CN107468708A - 一种干细胞活性因子凝胶的制备方法及在难愈合伤口治疗中的应用 - Google Patents

一种干细胞活性因子凝胶的制备方法及在难愈合伤口治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种干细胞活性因子凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)活性因子悬液的制备，(2)活性因子分离纯化，(3)干细胞活性因子凝胶的配制，本发明采用能促进伤口愈合的高分子材料提取的干细胞分泌活性因子不需要进一步纯化可直接使用，方法简单实用，避免了间充质干细胞分泌因子提取的繁琐步骤；配方中不含动物源血清，防腐剂；凝胶制备后采用低温保存方式，可以有充足的时间进行放行检验，满足药典法微生物检测、支原体检测的时间要求，保证了制品质量。

Description

一种干细胞活性因子凝胶的制备方法及在难愈合伤口治疗中 的应用
技术领域
本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，尤其涉及一种治疗慢性难愈合伤口的干细胞活性因子凝胶制备方法。
背景技术
慢性难愈性伤口又称溃疡，是指由各种原因引起的经一个月以上治疗未能愈合的创面。目前以糖尿病足、创伤性溃疡、褥疮和下肢静脉性溃疡最常见。它们多发生于糖尿病、创伤、静脉曲张、血管硬化、截瘫长期卧床等严重慢性和急性损伤的患者，并且随着年龄的增加，发病率呈明显上升趋势，具有发病机制复杂、病程长、涉及学科多、治疗难度大以及治疗费用高等特点。目前，慢性难愈合伤口已经成为影响社会和谐发展、严重降低人们工作和生活质量以及加重社会和家庭负担的重要因素。
现有治疗方法有血管形成术、生物敷料治疗、高压氧治疗、细胞因子治疗、细胞治疗等方法。其中生物敷料的使用是目前治疗所必须采用的方法，因为保持一个湿润清洁的创面环境可以防止组织失水、细胞坏死、有利于血管的生成。而随着技术的进步，含有生长因子的新型生物活性敷料被开发出来，生长因子在创面的修复过程中发挥着非常重要的作用，它参与整个创面的修复再生。慢性难愈合伤口经久不愈的一个主要原因就是因为内源性生长因子释放的减少，组织再生修复能力下降。
间充质干细胞是一种取材方便，不被异体免疫排斥，具有多向分化潜能的干细胞。间充质干细胞培养体系中含有多种活性成份。已经被证明对缺血性心肌、骨组织具有再生修复作用，在治疗难愈性伤口的研究中也多有报道。申请号为200810136415.6的发明专利公开了一种使用甲基纤维素作为细胞基质的人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，但是该发明含有抗生素庆大霉素，不适用于抗生素过敏人群；而且涂抹剂快速配制中含有动物源成分胎牛血清，有可能造成过敏以及具有动物源性安全隐患；快速配制中操作步骤多，过程繁杂，带来微生物污染风险，运输前不能按照药典要求完成两周的无菌检测，制品质量无法保证。申请号201210133427.X、申请号20161088226.0的发明专利都是是直接使用活性细胞，但是单纯的细胞悬液很难附着在创口表面持续发生作用，并且单纯的细胞悬液中活细胞的数量随着用药时间的延长而降低，不能保证足够的活细胞发挥治疗作用且不利于储存和运输。
大量的研究显示间充质干细胞主要依靠的是其强大的旁分泌能力实现血管再生修复的，如血管内皮细胞生长因子的释放。因此，如何从干细胞的培养基中分离浓缩干细胞分泌的活性细胞因子成为干细胞临床应用的关键。本发明使用了一种简单的方法从干细胞培养基中分离浓缩活性因子，且不需要进一步分离，可直接制备成凝胶用于治疗慢性难愈合伤口，非常具有应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种干细胞活性因子凝胶的简单制备方法，解决了现有技术中使用活性干细胞引发的各种弊端或干细胞活性因子凝胶制备复杂等存在的问题，为治疗皮肤损伤提供了有效的治疗手段。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是，一种干细胞活性因子凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)活性因子悬液的制备：从脐带、脂肪、胎盘分离、纯化所述间充质干细胞，使用含10％胎牛血清的DMEM或DF12培养基、常规培养，待细胞融合度达80-90％时，用胰蛋白酶消化，使用上述完全培养基进行中止，离心收集细胞，再用无血清DMEM或DF12培养基悬浮细胞沉淀，调整细胞浓度传代培养，收集10代以内的培养上清，离心除掉不溶性杂质和变性蛋白，取上清液用于活性因子的分离纯化。
(2)活性因子分离纯化：将上清液与经过无菌处理的质量浓度为1～10g/L壳聚糖10:1-20:1混合，调节pH值，然后置于摇床中振摇，离心，沉淀经弱碱性水溶液洗涤溶解。
(3)干细胞活性因子凝胶的配制：在上述活性因子浓缩液逐滴添加保湿剂，边添加，边进行混合，所述保湿剂剂与活性因子悬液的体积比为1∶3；混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-20℃冰箱中冻存待用。
本发明步骤3中的保湿剂为透明质酸钠。
本发明步骤3所述保湿剂与活性因子悬液的体积比为1∶3。
本发明所述的干细胞活性因子凝胶的制备方法制得的干细胞活性因子凝胶在难愈合伤口治疗中的应用本发明所述间充质干细胞经体外分离、筛选、传代、扩增后制备而得，它们贴壁生长，表达CD29、CD73、CD90、CD105 等细胞表面蛋白分子，而不表达CD11b、CD34、CD45、HLA-DR 等细胞表面蛋白分子；它们具有自我更新、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，如向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化，也可以向其它胚层谱系分化，如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。
高分子材料壳聚糖、透明质酸钠、γ-聚谷氨酸生物相容性良好，可作为高分子稳定剂制备外用药物制剂，已在临床上广泛应用。本发明将上述高分子材料用于上述干细胞活性因子凝胶中，可以保持活性因子在有效期内的生物活性。
使用时，将装有上述干细胞活性因子凝胶的预充注射器从-20℃冰箱中取出，解冻，将干细胞活性因子凝胶从注射器中打出，均匀涂抹于患处。
本发明将高分子材料凝胶添加到活性因子悬液中，可以缓释因子活性，达到长时间促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间，促进经久不愈的伤口愈合等作用。
本发明可通过调节处方和粘度，制成喷雾剂或擦剂，分装于不同形式的容器中。
本发明所述干细胞活性因子凝胶具有以下优势 ：
(1)采用能促进伤口愈合的高分子材料提取的干细胞分泌活性因子不需要进一步纯化可直接使用，方法简单实用，避免了间充质干细胞分泌因子提取的繁琐步骤；
(2)配方中不含动物源血清，防腐剂；凝胶制备后采用低温保存方式，可以有充足的时间进行放行检验，满足药典法微生物检测、支原体检测的时间要求，保证了制品质量；
(3)配方中含有天然保湿成份，能够促进活性因子的长期释放，利于伤口的愈合。
(4)不含活性细胞，通过冷链运输，无需繁杂操作，可直接用于患处。
具体实施方式
为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
实施例1本发明所述干细胞活性因子凝胶的的制备方法
活性因子悬液的制备：从大鼠脂肪中分离间充质干细胞，使用含10％胎牛血清的DMEM或DF12培养基(完全培养基)对大鼠的脂肪间充质干细胞常规培养，待细胞融合度达85％左右时，用胰蛋白酶消化，使用上述完全培养基进行中止，离心收集细胞，再用无血清DMEM或DF12培养基悬浮细胞沉淀，调整细胞浓度传代，收集培养上清，离心除掉不溶性杂质和变性蛋白，取上清液用于活性因子的分离纯化。
活性因子分离纯化：将上清液与壳聚糖溶液按一定比例混合。调节pH值，然后置于摇床中振摇，离心，沉淀经弱碱性水溶液洗涤溶解。
干细胞活性因子凝胶的配制：在上述活性因子浓缩液逐滴添加保湿剂，边添加，边进行混合，所述保湿剂剂与活性因子悬液的体积比为1∶3；混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-20℃冰箱中冻存待用。
实施二2验证实验
模型构建及分组：取体重150～180g，健康清洁级雄性SD大鼠50只。大鼠适应性喂养1周后，高脂饲料喂养1个月，禁食12h后称量体重，按体重65mg/kg腹腔注射STZ(链脲佐菌素)，以3d后测空腹血糖≥17.9mmol/L的大鼠构建糖尿病模型，次日用液氮棉签法建立糖尿病足溃疡模型，液氮棉签冷冻大鼠右后肢各3次，每次持续约20s，一次冷冻后待皮肤复温后再行下次冷冻，冷冻后出现后肢局部充血水肿，第5d形成溃疡，选取Wagner分级3级的动物。取已建立糖尿病足溃疡模型的大鼠20只，随机分为二组，每组10只，分别为实验组和对照组（生理盐水）。
干细胞活性因子凝胶治疗：每组在创面上分别给予150μl受试物，涂抹均匀，覆盖纱布，包扎。正常饲养28天，于受试物使用后7d、14d、28d时，观察创面面积的大小（cm2）。参见下表1，表1为实施例组和对照组进行治疗后7d、14d、28d时创面面积的大小。
表1干细胞活性因子凝胶修复糖尿病大鼠皮肤损创面的疗效情况
0d 7d 14d 28d
实验组（n=10） 12.31±3.77 10.25±3.02 7.26±3.14 3.31±1.58
对照组（n=10） 12.63±4.01 11.41±3.18 11.22±2.89 10.8±3.53
结果显示：随着天数增加，左侧创面的创伤面积越来越小，反应本发明干细胞制剂逐渐显效，伤口愈合速度快于对照组，结果提示本发明的干细胞制剂能促进伤口愈合，缩短病程。
以上仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种干细胞活性因子凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)活性因子悬液的制备：从脐带、脂肪、胎盘分离、纯化所述间充质干细胞，使用含10％胎牛血清的DMEM或DF12培养基、常规培养，待细胞融合度达80-90％时，用胰蛋白酶消化，使用上述完全培养基进行中止，离心收集细胞，再用无血清DMEM或DF12培养基悬浮细胞沉淀，调整细胞浓度传代培养，收集10代以内的培养上清，离心除掉不溶性杂质和变性蛋白，取上清液用于活性因子的分离纯化；
(2)活性因子分离纯化：将上清液与经过无菌处理的质量浓度为1～10g/L壳聚糖10:1-20:1混合，调节pH值，然后置于摇床中振摇，离心，沉淀经弱碱性水溶液洗涤溶解；
(3)干细胞活性因子凝胶的配制：在上述活性因子浓缩液逐滴添加保湿剂，边添加，边进行混合，所述保湿剂剂与活性因子悬液的体积比为1∶3；混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-20℃冰箱中冻存待用。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞活性因子凝胶的制备方法，其特征在于：步骤3中的保湿剂为透明质酸钠或γ-聚谷氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的一种干细胞活性因子凝胶的制备方法，其特征在于：步骤3所述保湿剂与活性因子悬液的体积比为1∶3。
4.一种如权利要求1所述的干细胞活性因子凝胶的制备方法制得的干细胞活性因子凝胶在难愈合伤口治疗中的应用。
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