también se ha demostrado que su activación es vital en los procesos de cicatrización de heridas en células no malignas. La regulación opuesta de AKT fosforilada en células Het-1a y OE33 en respuesta a los mismos estímulos de hidrogel de ECM sería favorable para un tratamiento que promueve la reconstrucción de tejidos en una situación de cáncer previo.

FIGURA 20. La fracción soluble de UBM induce la apoptosis mediada por caspasa-3 en células primarias de glioma. Se trataron fibroblastos primarios normales de prepucio humano o células primarias de glioma humano (0319) con 3 mg/ml de fracción soluble de UBM (UBM-SF) durante 12 horas. La microscopía de contraste de fase muestra que, a diferencia de los fibroblastos humanos normales, las células primarias de glioma humano experimentan una apoptosis rápida después del tratamiento con UBM-SF. La evaluación del cultivo celular utilizando un sustrato de caspasa-3 de Nucview a las 12 horas (h) muestra que la caspasa-3 media en el efecto apoptótico de UBM-SF.

FIGURA 21. La fracción soluble de UBM aumenta la tasa de proliferación de astrocitos primarios humanos normales. Se trataron astrocitos primarios humanos, células primarias de glioma humano (0319) o una línea celular de glioma inmortalizada (U87MG) con o sin 3 mg/ml de fracción soluble de UBM (UBM-SF) durante 24 horas. Los datos muestran que UBM-SF aumentó la proliferación de astrocitos primarios humanos normales, pero disminuyó de manera significativa el número de células de glioma.

FIGURA 22. La fracción soluble de UBM es tóxica para las células primarias de glioma, pero no para los astrocitos primarios humanos. Se trataron astrocitos primarios humanos, células primarias de glioma humano (0319) o una línea celular de glioma inmortalizada (U87MG) con o sin 3 mg/ml de fracción soluble de UBM (UBM-SF) durante 24 horas. Los resultados de un ensayo de viabilidad de células VIVAS/MUERTAS muestran que la UBM-SF no afectó la viabilidad de los astrocitos primarios humanos normales, pero disminuyó de manera significativa la viabilidad de las células de glioma.

FIGURA 23. La fracción soluble de UBM inhibe el crecimiento celular en una variedad de células neoplásicas. Las células se trataron con los artículos de prueba indicados durante 24 horas. La viabilidad celular se evaluó mediante ensayo de MTT.

FIGURA 24. Comparación de temozolomida con UBM-SF. La temozolomida (TMZ) es un agente alquilante oral que se utiliza para tratar el glioblastoma multiforme (GBM) y los astrocitomas. Se trataron células de microglía humano (CHME5), fibroblastos primarios de prepucio humano (HFF) y dos líneas celulares primarias de glioma humano (1015 y 1119) con concentraciones crecientes de TMZ o UB^m -SF durante 24 horas para comparar la ventana terapéutica de cada sustrato de prueba. La TMX fue tóxica para las líneas celulares tanto normales como neoplásicas, lo que sugiere que TMZ no tiene una ventana terapéutica o, en el mejor de los casos, una ventana terapéutica muy estrecha. Por el contrario, la UBM-SF tenía una gran ventana terapéutica en la que el sustrato destruía de manera preferente las células neoplásicas sin afectar la viabilidad de las células normales.

FIGURA 25. Fraccionamiento de UBM-SF mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, Size Exclusión Chromatography). La UBM-SF se resolvió mediante SEC utilizando la resina Sepharose CL-6B (panel derecho). Las fracciones se agruparon tal como se indica y se utilizaron para tratar células de microglía humano (CHME5), fibroblastos primarios de prepucio humano (HFF) y dos líneas celulares primarias de glioma humano (0319 y 1119). Los datos muestran que las fracciones 9-22 destruyen de manera preferente las células de glioma (panel izquierdo).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el presente documento se da a conocer que la ECM solubilizada, o una fracción soluble de un hidrogel de ECM, puede utilizarse para disminuir la proliferación, aumentar la apoptosis y/o reducir la migración de células tumorales, tales como células tumorales malignas. La fracción soluble de los hidrogeles de ECM no es citotóxica para las células normales y no provoca un efecto adverso en el tejido parenquimatoso circundante. Por tanto, la ECM solubilizada y/o una fracción soluble de un hidrogel de ECM es útil para tratar un tumor en un sujeto. En un ejemplo específico no limitativo, el tumor es un glioma y/o el hidrogel de ECM soluble se deriva de ECM de vejiga urinaria.

Términos

A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se utilizan según el uso convencional. Las definiciones de términos habituales en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (Is Bn 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por V^c H Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8).

A efectos de facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la presente divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:

Proteasa ácida: Una enzima que escinde los enlaces peptídicos, en la que la enzima tiene una mayor actividad de escisión de los enlaces peptídicos a pH ácido. Por ejemplo y sin limitación, las proteasas ácidas pueden incluir pepsina y tripsina.

Adenocarcinoma: Un tipo de tumor maligno que puede aparecer en diversas partes del cuerpo. Es una neoplasia de tejido epitelial que tiene origen glandular, características glandulares o ambos.

Apoptosis: Un proceso de muerte celular programada que tiene lugar en organismos multicelulares. La apoptosis incluye cambios celulares característicos (morfología) y muerte. Entre estos cambios se incluyen formación de ampollas, encogimiento celular, fragmentación nuclear, condensación de cromatina, fragmentación del ADN cromosómico y descomposición global del ARNm.

Base: Un compuesto o una solución de un compuesto con un pH superior a 7. Por ejemplo y sin limitación, la base es un hidróxido alcalino o una solución acuosa de un hidróxido alcalino. En determinadas realizaciones, la base es NaOH o NaOH en PBS.

Cáncer: Un tumor benigno o maligno que ha experimentado una anaplasia característica con pérdida de diferenciación, aumento de la tasa de crecimiento, invasión del tejido circundante y capacidad de metástasis. Por ejemplo, el cáncer de tiroides es un tumor que surge en tejido tiroideo o a partir del mismo, y el cáncer de esófago es un tumor que surge en tejido esofágico o a partir del mismo. El cáncer residual es cáncer que permanece en un sujeto después de cualquier forma de tratamiento administrado al sujeto para reducir o erradicar el cáncer. El cáncer metastásico es un tumor en uno o más sitios del cuerpo distintos del sitio de origen del cáncer original (primario) del que se deriva el cáncer metastásico. El cáncer incluye, pero sin limitarse a los mismos, tumores sólidos.

Centrifugación: El procedimiento mediante el cual se aplica una fuerza centrífuga a una mezcla, mediante la cual los componentes más densos de la mezcla se alejan por migración del eje de la centrífuga en relación con otros componentes menos densos de la mezcla. La fuerza que se aplica a la mezcla es función de la velocidad del rotor de la centrífuga y del radio de giro. En la mayoría de las aplicaciones, la fuerza del giro dará como resultado que se acumule un precipitado (un sedimento) en el fondo del tubo de centrífuga, donde la solución restante se denomina correctamente “sobrenadante”. En otras aplicaciones similares, se utiliza una técnica de separación basada en la densidad o “centrifugación en gradiente” para aislar una especie particular de una mezcla que contiene componentes que son más densos y menos densos que el componente deseado.

Durante el movimiento circular del rotor de una centrífuga, la fuerza que se aplica es el producto del radio y la velocidad angular del giro, donde la fuerza se expresa habitualmente como una aceleración relativa a “g”, la aceleración estándar debida a la gravedad en la superficie de la tierra. La fuerza centrífuga que se aplica se denomina “fuerza centrífuga relativa” (RCF, relative centrifuga! force) y se expresa en múltiplos de “g”.

Quimioterapia; agentes quimioterapéuticos: Tal como se utiliza en el presente documento, cualquier agente químico con utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular anormal. Entre dichas enfermedades se incluyen tumores, neoplasias y cáncer, así como enfermedades caracterizadas por un crecimiento hiperplásico, tales como la psoriasis. En una realización, un agente quimioterapéutico es un agente para utilizar en el tratamiento de neoplasias, tales como tumores sólidos. En una realización, un agente quimioterapéutico es una molécula radiactiva. Un experto en la materia puede identificar fácilmente un agente quimioterapéutico para su utilización (por ejemplo, véase Slapak y Kufe, Principles of Cancer Therapy, capítulo 86 en Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14a edición; Perry et al., Chemotherapy, capítulo 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2a ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc. Baltzer L., Berkery R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993). Entre los agentes quimioterapéuticos se incluyen los conocidos por los expertos en la materia, que incluyen, pero sin limitarse a los mismos: 5-fluorouracilo (5-FU), azatioprina, ciclofosfamida, antimetabolitos (tales como fludarabina), antineoplásicos (tales como etopósido, doxorrubicina, metotrexato y vincristina), carboplatino, cisplatino y los taxanos, tales como taxol. La rapamicina también se ha utilizado como agente quimioterapéutico.

Triturar (triturado y trituración): El procedimiento de reducir partículas más grandes a partículas más pequeñas, que incluye, sin limitación, pulverizar, mezclar, desmenuzar, rebanar, moler, cortar, desmenuzar. La ECM se puede triturar en cualquier forma, que incluye, pero sin limitarse a las mismas, formas hidratadas, congeladas, secadas al aire, liofilizadas, en polvo, en forma de lámina.

Poner en contacto: Colocación en asociación física directa. Incluye tanto en forma sólida como líquida.

Citocina: El término “citocina” se utiliza como nombre genérico para un grupo diverso de proteínas y péptidos solubles que actúan como reguladores humorales en concentraciones de nanomoleculares a picomolares y que, en condiciones normales o patológicas, modulan las actividades funcionales de las células individuales y los tejidos. Estas proteínas también median directamente en las interacciones entre las células y regulan los procedimientos que tienen lugar en el entorno extracelular. Entre los ejemplos de citocinas se incluyen, pero sin limitarse a las mismas, factor de necrosis tumoral-a, interleucina (IL)-6, IL-10, IL-12, factor de crecimiento transformante e interferón-y.

Diagnóstico: El procedimiento de identificar una enfermedad por sus signos, síntomas y resultados de diversas pruebas. La conclusión a la que se llega a través de ese procedimiento también se denomina “diagnóstico”. Entre las formas de pruebas realizadas habitualmente se incluyen análisis de sangre, imágenes médicas y biopsia.

Matriz extracelular (ECM): Un armazón natural o artificial para el crecimiento celular. Las E^c M naturales (las ECM que se encuentran en organismos multicelulares, tales como, pero sin limitarse a los mismos, mamíferos y seres humanos) son mezclas complejas de biomoléculas estructurales y no estructurales, que incluyen, pero sin limitarse a las mismas, colágenos, elastinas, lamininas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, antimicrobianos, quimioatrayentes, citocinas y factores de crecimiento. En los mamíferos, la ECM a menudo comprende aproximadamente un 90 % de colágeno, en sus diversas formas. La composición y la estructura de las ECM varían según el origen del tejido. Por ejemplo, la submucosa del intestino delgado (SIS), la matriz de la vejiga urinaria (UBM), el esófago (E) y la ECM del estroma hepático difieren, cada uno, en su estructura y composición general debido al nicho celular único necesario para cada tejido. Una “matriz extracelular” intacta y una “ECM intacta” son una matriz extracelular que conserva la actividad de sus biomoléculas estructurales y no estructurales, que incluyen, pero sin limitarse a las mismas, colágenos, elastinas, lamininas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, antimicrobianos, quimioatrayentes, citocinas y factores de crecimiento

La estructura y/o la actividad de las biomoléculas dentro de la ECM pueden alterarse o eliminarse de manera química o mecánica, por ejemplo, mediante reticulación y/o dialización de la ECM. Esencialmente, la ECM intacta no ha sido digerida enzimáticamente, reticulada o dializada, lo que significa que la ECM no ha sido sometida a un proceso de digestión, diálisis y/o reticulación, o condiciones distintas a los procesos que tiene lugar de forma natural durante el almacenamiento y la manipulación de la ECM antes de la solubilización. Por tanto, la ECM que está sustancialmente reticulada y/o dializada (de una manera que no sea trivial y que no afecte sustancialmente la gelificación y las características funcionales de la ECM en sus utilizaciones descritas en el presente documento) no se considera “intacta”. Una ECM “acelular” representa una fuente de tejido que ha sido tratada para retirar las células, de manera que permanece la ECM.

Gelificación: La formación de un gel a partir de una solución (“sol”).

Glioma: Un tumor que surge de las células gliales. Entre los gliomas se incluyen ependimomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, gliomas del tronco encefálico, gliomas del nervio óptico y gliomas mixtos. Los gliomas se pueden caracterizar por el grado. La Organización Mundial de la Salud (OMS) clasifica los gliomas como grados I-IV. Los gliomas de bajo grado (grado II según la OMS) están bien diferenciados (no anaplásicos) y muestran tendencias benignas y, en general, tienen un mejor pronóstico. Sin embargo, pueden reaparecer y aumentar de grado con el tiempo, por lo que se clasifican como malignos. Los gliomas de alto grado (grados III-IV según la OMS) no están diferenciados o son anaplásicos. Los gliomas de alto grado son malignos y tienen un mal pronóstico. Los gliomas son supratentoriales (por encima de la tienda del cerebelo, en el cerebro, y se encuentran principalmente en adultos), infratentoriales (por debajo de la tienda del cerebelo, en el cerebelo, y se encuentran principalmente en los niños), o pontino (ubicado en el puente del tronco encefálico). Los síntomas de los gliomas dependen de la ubicación del tumor dentro del sistema nervioso central afectado. Los síntomas de un glioma cerebral son dolores de cabeza, vómitos, convulsiones y trastornos de los nervios craneales. Un síntoma de un glioma del nervio óptico es la pérdida visual. Los síntomas de los gliomas de la médula espinal son dolor, debilidad o entumecimiento en las extremidades. En general, los gliomas se extienden a través del líquido cefalorraquídeo y pueden causar “metástasis en gota” en la médula espinal.

Hidrogel: Una red de cadenas poliméricas que son hidrófilas, que a veces se encuentran como un gel coloidal, en el que el agua es el medio de dispersión. Los hidrogeles son redes poliméricas naturales o sintéticas muy absorbentes. Los hidrogeles también poseen un grado de flexibilidad similar al tejido natural.

Inflamación: Una respuesta protectora localizada provocada por una lesión en el tejido. La inflamación se caracteriza por la aparición o migración en cualquier espacio, unidad o región tisular de cualquier clase de leucocitos en cantidades que superan la cantidad de dichas células encontradas dentro de dicha región de tejido en circunstancias normales (sanas). La inflamación está orquestada por una respuesta biológica compleja de los tejidos vasculares a estímulos dañinos, tales como patógenos, células dañadas o irritantes.

Aislado: Un componente biológico “aislado” (tal como un ácido nucleico, un péptido o una proteína) ha sido sustancialmente separado, producido aparte o purificado de otros componentes biológicos en la matriz, la célula o el organismo en el que se encuentra el componente de forma natural, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, y proteínas. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas que han sido “aislados” incluyen, por tanto, ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos, péptidos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente. Se ha separado una ECM aislada de las células que la producen.

Solución tamponada isotónica: Una solución que se ha tamponado a un pH entre 7,2 y 7,8 y que tiene una concentración equilibrada de sales para promover un entorno isotónico.

Mamífero: Este término incluye mamíferos humanos y no humanos. De manera similar, el término “sujeto” incluye tanto sujetos humanos como veterinarios.

Metástasis: Propagación del cáncer de un lugar a otro en el cuerpo. Es una serie compleja de etapas en las que las células cancerosas abandonan el sitio del tumor original y migran a través del torrente sanguíneo, el sistema linfático, el líquido cefalorraquídeo o por extensión.

Prevenir o tratar una enfermedad: “Prevenir” una enfermedad se refiere a inhibir el desarrollo parcial o total de una enfermedad, por ejemplo, en una persona que se sabe que tiene una predisposición a una enfermedad, tal como el cáncer. Un ejemplo de una persona con una predisposición conocida es alguien con antecedentes de cáncer de mama en la familia, o que ha estado expuesto a factores que predisponen al sujeto a una afección, tal como el melanoma. “Tratamiento” se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica después de que haya comenzado a desarrollarse. En varias realizaciones, el tratamiento se refiere a una reducción del tamaño de un tumor, una reducción del número y/o el tamaño de las metástasis o una reducción de un síntoma del tumor.

Proliferación: División de células de manera que aumentan en número. El procedimiento de división celular se llama mitosis.

Agente terapéutico: Utilizado en un sentido genérico, incluye agentes de tratamiento, agentes profilácticos y agentes de reemplazo. “Tratamiento” o “tratar” significan proporcionar una sustancia, tal como una fracción soluble de un hidrogel de ECM, a un paciente en una cantidad suficiente para reducir de forma mesurable cualquier síntoma de la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad o provocar la regresión de la enfermedad, tal como de un tumor. En determinadas realizaciones, el tratamiento de la enfermedad puede comenzar antes de que el paciente presente síntomas de la enfermedad, tal como un tumor.

Cantidad eficaz terapéuticamente: Una “cantidad eficaz terapéuticamente” de una composición, tal como un hidrogel de ECM, significa una cantidad eficaz, cuando se administra a un paciente, para proporcionar un beneficio terapéutico, tal como una mejora de los síntomas, reducción de la progresión o para provocar la regresión de la enfermedad. Una cantidad de una fracción soluble especificada de un hidrogel de ECM es suficiente para conseguir el efecto deseado en un sujeto que se está tratando. Una cantidad eficaz terapéuticamente puede administrarse de manera sistémica o local, tal como en el cerebro. Además, se puede administrar una cantidad eficaz de una fracción soluble de un hidrogel de ECM en una sola dosis o en varias dosis a lo largo del tiempo. Sin embargo, la cantidad eficaz dependerá de la preparación aplicada, el sujeto a tratar, la gravedad y el tipo de afección, y de la forma de administración del compuesto. Las fracciones solubles de los hidrogeles de ECM para su utilización en los procedimientos dados a conocer en el presente documento tienen las mismas aplicaciones en entornos médicos y veterinarios. Por lo tanto, se entiende que el término general “sujeto” o “paciente” incluye todos los animales, que incluyen, pero sin limitarse a los mismos, sujetos humanos o veterinarios, tales como otros primates, perros, gatos, caballos y vacas.

Tumor: Un crecimiento anormal de células que puede ser benigno o maligno. Entre otras características a menudo asociadas con la malignidad se incluyen metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales y supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc. “Enfermedad metastásica” se refiere a las células cancerosas que han abandonado el sitio original del tumor y migran a otras partes del cuerpo, por ejemplo, a través del torrente sanguíneo o del sistema linfático.

La cantidad de un tumor en un individuo es la “carga tumoral” que se puede medir como el número, volumen o peso del tumor. Un tumor que invade el tejido circundante y/o puede experimentar metástasis se denomina “maligno”. Entre los ejemplos de tumores hematológicos se incluyen leucemias, que incluyen leucemias agudas (tales como leucemia aguda positiva para 11q23, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y leucemias mieloblásticas, promielocíticas, mielomonocíticas, monocíticas y eritroleucémica), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.

Entre los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, se incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteógeno y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, tumor maligno linfoide, cáncer pancreático, cáncer de mama (que incluye el carcinoma basal de mama, carcinoma ductal y carcinoma lobulillar de mama), cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga y tumores del SNC (tales como un glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma). En un ejemplo no limitativo, un tumor es un glioma.

Ultrasonicación: El procedimiento de exponer a ondas ultrasónicas con una frecuencia superior a 15 kHz e inferior a 400 kHz.

A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación. Los términos singulares “un”, “una” y “el” o “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra “o” pretende incluir “y” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Debe entenderse además que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, proporcionados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para su descripción. Aunque en la práctica o pruebas de esta divulgación, se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen procedimientos y materiales adecuados. El término “comprende” significa “incluye”. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria, incluyendo las explicaciones de los términos. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Hidrogeles de matriz extracelular (ECM) y fracciones solubles de los mismos

Los procedimientos para preparar hidrogeles de ECM se dan a conocer, por ejemplo, en la Patente US8,361,503. Se puede utilizar cualquier tipo de matriz extracelular para fabricar un hidrogel que se pueda utilizar en los procedimientos, tal como se dan a conocer en el presente documento (véanse las Patentes US4,902,508; US4,956,178; US5,281,422; US5,352,463; US5,372,821; US5,554,389; US5,573,784; US5,645,860; US5,771,969; US5,753,267; US5,762,966; US5,866,414; US6,099,567; US6,485,723; US6,576,265; US6,579,538; US6,696,270; US6,783,776; US6,793,939; US6,849,273; US6,852,339; US6,861,074; US6,887,495; US6,890,562; US6,890,563; US6,890,564; y US6,893,666 relacionadas con ECM). En determinadas realizaciones, la ECM se aísla a partir de un animal vertebrado, por ejemplo, y sin limitación, a partir de un animal vertebrado mamífero de sangre caliente que incluye, pero sin limitarse a los mismos, seres humanos, monos, caballos, cerdos, vacas y ovejas. En ejemplos específicos no limitativos, la ECM es porcina o humana.

La ECM se puede obtener de cualquier órgano o tejido, que incluyen, sin limitación, vejiga urinaria, intestino, hígado, esófago y dermis. La ECM se puede obtener a partir de un cultivo celular. En una realización, la ECM se aísla a partir de una vejiga urinaria. En otra realización, la ECM es de un esófago. La ECM puede incluir o no la parte de la membrana basal de la ECM. En determinadas realizaciones, la ECM incluye, como mínimo, una parte de la membrana basal.

En algunas realizaciones, como en la Patente US8,361,503, se prepara una ECM de vejiga urinaria, tal como una ECM de vejiga porcina, raspando el tejido de la vejiga para eliminar las capas externas, que incluyen tanto la túnica serosa como la túnica muscular, con un movimiento de limpieza longitudinal con el mango de un bisturí y una gasa humedecida. Después de la eversión del segmento de tejido, la parte luminal de la túnica mucosa se deslamina del tejido subyacente con el mismo movimiento de limpieza. En algunas realizaciones, se evita la perforación de la submucosa. Después de eliminar estos tejidos, la ECM resultante consiste principalmente en la túnica submucosa. La producción de hidrogeles a partir de ECM dérmica descelularizada se da a conocer en Wolf et al., Biomaterials 33: 7028-7038, 2012. La producción de ECM a partir de tejido esofágico se da a conocer, por ejemplo, en Badylak et al. J Pediatr Surg. 35(7): 1097-103, 2000 y Badylak et al., J Surg Res. Septiembre de 2005; 128(1): 87-97, 2005. La Patente US6,893,666 da a conocer la producción de ECM a partir de vejiga urinaria, piel, esófago e intestino delgado.

Las preparaciones de ECM disponibles en el mercado también se pueden utilizar en los procedimientos, dispositivos y composiciones descritos en el presente documento. En una realización, la ECM se obtiene de la submucosa del intestino delgado o SIS. Entre las preparaciones disponibles en el mercado se incluyen, pero sin limitarse a las mismas, SURGISIS™, SURGISIS-ES™, STRATASIS™ y STRATASIS-ES™ (Cook Urological Inc.; Indianapolis, Ind.) y GRAFTPATCH™ (Organogenesis Inc.; Canton Mass). En otra realización, la ECM se obtiene de la dermis. Entre las preparaciones disponibles en el mercado se incluyen, pero sin limitarse a las mismas, PELVICOL™ (comercializada como P^e RMACOL™ en Europa; Bard, Covington, Ga.), REPLIFORM™ (Microvasive; Boston, Mass.) y ALLODERM™ (LifeCell; Branchburg, N.J.). En otra realización, la ECM se obtiene de la vejiga urinaria. Entre las preparaciones disponibles en el mercado se incluyen, pero sin limitarse a las mismas, UBM (Acell Corporation; Jessup, Md.).

El tejido para la preparación de ECM se puede recoger de una gran variedad de formas y, una vez recogido, se pueden utilizar una variedad de partes del tejido recogido. También se ha preparado ECM a partir del esófago y del intestino delgado, y se han preparado hidrogeles a partir de esta ECM, véase, por ejemplo, Keane et al., Tissue Eng. Part A, 21(17-18): 2293-2300, 2015. La ECM esofágica se puede preparar separando mecánicamente la mucosa y la submucosa de la muscularis externa y digiriendo las capas de la mucosa en un tampón que incluya tripsina, seguido de la exposición a sacarosa, TRITON-X100®, ácido desoxicólico, ácido peracético y ADNasa. La submucosa del intestino delgado (SIS) se puede preparar extrayendo mecánicamente las capas superficiales de la túnica mucosa, la túnica serosa y la túnica muscular externa del intestino delgado intacto, dejando intactos la submucosa, la mucosa muscular y el estrato basilar compacto. A continuación, la SIS se trata con ácido peracético. Se dan a conocer protocolos de ejemplo en Keane et al. Se pueden producir hidrogeles dérmicos, por ejemplo, tal como se da a conocer en Wolf et al, J Biomed Mater Res A. 2013. 35(25): 6838-49. PMID: 23873846. PMCID: 3808505.

En una realización, la ECM se aísla de la vejiga urinaria porcina recogida para preparar la matriz de vejiga urinaria (UBM). El exceso de tejido conectivo y la orina residual se eliminan de la vejiga urinaria. La túnica serosa, la túnica muscular externa, la túnica submucosa y la mayor parte de la mucosa muscular pueden extraerse mediante abrasión mecánica o mediante una combinación de tratamiento enzimático, hidratación y abrasión. La extracción mecánica de estos tejidos se puede conseguir mediante abrasión con un movimiento de limpieza longitudinal para extraer las capas externas (en particular, las capas de músculo liso abluminal) e incluso las partes luminales de la túnica mucosa (capas epiteliales). La extracción mecánica de estos tejidos se consigue mediante la extracción de tejidos mesentéricos, por ejemplo, con fórceps de Adson-Brown y tijeras de Metzenbaum y limpiando la túnica muscular y la túnica submucosa con un movimiento de limpieza longitudinal con el mango de un bisturí u otro objeto rígido envuelto en una gasa humedecida. Las células epiteliales de la túnica mucosa también pueden disociarse sumergiendo el tejido en una solución desepitelizante, por ejemplo, y sin limitación, solución salina hipertónica. La UBM resultante comprende la membrana basal de la túnica mucosa y la túnica propria adyacente, que además se trata con ácido peracético, se liofiliza y se pulveriza, véase la Patente US8,361,503.

Se pueden utilizar secciones de dermis para la preparación de hidrogeles de ECM, véase la Patente PCT2015/15164728. En un ejemplo específico no limitativo, la dermis se puede descelularizar con tripsina al 0,25 %/Triton X-100 al 1 % (es decir, sin SDS) en un agitador para vórtice a 300 RPM a temperatura ambiente en las siguientes soluciones: tripsina al 0,25 % durante 6 horas , 1x; agua desionizada, 15 minutos, 3x; etanol al 70 %, de 10 a 12 horas, 1x; H2O2 al 3 %, 15 minutos, 1x, agua desionizada, 15 minutos, 2x; Triton X-100 al 1 % en EDTA al 0,26 %/Tris al 0,69 %, 6 horas, 1x y, a continuación, durante una noche, 1x; agua desionizada, 15 minutos, 3x; ácido peracético al 0,1 %/etanol al 4 %, 2 horas, 1x; PBS, 15 minutos, 2x; y finalmente agua desionizada, 15 minutos, 2x. A continuación, las láminas de dermis se liofilizan y posteriormente se reducen a forma de partículas utilizando un mezclador Waring y un molino de Wiley con un tamiz de malla #20.

En algunas realizaciones, las células epiteliales se pueden deslaminar primero sumergiendo en primer lugar el tejido en una solución desepitelizante, tal como solución salina hipertónica, por ejemplo, y sin limitación, solución salina 1,0 N, durante períodos de tiempo que varían de 10 minutos a 4 horas. La exposición a la solución salina hipertónica extrae de manera eficaz las células epiteliales de la membrana basal subyacente. El tejido restante después del procedimiento de deslaminación inicial incluye la membrana basal epitelial y las capas de tejido abluminales a la membrana basal epitelial. A continuación, este tejido se somete a un tratamiento adicional para extraer la mayoría de los tejidos abluminales, pero no la membrana basal epitelial. Los tejidos musculares lisos, adventicios y serosos externos, la túnica submucosa y la mayor parte de la mucosa muscular se extraen del tejido desepitelizado restante mediante abrasión mecánica o mediante una combinación de tratamiento enzimático, hidratación y abrasión.

La ECM se puede esterilizar mediante varias técnicas estándar, que incluyen, pero sin limitarse a las mismas, exposición a ácido peracético, radiación gamma de dosis baja, esterilización con plasma gaseoso, tratamiento con óxido de etileno o tratamiento con haz de electrones. Más habitualmente, la esterilización de ECM se obtiene sumergiendo en 0,1 % (v/v) de ácido peracético, 4 % (v/v) de etanol y 95,9 % (v/v) de agua esterilizada durante dos horas. El residuo de ácido peracético se elimina lavando dos veces durante 15 minutos con PBS (pH = 7,4) y dos veces durante 15 minutos con agua estéril. El material de ECM se puede esterilizar mediante tratamiento con óxido de propileno u óxido de etileno, tratamiento con radiación gamma (de 0,05 a 4 mRad), esterilización con plasma gaseoso, esterilización con ácido peracético o tratamiento con haz de electrones. La ECM también se puede esterilizar mediante tratamiento con glutaraldehído, que provoca la reticulación del material proteico, pero este tratamiento altera de manera sustancial el material, de manera que se reabsorbe lentamente o no se reabsorbe en absoluto e incita a un tipo diferente de remodelación del huésped que se parece más a la formación o encapsulación de tejido cicatricial que a la remodelación constructiva. La reticulación del material proteico también se puede inducir con carbodiimida o procedimientos deshidrotermales o de fotooxidación. Tal como se da a conocer en la Patente US8,361,503, la ECM se desinfecta por inmersión en 0,1 % (v/v) de ácido peracético, 4 % (v/v) de etanol y 96 % (v/v) de agua estéril durante 2 horas. A continuación, el material de ECM se lava dos veces durante 15 minutos con PBS (pH = 7,4) y dos veces durante 15 minutos con agua desionizada.

Después del aislamiento del tejido de interés, se realiza la descelularización mediante diversos procedimientos, por ejemplo, y sin limitación, exposición a solución salina hipertónica, ácido peracético, TRITON-X® u otros detergentes. La esterilización y la descelularización pueden ser simultáneas. Por ejemplo y sin limitación, la esterilización con ácido peracético, descrita anteriormente, también puede servir para descelularizar la ECM. A continuación, la ECM descelularizada se puede secar, ya sea liofilizada (secada por congelación) o secada al aire. La ECM seca se puede triturar mediante procedimientos que incluyen, pero sin limitarse a los mismos, rasgado, molienda, corte, trituración y cizallamiento. La ECM triturada también se puede procesar adicionalmente en forma de polvo mediante procedimientos, por ejemplo, y sin limitación, tales como trituración o molienda en un estado congelado o liofilizado. A efectos de preparar tejido de ECM solubilizado, la ECM triturada se digiere con una proteasa ácida en una solución ácida para formar una solución de digestión.

En una realización, el material de ECM descelularizado es parcialmente digerido por la proteasa ácida. En un ejemplo, el material de ECM descelularizado se digiere menos completamente que una digestión de 1 mg/ml de material de ECM en polvo liofilizado con 1 mg/ml de pepsina en HCl 0,01 M durante 48 horas. En otro ejemplo, el material de ECM descelularizado se digiere menos completamente que una digestión de 10 mg/ml de material de ECM en polvo liofilizado con 1 mg/ml de pepsina en HCl 0,01 M durante 48 horas. En una realización adicional, el ácido hialurónico en el material de ECM se digiere menos del 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 % o 10 % en comparación con el material de ECM no digerido, véase la Patente WO 2015/164728.

La solución de digestión de ECM habitualmente se mantiene en agitación constante durante una determinada cantidad de tiempo a temperatura ambiente. El producto de digestión de ECM se puede utilizar de manera inmediata o se puede almacenar a -20 oC o congelar, por ejemplo, y sin limitación, a -20 oC o -80 oC. Por tanto, el producto de digestión de ECM se puede mantener en forma solubilizada. Los procedimientos para mantener un hidrogel en forma solubilizada se dan a conocer, por ejemplo, en la Patente PCT/US16/52261, presentada el 10 de septiembre de 2016. Cualquiera de estos procedimientos dados a conocer en esta solicitud PCT es útil para fabricar hidrogeles solubilizados para tratar tumores, o fracciones solubles de los mismos.

Una vez que se solubiliza la ECM (habitualmente de manera sustancialmente completa), el pH de la solución se eleva a entre 7,2 y 7,8 y, según una realización, hasta pH 7,4. Se pueden utilizar bases, tales como bases que contienen iones hidroxilo, que incluyen NaOH, para elevar el pH de la solución. Del mismo modo, se pueden utilizar tampones, tales como un tampón isotónico, que incluye, sin limitación, solución salina tamponada con fosfato (PBS, phosphate buffered satine), para llevar la solución a un pH objetivo, o para ayudar a mantener el pH y la fuerza iónica del gel en los niveles objetivo, tales como pH y condiciones iónicas fisiológicas. Se forma una solución “pregel” que es un hidrogel de ECM solubilizado. La solución de digestión neutralizada (pregel, hidrogel de ECM solubilizado) se puede gelificar a una temperatura crítica inferior de solución, véase la Patente PCT 2015/164728, incorporada en el presente documento por referencia.

El hidrogel de ECM forma un gel (transición de sol a gel) después de aumentar la temperatura. La temperatura crítica inferior de solución (LCST, lower critica! solution temperature) en un gel inverso es una temperatura por debajo de la cual un polímero de gelificación inversa es soluble en su disolvente (por ejemplo, agua o un disolvente acuoso). A medida que la temperatura se eleva por encima de la LCST en un gel inverso, se forma un hidrogel. El concepto general de gelificación inversa de polímeros y su relación con LCST son ampliamente conocidos en las técnicas químicas. Los geles de ECM descritos en el presente documento se preparan, por ejemplo, a partir de ECM intacta descelularizada, tal como se describe a continuación, mediante digestión del material de ECM con una proteasa ácida, neutralización del material para formar un pregel, aumento de la temperatura del pregel por encima de la LCST del pregel para hacer que el pregel gelifique, tal como para formar un hidrogel. La temperatura de transición de solución a gel con digestión con proteasa ácida está habitualmente dentro del intervalo de 10 oC a 40 oC y cualquier incremento o intervalo entre los mismos, por ejemplo, de 20 oC a 35 oC. Por ejemplo, el pregel se puede calentar a 37 oC para formar un hidrogel. A continuación, el hidrogel se centrifuga y se recoge la fracción soluble. A efectos de separar los componentes estructurales de los solubles del hidrogel resultante, el hidrogel se centrifuga a una fuerza g suficiente y durante un tiempo suficiente para separar componentes en solución y los estructurales del hidrogel. Por solución en el contexto de este procedimiento de separación, se hace referencia a la solución acuosa resultante y a los constituyentes disueltos o que, en cualquier caso, permanecen en la solución acuosa después de la centrifugación de aproximadamente 10.000 g (10.000 veces la gravedad) a aproximadamente 100.000 g, tal como aproximadamente 10.000 g, 15.000 g, 20.000 g, 25.000 g, 30.000 g, 35.000 g, 40.000 g, 45.000 g, 50.000 g, 55.000 g, 60.000 g, 65.000 g, 70.000 g, 75.000 g, 80.000 g, 85.000 g, 90.000 g, 95.000 g o 100.000 g. En un ejemplo específico no limitativo, la centrifugación se realiza a aproximadamente 25.000 g durante aproximadamente 30 minutos. En algunas realizaciones, la centrifugación es de aproximadamente 10.000 g durante de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 20 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 horas, o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, tal como aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas. La centrifugación se puede realizar, por ejemplo, durante de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 18 a aproximadamente 24 horas. En otras realizaciones, la centrifugación es a aproximadamente 100.000 g durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 minutos, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 minutos, tal como durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 minutos. En un ejemplo no limitativo, la centrifugación se realiza a 100.000 g durante aproximadamente 10 minutos. Habitualmente, el procedimiento no incluye una etapa de diálisis antes de la gelificación, lo que genera una matriz similar a la ECM más completa que habitualmente gelifica a 37 oC a velocidades específicas (véase a continuación).

Por tanto, la ECM habitualmente puede obtenerse a partir de tejido de mamífero, tal como, sin limitación, de uno entre vejiga urinaria, esófago o intestino delgado. En un ejemplo específico no limitativo, la ECM se obtiene de la vejiga urinaria. Según una realización, el material de ECM descelularizado preparado a partir del tejido no se dializa antes de la digestión parcial o completa con la proteasa ácida y/o no se dializa después de la digestión con una proteasa ácida y antes de la gelificación del material de ECM neutralizado y digerido.

En una realización no limitativa, la ECM se liofiliza y se tritura. A continuación, la ECM se solubiliza con una proteasa ácida en una solución ácida para producir ECM digerida, tal como ECM de la vejiga urinaria. La proteasa ácida puede ser, sin limitación, pepsina o tripsina, o una combinación de las mismas. A continuación, la ECM se puede solubilizar a un pH ácido adecuado u óptimo para la proteasa, tal como superior a aproximadamente pH 2, o entre pH y 4, por ejemplo, en una solución de HCl 0,01 M. La solución habitualmente se solubiliza durante de aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas, dependiendo del tipo de tejido (por ejemplo, véanse los ejemplos a continuación), con mezcla (removiendo, agitando, mezclando, combinando, girando, inclinando, etc.). El hidrogel de ECM se prepara mediante las etapas de (i) triturar una matriz extracelular, (ii) solubilizar la matriz extracelular intacta, no dializada o no reticulada mediante digestión con una proteasa ácida en una solución ácida para producir una solución de digestión, (iii) elevar el pH de la solución de digestión a un pH entre 7,2 y 7,8 para producir una solución de digestión neutralizada (solución de pregel) y (iv) gelificar la solución. A continuación, el hidrogel de ECM se centrifuga y se recoge la fracción soluble.

Se pueden producir fracciones solubles de hidrogeles de ECM, por ejemplo, mediante la digestión de manera parcial o completa una ECM, tal como una ECM descelularizada con una proteasa ácida, neutralización del material de ECM digerido hasta un pH de 7,0-8,0, por ejemplo, 7,2-7,8 o 7,4, gelificación del material de ECM neutralizado y digerido a una temperatura por encima de su temperatura crítica inferior de solución y centrifugación del material de ECM gelificado para producir un sedimento y un sobrenadante. A continuación, el sobrenadante se recoge y utiliza en los procedimientos dados a conocer en el presente documento.

Los procedimientos de ejemplo para el fraccionamiento de un hidrogel de ECM se dan a conocer, por ejemplo, en la Patente WO 2015/164728. Entre los procedimientos dados a conocer en esta publicación ^pC^t se incluyen la digestión parcial o completa con una proteasa ácida, tal como pepsina, del material de ECM descelularizado preparado a partir de un tejido; neutralización del material de ECM digerido a un pH de 7,0-8,0, 7,2-7,8 o 7,4; gelificación del material de ECM neutralizado y digerido a una temperatura por encima de su temperatura crítica inferior de solución; centrifugación del material de ECM gelificado para producir un sedimento y un sobrenadante; y separación del sobrenadante y el sedimento, separando de este modo una fracción estructural y una soluble del material de ECM.

El hidrogel de ECM, cuando se expone a temperaturas por encima de la temperatura crítica inferior de solución, tal como una temperatura de aproximadamente 37 oC, forma el gel. El hidrogel de ECM en forma de “pregel” (el hidrogel de ECM solubilizado) puede congelarse y almacenarse, por ejemplo, y sin limitación, a -20 oC o -80 oC. El hidrogel de ECM en forma de “pregel” se puede almacenar a temperatura ambiente, tal como a aproximadamente 25 oC. En algunos ejemplos no limitativos, el hidrogel de ECM está en forma de pregel por debajo de 37 oC, tal como a 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 oC. El hidrogel de ECM se puede congelar para su almacenamiento y, por tanto, se puede almacenar por debajo de 0 oC. Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones “forma de pregel” o “pregel” se refieren al hidrogel de ECM, en el que se aumenta el pH, pero no se ha gelificado. Por ejemplo y sin limitación, un hidrogel de ECM en forma de pregel tiene un pH entre 7,2 y 7,8. En algunas realizaciones, el hidrogel de ECM solubilizado se utiliza en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. Los procedimientos para mantener un hidrogel en forma solubilizada se dan a conocer, por ejemplo, en la Patente PCT/US16/52261, presentada el 10 de septiembre de 2016. Cualquiera de estos procedimientos dados a conocer en esta solicitud ^pC^t es útil para producir hidrogeles solubilizados para tratar tumores o fracciones solubles de los mismos.

Cuando es de interés producir la fracción soluble, la temperatura del hidrogel de ECM se eleva por encima de su temperatura crítica inferior de solución. A continuación, se centrifuga el hidrogel de ECM y se recoge la fracción soluble.

La fracción soluble se utiliza en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. La fracción soluble se puede incluir en una composición farmacéutica con ingredientes adicionales, tales como, pero sin limitarse a los mismos, portadores aceptables farmacéuticamente. La fracción soluble, y las composiciones farmacéuticas que incluyen la fracción soluble, se pueden aplicar o administrar de diversas maneras, ya sea como un polvo seco, por ejemplo, liofilizado, una solución, un gel, etc. La composición se puede administrar por sí sola o con un dispositivo. En otra realización, el sobrenadante/fracción soluble se purifica adicionalmente mediante la precipitación de los componentes estructurales restantes a partir del sobrenadante, por ejemplo, mediante la separación por salinización de estos componentes estructurales, tales como, por ejemplo, mediante el aumento de la concentración de sal en el sobrenadante. La fracción soluble se seca, opcionalmente, por ejemplo, mediante liofilización y, a continuación, se puede rehidratar utilizando una solución acuosa adecuada, tal como agua, solución salina, tampón isotónico, PBS o medio sin suero. Según una realización, el sobrenadante se concentra. Es decir, el sobrenadante liofilizado se rehidrata hasta un volumen menor que el volumen del sobrenadante antes de la liofilización, de manera opcional, el sobrenadante liofilizado se rehidrata hasta un volumen <10 %, 10 %, 20 %, 25 % o 50 % del volumen del sobrenadante antes de la liofilización, produciendo, de este modo, una solución concentrada de componentes de ECM solubles.

En algunas realizaciones, la fracción soluble biológicamente activa de la composición de ECM preparada mediante cualquier procedimiento descrito en el presente documento se absorbe en, se adsorbe sobre o se dispersa de otro modo sobre o en un sustrato biocompatible. Entre los ejemplos no limitativos de un sustrato biocompatible se incluyen: una malla, un tejido descelularizado no tejido, una composición polimérica, una estructura polimérica, un armazón de crecimiento celular, un implante, un implante ortopédico y una lente intraocular, suturas, implantes intravasculares, endoprótesis vasculares y trasplantes. Las composiciones descritas en el presente documento pueden aplicarse a o incorporarse en, mediante cualquier procedimiento adecuado, un material no tejido, tal como un vendaje, una sutura, un implante, tal como un implante cerámico, metálico o polimérico, por ejemplo, una prótesis, vaso artificial o modificado de otro modo, una válvula, una lente intraocular o un implante de tejido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “recubrir” y términos similares relacionados, tales como “recubierto” y “recubrimiento” se refieren a un procedimiento que comprende cubrir, en parte o en su totalidad, una estructura inorgánica con una composición descrita en el presente documento. Por ejemplo y sin limitación, el recubrimiento de una estructura inorgánica con una fracción solubilizada puede incluir procedimientos, tales como vertido, incrustación, estratificación, inmersión, pulverización. Se puede utilizar la ultrasonicación para ayudar en el recubrimiento de una estructura inorgánica.

En otra realización, la composición que incluye la fracción soluble de un hidrogel de ECM recubre un material estructural biocompatible, tal como un metal, un compuesto de calcio inorgánico, tal como hidróxido de calcio, fosfato de calcio o carbonato de calcio, o una composición cerámica. Entre los ejemplos no limitativos de metales adecuados se encuentran aleaciones de cobalto-cromo, aleaciones de acero inoxidable, aleaciones de titanio, aleaciones de tántalo, aleaciones de titanio-tántalo, que pueden incluir componentes metálicos y no metálicos, tales como molibdeno, tántalo, niobio, zirconio, hierro, manganeso, cromo, cobalto, níquel aluminio y lantano, que incluyen, sin limitación, CP Ti (titanio comercialmente puro) de diversos grados o Ti 6Al 4V (90 % en peso de Ti, 6 % en peso de Al y 4 % en peso de V), acero inoxidable 316, Nitinol (aleación de níquel-titanio), aleaciones de titanio recubiertas con hidroxiapatita. Los metales son útiles debido a su alta resistencia, flexibilidad y biocompatibilidad. Los metales también se pueden formar en formas complejas y muchos pueden soportar la corrosión en entornos biológicos, reducir el desgaste y no causar daño a los tejidos. Otras composiciones, incluyendo cerámicos, compuestos de calcio, tales como, sin limitación, aragonita. También pueden ser útiles las combinaciones de metal, cerámicos y/u otros materiales.

Cualquier agente útil puede mezclarse, administrarse conjuntamente, aplicarse conjuntamente o combinarse de otro modo con cualquier composición, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo y sin limitación, entre los agentes útiles se incluyen interferones, interleucinas, quimiocinas, monocinas, hormonas, factores angiógenos, agentes quimioterapéuticos y antibióticos.

Procedimientos de utilización

En el presente documento se dan a conocer procedimientos para reducir la proliferación de células tumorales, ya sea in vivo o in vitro. En el presente documento también se dan a conocer procedimientos para aumentar la apoptosis de las células tumorales, ya sea in vivo o in vitro. Además, en el presente documento se dan a conocer procedimientos para disminuir la migración de células tumorales, ya sea in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen poner en contacto las células tumorales con una cantidad eficaz de un hidrogel de ECM solubilizado. En otras realizaciones, los procedimientos incluyen poner en contacto las células tumorales con una cantidad eficaz de una fracción soluble de un hidrogel de matriz extracelular. En algunas realizaciones, las células tumorales son células de glioma. En otras realizaciones, la ECM es ECM de vejiga urinaria. En realizaciones adicionales, las células tumorales son células de glioma y la ECM es ECM de vejiga urinaria o ECM de SIS. En realizaciones adicionales, las células tumorales son células de adenocarcinoma esofágico. En otras realizaciones, la matriz extracelular es ECM esofágica. En realizaciones adicionales, las células tumorales son de adenocarcinoma esofágico y la ECM es ECM esofágica.

Todos los procedimientos dados a conocer en el presente documento se pueden utilizar para cualquier tipo de glioma o célula de glioma. El glioma puede ser un ependimoma, un astrocitoma, un oligodendroglioma, un glioma del tronco encefálico, un glioma del nervio óptico o un glioma mixto. El glioma puede ser de grado I, II, III o IV según la OMS. El glioma puede ser un glioma de bajo grado o un glioma de alto grado (grado III-IV según la OMS). El glioma puede ser supratentorial, infratentorial o pontino.

También se dan a conocer procedimientos para tratar un tumor en un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen el tratamiento de un tumor existente en un sujeto. En realizaciones adicionales, en el presente documento se dan a conocer procedimientos para prevenir la conversión de una lesión benigna en maligna, o para prevenir la metástasis en un sujeto. En algunos ejemplos no limitativos, los procedimientos reducen un síntoma del tumor en el sujeto. En ejemplos no limitativos adicionales, el tumor es un tumor sólido. En algunas realizaciones, las células tumorales son células de glioma. En otras realizaciones, la ECM es ECM de vejiga urinaria. En realizaciones adicionales, las células tumorales son células de glioma y la ECM es ECM de vejiga urinaria. En realizaciones adicionales, las células tumorales son células de adenocarcinoma esofágico. En otras realizaciones, la matriz extracelular es ECM esofágica. En realizaciones adicionales, las células tumorales son de adenocarcinoma esofágico y la ECM es ECM esofágica.

En general, los procedimientos incluyen seleccionar un sujeto que tiene un tumor, tal como un tumor benigno o maligno, y administrar al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de un hidrogel de ECM solubilizado y/o una fracción soluble de un hidrogel de ECM. En algunas realizaciones, entre los procedimientos dados a conocer en el presente documento se incluyen seleccionar un sujeto que necesita tratamiento, tal como un sujeto con un glioma, y administrar al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de la fracción soluble del hidrogel de ECM. También se pueden administrar agentes adicionales al paciente de interés, tales como, pero sin limitarse a los mismos, agentes quimioterapéuticos. También se pueden administrar tratamientos adicionales al sujeto, tales como, pero sin limitarse a la misma, resección quirúrgica del tumor.

El tumor puede ser benigno o maligno. El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor linfoproliferativo. El tumor puede ser cualquier tumor de interés, que incluye, pero sin limitarse a los mismos, gliomas. En otras realizaciones, el tumor es un linfoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de colon. Entre los ejemplos adicionales se encuentran tumores de la piel, tumores de mama, tumores cerebrales, carcinomas de cuello uterino, carcinomas testiculares, tumores de cabeza y cuello, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del sistema genitourinario, tumores del sistema ginecológico, tumores de mama, tumores del sistema endocrino, tumores de la piel, un sarcoma del tejido blando y hueso, un mesotelioma, un melanoma, una neoplasia del sistema nervioso central o una leucemia. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor de cabeza y cuello, tal como tumores de la cavidad nasal, senos paranasales, nasofaringe, cavidad bucal, orofaringe, laringe, hipofaringe, glándulas salivales y paragangliomas. En otras realizaciones, el tumor es un tumor de pulmón, tal como un cáncer de pulmón no microcítico o un cáncer de pulmón microcítico. En realizaciones adicionales, el tumor puede ser un tumor del tracto gastrointestinal, tal como cáncer de esófago, estómago, páncreas, hígado, vías biliares, intestino delgado, colon, recto y región anal. En aún otras realizaciones, el tumor puede ser un tumor del sistema genitourinario, tal como cáncer de riñón, uretra, vejiga, próstata, uretra, pene y testículo. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor ginecológico, tal como cáncer de cuello uterino, vagina, vulva, cuerpo uterino, enfermedades trofoblásticas gestacionales, ovario, trompa de Falopio, peritoneal o de mama. En otras realizaciones, el tumor es un tumor del sistema endocrino, tal como un tumor tiroideo, tumor paratiroideo, tumor de la corteza suprarrenal, tumor endocrino pancreático, tumor carcinoide y síndrome carcinoide. El tumor puede ser un sarcoma de tejido blando y hueso, un mesotelioma, un cáncer de piel, un melanoma, que comprende melanomas cutáneos y melanomas intraoculares, una neoplasia del sistema nervioso central, un cáncer de la infancia, que comprende retinoblastoma, tumor de Wilm, neurofibromatosis, neuroblastoma, familia de tumores del sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma. El tumor puede ser un linfoma, que comprende linfomas no Hodgkin, linfomas cutáneos de linfocitos T, linfoma primario del sistema nervioso central y enfermedad de Hodgkin. El tumor puede ser una leucemia, tal como leucemia aguda, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica. El tumor puede ser neoplasias de células plasmáticas, un cáncer de sitio primario desconocido, una carcinomastosis peritoneal, un sarcoma de Kaposi, linfomas asociados con el SIDA, linfoma primario del sistema nervioso central asociado con el SIDA, enfermedad de Hodgkin asociada con el SIDA y cánceres anogenitales asociados con el SIDA, cáncer metastásico en el hígado, cáncer metastásico en el hueso, derrames pleural y pericárdico malignos y ascitis maligna. En ejemplos específicos no limitativos, el tumor es melanoma o cáncer de colon.

El tratamiento del tumor, en general, se inicia después del diagnóstico del tumor o después del inicio de una afección precursora (tal como displasia o desarrollo de un tumor benigno). El tratamiento puede iniciarse en los primeros estadios del cáncer, por ejemplo, puede iniciarse antes de que un sujeto manifieste síntomas de una afección, tal como durante un diagnóstico de estadio I o en el momento en que se diagnostica la displasia. Sin embargo, el tratamiento puede iniciarse durante cualquier estadio de la enfermedad, tal como, pero sin limitarse a los mismos, cánceres en estadio I, estadio II, estadio III y estadio IV. En algunos ejemplos, el tratamiento se administra a estos sujetos con un tumor benigno que puede convertirse en un tumor maligno o incluso metastásico.

La presencia de un tumor se puede determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica y habitualmente incluyen evaluación citológica y morfológica. El tumor puede ser un tumor establecido.

El tratamiento iniciado después del desarrollo de una afección, tal como cáncer maligno, puede dar como resultado la disminución de la gravedad de los síntomas de una de las afecciones o la eliminación completa de los síntomas, o la reducción de la metástasis, el volumen del tumor o el número de tumores. En algunos ejemplos, el tumor resulta indetectable después del tratamiento. En un aspecto de la divulgación, se retrasa, previene o disminuye la formación de tumores, tales como metástasis. En otro aspecto, se reduce el tamaño del tumor primario. En otro aspecto, se reduce un síntoma del tumor. En aún otro aspecto, se reduce el volumen del tumor.

En algunas realizaciones, se dan a conocer procedimientos para el tratamiento de un sujeto con un tumor. En algunos ejemplos no limitativos, se utiliza una cantidad eficaz terapéuticamente de cualquiera de las fracciones solubilizadas del hidrogel de ECM, tal como se da a conocer en el presente documento. En otros ejemplos no limitativos, se utiliza una cantidad eficaz terapéuticamente de cualquiera de las formas solubilizadas del hidrogel de ECM, tal como se da a conocer en el presente documento.

En ejemplos específicos no limitativos, el hidrogel de ECM es un hidrogel de ECM de vejiga urinaria. En otros ejemplos no limitativos, el hidrogel de ECM es un hidrogel de ECM de SIS. En algunas realizaciones, la administración reduce la proliferación de células tumorales, aumenta la apoptosis de células tumorales y/o disminuye la migración de células tumorales. La administración puede ser directamente al tumor. En ejemplos específicos no limitativos, el tumor es un glioma.

El tratamiento previo al desarrollo de la afección, tal como el tratamiento después de detectar displasia o una afección precursora temprana (benigna), se denomina en el presente documento tratamiento de un sujeto que está “en riesgo” de desarrollar la afección. En algunas realizaciones, la administración de una composición, tal como una fracción solubilizada de un hidrogel de ECM, o una composición farmacéutica que comprende la fracción soluble, se puede realizar durante o después de la aparición de las afecciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el sujeto no tiene esófago de Barrett. En otras realizaciones, el sujeto tiene esófago de Barrett. En algunos ejemplos, el sujeto tiene una displasia epitelial, por ejemplo, del cuello uterino, epitelio vaginal o anal, o displasia epitelial en la cavidad bucal o seno. En algunos ejemplos, la displasia epitelial ha aparecido o está en riesgo de aparecer debido a la infección con un virus del papiloma humano (VPH) oncógeno.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir la fracción soluble del hidrogel de ECM y/o el hidrogel de ECM solubilizado y, de manera opcional, uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales. Estas composiciones son útiles para tratar un tumor. Estas composiciones se pueden formular en una variedad de formas para la administración a un sujeto para afectar la proliferación de células en el tumor, o para retrasar, prevenir, reducir el riesgo de desarrollar, o tratar, o reducir la incidencia de metástasis de cualquier tumor de interés. Las composiciones descritas en el presente documento también se pueden formular para su aplicación, de modo que eviten la metástasis de una lesión inicial. En algunas realizaciones, las composiciones se formulan para administración local, tal como administración intratumoral. Por tanto, se dan a conocer composiciones farmacéuticas tanto para utilización local como para utilización sistémica, formuladas para su utilización en medicina humana o veterinaria. La administración local puede ser directamente en un tumor o en un sitio de resección del tumor.

Aunque los procedimientos y composiciones dados a conocer se utilizarán normalmente para tratar sujetos humanos, también se pueden utilizar para tratar enfermedades similares o idénticas en otros vertebrados, tales como otros primates, perros, gatos, caballos y vacas. Un médico puede determinar mejor un formato de administración adecuado para cada sujeto de manera individual. Diversos portadores aceptables farmacéuticamente y su formulación se describen en tratados de formulación estándar, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. Véase también Wang, Y. J. y Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report N.° 10, Suplemento 42: 2S, 1988. La forma de dosificación de la composición farmacéutica vendrá determinada por el modo de administración elegido.

En algunas realizaciones, cuando se administran de manera local en células en una zona afectada o un tejido de interés, tal como un tumor, las composiciones dadas a conocer reducen la proliferación de células tumorales, aumentan la apoptosis de células tumorales y/o reducen la migración de células tumorales. La administración local también puede ser mediante inyección directa en el tumor o mediante pulverización, cepillado u otra aplicación a un tumor o sitio de extirpación del tumor. En algunas realizaciones, se utiliza un vehículo de administración, tal como colágeno. También se pueden utilizar soportes biocompatibles, tales como mallas, en los que el soporte está recubierto con el hidrogel. La fracción soluble del hidrogel de ECM solubilizado o el hidrogel de ECM solubilizado se pueden administrar mediante cualquier vía, que incluye la administración parenteral, por ejemplo, inyección o infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal o intraarticular, o mediante administración sublingual, oral, tópica, intranasal o transmucosa, o mediante inhalación pulmonar. Un médico puede seleccionar la vía de administración adecuada en función de la presentación del tumor.

Cuando la fracción soluble de los hidrogeles de ECM solubilizados se proporciona como composiciones parenterales, por ejemplo, para inyección o infusión, en general, se suspenden en un portador acuoso, por ejemplo, en una solución tampón isotónica a un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 8,0, de manera preferente, a un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,4, tal como de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4. Entre los tampones útiles se incluyen citrato de sodio-ácido cítrico y fosfato de sodio-ácido fosfórico, y tampones de acetato de sodio-ácido acético.

Se puede utilizar una forma de preparación de liberación lenta de almacén o “de depósito”, de manera que se administren cantidades eficaces terapéuticamente de la preparación al torrente sanguíneo durante muchas horas o días después de la inyección o administración. Entre los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida se incluyen materiales poliméricos adecuados (tales como, por ejemplo, matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas), materiales hidrófobos adecuados (tales como, por ejemplo, una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, y derivados poco solubles (tales como, por ejemplo, una sal poco soluble). Las formulaciones de liberación sostenida se pueden administrar por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, geles, gotas o parche transdérmico), bucal, o como un aerosol oral o nasal, dependiendo de la ubicación del tumor. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de partículas que comprenden un polímero biodegradable y/o un polímero gelificante y/o bioadhesivo de polisacárido, un polímero anfifílico, un agente que modifica las propiedades de interfase de las partículas y una sustancia activa farmacológicamente. Estas composiciones presentan determinadas características de biocompatibilidad que permiten una liberación controlada de la sustancia activa. Véase la Patente de US5,700,486.

Los portadores y excipientes aceptables farmacéuticamente útiles en los procedimientos dados a conocer son convencionales. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que son vehículos fluidos aceptables farmacéutica y fisiológicamente, tales como agua, solución salina fisiológica, otras soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares. Entre los excipientes que se pueden incluir se encuentran, por ejemplo, proteínas, tales como albúmina de suero humano o preparaciones de plasma. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán. Los procedimientos reales para preparar dichas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en la materia.

La cantidad administrada del compuesto o compuestos activos dependerá del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la afección y la forma de administración, y es mejor dejarlo a juicio del médico a cargo. Dentro de estos límites, la formulación a administrar contendrá una cantidad de componente o componentes activos en cantidades eficaces para conseguir el efecto deseado en el sujeto que se esté tratando. Se contemplan múltiples tratamientos, tales como en intervalos de tiempo definidos, tales como de manera diaria, quincenal, semanal, bimensual o mensual, de manera que se consiga una administración crónica. La administración puede comenzar siempre que se desee la supresión o prevención de la enfermedad, por ejemplo, a cierta edad de un sujeto, o antes de una exposición ambiental.

La dosis exacta es determinada fácilmente por un experto en la materia basándose en la potencia de la fracción específica, la edad, el peso, el sexo y el estado fisiológico del sujeto.

Se pueden administrar agentes adicionales, tales como una citocina, una quimiocina o un agente quimioterapéutico. Estos pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas dadas a conocer. Se puede administrar una citocina, tal como una interleucina (IL) o un interferón, tal como el interferón (IFN), tal como IL-1p, IL6, IL-10, IFN-a, IFN-p o IFN y. En un ejemplo, para la prevención y el tratamiento de tumores, se puede administrar al sujeto un tratamiento quirúrgico. En un ejemplo, esta administración es secuencial. En otros ejemplos, esta administración es simultánea. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se encuentran agentes alquilantes, antimetabolitos, productos naturales u hormonas y sus antagonistas. Entre los ejemplos de agentes alquilantes se incluyen mostazas nitrogenadas (tales como mecloretamina, ciclofosfamida, melfalán, mostaza de uracilo o clorambucilo), sulfonatos de alquilo (tales como busulfán), nitrosoureas (tales como carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina o dacarbazina). Entre los ejemplos de antimetabolitos se incluyen análogos de ácido fólico (tales como metotrexato), análogos de pirimidina (tales como 5-FU o citarabina) y análogos de purina, tales como mercaptopurina o tioguanina. Entre los ejemplos de productos naturales se incluyen alcaloides de la vinca (tales como vinblastina, vincristina o vindesina), epipodofilotoxinas (tales como etopósido o tenipósido), antibióticos (tales como dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicamicina o mitocicina C) y enzimas (tales como L-asparaginasa). Entre los ejemplos de agentes diversos se incluyen complejos de coordinación de platino (tales como cis-diamina-dicloroplatino II, también conocido como cisplatino), ureas sustituidas (tales como hidroxiurea), derivados de metilhidrazina (tales como procarbazina) y supresores corticosuprarrenales (tales como mitotano y aminoglutetimida). Entre los ejemplos de hormonas y antagonistas se incluyen adrenocorticosteroides (tales como prednisona), progestinas (tales como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de magestrol), estrógenos (tales como dietilestilbestrol y etinil estradiol), antiestrógenos (tales como tamoxifeno) y andrógenos (tales como propionato de testosterona y fluoximesterona). Entre los ejemplos de los medicamentos para quimioterapia más utilizados se incluyen adriamicina, alkeran, Ara-C, BiCNU, busulfán, CCNU, carboplatino, cisplatino, citoxano, daunorrubicina, DTIC, 5-FU, fludarabina, hydrea, idarrubicina, ifosfamida, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, mostaza nitrogenada, taxol (u otros taxanos, tales como docetaxel), velban, vincristina, VP-16, mientras que entre algunos medicamentos más nuevos se incluyen gemcitabina (Gemzar), herceptin, irinotecán (Camptosar, CPT-11), leustatina, navelbine, rituxan STI-571, taxotere, topotecán (Hycamtin), xeloda (Capecitabina), zevalin y calcitriol. Entre los ejemplos no limitativos de inmunomoduladores que se pueden utilizar se incluyen AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), bropirimina (Upjohn), interferón gamma (Genentech), GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; Genetics Institute), IL-2 (Cetus o Hoffman-LaRoche), inmunoglobulina humana (Cutter Biological), IMREG (de Imreg of New Orleans, La.), S^k&F 106528 y TNF (factor de necrosis tumoral; Genentech).

La presente divulgación se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos:

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Producción de una fracción soluble

Preparación de matriz de vejiga urinaria: Se adquirieron vejigas urinarias porcinas de cerdos con peso de mercado (110-130 kg) como subproducto de la producción comercial rutinaria. La matriz extracelular de este tejido, denominada UBM, se preparó tal como se ha descrito previamente (Freytes et al, J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2006; 78: 327-33). De manera resumida, se extrajeron de manera mecánica la túnica serosa, la túnica muscular externa, la túnica submucosa y la mayor parte de la túnica de mucosa muscular y las células uroteliales luminales de la túnica mucosa se disociaron enjuagando en agua estéril. El tejido restante consistía en la membrana basal, la túnica propria subyacente de la túnica mucosa y cualquier célula residente en estas capas. La matriz se descelularizó mediante agitación en ácido peracético al 0,1 % con etanol al 4 % durante 2 horas a alta velocidad, seguida de un enjuague intenso con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y agua estéril. La descelularización se verificó mediante tinción nuclear con 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Fisher Scientific, Waltham, MA) y cuantificación del ADN remanente (Crapo et al., Biomaterials 2011; 32: 3233-43). A continuación, la UBM se liofilizó en una lámina seca y se molió en partículas utilizando un molino de Wiley con un tamiz de malla #60 (Gilbert et al., Biomaterials 2005; 26: 1431 -5) o se dejó como una lámina seca.

Preparación de ECM esofágica: Se adquirieron esófagos porcinos de cerdos de peso comercial (110-130 kg) como subproducto de la producción comercial rutinaria. La matriz extracelular de este tejido, denominada eECM, se preparó tal como se ha descrito previamente (Keane et al, Tissue Eng Part A 2015; 21(17-18): 2293-30). Los esófagos porcinos se almacenaron a -20 oC y se descongelaron durante una noche a 4 oC. La eECM se preparó separando de manera mecánica las capas de mucosa y submucosa de la capa muscular externa subyacente. La mucosa y la submucosa se descelularizaron con las siguientes etapas: tripsina al 1 % (Amresco)/EDTA al 0,05 % (Sigma) durante 1 hora a 37 oC en una placa oscilante, agua tipo 1 durante 15 minutos, sacarosa 1 M (Sigma) durante 30 minutos, agua tipo 1 durante 30 minutos, Triton X-100 al 3,0 % (Sigma) durante 48 horas, agua tipo 1 durante 15 minutos, PBS durante 15 minutos, desoxicolato de sodio al 10 % (Sigma) durante 4 horas, agua tipo 1 durante 30 minutos, ácido peracético (PAA, peracetic acid) al 0,1 % (Rochester Midland) en etanol al 4 % durante 4 horas, ADNasa 100 U/ml (Invitrogen) durante 2 hora en una placa oscilante y lavados de 15 minutos con PBS, agua tipo 1 , PBS y agua tipo 1 para crear eECM. Todas las etapas de descelularización se realizaron a 300 rpm a temperatura ambiente en una placa agitadora.

Preparación de ECM de submucosa del intestino delgado (SIS): Se adquirieron intestinos delgados porcinos de cerdos de peso comercial (110-130 kg) como un subproducto de la producción comercial rutinaria. La SIS se preparó mediante la extracción de manera mecánica de las capas superficiales de la túnica mucosa, la túnica serosa y la túnica muscular externa del intestino delgado intacto, dejando intactas la submucosa, la mucosa muscular y el estrato basilar compacto de acuerdo con un protocolo de descelularización establecido previamente (Badylak et al. Biomaterials 1999; 20: 2257). A continuación, la SIS se sometió a ácido peracético al 0,1 % en etanol al 4,0 % durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación en una placa agitadora a 300 rpm.

Preparación de ECM de la dermis: Se recogió piel de grosor total del flanco dorsolateral porcino inmediatamente después del sacrificio. La matriz extracelular de este tejido, denominada dermis, se preparó tal como se ha descrito previamente (Reing et al. Biomaterials. 2010; 31(33): 8626-33). Se cortaron láminas de piel de grosor completo en rectángulos de 6 cm x 10 cm y posteriormente se dividieron para extraer la grasa subcutánea, el tejido conectivo y la epidermis suprayacente, dejando las capas reticular y papilar de la dermis. Los lavados consecutivos con tripsina, peróxido de hidrógeno, Triton X-100 y e Dt A y ácido peracético lograron la descelularización.

Preparación de ECM testicular: Se adquirieron testículos porcinos de Tissue Source (Lafayette, Indiana) y se almacenaron a -20 oC. Los testículos congelados se descongelaron en agua corriente tibia, se cortaron en rodajas de 4 mm, se enjuagaron con agua tipo I, que se reemplazó cada 20 a 60 minutos hasta que el agua permaneció incolora, se decapsularon y se agitaron en una solución de EGTA al 0,02 % y al 0,05 % a 37 oC durante 2,5 horas. A continuación, el tejido se agitó a temperatura ambiente en dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,075 % durante 24 horas; la solución de SDS se reemplazó con una solución nueva a las 12 horas. El tejido se enjuagó con agua tipo 1 durante 20 minutos, seguida de PBS durante 20 minutos, agua tipo 1 durante 20 minutos y PBS durante 20 minutos. A continuación, el tejido se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas en TX-100 al 1 % y se enjuagó de nuevo con agua/PBS/agua/PBS durante 20 minutos cada vez. A continuación, el material se lavó en PPA al 0,1 % y EtOH al 4 % durante 2 horas y se enjuagó con agua/PBS, tal como se ha descrito anteriormente.

Preparación de ECM solubilizada con pepsina: La ECM se digirió de manera enzimática, tal como se ha descrito previamente (Freytes et al., Biomaterials 2008; 29: 1630-7) con pepsina mezclando UBM o eECM (10 mg/ml) liofilizadas en polvo y pepsina (1 mg/ml) en HCl 0,01 M (pH 2,0). Esta solución se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. Después de agitar, la suspensión de UBM se neutralizó hasta un pH de 7,4 en 1X PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, fosfato 12 mM, Fisher Scientific, Waltham, MA) para inactivar la pepsina y preparar el material para ensayos de cultivo celular. Una solución de pepsina (1 mg/ml) en HCl 0,01 M, tratada de la misma manera que la muestra de UBM, sirvió como condición de control para todos los experimentos. Todos los materiales se almacenaron a -80 oC hasta su utilización.

Fraccionamiento de ECM solubilizada con pepsina: El producto de digestión de ECM neutralizado se incubó a 37 oC para inducir la gelificación. A continuación, el hidrogel de ECM se centrifugó a 25.000 xg durante 30 minutos para comprimir los componentes estructurales insolubles del armazón en un sedimento, dejando un sobrenadante transparente por encima del sedimento. El sedimento de gel que contenía los componentes estructurales se recogió y se resuspendió hasta el volumen inicial en 1X PBS. Debido a la insolubilidad del sedimento de gel, la suspensión del sedimento de gel se pipeteó enérgicamente a través de una punta de pipeta de 10 |j.l para homogeneizar el material tanto como fuera posible. La suspensión homogeneizada se almacenó a -80 oC hasta su utilización. Se extrajo el sobrenadante transparente que contenía los componentes solubles y se liofilizó hasta sequedad. El sobrenadante seco se rehidrató en un 10 % de su volumen original con agua estéril para llevar la concentración de PBS de 1X a 10X. Los componentes solubles rehidratados se centrifugaron a 20.000 xg para aclarar la solución. El sobrenadante de este centrifugado final se extrajo, se diluyó hasta el volumen inicial y se almacenó a 80 oC hasta su utilización. La dilución al volumen inicial para ambos componentes fraccionados permitió la comparación directa de la actividad biológica de las fracciones utilizando el mismo factor de dilución para todos los materiales.

Preparación de la fracción soluble de ECM mediante extracción con sal: Se incubaron 10 mg de UBM en 10 ml de NaCl 0,154 molar en un recipiente cónico durante 24 horas a 22 oC en un agitador orbital. Después de la incubación, la muestra se centrifugó a 10.000 xg durante 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 micras y se liofilizó. La fracción soluble en solución salina liofilizada se resuspendió en 10 ml de agua ultrapura y se desalinizó utilizando una columna con un corte de peso molecular de 10 kDa mediante centrifugación a 5.000 xg durante 30 minutos. El eluato se descartó y el volumen de la fracción soluble desalinizada se ajustó a 1 ml utilizando agua ultrapura, lo que produjo una solución de fracción soluble en solución salina de UBM (u Bm -SF) designada como una concentración 10X.

Ejemplo 2

Resultados

La fracción soluble de la ECM solubilizada con pepsina moduló el fenotipo de células primarias de glioma humano. Las células primarias de glioma humano reaccionan con la ECM solubilizada con pepsina de diversos tejidos de origen en 24 horas. Estos efectos no pueden atribuirse a la presencia de pepsina, tal como se muestra por el control con pepsina que coincide con el control con medio. El tratamiento con SIS y UBM provoca una reducción drástica de las células de glioma viables, lo que sugiere que estos entornos con ECM reducen las tasas de proliferación de las células de glioma o hacen que experimenten la muerte celular, o ambas cosas (figura 1).

El hidrogel de ECM moduló el fenotipo de células de cáncer de esófago. Las células de cáncer de esófago OE33 mostraron un cambio fenotípico sorprendente después de 24 horas de tratamiento con UBM solubilizada con pepsina con la aparición de “puentes celulares” (indicados por flechas) que estaban ausentes en el control con pepsina o medio. El fenotipo también es distinto del control positivo de TGFp-1, un inductor conocido de la migración de células cancerosas (figura 2).

El hidrogel de ECM disminuyó la proliferación de adenocarcinoma esofágico. El efecto de las UBM o eECM solubilizadas sobre la proliferación de células Het-1A, CP-A y EAC (OE33, SK-GT-4) se evaluó utilizando un ensayo de proliferación de BrdU. Se muestran gráficos representativos de las réplicas biológicas (n = 3) (figuras 3A-D). Las UBM-ECM disminuyeron la proliferación de células cancerosas OE33 en comparación con el control con pepsina (p = 0,0008, figura 3C), pero no mostraron cambios en la proliferación en comparación con el control con pepsina para las células Het-1A (figura 3A), CP-A (figura 3B) o células SK-GT-4 (figura 3D). La eECM disminuyó la proliferación de todos los tipos de células en comparación con el control con pepsina: Het-1A (p < 0,0001), CP-A (p < 0,0001), OE33 (0,0003) y SK-GT-4 (p < 0,0001) (figuras 3A-3D).

En comparación con los tipos de tejido de ECM, eECM disminuyó de manera significativa la proliferación de todos los tipos de células en comparación con UBM-ECM para Het-1 A (p < 0,0001, figura 3A), CP-A (p < 0,0001, figura 3B) y SK-GT-4 (p < 0,0001, figura 3D). No hubo diferencia entre eECM y UBM-ECM para disminuir la proliferación de células OE33 (figura 3C). Por tanto, la ECM esofágica se utilizó en particular para tratar el cáncer de esófago.

Las UBM y eECM solubilizadas con pepsina aumentaron la apoptosis de las células metaplásicas (figuras 4A-4D). El efecto de la ECM solubilizada sobre la apoptosis se determinó utilizando una tinción dual de yoduro de propidio (PI) y anexina V. El factor multiplicador de cambio de las células apoptóticas tempranas y tardías con un tratamiento con UBM o eECM solubilizadas con pepsina en comparación con pepsina se muestra para Het-1A (figura 4A), CP-A (figura 4B), OE33 (figura 4C) y SK-GT-4 (figura 4D). Para las células CP-A, el tratamiento con UBM-ECM aumentó la apoptosis tardía (p = 0,0095) en comparación con el control con pepsina, y el tratamiento con eECM tendió a aumentar la apoptosis tardía en comparación con el control con pepsina (p = 0,0756). Las UBM y eECM no mostraron diferencias para la apoptosis temprana o tardía en células Het-1A, OE33 o ^s K-GT-4 en comparación con el control con pepsina. Los resultados mostraron que UBM aumentaba la apoptosis de una célula precursora de cáncer de esófago.

Los hidrogeles de ECM se pueden separar en partes constituyentes. En un ejemplo específico no limitativo, esta figura presenta un procedimiento para dividir un hidrogel de UBM en componentes estructurales y solubles, o en componentes de alta y baja densidad, mediante centrifugación (figura 5). El producto de digestión de ECM neutralizado se incubó a 37 oC para inducir la gelificación. A continuación, el hidrogel de ECM se centrifugó a 25.000 xg durante 30 minutos para comprimir los componentes estructurales insolubles del armazón en un sedimento, dejando un sobrenadante transparente por encima del sedimento. El sedimento de gel que contenía los componentes estructurales se recogió y se resuspendió hasta el volumen inicial en 1X PBS. Debido a la insolubilidad del sedimento de gel, la suspensión del sedimento de gel se pipeteó enérgicamente a través de una punta de pipeta de 10 |j.l para homogeneizar el material tanto como fuera posible. La suspensión homogeneizada se almacenó a 80 oC hasta su utilización. Se extrajo el sobrenadante transparente que contenía los componentes solubles y se liofilizó hasta sequedad. El sobrenadante seco se rehidrató en un 10 % de su volumen original con agua estéril para llevar la concentración de PBS de 1X a 10X. Los componentes solubles rehidratados se centrifugaron a 20.000 xg para aclarar la solución. El sobrenadante de este centrifugado final se extrajo, se diluyó hasta el volumen inicial y se almacenó a -80 oC hasta su utilización. La dilución al volumen inicial para ambos componentes fraccionados permitió la comparación directa de la actividad biológica de las fracciones utilizando el mismo factor de dilución para todos los materiales.

La línea celular de microglía no neoplásica no se vio afectada por UBM-SF. Las células CHME5 tratadas con concentraciones crecientes de UBM-SF aparentemente crecieron con normalidad. Por tanto, los tipos de células no neoplásicas no resultaron dañados (y a menudo se beneficiaron) por la presencia de ECM no neoplásica añadida a los medios de cultivo (figura 6).

La fracción soluble en solución salina de UBM (UBMSF) disminuyó el recuento de células de glioma de una manera dependiente de la dosis a la vez que apoyaba a las células de microglía. Los datos de recuento de células mostraron que las concentraciones crecientes de ^u B^m -SF redujeron el número total de células primarias de glioma humano de grado alto (1015) y grado bajo (1119), mientras que una línea celular de microglía (CHME5) crece sin verse afectada, lo que sugiere que la U^b M-S^f posee actividad oncolítica, en comparación con actividad pancitotóxica (figura 7). Véanse también las figuras 10, 20, 21 y 23-25.

La UBM-SF disminuyó la migración de células de glioma. En un ensayo de raspado clásico (Liang et al. Nature Protocols. 2007; 2: 329-333), las células de glioma expuestas a UBM-SF muestran una migración reducida en 24 horas en comparación con un control con medio (figura 8). Véanse también las figuras 14A-14D, que muestran un ensayo de raspado.

La fracción soluble en solución salina de los bioarmazones de ECM y las vesículas unidas a la membrana (MBV) obtenidas de los bioarmazones de ECM inhibieron la viabilidad de las células de cáncer de esófago. El efecto de la fracción soluble en solución salina de los bioarmazones de ECM y MBV sobre la viabilidad se evaluó mediante un ensayo de MTT. Las células OE33 y OE19 mostraron una disminución de la viabilidad con UBM SFF, MBV de colagenasa (cMBV) y MBV de elastasa (eMBV) en comparación con el control (figura 9).

Las fracciones solubles en solución salina de los bioarmazones de ECM disminuyeron la viabilidad celular de glioma, pero no la de las células no neoplásicas. Las fracciones solubles de ECM dérmica, SIS y UBM disminuyeron, en orden de potencia creciente, la viabilidad de las células de glioma. Estos mismos componentes de la ECM no disminuyeron la viabilidad de las células de la microglía (CHME5) o los neuroblastos (N1E-115). Esto sugiere que la UBM-SF posee una actividad oncolítica preferencial en comparación con la actividad pancitotóxica (figura 10). En las figuras 7, 20, 21 y 23-25 se muestran resultados adicionales.

La composición proteica del entorno de la ECM es compleja y variada según el tejido de origen. Los efectos diferenciales de la ECM del tejido de origen sobre las células pueden explicarse, como mínimo, de manera parcial, por las composiciones proteicas diferenciales de esos tejidos de origen. Tal como se muestra en la figura 11, la firma proteica es compleja.

La formación de colonias de glioma fue inhibida por UBM-SF de una manera dependiente de la dosis. La formación de colonias en agar blando (0,5 %) es un ensayo aceptado en la técnica para el cribado in vitro de fármacos quimioterapéuticos. Los resultados se muestran en las figuras 12A-12C para N = 2 de dos células primarias de glioma humano de alto grado (0319, 1015) y una de bajo grado (1119). Fue evidente que la formación de una gran colonia se produjo dentro de las 16 horas posteriores al cultivo de células en placas de agar. Sin embargo, esto se interrumpió en presencia de UBM-SF (figura 12A). En puntos de tiempo posteriores, este efecto disruptivo de las colonias dependía de la concentración de UBM-SF presente y esta tendencia se mantuvo para cada tipo de célula de glioma probado (figuras 12B y 12C).

pERK1/2 fue regulada por incremento en células de glioma tratadas con UBM-SF. Las propiedades oncolíticas/oncoestáticas mostradas por UBM-SF pueden explicarse por la modulación de la vía Ma Pk/ERK. Tal como se muestra en la figura 13, existe un aumento de pERK1/2 en células de glioma después del tratamiento con UBM-SF. Se ha observado que la regulación por incremento de pERK reduce la proliferación de células de glioma (Chen et al. PLoS ONE. 2014; 9(1): e87281).

La UBM-SF disminuyó la migración de células de glioma en puntos de tiempo tempranos y provoca la muerte celular en puntos de tiempo posteriores. Se probaron dos tipos de células de glioma de alto grado (0310, 1015) y uno de bajo grado (1119) en un ensayo de raspado clásico (figuras 14A-14D). Las células se trataron previamente con medios sin suero con o sin 3X UBM-SF, se introdujo el raspado y, a continuación, se introdujeron los grupos de tratamiento (correspondientes al primer símbolo, la flecha hacia la derecha “W y el segundo símbolo en la parte superior de cada columna). 0 % designa un medio sin suero y 3X indica UBM-SF a una concentración de 3 mg/ml medida mediante un espectrofotómetro. A tiempo 0, inmediatamente después del raspado, se observó que todas las condiciones eran esencialmente idénticas (figura 14A). Veinticuatro horas (24 horas) después, era evidente que las células que recibieron medio sin suero estaban migrando para rellenar el raspado mucho más rápidamente que las células expuestas a UBM-SF (figura 14B). A las 48 horas, determinados grupos que recibieron UBM-SF estaban obviamente muertos; las células en el control con medio continuaban migrando y rellenando el raspado. A las células que recibieron UBM-SF que no estaban muertas se les había detenido la migración (figura 14C). A las 96 horas después del tratamiento, todas las células de glioma que recibieron UBM-SF están muertas (figura 14D).

Migración de células de glioma mitigada por UBM-SF. La migración de células de glioma en presencia de UBM-SF se midió mediante un ensayo de cámara de Boyden. Se demostró que las células 1015 de alto grado eran destruidas por UBM-SF en puntos de tiempo tempranos y, de este modo, no se observó migración. Se demostró que las células 1119 de bajo grado migran menos hacia FBS al 10 % en presencia de UBM-SF cuando se tratan previamente con FBS al 0 %. De forma similar, las células 1119 tratadas previamente con UBM-SF en medio de FBS al 0 % no migraron en absoluto hacia FBS al 10 %, quizás debido a la muerte celular (figura 15).

La ECM solubilizada con pepsina disminuyó el metabolismo de las células de adenocarcinoma esofágico. El efecto de la ECM solubilizada sobre la actividad metabólica de las células normales, de Barrett y de EAC se evaluó utilizando un ensayo de MTT. Se muestran gráficos representativos de las réplicas biológicas (n = 3) (figuras 16A-D). Las UBM y eECM no afectaron la actividad metabólica de las células Het-1A (figura 16A) o CP-A (figura 16B) en comparación con el control con pepsina. La UBM disminuyó la actividad metabólica de las células OE33 (p = 0,0001, figura 16C) y SK-GT-4 (p = 0,0035, figura 23D) en comparación con el control con pepsina. La UBM también disminuyó la actividad metabólica de las células ^o E33 (p < 0,0001, figura 16C) y SK-GT-4 (p = 0,0024, figura 16D) en comparación con eECM.

Las UBM y eECM solubilizadas regularon por disminución las vías de señalización de células de cáncer de esófago. Se utilizó el análisis del transcriptoma completo para identificar la firma genética de las células normales Het-1A y las células de cáncer epitelial esofágico OE33 tratadas con UBM o eECM en comparación con el control negativo con pepsina durante 24 horas. Los genes que se expresaron de forma diferencial (definida como un factor de multiplicación de cambio mayor o menor que 2 veces con significación mediante ANOVA de una vía, p < 0,05) se analizaron utilizando un análisis de señalización de vías insesgado para identificar las principales vías de señalización. De manera destacada, las principales vías expresadas de forma diferencial reguladas por el tratamiento con UBM y eECM en comparación con el control negativo con pepsina están relacionadas con la progresión del cáncer. La eECM reguló por disminución la adhesión focal-PI3K-Akt-mTOR, el ciclo celular y la replicación del ADN, y reguló por incremento la autofagia (muerte controlada de células cancerosas), con un efecto neto de fenotipo de células de cáncer esofágico reguladoras por disminución (figura 17).

Validación mediante qPCR del análisis transcriptómico completo. Los resultados mostrados en la figura 17 fueron validados utilizando qPCR (figura 18). Para la señalización de adhesión focal-PI3K-Akt-mTOR en células OE33, el tratamiento con eECM reguló por incremento 3 reguladores negativos (ULK1, TSC2, PIK3IP1) y reguló por disminución 1 regulador positivo (HRAS). La UBM-ECM reguló por disminución 1 regulador negativo (DDIT4) y 1 regulador positivo (SLC2A3). Para la señalización de adhesión focal-PI3K-Akt-mTOR en células Het1-A, el tratamiento con eECM aumentó 4 reguladores negativos (DDIT4, ULK1, FOXO3A, TSC2) y aumentó 2 reguladores positivos (RICTOR, SLC2A3).

Para la señalización de autofagia en células OE33, la eECM reguló por incremento 2 reguladores positivos (ULK1, MAPILC3E) y reguló por disminución 4 reguladores/genes negativos (HRAS, E2F1, CDK2, PCNA). Para la señalización de autofagia en células Het-1A, la eECM aumentó el supresor de tumores ULK1, los marcadores de proliferación PCNA y E2F1, y los genes relacionados con la autofagia MAPILC3B y GABARAPL2.

Para las vías del ciclo celular y replicación del ADN, muchos genes se solaparon. Para la señalización del ciclo celular, la eECM reguló por disminución nueve reguladores positivos en las células OE33 (CDC6, CDK2, MCM4, MCM7, PCNA, CCNE2, CDC45, CDK1, MCM6) y reguló por incremento cinco reguladores positivos en las células Het-1A (CDC6, MCM4, MCM7, PCNA, MCM6). Para la señalización de la replicación del ADN en células OE33, la eECM reguló por disminución ocho reguladores positivos (RPA2, CDC6, PRIM1, CDK2, MCM4, MCM7, PCNA, MCM6) y reguló por incremento siete reguladores positivos en células Het-1A (RPA2, CDC6, PRIM1, MCM4, MCM7, PCNA, MCM6).

Las UBM y eECM solubilizadas con pepsina redujeron la expresión de la proteína AKT fosforilada en las células OE33 y aumentaron la AKT fosforilada en las células Het-1A. Se realizó una inmunotransferencia Western en los lisados de OE33 y Het-1A para pAKT, un regulador clave aguas arriba de la proliferación, el ciclo celular y el metabolismo. Las células OE33 y las células Het-1A no mostraron cambios en pAKT en el control con pepsina. Las células OE33 mostraron una regulación por disminución en la expresión de pAKT con el tratamiento con UBM a las 24 horas y una regulación por disminución en la expresión de pAKT con el tratamiento con eECM a las 6 y 24 horas (figura 19A). Por el contrario, las células Het-1A mostraron una regulación por incremento en la expresión de pAKT con el tratamiento con UBM y eECM a las 6 y 24 horas (figura 19B).

Se ha demostrado que PI3K-Akt-mTOR está regulada por incremento en muchos cánceres, incluida la progresión de BE a EAC. PI3K-Akt es una vía de señalización de EAC, pero también se ha demostrado que su activación es vital en los procedimientos de cicatrización de heridas en células no malignas. La regulación opuesta de AKT fosforilada en células Het-1A y OE33 en respuesta a los mismos estímulos de hidrogel de ECM es un resultado favorable para un tratamiento que promueve la reconstrucción de tejidos en una situación de cáncer previo.

La UBM-SF provocó la muerte de células de glioma a través de la apoptosis mediada por caspasa-3. El vídeo a cámara rápida se adquirió mediante la formación de imágenes de células cada 20 minutos durante 12 horas. Las células de glioma (0319) que recibieron UBM-SF experimentaron muerte celular, mientras que los fibroblastos de prepucio humano continuaron creciendo y dividiéndose. La adición del reactivo NUCVIEW™, escindido de manera específica por caspasa-3, a los pocillos reveló que las células de glioma experimentaron apoptosis mediada por caspasa-3, mientras que no se observó apoptosis en las células de fibroblastos (figura 20).

La UBM-SF destruyó gliomas primarios humanos y una línea celular de glioma establecida, a la vez que apoyaba el crecimiento de astrocitos primarios. La viabilidad celular se midió mediante un ensayo fluorescente vivo/muerto y, a continuación, se cuantificó utilizando Cell Profiler. Los astrocitos primarios permanecieron viables, mientras que un tipo de célula primaria de glioma humano (0319) y una línea celular de glioma establecida (U-87MG) experimentaron muerte celular cuando se trataron con UBM-SF (figura 22A). Esta observación se cuantificó mediante Cell Profiler y los astrocitos primarios tratados con UBM-SF proliferaron de manera significativa más que el control con medio en 24 horas, mientras que las poblaciones de células de glioma se redujeron de manera significativa (figura 22B). La UBM-SF disminuyó la viabilidad de las células de cáncer de pulmón y de mama y apoya las células epiteliales de mama normales. Las células de cáncer de pulmón y HeLa mostraron una disminución de la viabilidad dependiente de la dosis cuando se trataron con UBM-s F, mientras que las células epiteliales de mama normales permanecieron prácticamente sin cambios. Por tanto, la ECM de mamífero (de manera específica, la fracción extraída con solución salina de UBM liofilizada) poseía propiedades oncolíticas en muchos tipos de células cancerosas (figura 23).

La UBM-SF mostró una ventana terapéutica para dirigirse a las células de glioma, a diferencia de la temozolomida (TMZ). Cuando los pocillos no neoplásicos y con glioma se trataron con el agente alquilante, TMZ, el agente de referencia actual en el tratamiento de pacientes con glioma de grado IV, se observó que todas las células morían a tasas similares de manera dependiente de la dosis. Sin embargo, cuando estas mismas células se trataron con concentraciones crecientes de UBM-SF, las células no neoplásicas siempre sobrevivieron en mayor número que las células de glioma, mostrando así la presencia de una ventana terapéutica para UBM-SF (figura 24).

Múltiples subfracciones de UBM-SF conservaron propiedades antiglioma. La UBM-SF se subdividió en subfracciones mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando Sepharose CL-6B. Las fracciones se agruparon y se utilizaron para tratar células de microglía (CHME5), fibroblastos primarios de prepucio humano (HFF), un tipo de célula de glioma de alto grado (0319) y un tipo de célula de glioma de bajo grado (1119). Múltiples fracciones agrupadas conservaron las propiedades antiglioma de la solución original, mientras que también apoyaban a las células no neoplásicas (figura 25).

En vista de las muchas realizaciones posibles a las que se pueden aplicar los principios de la presente invención dada a conocer, debe admitirse que las realizaciones ilustradas son solo ejemplos preferentes de la presente invención y no deben considerarse como limitativas del alcance de la presente invención. Más bien, el alcance de la presente invención está definido por las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo y un portador aceptable farmacéuticamente, para su utilización en el tratamiento de un tumor en un sujeto.

2. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o la fracción soluble del mismo para su utilización, según la reivindicación 1, en el que la fracción soluble se produce mediante las siguientes etapas:

a. digerir parcial o completamente la matriz extracelular (ECM) descelularizada de un tejido para producir un material de ECM digerido;

b. neutralizar el material de ECM digerido hasta un pH de 7,2 a aproximadamente 7,4 para producir un material de ECM neutralizado y digerido;

c. gelificar el material de ECM neutralizado y digerido a una temperatura por encima de su temperatura crítica inferior de solución para producir un material de ECM gelificado;

d. centrifugar el material de ECM gelificado para producir un sedimento y un sobrenadante; y

e. aislar el sobrenadante, que es la fracción soluble del hidrogel de ECM solubilizado.

3. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según la reivindicación 2, en el que la ECM descelularizada no se dializa antes de digerir parcial o completamente la ECM descelularizada.

4. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el tumor es un tumor sólido.

5. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, segú reivindicación 4, en el que el tumor sólido es un glioma, un cáncer de pulmón o un cáncer de mama.

6. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, segú reivindicación 5, en el que el tumor es un glioma, y en el que el glioma es un ependimoma, un astrocitoma, un oligodendroglioma, un glioma del tronco encefálico, un glioma del nervio óptico glioma o un glioma mixto.

7. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la ECM es una ECM de vejiga urinaria.

8. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según la reivindicación 4, en el que la ECM es ECM esofágica y en el que el tumor sólido es un adenocarcinoma esofágico.

9. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o la fracción soluble del mismo es para la administración local al tumor.

10. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en el que tratar el tumor comprende disminuir el volumen del tumor; disminuir el número o tamaño de las metástasis; o disminuir un síntoma del tumor.

11. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que tratar el tumor comprende reducir la proliferación de células tumorales, aumentar la apoptosis de células tumorales y/o disminuir la migración de células tumorales.

12. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que un agente quimioterapéutico adicional es para la administración conjunta con el hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o la fracción soluble del mismo.

13. Hidrogel de matriz extracelular (ECM) solubilizado o fracción soluble del mismo para su utilización, según la reivindicación 1, en el que la ECM es una matriz extracelular de vejiga urinaria, y el tumor es un glioma, un cáncer de mama o un cáncer de pulmón.