CN114515353A - 一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶、其制备方法及应用。所述的复合水凝胶包括脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料，其中所述的脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料的体积比为1：1：2～4。本发明所提供的复合水凝胶可缓慢释放脐带干细胞外泌体，延长外泌体在创伤表面的驻留时间，加快伤口的修复愈合。同时，本发明通过在培养基中添加脐静脉内皮细胞外泌体提高脐带间充质干细胞的产量及活性；通过在培养基添加VCAM1试剂，提高脐带间充质干细胞外泌体的产量；通过对脐带间充质干细胞修饰使其高表达miR‑525‑3p后提高外泌体活性，进而促进外泌体对皮肤的修复作用。

Description

一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶、其 制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶、其制备方法及应用。
背景技术
皮肤是人体与外界直接接触的器官，是人体的保护屏障。由于皮肤直接与外界接触，所以皮肤也是最容易受到损伤的，一般小的损伤，皮肤会自发缓慢修复，但是修复的时间非常漫长；而当皮肤大面积损伤时，通过皮肤自身的修复就比较困难，需要使用外部辅助医疗来修复。
目前常见皮肤修复方式是通过生物型人工皮肤移植来修复皮肤损伤，但是生物型人工皮肤与原患者的皮肤具有不同的免疫原性，使得移植的皮肤的治疗方式具有很大的局限性。
另外，目前皮肤修复的方式还有通过中药缓慢调理，使得皮肤自行缓慢修复，但是治疗周期长，患者需要忍受较长时间的痛苦。
近年来，随着对干细胞的深入研究，逐渐出现了一些干细胞相关的生物制剂在治疗皮肤损伤方面的应用，如ZL201410775694.6公开了人脐带间质干细胞分泌的exosome治疗皮肤损伤的应用，具体涉及一种脐带间质干细胞分泌的直径为100nm左右的囊泡结构exosome在促进皮肤损伤修复中的药用作用，所述的exosome是来源于人脐带间质干细胞，经试验验证，所涉及的exosome作为脐带间质干细胞分泌的重要“成分”对皮肤损伤方面(包括烧烫伤和切除损伤)具有明显促修复的药用作用。
又如CN201410273905.6提供了人脐带间充质干细胞复合细胞因子在制备修复皮肤损伤的生物制剂中的应用，所述的皮肤损伤包括激光灼伤，也可以是热灼伤、冷冻伤或普通外伤、皮肤物理化学性损伤。该发明首次将脐带干细胞复合生长因子用于人皮肤激光损伤治疗中，在一定保存条件下，人脐带间充质干细胞复合细胞因子可以保存最大活性，并发挥最大的损伤修复治疗作用。
再如CN202010240486.1公开了一种用于皮肤创面修复的含干细胞外泌体的凝胶制备方法，该方法包括以下步骤：1)人脐带间充质干细胞的原代提取和培养：1.1)人脐带间充质干细胞的原代提取；1.2)传代培养；1.3)培养上清收集；2)人脐带间充质干细胞分泌体提取；2.1)初次离心；2.2)二次离心；2.3)去除细胞器离心；2.4)外泌体粗提；2.5)外泌体终提；3)凝胶材料制备：3.1)壳聚糖制备；3.2)β-GP配置；3.3)凝胶材料制备；4)凝胶负载外泌体。该发明可促进皮肤创面修复，缩短伤口愈合时间及减少瘢痕形成。
然而，现有技术中无论是水凝胶溶胀吸附还是电荷吸附，外泌体的释放都是以扩散的形式为主，释放速率快。面对大面积皮肤损伤修复，由于外泌体的释放过快，无法实现后期调控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶、其制备方法及应用。该复合水凝胶可缓慢释放脐带干细胞外泌体，提高外泌体在创伤表面的驻留时间，加快伤口的修复愈合。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，其中，所述的复合水凝胶包括脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料，所述的脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料的体积比为1：1：2～4。
优选地，所述的脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料的体积比为1：1：3。
进一步地，所述的凝胶材料由益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液和β-GP水溶液制备而成。
本发明中，采用益多酚、透明质酸钠和壳聚糖配置而成的益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液与β-GP水溶液制备凝胶材料，能够包封外泌体，使外泌体缓慢释放，从而提高外泌体在创伤表面的驻留时间。外泌体包含的大量细胞因子能够深入到创面皮肤基底层促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，促进损伤皮肤组织的结构重建与再生修复，可以应用于各种原因引起的伤口。
进一步地，所述的益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液和β-GP水溶液的体积比为9：1。
进一步地，所述的透明质酸钠的分子量为120-140万Da，所述的壳聚糖的N-脱乙酰度为95％以上。
本发明还提供所述的复合水凝胶的制备方法，具体地说，所述的制备方法为：
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，低温保存。
进一步地，所述的凝胶材料的制备方法包括如下步骤：
1)益多酚/透明质酸钠/壳聚糖的配置：将透明质酸钠用无菌水溶解，得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加壳聚糖，然后再添加益多酚，搅拌，得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：将β-GP溶解于无菌注射用水中，搅拌，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：在低温环境下将得到的β-GP水溶液逐步滴加至益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌，得到凝胶材料。
本发明中，在透明质酸钠溶液中添加壳聚糖和益多酚配置得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液，然后再与β-GP水溶液制备成凝胶材料，试验表明该凝胶材料能够包封外泌体，使外泌体缓慢释放，从而延长外泌体在创伤表面的驻留时间，延长作用效果，加快伤口修复愈合。
进一步地，步骤1)中，所述壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶液总质量的1-8％；所述益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的1-3％；所述的透明质酸钠溶液的质量分数为0.1-0.8％。
进一步地，步骤4)中，所述的低温环境为-5～5℃。
进一步地，所述脐带干细胞是通过采用含有脐静脉内皮细胞外泌体的培养基培养同源脐带间充质干细胞获得的；优选，所述脐带干细胞是用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞。
进一步地，所述脐带干细胞外泌体是通过采用含有VCAM1试剂的培养基培养所述miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞获得的。
本发明中，所述的脐带干细胞外泌体是由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取制备得到。所述脐带干细胞的原代培养按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述脐带干细胞经过原代培养后进行传代培养，所述传代培养的方式为本领域技术人员熟知的，本申请不进行特别的限制。
作为优选方案，本发明所采用的脐带干细胞均为P2～P5代。
作为另一种优选方案，本发明所述脐带干细胞是通过采用含有脐静脉内皮细胞外泌体的培养基培养同源脐带间充质干细胞获得的。外泌体携带特定miRNA，具有增强干细胞的生物学作用。因此通过在培养基中添加外泌体，促进脐带间充质干细胞的增殖及迁移，快速增加脐带间充质干细胞数量，保证生存活性，避免多代培养数量增加活性降低，为其分泌更多的外泌体提供前提条件。且通过采用含有脐静脉内皮细胞外泌体使得同源细胞间能够减小移植免疫排斥。
作为最优选方案，所述脐带干细胞是用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞。通过对脐带间充质干细胞修饰使其高表达miR-525-3p后提高外泌体活性，进而促进外泌体对皮肤的修复作用。
所述脐带干细胞经过传代培养后进行提取，得到外泌体。
作为优选方案，本发明所述外泌体的提取优选按照invitrogen试剂盒说明书提取。脐带干细胞经过传代培养后提取，得到了外泌体。将所述外泌体进行保存以备用。
作为最优选方案，本发明所述脐带干细胞外泌体是通过采用含有VCAM1试剂的培养基培养所述miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞获得。通过VCAM1试剂提高外泌体产量。
本发明中，所述的低温保存为在4℃下保存。
本发明还进一步提供所述的复合水凝胶在制备治疗皮肤损伤药物方面的应用。
试验表明，本发明制备的基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶中的脐带干细胞外泌体可持续释放，延长外泌体在创伤表面的驻留时间，从而达到长效的效果，进而表明其可以加快伤口愈合时间。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明所提供的复合水凝胶可缓慢释放脐带干细胞外泌体，延长外泌体在创伤表面的驻留时间，加快伤口的修复愈合；
(2)同时，本发明通过在培养基中添加脐静脉内皮细胞外泌体提高脐带间充质干细胞的产量及活性，为快速制备大量脐带间充质干细胞外泌体做准备；通过在培养基添加VCAM1试剂，以提高脐带间充质干细胞外泌体的产量；通过对脐带间充质干细胞修饰使其高表达miR-525-3p后提高外泌体活性，进而促进外泌体对皮肤的修复作用。
附图说明
图1为本发明和对比例的复合水凝胶经时溶蚀曲线；
图2为在小鼠伤口处涂抹本发明实施例2的复合水凝胶后第0天、第3天、第7天和第12天的创面变化图；
图3为在小鼠伤口处涂抹本发明实施例4的复合水凝胶后第0天、第3天、第7天和第12天的创面变化图。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
以下实施例1-3及对比例1-3中，所述的脐带干细胞和脐带干细胞外泌体采用如下方法制备得到：
1)脐带干细胞原代培养
取健康足月剖腹产婴儿的脐带，于超净台中进行无菌清洗，剥离脐带羊膜和动静脉，取出沃顿胶，用手术剪进行剪碎，用DMEM+10％FBS完全培养基重悬后接种至15cm平皿中，转移至5％CO2，37℃的环境中培养。
于5天后补液，直至细胞爬出，弃去组织块，补充新的完全培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代。
2)脐带干细胞传代培养
①取可传代的PO代细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mlPBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面，弃去洗液。
②加入2mL0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底；显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩；当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基中止消化。
③反复吹打，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，室温离心1500rpm/5min。
④弃上清，加入DMEM+10％FBS完全培养基重悬细胞，按密度为1×105cells传代培养。将培养瓶置于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
⑤待细胞生长至融合时，重复操作⑤进行细胞扩增培养。如无说明，本发明实施例1-3中所用人脐带干细胞为P2至P5代。
3)外泌体的分离
收集P2-P5代UC-MSCs培养上清，按照invitrogen试剂盒说明书提取外泌体。具体步骤为：
将培养上清转至高速离心管中，4℃，2000g离心30min，去除细胞碎片。取上清，转移至新的高速离心管中，以细胞上清液：试剂＝2：1的比例加入试剂，用涡旋器充分混匀后，置于冰箱中4℃过夜孵育。在4℃环境中10000g离心60min，弃去上清，用500μL4℃的PBS溶液缓冲液重悬即为外泌体悬液，置于-20℃保存。
以下实施例4-6中，所述的脐带干细胞和脐带干细胞外泌体采用如下方法制备得到：
1)脐带干细胞的制备
①将脐带剪切并分离，得到脐动脉、脐静脉和脐带胶质；
②将步骤①中得到的脐静脉，采用0.1％Ⅰ型胶原酶脐带静脉灌注消化法，分离得到脐静脉内皮细胞，取脐静脉内皮细胞的培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐静脉内皮细胞外泌体；
③将步骤②中得到的脐静脉内皮细胞外泌体，加入至DMEM-F12培养基中，得到含有脐静脉内皮细胞外泌体的DMEM-F12培养基；
④将步骤①中得到的脐带胶质剪碎成组织块，并加入至步骤③得到的含有脐静脉内皮细胞外泌体的DMEM-F12培养基中进行培养，得到第2代脐带间充质干细胞；
⑤用miR-525-3p过表达腺病毒感染步骤④得到的第2代脐带间充质干细胞得到miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞。
2)脐带干细胞外泌体的制备
①将VCAM1试剂加入至DMEM-F12培养基中，得到含有VCAM1试剂的DMEM-F12培养基；
②将得到的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞接种至步骤①得到的含有VCAM1试剂的DMEM-F12培养基中进行培养，取miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞的培养上清液，采用超速离心法，分离、提取得到脐带间充质干细胞外泌体。
实施例1
一、凝胶材料的制备
1)益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液的配置：在无菌水中缓慢加入水重量0.5％的分子量为120万Da的透明质酸钠，完全溶解后得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加N-脱乙酰度为96％的壳聚糖，N-脱乙酰度为96％的壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶液总质量的5％，然后再添加益多酚，益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的2％，搅拌，得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水凝胶的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：2混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
实施例2
一、凝胶材料的制备
1)益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液的配置：在无菌水中缓慢加入水重量0.1％的分子量为140万Da的透明质酸钠，完全溶解后得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加N-脱乙酰度为98％的壳聚糖，N-脱乙酰度为98％的壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶液总质量的1％，然后再添加益多酚，益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的1％，搅拌，得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水凝胶的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：3混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
实施例3
一、凝胶材料的制备
1)益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液的配置：在无菌水中缓慢加入水重量0.8％的分子量为130万Da的透明质酸钠，完全溶解后得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加N-脱乙酰度为97％的壳聚糖，N-脱乙酰度为97％的壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶液总质量的8％，然后再添加益多酚，益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的3％，搅拌，得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水胶胶制剂的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：4混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
实施例4
具体操作步骤同实施例2，与实施例2所不同的是所述脐带干细胞是用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞；所述脐带间充质干细胞外泌体是通过采用含有VCAM1试剂的培养基培养所述miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞获得。
实施例5
一、凝胶材料的制备
1)益多酚/透明质酸钠/壳聚糖的配置：在无菌水中缓慢加入水重量0.2％的分子量为135万Da的透明质酸钠，完全溶解后得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加N-脱乙酰度为95％的壳聚糖，N-脱乙酰度为95％的壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶液总质量的2％，然后再添加益多酚，益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的1.5％，搅拌，得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水凝胶的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：2.5混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
实施例6
一、凝胶材料的制备
1)益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液的配置：在无菌水中缓慢加入水重量0.3％的分子量为125万Da的透明质酸钠，完全溶解后得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加N-脱乙酰度为98％的壳聚糖，N-脱乙酰度为98％的壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶液总质量的3％，然后再添加益多酚，益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的2.5％，搅拌，得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水凝胶的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：3.5混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
对比例1
一、凝胶材料的制备
1)壳聚糖溶液的配置：取200gN-脱乙酰度为96％的壳聚糖，加入至9ml浓度为0.1M、pH4.0的乙酸中，搅拌2h，得到壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水凝胶的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：2混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
对比例2
一、凝胶材料的制备
1)透明质酸钠/壳聚糖溶液的配置：在无菌水中缓慢加入水重量0.5％的分子量为120万Da的透明质酸钠，完全溶解后得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加N-脱乙酰度为96％的壳聚糖，N-脱乙酰度为96％的壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶总质量的5％，得到透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水凝胶的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：2混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
对比例3
一、凝胶材料的制备
1)益多酚/壳聚糖溶液的配置：取200gN-脱乙酰度为96％的壳聚糖，加入至9ml浓度为0.1M、pH4.0的乙酸中，搅拌2h，向所得的溶液中添加益多酚，益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的2％，搅拌，得到益多酚/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：取0.56gβ-GP溶解于2ml无菌注射用水中，搅拌5min，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：取1ml步骤2)得到的β-GP水溶液，在-5～5℃下将其逐步滴加至9ml益多酚/壳聚糖溶液中，搅拌10min，得到凝胶材料。
二、复合水凝胶的制备
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料以体积比1：1：2混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，4℃下保存。
试验例1、体外溶蚀试验
凝胶溶蚀是控制药物释放的主要因素，该试验采用无膜溶出模型研究实施例1和各对比例制备的复合水凝胶中脐带干细胞外泌体的溶蚀动力学药物释放情况：
1、试验方法
(1)分别精密吸取实施例1、对比例1、对比例2和对比例3制备的水凝胶制剂，置于预先已称重的10mL具塞刻度试管中，再行称重，使加入的水凝胶质量大概为5g左右；
(2)将试管置于(37℃±0.5)的恒温水浴振荡器中平衡10min，使水凝胶制剂完全胶凝。
(3)加入37℃1mL的PBS溶剂作为释放介质，在30r/min恒温水浴震荡，分别在1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h和12h倾出全部释放介质，将试管外表面用滤纸吸干，迅速称量并记录；
(4)将试管重新放入恒温水浴中平衡10min，在补充释放介质1mL；如此反复操作，直至剩余凝胶量不足加入量的10％，考察时设置3个平行管(重复)，结果取其平均值。
(5)直至试验结束，相邻时间点的样品重量差异即为在此期间凝胶溶蚀量。计算不同时间点凝胶的累计溶蚀率(M％)，(M％)的计算公式为：(M％)＝Et/E*100％，其中Et为t时刻的累计凝胶溶蚀量；E为凝胶初始重量；
(6)以不同时间点复合水凝胶的累积百分溶蚀率(M％)对时间(t)作图，得到复合水凝胶经时溶蚀曲线。
2、试验结果
试验结果见图1所示：
从图1可以看出，对比例1、对比例2和对比例3制得的复合水凝胶溶蚀过快。而凝胶溶蚀是控制药物释放的主要因素。图1的结果表明，本发明实施例1制得的复合水凝胶中的脐带干细胞外泌体可持续释放，延长外泌体在创伤表面的驻留时间，达到长效的效果。
试验例2、小鼠伤口愈合对照实验
本试验例研究了本发明实施例1、对比例1、对比例2和对比例3制备的复合水凝胶用于小鼠皮肤伤口修复愈合的性能，具体方法如下：
(1)实验动物选择12只健康成年Bab1/c小鼠18-20g。根据Bab1/c小鼠的性别和体重，按照雄性0.5mL/100g剂量注射10％水合氯醛，雌性0.35mL/100g剂量注射10％水合氯醛的方法，对小鼠进行腹腔麻醉注射。
(2)在小鼠应答不能，麻醉完毕之后，使用硫化钠溶液对小鼠背部进行脱毛，以暴露手术区，脱毛完成后使用95％酒精清洗硫化钠试剂，用干棉球擦干小鼠身躯。
(3)在小鼠左右侧随机选择一边，距脊柱3cm处使用环形切割刀割去直径为0.6cm的圆形皮肤全层切口，切除的皮肤弃去。
(4)使用随机双盲法将小鼠分为试验组、对照组1、对照组2和对照组3四组，试验组涂抹本发明实施例1制备的复合水凝胶，每日涂抹一次；对照组1涂抹对比例1制备的复合水凝胶，每日涂抹一次；对照组2涂抹对比例2制备的复合水凝胶，每日涂抹一次；对照组3涂抹对比例3制备的复合水凝胶，每日涂抹一次。每日拍照记录，通过与1cm×1cm大小的黑色色块对比，测定皮肤伤口面积。经过统计分析，试验组小鼠的伤口收缩面积明显快于对照组(见表1)。
表1、各组水凝胶制剂促进环形伤口愈合的收缩面积的测试结果
Figure BDA0003516327690000131
上述试验结果表明，涂抹本发明的复合水凝胶治疗后，小鼠环形伤口愈合时间加快。
试验例3、小鼠伤口愈合试验
本试验例研究了本发明实施例2和实施例4制备的复合水凝胶用于小鼠皮肤伤口修复愈合的性能，以考察在其它条件相同的情况下，使用不同的脐带干细胞和脐带干细胞外泌体制得的复合水凝胶对伤口修复的影响。具体方法如下：
(1)实验动物选择2只健康成年Bab1/c小鼠18-20g。根据Bab1/c小鼠的性别和体重，按照雄性0.5mL/100g剂量注射10％水合氯醛，雌性0.35mL/100g剂量注射10％水合氯醛的方法，对小鼠进行腹腔麻醉注射。
(2)在小鼠应答不能，麻醉完毕之后，使用硫化钠溶液对小鼠背部进行脱毛，以暴露手术区，脱毛完成后使用95％酒精清洗硫化钠试剂，用干棉球擦干小鼠身躯。
(3)在小鼠左右侧随机选择一边，距脊柱3cm处使用环形切割刀割去直径为0.6cm的圆形皮肤全层切口，切除的皮肤弃去。
(4)两只小鼠分别涂抹本发明实施例2和实施例4制备的复合水凝胶，每日涂抹一次。分别于第0天、第3天、第7天和第12天拍照，观察伤口愈合情况。涂抹实施例2的复合水凝胶的小鼠伤口愈合情况如图2所示，涂抹实施例4的复合水凝胶的小鼠伤口愈合情况如图3所示。
从图2和图3可以看出，在小鼠伤口处涂抹本发明制备的复合水凝胶后第3天，伤口血液凝固、干结，伤口面积开始缩小；第7天，伤口结痂，伤口面积继续缩小；第12天，伤口基本愈合。
上述试验结果表明，涂抹本发明的复合水凝胶治疗后，小鼠环形伤口愈合修复较快，12天基本愈合。但与实施例2相比，在小鼠伤口处涂抹实施例4制备的复合水凝胶时，伤口修复愈合的效果更加明显。可见通过在培养基中添加脐静脉内皮细胞外泌体提高脐带间充质干细胞的产量及活性，为快速制备大量脐带间充质干细胞外泌体做准备；通过在培养基添加VCAM1试剂，以提高脐带间充质干细胞外泌体的产量；通过对脐带间充质干细胞修饰使其高表达miR-525-3p后提高外泌体活性，进而促进了外泌体对皮肤的修复作用。
对其它实施例制备的复合水凝胶也进行了上述试验，其获得的结果相似。

Claims (10)

1.一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，其特征在于，所述的复合水凝胶包括脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料，其中所述的脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料的体积比为1：1：2～4。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述的脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料的体积比为1：1：3。
3.根据权利要求1或2所述的复合水凝胶，其特征在于，所述的凝胶材料由益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液和β-GP水溶液制备而成，其中，所述的益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液和β-GP水溶液的体积比为9：1。
4.根据权利要求3所述的复合水凝胶，其特征在于，所述的透明质酸钠的分子量为120-140万Da，所述的壳聚糖的N-脱乙酰度为95％以上。
5.一种权利要求1-4任意一项所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为：
将脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料混合并搅拌均匀，待脐带干细胞和脐带干细胞外泌体负载完成后，得到负载脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶，低温保存。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的凝胶材料的制备方法包括如下步骤：
1)益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液的配置：将透明质酸钠用无菌水溶解，得到透明质酸钠溶液；向透明质酸钠溶液中添加壳聚糖，然后再添加益多酚，搅拌，得到益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液；
2)β-GP水溶液的配置：将β-GP溶解于无菌注射用水中，搅拌，过滤，得到β-GP水溶液；
3)凝胶材料的配置：在低温环境下将得到的β-GP水溶液逐步滴加至益多酚/透明质酸钠/壳聚糖溶液中，搅拌，得到凝胶材料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述壳聚糖的添加量为透明质酸钠溶液总质量的1-8％；所述益多酚的添加量为透明质酸钠溶液总质量的1-3％；所述的透明质酸钠溶液的质量分数为0.1-0.8％。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脐带干细胞是通过采用含有脐静脉内皮细胞外泌体的培养基培养同源脐带间充质干细胞获得的；优选，所述脐带干细胞是用miR-525-3p过表达腺病毒感染修饰的miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述脐带干细胞外泌体是通过采用含有VCAM1试剂的培养基培养所述miR-525-3p高表达脐带间充质干细胞获得的。
10.一种权利要求1-4任意一项所述的复合水凝胶在制备治疗皮肤损伤药物方面的应用。
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