CN115820548B - 一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法，该方法步骤如下：分离动物组织并剪碎、在含有星形孢菌素的培养基中诱导凋亡、通过梯度离心法分离得到组织来源的凋亡囊泡。本发明首次以动物组织为起始材料制备凋亡囊泡，制备方法简单，时间短，产量高，成本低。通过本发明的方法制备的凋亡囊泡具有调控大鼠骨髓间充质干细胞活性、促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化、促进成纤维细胞迁移等作用，在相关疾病的治疗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用。
背景技术
细胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)是一种由细胞分泌的双层膜结构的囊泡样小体，其内含有丰富的蛋白、RNA和脂质，是细胞或组织的关键通讯媒介，在多种生理过程中发挥着重要的作用。凋亡囊泡(apoptotic vesicles,apoVs)是细胞凋亡后释放的细胞外囊泡，由于其内含有丰富的蛋白、RNA和脂质，是细胞或组织的关键通讯媒介，也是细胞外囊泡研究的新兴领域。凋亡囊泡在多种疾病中如糖尿病、血友病、骨质疏松等疾病中，可发挥重要的治疗作用。
细胞是构成人体结构和功能的基本单位,组织是由数量众多的不同结构和功能的细胞组成，组织来源的囊泡具有一定的组织特异性和功能，也有可能在不同的疾病中发挥重要作用。目前，凋亡囊泡的提取主要来自于培养的细胞或体液，但是提取细胞来源的凋亡囊泡需要培养大量细胞，比较费时，且成本较高，体液来源的凋亡囊泡提取量较少，很大程度上限制了凋亡囊泡在生物医学领域的应用。因此寻找一种提取量大且成本较低的凋亡囊泡提取方法十分重要。
发明内容
针对现有细胞外囊泡提取方法的不足之处，本发明的目的是提供一种动物组织来源的凋亡囊泡(apoVs)的制备方法及其应用。
本发明通过以下技术方案来解决其技术问题：
一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法，包括以下步骤；
(1)分离动物组织并将其剪碎；
(2)将步骤(1)中剪碎的组织在含有星形孢菌素的培养基中诱导凋亡；
(3)收集步骤(2)诱导后的组织上清液，通过梯度离心法分离得到组织来源的凋亡囊泡。
具体地，所述动物为哺乳动物，所述哺乳动物包括人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；
更具体地，所述哺乳动物为人、大鼠、小鼠。
具体地，所述组织包括脂肪组织、牙槽骨组织、牙龈组织；
更具体地，所述组织为脂肪组织、牙槽骨组织、牙龈组织。
具体地，所述凋亡囊泡为粒径小于1μm的凋亡微囊泡。
具体地，步骤(2)中所述培养基为加入含星形孢菌素的α-MEM培养基，所述诱导凋亡的时间为12h。
具体地，步骤(3)中所述梯度离心法的步骤如下：
(1)800g、4℃条件下离心10min，收集上清液；
(2)将步骤(1)中获得的上清液于2000g、4℃条件下离心10min，收集上清液；
(3)将步骤(2)中获得的上清液于16000g、4℃条件下离心30min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中获得的沉淀用无菌PBS洗涤后于16000g、4℃条件下离心30min，获得组织来源的凋亡囊泡。
本发明还提供了一种前述方法在制备调控骨髓间充质干细胞活性的药物中的应用；
具体地，所述骨髓间充质干细胞来源于人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；
具体地，所述应用中凋亡囊泡的剂量为0.01-0.1ug/mL。
本发明还提供了一种前述方法在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用；
具体地，所述骨髓间充质干细胞来源于人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；
具体地，所述应用中凋亡囊泡的剂量为1-100ng/mL。
本发明还提供了一种前述方法在制备促进人皮肤成纤维细胞迁移的药物中的应用；
具体地，所述应用中凋亡囊泡的剂量为1-100ng/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)相比于细胞来源的凋亡囊泡，本发明的方法制备的组织来源的凋亡囊泡不需要进行细胞培养，制备方法较为简单，成本低。
(2)相比于体液来源的凋亡囊泡，本发明的方法制备的组织来源的凋亡囊泡产量较高，且具有一定的组织特异性。
(3)本发明的方法制备的凋亡囊泡具有提高细胞活性、促进骨髓间充质干细胞成骨分化、促进成纤维细胞迁移等多种生物活性，有可能在相关疾病的治疗中发挥重要作用。
附图说明
图1为动物组织来源的凋亡囊泡的提取流程图。
图2为动物组织来源的凋亡囊泡的提取示意图。
图3为不同组织来源的凋亡囊泡的透射电镜观测图；脂肪apoVs代表脂肪组织来源的凋亡囊泡，牙槽骨apoVs代表牙槽骨组织来源的凋亡囊泡，牙龈apoVs代表牙龈组织来源的凋亡囊泡。
图4为不同组织来源的凋亡囊泡的纳米颗粒跟踪分析检测结果图；脂肪apoVs代表脂肪组织来源的凋亡囊泡，牙槽骨apoVs代表牙槽骨组织来源的凋亡囊泡，牙龈apoVs代表牙龈组织来源的凋亡囊泡。
图5为不同组织来源的凋亡囊泡的囊泡标志物western blot检测结果，图5A为脂肪组织和脂肪apoVs(脂肪组织来源的凋亡囊泡)的囊泡标志物CD9和CD81的电泳图，图5B为牙槽骨组织和牙槽骨apoVs(牙槽骨组织来源的凋亡囊泡)的囊泡标志物CD9和CD81的电泳图，图5C为牙龈组织和牙龈apoVs(牙龈组织来源的凋亡囊泡)的囊泡标志物CD9和CD81的电泳图。
图6为CCK8实验检测不同组织来源的凋亡囊泡对大鼠骨髓间充质干细胞细胞活性的调控作用结果图；图6A为随着时间的变化不同浓度(0/0.01/0.1/1/10μg/mL)的脂肪apoVs(脂肪组织来源的凋亡囊泡)对大鼠骨髓间充质干细胞细胞活性的影响；图6B为随着时间的变化不同浓度(0/0.01/0.1/1/10μg/mL)的牙槽骨apoVs(牙槽骨组织来源的凋亡囊泡)对大鼠骨髓间充质干细胞细胞活性的影响；图6C为随着时间的变化不同浓度(0/0.01/0.1/1/10μg/mL)的牙龈apoVs(牙龈组织来源的凋亡囊泡)对大鼠骨髓间充质干细胞细胞活性的影响。
图7为不同组织来源的凋亡囊泡对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化影响的ALP染色和ARS染色结果图；图7A为检测不同浓度(1/10/100ng/mL)的脂肪apoVs(脂肪组织来源的凋亡囊泡)对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响的ALP染色图和ARS染色图；图7B为检测不同浓度(1/10/100ng/mL)的牙槽骨apoVs(牙槽骨组织来源的凋亡囊泡)对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响的ALP染色图和ARS染色图；图7C为检测不同浓度(1/10/100ng/mL)的牙龈apoVs(牙龈组织来源的凋亡囊泡)对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响的ALP染色图和ARS染色图。
图8为检测不同组织来源的凋亡囊泡对皮肤成纤维细胞的细胞划痕实验结果；图8A为随着时间的变化不同浓度(0/1/10/100ng/mL)的脂肪apoVs(脂肪组织来源的凋亡囊泡)对皮肤成纤维细胞迁移速度的影响；图8B为随着时间的变化不同浓度(0/1/10/100ng/mL)的牙槽骨apoVs(牙槽骨组织来源的凋亡囊泡)对皮肤成纤维细胞迁移速度的影响；图8C为随着时间的变化不同浓度(0/1/10/100ng/mL)的牙龈apoVs(牙龈组织来源的凋亡囊泡)对皮肤成纤维细胞迁移速度的的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂家购买得到的。
实施例1组织来源的凋亡囊泡的提取步骤和特征分析
如图1-2的流程所示，提取组织来源的凋亡囊泡的步骤如下：处死大鼠后，使用剪刀取出大鼠组织(如腹部脂肪组织、牙龈组织、牙槽骨组织等)，使用无菌PBS多次冲洗后，将组织剪碎，并转移至培养皿或培养瓶中，加入含星形孢菌素(Staurosporine，STS，APExBIO，A8192)的α-MEM培养基(Aqlabtech，AQ12571)于细胞孵箱中进行凋亡诱导，加入组织与培养基的体积比1：10-1：20。诱导12小时后，使用40μm细胞过滤器过滤，收集组织上清液。随后通过梯度离心法获取组织来源的凋亡囊泡。
所述梯度离心法的步骤如下：将过滤后收集的上清液于800g、4℃条件下离心10min(第一次离心)，收集上清液；将第一次离心后收集的上清液于2000g、4℃条件下离心10min(第二次离心)，收集上清液；将第二次离心后后收集的上清液于16000g、4℃条件下离心30min(第三次离心)，收集沉淀；将第三次离心后收集的沉淀用无菌PBS洗涤后于16000g、4℃条件下离心30min，即得组织来源的凋亡囊泡。
通过透射电镜观察组织来源的凋亡囊泡的形态与粒径，使用纳米颗粒跟踪分析检测其浓度，通过western blot检测其囊泡标志物CD9和CD81的表达。
如图3所示，三种不同组织来源(脂肪、牙槽骨、牙龈)的凋亡囊泡形态均为双面凹的圆盘状。
如图4所示，脂肪组织来源的凋亡囊泡粒径为218.8+/-2.8nm；牙槽骨组织来源的凋亡囊泡粒径为201.0+/-10.9nm；牙龈组织来源的凋亡囊泡粒径为181.1+/-7.4nm。
如图5所示，囊泡标志物CD9和CD81在脂肪组织、牙槽骨组织和牙龈组织中表达量低，而在从这三种组织提取的凋亡囊泡中均呈现高表达，说明本实施例从脂肪组织、牙槽骨组织、牙龈组织中成功提取到凋亡囊泡。
实施例2体外检测组织来源的凋亡囊泡对大鼠骨髓间充质干细胞细胞活性的调控作用
通过BCA试剂盒(PierceTM BCA Protein Assay，Thermo scientific，23228)检测不同组织来源的凋亡囊泡的浓度，并设立不同浓度分组，具体设置6个浓度分组：0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL，对大鼠骨髓间充质干细胞进行细胞增殖检测，在接种后的1到7天通过CCK8实验检测细胞活性。
如图6所示，随着时间的进展，在0.01-1μg/mL浓度范围内，脂肪组织来源的凋亡囊泡对细胞活性无明显影响，而浓度到达10μg/mL时，则对细胞活性有明显抑制。牙槽骨来源的凋亡囊泡在0.01-0.1μg/mL浓度范围对细胞活性无显著影响，浓度超过1μg/mL时，则对细胞活性有明显抑制。牙龈来源的凋亡囊泡在0.01-1μg/mL浓度范围对细胞活性无显著影响，浓度在10μg/mL时，则对细胞活性有明显抑制。
实施例3体外检测组织来源的凋亡囊泡对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化的调控作用
提取大鼠原代骨髓间充质干细胞，麻醉处死大鼠后，分离股骨，剪断后使用培养基将骨髓腔冲出，培养传代后，将大鼠骨髓间充质干细胞接种于孔板，分别进行普通增殖培养(PM，含有10％FBS和1％青-链霉素双抗的α-MEM培养基)、成骨诱导培养(OM，含有10％FBS、1％青-链霉素双抗、10nM地塞米松、0.2mM抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠的α-MEM培养基)以及成骨诱导培养条件下添加组织来源的凋亡囊泡(OM+apoVs)(凋亡囊泡的添加量设置三个浓度：1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)，培养7天和14天后，分别进行碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红S(ARS)染色。
如图7所示，ALP染色结果显示加入脂肪、牙槽骨、牙龈组织来源的凋亡囊泡后，大鼠间充质干细胞的ALP染色相比对照组加深，ARS染色结果显示加入脂肪、牙槽骨、牙龈组织来源的凋亡囊泡后，大鼠间充质干细胞的ARS染色着色程度相比对照组明显加深，表明在1-100ng/mL的安全浓度范围内，脂肪组织、牙槽骨、牙龈来源的凋亡囊泡对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化均有促进作用。
实施例4体外检测组织来源的凋亡囊泡对皮肤成纤维细胞的细胞迁移的调控作用
将人皮肤成纤维细胞(Sciencell公司)接种于孔板，细胞密度达到100％时，制造划痕，并使用无血清或低血清(FBS＜2％)培养基(不含FBS或含有＜2％FBS和1％青-链霉素双抗的α-MEM培养基)继续培养细胞。向培养基内加入不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)的脂肪组织、牙槽骨、牙龈来源的凋亡囊泡，在0h、24h、48h后取出细胞于显微镜下拍照，并根据划痕的宽度计算细胞迁移的速度。
如图8所示，添加不同浓度的三种组织来源的囊泡后，在一定浓度范围内，脂肪组织、牙槽骨和牙龈来源的凋亡囊泡均能促进皮肤成纤维细胞的迁移能力。脂肪组织来源的凋亡囊泡在1-100ng/mL时能促进皮肤成纤维细胞的迁移能力，其中1ng/mL的浓度促进效果较为显著；牙槽骨来源的凋亡囊泡在1-100ng/mL时浓度时能促进皮肤成纤维细胞的迁移能力，其中1ng/mL的浓度促进效果较为显著；牙龈来源的凋亡囊泡在1-100ng/mL时的浓度时能促进皮肤成纤维细胞的迁移能力，其中10ng/mL的浓度促进效果较为显著。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种动物组织来源的凋亡囊泡在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用，其特征在于，所述凋亡囊泡的制备方法包括以下步骤；
（1）分离动物组织并将其剪碎；
（2）将步骤（1）中剪碎的组织在含有星形孢菌素的培养基中诱导凋亡；
（3）收集步骤（2）诱导后的组织上清液，通过梯度离心法分离得到组织来源的凋亡囊泡，
其中所述动物组织为大鼠的脂肪组织，所述凋亡囊泡为粒径小于1μm的凋亡微囊泡。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述培养基为加入含星形孢菌素的α-MEM培养基，所述诱导凋亡的时间为12 h。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）中所述梯度离心法的步骤如下：
（1）800g、4℃条件下离心10 min，收集上清液；
（2）将步骤（1）中获得的上清液于2000g、4℃条件下离心10 min，收集上清液；
（3）将步骤（2）中获得的上清液于16000g、4℃条件下离心30 min，收集沉淀；
（4）将步骤（3）中获得的沉淀用无菌PBS洗涤后于16000g、4℃条件下离心30 min，获得组织来源的凋亡囊泡。
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