CN111172103A - 一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用，通过在培养间充质干细胞(MSC)时添加当归提取物，能促进MSC外泌体的释放，获得的外泌体具有更强的促血管内皮细胞增殖的能力，可用于机体损伤类血管新生的修复治疗；该发明方法简便易行，适用于不同来源的干细胞外泌体的大规模生产，为干细胞外泌体应用于医学转化事业提供一条新的路径；本发明公开了一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用，工艺设计合理，可行性高，且可产业化和衍生化，适用于制备不同来源的间充质干细胞的“血管修复外泌体”，同时可将干细胞外泌体应用于其他机体损伤的血管修复治疗，具有较优异的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物干细胞技术领域，具体是一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。
近年来国内外大量的基础和临床研究证实间充质干细胞可以迁移到伤口组织、分泌血管内皮生长因子等促进新生血管形成、刺激角质形成细胞参与表皮再形成，进而促进糖尿病足溃疡的愈合、改善临床症状，其原因是因为间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板样衍生生长因子(PDGF)、纤维连接蛋白(FN)等。
其中，成纤维细胞生长因子(FGF)是一类来源于中胚层和神经外胚层的细胞分泌的具有重要生物活性的细胞生长因子，也是一类重要的促有丝分裂因子和促细胞分化的诱导因子。有关研究表明，FGF能促进组织和神经修复、再生及伤口愈合和新生血管生成等多种生理作用；FGF是现如今体内发现的最有效的血管生成因子之一，其在毛细管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成等新生血管生成过程中具有明显的促进作用。
角质细胞生长因子(KGF)属于成纤维细胞生长因子(FGFs)家族的成员之一，又称FGF-7，主要由间质细胞产生，KGF与上皮细胞上的受体KGFR特异性结合来参与调控信号传递级联反应，参与组织器官发育和细胞生长增殖等多种生物过程，改善皮肤微循环及促进血管扩张，促进创伤愈合，并且在促进毛发再生也起到重要作用。但是，干细胞分泌的因子都属于大分子蛋白类，其被皮肤和毛囊前体细胞吸收的比例率差。
针对上述情况，我们公开了一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用，这是我们亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1)间充质干细胞的制备；
2)将步骤1)得到的间充质干细胞接种于培养板中，无血清培养；
3)在培养基中加入当归提取物，继续培养并收集细胞培养上清液；
4)超速离心，得到所述干细胞外泌体。
较优化地，包括以下步骤：
1)间充质干细胞的制备；步骤1)中进行间充质干细胞的制备，间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板样衍生生长因子(PDGF)、纤维连接蛋白(FN)等；
2)取步骤1)制备的间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；
3)用血球计数板进行计数，再按照1×105个细胞/孔接种于6孔板中，在温度为37℃、湿度为95％、5％CO2条件下培养24h，去除上清；步骤2)、步骤3)中进行间充质干细胞的扩增；
4)更换含有当归提取物的opti-MEM培养基，继续培养3天，并收集细胞培养上清液；步骤4)中更换含有当归提取物的opti-MEM培养基，通过当归提取物对间充质干细胞作用，促进MSC外泌体的释放，同时获得的干细胞外泌体具有更强的促血管内皮细胞增殖的能力；
5)超速离心，得到所述干细胞外泌体。
较优化地，所述步骤5)中，包括以下步骤：
A.取步骤4)收集的细胞培养上清液，在4℃、350g下离心15分钟，得到一次离心上清液；
B.取步骤A得到的一次离心上清液，在4℃、7000g下离心10分钟，得到二次离心上清液；
C.取步骤B得到的二次离心上清液，在4℃、20000g下离心20分钟，得到三次离心上清液，再将三次离心上清液经0.22μM孔径滤膜过滤，得到滤液；
D.取步骤C得到的滤液，在4℃、130000g下离心1.5h，
取沉淀物，加入pH为7.4的PBS缓存液复溶，得到所述干细胞外泌体。
较优化地，步骤4)中，所述当归提取物的制备步骤为：取当归粉末，通过水提法进行提取得到提取液，过滤除去沉淀，浓缩冻干。
较优化地，步骤4)中，水提法提取当归粉末时，提取时间为1-3h，提取次数为1-3次，当归粉末与水的重量比为1：10。
较优化地，所述当归提取物的浓度为1g/mL。
较优化地，步骤1)中，所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带、脐血或子宫内膜。
较优化地，步骤1)中，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
a)无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的组织块，整个过程在冰浴中进行；
b)将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
根据以上任意一种方案得到的干细胞外泌体在治疗血管损伤的修复药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
外泌体(exsome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，包含了复杂丰富的RNA和蛋白质类活性物质。外泌体可通过多种途径来参与调节受体细胞的生物活性，一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路；二是在细胞外基质中，外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路，有报道称一些外泌体膜上蛋白在其来源细胞膜上未能检测出；三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA以及microRNA。
现如今有关研究显示，MSCs来源的外泌体包含多种生物活性物质，如促血管生成的mRNA-200a、mRNA-20等，目前有通过饥饿及低氧来促进MSC外泌体的释放及添加血小板衍生生长因子(PDG-BB)来提高MSC外泌体的数量和性能的报道；而在传统中医中，常用当归来加入活血化瘀、跌打损伤的处分中，现代中药发展研究也显示，当归补血汤促进血管新生的报道。
本发明公开了一种当归提取物作用的干细胞外泌体及其制备方法，所述方法通过在培养间充质干细胞(MSC)时添加当归提取物，能促进MSC外泌体的释放，获得的外泌体具有更强的促血管内皮细胞增殖的能力，可用于机体损伤类血管新生的修复治疗；该发明方法简便易行，适用于不同来源的干细胞外泌体的大规模生产，为干细胞外泌体应用于医学转化事业提供一条新的路径。
本发明公开了一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用，工艺设计合理，操作简单，可行性高，且可产业化和衍生化，适用于制备不同来源的间充质干细胞的“血管修复外泌体”，同时可将并将干细胞外泌体应用于其他机体损伤的血管修复治疗，具有较优异的治疗效果，实用性好。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法的实验2中①、②、③组对比实验数据示意图；
图2为本发明一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法的实验3中④、⑤、⑥组进行定量PCR测定内皮细胞中的VEGF表达实验数据示意图；
图3为本发明一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法的实验3中④、⑤、⑥组进行定量PCR测定内皮细胞中的HIF-1α表达实验数据示意图；
图4为本发明一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法的实验1中透射电镜分析外泌体示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
S1：间充质干细胞的制备：
无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的组织块，整个过程在冰浴中进行；
再将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
S2：取S1制备的间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；再用血球计数板进行计数，再按照1×105细胞/孔接种于6孔板中，在温度为37℃、湿度为95％、5％CO2条件下培养24h，去除上清；
S3：更换含有当归提取物的opti-MEM培养基，继续培养3天，并收集细胞培养上清液；
S4：再取细胞培养上清液，在4℃、350g下离心15分钟，得到一次离心上清液；
取一次离心上清液，在4℃、7000g下离心10分钟，得到二次离心上清液；
取二次离心上清液，在4℃、20000g下离心20分钟，得到三次离心上清液，再将三次离心上清液经0.22μM孔径滤膜过滤，得到滤液；
取滤液，在4℃、130000g下离心1.5h，取沉淀物，加入pH为7.4的PBS缓冲液复溶，得到所述干细胞外泌体。
本实施例中，当归提取物的浓度为1g/mL，当归提取物的制备步骤为：取当归粉末，通过水提法进行提取得到提取液，过滤除去沉淀，浓缩冻干；其中水提法提取当归粉末时，提取时间为1-3h，提取次数为1-3次，当归粉末与水的重量比为1：10。
实施例2：
采用现有工艺进行干细胞外泌体的制备，未添加当归提取物进行作用。
实验1：
1、取实施例1-2制备的干细胞外泌体溶液，采用BCA方法测定蛋白质含量。
2、取实施例1-2制备的干细胞外泌体溶液，采用透射电镜分析外泌体的粒径大小。
结论：1、实施例1为加入当归提取物作用的干细胞外泌体，其蛋白含量为2302.5±683.3μg/108细胞；实施例2为未加入当归提取物作用的干细胞外泌体，其蛋白含量为426.7±74.8μg/108细胞。
实施例1制备的干细胞外泌体中的蛋白含量明显高于实施例2的数据，表明当归提取物作用后，干细胞外泌体的数量得到增加。
2、透射电镜分析所得干细胞外泌体的粒径大小平均为90nm左右，说明当归提取物作用后干细胞外泌体的形态良好。
实验2：采用MTT法评价MSC外泌体对血管内皮细胞的增殖影响
①组：取准备的血管内皮细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；用血球计数板进行计数；按照1×104细胞/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO2，95％湿度下培养24h，去除上清液，更换含有当归提取物作用的干细胞外泌体(10μg/mL)的opti-MEM培养基100μL，每组三个复孔，继续培养72h。去除培养基，加入MTT，继续培养4h，加入二甲基亚砜，于490nm测定吸光度值。
②组：取准备的血管内皮细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；用血球计数板进行计数；按照1×104细胞/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO2，95％湿度下培养24h，去除上清液，更换含有未经当归提取物作用的干细胞外泌体(10μg/mL)的opti-MEM培养基100μL，每组三个复孔，继续培养72h。去除培养基，加入MTT，继续培养4h，加入二甲基亚砜，于490nm测定吸光度值。
③组：取准备的血管内皮细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；用血球计数板进行计数；按照1×104细胞/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO2，95％湿度下培养24h，去除上清液，更换opti-MEM培养基100μL，每组三个复孔，继续培养72h。去除培养基，加入MTT，继续培养4h，加入二甲基亚砜，于490nm测定吸光度值。
结论：
上述①、②、③组形成对照实验，经过处理后的血管内皮细胞后的增殖率如说明书附图2所示(③组为最左边数据，②组为中间数据，①组为最右边数据)。
结合附图可知，经当归提取物作用后MSC分泌的外泌体能够更好的提高内皮细胞增殖活性。
实验3：采用定量PCR法分析血管内皮细胞中VEGF和HIF-1α的表达。
④组：取准备的血管内皮细胞，将内皮细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中，培养24h后，弃去上清换成无血清培养基在培养箱中培养4h，加入含有当归提取物作用的干细胞外泌体(10μg/mL)的opti-MEM培养基，继续培养72h后，用TRIzon总RNA提取试剂提取总RNA，再将总RNA使用PrimeScriptTMmRNA qPCR starter kit进行反转录(37℃，2h)，反转录完成后，将cDNA稀释10倍，然后用SybrGreenⅡ2×PCR Mix(Perfect Real-time)检测RNA的表达。
⑤组：取准备的血管内皮细胞，将内皮细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中，培养24h后，弃去上清换成无血清培养基在培养箱中培养4h，加入含有未经当归提取物作用的干细胞外泌体(10μg/mL)的opti-MEM培养基，继续培养72h后，用TRIzon总RNA提取试剂提取总RNA，再将总RNA使用PrimeScriptTMmRNA qPCR starter kit进行反转录(37℃，2h)，反转录完成后，将cDNA稀释10倍，然后用SybrGreenⅡ2×PCR Mix(Perfect Real-time)检测RNA的表达。
⑥组：取准备的血管内皮细胞，将内皮细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中，培养24h后，弃去上清换成无血清培养基在培养箱中培养4h，加入opti-MEM培养基，继续培养72h后，用TRIzon总RNA提取试剂提取总RNA，再将总RNA使用PrimeScriptTMmRNA qPCRstarter kit进行反转录(37℃，2h)，反转录完成后，将cDNA稀释10倍，然后用SybrGreenⅡ2×PCR Mix(Perfect Real-time)检测RNA的表达。
结论：上述④、⑤、⑥组形成对照实验，定量PCR测定内皮细胞中的VEGF和HIF-1α的表达量如说明书附图3、附图4所示(附图3、附图4中，⑥组均为最左边数据，⑤组均为中间数据，④组均为最右边数据)。
结合附图可知，经当归提取物作用后MSC分泌的外泌体能够提高血管内皮细胞的VEGF、HIF-1α的表达，而VEGF和HIF-1α表达越多，说明该血管内皮细胞的增殖能力和血管新生能力越高。
实施例5：Matrigel法评价当归提取物作用后MSC分泌的外泌体对促血管新成的效果
取准备的血管内皮细胞，将内皮细胞按照每孔5×104个细胞接种于Matrigel铺板的24孔培养板上，加入当归提取物作用的干细胞外泌体(10μg/mL)600μL，作用24h后，采用高倍显微镜观察计算毛细管网状结构数目。
同时，以外加外泌体作为阴性对照组，以未经当归提取物作用的外泌体组作为阳性对照组，每组6个复孔，形成三组对照实验。
结论：阴性对照组的每视野网状结构数量为2.41±0.65，未经当归提取物作用的外泌体组的每视野网状结构数量为3.75±0.95，经过当归提取物作用的外泌体组的每视野网状结构数量为7.46±1.24。
经过当归提取物作用的外泌体组的每视野网状结构数量显著大于未经当归提取物作用的外泌体组(P＜0.01)，由上数据表明，经过当归提取物作用后，MSC释放的外泌体对血管新生的促进能力显著增强。
结果显示，阴性对照组、未经当归提取物作用的外泌体组和当归提取物作用的外泌体组的每视野网状结构数量分别为2.41±0.65、3.75±0.95和7.46±1.24。当归提取物作用的外泌体组的每视野网状结构数量显著大于未经当归提取物作用的外泌体组(P＜0.01)。以上结果说明，经当归提取物作用后，MSC释放的外泌体对血管新生的促进能力显著增强。
结论：本发明公开了一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用，工艺设计合理，操作简单，可行性高，且可产业化和衍生化，适用于制备不同来源的间充质干细胞的“血管修复外泌体”，同时可将并将干细胞外泌体应用于其他机体损伤的血管修复治疗，具有较优异的治疗效果，实用性好。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (9)
1.一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)间充质干细胞的制备；
2)将步骤1)得到的间充质干细胞接种于培养皿中，无血清培养；
3)在培养基中加入当归提取物，继续培养并收集细胞培养上清液；
4)超速离心，得到所述干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)间充质干细胞的制备；
2)取步骤1)制备的间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；
3)用血球计数板进行计数，再按照1×105个细胞/孔接种于6孔板中，在温度为37℃、湿度为95％、5％CO2条件下培养24h，去除上清；
4)更换含有当归提取物的opti-MEM培养基，继续培养3天，并收集细胞培养上清液；
5)超速离心，得到所述干细胞外泌体。
3.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，包括以下步骤：
A.取步骤4)收集的细胞培养上清液，在4℃、350g下离心15分钟，得到一次离心上清液；
B.取步骤A得到的一次离心上清液，在4℃、7000g下离心10分钟，得到二次离心上清液；
C.取步骤B得到的二次离心上清液，在4℃、20000g下离心20分钟，得到三次离心上清液，再将三次离心上清液经0.22μM孔径滤膜过滤，得到滤液；
D.取步骤C得到的滤液，在4℃、130000g下离心1.5h，取沉淀物，加入pH为7.4的PBS缓冲液复溶，得到所述干细胞外泌体。
4.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤4)中，所述当归提取物的制备步骤为：取当归粉末，通过水提法进行提取得到提取液，过滤除去沉淀，浓缩冻干。
5.根据权利要求4所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤4)中，水提法提取当归粉末时，提取时间为1-3h，提取次数为1-3次，当归粉末与水的重量比为1：10。
6.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述当归提取物的浓度为1g/mL。
7.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带或子宫内膜。
8.根据权利要求7所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
a)无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的组织块，整个过程在冰浴中进行；
b)将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
9.按权利要求1-8中任意一项所述的干细胞外泌体在治疗血管损伤的修复药物中的用途。
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