CN112245451A - 脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用 - Google Patents

脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用，涉及毛发再生技术领域。本发明对大鼠创伤后毛发进行观察，所述微囊泡可以促进创伤后的毛发再生，表现为毛发长度与重量均增加，且高浓度微囊泡效果更为显著；所述微囊泡可以促进皮肤结构的合理化分布，具体表现在胶原的结构更加合理，附属结构显著地的增多，毛囊数量增多。本发明所述微囊泡来源于间质干细胞，免疫原性低，不存在排斥反应，安全性更可控，可直接刺激损伤后的毛囊再生；在使用时，所述微囊泡为微粒计数，剂量便于掌握。

Description

脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构 再生的制剂中的应用
技术领域
本发明属于毛发再生技术领域，具体涉及脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用。
背景技术
脱发属于临床皮肤科常见病及多发病，包括老年性脱发、斑秃、化疗性脱发以及脂溢性脱发等，其中大多数患者属于斑秃或脂溢性脱发。目前临床常用的脱发治疗药物包括维A酸、阿托品、糖皮质激素等，但患者若长期使用西药进行治疗毒副作用较大，对其身心均造成一定伤害，已引起广大医务工作者高度重视。中医辨证治疗脱发效果显著，且毒副作用较少，无明显药物依赖性，但治疗疗程相对较长。毛发移植是治疗脱发的一种手术方式，是将非脱发区的毛囊提取并处理后移植至脱发或秃发区域，但此方法价格相对昂贵。自体富血小板血浆注射是将自体富血小板血浆局部注射至脱发区域头皮皮层，此方法也有一定的副作用。
近年来，间质干细胞因其免疫调节和组织修复能力以及对肿瘤发展的影响而备受关注。间质干细胞是一类中胚层多能干细胞，具有多向分化潜能，优先存在于几乎所有人类组织和器官的血管周间隙的壁龛中，在倒置显微镜下观察，MSCs是相对均匀的成纤维细胞样细胞，具有旋转填充贴壁生长特性。研究表明MSC可以通过分化为皮肤细胞、汗腺细胞和旁分泌促进皮肤创伤后的毛发等附属结构的再生，在毛发再生中具有临床应用前景。但是干细胞的伦理、安全性、难以储存和运输等问题限制其临床应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用，所述微囊泡可促进皮肤创伤后毛发再生和毛囊再生。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用。
优选的，所述皮肤附属结构包括毛发和毛囊。
优选的，所述制剂以PBS缓冲液为溶剂，包含4.5×108～4.5×1011个所述微囊泡/200μl。
本发明提供了一种促进创伤后皮肤附属结构再生的制剂，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为 4.5×108～4.5×1011个/200μl。
本发明提供了一种促毛发生长的制剂，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为4.5×108～4.5×1011个/200μl。
本发明提供了一种促毛囊再生的制剂，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为4.5×108～4.5×1011个/200μl。
本发明提供了脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用，对大鼠创伤后毛发进行观察，与对照PBS相比，低浓度微囊泡与高浓度微囊泡均可以促进创伤后的毛发再生，表现为毛发长度与重量均增加，且高浓度微囊泡效果更为显著；经皮肤组织病理切片苏木精伊红染色(HE染色)后的观察表明，与PBS组对照相比，高浓度微囊泡与低浓度微囊泡均可以促进皮肤结构的合理化分布，具体表现在胶原的结构更加合理，附属结构显著地的增多，毛囊数量增多。本发明所述微囊泡来源于间质干细胞，免疫原性低，不存在排斥反应，安全性更可控，可直接刺激损伤后的毛囊再生；在使用时，所述微囊泡为微粒计数，剂量便于掌握。
附图说明
图1为MSC及其微囊泡的鉴定图，其中A为脐带间质干细胞；B为脐带间质干细胞透射电镜图；C为脐带间质干细胞微囊泡表面标记图；
图2为Nanosight技术测微囊泡粒径，其中A为微囊泡峰值；B为镜下观察微囊泡图；
图3为微囊泡促进大鼠创伤后毛发再生的治疗模型图，其中图3A为PBS 对照、低浓度和高浓度组在第1d、第4d和第7d的治疗效果对比图；图3B 为PBS对照、低浓度和高浓度组在第10d、第13d和第16d的治疗效果对比图；
图4为微囊泡促进小鼠创伤后毛发再生的治疗模型图；
图5为老鼠背部毛发重量和长度图；
图6为皮肤组织病理切片HE染色结果图；
图7为毛囊数量的对比图。
具体实施方式
本发明提供了脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用。
本发明所述皮肤附属结构优选包括毛发和毛囊，所述脐带间质干细胞来源的微囊泡促创伤后皮肤附属结构再生具体表现在，促进毛发生长和促毛囊再生。本发明所述制剂优选以PBS缓冲液为溶剂，包含4.5×108～4.5×1011个所述微囊泡/200μl。
本发明对脐带间质干细胞来源的微囊泡的制备方法并没有特殊限定，优选按照HucMSC分离培养及鉴定方法体外培养扩增MSC(Qiao Chun et al. Human mesenchymalstem cells isolated from the umbilical cord.Cell Biol Int. 2008Jan；32(1):8-15)。本发明从人脐带间质干细胞中提取微囊泡，具体步骤优选包括：待所述MSC生长面积覆盖80％后用无血清培养基培养48h收集培养上清液，2000g，10min离心除去细胞碎片后即为脐带间质干细胞分泌的上清(MSC-CM)；将收集的MSC-CM经差速离心弃去细胞碎片及细胞器后移至15ml规格的100000Da MWCO超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至 5ml浓度为30％的蔗糖/D2O密度垫上，4℃条件下，100000g离心3h，收集底部5ml的缓冲垫(含微囊泡)用PBS稀释洗涤后，置入100000Da MWCO 超滤离心管中洗涤，最后将收集的微囊泡浓缩液定量，0.22μm滤膜过滤除菌，Nanosigt法测定胞外囊泡的微粒数，分装，于-70℃冷藏备用。利用本发明所述提取方法，提取得到的微囊泡具有直径约为100nm的囊泡状结构，较均一，且微粒数量原始浓度2.2～2.5×108/μl。
本发明提供了一种促进创伤后皮肤附属结构再生的制剂，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为 4.5×108～4.5×1011个/200μl。本发明对所述制剂的剂型和种类并没有特殊限定，可为药品、护肤品或洗发水等。
本发明提供了一种促毛发生长的制剂，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为4.5×108～4.5×1011个/200μl。本发明所述制剂的剂型、种类和使用方法等与上述制剂相同，在此不再赘述。
本发明提供了一种促毛囊再生的制剂，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为4.5×108～4.5×1011个/200μl。本发明所述制剂的剂型、种类和使用方法等与上述制剂相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例中所使用的主要材料和来源分别如下：
MSC培养试剂低糖DMEM、胎牛血清(Gibco公司产品)、胰蛋白酶 (Sigma公司产品)、二氧化碳培养箱(Forma公司)、无血清培养基(上海依科赛公司；
倒置显微镜，荧光显微镜，生物显微镜，电子显微镜，超净工作台，台式离心机。
微囊泡提取试剂：重水(D2O，上海创赛公司)，分析纯蔗糖(广州化学试剂厂)，兔抗人CD9抗体(美国BioworldTechnology公司)，兔抗人CD63 抗体(美国Epitomics公司)，BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP) 标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)，HRP化学发光底物、100-kDa MWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)；透射电子显微镜(FEI Tecnai 12，Philips公司)；超速离心机(美国贝克曼公司)。
实施例1
脐带间质干细胞(hucMSC)来源微囊泡的获得
(1)脐带MSC的分离培养：按早期建立的HucMSC分离培养及鉴定方法体外培养扩增MSC(Qiao Chun et al.Human mesenchymal stem cells isolated from the umbilicalcord.Cell Biol Int.2008Jan；32(1):8-15)，选择增殖能力强，状态好的健康人MSC(图1中A)，生长面积覆盖80％后用无血清培养基培养48h收集培养上清液，2000g，10min离心除去细胞碎片后即为MSC-CM，-70℃冷藏备用。
(2)脐带间质干细胞分泌的上清中微囊泡的分离纯化：将收集的 MSC-CM经差速离心弃去细胞碎片及细胞器后移至15ml规格的100000Da MWCO超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至5ml浓度为30％的蔗糖/D2O密度垫上，4℃条件下，100000g离心3h，收集底部5ml的缓冲垫(含微囊泡) 用PBS稀释洗涤后，置入100000Da MWCO超滤离心管中洗涤，最后将收集的微囊泡浓缩液定量，0.22μm滤膜过滤除菌，Nanosigt法测定胞外囊泡的微粒数，分装，于-70℃冷藏备用。
(3)透射电镜观察微囊泡的基本形态：MSC微囊泡20μL，充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH 6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照，可见如图1中B所示微囊泡直径约为100nm的囊泡状结构；
(4)westernblot检测微囊泡表面标记蛋白：配制12％SDS-PAGE电泳胶，将上述提取的微囊泡充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与兔抗人CD9抗体和兔抗人CD81抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃温育1h)， TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如图1中C所示，脐带来源的微囊泡的标记。
(5)Nanosight技术测得此微囊泡粒径约为100nm左右，较均一。微粒数量原始浓度2.2～2.5×108/μl，如图2所示。
实施例2
创伤大鼠模型的构建及所述微囊泡对瘢痕大鼠的治疗效果
动物模型所需材料：8周龄雌性SD大鼠，普通饲料(济南朋悦实验动物有限公司)其他器材：一次性注射针筒，
(1)SD大鼠皮肤创伤模型的构建：将体重200g的大鼠用10％水合氯醛麻醉，背部应用8％的Na2S进行脱毛处理，用无菌手术器械制备一个直径为2cm的圆形全层皮肤缺损创面，第2～3d结痂，第7d左右形成皮肤创伤模型；
(2)微囊泡的干预治疗：设置三组实验组，PBS对照组，高浓度组，低浓度组(高浓度：4.5×1011/只实验动物；低浓度：4.5×108/只实验动物)；每组各第三只，将每只大鼠在瘢痕周围皮下组织注射200μl磷酸盐缓冲液 (PBS)溶解高浓度及低浓度微囊泡进行治疗，以PBS作为空白对照；修复效果观察的时间分别是第1d，4d，7d，10d，13d，16d，并进行拍照，如图 3所示，大鼠创伤后毛发再生观察照片表明，与对照PBS相比，低浓度微囊泡与高浓度微囊泡均可以促进创伤后的毛发再生。
实施例3
小鼠创伤后毛发再生微囊泡的治疗效果
(1)C57BL/6小鼠皮肤创伤模型的构建：将小鼠用10％水合氯醛麻醉，背部应用8％的Na2S进行脱毛处理，用无菌手术器械制备一个直径为2cm 的圆形全层皮肤缺损创面，第2～3d结痂，第7d左右形成皮肤创伤模型；
(2)微囊泡的干预治疗：设置三组实验组，PBS对照组，高浓度组，低浓度组(高浓度：4.5×1011/只实验动物；低浓度：4.5×108/只实验动物)；每组各3只，将每只小鼠在创伤周围皮下组织注射200μl磷酸盐缓冲液(PBS) 溶解高浓度及低浓度微囊泡进行治疗，以PBS作为空白对照；修复效果观察的时间分别是第1d，5d，10d，15d，18d并进行拍照，如图4所示，小鼠创伤后毛发再生观察照片表明，与对照PBS相比，低浓度微囊泡与高浓度微囊泡均可以促进创伤后的毛发再生。
取小鼠的背部毛发，称量其重量并测量长度，结果如图5所示，高浓度微囊泡与低浓度微囊泡的毛发长度与重量均增加，其中高浓度微囊泡效果最为显著。
皮肤组织病理切片苏木精伊红染色(HE染色)的观察结果显示，与PBS 组对照相比，高浓度微囊泡与低浓度微囊泡均可以促进皮肤结构的合理化分布(图6)，具体表现在胶原的结构更加合理，附属结构显著地的增多，毛囊数量增多(图7)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.脐带间质干细胞来源的微囊泡在制备促创伤后皮肤附属结构再生的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述皮肤附属结构包括毛发和毛囊。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述制剂以PBS缓冲液为溶剂，包含4.5×108～4.5×1011个所述微囊泡/200μl。
4.一种促进创伤后皮肤附属结构再生的制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为4.5×108～4.5×1011个/200μl。
5.一种促毛发生长的制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为4.5×108～4.5×1011个/200μl。
6.一种促毛囊再生的制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分包括脐带间质干细胞来源的微囊泡，所述微囊泡的数量为4.5×108～4.5×1011个/200μl。
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