CN114015649A - 一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114015649A CN114015649A CN202111354445.6A CN202111354445A CN114015649A CN 114015649 A CN114015649 A CN 114015649A CN 202111354445 A CN202111354445 A CN 202111354445A CN 114015649 A CN114015649 A CN 114015649A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mscs
- group
- exos
- mesenchymal stem
- bone marrow
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 235000011135 Salvia miltiorrhiza Nutrition 0.000 title claims abstract description 29
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 241000304195 Salvia miltiorrhiza Species 0.000 title claims abstract 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 81
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 abstract description 69
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 31
- 101800001821 Precursor of protein E3/E2 Proteins 0.000 abstract description 23
- 101800002664 p62 Proteins 0.000 abstract description 23
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 abstract description 22
- 102100020814 Sequestosome-1 Human genes 0.000 abstract description 21
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 abstract description 13
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 abstract description 11
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 abstract description 8
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 abstract description 7
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000008965 mitochondrial swelling Effects 0.000 abstract description 7
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 abstract description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 2
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 abstract description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 50
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 28
- 102100024178 Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A Human genes 0.000 description 19
- 230000008859 change Effects 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 244000132619 red sage Species 0.000 description 14
- 102100032305 Bcl-2 homologous antagonist/killer Human genes 0.000 description 13
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 13
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 11
- 101000798320 Homo sapiens Bcl-2 homologous antagonist/killer Proteins 0.000 description 10
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 9
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 8
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 210000003365 myofibril Anatomy 0.000 description 8
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 7
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 7
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 7
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 7
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108091005975 Myofilaments Proteins 0.000 description 4
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 4
- -1 alpha-HBDH Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 4
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 4
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 4
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 4
- 238000013042 tunel staining Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000003954 Autophagy-Related Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010082399 Autophagy-Related Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150046345 Bak1 gene Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010028594 Myocardial fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000718 qrs complex Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- AFENDNXGAFYKQO-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybutyric acid Chemical compound CCC(O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036009 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000013875 Heart injury Diseases 0.000 description 1
- 101000783681 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000007201 Myocardial reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010067268 Post procedural infection Diseases 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 240000007164 Salvia officinalis Species 0.000 description 1
- 240000000513 Santalum album Species 0.000 description 1
- 235000008632 Santalum album Nutrition 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- SFCVEUVVOJFYSX-UHFFFAOYSA-J [Pb+2].C(CC(O)(C(=O)[O-])CC(=O)[O-])(=O)[O-].C(C)(=O)[O-].[U+6] Chemical compound [Pb+2].C(CC(O)(C(=O)[O-])CC(=O)[O-])(=O)[O-].C(C)(=O)[O-].[U+6] SFCVEUVVOJFYSX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000008081 blood perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000035565 breathing frequency Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 208000037877 cardiac atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000005242 cardiac chamber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002169 extracardiac Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000002976 pectoralis muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 235000005412 red sage Nutrition 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002235 sarcomere Anatomy 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/76—Undefined extracts from plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属中药以及生物技术领域，提供一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。该外泌体为丹参饮水提取物诱导处理的骨髓间充质干细胞外泌体。通过SD大鼠心肌梗死模型，从宏观和微观水平评价丹参饮水提取物诱导处理的骨髓间充质干细胞外泌体对心肌梗死的治疗效果。通过心肌注射治疗，结果显示：血清心肌酶含量升高；心肌梗死面积降低；细胞排列紊乱、心肌细胞坏死、炎细胞浸润及纤维增生减轻；心肌细胞内线粒体肿胀减轻，线粒体嵴数量增加；Cleaved Caspase‑3、p‑GSK‑3β表达及Bax/Bcl‑2比值降低；p62、LC3表达提高，提示可通过抑制心肌细胞凋亡、提高自噬水平，发挥抗心肌梗死的作用。
Description
技术领域
本发明属于中药以及生物技术领域，具体涉及一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，具体的为在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
背景技术
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）主要是由于血栓或栓子堵塞冠状动脉，心肌血液灌注减少、供氧降低，心肌氧耗增加，导致的一种贫血性坏死的病理状态[1]。AMI是冠心病最严重的一种临床类型，占发达国家每年死亡人数的1/3以上，是全球范围内致死致残的首要病因[2]。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）来源于发育早期中胚层，可从骨髓、脂肪、脐带、肝脏、牙髓等多种组织中获得。具有多向分化潜能和旁分泌作用，研究发现MSCs移植能减少心肌梗死面积、改善心功能，在心肌梗死治疗中显示出一定的作用。但是，干细胞移植的低存活率、低分化率、低归巢率以及免疫排斥等问题，提示干细胞主要通过旁分泌机制发挥修复作用。
外泌体（exosomes）被认为是干细胞发挥主要作用的旁分泌因子之一。Exosomes是细胞在生理或病理状态下释放的被有脂质双分子层的微小囊泡结构，直径30~150nm，包裹大量蛋白质、脂质、mRNA、DNA和MicroRNAs等。Exosomes一旦被受体细胞吸收，从亲代细胞携带的蛋白质、脂质和RNA等就会释放到受体细胞，对受体细胞进行活性和功能的调节。研究发现，不同来源的MSCs外泌体具有抑制心功能不全、心肌细胞凋亡、心肌纤维化和多种炎症反应的作用，进而缓解MI引起的心脏损伤[2, 3, 4]。
当MSCs所处微环境变化时，MSCs外泌体内容物也会随之改变，导致其疗效提高或降低[5]。因此，通过改变微环境以提高MSCs外泌体的治疗效果有待进一步研究。
丹参饮出自清代·陈修园《时方歌括》，方中丹参活血祛瘀，檀香、砂仁行气宽中而止痛，三药合用，使气血通畅，则疼痛自止，为治疗气滞血淤胃痛有效之方。现代药理学研究表明丹参饮具有改善心肌病理形态、减轻心肌细胞超微结构损伤及减少心肌细胞坏死和凋亡等作用，在治疗心肌梗死方面有很好的疗效。
发明内容
本发明提供了一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，具体的为在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体，所述外泌体为丹参饮水提取物诱导处理的骨髓间充质干细胞外泌体。
具体制备方法为：
（1）制备丹参饮水提取物即DYS提取物：丹参30g、檀香5g、砂仁5g加8倍水浸泡30min，先将丹参煎煮50min，后加入檀香、砂仁，再煎煮10min，过滤，药渣继续加6倍水煎煮，共煮3次，收取煎煮液，浓缩蒸干，密封后4℃备用；
（2）收集骨髓间充质干细胞BM-MSCs：利用DMEM:F12完全培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞BM-MSCs，BM-MSCs接种于培养瓶内，37℃、5%CO2培养，24h后首次换液，弃去红细胞及未贴壁细胞，7~10d后传代，得到间充质干细胞BM-MSCs；
（3）制备丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体BM-MSCsDSY-exos：步骤（2）所制备的BM-MSCs用含有浓度0.16/L DSY提取物的DMEM:F12完全培养基诱导3d，弃去培养基，PBS清洗3次，然后加入DSY提取物浓度为0.16g/L的DMEM:F12无血清培养基，37℃、5%CO2培养24h后收集上清；将上清液2000g×10min、12000g×30min离心后，0.22um滤器滤去细胞碎片，滤液110000g×1h超高速离心，弃去上清、PBS重悬，重复110000g×1h超高速离心，弃去上清，保留BM-MSCs-exos，PBS重悬，-80℃保存备用。
所述骨髓间充质干细胞为P3-P10代。
所述丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
本发明通过制备SD大鼠心肌梗死模型，从宏观和微观水平评价BM-MSCsDSY-exos对心肌梗死的治疗效果。通过BM-MSCsDSY-exos心肌注射治疗，心电图显示BM-MSCsDSY-exos心肌注射治疗心肌梗死模型组7d、14d、28d心率平稳，BM-MSCsDSY-exos通过恢复QRS波群形态，降低心率，改善心肌梗死大鼠心电图；检测血清心肌酶谱含量显示显著提高了心肌梗死大鼠血清心肌酶谱CK、LDH、α-HBDH、ALT、AST含量；处理7d后心肌颜色呈红紫色，28d心肌颜色发白，但明显优于模型组，心脏形态无显著改变，显然，BM-MSCsDSY-exos能够改善心肌颜色，且能够恢复心脏形态以及大小。TTC染色结果显示BM-MSCsDSY-exos心肌注射治疗可显著缩小心肌梗死大鼠的心梗面积。而心肌组织病理形态也得到了明显的改善，同时还具有明显的抗心肌纤维增生的作用。通过显微检测心肌细胞超微结构显示，治疗组肌原纤维排列情况、线粒体肿胀与膜破裂程度、线粒体嵴排列情况等均有显著改善，充分说明了本发明所述治疗方法能够显著改善心肌梗死大鼠心肌细胞内肌原纤维排列情况、线粒体形态及数量等的作用。通过对心肌细胞进行TUNEL染色显示，心肌细胞凋亡数目显著减少，也就是说，本发明所述BM-MSCsDSY-exos具有抑制心肌细胞凋亡的作用。
通过对其基因表达进行检测显示：Real time PCR结果分析说明BM-MSCsDSY-exos通过降低促凋亡基因p53、BAK1表达，抑制心肌细胞凋亡。通过对p53、BAK1基因表达的检测显示，BM-MSCsDSY-exos通过降低促凋亡基因p53、BAK1表达，抑制心肌细胞凋亡；对Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-GSK-3β表达的检测显示：BM-MSCsDSY-exos通过降低凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、p-GSK-3β表达水平、提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，发挥抗心肌细胞凋亡的作用；对p62、LC3基因表达的检测显示：BM-MSCsDSY-exos通过提高自噬基因p62、LC3表达，提高心肌细胞自噬水平；提高自噬相关蛋白p62、LC3表达水平，发挥促进心肌细胞自噬的作用。
血清心肌酶含量升高；心肌梗死面积显著降低；细胞排列紊乱、心肌细胞坏死、炎细胞浸润及纤维增生明显减轻；心肌细胞内线粒体肿胀减轻，线粒体嵴数量明显增加；Cleaved Caspase-3表达、p-GSK-3β表达及Bax/Bcl-2比值降低；p62、LC3表达提高，提示BM-MSCsDSY-exo可通过抑制心肌细胞凋亡、提高自噬水平，发挥抗心肌梗死的作用。
丹参饮处理的骨髓间充质干细胞外泌体（DSY-bone marrow mesenchymal stemcells-exosomes, BM-MSCsDSY-exos）较未处理组有（BM-MSCs-exos）显著改善的抗心肌细胞凋亡的效果，实验也充分验证了，丹参饮处理可以通过改变BM-MSCs-exos内含的蛋白质、脂质、核酸等内容物，进而提高BM-MSCs-exos抗MI的治疗效果。
本发明利用中药经典方剂DSY诱导提高BM-MSCs-exos抗心肌梗死的疗效，并对作用机制进行深入研究，拟将传统中医治疗与现代医学有机结合，探寻一种对慢性重大疾病心肌梗死更为精准的治疗方法。
附图说明
图1为传代BM-MSCs生长状况，×400；
图2为BM-MSCs exosomes电镜及粒径分析结果；图中：A.电镜分析结果(放大倍数100nm); B. 粒径分析结果；
图3为BM-MSCs exosomes CD9表达鉴定；图中：1为BM-MSCs；2为BM-MSCs-exos；3为BM-MSCsDSY；4为BM-MSCsDSY-exos；
图4为各组大鼠不同时间节点心电图；图中：A：假手术组7d；B：假手术组14d；C：假手术组28d；D：模型组7d；E：模型组14d；F：模型组28d；G：BM-MSCs-exos组7d；H：BM-MSCs-exos组14d；I：BM-MSCs-exos组28d；J：BM-MSCsDSY-exos组7d； K：BM-MSCsDSY-exos组14d；L：BM-MSCsDSY-exos组28d；
图5为心肌酶谱酶含量表达水平；图中：A为CK表达改变；B为LDH表达改变；C为α-HBDH 表达改变；D为ALT表达改变；E为AST表达改变；注：与模型组7d、14d、28d比较，* P<0.05，** P<0.01；
图6为各组大鼠不同时间节点心脏大体情况；
图7为大鼠心脏TTC染色结果；
图8为心肌组织HE染色结果（×200）；
图9为心肌组织Masson染色结果（×200）；
图10为心肌细胞超微结构改变；
图11为心肌细胞TUNEL染色结果（×200）；
图12为p53、BAK1表达改变；图中：A为p53表达改变；B为BAK1表达改变；注：与模型组7d、14d、28d比较，* P<0.05，** P<0.01；
图13为Bcl-2、Bax、p-GSK-3β、Cleaved Caspase-3表达改变；图中：A为Bax/Bcl-2表达改变结果；B为Cleaved Caspase-3表达结果；C为p-GSK-3β表达结果；D为电泳图；
D图中：1：假手术组7d；2：假手术组14d；3：假手术组28d；4：模型组7d；5：模型组14d；6：模型组28d；7：BM-MSCs-exos组7d；8：BM-MSCs-exos组14d；9：BM-MSCs-exos组28d；10：BM-MSCsDSY-exos组7d； 11：BM-MSCsDSY-exos组14d；12：BM-MSCsDSY-exos组28d；
图14为p62、LC3基因表达改变；图中A为p62基因表达改变；B为LC3基因表达改变；注：与模型组7d、14d、28d比较，* P<0.05，** P<0.01；
图15为p62、LC3蛋白表达改变；图中A为p62蛋白表达改变；B为LC3蛋白表达改变；C为电泳图；C中：1：假手术组7d；2：假手术组14d；3：假手术组28d；4：模型组7d；5：模型组14d；6：模型组28d；7：BM-MSCs-exos组7d；8：BM-MSCs-exos组14d；9：BM-MSCs-exos组28d；10：BM-MSCsDSY-exos组7d； 11：BM-MSCsDSY-exos组14d；12：BM-MSCsDSY-exos组28d。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、实验材料：
1、SD大鼠，雄性，280±20g，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK(京)2019-0008。饲养于山西省中医药研究院中心实验室动物房，室温：22±1℃，相对湿度40%～60%；自由饮水摄食；新生SD大鼠，1~3d，饲养于屏障环境，自由饮水摄食，室温：22±1℃，相对湿度40%～60%。
2、丹参饮水提取物：丹参30g、檀香5g、砂仁5g加8倍水浸泡30min，先将丹参煎煮50min，后下檀香、砂仁，再煎煮10min，药渣继续加6倍水煎煮，共煮3次，收取煎煮液，浓缩蒸干，密封后存放于4℃备用。
3、工作液用DMEM:F12完全培养基或DMEM:F12无血清培养基溶解提取物，浓度为0.16g/L，现用现配。
4、SD大鼠骨髓间充质干细胞BM-MSCs的获取方法：取出生1~3d的SD大鼠乳鼠3只，75%酒精体表消毒，无菌条件下取脊柱，用DMEM:F12完全培养基缓慢冲洗脊柱，接种于培养瓶内，37℃、5%CO2培养，24h后首次换液，弃去红细胞等未贴壁细胞，7~10d后传代至P3-P10代。
5、SD大鼠骨髓间充质干细胞外泌体BM-MSCs-exos的获取方法：当BM-MSCs融合至80%时，弃去DMEM:F12完全培养基，PBS清洗3次，加入无血清DMEM:F12培养基，培养24h后收集细胞培养液。将细胞培养液2000g×10min、12000g×30min离心后，0.22um滤器滤去细胞碎片，滤液110000g×1h超高速离心，弃去上清、PBS重悬，重复110000g×1h超高速离心，弃去上清，保留BM-MSCs-exos，PBS重悬，-80℃保存备用。BCA定量后，Western blot检测exosomes表面特异性标志物CD9，透射电镜观察并拍照。
6、丹参饮处理的骨髓间充质干细胞外泌体BM-MSCsDSY-exos的获得：BM-MSCs用DSY提取物浓度为0.16/L的DMEM:F12完全培养基诱导3d后，弃去，PBS清洗3次，加入DSY提取物浓度为0.16g/L的DMEM:F12无血清培养基，37℃、5%CO2培养24h后收集上清。外泌体提取、浓度测定及鉴定方法同BM-MSCs-exos。
二、实验方法
1、急性心肌梗死MI模型的建立：SD大鼠称重后用2%戊巴比妥钠溶液（10ml/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，头部后仰，行气管插管，连接呼吸机，呼吸频率80次/分，呼吸比1：1，潮气量4.0ml。稳定后，左胸碘伏消毒，在胸骨左侧3~4肋间斜20º~30º作1cm纵行切口，逐层钝性分离胸肌，在第3~4肋骨间隙最宽处用眼睑器撑开并固定，挤出心脏。模型组大鼠在平左心耳下缘处迅速以6-0号线结扎左前降支近端（进针深度0.5mm，宽度2mm），假手术组只穿线不结扎。BM-MSCs-exos组与BM-MSCsDSY-exos组结扎后分别用BM-MSCs-exos、BM-MSCsDSY-exos 40ug心肌注射治疗。闭合胸腔，缝合肌肉层，同时将胸腔内空气挤出，完成后棉签蘸取注射用青霉素钠浸润手术区防止感染，最后缝合皮肤。观察3-5分钟，拔除呼吸管，待大鼠恢复自主呼吸后放回饲养框内，左侧卧位并适当垫高头部。术后连续肌注青霉素钠3d（200000U/d），预防术后感染。取术后7d、14d、28d作为观测时间点。
2、心电图监测：将BL-420S生物机能实验系统的黑色、红色、白色电极分别连接于SD大鼠右后肢、左后肢及右前肢皮下，分别于术后第7d、14d、28d记录假手术组、模型组、BM-MSCs-exos组以及BM-MSCsDSY-exos组心电图并观察II导联ST段改变情况。
3、心肌酶谱含量测定：各组大鼠称重、麻醉后，下腔静脉取血，3000rpm、20min离心后分离血清，利用血清生化分析仪检测血清心肌酶谱含量：肌酸激酶(CK)、α-羟丁酸 (α-HBDH)、乳酸脱氢酶（LDH）、谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。
4、心脏大体变化观察：分别于术后第7d、14d、28d麻醉各组大鼠，开胸观察心脏大体变化情况。
5、心肌梗死面积测定：剔除大血管及心脏外结缔组织后摘取心脏，PBS洗涤，放入-20℃冰箱速冻30min，从心底部开始每间隔1~2mm切一片，取3片置于2%TTC磷酸缓冲液（pH=7.4）中，37℃避光孵育，每隔3min翻动一次，15min后取出组织，观察并记录染色情况。正常组织呈红色，梗死组织呈苍白色，采用Image-J图像分析软件计算心肌梗死面积。
6、心肌病理形态观察：于术后第7d、14d、28d，取各组大鼠心脏，剔除心包膜后，取结扎线0.5mm以下心肌组织浸于10%甲醛溶液中固定，脱水、石蜡包埋、切片（厚度为5µm），行HE（苏木素-伊红）和Masson染色，光学显微镜下观察心肌组织病理改变和纤维化程度。
7、心肌细胞超微结构观察：对各组大鼠心脏组织，2.5%戊二醛固定后，0.1M PBS15min漂洗3次，1%锇酸固定液固定2-3h后，梯度酒精脱水，Epon812渗透、包埋。首先制备半薄切片，1%甲苯胺蓝染色，Olympus BX-光学显微镜观察，记录心肌缺血显微结构变化，同时定位。根据半薄定位进行超薄切片，固定在铜网上，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，JEM-1200EX透射电镜（JEOL Ltd. Japan）观察心肌细胞超微结构的改变。
8、心肌细胞凋亡观察：将心脏组织石蜡切片脱蜡至水，用Proteinase K处理组织15-30min，滴加TUNEL反应混合液避光反应，终止、封闭后，DAB显色，苏木素复染，光学显微镜下观察心肌细胞凋亡情况。
9、Real time PCR检测：Trizol法提取心脏组织总RNA；RNA定量后，根据第一链cDNA合成试剂盒说明书，逆转录cDNA，反应体系：20ul，反应条件：25℃ 10min、55℃ 30min、85℃ 5min，-20℃保存；SYBR GREEN法进行real time PCR扩增，反应体系：25ul，反应条件：95℃ 5min (1 cycle)，95℃ 10s、60℃ 35s（40 cycle）。p53、BAK1、p62、LC3II引物序列见表1。
表1 p53、BAK1、p62、LC3II引物序列
10、Western Blot检测：提取心脏组织总蛋白，BCA法定量；根据蛋白定量结果，取50μg总蛋白、彩色预染Marker 3μl进行电泳，浓缩胶80V、分离胶120V，待目标分子量展开时停止电泳；0.22um PVDF膜半干转印15V 55min；5%BSA 4℃过夜封闭后，一抗4℃过夜孵育（Bax 1:1000; Bcl-2 1:1000; Cleaved Caspase-3 1:500; GSK-3β 1:500; LC3II 1:500; p62 1:500），TBST漂洗10min×3次，二抗(1:10000)室温孵育1h，TBST漂洗10min×3次，ECL显色，AlphaView-FluorChem HD2系统检测。采用Image-J图像分析软件计算条带灰度值，进行半定量分析。
三、统计分析：采用GraphPad Prism 6.0统计软件进行处理，结果以
表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，P<0.05视 为具有统计学意义。
四、结果以及分析
1、BM-MSCs体外分离培养及exosomes鉴定：传代BM-MSCs 24h完全贴壁，细胞形态均一，呈长梭形、鱼群样生长，生长旺盛，见图1。BM-MSCs exosomes粒径30~200nm，平均粒径75.73nm，形态完整、球形、大小均一，有典型的“杯盘”形态，见图2。WB鉴定CD9阳性，结果见图3。经鉴定，从SD大鼠乳鼠脊柱中获取的传代细胞为BM-MSCs，为P3-P10代，且从BM-MSCs培养液中提取的物质为exosomes。
2、心电图改变：表2为各组大鼠不同时间节点J点位置，如表2、图4所示，假手术组大鼠心电图平稳，J点始终位于基线下方。模型组大鼠不同时间节点心电图J点位置表现出不同程度的抬高：7d时J点轻度抬高、T波高耸，14d、28d时J点均显著抬高；Q波、R波波形和振幅发生不同程度的改变：7d时改变不明显，14d时Q波、R波波形增宽、振幅增大，二者振幅接近，28d时Q波、R波波形增宽，Q波振幅大于R波。
与模型组比较，BM-MSCs-exos组、BM-MSCsDSY-exos组J点位置3个时间节点均降低，且后者7d、14d降低更显著，28d时二组J点位置基本相当。此外，假手术组大鼠7d、14d、28d时心率平稳，未见明显波动；与假手术组比较，模型组大鼠术后7d心率加快、14d心率较快、28d心率降低，BM-MSCs-exos组7d、14d心率加快、28d心率恢复，BM-MSCsDSY-exos组7d、14d、28d心率平稳。
心电图分析显示，BM-MSCsDSY-exos通过恢复QRS波群形态，降低心率，改善心肌梗死大鼠心电图。
表2：各组大鼠不同时间节点J点位置
与模型组7d、14d、28比较，*P<0.05,**P<0.01
3、血清心肌酶谱含量改变：与模型组比较，BM-MSCs-exos、BM-MSCsDSY-exos心肌注射治疗7d、14d、28d后，CK、LDH、α-HBDH、ALT、AST表达量均增高。由图5可见，与模型7d组比较，BM-MSCsDSY-exos 7d组LDH、α-HBDH、AST含量显著增高，BM-MSCs-exos 7d组α-HBDH含量显著增高；与模型28d组比较，BM-MSCsDSY-exos 28d组CK、LDH、α-HBDH、ALT、AST含量显著增高，BM-MSCs-exos 28d组LDH含量显著增高。因此，BM-MSCsDSY-exos心肌注射治疗可以显著提高心肌梗死大鼠血清心肌酶谱CK、LDH、α-HBDH、ALT、AST含量。
4、心脏大体改变：图6为各组大鼠不同时间节点心脏大体情况，如图6所示，假手术组大鼠7d、14d、28d后均可见左心室前臂及心尖部心肌呈红色，心肌颜色、心脏形态均未发生明显变化。模型组大鼠7d后结扎位置及以下可见心肌颜色发白、左心室肥大，14d后心肌发白程度、左心室肥大程度加剧，28d后心肌呈现暗灰色、心脏萎缩。BM-MSCs-exos组大鼠7d后可见心肌呈紫色、心脏形态未发生显著改变，14d后心肌颜色略发白、心脏形态未发生显著改变，28d后心肌呈灰白色、心脏萎缩。BM-MSCsDSY-exos组大鼠7d后心肌呈红紫色、心脏形态未发生显著改变，14d后心肌颜色略发白、心脏形态未发生显著改变，28d后结扎区心肌颜色发白、心脏形态未发生显著改变。通过28d实验观察，BM-MSCsDSY-exos具有改善心肌颜色、恢复心脏形态及大小的作用。
5、心肌梗死面积：各组大鼠不同时间节点心肌梗死面积结果如表3、图7所示，结果显示：随观察时间延长，模型组大鼠心梗面积呈显著增加趋势，左心腔扩张程度、心室壁变薄程度亦呈增加趋势；假手术组大鼠3个观测时间节点均未见梗死灶；BM-MSCs-exos组大鼠心梗面积呈增加趋势，但与模型组比较，范围显著缩小（14dP<0.01，28dP<0.05）；BM-MSCsDSY-exos组大鼠心脏可见小范围梗死灶，与模型组比较，范围显著缩小（14d、28d P<0.01）。TTC染色结果显示，BM-MSCsDSY-exos心肌注射治疗可显著缩小心肌梗死大鼠心梗面积。
表3 各组大鼠不同时间节点心肌梗死面积
注：与模型组7d、14d、28d比较，*P<0.05，**P<0.01.
6、心肌组织病理改变：HE染色结果见图8，如图8可见：假手术组7d、14d、28d心肌组织纤维排列整齐、横纹清晰，心肌细胞排列规则、细胞完整，未见炎性细胞浸润；模型7d组，心肌细胞、心肌纤维轻度排列紊乱，心肌细胞肿胀；模型14d组，心肌细胞、心肌纤维中度排列紊乱，心肌细胞坏死、心肌纤维溶解、间质多量炎细胞浸润；模型28d组，心肌细胞坏死、溶解，纤维、毛细血管增生，间质大量炎细胞浸润，形成瘢痕组织；与模型组比较，BM-MSCs-exos组、BM-MSCsDSY-exos组对应时间节点心肌细胞坏死、心肌纤维溶解、间质多量炎细胞浸润程度均有不同程度减轻，且BM-MSCsDSY-exos组心肌组织病理改变更轻。见图8。通过HE染色结果分析，BM-MSCsDSY-exos具有明显改善心肌组织病理形态的作用。
Masson染色可见：心肌组织Masson染色结果如图9所示，结果显示：假手术组7d、14d、28d均未见明显病理学改变；模型组7d、14d、28d，胶原纤维增生程度显著增加；与模型组对应时间节点比较，BM-MSCs-exos组和BM-MSCsDSY-exos组7d、14d、28d纤维增生程度明显减轻，且BM-MSCsDSY-exos组更轻。通过Masson染色结果分析，BM-MSCsDSY-exos具有明显抗心肌纤维增生的作用。
7、心肌细胞超微结构改变：心肌细胞超微结构改变结果如图10所示，由图10可见：假手术组7d、14d、28d均可见心肌细胞超微结构完整，肌原纤维纵向平行排列，肌丝分布均匀，肌节的位置和长度相当，线粒体排列密集，嵴丰富且排列有序，无断裂现象，核膜完整；
模型7d组，肌原纤维纵向平行排列，肌丝分布均匀，肌节的位置和长度相当，线粒体轻度肿胀，嵴间隙扩张，嵴稀少或排列混乱；
模型14d组，肌原纤维排列紊乱，肌丝断裂、溶解，线粒体肿胀、膜破裂，嵴断裂、溶解；
模型28d组，肌原纤维排列紊乱，肌丝断裂、溶解，线粒体极度肿胀、膜破裂，基质物质丢失，嵴移向周围，变短及数量减少，可见基质内空泡形成；
与模型组比较，BM-MSCs-exos组、BM-MSCsDSY-exos组对应时间点肌原纤维排列情况、线粒体肿胀与膜破裂程度、线粒体嵴排列情况等均有不同程度改善，且BM-MSCsDSY-exos改善更为显著。
透射电镜观察结果显示，BM-MSCsDSY-exos具有显著改善心肌梗死大鼠心肌细胞内肌原纤维排列情况、线粒体形态及数量等的作用。
8、心肌细胞凋亡
A、TUNEL染色结果：心肌细胞TUNEL染色结果如图11所示，结果显示：假手术组7d、14d、28d可偶见凋亡细胞；随观察时间延长，模型组心肌细胞凋亡数目呈渐进性增加；与模型组对应时间节点比较，BM-MSCs-exos组和BM-MSCsDSY-exos组心肌细胞凋亡数目均减少。见图11。结果显示，BM-MSCs-exos、BM-MSCsDSY-exos均具有抑制心肌细胞凋亡的作用。
B、p53、BAK1基因表达改变：p53、BAK1表达改变如图12所示，结果显示：
如图12A所示，与模型7d组比较，BM-MSCs-exos 7d组p53表达量显著提高；与模型14d组比较，BM-MSCs-exos 14d组、BM-MSCsDSY-exos 14d组p53表达量均显著降低；与模型28d组比较，BM-MSCs-exos 28d组、BM-MSCsDSY-exos 28d组p53表达量均显著增高。但是，在7d、14d、28d 3个观测时间点，BM-MSCsDSY-exos组p53表达量均低于BM-MSCs-exos组。
如图12B所示，与模型7d组比较，BM-MSCs-exos 7d组BAK1表达量显著降低，BM-MSCsDSY-exos 7d组BAK1表达量显著增高；与模型14d组比较，BM-MSCsDSY-exos 14d组BAK1表达量显著降低。在第7d时，BM-MSCsDSY-exos组BAK1表达量高于BM-MSCs-exos组；在第14d和28d时，BM-MSCsDSY-exos组BAK1表达量均低于BM-MSCs-exos组。
通过对Real time PCR结果分析，BM-MSCsDSY-exos通过降低促凋亡基因p53、BAK1表达，抑制心肌细胞凋亡。
C、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-GSK-3β表达改变：
如图13A所示，与模型7d组比较，BM-MSCs-exos 7d组Bax/Bcl-2比值增高，BM-MSCsDSY-exos 7d组比值降低；与模型14d组比较，BM-MSCs-exos 14d组、BM-MSCsDSY-exos14d组Bax/Bcl-2比值没有明显变化；与模型28d组比较，BM-MSCs-exos 28d组Bax/Bcl-2比值增高，BM-MSCsDSY-exos 7d组比值降低。在7d和28d时，BM-MSCsDSY-exo组Bax/Bcl-2比值均低于BM-MSCs-exos组。
如图13B所示，分别与模型组7d、14d、28d比较，BM-MSCs-exos组、BM-MSCsDSY-exos组Cleaved Caspase-3表达均降低，且BM-MSCsDSY-exo组Cleaved Caspase-3表达均低于BM-MSCs-exos组。
如图13C所示，与模型14d组比较，BM-MSCs-exos 14d组、BM-MSCsDSY-exos 14d组表达量均降低；与模型7d、28d组比较，BM-MSCs-exos组、BM-MSCsDSY-exos组p-GSK-3β表达量没有明显变化，且模型28d组p-GSK-3β表达量低于模型7d组。
WB结果显示，BM-MSCsDSY-exos通过降低凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、p-GSK-3β表达水平、提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，发挥抗心肌细胞凋亡的作用。
9、心肌细胞自噬
A、p62、LC3基因表达改变
如图14A所示，与模型7d组比较，BM-MSCsDSY-exos 7d组p62表达量显著提高；与模型14d组比较，BM-MSCs-exos 14d组、BM-MSCsDSY-exos 14d组p62表达量均显著降低；与模型28d组比较，BM-MSCs-exos 28d组、BM-MSCsDSY-exos 28d组p62表达量均显著增高。但是，在7d和28d时，BM-MSCsDSY-exos组p62表达量均高于BM-MSCs-exos组；在14d时，BM-MSCsDSY-exos组p62表达量低于BM-MSCs-exos组。
如图14B所示，与模型7d组比较，BM-MSCsDSY-exos 7d组LC3表达量显著提高；与模型14d组比较，BM-MSCs-exos 14d组、BM-MSCsDSY-exos 14d组LC3表达量均显著降低；与模型28d组比较，BM-MSCs-exos 28d组LC3表达量显著降低。但是，在7d和28d时，BM-MSCsDSY-exos组LC3表达量均高于BM-MSCs-exos组；在14d时，BM-MSCsDSY-exos组LC3表达量低于BM-MSCs-exos组。
通过对Real time PCR结果分析，BM-MSCsDSY-exos通过提高自噬基因p62、LC3表达，提高心肌细胞自噬水平。
A、p62、LC3蛋白表达改变
如图15A所示，与模型7d组比较，BM-MSCsDSY-exos 7d组p62表达量降低；与模型14d组比较，BM-MSCs-exos 14d组、BM-MSCsDSY-exos 14d组p62表达量均降低；与模型28d组比较，BM-MSCs-exos 28d组、BM-MSCsDSY-exos 28d组p62表达量均增高，且BM-MSCsDSY-exos组高于BM-MSCs-exos组。
如图15B所示，与模型7d组比较，BM-MSCsDSY-exos 7d组LC3II表达量降低；与模型14d组比较，BM-MSCs-exos 14d组、BM-MSCsDSY-exos 14d组LC3表达量未见明显改变；与模型28d组比较，BM-MSCs-exos 28d组、BM-MSCsDSY-exos 28d组LC3表达量明显增高。在7d和28d时，BM-MSCsDSY-exos组LC3表达量均高于BM-MSCs-exos组；在14d时，BM-MSCsDSY-exos组LC3表达量低于BM-MSCs-exos组。
WB结果显示，BM-MSCsDSY-exos通过提高自噬相关蛋白p62、LC3表达水平，发挥促进心肌细胞自噬的作用。
本发明通过制备SD大鼠心肌梗死模型，从宏观和微观水平评价BM-MSCsDSY-exos对心肌梗死的治疗效果。通过BM-MSCsDSY-exos心肌注射治疗，血清心肌酶含量升高；心肌梗死面积显著降低；细胞排列紊乱、心肌细胞坏死、炎细胞浸润及纤维增生明显减轻；心肌细胞内线粒体肿胀减轻，线粒体嵴数量明显增加；
Cleaved Caspase-3表达、p-GSK-3β表达及Bax/Bcl-2比值降低； p62、LC3表达提高，提示BM-MSCsDSY-exo可通过抑制心肌细胞凋亡、提高自噬水平，发挥抗心肌梗死的作用。
在国内外研究的基础上，本研究利用中药经典方剂DSY诱导提高BM-MSCs-exos抗心肌梗死的疗效，并对作用机制进行深入研究，拟将传统中医治疗与现代医学有机结合，探寻一种对慢性重大疾病心肌梗死更为精准的治疗方法。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
参考文献：
[1] Wearn J. Thrombosis of the coronary arteries with infarction ofthe heart. Am J Med Sci. 1923;165(2):250–75.
[2] Yeh RW, Sidney S, Chandra M, Sorel M, Selby JV, Go AS. Populationtrends in the incidence and outcomes of acute myocardial infarction. N Engl J Med 2010; 362: 2155–65.
[3] Shengqiong Deng, Xianjin Zhou, Zhiru Ge, et al. Exosomes fromadipose-derived mesenchymal stem cells ameliorate cardiac damage aftermyocardial infarction by activating S1P/SK1/S1PR1 signaling and promotingmacrophage M2 polarization. Int J Biochem Cell Biol. 2019 Sep;114:105564.doi: 10.1016/j.biocel.2019.105564.
[4] Teng X, Chen L, Chen W, Yang J, Yang Z, Shen Z. Mesenchymal StemCell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted MyocardiumContributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation [J]. Cell Physiol Biochem.2015, 37: 2415-24.
[5] Liu L, Jin X, Hu CF, Li R, Zhou Z, Shen CX. Exosomes Derived fromMesenchymal Stem Cells Rescue Myocardial Ischaemia/Reperfusion Injury byInducing Cardiomyocyte Autophagy Via AMPK and Akt Pathways [J]. Cell PhysiolBiochem. 2017. 43: 52-68。
Claims (5)
1.一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述外泌体为丹参饮水提取物诱导处理的骨髓间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体，其特征在于：具体制备方法为：
（1）制备丹参饮水提取物即DYS提取物：丹参30g、檀香5g、砂仁5g加8倍水浸泡30min，先将丹参煎煮50min，后加入檀香、砂仁，再煎煮10min，过滤，药渣继续加6倍水煎煮，共煮3次，收取煎煮液，浓缩蒸干，密封后4℃备用；
（2）收集骨髓间充质干细胞BM-MSCs：利用DMEM:F12完全培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞BM-MSCs，BM-MSCs接种于培养瓶内，37℃、5%CO2培养，24h后首次换液，弃去红细胞及未贴壁细胞，7~10d后传代，得到间充质干细胞BM-MSCs；
（3）制备丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体BM-MSCsDSY-exos：步骤（2）所制备的BM-MSCs用含有浓度0.16/L DSY提取物的DMEM:F12完全培养基诱导3d，弃去培养基，PBS清洗3次，然后加入DSY提取物浓度为0.16g/L的DMEM:F12无血清培养基，37℃、5%CO2培养24h后收集上清；将上清液2000g×10min、12000g×30min离心后，0.22um滤器滤去细胞碎片，滤液110000g×1h超高速离心，弃去上清、PBS重悬，重复110000g×1h超高速离心，弃去上清，保留BM-MSCs-exos，PBS重悬，-80℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述DMEM:F12完全培养基和溶解有浓度0.16/L DSY提取物的DMEM:F12无血清培养基，现用现配。
4.根据权利要求2所述的一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞为P3-P10代。
5.一种如权利要1或2所述的丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111354445.6A CN114015649B (zh) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111354445.6A CN114015649B (zh) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114015649A true CN114015649A (zh) | 2022-02-08 |
| CN114015649B CN114015649B (zh) | 2024-04-16 |
Family
ID=80064390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111354445.6A Active CN114015649B (zh) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114015649B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117982555A (zh) * | 2024-04-03 | 2024-05-07 | 广东医科大学附属医院 | 丹参来源类外泌体纳米囊泡在制备抗gc性肌病药物中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106955269A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-18 | 南方医科大学 | 一种葛根素水凝胶在心肌梗死治疗药物中的应用 |
| CN109112109A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-01-01 | 浙江大学 | 一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法 |
| CN109679897A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-26 | 浙江省肿瘤医院 | 对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法 |
| CN112402458A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-26 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种间充质干细胞和外泌体联合制剂在制备心肌梗死药物中的应用 |
-
2021
- 2021-11-16 CN CN202111354445.6A patent/CN114015649B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106955269A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-18 | 南方医科大学 | 一种葛根素水凝胶在心肌梗死治疗药物中的应用 |
| CN109112109A (zh) * | 2018-07-27 | 2019-01-01 | 浙江大学 | 一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法 |
| CN109679897A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-04-26 | 浙江省肿瘤医院 | 对骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞诱导药物及检测方法 |
| CN112402458A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-26 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种间充质干细胞和外泌体联合制剂在制备心肌梗死药物中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 陈琮: "心肌细胞外泌体对心脏的主要作用及潜在机制分析", 医药前沿, vol. 10, no. 18 * |
| 韩析言: "加味丹参饮体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究", 中国比较医学杂志, vol. 26, no. 11, pages 1 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117982555A (zh) * | 2024-04-03 | 2024-05-07 | 广东医科大学附属医院 | 丹参来源类外泌体纳米囊泡在制备抗gc性肌病药物中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114015649B (zh) | 2024-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69835354T2 (de) | Transplantate für myokardiale narben, sowie methode und zelluläre präparationen dafür | |
| CN110494154B (zh) | 心肌病、陈旧性心肌梗塞及慢性心力衰竭的治疗剂 | |
| CN113462632B (zh) | 一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用 | |
| CN114015649B (zh) | 一种丹参饮刺激的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN111172103A (zh) | 一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用 | |
| CN105597088A (zh) | 一种制剂、其制备方法及其应用 | |
| CN116831983B (zh) | 一种浓缩生长因子复合凝胶制剂、制备方法及生发应用 | |
| CN112402458A (zh) | 一种间充质干细胞和外泌体联合制剂在制备心肌梗死药物中的应用 | |
| KR20080091874A (ko) | 인간 원종 줄기세포들을 자가 배양하기 위한 배지와 그의 응용 | |
| JP2019026573A (ja) | 育毛剤 | |
| CN111304150A (zh) | 可促进移植物微循环血供恢复的ADSCs与EPCs干细胞体系 | |
| CN103638162B (zh) | 一种巴戟天寡糖4聚糖在制备抗心肌缺血及再灌注损伤药物中的应用 | |
| CN114984047B (zh) | 血浆外泌体在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 | |
| Furfaro et al. | Do adult stem cells ameliorate the damaged myocardium? Human cord blood as a potential source of stem cells | |
| WO2023082238A1 (zh) | 预防和治疗哺乳动物缺血性心脏病的药物和制备方法及应用 | |
| CN103665180A (zh) | 一种巴戟天寡糖6聚糖在制备抗心肌缺血及再灌注损伤药物中的应用 | |
| CN111184743B (zh) | 多类型混合细胞在心肌梗死细胞治疗中的应用 | |
| CN115120708A (zh) | 一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶 | |
| CN103638034A (zh) | 一种巴戟天寡糖5聚糖在制备抗心肌缺血及再灌注损伤药物中的应用 | |
| TWI732537B (zh) | 促進心肌再生之中藥組成物、其製法及其用途 | |
| WO2018031654A1 (en) | Device and methods for harvesting fat derived microvessel segments | |
| WO2023037868A1 (ja) | 線維芽細胞を含む腎疾患治療用医薬組成物 | |
| CN110151941B (zh) | 一种具有活血化瘀、通窍止痛、行气通脉作用的中药组合物及其制备方法 | |
| CN115120619A (zh) | 一种治疗动脉粥样硬化的干细胞药物 | |
| CN104587187B (zh) | 荣心丸在制备治疗扩张型心肌病的药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |