CN109276757A - 来源于体外培养的细胞外基质的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，包括细胞的体外培养、化学方法进行第一阶段脱细胞处理、物理方法进行第二阶段脱细胞处理、DNA酶/RNA酶处理及细胞外基质的存储几个步骤。本发明方法通过物理、化学和生物酶学手段有效除去细胞中的DNA成分，脱细胞后得到的细胞外基质中DNA残留含量低于2%，同时有效保留了基质结构蛋白及其超微结构。本发明方法制备的细胞外基质应用于再生医学中的生物材料表面修饰时表现出促进干细胞增殖及分化潜能的生物学特性。

Description

来源于体外培养的细胞外基质的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程中生物材料和组织工程技术领域，具体是一种来源于体外培养的细胞外基质的制备方法及应用。
背景技术
生物支架的构建及修饰一直是组织工程领域的核心研究内容。很多研究表明支架的表面特性对于植入物的重要性不亚于主体材料，而且在植入体内早期就开始调控免疫反应和细胞募集等生理过程。利用物理和化学方法在材料表面进行修饰来获得额外生物学功能的研究已非常普遍。近年来采用不同的方法诱导细胞产生特定的细胞外基质来改良支架性能的研究开始出现，其将细胞培养在支架表面，培养一定时间后，去除细胞保留细胞外基质。基质修饰复合支架不仅能为体内细胞提供正确的模板支架，模拟体内组织微环境，而且具有优异的生物学功能。脱细胞方法是此类修饰技术的核心部分，影响细胞成分残留度、细胞外基质组成、超微结构和力学性能等。
现有的体外培养体系脱细胞方法氨水法，通过Triton X-100破坏细胞膜，使氨水进入细胞核，导致染色质DNA变性，然后在DNA酶和RNA酶消化后洗去细胞碎片。然而此方法脱细胞后基质DAPI染色后在荧光显微镜下依然可见清晰着色的核碎片，同时氨水也会破坏细胞外基质蛋白，特别是酸性蛋白，从而损害脱细胞后的细胞外基质的生物学活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供来源于体外培养的细胞外基质的制备方法及应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)细胞的体外培养：将细胞培养于培养液中，当培养的细胞的汇合度达到80～90％时，弃去旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为40～50μL/cm2的0.25wt％的胰酶，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至(1～2)×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养，培养过程中，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，培养7～28天，即完成细胞的体外培养；
(2)化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将Triton X-100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5％的Triton X-100溶液，置于37℃预热；吸去步骤(1)中细胞培养板中旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为200μL/cm2的配制的Triton X-100溶液，37℃静置5min；吸去细胞培养板中的Triton X-100溶液，加入37℃预热的用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；
(3)物理方法进行第二阶段脱细胞处理：将细胞培养板置于-80℃/37℃反复冻融处理3次，每次的冻融处理过程如下：将细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下冰冻30～60min，然后取出细胞培养板，在超净台中除去塑料袋和封口膜，之后在细胞培养板中加入37℃预热的用量为250μL/cm2的PBS缓冲液，再将细胞培养板置于37℃静置融化30～60min；吸去细胞培养板中的PBS缓冲液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；
(4)DNA酶/RNA酶处理：在PBS缓冲液中加入DNA酶和RNA酶，配制得到含有DNA酶和RNA酶的溶液，该溶液中，DNA酶的终浓度为50U/mL，RNA酶的终浓度为50μg/mL；然后在细胞培养板中加入用量为150μL/cm2的配制的含有DNA酶和RNA酶的溶液，37℃静置2h；吸去细胞培养板中的液体，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液，在细胞培养板中获得脱细胞的细胞外基质；
(5)细胞外基质的存储：将含有细胞外基质的细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下存储备用。
上述来源于体外培养的细胞外基质在生物材料表面修饰上的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开的来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，通过物理、化学和生物酶学手段有效除去细胞中的DNA成分，脱细胞后得到的细胞外基质中DNA残留含量低于2％，同时有效保留了基质结构蛋白及其超微结构。本发明方法制备的细胞外基质应用于再生医学中的生物材料表面修饰时表现出促进干细胞增殖及分化潜能的生物学特性。
附图说明
图1a为脱细胞前的实施例1中MC3T3-E1细胞的光学显微镜明场照片；
图1b为脱细胞后得到的实施例1中脱细胞ECM的光学显微镜明场照片；
图1c为传统氨水法脱细胞得到的脱细胞ECM的光学显微镜明场照片；
图2a为脱细胞前的实施例1中MC3T3-E1细胞在荧光显微镜下的形貌图；
图2b为脱细胞后得到的实施例1中脱细胞ECM在荧光显微镜下的形貌图；
图2c为传统氨水法脱细胞得到的脱细胞ECM在荧光显微镜下的形貌图；
图3为实施例1中脱细胞前MC3T3-E1细胞、脱细胞ECM与传统氨水法脱细胞得到的脱细胞ECM的DNA含量百分比对比图；
图4为实施例1中脱细胞ECM的FN蛋白和COLI蛋白量；
图5为实施例1中脱细胞前MC3T3-E1细胞与两种脱细胞ECM中BSP蛋白量；
图6为培养在普通细胞培养板与ECM修饰细胞培养板上的大鼠BMSCs细胞增殖情况对比图；
图7为培养12天的普通细胞培养板与ECM修饰细胞培养板上的大鼠BMSCs细胞的Alizarin red S染色结果对比图；
图8为培养在的SIS材料与ECM-SIS材料上的大鼠脂肪干细胞增殖曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1的来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)细胞的体外培养：取一瓶培养于T25细胞培养瓶的细胞汇合度为80～90％的MC3T3-E1细胞，弃去旧的培养液，加入5mL的PBS缓冲液，清洗2次；再加入1mL的0.25wt％的胰酶，前后左右倾斜细胞培养瓶，使胰酶均匀覆盖于细胞表面，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至1×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至24孔细胞培养板上，每孔加入500μL细胞悬液，细胞数量为5×104细胞/孔，再将24孔细胞培养板置于细胞培养箱中培养，培养过程中，每隔48h弃去旧的培养液并加入500μL/孔新的培养液，培养7天，即完成细胞的体外培养；
(2)化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将Triton X-100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5％的Triton X-100溶液，置于37℃预热；吸去步骤(1)中细胞培养板中旧的培养液，每孔加入400μL的PBS缓冲液，清洗2～3次；再每孔加入400μL的配制的Triton X-100溶液，37℃静置5min；用移液器轻轻吸去细胞培养板中的Triton X-100溶液，每孔加入400μL的37℃预热的PBS缓冲液，清洗2次后吸去PBS缓冲液；
(3)物理方法进行第二阶段脱细胞处理：将细胞培养板置于-80℃/37℃反复冻融处理3次，每次的冻融处理过程如下：将细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃的冰箱中冰冻40min，然后取出细胞培养板，在超净台中除去塑料袋和封口膜，之后在细胞培养板的每孔加入500μL的37℃预热的PBS缓冲液，再将细胞培养板置于37℃静置融化30min；用移液器轻轻吸去细胞培养板中的PBS缓冲液，每孔加入400μL的PBS缓冲液，清洗2次后吸去PBS缓冲液；
(4)DNA酶/RNA酶处理：在PBS缓冲液中加入DNA酶和RNA酶，配制得到含有DNA酶和RNA酶的溶液，该溶液中，DNA酶的终浓度为50U/mL，RNA酶的终浓度为50μg/mL；然后在细胞培养板中加入含有DNA酶和RNA酶的溶液，每孔加入量为300μL，37℃静置2h；吸去细胞培养板中的液体，每孔加入400μL的PBS缓冲液，清洗2次后吸去PBS缓冲液，在细胞培养板中获得脱细胞的细胞外基质；
(5)细胞外基质的存储：将含有细胞外基质的细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下存储备用。
实施例1中获得的细胞外基质(下称脱细胞ECM，ECM即extracellular matrix)的形貌观察、DAPI染色及DNA含量测定、ECM蛋白分析、生物学功能评估结果如下：
1、明场形貌观察
实施例1中，脱细胞前的MC3T3-E1细胞为三角梭形，细胞铺展，如图1a所示。脱细胞后，细胞破裂，细胞外基质呈现网格型，如图1b所示。传统氨水法脱细胞得到的细胞外基质结构如图1c所示，网格状结构不清晰。
2、DAPI染色及DNA含量测定
针对实施例1中脱细胞前的MC3T3-E1细胞及脱细胞ECM进行DAPI染色，并测定各自的DNA含量。DAPI染料可以插入DNA，在荧光显微镜下显示蓝色。如图2a和图2b所示，脱细胞前的MC3T3-E1细胞有明亮的椭圆形蓝色细胞核，而脱细胞后得到的脱细胞ECM无蓝色信号。图2c为传统氨水法脱细胞得到的细胞外基质在荧光显微镜下的形貌图，依然可见较小片段的蓝色DNA信号。进一步测定脱细胞前后DNA含量，结果发现，见图3，脱细胞ECM中DNA含量仅为脱细胞前MC3T3-E1细胞的(1.92±0.29)％，显著低于传统氨水法脱细胞得到的脱细胞ECM。综上可见，本发明采用化学方法和物理方法相结合的脱细胞方法能够更有效地去除DNA。
3、ECM蛋白染色与含量检测
FN和COLI是两个重要的基质结构蛋白。针对实施例1中脱细胞ECM，通过免疫荧光的方法观察FN和COLI的蛋白表达和定量。图4为实施例1中脱细胞ECM的FN蛋白和COLI蛋白量。从图4可见，本发明脱细胞方法能够比较完整地保留ECM蛋白，FN蛋白和COLI蛋白表达清晰、完整，呈现网格状分布。BSP是一种重要的骨基质蛋白，为酸性蛋白。图5为实施例1中脱细胞前MC3T3-E1细胞与两种脱细胞ECM中BSP蛋白量。图5中1、2、3栏分别代表脱细胞前MC3T3-E1细胞、实施例1中脱细胞ECM和传统氨水脱细胞ECM中BSP含量，结果表明本发明方法能有效保留酸性蛋白质于脱细胞基质中。
4、生物学功能评估
将实施例1中获得的脱细胞ECM覆盖24孔细胞培养板。在该ECM修饰细胞培养板上种植大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，分别评估干细胞的细胞增殖和成骨分化。
4-1、细胞增殖评估：收集汇合度为70～80％的大鼠BMSCs，调整细胞悬液浓度，将细胞悬液加入24孔普通细胞培养板和ECM修饰细胞培养板，每孔加入500μL细胞悬液，细胞密度为5×103细胞/孔，置入37℃的细胞培养箱培养。分别在种植细胞后的1、3、5、7天通过细胞增殖检测试剂盒测定BMSCs的细胞增殖情况。图6为培养在普通细胞培养板与ECM修饰细胞培养板上的大鼠BMSCs细胞增殖情况对比图。如图6所示，与普通细胞培养板相比，ECM修饰细胞培养板能显著促进大鼠BMSCs的细胞增殖。
4-2、细胞分化评估：收集汇合度为70～80％的大鼠BMSCs，调整细胞悬液浓度，将细胞悬液加入24孔普通细胞培养板和ECM修饰细胞培养板，每孔加入500μL细胞悬液，细胞密度为8×104细胞/孔，置入37℃的细胞培养箱培养。培养12天后，进行Alizarin red S染色，检测矿物化沉积情况。图7为培养12天的普通细胞培养板与ECM修饰细胞培养板上的大鼠BMSCs细胞的Alizarin red S染色结果对比图；
如图7所示，与普通细胞培养板相比，ECM修饰细胞培养板能显著促进矿物化结节形成，促进大鼠BMSCs的成骨分化。
实施例2的来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)取一张干的SIS(即小肠粘膜下层，small intestinal submucossa)片层，用5mm打孔器将SIS片层切割为多片5mm直径的圆片；将圆片放到96孔细胞培养板中，加入培养液浸泡24h，备用；
(2)细胞的体外培养：取一瓶培养于T25细胞培养瓶的细胞汇合度为80～90％的HUVEC细胞，弃去旧的培养液，加入5mL的PBS缓冲液，清洗2次；再加入1mL的0.25wt％的胰酶，前后左右倾斜细胞培养瓶，使胰酶均匀覆盖于细胞表面，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至5×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至步骤(1)中准备的96孔细胞培养板上，每孔加入100μL细胞悬液，细胞数量为5×104细胞/孔，再将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中培养，在SIS材料上种植细胞，培养16～24h后，将种植有细胞的SIS材料转移到新的96孔细胞培养板中，每孔加入150μL新的培养液，以后每隔48h弃去旧的培养液并加入150μL/孔新的培养液，培养14天，即完成细胞的体外培养；
(3)化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将Triton X-100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5％的Triton X-100溶液，置于37℃预热；吸去步骤(2)中细胞培养板中旧的培养液，每孔加入100μL的PBS缓冲液，清洗2～3次；再每孔加入100μL的配制的Triton X-100溶液，37℃静置5min；用移液器轻轻吸去细胞培养板中的Triton X-100溶液，每孔加入100μL的37℃预热的PBS缓冲液，清洗2次后吸去PBS缓冲液；
(4)物理方法进行第二阶段脱细胞处理：将细胞培养板置于-80℃/37℃反复冻融处理3次，每次的冻融处理过程如下：将细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃的冰箱中冰冻40min，然后取出细胞培养板，在超净台中除去塑料袋和封口膜，之后在细胞培养板的每孔加入100μL的37℃预热的PBS缓冲液，再将细胞培养板置于37℃静置融化30min；用移液器轻轻吸去细胞培养板中的PBS缓冲液，每孔加入100μL的PBS缓冲液，清洗2次后吸去PBS缓冲液；
(5)DNA酶/RNA酶处理：在PBS缓冲液中加入DNA酶和RNA酶，配制得到含有DNA酶和RNA酶的溶液，该溶液中，DNA酶的终浓度为50U/mL，RNA酶的终浓度为50μg/mL；然后在细胞培养板中加入含有DNA酶和RNA酶的溶液，每孔加入量为100μL，37℃静置2h；吸去细胞培养板中的液体，每孔加入100μL的PBS缓冲液，清洗2次后吸去PBS缓冲液，在细胞培养板中获得脱细胞的细胞外基质修饰的小肠粘膜下层三维材料(下称ECM-SIS材料)；
(6)细胞外基质的存储：将含有ECM-SIS材料的细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下存储备用。
实施例2中获得的ECM-SIS材料的生物学功能评估：在ECM-SIS材料上种植大鼠脂肪干细胞(ADSCs)，评估细胞增殖能力。将SIS材料和ECM-SIS材料放到96孔细胞培养板中。收集汇合度为70～80％的大鼠ADSCs，调整细胞悬液浓度，将细胞悬液分别加到SIS材料和ECM-SIS材料上，每孔加入100μL细胞悬液，细胞密度为5×103细胞/孔，置入37℃的细胞培养箱培养，培养16～24h后，将种植有细胞的SIS材料转移到新的孔中，分别在第1、2、3、5天通过细胞增殖检测试剂盒测定ADSCs的细胞数量。图8为培养在的SIS材料与ECM-SIS材料上的大鼠脂肪干细胞增殖曲线。如图8所示，与SIS材料相比，ECM-SIS材料能显著促进大鼠ADSCs的细胞增殖。

Claims (2)

1.来源于体外培养的细胞外基质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）细胞的体外培养：将细胞培养于培养液中，当培养的细胞的汇合度达到80～90%时，弃去旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为40～50μL/cm2的0.25 wt%的胰酶，在37℃下孵育2min；然后加入与胰酶等体积的培养液，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min后，弃去上清，之后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液用培养液稀释至（1～2）×105细胞/mL，随后将稀释好的细胞悬液加至细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养，培养过程中，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，培养7～28天，即完成细胞的体外培养；
（2）化学方法进行第一阶段脱细胞处理：将Triton X-100加入到PBS缓冲液中，混合均匀，配制成体积百分含量0.5%的Triton X-100溶液，置于37℃预热；吸去步骤（1）中细胞培养板中旧的培养液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次；再加入用量为200μL/cm2的配制的Triton X-100溶液，37℃静置5min；吸去细胞培养板中的Triton X-100溶液，加入37℃预热的用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；
（3）物理方法进行第二阶段脱细胞处理：将细胞培养板置于-80℃/37℃反复冻融处理3次，每次的冻融处理过程如下：将细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下冰冻30～60min，然后取出细胞培养板，在超净台中除去塑料袋和封口膜，之后在细胞培养板中加入37℃预热的用量为250μL/cm2的PBS缓冲液，再将细胞培养板置于37℃静置融化30～60min；吸去细胞培养板中的PBS缓冲液，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液；
（4）DNA酶/RNA酶处理：在PBS缓冲液中加入DNA酶和RNA酶，配制得到含有DNA酶和RNA酶的溶液，该溶液中，DNA酶的终浓度为50U/mL，RNA酶的终浓度为50μg/mL；然后在细胞培养板中加入用量为150μL/cm2的配制的含有DNA酶和RNA酶的溶液，37℃静置2h；吸去细胞培养板中的液体，加入用量为200μL/cm2的PBS缓冲液，清洗2～3次后吸去PBS缓冲液，在细胞培养板中获得脱细胞的细胞外基质；
（5）细胞外基质的存储：将含有细胞外基质的细胞培养板用封口膜封口，装入洁净无菌的塑料袋内，将塑料袋的封口无菌密封，随后将细胞培养板置于-80℃下存储备用。
2.权利要求1所述的来源于体外培养的细胞外基质在生物材料表面修饰上的应用。
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