CN114410576A - 一种脂肪干细胞外泌体在生发中的用途 - Google Patents

一种脂肪干细胞外泌体在生发中的用途 Download PDF

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CN114410576A CN202210012302.5A CN202210012302A CN114410576A CN 114410576 A CN114410576 A CN 114410576A CN 202210012302 A CN202210012302 A CN 202210012302A CN 114410576 A CN114410576 A CN 114410576A
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Abstract

本发明涉及一种脂肪干细胞外泌体在生发中的用途，所述脂肪干细胞外泌体的制备方法为：取对数生长的第3至6代的小鼠脂肪干细胞用含FBS的完全培养液培养，直到细胞密度达到70％‑80％，换用含无外泌体FBS的DMEM培养液继续培养45‑50小时，收集上清培养液，离心除去细胞和细胞碎片，再用100kDa分子量的超滤管于1500‑2500g下离心30min浓缩，将外泌体快速提取试剂加入到浓缩液提取，离心，收集小鼠脂肪干细胞外泌体。体外和体内实验表明，本发明的小鼠脂肪干细胞外泌体能显著促进毛发生长，效果突出。

Description

一种脂肪干细胞外泌体在生发中的用途
技术领域
本发明涉及干细胞外泌体的医药用途，具体地说，涉及一种脂肪干细胞外泌体在生发中的用途。
背景技术
脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)是一类存在于脂肪组织中，具有多向分化潜能的间充质干细胞。在体外和体内，ADSC均具有分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经元、血管内皮细胞、腱细胞等多种细胞系的潜能。
外泌体(Exosome)是一类能够被细胞分泌到细胞培养上清中、具有脂质双分子层结构、直径为30-150nm的细胞外囊泡。外泌体含有多种蛋白质、核酸(miRNA，mRNA，lncRNA，circRNA)和脂质等成分，是细胞间通讯的重要载体，几乎所有细胞均可释放外泌体。
外泌体应用广泛，能够用于多种疾病治疗，副作用小，减少人体排斥反应。
专利文献CN112704688A公开了一种基于自体脂肪干细胞外泌体的生发注射液，所述生发注射液由自体脂肪干细胞外泌体和注射用水组成，其制备方法包括如下步骤：步骤1，自体脂肪的选择；步骤2，脂肪干细胞的制备；步骤3，脂肪干细胞外泌体的制备；步骤4，脂肪干细胞外泌体的生发注射液的制备。专利文献CN110339338A公开了一种生发剂，所述生发剂包含脂肪间充质干细胞条件培养液、成纤维细胞外泌体、甘露醇、海藻糖和右旋糖酐40，其中，所述脂肪间充质干细胞采用以20-100mJ/cm2的UVB辐照剂量辐照，辐照后的脂肪间充质干细胞分泌多种生物活性因子，能够刺激毛乳头，激活毛囊干细胞，达到从内到外的生发功效。
而我们知道，细胞外的环境成分复杂，常见的外泌体分离方法难以完全分离非囊泡实体和细胞外囊泡组分，因此外泌体分离方法影响分离得到的细胞外囊泡的组成，并由此产生功能上的差异。此外，分泌外泌体的细胞种类、状态也是影响外泌体功能的重要因素。目前尚未见如本申请所述的小鼠脂肪干细胞外泌体和用于生发的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种小鼠脂肪干细胞外泌体的用途。
第一方面，本发明提供了一种小鼠脂肪干细胞外泌体在制备生发的药物中的应用，所述小鼠脂肪干细胞外泌体是按照以下方法制备得到的：
(a)取对数生长的第3至6代的小鼠脂肪干细胞，用10％FBS DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗，换用含10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续在37℃、5％CO2培养箱中培养45-50小时，收集上清培养液；
(b)3000g×15min离心上清培养液以除去细胞和细胞碎片，将上清液转移至100kDa分子量的超滤管中再次1500-2500g离心30min，收集浓缩液；
(c)将外泌体提取试剂加入到浓缩液中，轻轻震荡混匀，放置4℃下至少12h；
(d)将混合物离心，4℃，1500g×30min，小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体，即得所述小鼠脂肪干细胞外泌体。
作为本发明的一个优选例，所述小鼠脂肪干细胞分离自5-10天龄C57BL/6小鼠。
作为本发明的另一优选例，步骤(a)中，换用含10％无外泌体FBS的DMEM培养液后继续培养48小时，开始收集上清培养液。
作为本发明的另一优选例，步骤(a)中吸走原培养液后用PBS清洗1-3次。
作为本发明的另一优选例，步骤(b)中上清液转移至超滤管后的离心参数为：1500g，30min。
第二方面，本发明提供了一种小鼠脂肪干细胞外泌体，所述小鼠脂肪干细胞外泌体是按照以下方法制备得到的：
(a)取对数生长的第3至6代的小鼠脂肪干细胞，用10％FBS DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗，换用含10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续在37℃、5％CO2培养箱中培养45-50小时，收集上清培养液；
(b)3000g×15min离心上清培养液以除去细胞和细胞碎片，将上清液转移至100kDa分子量的超滤管中再次1500-2500g离心30min，收集浓缩液；
(c)将外泌体提取试剂加入到浓缩液中，轻轻震荡混匀，放置4℃下至少12h；
(d)将混合物离心，4℃，1500g×30min，小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体，即得所述小鼠脂肪干细胞外泌体。
第三方面，本发明提供了如上所述的小鼠脂肪干细胞外泌体在制备促进毛囊数量和/或真皮厚度增加的药物中的应用。
第四方面，本发明提供了如上所述的小鼠脂肪干细胞外泌体在制备体外促进毛囊毛乳头细胞增殖的实验试剂中的应用。
第五方面，本发明提供了一种促进生发的药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的小鼠脂肪干细胞外泌体和常规的药用载体。
本发明优点在于：
本发明通过快速高效的方法制备得到一种小鼠脂肪干细胞外泌体，经体外和体内实验证实所述小鼠脂肪干细胞外泌体对于毛囊毛乳头细胞的增殖有显著的促进作用，能显著增加小鼠毛囊数量和真皮厚度，促进小鼠毛发生长，作用显著强于其他方法制备的外泌体。脱发是一种皮肤科的常见疾病，其患病率较高且常常影响患者身心健康。现有的治疗手段主要有药物、激光、手术等方式，但这些手段面临着治疗周期长、药物副作用、费用高和有创等不足，因此脱发治疗一直是国际上的难点和热点问题，如何促进毛发再生是学界亟待解决的难题。本发明的对毛发生长作用显著的小鼠脂肪干细胞外泌体有望开发为治疗脱发的药物，进而为脱发治疗提供一种非手术、无细胞治疗手段。由于外泌体属于无细胞成分，因此相比于现阶段的手术治疗脱发具有低免疫原性、无致瘤、无致栓的优势；而与现阶段治疗脱发的药物相比，由于外泌体含有可参与细胞间信息交流的核酸(如microRNA)、蛋白质和脂质，这些功能性分子有可能靶向作用于毛发生长的效应细胞(如毛囊毛乳头细胞)发挥作用，从而更精准地治疗。此外从可操作性的角度来说，外泌体属于无细胞成分，易于存储、运输、大规模生产及转化为产品。
附图说明
图1：分离得到的ADSC-Exo。
图2：ADSC-Exo的粒径分析。
图3：ADSC-Exo的透射电镜分析。
图4：western blot鉴定外泌体标记蛋白。
图5：ADSC-Exo促进毛囊毛乳头细胞的增殖。*P＜0.05，**P＜0.01。
图6：ADSC-Exo促进小鼠毛发生长。A.两组小鼠的毛发生长情况肉眼观察。B.两组小鼠毛囊数量、真皮厚度的统计结果。*P＜0.05，**P＜0.01。
图7：分离培养的脂肪干细胞成脂分化显示油红染色阳性。
图8：分离培养的脂肪干细胞成软骨分化显示细胞团块阿利辛蓝染色阳性。
图9：分离培养的脂肪干细胞成骨分化显示茜素红染色阳性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、材料与方法
1材料
1.1动物来源
实验使用SPF级C57BL/6雄性小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于同济大学实验动物中心，实验研究伦理受同济大学实验动物中心批准。
1.2主要实验试剂/耗材
DMEM培养基(Gibco，美国，货号：C11995500BT)、磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferSolution，PBS，Gibco，美国)、0.05％胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，Gibco，美国)、FetalBlood Serum(FBS，Gibco，美国，货号：10099141C)、I型胶原酶(Worthington，美国)。
Figure BDA0003458102850000041
Ultra-15 Centrifugal Filter Unit(Millipore，USA，货号UFC910008)、ExoQuick-TC(货号EXOTC10A-1，SBI Biosciences，SBI，美国)、Anti-CD9抗体(abcam，英国)、Anti-CD81抗体(abcam，英国)、Anti-TSG101抗体(abcam，英国)。
2方法
2.1脂肪干细胞的制备
(1)脂肪组织来源于SPF级、7天龄C57BL/6小鼠，于无菌环境下取双侧腹股沟脂肪，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维成分。
(2)脂肪组织标本用配制好的含1％抗生素(青霉素/链霉素)的无菌PBS冲洗液反复冲洗数次，除去血性液体及筋膜成分，获取纯的脂肪组织。
(3)用组织剪将脂肪组织剪成乳糜状，然后加入0.1％的I型胶原酶，37℃震荡消化30min，使组织均匀消化。
(4)2000g，10min离心，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，放于37℃、5％CO2培养箱中进行贴壁培养。
(5)24h后换液，用PBS洗去未贴壁的细胞及其他杂质，然后加入新鲜培养液，以后每三天换一次液，待细胞密度达到80％时，用0.05％胰酶进行消化和传代。在得到第3代脂肪干细胞后，通过检测其成脂分化、成软骨分化和成骨分化的潜能进行细胞鉴定。成脂、成软骨、成骨分化诱导分别采用成脂诱导培养基、成软骨诱导培养基、成骨诱导培养基培养2-3周后，进行油红、阿利辛蓝、茜素红染色观察染色结果。结果显示鉴定的细胞符合脂肪干细胞特征(图7-9)。
2.2脂肪干细胞外泌体的制备
(1)取对数生长的第3代的脂肪干细胞用10％FBS DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗3遍，换用10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，收集上清培养液。
(2)3000g×15min离心上清液以除去细胞和细胞碎片。将上清转移至100kDa分子量的超滤管中再次1500g下离心30min，将上清液浓缩至1-2ml，收集浓缩液。
(3)将ExoQuick-TC(SBI)试剂按1：5体积比加入到浓缩液中，轻轻震荡混匀，放置4℃12h。
(4)将混合物离心，4℃，1500g×30min。小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体。加入适量PBS或灭菌注射用水，轻轻吹打沉淀，得到重悬液。
(5)使用BCA蛋白测定试剂盒检测外泌体浓度，余下外泌体-80℃保存备用。
2.3脂肪干细胞外泌体的鉴定
通过利用纳米颗粒追踪分析仪(NTA)、透射电镜(TEM)、western blot三个方面对脂肪干细胞外泌体进行鉴定。
二、结果
选取P3代ADSC在无外泌体血清条件下培养48h收集上清，应用Exoquick TC试剂进行ADSC-Exo的提取(图1)。结果成功提取了ADSC-Exo，并通过纳米颗粒追踪分析仪(NTA)、透射电镜(TEM)和western blot方法进行鉴定。
1纳米颗粒追踪分析仪(NTA)
通过NTA方法分析ADSC-Exo的粒径大小，结果显示其平均大小约144.3nm，基本符合外泌体大小(图2)。
2透射电镜(TEM)
通过透射电镜方法，分析ADSC-Exo的形态，结果显示电镜下呈现出外泌体的形态(图3)。
3 western blot
通过western blot方法鉴定外泌体的三种标记蛋白TSG101、CD9、CD81的表达情况，结果如图4所示，ADSC-Exo中三种标记蛋白均有表达，进一步证实所鉴定即为ADSC-Exo。
实施例2
一、材料与方法
1材料
1.1动物来源
实验使用SPF级C57BL/6雄性小鼠和SPF级SD雄性大鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于同济大学实验动物中心，实验研究伦理受同济大学实验动物中心批准。
1.2主要实验试剂/耗材
DMEM培养基(Gibco，美国，货号：C11995500BT)、磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferSolution，PBS，Gibco，美国)、0.05％胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，Gibco，美国)、FetalBlood Serum(FBS，Gibco，美国，货号：10099141C)、I型胶原酶(Worthington，美国)、CCK8试剂(Cell Counting Kit-8，Dojindo，日本)。
2方法
2.1脂肪干细胞外泌体促进毛囊毛乳头增殖实验
将第3-5代大鼠毛囊毛乳头细胞接种于96孔板(5000cells/孔)，设置5个ADSC-Exo(按照实施例1的方法制备)浓度梯度(0、50、100、200、400μg/ml)及复孔。37℃，5％二氧化碳培养箱过夜使其贴壁，弃培养液，PBS洗3遍，然后加入上述的ADSC-Exo共孵育0、24、48、72h。检测前将CCK8试剂以1:10加入DMEM基础培养基中，混匀后加入每孔，37℃条件下孵育1h，用酶标仪检测ADSC-Exo作用0h、24h、48h、72h的OD450nm的吸光度，观察毛乳头细胞增殖情况。
2.2动物实验
选取7周龄C57BL/6雄性小鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，用剃毛器剃除小鼠背部约2*2cm大小的方形区域毛发，将其分为2组：PBS组和Exo(即ADSC-Exo)组。Exo组外泌体用量为脱毛区皮下注射Exo 400μg/只，PBS组则给予等体积PBS。在处理后观察记录21天内两组小鼠的毛发生长情况差异。
二、结果
1 ADSC-Exo促进毛囊毛乳头细胞的增殖
毛囊毛乳头细胞增殖实验表明，ADSC-Exo处理能显著促进细胞增殖(图5)。
2 ADSCs-Exo促进小鼠毛发生长
小鼠体内实验结果显示ADSC-Exo处理小鼠毛发生长较PBS组(对照组)更好，毛囊数量、真皮厚度等较对照组均更大(图6)。说明此种方法制备的ADSCs-Exo具有生发作用。
实施例3
一、材料与方法
1材料
1.1动物来源
实验使用SPF级C57BL/6雄性小鼠和SPF级SD雄性大鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于同济大学实验动物中心，实验研究伦理受同济大学实验动物中心批准。
1.2主要实验试剂/耗材
DMEM培养基(Gibco，美国，货号：C11995500BT)、磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferSolution，PBS，Gibco，美国)、0.05％胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，Gibco，美国)、FetalBlood Serum(FBS，Gibco，美国，货号：10099141C)、I型胶原酶(Worthington，美国)。
Figure BDA0003458102850000071
Ultra-15 Centrifugal Filter Unit(Millipore，USA，货号UFC910008)、ExoQuick-TC(货号EXOTC10A-1，SBI Biosciences，SBI，美国)。CCK8试剂(Cell CountingKit-8，Dojindo，日本)。
2方法
2.1外泌体提取方法
2.1.1脂肪干细胞的制备
(1)脂肪组织来源于SPF级、7天龄C57BL/6小鼠，于无菌环境下取双侧腹股沟脂肪，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维成分。
(2)脂肪组织标本用配制好的含1％抗生素(青霉素/链霉素)的无菌PBS冲洗液反复冲洗数次，除去血性液体及筋膜成分，获取纯的脂肪组织。
(3)用组织剪将脂肪组织剪成乳糜状，然后加入0.1％的I型胶原酶，37℃震荡消化30min，使组织均匀消化。
(4)2000g，10min离心，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，放于37℃、5％CO2培养箱中进行贴壁培养。
(5)24h后换液，用PBS洗去未贴壁的细胞及其他杂质，然后加入新鲜培养液，以后每三天换一次液，待细胞密度达到80％时，用0.05％胰酶进行消化和传代。
2.1.2脂肪干细胞外泌体的制备
2.1.2.1提取方法一
(1)取对数生长期的第3代的脂肪干细胞，用10％无外泌体FBS的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，收集上清培养液。
(2)3000g×15min离心上清液以除去细胞和细胞碎片。取上清转移至100kDa分子量的超滤管中再次1500g下离心30min，浓缩上清液，收集浓缩液。
(3)将ExoQuick-TC(SBI)试剂按1：5体积比加入到浓缩液中，轻轻混匀，放置4℃12h。
(4)将混合物离心，4℃，1500g×30min。小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体。加入适量PBS或灭菌注射用水，轻轻吹打沉淀，得到重悬液。
2.1.2.2提取方法二
(1)取对数生长的第3代的脂肪干细胞用10％FBS DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗3遍，换用10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，收集上清培养液。
(2)3000g×15min离心上清液以除去细胞和细胞碎片。取上清转移至100kDa分子量的超滤管中再次1500g下离心30min，浓缩上清液，收集浓缩液。
(3)将ExoQuick-TC(SBI)试剂按1：5体积比加入到浓缩液中，轻轻震荡混匀，放置4℃12h。
(4)将混合物离心，4℃，1500g×30min。小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体。加入适量PBS或灭菌注射用水，轻轻吹打沉淀，得到重悬液。
2.1.2.3提取方法三
(1)取对数生长的第3代的脂肪干细胞用10％FBS DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗3遍，换用10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，收集上清培养液。
(2)3000g×15min离心上清液以除去细胞和细胞碎片。取上清转移至100kDa分子量的超滤管中再次1000g下离心30min，浓缩上清液，收集浓缩液。
(3)将ExoQuick-TC(SBI)试剂按1：5体积比加入到浓缩液中，轻轻震荡混匀，放置4℃12h。
(4)将混合物离心，4℃，1500g×30min。小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体。加入适量PBS或灭菌注射用水，轻轻吹打沉淀，得到重悬液。
2.1.2.4提取方法四
(1)取对数生长的第3代的脂肪干细胞用10％FBS DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗3遍，换用10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，收集上清培养液。
(2)3000g×15min离心上清液以除去细胞和细胞碎片。取上清转移至100kDa分子量的超滤管中再次2000g下离心30min，浓缩上清液，收集浓缩液。
(3)将ExoQuick-TC(SBI)试剂按5:1体积比加入到浓缩液中，轻轻震荡混匀，放置4℃12h。
(4)将混合物离心，4℃，1500g×30min。小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体。加入适量PBS或灭菌注射用水，轻轻吹打沉淀，得到重悬液。
2.1.2.5提取方法五
(1)取对数生长的第3代的脂肪干细胞用10％FBS DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗3遍，换用10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，收集上清培养液。
(2)3000g×15min离心上清液以除去细胞和细胞碎片。取上清转移至100kDa分子量的超滤管中再次3000g下离心20min，浓缩上清液，收集浓缩液。
(3)将ExoQuick-TC(SBI)试剂按5:1体积比加入到浓缩液中，轻轻震荡混匀，放置4℃12h。
(4)将混合物离心，4℃，1500g×30min。小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体。加入适量PBS或灭菌注射用水，轻轻吹打沉淀，得到重悬液。
2.2.3外泌体形态观察
通过透射电镜(TEM)观察脂肪干细胞外泌体的形态。
2.2.4外泌体产量测定
使用BCA蛋白测定试剂盒检测外泌体浓度。每组测定3个样品，实验重复3次。
2.2.5 ADSC-Exo促进毛囊毛乳头细胞的增殖实验
将第3-5代大鼠毛囊毛乳头细胞接种于96孔板(5000cells/孔)，37℃，5％二氧化碳培养箱过夜使其贴壁，弃培养液，PBS洗3遍，加入ADSC-Exo与毛乳头细胞共孵育，终浓度最大为400μg/ml，设置3-5个复孔。将CCK8试剂以1:10加入DMEM基础培养基中，混匀后加入每孔，37℃条件下孵育1h，用酶标仪检测OD450nm的吸光度，计为0h值。之后于ADSC-Exo孵育24h、48h、72h检测，观察毛乳头细胞增殖情况。实验重复三次。
二、结果
1外泌体形态学观察
电镜下观察可见，以上提取方法得到的外泌体均呈现出外泌体典型形态，为圆形或椭圆形的囊泡状结构。
2外泌体产量比较
经检测，方法二提取的外泌体产量最高，选择该提取方式作为最优选提取外泌体方法。外泌体产量由大到小排序为：提取方法二>提取方法一>提取方法三>提取方法四>提取方法五。与提取方法二比较，提取方法一、三、四、五的外泌体产量均显著低于提取方法二(P<0.05)，表明外泌体浓缩步骤中，离心力大小对于外泌体提取效率有显著的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种小鼠脂肪干细胞外泌体在制备生发的药物中的应用，其特征在于，所述小鼠脂肪干细胞外泌体是按照以下方法制备得到的：
(a)取对数生长的第3至6代的小鼠脂肪干细胞，用10％FBSDMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗，换用含10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续在37℃、5％CO2培养箱中培养45-50小时，收集上清培养液；
(b)3000g×15min离心上清培养液以除去细胞和细胞碎片，将上清液转移至100kDa分子量的超滤管中再次1500-2500g离心30min，收集浓缩液；
(c)将外泌体提取试剂加入到浓缩液中，轻轻颠倒混匀，放置4℃下至少12h；
(d)将混合物离心，4℃，1500g×30min，小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体，即得所述小鼠脂肪干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小鼠脂肪干细胞分离自5-10天龄C57BL/6小鼠。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(a)中，换用含10％无外泌体FBS的DMEM培养液后继续培养48小时，开始收集上清培养液。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(a)中吸走原培养液后用PBS清洗1-3次。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(b)中上清液转移至超滤管后的离心参数为：1500g，30min。
6.一种小鼠脂肪干细胞外泌体，其特征在于，所述小鼠脂肪干细胞外泌体是按照以下方法制备得到的：
(a)取对数生长的第3至6代的小鼠脂肪干细胞，用10％FBSDMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％-80％，吸走原培养液，用PBS清洗，换用含10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续在37℃、5％CO2培养箱中培养45-50小时，收集上清培养液；
(b)3000g×15min离心上清培养液以除去细胞和细胞碎片，将上清液转移至100kDa分子量的超滤管中再次1500-2500g离心30min，收集浓缩液；
(c)将外泌体提取试剂加入到浓缩液中，轻轻颠倒混匀，放置4℃下至少12h；
(d)将混合物离心，4℃，1500g×30min，小心弃上清，加入PBS继续离心1500g×5min，吸去残余液体，即得所述小鼠脂肪干细胞外泌体。
7.权利要求6所述的小鼠脂肪干细胞外泌体在制备促进毛囊数量和/或真皮厚度增加的药物中的应用。
8.权利要求6所述的小鼠脂肪干细胞外泌体在制备体外促进毛囊毛乳头细胞增殖的实验试剂中的应用。
9.一种促进生发的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求6所述的小鼠脂肪干细胞外泌体和常规的药用载体。
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