CN107397978A - 动物膀胱脱细胞基质的制备方法、所得的基质及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种动物膀胱脱细胞基质的制备方法，取动物膀胱的粘膜下层，经过病毒灭活步骤、脱脂步骤以及脱细胞步骤制得，其中，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤，所述冻融步骤中，冷冻温度为‑70℃～‑90℃，冷冻时间为5～15小时。本发明还提供了通过所述制备方法制得的脱细胞基质及其应用。本发明提供的制备方法通过反复冻融与脱细胞溶液脱细胞处理相结合制得膀胱脱细胞基质，最大限度保留了细胞外基质的弹性纤维与胶原网状结构，同时抗原去除彻底，可应用于膀胱、尿道和输尿管修复领域。

Description

动物膀胱脱细胞基质的制备方法、所得的基质及应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种动物膀胱脱细胞基质的制备方法、所得的脱细胞基质及其应用。
背景技术
对于膀胱、尿道和输尿管的缺损，目前临床上大多采用三种组织替代材料：合成高分子材料、同种异体脱细胞基质、异种脱细胞基质。采用不可降解的合成高分子材料如聚硅酮、聚四氟乙烯等，容易发生组织坏死、瘘、狭窄、外渗、结石形成等情况，而采用聚乳酸、聚羟基乙酸等可降解的合成高分子材料用于膀胱、尿道和输尿管缺损，虽然取材容易，制备方便，但是降解的过程中炎症反应较强，影响细胞的分化增殖。同种异体脱细胞基质原材料来源有限，因此，异种脱细胞基质深受广大研究者的青睐。
猪膀胱脱细胞基质经特殊脱细胞处理后，已去除了含细胞抗原的细胞成分，仅保留了细胞外基质，包含弹性纤维与胶原网状支架，免疫原性大大降低，不易引起宿主产生免疫排斥反应。其优点主要有：质地柔软、易塑形、不会破碎和遇水皱缩、应用方便，可为机体提供良好的供宿主细胞“爬行替代”的支架，此外，作为细胞外基质，生物相容性良好，可诱导组织再生。
现有的猪膀胱脱细胞基质多是通过化学试剂进行脱细胞处理，存在抗原去除不彻底、化学试剂用量较大等缺陷。
发明内容
为克服现有动物膀胱脱细胞基质在制备以及应用中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种动物膀胱脱细胞基质的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种动物膀胱脱细胞基质及其应用。
本发明提供的动物膀胱脱细胞基质的制备方法为：取动物膀胱的粘膜下层，经过病毒灭活步骤、脱脂步骤以及脱细胞步骤制得，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤，其中，所述冻融步骤中，冷冻温度为-70℃～-90℃，冷冻时间为5～15小时。
本发明提供的制备方法中，所述脱细胞溶液脱细胞步骤中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，所述粘膜下层与所述脱细胞溶液的质量比为1:6～1:10，所述粘膜下层浸泡于所述脱细胞溶液中10～60分钟。
本发明提供的制备方法中，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。
本发明提供的制备方法中，所述多次冻融步骤于所述病毒灭活步骤之前进行，或穿插于所述病毒灭活步骤、脱脂步骤之间进行。
本发明提供的制备方法中，所述病毒灭活步骤为将所述粘膜下层置于病毒灭活溶液中浸泡10～60分钟，所述粘膜下层与所述病毒灭活溶液的质量比为1:6～1:10，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％的氯化钠。
本发明提供的制备方法中，所述脱脂步骤为将所述粘膜下层置于脱脂溶液中10～60分钟，所述粘膜下层与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂；其中，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。
本发明提供的制备方法中，还包括去除DNA/RNA步骤，其为将所述粘膜下层置于DNA酶溶液和RNA酶溶液中浸泡20～60分钟。
本发明提供的制备方法中，在所述脱细胞步骤之后还包括冷冻干燥步骤以及灭菌步骤，其中，所述灭菌步骤采用剂量为15～30KGy/h的60Co辐照灭菌。
本发明提供了一种动物膀胱脱细胞基质，采用以上技术方案任一项所述制备方法制得。
本发明还提供了上述动物膀胱脱细胞基质在修复膀胱、尿道和输尿管缺损中的应用。
本发明提供的制备方法首次将冻融工艺应用于膀胱组织的脱细胞工艺中，并与化学法的去抗原工艺相结合，既可以最大限度地保留胶原纤维束的结构完整性，又可以最大限度地去除其抗原性，从而降低了对其性能的影响，结合病毒灭活等工艺，可以降低病毒(如猪内源性逆转录病毒)传播的风险，安全性更高。膀胱粘膜下层脱细胞后具有细胞外基质(EDM)，尤其是Ⅰ型胶原和少量Ⅲ型胶原组成的胶原纤维束构成的三维多孔支架结构，保留了完整的胶原纤维三维结构以及排列规整性，可以作为组织再生修复的生物模板。
综上所述，本发明提供的制备方法以动物膀胱组织为原料，保留了胶原纤维束及其形成的三维结构，通过反复冻融、病毒灭活、脱脂、脱细胞等工艺技术，制备得到了低免疫原性的脱细胞基质，制备中使用的化学试剂浓度低、性质温和，最大限度保留了细胞外基质的弹性纤维与胶原网状结构，同时抗原去除彻底。本发明制备方法所得的脱细胞基质，可应用于膀胱、尿道和输尿管修复领域。
附图说明
图1示出了本发明的猪膀胱脱细胞基质制备方法两种实施方式的流程图。
图2示出了本发明制得的猪膀胱脱细胞基质的HE染色切片扫描图。
图3示出了本发明制得的猪膀胱脱细胞基质在不同标尺下的SEM图。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了一种动物膀胱脱细胞基质的制备方法为：取动物膀胱的粘膜下层，经过病毒灭活步骤、脱脂步骤以及脱细胞步骤制得，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤，其中，所述冻融步骤中，冷冻温度为-70℃～-90℃，冷冻时间为5～15小时。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述动物膀胱优选为常见的哺乳动物膀胱，如常见的猪、牛等，更优选低成本的猪膀胱。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，动物膀胱的粘膜下层可按照现有的任意方法获取。如将深低温冷冻的膀胱组织复温后注入纯化水，紧固端部并使水压力逐步增大，直至粘膜层出现裂纹，再钝性刮去粘膜层，并只保留粘膜下层。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述脱细胞溶液脱细胞步骤中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂。在一个实施方式中，所述脱脂剂可选用本领域使用的任意种类，包括但不限于平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚等。在一个实施方式中，粘膜下层浸泡于脱细胞溶液中10～60分钟，也可根据脱细胞效果简单调整。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述多次冻融步骤的次数可以根据原材料膀胱粘膜下层的情况进行调整，一般可以为3～10次，优选可以为3～5次。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述多次冻融步骤可以于所述病毒灭活步骤之前进行，也可以穿插于所述病毒灭活步骤、脱脂步骤等步骤之间进行，如图1的流程图所示。在一个优选的实施方式中，多次冻融步骤在病毒灭活步骤之前进行，即流程2所示制备流程。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，病毒灭活步骤为将所述粘膜下层置于病毒灭活溶液中浸泡10～60分钟，浸泡时间也可根据实际工艺情况进行调整，如10～15分钟。粘膜下层与所述病毒灭活溶液的质量比为1:6～1:10，也可根据实际工艺情况进行调整。所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％的氯化钠。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，脱脂步骤为将所述粘膜下层置于脱脂溶液中10～60分钟，浸泡时间也可根据实际工艺情况进行调整。所述粘膜下层与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，也可根据实际工艺情况进行调整。所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂；其中，所述脱脂剂可选用本领域使用的任意种类，包括但不限于平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚等。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述制备方法还包括去除DNA/RNA步骤，其为将所述膀胱粘膜下层置于DNA酶溶液和RNA酶溶液中浸泡20～60分钟，优选30～60分钟。通常，用于本发明制备方法的DNA酶溶液和RNA酶溶液配置成8～12mg/ml的浓度(DNA酶、RNA酶的浓度皆为此范围)，优选配置成10mg/ml的浓度。该步骤可采用本领域常见的处理步骤，由于脱细胞步骤也有去除DNA/RNA的作用，因此在检验DNA/RNA残留量合格的情况下可省略此步骤。如需采用该步骤，一般可在脱细胞溶液脱细胞步骤之前进行，也可穿插至其他处理步骤间。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述制备方法在所述脱细胞步骤之后还包括冷冻干燥步骤以及灭菌步骤，其中，冷冻干燥步骤、灭菌步骤可以采用本领域常见的处理步骤。在一个优选的实施方式中，灭菌步骤可采用辐照灭菌，优选采用剂量为15～30KGy/h的60Co辐照灭菌。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述制备方法在各个处理步骤间隙还包含清洗步骤，可以采用本领域常见的处理步骤。在一个优选的实施方式中，可先使用纯化水进行清洗，然后再进行超声清洗，超声清洗可辅助溶解细胞以及移除细胞残留碎片。
本发明的另一方面提供了一种动物膀胱脱细胞基质，采用本发明所述制备方法制得。
本发明的还一方面提供了上述动物膀胱脱细胞基质在修复膀胱、尿道和输尿管缺损中的应用。
在根据本发明的制备方法的一个具体实施例中，可包括以下制备步骤(以下步骤以猪膀胱为例，本发明并不限于此)：
1、选材
选择从种猪繁育、养殖、屠宰、分割均具有可追溯性的生猪屠宰企业作为猪膀胱原料的供应商，并选取检验检疫合格的猪膀胱作为原材料，必要时需进行血相学检查且各项指标为阴性时方可使用。
2、运输及保存
猪膀胱运输过程中应放置在洁净的保温箱中，并用干冰、冰壶或冰袋降温，在12小时之内完成整理、清洗并放入-20℃至-196℃的深低温环境中保存。
3、预处理
钝性去除多余的脂肪等组织，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻5小时以上，作为优先实施例，深低温冷冻时间选择15小时以上。
4、膀胱粘膜下层的获取
将猪膀胱从深低温冰箱中取出后固定在纯化水加压冲洗装置内，加压冲洗直至膀胱粘膜层出现裂纹，然后，钝性刮除粘膜层，只保留粘膜下层。
5、反复冻融
将获取的膀胱粘膜下层放入-80℃深低温冰箱冷冻5小时以上，取出膀胱粘膜下层，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程，如此反复冻融3～5次。
6、病毒灭活
配制病毒灭活溶液，具体为质量浓度为0.01％～0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％的氯化钠组合溶液，将反复冻融后的膀胱粘膜下层放入上述溶液中浸泡10～60分钟，处理材料与病毒灭活溶液的质量比应小于1:6。
7、清洗
磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，再超声清洗10～30分钟。
8、脱脂
配制脱脂溶液，具体为质量浓度为0.1％～1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％的烧碱和质量浓度为0.01％～0.2％的平平加，将病毒灭活后的膀胱粘膜下层放入上述脱脂溶液中脱脂10～60分钟，处理材料与脱脂溶液的质量比应小于1:6。
9、清洗
磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，再超声清洗10～30分钟。
10、去除DNA/RNA
配置一定浓度的DNA酶溶液和RNA酶溶液(DNA酶、RNA酶的浓度通常为8～12mg/ml、优选为10mg/ml)，并将膀胱粘膜下层放入其中并浸泡30分钟以上(优选30～60分钟)。在检验DNA及RNA残留量合格的情况下，可以不进行此步骤。
11、清洗
磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，再超声清洗10～30分钟。
12、脱细胞
配制脱细胞溶液，具体为质量浓度为0.01％～0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％的硫酸铵、质量浓度为0.01％～0.2％的平平加，将膀胱粘膜下层放入上述脱细胞溶液中脱细胞10～60分钟，材料与脱细胞溶液的质量比应小于1:6。
13、清洗
磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，在超声清洗10～30分钟。
14、冷冻干燥
将制备好的脱细胞基质放入冷冻干燥机中干燥24～72小时。
15、包装并辐照灭菌
按规格尺寸进行裁剪，包装后经剂量为15～30KGy/h的60Co辐照灭菌，即为成品。
在根据本发明的制备方法的另一个具体实施例中，反复冻融工艺也可在上述步骤6至步骤11之间交替进行。
下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
如没有特别说明，实施例所使用的原料均为市售产品、所使用的操作均为本领域的常规操作。
实施例1
采购各项指标合格的猪膀胱，整理、清洗并放入-20℃至-196℃的深低温环境中保存。钝性去除多余的脂肪等组织，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻15小时。将猪膀胱从深低温冰箱中取出后固定在纯化水加压冲洗装置内，加压冲洗直至膀胱粘膜层出现裂纹，然后，钝性刮除粘膜层，只保留粘膜下层。将膀胱粘膜下层放入-80℃冰箱冷冻6小时，从深低温冰箱中取出膀胱粘膜下层，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。如此反复冻融3次。配制病毒灭活溶液，具体为质量浓度为0.05％的过氧乙酸和质量浓度为0.2％的氯化钠组合溶液。将反复冻融后的膀胱粘膜下层放入上述溶液中浸泡15分钟，处理材料与病毒灭活溶液的质量比为1:7。磁力搅拌下用纯化水清洗10分钟，再超声清洗10分钟。配制脱脂溶液，具体为质量浓度为0.2％的纯碱、质量浓度为0.2％的烧碱和质量浓度为0.05％的平平加，将病毒灭活后的膀胱粘膜下层放入上述脱脂溶液中脱脂10分钟，处理材料与脱脂溶液的质量比为1:7。磁力搅拌下用纯化水清洗10分钟，再超声清洗10分钟。配置10mg/ml的DNA酶溶液和RNA酶溶液，并将脱脂后的膀胱粘膜下层放入其中并浸泡40分钟。磁力搅拌下用纯化水清洗10分钟，再超声清洗10分钟。配制脱细胞溶液，具体为质量浓度为0.05％的胰酶、质量浓度为0.2％的硫酸铵、质量浓度为0.05％的平平加，然后放入上述脱细胞溶液中脱细胞10分钟，材料与脱细胞溶液的质量比为1:7。磁力搅拌下用纯化水清洗10分钟，在超声清洗10分钟。将制备好的膀胱粘膜下层放入冷冻干燥机中干燥24小时。按规格尺寸进行裁剪，包装后经剂量为15KGy/h的60Co辐照灭菌，即为成品。
实施例2
采购各项指标合格的猪膀胱，整理、清洗并放入-20℃至-196℃的深低温环境中保存。钝性去除多余的脂肪等组织，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻15小时。将猪膀胱从深低温冰箱中取出后固定在纯化水加压冲洗装置内，加压冲洗直至膀胱粘膜层出现裂纹，然后，钝性刮除粘膜层，只保留粘膜下层。将膀胱粘膜下层放入-80℃冰箱冷冻7小时，从深低温冰箱中取出膀胱粘膜下层，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。如此反复冻融5次。配制病毒灭活溶液，具体为质量浓度为0.1％的过氧乙酸和质量浓度为0.3％的氯化钠组合溶液。将反复冻融后的膀胱粘膜下层放入上述溶液中浸泡20分钟，处理材料与病毒灭活溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗20分钟，再超声清洗20分钟。配制脱脂溶液，具体为质量浓度为0.3％的纯碱、质量浓度为0.3％的烧碱和质量浓度为0.1％的平平加，将病毒灭活后的膀胱粘膜下层放入上述脱脂溶液中脱脂20分钟，处理材料与脱脂溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗20分钟，再超声清洗20分钟。配制脱细胞溶液，具体为质量浓度为0.1％的胰酶、质量浓度为0.3％的硫酸铵、质量浓度为0.1％的平平加，然后放入上述脱细胞溶液中脱细胞30分钟，材料与脱细胞溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗20分钟，在超声清洗20分钟。将制备好的膀胱粘膜下层放入冷冻干燥机中干燥48小时。按规格尺寸进行裁剪，包装后经剂量为25KGy/h的60Co辐照灭菌，即为成品。
实施例3
采购各项指标合格的猪膀胱，整理、清洗并放入-20℃至-196℃的深低温环境中保存。钝性去除多余的脂肪等组织，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻15小时。将猪膀胱从深低温冰箱中取出后固定在纯化水加压冲洗装置内，加压冲洗直至膀胱粘膜层出现裂纹，然后，钝性刮除粘膜层，只保留粘膜下层。将膀胱粘膜下层放入-80℃冰箱冷冻9小时，从深低温冰箱中取出膀胱粘膜下层，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。如此反复冻融4次。配制病毒灭活溶液，具体为质量浓度为0.1％的过氧乙酸和质量浓度为0.4％的氯化钠组合溶液。将反复冻融后的膀胱粘膜下层放入上述溶液中浸泡15分钟，处理材料与病毒灭活溶液的质量比为1:7。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，再超声清洗15分钟。配制脱脂溶液，具体为质量浓度为0.4％的纯碱、质量浓度为0.4％的烧碱和质量浓度为0.1％的平平加，将病毒灭活后的膀胱粘膜下层放入上述脱脂溶液中脱脂15分钟，处理材料与脱脂溶液的质量比为1:7。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，再超声清洗15分钟。配置8mg/ml的DNA酶溶液和RNA酶溶液，并将脱脂后的膀胱粘膜下层放入其中并浸泡60分钟。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，再超声清洗15分钟。配制脱细胞溶液，具体为质量浓度为0.1％的胰酶、质量浓度为0.4％的硫酸铵、质量浓度为0.1％的平平加，然后放入上述脱细胞溶液中脱细胞15分钟，材料与脱细胞溶液的质量比为1:7。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，在超声清洗15分钟。将制备好的膀胱粘膜下层放入冷冻干燥机中干燥72小时。按规格尺寸进行裁剪，包装后经剂量为20KGy/h的60Co辐照灭菌，即为成品。
实施例4
采购各项指标合格的猪膀胱，整理、清洗并放入-20℃至-196℃的深低温环境中保存。钝性去除多余的脂肪等组织，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻15小时。将猪膀胱从深低温冰箱中取出后固定在纯化水加压冲洗装置内，加压冲洗直至膀胱粘膜层出现裂纹，然后，钝性刮除粘膜层，只保留粘膜下层。将膀胱粘膜下层放入-80℃冰箱冷冻9小时，从深低温冰箱中取出膀胱粘膜下层，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。如此反复冻融4次。配制病毒灭活溶液，具体为质量浓度为0.01％的过氧乙酸和质量浓度为1.0％的氯化钠组合溶液。将反复冻融后的膀胱粘膜下层放入上述溶液中浸泡15分钟，处理材料与病毒灭活溶液的质量比为1:7。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，再超声清洗15分钟。配制脱脂溶液，具体为质量浓度为1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％的烧碱和质量浓度为0.2％的平平加，将病毒灭活后的膀胱粘膜下层放入上述脱脂溶液中脱脂15分钟，处理材料与脱脂溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，再超声清洗15分钟。配置12mg/ml的DNA酶溶液和RNA酶溶液，并将脱脂后的膀胱粘膜下层放入其中并浸泡60分钟。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，再超声清洗15分钟。配制脱细胞溶液，具体为质量浓度为0.01％的胰酶、质量浓度为1.0％的硫酸铵、质量浓度为0.2％的平平加，然后放入上述脱细胞溶液中脱细胞15分钟，材料与脱细胞溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗15分钟，在超声清洗15分钟。将制备好的膀胱粘膜下层放入冷冻干燥机中干燥72小时。按规格尺寸进行裁剪，包装后经剂量为20KGy/h的60Co辐照灭菌，即为成品。
实施例5
采购各项指标合格的猪膀胱，整理、清洗并放入-20℃至-196℃的深低温环境中保存。钝性去除多余的脂肪等组织，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻15小时。将猪膀胱从深低温冰箱中取出后固定在纯化水加压冲洗装置内，加压冲洗直至膀胱粘膜层出现裂纹，然后，钝性刮除粘膜层，只保留粘膜下层。将膀胱粘膜下层放入-80℃冰箱冷冻7小时，从深低温冰箱中取出膀胱粘膜下层，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。如此反复冻融5次。配制病毒灭活溶液，具体为质量浓度为0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％的氯化钠组合溶液。将反复冻融后的膀胱粘膜下层放入上述溶液中浸泡20分钟，处理材料与病毒灭活溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗20分钟，再超声清洗20分钟。配制脱脂溶液，具体为质量浓度为0.1％的纯碱、质量浓度为1.0％的烧碱和质量浓度为0.01％的平平加，将病毒灭活后的膀胱粘膜下层放入上述脱脂溶液中脱脂20分钟，处理材料与脱脂溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗20分钟，再超声清洗20分钟。配制脱细胞溶液，具体为质量浓度为0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％的硫酸铵、质量浓度为0.01％的平平加，然后放入上述脱细胞溶液中脱细胞30分钟，材料与脱细胞溶液的质量比为1:8。磁力搅拌下用纯化水清洗20分钟，在超声清洗20分钟。将制备好的膀胱粘膜下层放入冷冻干燥机中干燥48小时。按规格尺寸进行裁剪，包装后经剂量为25KGy/h的60Co辐照灭菌，即为成品。
测试例
如图2所示，本发明制备方法制得的动物膀胱脱细胞基质无任何细胞残留，去抗原性彻底，应用安全性高。
如图3所示，本发明制备方法制得的动物膀胱脱细胞基质具备纳米级的微观结构，保留了完整的胶原纤维三维结构以及排列规整性，可以作为组织再生的模板。
除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种动物膀胱脱细胞基质的制备方法，取动物膀胱的粘膜下层，经过病毒灭活步骤、脱脂步骤以及脱细胞步骤制得，其特征在于，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤，其中，所述冻融步骤中，冷冻温度为-70℃～-90℃，冷冻时间为5～15小时。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞溶液脱细胞步骤中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，所述粘膜下层与所述脱细胞溶液的质量比为1:6～1:10，所述粘膜下层浸泡于所述脱细胞溶液中10～60分钟。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多次冻融步骤于所述病毒灭活步骤之前进行，或穿插于所述病毒灭活步骤、脱脂步骤之间进行。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活步骤为将所述粘膜下层置于病毒灭活溶液中浸泡10～60分钟，所述粘膜下层与所述病毒灭活溶液的质量比为1:6～1:10，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％的氯化钠。
6.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂步骤为将所述粘膜下层置于脱脂溶液中10～60分钟，所述粘膜下层与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂；其中，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括去除DNA/RNA步骤，其为将所述粘膜下层置于DNA酶溶液和RNA酶溶液中浸泡20～60分钟。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法在所述脱细胞步骤之后还包括冷冻干燥步骤以及灭菌步骤，其中，所述灭菌步骤采用剂量为15～30KGy/h的60Co辐照灭菌。
9.一种动物膀胱脱细胞基质，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述制备方法制得。
10.权利要求9所述的动物膀胱脱细胞基质在修复膀胱、尿道和输尿管缺损中的应用。
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