JP5251873B2 - 脂肪組織細胞画分の照射後組織再生への使用 - Google Patents

Description

本発明は、照射に起因する損傷後の組織再生を促進するための髄外脂肪組織の血管ストロマ画分に由来する細胞の使用に関する。

創傷治癒過程には、細胞移行、細胞増殖又は細胞外基質の沈着といった、一組の複雑で完璧に調整された生物学的及び分子的メカニズムが関与している。誘導された損傷は、局所的、領域的及び全身的な成長因子の間の相互作用、並びに骨髄幹細胞のような各種要素の細胞レベルでの関与を含む一連の事象のための出発点となる。これらの複雑なメカニズムの崩壊は、特に肉体的成り行きにおいて患者に無能力化の影響を及ぼし、又は死という最悪の結果に至ることもあるような生活の質への影響を及ぼす。感染が起こった場合も同様であって、最も深刻な場合には、手足の切断、又はより一般的には大きな手術が必要になることがある。

皮膚障害に関して、創傷は組織のある程度の深さの破壊と酸素欠乏を生じ、酸素欠乏は成長因子の調節、基質破壊の活性化、及び脈管形成の刺激を生ずる。わずか数時間後に、上皮 (表皮) 及び真皮細胞の移行及び増殖が上皮再形成を発動する因子を構成する。新しい血管ネットワークの形成は、新たに形成された組織を維持するのにも必要である。しかし、多くの病的状況では脈管形成の機能不全、ケラチノサイト（角化細胞）の損失、並びに皮膚再生の障害を生ずることが示されてきた。

現在採用されている治療法は、本質的に手術又は外科的処置を含み、時に抗生物質のような適当な医薬の投与を伴う。成長因子を利用した治療法、特にＰＤＧＦ−ＢＢ及びｂＦＧＦの投与、さらには細胞治療も構想されてきた。この種の治療法は創傷治癒を促進させ、単独で、又は他の治療法若しくは手術の補助として使用することができる。

細胞再生を含む手法はこれまで比較的成功してきた。それは、幹細胞がもつ無限に自己再生して特化された成熟細胞及び組織に分化するようになるという能力を利用することからなる。しかし、このような方法は最先端の技術を必要とし、原材料の利用可能性、取得及び精製のために極めて高価になる。さらに、一般に微生物による汚染の可能性への依存性が高く、原材料の調製に比較的長い時間を必要とする。この種の細胞治療は最も有望であると思われる。

例えば、出願US−2003／0082152（特許文献１）には、脂肪組織由来の幹細胞のかなり一般的な調製方法、並びにそれらの多能性及びそれらの細胞の組織工学、創傷治癒及びin vivo及びex vivoでの組織再生への使用の利点が記載されている。治癒を促進するためにこれらの細胞を使用することができる創傷の種類に機械的原因の創傷は含まれていない。この特許文献のどこにも、照射により引き起こされた損傷・障害を治療することができることは示唆されていない。

また、De Vries et al. 1995 (非特許文献１) には、機械的原因により生じた皮膚損傷の治癒に対する各種タイプの細胞集団を接種した皮膚代用物についての試験が記載されている。試験した細胞集団には、自己線維芽細胞、脂肪組織由来の血管ストロマ画分 (ＶＳＦ，vascular stroma fraction)、並びに血管画分が除去された同じ血管ストロマ画分 (ＳＦ) が含まれる。この論文で得られた結果は、ＳＦ集団が接種された皮膚代用物並びに自己線維芽細胞が接種された皮膚代用物は機械的原因で引き起こされた皮膚創傷の治癒を促進することができることを示している。ここでもやはり、この論文は、ずっとより複雑である照射により生じた損傷を同様にして治療することができることは記載も示唆もしていない。

既に示した通り、さまざまな病的状態が損傷の修復メカニズムを阻害・崩壊させる。このことは照射にもあてはまり、照射は脈管形成及び上皮再形成を変質させてしまう。いくつかの研究により、照射が非定型的な皮膚角質化に関連する乾性落屑又は潰瘍を伴う表皮損失を引き起こすことがあることが示された。閉塞、浮腫、血栓症、又は血管破損を含む血管の変化も起こる。例えば、皮膚レベルで、照射による損傷は、他の創傷又は病的損傷の場合にみられるものとは異なる。これらの現象は治癒過程の遅速化を発動させる。

特に、皮膚の局部的照射は治癒過程にかなりの影響を及ぼす。高線量の放射線に曝露されると、表皮の増殖性基底層の遅延性障害に起因すると考えられる初期損傷と、真皮及びその直下の組織の障害に結びつく後期損傷とが現れるであろう。観察される最初の徴候は、第一度熱傷に類似の炎症性皮膚反応と定義される放射線皮膚炎と、それに続く脱毛である。毛細血管の拡張によって急性紅斑も生じる。最後に、１０〜２０グレイの照射から数日後に、乾性の、次に湿性の落屑が起こることがあり、これは一方では、真皮乳頭の薄肉化と平坦化とを生ずる表皮におけるケラチノサイトの退化によって、他方では、血管内皮の膨張及び増殖によって特徴づけられる。虚血の形態の遅発性影響も見られ、これは恐らく残存上皮細胞の過剰増殖により細動脈及び局部的若しくは部分的閉塞並びに重度の線維化を生じることに原因がある。これらの生理的現象は、機械的に起こった創傷型の皮膚損傷では存在せず、従って、この種の皮膚損傷は、照射により生じた皮膚損傷とは異なる性質のものである。

特に、ある医薬が機械的原因の創傷の治癒を改善するのに有効であることは、この医薬が照射に関連する損傷、特に皮膚の損傷の治療に有効であることを必ずしも意味しない。これは、照射後の損傷の治癒にはずっと複雑なメカニズムが関係するからである。

従って、照射後の損傷に関しては、原因が事故であろうと、放射線治療によるものであろうと、特に皮膚損傷について効果的な損傷修復メカニズムを実行できることが非常に重要である。

細胞治療の実施に対して各種の幹細胞供給源が検討されてきた。当初、幹細胞は胚組織から分離されていたが、最近、骨髄、皮膚、脳、筋肉及び脂肪組織のような各種の成人組織中に多能性（多分化能性）幹細胞の存在が検出されている。このような幹細胞は、胚細胞より容易に入手可能であり、その使用は胚細胞と同じような倫理的問題を伴わない。幹細胞の使用は、大部分の成人組織中での数が少ないことと、その抽出及び精製が困難であることとによって制限される。特に脂肪組織から幹細胞を取得するための新たな接近経路が特許文献２に示唆されている。

脂肪組織は実際、幹細胞を比較的容易かつ比較的多量に単離できる重要な蓄積部位を構成できる。さらに、幹細胞は、ドナー適合性の問題（例えば、骨髄細胞で起こる問題）を克服することができる。幹細胞ではまた、「自己移植」の使用を考慮することも可能であり、従って、拒絶反応が起こりうることに関連する不首尾が避けられる。

脂肪組織は哺乳動物において、例えば、髄外白色脂肪組織、体内の主要貯蔵臓器、白色髄様脂肪組織、及び発熱性褐色脂肪組織といった、多様な形態で存在する。白色脂肪組織は、細胞の容易に入手できる豊富な供給源となる。また、その潜在能力は一生を通じて持続する。脂肪組織は下記２種類の画分からなる：トリグリセリドの蓄積で特徴づけられ、主に分化した脂肪細胞からなる脂肪細胞画分、並びに血球、成熟内皮細胞、外膜細胞 (周細胞)、線維芽細胞及び多能性幹細胞から構成される、血管ストロマ画分（ＶＳＦ）と呼ばれる非脂肪細胞の画分。血管ストロマ画分はまた、他の脂肪細胞前躯体、造血及び神経前駆体、並びにエストロゲン、コンドロゲン (軟骨原) 及びミオゲンの各系統に分化することができる間葉幹細胞も含んでいる (特許文献３)。

白色脂肪組織は、外傷後又は病的な状況において自己細胞治療の用途をもつ脈管形成性を有する。自己脂肪組織の注入は、特に手術において移植片の血管再生及び軟組織の再建を促進するために使用される。ＶＳＦ由来の細胞はまた、虚血性病状の治療において脈管形成を促進するのに投与されてきた。ＶＳＦ細胞は脂肪組織において脂肪細胞を包囲する異質細胞集団を意味し、成熟微小血管内皮細胞を含む。この画分はまた神経原性及び心筋細胞表現型に分化することができ、より最近には脈管形成活性を有する、多能性細胞の重要な供給源であることが確認されている。ＶＳＦはマトリゲルモデル（matrigel model）の形成にも関与し、虚血性組織の血管新生を増大させる (特許文献４)。さらに、脂肪細胞系はモノブチリル（monobutyril）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びレプチンといった重要な脈管形成前因子を放出する能力を有する。

従って、細胞治療におけるＶＳＦ由来細胞の使用は大いに興味あることが認められている。この種の細胞は、筋疾患、心疾患及び筋肉退化が起こっているその他の疾患の治療に提案されてきた。機能的血管ネットワークの再建における該細胞の利点についても検討されてきた。

本出願人は、髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来の細胞が特異的に照射後の状況下での損傷の治療に大いに有益であることを予想外にも見出した。
かくして、本発明は、照射で引き起こされた損傷後の組織再生を促進するための医薬の製造に髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来の細胞を使用することに関する。

本発明の有利な側面は、照射に起因する損傷後の皮膚再生、特にケラチノサイトの再生を促進するための医薬の製造に髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来の細胞を使用することに関する。より具体的には、損傷は照射が原因の皮膚創傷である。

今日まで多くの研究が、脈管形成前駆剤（pro-angiogenic agents）又は炎症前駆分子（pro-inflammatory molecules）の投与による治癒過程の薬理学的刺激の着想を提案している。公知の細胞手法としては、骨髄細胞又は血球を使用する方法が挙げられる。照射後の病状治癒については、脂肪組織由来細胞が使用されたことは全くなかった。

照射に起因する損傷及びより具体的には創傷及び／若しくは皮膚熱傷は、偶発的な（事故による）ものであろうと、放射線治療の結果であろうと、生理病理学的外傷に起因するものとは性質が異なる。表皮及びケラチノサイトが損傷し、組織の弾性が低下し、そして治癒過程がかなり遅くなる。

髄外脂肪組織のＶＳＦ由来の細胞の使用は、ケラチノサイト分化および／または皮膚粘弾性のレベルに作用することにより、具体的にはコラーゲンの産生を増大させることにより創傷閉鎖を促進するよう作用する。これには多量の組織及び細胞を与えるという利点があり、何らかの倫理的問題を提起することは全くない。さらに、同種又は異種の移植物や、一つの個体から数人を治療する可能性を検討することもできる。本発明に係る使用の実施は、使用した組織の供給源により著しく容易となる。実際、所定の培地内でin vitroで細胞を維持し、増殖させ、さらには不死化することも可能である。細胞プール (集団) を利用可能にするために細胞を凍結保存することも考えられる。

本発明に従った使用では、損傷、より具体的には皮膚損傷がずっとすばやく回復するので、組織は外部病原物質に対してよりすばやく防護される。
コストに関する利点も考慮されうる。幹細胞の取得はその供給源の点からより容易であり、またプロトコル (手順) もより簡便でより安価である。実際問題として、特に脂肪吸引又は皮膚脂肪組織切除術中に多くのサンプルを採取することができ、それらのサンプルは通常は破棄されるものである。サンプリング方法は侵襲性が高くなく、従って、入院及び療養期間はずっと短い。これらのすべての要素は上記治療のコスト低減に寄与する。

本発明の別の側面は、皮膚、骨、脳、頸部、腸、胸部、心臓、肺、子宮及び直腸から選ばれた組織における照射に起因する損傷後の組織再生を促進するための、髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来の細胞の使用に関する。

本発明に係る髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来細胞の使用は、多くの分野に適用可能である。損傷は事故による偶発的な照射により起こったものでも、又は放射線治療の結果として生じたものでもよい。これは特にがん患者の場合にあてはまる。

本発明の範囲内で使用される薬剤を、予防的に使用して、照射前に投与することができる。薬剤は無論、治療のために使用し、照射後に投与することもできる。
脂肪組織由来の細胞は麻酔下で脂肪組織断片から直接取得される。細胞外基質の酵素消化後、密度の差又は抗原表現の差によって、多様な細胞集団を選択する。こうして、本発明を実施するのに使用される、脂肪細胞を含まない血管ストロマ画分が単離される。

本発明の有利な態様によると、上記細胞は下記の引き続く工程を経て得られる:
・髄外脂肪組織のサンプルを取り出し、
・Bjorntorp et al. (非特許文献２) に記載された手順に従って、タンパク分解酵素を用いた基質消化及び密度勾配による分離によって血管ストロマ画分を単離し、
・物理的分離および／または免疫的選択によって細胞を精製する。

物理的分離は固体担体上での付着の差によって行われ、一方、免疫的選択は脂肪細胞前駆体により発現されるマーカー（ＣＤ３４＋，ＣＤ４５−及びＣＤ３１−）に対して特異的な数種類の抗体を用いて行われる。

本発明に従って、髄外脂肪組織のＶＳＦ由来の細胞を用いて、髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来の細胞と少なくとも１種の薬剤に許容されるビヒクル及び／又は担体とを含有する薬剤組成物の形態の医薬を製造する。この薬剤組成物は、通常に使用される任意の投与形態で適用される。製剤形態としては、特に非経口又は経皮投与に適したものが挙げられ、例えば、クリーム、軟膏、スプレイ剤（噴霧剤）、ゲル剤、バイアル、及び／又は注射液などである。用量は患者の年齢、体重、投与経路及び併用治療の有無と種類に応じて変動する。

本発明の１側面において、髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来の細胞の使用は、スプレイ剤、ゲル剤又は注射液の形態の医薬の製造を目的とする。具体的には、これらの薬剤組成物はエアゾール（エアロゾル）剤の形態とすることができる。

本発明の別の側面において、髄外脂肪組織の血管ストロマ画分由来の細胞は、インテグラ(INTEGRA)^TM のような真皮均等物 (人口皮膚) の製造に使用され、照射に起因する損傷後の組織再生を促進することを目的とする。真皮均等物は、インテグラを構成するコラーゲン基質中に前記細胞を付与することを目的とする。ポリマー又はコポリマー担体は固体又は半固体である。

インテグラは人口皮膚又は皮膚再生構造物である。これは皮膚の代用を目的とする２層膜系である。具体的には、真皮代用層は、ウシの腱及びグリコサミノグリカン（その多孔度が制御され、かつその分解速度は製造中に決められる）からの網目状コラーゲン線維の多孔質マトリックスから作製される。

より具体的には、この側面によると、真皮均等物は照射に起因する熱傷の治療に有用である。
下記の実施例は本発明を例示するがそれを決して制限するものではない。

ＵＳ２００３／００８２１５２ ＷＯ２００５／０３５７４２ ＷＯ０２／０５５６７８ ＷＯ２００５／０２５５８４ De Vries et al., Lab. Invest. 1995年10月, 73(4): 532-40 Bjorntrop et al., J. Lipd Res., 1978, p.19, 316-324

病的な照射後状況でのマウスにおける創傷治癒の進展変化の観察結果。 照射を伴わない生理的状況でのマウスにおける創傷治癒進展の観察結果。 Ｄ１４で残る創傷穴の測定（図３Ａ）及びＤ１４での粘弾性測定（図３Ｂ）の柱状図。ＮＩＲ＝ＩＲ照射なし。

実施例１：脂肪組織の取得及び調製
麻酔処置したマウスから採取した皮下脂肪組織から脂肪組織断片を取り出す。コラゲナーゼ中３７℃でタンパク分解酵素による細胞外基質の消化を４５分間行って、組織細胞を解離させた後、非特許文献２に記載に記載された方法に従った密度差により、又は抗原表現の差によって各種の細胞集団を選択する。脂肪細胞を含まない細胞画分が血管ストロマ画分に対応する。細胞はＣ３４ ⁺ 、ＣＤ４５ ^- 及びＣＤ３１ ^- の表現型である。

実施例２：本発明に係る細胞画分の治癒に及ぼす効果
２０Ｇｙでの局部照射を剃毛及び麻酔後のマウスの背側に行う。照射は穿孔（パンチ）適用前に行う。

創傷治癒モデル：
創傷を形成するために、８週齢の雄性マウス（Ｃ５７Ｂ１６、Iffa Creddo）の背側に直径０.８ｍｍの穿孔（パンチ）を適用する。穿孔適用後直ちに、実施例１で得られた細胞を局所 (loc) 又は静脈内 (iv) 注射する。試験動物には１×10⁶ 個の細胞を投与し、対照動物には溶媒 (リン酸食塩緩衝液) を投与する。各実験群は５匹ずつを含む。別にマウスの事前照射を行わずに本実験を繰り返す。

創傷治癒の技術的評価:
創傷表面積の減少を異なる時間（Ｄ０，Ｄ４，Ｄ７，Ｄ１０及びＤ１４、Ｄ＝日）での直接観察により評価する。マウスの創傷の変化を写真で監視する。得られた結果を図１に報告する（ＩＲ，ＩＲ ｌｏｃ、ＩＲ ｉｖ）。

これらの観察を，生理的状況で行われた、換言すると事前照射を行わなかった、同じ創傷の変化（ＣＴ，ＣＴ ｌｏｃ、ＣＴ ｉｖ）と比較する（図２を参照）。
表面測定は、画像解析ソフトウェア（Histolab）を用いて、生理的及び病的という２種類の創傷治癒条件下で行う。結果を、Ｄ１４（１４日目）に残る創傷穴の値を示す下の表１に報告する。これらの値は、Ｄ０での値を１００％とし、その値に対する残留％で表す。対応するグラフ（柱状図）を図３Ａに示す。

キュトメーター（皮膚粘弾性測定装置）法を用いた治癒品質の測定
本測定の目的は、組織再生が組織品質の改善を伴うことを実証することである。治癒過程の最後に２ｍｍのプローブを動物の背側皮膚を吸引するように当てて、再生された組織の皮膚粘弾性パラメータを評価する。プローブを当てると、皮膚を吸い込んで弛緩させることができる。光学測定装置を用いて皮膚の変形を評価し、皮膚の弾力性及び弛緩測定値のグラフを得る。前と同じように、測定は、照射された動物による病的状態と、事前照射を受けていない動物による生理的状態との２種類について並行して行う。

粘弾性測定結果を、任意単位で示す次の表２に報告する。対応する結果は図３Ｂにも示す。

結論：
髄外脂肪組織由来のＶＳＦ細胞が存在しない場合、照射後の状況での組織修復は遅い速度でしか起こらず、再生は部分的でしかない。実際、治癒過程の最後（Ｄ１４）でもまだ大きな開口創傷面積が残っている。

一方、髄外脂肪組織由来のＶＳＦ細胞が投与されたマウスは、完全に再生された皮膚を有し、創傷は完全に閉じ、皮膚の品質は特にその粘弾性においてより明らかなように改善されている。

照射後の状況で認められる創傷閉鎖の遅速化は、本発明に従って髄外脂肪組織由来のＶＳＦ細胞を使用することにより解消され、観察された結果は、照射状況下で上記細胞の投与後は治癒過程が促進されて、普通の生理的な治癒状況で観察されるのに似た創傷治癒となることを示している。

Claims (10)

1. 照射に起因する皮膚創傷における皮膚の再生促進を目的とする医薬を製造するための、髄外脂肪組織の血管ストロマ細胞画分に由来するＣＤ３４ ⁺ ＣＤ４５ ^- ＣＤ３１ ^- 細胞の使用。
2. 前記医薬がケラチノサイトの再生促進を目的とするものである請求項１に記載の使用。
3. 前記皮膚創傷が放射線治療の結果として照射が引き起こしたものである、請求項１または２記載の使用。
4. 前記皮膚創傷が偶発的照射に起因するものである、請求項１または２に記載の使用。
5. 前記医薬が照射前に予備的処置として投与される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
6. 前記医薬が照射後に治療処置として投与される請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
7. 前記医薬ががん患者に投与されるためのものである、請求項３に記載の使用。
8. 前記医薬がクリーム、軟膏、スプレイ剤、ゲル剤、バイアル、及び／又は注射液の形態である、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
9. 前記医薬が真皮均等物の形態である、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
10. 前記真皮均等物が照射に起因する熱傷の治療用のものである請求項９に記載の使用。

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