CN109867802A

CN109867802A - 一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法

Info

Publication number: CN109867802A
Application number: CN201910174565.4A
Authority: CN
Inventors: 贾瑞鹏; 周六化; 周昌成; 赵峰; 秦志强; 徐忠乐; 许露伟
Original assignee: Nanjing First Hospital
Current assignee: Nanjing First Hospital
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2019-06-11

Abstract

本发明公开了一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，涉及生物活性水凝胶制备方法相关领域，为解决现有技术中的现存的细胞外基质获得方法多洗脱不充分或对ECM损伤较大，且膀胱源性ECM水凝胶的制备目前没有报道的问题。包括如下步骤：步骤一：取新鲜猪膀胱，保留输尿管和尿道结构，以3000ml双蒸水浸泡冲洗2h；步骤二：锡箔纸包裹后，迅速放置于负80℃冰箱速冻1小时，后取出平衡至室温；步骤三：重复步骤二两次；步骤四：双蒸水灌注浸泡4h，并将整个膀胱浸入灌注液中；步骤五：1%Triton X‑100灌注浸泡4h，并将整个膀胱浸入1%Triton X‑100灌注液中，随后予以双蒸水充分冲洗20min。

Description

一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及生物活性水凝胶制备方法相关领域，具体为一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法。

背景技术

近年来的研究表明，干细胞在促进血管内皮新生、修复膀胱平滑肌损伤等方面显示出了较好的临床应用前景。目前，用于治疗膀胱损伤的干细胞移植方式包括两种，即1）经外周血管注射，包括膀胱动脉、膀胱静脉注射；2）局部注射，包括膀胱壁注射。研究发现，经外周血管注射为一种较为便捷的干细胞移植方式，然而，外周血管注射时，进入靶器官中的干细胞数量较少，且有导致全身不良反应，干细胞滞留于其它脏器的可能。而经膀胱动脉注射干细胞虽可直达损伤膀胱组织，但有导致血管阻塞以及膀胱局部坏死的可能。经膀胱壁注射，虽可使干细胞直达受损膀胱，不引起膀胱微血管阻塞，却有导致干细胞丢失、凋亡以及膀胱组织坏死的可能，且移植的干细胞存活率较低。因此，有待进一步探索增强干细胞移植效率的新方法。

ECM，即细胞外基质（Extracellular matrix），是一种由细胞合成、分泌的包含胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等的复杂网状结构，富含多种生物活性因子，在细胞粘附、增殖、存活以及组织结构的维系中具有重要作用。细胞外基质（ECM）水凝胶可显著提高干细胞的滞留率和存活率，增强干细胞的组织修复能力。但现存的细胞外基质获得方法，多洗脱不充分或对ECM损伤较大，且膀胱源性ECM水凝胶的制备，目前尚没有报道；因此市场急需研制一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法来帮助人们解决现有的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，以解决上述背景技术中提出的现存的细胞外基质获得方法多洗脱不充分或对ECM损伤较大，且膀胱源性ECM水凝胶的制备目前没有报道的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：取新鲜猪膀胱，保留输尿管和尿道结构，以3000ml双蒸水浸泡冲洗2h；

步骤二：锡箔纸包裹后，迅速放置于负80℃冰箱速冻1小时，后取出平衡至室温；

步骤三：重复步骤二两次；

步骤四：双蒸水灌注浸泡4h，并将整个膀胱浸入灌注液中；

步骤五：1% Triton X-100灌注浸泡4h，并将整个膀胱浸入1% Triton X-100灌注液中，随后予以双蒸水充分冲洗20min；

步骤六：0.5% Triton X-100浸泡灌注8h，并将整个膀胱浸入0.5% Triton X-100灌注液中，随后予以双蒸水充分冲洗20min；

步骤七：0.1% Triton X-100浸泡灌注12h，并将整个膀胱浸入0.1% Triton X-100灌注液中，随后予以双蒸水充分冲洗20min；

步骤八：50 U/ml DNase I液和RNase I浸泡灌注4h，并将整个膀胱浸入灌注液中；

步骤九：双蒸水快速灌注冲洗30min，去除残余的冲洗液；

步骤十：对脱细胞后的膀胱进行膀胱ECM水凝胶的制备。

优选的，所述步骤十的一种制备方法，包括如下步骤：

S1：脱细胞后的膀胱在冷冻干燥机中脱去水分，剪碎；

S2：使用环氧乙烷气体灭菌；

S3：将粉末化的膀胱ECM溶于含胃蛋白酶的0.1M盐酸中，不断搅拌在室温下消化48h；

S4：使用1M的NaOH调整溶液PH值至7.4，加入1/9溶液总体积的灭菌10x PBS，并利用灭菌1x PBS调整最终ECM水凝胶浓度为10mg/ml。

优选的，所述步骤八中，灌注液内含10 mM Tris-base、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、150 mM NaCl以及50 U/ml DNase I液和RNase I，PH值为7.6。

优选的，所述步骤四、步骤五、步骤六、步骤七和步骤八中，灌注液均从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈。

优选的，所述步骤一、步骤四、步骤五、步骤六、步骤七、步骤八和步骤九中，所有的灌注液和冲洗液中均需加入双抗。

优选的，所述S3中，ECM与胃蛋白酶的比例为10:1。

优选的，所述S4中，整个过程始终保持在冰上进行。

优选的，所述S1、S2、S3和S4中，整个过程在超净台中完成，加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、该发明中使用反复低温冻融，以及梯度Triton X-100（由高到低）和DNase I、RNaseI联合灌注，既对细胞核成分进行充分洗脱，也最大限度保留了膀胱ECM的生物活性成分，使其能够发挥更好的生物学作用；

2、该发明中膀胱ECM水凝胶包含胶原纤维、层连蛋白等，并且随着温度的升高，可逐渐变成胶冻状，至37℃左右可形成较稳定的纵横交错的多孔结构，有利于干细胞浸入，并可防止干细胞的流失；

3、该发明中膀胱ECM水凝胶可减轻氧化应激损伤，提高干细胞的存活率；

4、该发明中膀胱ECM水凝胶可提高干细胞的旁分泌能力，与单纯干细胞相比，复合水凝胶的干细胞可分泌更多的生物活性因子，增强对损伤组织的修复能力；

5、该发明中膀胱ECM水凝胶中富含硫酸糖胺聚糖等，可与bFGF、HGF等生长因子有效结合，具有缓释的特点，可发挥持久的修复作用。

附图说明

图1为本发明的一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法的制备流程图；

图2为本发明的膀胱ECM水凝胶的制备流程图；

图3为本发明的膀胱ECM的结构蛋白荧光图；

图4为本发明的膀胱ECM水凝胶的扫描电镜图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

请参阅图1-4，本发明提供的一种实施例：一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤三：重复步骤二两次，使用反复低温冻融，增加膀胱壁的通透性；

步骤四：双蒸水灌注浸泡4h，并将整个膀胱浸入灌注液中；

步骤九：双蒸水快速灌注冲洗30min，去除残余的冲洗液；

步骤十：对脱细胞后的膀胱进行膀胱ECM水凝胶的制备。

进一步，步骤十的一种制备方法，包括如下步骤：

S1：脱细胞后的膀胱在冷冻干燥机中脱去水分，剪碎；

S2：使用环氧乙烷气体灭菌；

S4：使用1M的NaOH调整溶液PH值至7.4，加入1/9溶液总体积的灭菌10x PBS，并利用灭菌1x PBS调整最终ECM水凝胶浓度为10mg/ml，可减轻氧化应激损伤，提高干细胞的存活率，膀胱ECM水凝胶可提高干细胞的旁分泌能力，与单纯干细胞相比，复合水凝胶的干细胞可分泌更多的生物活性因子，增强对损伤组织的修复能力，富含硫酸糖胺聚糖等，可与bFGF、HGF等生长因子有效结合，具有缓释的特点，可发挥持久的修复作用。

进一步，步骤八中，灌注液内含10 mM Tris-base、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、150mM NaCl以及50 U/ml DNase I液和RNase I，PH值为7.6。

进一步，步骤四、步骤五、步骤六、步骤七和步骤八中，灌注液均从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈，使用梯度Triton X-100（由高到低）和DNase I、RNase I联合灌注，最大限度保留了膀胱ECM的生物活性成分。

进一步，步骤一、步骤四、步骤五、步骤六、步骤七、步骤八和步骤九中，所有的灌注液和冲洗液中均需加入双抗。

进一步，S3中，ECM与胃蛋白酶的比例为10:1。

进一步，S4中，整个过程始终保持在冰上进行。

进一步，S1、S2、S3和S4中，整个过程在超净台中完成，加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。

在既往研究中，主要是通过组织切块剪碎浸泡的方法以获得ECM，与浸泡法相比，利用反复冻融加灌注浸泡法进行脱细胞，脱细胞效率更高。

现存的脱细胞方案，主要是使用去污剂Triton X-100及SDS，或胰蛋白酶-EGTA等，但既往研究显示，单独使用Triton X-100，对细胞核成分并不能达到很好的洗脱效果，而联合使用SDS或胰蛋白酶-EGTA对细胞外成分包括胶原蛋白、层连蛋白和细胞因子等的破坏较大，影响其后续的生物学功能的发挥。在本发明中，先对膀胱进行反复的低温冻融，增加膀胱壁的通透性，随后使用梯度Triton X-100和DNase I及RNase I联合灌注，既对细胞成分进行充分洗脱（通过免疫荧光证实细胞成分已完全去除），也最大限度保留了ECM的生物活性成分（通过免疫荧光和Elisa证实脏ECM充分保留了胶原、层粘连蛋白和细胞因子等成分），使其能够发挥更好的生物学作用。

工作原理：取新鲜猪膀胱，保留输尿管和尿道结构，以3000ml双蒸水浸泡冲洗2h，去除残余的血液，锡箔纸包裹后，迅速放置于负80℃冰箱速冻1小时，后取出平衡至室温，重复步骤二两次，双蒸水灌注浸泡4h，从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈，并将整个膀胱浸入灌注液中，1% Triton X-100灌注浸泡4h，从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈，并将整个膀胱浸入1% Triton X-100灌注液中，随后予以双蒸水充分冲洗20min，0.5% Triton X-100浸泡灌注8h，从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈，并将整个膀胱浸入0.5% Triton X-100灌注液中，随后予以双蒸水充分冲洗20min，0.1%Triton X-100浸泡灌注12h，从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈，并将整个膀胱浸入0.1% Triton X-100灌注液中，随后予以双蒸水充分冲洗20min，50 U/ml DNase I液和RNase I（内含10 mM Tris-base，2 mM MgCl2，2 mM CaCl2及150 mM NaCl，pH7.6）浸泡灌注4h，从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈，并将整个膀胱浸入灌注液中，双蒸水快速灌注冲洗30min，去除残余的冲洗液，上述所有的灌注液和冲洗液中均需加入双抗。脱细胞后的膀胱在冷冻干燥机中脱去水分，剪碎，使用环氧乙烷气体灭菌，将粉末化的膀胱ECM溶于含胃蛋白酶的0.1M盐酸中（ECM与胃蛋白酶的比例为10:1），不断搅拌在室温下消化48h。随后使用1M的NaOH调整溶液PH值至7.4，加入1/9溶液总体积的灭菌10x PBS，并利用灭菌1x PBS调整最终ECM水凝胶浓度为10mg/ml，该过程需始终保持在冰上进行。整个膀胱ECM水凝胶的制备过程均在超净台中完成，加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims

1.一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤三：重复步骤二两次；

步骤四：双蒸水灌注浸泡4h，并将整个膀胱浸入灌注液中；

步骤九：双蒸水快速灌注冲洗30min，去除残余的冲洗液；

步骤十：对脱细胞后的膀胱进行膀胱ECM水凝胶的制备。

2.根据权利要求1所述步骤十的一种制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：脱细胞后的膀胱在冷冻干燥机中脱去水分，剪碎；

S2：使用环氧乙烷气体灭菌；

3.根据权利要求1所述的一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤八中，灌注液内含10 mM Tris-base、2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、150 mMNaCl以及50 U/ml DNase I液和RNase I，PH值为7.6。

4.根据权利要求1所述的一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤四、步骤五、步骤六、步骤七和步骤八中，灌注液均从输尿管通过输液皮条注入，使整个膀胱充分充盈。

5.根据权利要求1所述的一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤一、步骤四、步骤五、步骤六、步骤七、步骤八和步骤九中，所有的灌注液和冲洗液中均需加入双抗。

6.根据权利要求2所述的一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于：所述S3中，ECM与胃蛋白酶的比例为10:1。

7.根据权利要求2所述的一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于：所述S4中，整个过程始终保持在冰上进行。

8.根据权利要求2所述的一种热响应膀胱细胞外基质生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于：所述S1、S2、S3和S4中，整个过程在超净台中完成，加入的溶液必须经过灭菌或细菌过滤器过滤。