CN109679897A - 对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法 - Google Patents

对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药技术领域，公开了一种对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法，制备浙麦冬含药血清；制备心肌细胞提取以及裂解液；对大鼠骨髓MSCs进行分离与培养；利用细胞流式仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物；对大鼠骨髓MSCs细胞进行培养；利用免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43的表达；采用qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA‑4、β‑MHC mRNA的表达。本发明建立了高效率、系统性的研究模式用于具有潜在诱导能力中药的批量寻找及研究，为完善中药诱导剂的筛选与开发体系奠定基础，为中药诱导作用的研究提供新的思路，同时对提高MSCs自体移植的成功率，降低患者的死亡率，早期防治冠心心衰等疾病的发生、发展等有重要意义。

Description

对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法
技术领域
本发明属于中药技术领域，尤其涉及对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
心血管疾病是当今世界上威胁人类健康最主要的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤疾病而跃居世界第一。而据现代研究来看，临床上有多种对人类生命构成极大威胁的心血管疾病都是由心肌组织损伤、坏死所引起的，如冠心病、心衰等。这是由于心肌组织中成熟心肌细胞缺乏再生能力，心肌缺血、梗死后，心肌细胞(CM)即发生大面积受损、衰亡。目前，临床治疗心肌损伤的方法大致可分为心脏移植手术、药物治疗及干预性的置换新血管技术。但是研究表明，这些疗法除心脏移植外都不能修复已坏死的心肌组织，治标不治本，治疗效果有限。而心脏移植又由于组织来源匮乏、价格昂贵和移植后血管病等因素的限制很难在临床上被推广。可见，临床缺乏显著有效的对抗心肌损伤手段。
干细胞是一类具有无限自我更新能力的细胞，能控制和维持体内组织细胞再生。2001年，斯坦福大学的Blau等提出，干细胞可通过血液循环到达躯体各处，并参与受损心肌细胞的再生。这为心肌组织损伤的治疗提供了新的研究方向。骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow mesenchymalstem cells，MSCs)是成体干细胞，由于取材方便、无免疫排斥反应等优势而被大量用于相关实验。研究表明，体外时可通过特殊化学药物诱导或模拟心肌微环境等手段可使MSCs定向分化为具有心肌细胞形态结构，并分泌部分心肌特异性物质的类心肌样细胞。而将MSCs移植入患有心肌缺血的人或动物体内后，更发现它能分化成新生的心肌细胞代替已坏死细胞，而促进微循环建立，增加血液灌注，提高梗死后心脏功能。近年来，利用MSCs自体移植治疗心肌损伤已进入临床实验阶段[10]。因此，MSCs自体移植也被众多研究者们视为未来对抗心肌损伤的希望。
MSCs自体移植作为一种新技术，在移植过程中MSCs的转化率低，这极大的限制了在临床上的推广应用。而具有诱导MSCs分化CM作用的药物，即诱导剂的使用则能显著提高细胞转化率克服这一难题。但是现有诱导剂品种少、毒性大，不适合在临床使用，因此新型诱导剂的开发是MSCs自体移植亟待解决的关键问题之一。中药诱导剂的寻找及开发一直是个新路径，其毒副作用较小，有助于解决目前MSCs自体移植临床化所面临的问题。
补心阴中药具有滋阴补血、养心安神的作用。其代表药物有：麦冬、地黄等。临床上，补心阴药常用于治疗心痹胸痛。体内的心肌组织修复机能主要是来自各种多能干细胞，MSCs亦是其中之一。实验表明，补心阴药能诱导MSCs分化为CM。这不但证实了补心阴作用含有促进体内的心肌组织修复机能作用的理论推导，也提示了这种修复机能涉及诱导MSCs分化CM。因此，从理论上推测补心阴类中药具有诱导MSCs分化CM的作用，且其补心阴作用与MSCs转化率是成正比的。
麦冬是临床常见的补心阴中药，现代药理研究也表明，麦冬具有抗疲劳，抗心肌缺血、抗心律失常等作用，发现麦冬可拮抗垂体后叶素引起的S-T段抬高,可使结扎大鼠冠脉后升高的S-T段明显降低,同时降低动物血清中CK和LDH含量升高,对心肌缺血造成的SOD降低和MDA增加有一定的抑制作用。因此，本发明选择麦冬进行体外的MSCs诱导分化CM实验研究，以期为心肌损伤的药物研究提供科学基础。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)利用MSCs自体移植治疗心肌损伤的移植过程中MSCs的转化率低。
(2)现有诱导MSCs分化CM作用的药物品种少、效果差、毒性大。
解决上述技术问题的难度和意义：
MSCs具有多想分化潜能，可以分化为多种类型的细胞包括神经元、软骨细胞及心肌细胞等，但其向特定细胞的分化能力受很多因素的影响。国外很多研究证实骨髓间充质干细胞在5-氮胞苷作用下可以诱导分化为心肌样细胞，且经过5-氮胞苷诱导后的心肌样细胞无论在形态还是电生理特征上均与心肌细胞相似。
中药诱导剂的寻找及开发一直是个新路径，其毒副作用较小，有助于解决目前MSCs自体移植临床化所面临的问题，补心阴中药具有滋阴补血、养心安神的作用。补心阴中药的作用温和，安全性高，有效期长，且诱导率较高。同时现代研究表明，麦冬能改善心肌收缩力，对心肌细胞具有保护作用。当然除了给予中药改善心功能外，移植骨髓干细胞分化为心肌样细胞是治疗心血管疾病的新希望。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法。
本发明是这样实现的，对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法，具体包括以下步骤：
步骤一：制备浙麦冬含药血清；制备心肌细胞提取以及裂解液；
步骤二：对大鼠骨髓MSCs进行分离与培养；
步骤三：利用细胞流式仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物；对大鼠骨髓MSCs细胞进行培养；
步骤四：利用免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43的表达；采用qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA-4、β-MHCmRNA的表达。
进一步，步骤一中，制备浙麦冬含药血清，具体步骤为：
(1)选择符合2015版中国药典规定下的浙产麦冬，经过提取、浓缩成药液浓度为2g/ml的浙麦冬水煎液；
(2)取180g-200g的健康雄性SD大鼠4只，每日固定时间灌胃，灌胃前禁水禁食6小时；
(3)按照(药液浓度2g生药/mL，剂量2mL/100g)计算大鼠的常规给药剂量；釆用每天1次，连续灌胃7天；
(4)第7天腹主动脉取血，收集大鼠血液，自然凝固，300rpm离心，收集上层血清，56℃灭活30分钟，取出后无菌过滤，后放入-20℃箱保存，为浙麦冬含药血清。
进一步，步骤一中，制备心肌细胞提取以及裂解液，具体步骤为：
(1)取乳鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分，冷PBS漂洗3次；
(2)将心室组织剪成0.5-1mm3大小，冷PBS漂洗3次；
(3)0.125％胰酶+0.05％II型胶原酶反复消化至组织块消失；
(4)200目滤网过滤；
(5)收集下层细胞，PBS清洗3次；
(6)DMEM培养基+15％胎牛血清培养；
(7)差速贴壁2h后，收集未贴壁细胞，转至另外细胞瓶中培养；
(8)第二天录像记录心肌细胞；
(9)将生长较好的第二代心肌细胞制成106悬液；
(10)至于-70℃中，4-5h后取出融化，反复3次；
(11)2000rpm/min离心10min，上清无菌过滤后备用。
进一步，步骤二中，大鼠骨髓MSCs的分离与培养，具体步骤为：
(1)引颈处死大鼠，无菌条件下取股骨和胫骨；
(2)剪开股骨头，L-DMEM反复冲洗骨髓腔；
(3)将L-DMEM液(1：1)移至含Ficoll液的离心管中，4℃下2500r/min离心30min；
(4)取细胞沉淀再加人L-DMEM，20℃下1000r/min离心5min2次；
(5)最后加人培养液(含L-DMEM，20％FBS和100U/mL青、链霉素)，混匀细胞沉淀后移至10cm培养皿，置细胞培养箱内在37℃，5％CO2条件下培养；24h后见细胞大部分已经贴壁，换液移去未贴壁细胞；
(6)7～10d细胞形成单个集簇或克隆，80％～90％融合，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化传代(1：3)，密度为10000/cm2；3d换液1次。
进一步，步骤三中，流式细胞仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物，具体步骤为：
(1)细胞经固定液室温固定30min，PBS清洗3次；
(2)细胞经破膜液室温处理10min，PBS清洗3次；
(3)分别加入荧光标记流式抗体CD73，CD90，CD45，CD34室温避光孵育30min；
(4)离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀洗涤1次；
(5)离心弃上清后加入0.5mlPBS，混匀，制成单细胞悬液；
(6)用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
进一步，步骤三中，大鼠骨髓MSCs细胞培养，具体步骤为：
(1)培养瓶中的细胞覆盖率达到80％-90％时，把原有培养基吸掉；
(2)加适当的胰蛋白酶(0.25％)，消化1-2分钟；
(3)细胞都变圆后加入等体积的含血清(5％、10％、15％)的培养基，空白对照组(加入不含药血清)，阴性对照组(不加血清)，终止消化；
(4)移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，然后将细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟；
(5)倒掉上清液，加1-2ml培养基，将细胞重新悬浮转移至培养瓶中继续培养；
(6)SD大鼠MSCs细胞培养1W/2W/4W，分别对三个时间段进行免疫荧光和Q-PCR相关指标的测定。
进一步，步骤四中，免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43表达，具体步骤为：
(1)预处理：将细胞用4％多聚甲醛固定，0.1％tritonX-100通透，PBS清洗3次；
(2)灭活酶：每张切片滴加2滴3％H2O2-甲醇溶液，室温(15-25℃)封闭10min，PBS浸洗3次；
(3)封闭：滴加即用型山羊血清50-100ul，室温孵育20分钟；
(4)抗原-抗体反应：滴加一抗CTnI和CX43(1：50稀释)50-100ul，37℃，湿盒孵育2小时；PBS浸洗3次；
(5)一抗，二抗反应：滴加Kflour647/TRITC(1：100稀释)二抗50-100ul，37℃，避光孵育1h；
(6)PBS浸洗3次；
(7)复染：每张片子滴加配制DAPI染液50-100ul，室温避光放置5min；
(8)封片：用防萃灭封片胶封片；
(9)观察：高倍镜下观察细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存。
进一步，步骤四中，qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA-4、β-MHC mRNA表达，具体步骤为：
(1)Trizol法提取组织总RNA；
(2)RNA纯度的测定和RNA的定量；
(3)进行逆转录；
(4)荧光定量PCR扩增。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
因此，本发明选择补心阴类药中具有代表性浙江道地药材麦冬进行体外的MSCs诱导分化CM实验研究。以细胞为载体，通过在不同时间点检测特定蛋白质(CTnI、CX43)、基因(NKx2.5、GATA-4、β-MHC)以及形态学等指标，分析它们表达时间、持续时间及量的变化，阐明补心阴中药浙麦冬对MSCs的诱导作用和机制，探讨MSCs转化率的水平与补心阴作用的相关性，明确浙麦冬对MSCs转化率的影响。
本发明通过流式细胞仪对大鼠骨髓MSCs的表面标记分子CD73,CD90,CD45,CD34的鉴定，来确定所培养的细胞是来自SD大鼠MSCs中的。再通过免疫荧光法检测补心阴中药浙麦冬对SD大树MSCs诱导分化心肌样细胞中CTnl和CX43蛋白表达情况，以及qPCR法检测补心阴中浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中NKx2.5，GATA4和β-MHCmRNA表达情况，来验证补心阴中药浙麦冬对MSCs细胞的诱导作用及具体的影响。
与空白对照组比较，给药组的心肌样细胞中肌钙蛋白I(CTnI)和连接蛋白43(CX43)和NKx2.5，GATA4和β-MHCmRNA的表达量明显增加，而且呈现剂量依赖性和培养时间依赖性。与空白对照组比较，给药组的MSCs中在1周左右存活的部分细胞体积逐渐增大，呈球状、棒状或长梭形；2周以后细胞间出现连接，排列方向渐趋一致。结果表明补心阴中药浙麦冬能诱导MSCs分化形成心肌样细胞，而且呈现剂量依赖性。
通过本发明建立了高效率、系统性的研究模式用于具有潜在诱导能力中药的批量寻找及研究，为完善中药诱导剂的筛选与开发体系奠定基础，为中药诱导作用的研究提供新的思路，同时对提高MSCs自体移植的成功率，降低患者的死亡率，早期防治冠心心衰等疾病的发生、发展等有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的流式细胞仪检测细胞表面黏附分子CD73、CD90、CD34和CD45示意图。
图3是本发明实施例提供的补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞的示意图。
图4是本发明实施例提供的免疫荧光法检测补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中CTnI蛋白表达示意图。
图5是本发明实施例提供的免疫荧光法检测补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中CX43蛋白表达结果示意图。
图6是本发明实施例提供的浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中NKx2.5基因的mRNA表达结果示意图。
图7是本发明实施例提供的浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中GATA4基因的mRNA表达结果示意图。
图8是本发明实施例提供的浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中beta-MHC基因的mRNA表达结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明以浙麦冬为例，提供了补心阴中药对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞的诱导方法，本发明利用流式细胞仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标记分子CD73，CD90，CD45，CD34；观察补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞形态结构的影响；免疫荧光法检测补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中CTnI和CX43蛋白表达情况；qPCR法检测补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中NKx2.5，GATA4和β-MHCmRNA表达情况。
下面结合附图对本发明应用原理进行进一步详细说明；
如图1所示，本发明实施例提供的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，具体包括以下步骤：
S101：制备浙麦冬含药血清；制备心肌细胞提取以及裂解液；
S102：对大鼠骨髓MSCs进行分离与培养；
S103：利用细胞流式仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物；对大鼠骨髓MSCs细胞进行培养；
S104：利用免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43的表达；采用qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA-4、β-MHCmRNA的表达。
步骤S101中，本发明实施例提供的制备浙麦冬含药血清，具体步骤为：
(1)选择符合2015版中国药典规定下的浙产麦冬，经过提取、浓缩成药液浓度为2g/ml的浙麦冬水煎液；
(2)取180g-200g的健康雄性SD大鼠4只，每日固定时间灌胃，灌胃前禁水禁食6小时；
(3)按照(药液浓度2g生药/mL，剂量2mL/100g)计算大鼠的常规给药剂量；釆用每天1次，连续灌胃7天；
(4)第7天腹主动脉取血，收集大鼠血液，自然凝固，300rpm离心，收集上层血清，56℃灭活30分钟，取出后无菌过滤，后放入-20℃箱保存，为浙麦冬含药血清。
步骤S101中，本发明实施例提供的制备心肌细胞提取以及裂解液，具体步骤为：
(1)取乳鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分，冷PBS漂洗3次；
(2)将心室组织剪成0.5-1mm3大小，冷PBS漂洗3次；
(3)0.125％胰酶+0.05％II型胶原酶反复消化至组织块消失；
(4)200目滤网过滤；
(5)收集下层细胞，PBS清洗3次；
(6)DMEM培养基+15％胎牛血清培养；
(7)差速贴壁2h后，收集未贴壁细胞，转至另外细胞瓶中培养；
(8)第二天录像记录心肌细胞；
(9)将生长较好的第二代心肌细胞制成106悬液；
(10)至于-70℃中，4-5h后取出融化，反复3次；
(11)2000rpm/min离心10min，上清无菌过滤后备用。
步骤S102中，本发明实施例提供的大鼠骨髓MSCs的分离与培养，具体步骤为：
(1)引颈处死大鼠，无菌条件下取股骨和胫骨；
(2)剪开股骨头，L-DMEM反复冲洗骨髓腔；
(3)将L-DMEM液(1：1)移至含Ficoll液的离心管中，4℃下2500r/min离心30min；
(4)取细胞沉淀再加人L-DMEM，20℃下1000r/min离心5min2次；
(5)最后加人培养液(含L-DMEM，20％FBS和100U/mL青、链霉素)，混匀细胞沉淀后移至10cm培养皿，置细胞培养箱内在37℃，5％CO2条件下培养；24h后见细胞大部分已经贴壁，换液移去未贴壁细胞；
(6)7～10d细胞形成单个集簇或克隆，80％～90％融合，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化传代(1：3)，密度为10000/cm2；3d换液1次。
步骤S103中，本发明实施例提供的流式细胞仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物，具体步骤为：
(1)细胞经固定液室温固定30min，PBS清洗3次；
(2)细胞经破膜液室温处理10min，PBS清洗3次；
(3)分别加入荧光标记流式抗体CD73，CD90，CD45，CD34室温避光孵育30min；
(4)离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀洗涤1次；
(5)离心弃上清后加入0.5mlPBS，混匀，制成单细胞悬液；
(6)用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
步骤S103中，本发明实施例提供的大鼠骨髓MSCs细胞培养，具体步骤为：
(1)培养瓶中的细胞覆盖率达到80％-90％时，把原有培养基吸掉；
(2)加适当的胰蛋白酶(0.25％)，消化1-2分钟；
(3)细胞都变圆后加入等体积的含血清(5％、10％、15％)的培养基，空白对照组(加入不含药血清)，阴性对照组(不加血清)，终止消化；
(4)移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，然后将细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟；
(5)倒掉上清液，加1-2ml培养基，将细胞重新悬浮转移至培养瓶中继续培养；
(6)SD大鼠MSCs细胞培养1W/2W/4W，分别对三个时间段进行免疫荧光和Q-PCR相关指标的测定。
步骤S104中，本发明实施例提供的免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43表达，具体步骤为：
(1)预处理：将细胞用4％多聚甲醛固定，0.1％tritonX-100通透，PBS清洗3次；
(2)灭活酶：每张切片滴加2滴3％H2O2-甲醇溶液，室温(15-25℃)封闭10min，PBS浸洗3次；
(3)封闭：滴加即用型山羊血清50-100ul，室温孵育20分钟；
(4)抗原-抗体反应：滴加一抗CTnI和CX43(1：50稀释)50-100ul，37℃，湿盒孵育2小时；PBS浸洗3次；
(5)一抗，二抗反应：滴加Kflour647/TRITC(1：100稀释)二抗50-100ul，37℃，避光孵育1h；
(6)PBS浸洗3次；
(7)复染：每张片子滴加配制DAPI染液50-100ul，室温避光放置5min；
(8)封片：用防萃灭封片胶封片；
(9)观察：高倍镜下观察细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存。
步骤S104中，本发明实施例提供的qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA-4、β-MHCmRNA表达，具体步骤为：
(1)Trizol法提取组织总RNA；
(2)RNA纯度的测定和RNA的定量；
(3)进行逆转录；
(4)荧光定量PCR扩增。
下面结合具体实验对本发明的应用原理进行进一步详细说明；
实验1；
(一)1、准备实验材料
1、实验动物
SPF级雄性SD大鼠，体重250-300g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2013-0016。
饲养条件：恒温，温度22±2℃，湿度50％-60％，光照每12小时明暗交替，换风次数15-20次/小时。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养。实验饲养室许可证号SYXK(浙)2013-0184。
2、实验仪器及试剂
表1实验仪器
表2实验试剂与耗材
(二)、实验方法
1、浙麦冬含药血清制备
符合2015版中国药典规定下的浙产麦冬，经过提取、浓缩成药液浓度
为2g/ml的浙麦冬水煎液。取180g-200g的健康雄性SD大鼠4只，每日固定时间灌胃，灌胃前禁水禁食6小时。按照(药液浓度2g生药/mL，剂量2mL/100g)计算大鼠的常规给药剂量；釆用每天1次，连续灌胃7天。于第7天腹主动脉取血，收集大鼠血液，自然凝固，300rpm离心，收集上层血清，56℃灭活30分钟，取出后无菌过滤，后放入-20℃箱保存，为浙麦冬含药血清。
2、心肌细胞提取以及裂解液制备
(1)取乳鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分，冷PBS漂洗3次；
(2)将心室组织剪成0.5-1mm3大小，冷PBS漂洗3次；
(3)0.125％胰酶+0.05％II型胶原酶反复消化至组织块消失；
(4)200目滤网过滤；
(5)收集下层细胞，PBS清洗3次；
(6)DMEM培养基+15％胎牛血清培养；
(7)差速贴壁2h后，收集未贴壁细胞，转至另外细胞瓶中培养；
(8)第二天录像记录心肌细胞；
(9)将生长较好的第二代心肌细胞制成106悬液；
(10)至于-70℃中，4-5h后取出融化，反复3次；
(11)2000rpm/min离心10min，上清无菌过滤后备用。
3、大鼠骨髓MSCs的分离与培养，具体步骤为：
(1)引颈处死大鼠，无菌条件下取股骨和胫骨；
(2)剪开股骨头，L-DMEM反复冲洗骨髓腔；
(3)将L-DMEM液(1：1)移至含Ficoll液的离心管中，4℃下2500r/min离心30min；
(4)取细胞沉淀再加人L-DMEM，20℃下1000r/min离心5min2次；
(5)最后加人培养液(含L-DMEM，20％FBS和100U/mL青、链霉素)，混匀细胞沉淀后移至10cm培养皿，置细胞培养箱内在37℃，5％CO2条件下培养；24h后见细胞大部分已经贴壁，换液移去未贴壁细胞；
(6)7～10d细胞形成单个集簇或克隆，80％～90％融合，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化传代(1：3)，密度为10000/cm2；3d换液1次。
4、流式细胞仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物，具体步骤为：
(1)细胞经固定液室温固定30min，PBS清洗3次；
(2)细胞经破膜液室温处理10min，PBS清洗3次；
(3)分别加入荧光标记流式抗体CD73，CD90，CD45，CD34室温避光孵育30min；
(4)离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀洗涤1次；
(5)离心弃上清后加入0.5ml PBS，混匀，制成单细胞悬液；
(6)用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
5、大鼠骨髓MSCs细胞培养，具体步骤为：
(1)培养瓶中的细胞覆盖率达到80％-90％时，把原有培养基吸掉；
(2)加适当的胰蛋白酶(0.25％)，消化1-2分钟；
(3)细胞都变圆后加入等体积的含血清(5％、10％、15％)的培养基，空白对照组(加入不含药血清)，阴性对照组(不加血清)，终止消化；
(4)移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，然后将细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟；
(5)倒掉上清液，加1-2ml培养基，将细胞重新悬浮转移至培养瓶中继续培养；
(6)SD大鼠MSCs细胞培养1W/2W/4W，分别对三个时间段进行免疫荧光和Q-PCR相关指标的测定。
6、免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43表达，具体步骤为：
(1)预处理：将细胞用4％多聚甲醛固定，0.1％tritonX-100通透，PBS清洗3次；
(2)灭活酶：每张切片滴加2滴3％H2O2-甲醇溶液，室温(15-25℃)封闭10min，PBS浸洗3次；
(3)封闭：滴加即用型山羊血清50-100ul，室温孵育20分钟；
(4)抗原-抗体反应：滴加一抗CTnI和CX43(1：50稀释)50-100ul，37℃，湿盒孵育2小时；PBS浸洗3次；
(5)一抗，二抗反应：滴加Kflour647/TRITC(1：100稀释)二抗50-100ul，37℃，避光孵育1h；
(6)PBS浸洗3次；
(7)复染：每张片子滴加配制DAPI染液50-100ul，室温避光放置5min；
(8)封片：用防萃灭封片胶封片；
(9)观察：高倍镜下观察细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存。
7、qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA-4、β-MHC mRNA表达
(1)1.Trizol法提取组织总RNA
1)收集约1×105个细胞，再加预冷的1ml Trizol，用组织匀浆器将样本置于冰盒上进行匀浆，充分研磨，室温放置～15min，使其充分裂解；
2)分相：
①加0.2ml的氯仿，剧烈振荡15秒钟，15-30℃静置5分钟；
②4℃，12000×g，离心15分钟。
3)沉淀，并去除多糖
①用200μl的枪取无色相(大约300μl)至一新的EP管中，切勿吸到中间层；
②加入等体积异丙醇颠倒混匀(动作缓和)，15-30℃静置10min；
③4℃，12000×g，勿超过12000×g离心10分钟，倾去上清；
4)清洗(2次)
①用200μl的枪吸除多余上清，加1ml冰预冷的75％乙醇，旋涡震荡；
②4℃，7500×g离心5分钟，弃洗液；
③4℃，7500×g离心30s，用10μl枪头小心吸取离心管底部残余液体；
5)将离心管转到超净工作台，打开离心管盖子，让残余的液体蒸发，自然干燥；
6)加约40μl的DEPC·H2O，枪打数次，使沉淀完全溶解，然后置于55-60℃水浴或温箱中彻底溶解10分钟，迅速冰浴，5分钟，稍离心；置于-80℃保存。
(2)RNA纯度的测定和RNA的定量
以相应溶剂为对照(Blank)，取1μl RNA溶液于MerintonSMA4000检测，观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280>1.8且<2.0，则可以满足后续RT-qPCR所需。
(3)逆转录实验
1)将以下试剂加入到EP管中(总共30μl)：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)6μl；Total RNA(反应体系可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用500ng的Total RNA)；RNaseFree dH2O补足至30μl。
2)轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)；4℃。
(4)荧光定量PCR扩增实验
引物序列如下：
Beta-MHC(rat)：107bp
Forward：AGAACACCAGCCTCATCAACCA
Reverse：CTTCTCCTCTGCGTTCCTACACT
GATA4(rat)：193bp
Forward：CCTGAAGAACAACTGGTAGAACT
Reverse：AGGTAGAGAAGGAGGAAGAAGTC
NKx2.5(rat)：175bp
Forward：CCAACAGCAACTTCGTGAACT
Reverse：GAGTCATCGCCCTTCTCCTAA
GAPDH(rat)：130bp
Forward：AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA
Reverse：CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG
表3 PCR扩增反应体系
Q-PCR实验参数
1：95.0℃ for 30s
2：95.0℃ for 5s
3：60.0℃ for 30s
4：GOTO2,40more times
5：Melt Curve
65℃to95℃：Increment0.5℃for 10sPlate Read
8、统计学处理
采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)中的LSD法(最小显著性法)，P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。
(三)结果
1、流式细胞仪鉴定大鼠MSCs
如表4所示，与阴性对照组比较，从SD大鼠骨髓中提取的第二代细胞高表达CD73和CD90这类黏附分子，不表达CD45和CD34。结果与MSCs表达CD73和CD90，不表达CD45和CD34的特性相符合，所以提取培养的是SD大鼠MSCs。
表4流式细胞仪检测鉴定SD大鼠MSCs细胞表面CD73，CD90，CD45，CD34
如图2所示，本发明实施例提供的流式细胞仪检测细胞表面黏附分子CD73、CD90、CD34和CD45示意图。
左侧图为阴性对照组细胞，右侧图为SD大鼠骨髓提取培养细胞。
2、补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞的影响；
如图3所示，空白对照组与阴性对照组比较，在相同培养时间下，两组细胞形态结构基本无差别，排除血清这一干扰因素。与空白对照组比较，添加含药血清培养基培养的MSCs中在1周左右存活的部分细胞体积逐渐增大，呈球状、棒状或长梭形；2周以后细胞间出现连接，排列方向渐趋一致。补心阴中药浙麦冬能诱导MSCs分化形成心肌样细胞，而且呈现剂量依赖性。
3、免疫荧光法检测补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中CTnI和CX43蛋白表达的影响
如图4所示，空白对照组与阴性对照组比较，在相同培养时间下，两组CTnI和CX43蛋白表达基本无差别，排除血清这一干扰因素。与空白对照组比较，添加含药血清培养基培养的心肌样细胞中肌钙蛋白I(CTnI)和连接蛋白43(CX43)的表达量明显增加，而且呈现剂量依赖性和培养时间依赖性。
如图5所示，免疫荧光法检测补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中CX43蛋白表达的影响，(n＝3)蓝色为DAPI显示细胞核信号，绿色为CX43蛋白信号。
4、qPCR法检测补心阴中药浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化心肌样细胞中NKx2.5，GATA4和β-MHC mRNA表达情况
如表5～表7所示和如图6～图8所示，空白对照组与阴性对照组比较，在相同培养时间下，两组NKx2.5，GATA4和β-MHC mRNA相对表达量基本无差别，排除血清这一干扰因素。与空白对照组比较，添加含药血清培养基培养的心肌样细胞中NKx2.5，GATA4和β-MHC mRNA相对表达量明显增加，而且呈现剂量依赖性和培养时间依赖性。
表5浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化1周后心肌样细胞中NKx2.5，GATA4和β-MHCmRNA表达影响(n＝3)
注：与空白对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
表6浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化2周后心肌样细胞中NKx2.5，GATA4和β-MHCmRNA表达影响(n＝3)
注：与空白对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
表7浙麦冬对SD大鼠MSCs诱导分化4周后心肌样细胞中NKx2.5，GATA4和β-MHCmRNA表达影响(n＝3)
注：与空白对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物，其特征在于，所述对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物为浙麦冬。
2.一种如权利要求1所述对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物检测方法包括以下步骤：
步骤一：制备浙麦冬含药血清；制备心肌细胞提取以及裂解液；
步骤二：对大鼠骨髓MSCs进行分离与培养；
步骤三：利用细胞流式仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物；对大鼠骨髓MSCs细胞进行培养；
步骤四：利用免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43的表达；采用qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA-4、β-MHC mRNA的表达。
3.如权利要求2所述的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，制备浙麦冬含药血清具体步骤为：
(1)选择符合2015版中国药典规定下的浙产麦冬，经过提取、浓缩成药液浓度为2g/ml的浙麦冬水煎液；
(2)取180g-200g的健康雄性SD大鼠4只，每日固定时间灌胃，灌胃前禁水禁食6小时；
(3)按照药液浓度2g生药/mL，剂量2mL/100g计算大鼠的常规给药剂量；釆用每天1次，连续灌胃7天；
(4)第7天腹主动脉取血，收集大鼠血液，自然凝固，300rpm离心，收集上层血清，56℃灭活30分钟，取出后无菌过滤，后放入-20℃箱保存，为浙麦冬含药血清。
4.如权利要求2所述的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，制备心肌细胞提取以及裂解液，具体步骤为：
(1)取乳鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分，冷PBS漂洗3次；
(2)将心室组织剪成0.5-1mm3大小，冷PBS漂洗3次；
(3)0.125％胰酶+0.05％II型胶原酶反复消化至组织块消失；
(4)200目滤网过滤；
(5)收集下层细胞，PBS清洗3次；
(6)DMEM培养基+15％胎牛血清培养；
(7)差速贴壁2h后，收集未贴壁细胞，转至另外细胞瓶中培养；
(8)第二天录像记录心肌细胞；
(9)将生长较好的第二代心肌细胞制成106悬液；
(10)至于-70℃中，4-5h后取出融化，反复3次；
(11)2000rpm/min离心10min，上清无菌过滤后备用。
5.如权利要求2所述的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，大鼠骨髓MSCs的分离与培养具体步骤为：
(1)引颈处死大鼠，无菌条件下取股骨和胫骨；
(2)剪开股骨头，L-DMEM反复冲洗骨髓腔；
(3)将L-DMEM液1：1移至含Ficoll液的离心管中，4℃下2500r/min离心30min；
(4)取细胞沉淀再加人L-DMEM，20℃下1000r/min离心5min 2次；
(5)最后加人培养液，混匀细胞沉淀后移至10cm培养皿，置细胞培养箱内在37℃，5％CO2条件下培养；24h后见细胞大部分已经贴壁，换液移去未贴壁细胞；
(6)7～10d细胞形成单个集簇或克隆，80％～90％融合，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化传代1：3，密度为10000/cm2；3d换液1次。
6.如权利要求2所述的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述步骤三中，流式细胞仪鉴定大鼠骨髓MSCs的表面标志物，具体步骤为：
(1)细胞经固定液室温固定30min，PBS清洗3次；
(2)细胞经破膜液室温处理10min，PBS清洗3次；
(3)分别加入荧光标记流式抗体CD73，CD90，CD45，CD34室温避光孵育30min；
(4)离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀洗涤1次；
(5)离心弃上清后加入0.5ml PBS，混匀，制成单细胞悬液；
(6)用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
7.如权利要求2所述的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述步骤三中，大鼠骨髓MSCs细胞培养具体步骤为：
(1)培养瓶中的细胞覆盖率达到80％-90％时，把原有培养基吸掉；
(2)加适当的胰蛋白酶0.25％，消化1-2分钟；
(3)细胞都变圆后加入等体积的含血清5％、10％、15％的培养基，空白对照组，阴性对照组，终止消化；
(4)移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，然后将细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟；
(5)倒掉上清液，加1-2ml培养基，将细胞重新悬浮转移至培养瓶中继续培养；
(6)SD大鼠MSCs细胞培养1W/2W/4W，分别对三个时间段进行免疫荧光和Q-PCR相关指标的测定。
8.如权利要求2所述的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述步骤四中，免疫荧光检测心肌样细胞相关蛋白CTnI和CX43表达步骤为：
(1)预处理：将细胞用4％多聚甲醛固定，0.1％tritonX-100通透，PBS清洗3次；
(2)灭活酶：每张切片滴加2滴3％H2O2-甲醇溶液，15-25℃封闭10min，PBS浸洗3次；
(3)封闭：滴加即用型山羊血清50-100ul，室温孵育20分钟；
(4)抗原-抗体反应：滴加一抗CTnI和CX43 1：50稀释50-100ul，37℃，湿盒孵育2小时；PBS浸洗3次；
(5)一抗，二抗反应：滴加Kflour647/TRITC 1：100稀释二抗50-100ul，37℃，避光孵育1h；
(6)PBS浸洗3次；
(7)复染：每张片子滴加配制DAPI染液50-100ul，室温避光放置5min；
(8)封片：用防萃灭封片胶封片；
(9)观察：高倍镜下观察细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存。
9.如权利要求2所述的对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物的检测方法，其特征在于，所述步骤四中，qPCR法检测心肌样细胞NKx2.5、GATA-4、β-MHC mRNA表达，具体步骤为：
(1)Trizol法提取组织总RNA；
(2)RNA纯度的测定和RNA的定量；
(3)进行逆转录；
(4)荧光定量PCR扩增。
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