KR20160149292A - 면역적합성 융모막 생성물 - Google Patents

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KR20160149292A
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알라 다닐코비치
다나 유
티모시 잰슨
진-취앙 쿠앙
제니퍼 미셸 마르코니
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오시리스 쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 명세서에서 면역적합성 융모막을 포함하는 태반막 생성물이 제공된다. 이러한 태반막 생성물은 동결보존되고, 해동 후에 치료 인자 및 생존 세포를 함유할 수 있다. 태반막 생성물은 신생혈관생성을 촉진시키고, 염증을 감소시키며, 흉터 형성을 감소시킬 수 있기 때문에, 상처 치유 또는 조직 수복/재생 및 치유를 촉진시키는 다른 방법에서 유용하다. 본 기술은 상처난 또는 손상된 조직을 보호하기 위한 생성물, 또는 커버로서, 박테리아를 배제하거나, 박테리아 활성을 저해하거나, 또는 조직의 치유 또는 성장을 촉진시키는 생성물에 관한 것이다. 본 분야는 또한 이러한 막 유래 생성물의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.

Description

면역적합성 융모막 생성물{IMMUNOCOMPATIBLE CHORIONIC MEMBRANE PRODUCTS}
관련 출원
본 출원은 2014년 5월 7일자로 공동 출원되며, 그들의 전문은 발명의 명칭이 "Immunocompatible Amniotic Membrane Products", 및 "Therapeutic Placental Compositions, Methods Of Making And Methods Of Use"인 출원에 의해 참고로 포함된다.
기술분야
본 기술은, 예를 들어 태반막-유래 생성물 및 동결보존된 태반 생성물을 포함하는 상처 치유 또는 조직 수복/재생을 용이하게 하거나 또는 개선시키는 방법 및 생성물, 및 다음 중 하나 이상(신생혈관생성의 자극, 성장인자 분비, 프로테아제의 저해 및 유리 라디칼 산화)의 조합과 같은 상처에서 또는 상처 부위 근처 또는 상처 부위에서 치유를 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 본 기술은 상처가 생긴 또는 손상된 조직을 보호하기 위한 생성물, 또는 커버로서, 박테리아를 배제하거나, 박테리아 활성을 저해하거나, 또는 조직의 치유 또는 성장을 촉진시키는 생성물에 관한 것이다. 이러한 태반막의 예는 융모막이다. 본 분야는 또한 이러한 막 유래 생성물의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.
새로운 또는 탈세포화된 태반막은 존스 홉킨스 병원이 진피 용도를 위한 태반막의 사용을 보고하였을 때인 적어도 1910년 이래로 수술 용도에서 국소적으로 사용되었다. 후속적으로 화상 또는 궤양이 생긴 표면을 치료하기 위해 분리되지 않은 양막 및 융모막이 사용되었다. 1950년대 및 60년대 동안, 만성 다리 궤양에 트로엔세가르트-한센(Troensegaard-Hansen)에 끓인 양막을 적용하였다.
인간 융모막(CM)은 발생 중인 태아와 모체 사이에서 임신 동안 존재하는 막 중 하나이다. 이는 배아외 중배엽에 의해 형성되고, 배아 및 다른 막에 의해 둘러싸인다. 융모막 융모는 융모막으로부터 나오고, 자궁내막을 침입하며, 모체 혈액으로부터 태아 혈액으로 영양분을 전달하게 한다.
새로운 그리고 냉동된 CM은 둘 다 상처 치유 치료법을 위해 사용되었다. CM은, 예를 들어, 세포외 기질, 성장인자, 및 생존 세포(viable cell)와 같은 상처 치유에 기여할 수 있는 다수의 인자를 함유한다. 일부 보존 방법은 기질 또는 성장인자와 같은 인자의 일부 수준을 유지할 수 있지만, 생존 세포 수준을 보존하는 것은 도전을 제공한다. 새로운 CM이 사용될 때, 질환 전염 위험이 증가된다. 공개된 보고에 따르면, 새로운 태반 조직, 예를 들어, 융모막 조직은 높은 세포 생존도를 나타내지만, 그러나 0℃ 초과의 저장 28일 내에 세포 생존도는 15 내지 35%로 감소된다. 3주의 시간에 걸쳐 냉동은 온도 또는 배지와 상관없이 세포 생존도가 13 내지 18%로 감소되었다. CM은 면역원성이 되는 것으로 믿어지기 때문에, 이는 상업적 상처 치유 제품에서 사용되지 않았다.
생존 세포(신생아 포피로부터 유래), 애플리그라프(Apligraf) 및 더마그래프트(더마그래프트)를 함유하는 2개의 상업적으로 입수가능한 생체공학처리된 조직 이식편이 있다. 애플리그라프와 더마그래프트는 둘 다 배양 확장된 세포를 포함한다. 애플리그라프도 더마그래프도 천연 상처 치유 과정과 관련된 인자인 검출가능한 수준의 특정 인자, 예를 들어, 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질-1(IGFBP-1) 및 아디포넥틴을 포함하지 않는다. 추가로, 애플리그라프도 더마그래프도 상처 치유에 바람직할 수 있는 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 대 기질 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(TIMPS)의 특정 비(MMP 대 TIMP 비 또는 일반적으로 프로네아제-대-프로테아제 저해제 비)를 나타낸다. 상처 치유는 다인자 생물학적 과정이기 때문에, 상처를 적절하게 치료하는데 필요한 다수의 인자가 있으며; 적은 양의 생존 세포를 갖는 생성물은 피부 내에 존재하는 생존 세포 집단이 증가된 생성물이 비해 상처를 더 적게 치유할 수 있다. 상처 치유, 상처 드레싱, 미용 용도와 같은 용도에서 사용될 수 있는 융모막 유래 생성물을, 또는 더 높은 비율의 생존 세포 및, 예를 들어, 성장인자, 항산화제, 항염증제, 신생혈관생성 및 사이토카인을 촉진시키는 제제를 포함하는 인자의 증가된 양을 나타내는 집단을 포함하는 생물학적 피부 대체물로서 제공하도록 당업계에서의 진보를 나타낼 것이다.
애플리그라프는 소 I형 콜라겐과 조합된 신생아 포피 각질세포 및 섬유아세포를 이용하여 제조된 생존가능한 이중층 피부 대체물이다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 애플리그라프는 1998년 FDA에 의해 승인된 바와 같은 상업적 판매를 위해 이용가능한 제품을 지칭한다.
더마그래프트는 합성 세포외 기질 및 생흡수성 폴리갈락틴 메쉬 스캐폴드 상에 파종된 신생아 포피 조직으로부터 유래된 동결보존된 인간 섬유아세포이다. 그의 제품 설명서에 따르면, 더마그래프트는 3회 미만의 세척을 필요로 하는 생성물에 대해 상처 드레싱으로서 더마그래프트의 실행적 실행을 제한하는 사용 전의 3회 세척 단계를 필요로 한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 더마그래프트는 2001년 FDA에 의해 승인된 바와 같은 상업적 판매를 위해 이용가능한 제품을 지칭한다.
공학처리된 상처 드레싱, 예컨대 애플리그라프 및 더마그래프트는 상처 치유를 위한 최고의 가능성을 제공하지 않는데, 그들이 차선의 세포 조성물을 포함하며, 따라서 적절한 상처 치유를 제공하지 않기 때문이다. 예를 들어, 애플리그라프 및 더마그래프트는 MSC 또는 고유한 조직 세포외 기질을 포함하지 않으며, 그 결과, 세포에 의해 분비되는 상이한 인자 사이의 비는 효율적인 상처 치유를 가능하게 하지 않는다. 추가적으로, EGF, IGFBP1, 및 아디포넥틴을 포함하는 상처 치유에 중요한 일부 인자는, 검출가능하지 않거나, 또는 애플리그라프와 더마그래프트가 둘 다 없다. 추가적으로, MMP 및 TIMP를 포함하는 일부 인자는, 천연 상처 치유 과정에서 발견되는 비율과 크게 다른 비율로 존재하며; 이 차이는 특히 상류의 염증 사이토카인 경로를 변경시키는데, 이는 결국 상처 부위에서 차선의 미세환경을 가능하게 한다. 이들 생체공학처리된 생성물에서 기질 조성물은 I형 콜라겐만을 포함하고, 또한 히알루론산을 포함할 수 있다. 이는 다양한 콜라겐(예를 들어, 콜라겐 I, III, IV, V, VI 등), 엘라스틴, 당단백질 및 프로테오글리칸과 같은 성분을 포함하는 피부의 복잡한 구조적 기질과 상이하다. 피부는 또한 생체공학 생성물, 애플리그라프 및 더마그래프트의 대표적 예에서 결여된 진피 내 간충직 줄기 세포를 포함한다.
파쿠에트-피필드(Paquet-Fifield) 등은 간충직 줄기 세포 및 섬유아세포가 상처 치유를 위해 중요하다(J Clin Invest, 2009, 119: 2795)는 것을 보고한다. 간충직 줄기 세포 및 섬유아세포를 포함하는 생성물은 아직 기재되지 않았다.
MMP와 TIMP는 둘 다 상처 치유에 중요한 인자이다. 그러나, 이들 단백질의 발현은 고도로 조절되고 조정되어야 한다. 과량의 MMP 대 TIMP는 불량한 상처 치유의 마커이다(Liu et al, Diabetes Care, 2009, 32: 117; Mwaura et al, Eur J Vasc Endovasc Surg, 2006, 31: 306; Trengove et al, Wound Rep Reg, 1999, 7: 442; Vaalamo et al, Hum Pathol, 1999, 30: 795).
α2-마크로글로불린 및/또는 그의 수용체는 모두 4종의 메커니즘적 분류로부터 프로테아제를 불활성화하는 혈장 단백질로서 알려져 있다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스팔틱 프로테아제, 및 메탈로프로테아제(Borth et al., FASEB J, 1992,6: 3345; Baker et al., J Cell Sci, 2002, 115:3719). 이 단백질의 다른 중요한 기능은 사이토카인 및 성장인자의 저장소로서 작용하는데, 이의 예는 TGF, PDGF 및 FGF를 포함한다(Asplin et al, Blood, 2001, 97: 3450; Huang et al, J Biol Chem, 1988; 263: 1535). 당뇨성 궤양 또는 정맥 궤양과 같은 만성 상처에서, 고량의 프로테아제의 존재가 성장인자의 빠른 분해 및 상처 치유의 지연을 야기한다. 따라서, α2-마크로글로불린을 포함하는 태반 생성물은 당업계에서의 진보를 구성할 것이다.
bFGF는 신생혈관생성, 조직 수복 및 상처 치유를 포함하는 다양한 세포 처리를 조절한다(Presta et al., 2005, Reuss et al., 2003, 및 Su et al., 2008). 상처 치유 모델에서, bFGF는 상처 봉합을 증가시키고, 상처 부위에서 혈관 형성을 향상시키는 것으로 나타났다(Greenhalgh et al., 1990).
시험관내 세포 이동 분석은 생성물의 상처 치유 가능성을 평가하는데 중요하다. 상처 치유 과정은 고도로 복잡하며, 성장인자에 의해 제어된 일련의 구조화된 사건을 수반한다(Goldman, Adv Skin Wound Care, 2004, 1:24). 이들 사건은 증가된 혈관신생, 염증 면역세포에 의한 침윤 및 세포 증식의 증가를 포함한다. 상처 치유의 시작 단계는 개개 세포가 상처에 대해 양극화되고, 상처 영역에 근접하고 주위 조직을 재구성하기 위해 상처 영역 내로 이동하는 능력에 관해 다룬다. 세포이동과 상처 치유 사이의 상관관계를 시험함으로써 상처 치료법의 상처 치유 가능성을 평가할 수 있는 분석 은 당업계에서 잔보를 나타낼 것이다. 하기 개시내용에서 논의하는 바와 같이, 본 기술의 양상은 그들이 신생혈관생성을 촉진시키고, 항염증 활성을 촉진시키며, 항산화활성을 촉진시키고, 성장인자의 증가된 양 및 변형을 제공하는 생성물 및 방법에 관한 것이기 때문에 당업계에서 상당한 진보를 나타낸다. 이하에 더 상세하게 논의하는 바와 같이, 이들 생성물 및 방법은 다수의 상처 치유 용도, 연조직 손상 또는 골형성 수복에서 사용될 수 있다.
일 양상에서, 개시내용은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 융모막의 동결보존 및 후속적 해동 후에 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 약 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형.
다른 양상에서, 개시내용은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 융모막의 동결보존 및 후속적 해동 후에 하기를 포함한다:
A) 생존 세포, 하나 이상의 치료 인자, 및 세포외 기질을 포함하는 기질층,
밴드
B) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형; 여기서, 기질층 내 세포의 약 40% 초과는 생존 세포이다.
일 양상에서, 상기 개시내용은 하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 하나 이상의 조직 성분은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 약 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자; 및
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질;
융모막은 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포를 가지며; 1종 이상의 조직 성분이 치료적 이점을 제공하는데 효과적인 양으로 존재한다.
일 양상에서, 상기 개시내용은 하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 하나 이상의 조직 성분은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 약 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 성장 치료적 인자; 및
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질;
융모막은 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포를 가지며; 1종 이상의 조직 성분이 하기에 효과적인 양으로 존재한다:
(i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 감소시키는 것;
(ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 증가시키는 것;
(iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키는 것;
(iv) 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키는 것;
(v) 프로테아제의 양 및/또는 활성을 감소시키는 것;
(vi) 세포 증식을 증가시키는 것;
(vii) 신생혈관생성을 증가시키는 것; 및/또는
(viii) 세포 이동을 증가시키는 것.
다른 양상에서, 개시내용은 동결보존된 태반을 포함하는 막을 제공하되, 태반의 동결보존 및 후속적 해동 후에 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 태반 세포는 양막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 태반막에 대해 천연인 하나 이상의 치료 인자;
C) 태반에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형.
본 양상의 일부 실시형태에서, 태반막은 양막 및 융모막을 포함한다.
상기 양상의 일부 실시형태에서, 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포는 면역 반응을 생성하는데 충분한 수준 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성한다. 일부 실시형태에서, 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포는 검출가능한 한계 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성한다.
상기 양상의 실시형태에서, 막은 조직 세포를 포함하되, 상기 조직 세포의 약 50% 내지 약 100%는 살아있다. 일부 실시형태에서, 상기 조직 세포의 약 60% 내지 약 100%는 살아있다. 추가 실시형태에서, 상기 조직 세포의 약 70% 내지 약 100%는 살아있다.
상기 양상의 다양한 실시형태에서, 막은 시험관내 또는 생체내 (i) 내지 (viii)의 임의의 활성을 촉진시키는데 효과적인 양으로 1종 이상의 조직 성분(예를 들어, 생존 세포, 하나 이상의 치료 인자, 및/또는 세포외 기질)을 제공한다.
상기 기재한 양상의 다양한 실시형태는 막이 전달 기질에 고정되도록 전달 기질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 양상의 실시형태에서, 막은 후속적 해동 전에 장기간의 시간 동안 저장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 장기간의 시간은 약 6개월 내지 약 24개월 이상, 대안적으로 약 6개월 내지 적어도 약 12개월 이상, 대안적으로 약 6개월 내지 약 10개월, 대안적으로 약 6개월, 대안적으로 약 3개월 내지 약 6개월, 대안적으로 약 1개월 내지 약 3개월이며, 본 명세서에 기재된 다양한 시간에 대해 다른 몇 개월 및 며칠의 유도를 포함한다. 이들 실시형태에서, 조직 세포의 생존도는 해동 시 실질적으로 유지된다. 일부 실시형태에서, 조직 세포의 생존도는 냉동 저장 되었을 때 적어도 약 24개월 이상 동안 실질적으로 유지된다.
상기 양상의 실시형태에서, 막은 해동되고, 해동 방법의 시작 30분 내에 사용을 위한 준비가 될 수 있다.
상기 양상의 일부 실시형태에서, 막은 해동 후 1시간까지 식염수 중에서 저장될 수 있고, 약 70% 생존 세포를 여전히 유지할 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 상처를 치료하는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형;
투여 시 상기 막은 하기 중 하나 이상을 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다:
(i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소;
(ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가;
(iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소;
(iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가;
(v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소;
(vi) 세포 증식의 증가;
(vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는
(viii) 세포 이동의 증가.
다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 양상 및 실시형태에 따라 막을 투여하는 단계를 포함하는 상처 치유를 가속화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 12주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 5 내지 6주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 28일까지 50% 이상만큼 상처 크기의 감소를 촉진시키는데 효과적이다. 실시형태에서, 투여하는 단계는 표준 상처 치료에 비해 적어도 약 44%만큼 상처 봉합률을 개선시키는데 효과적이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 상처 치유 치료 전에 난치성인 상처에 대해 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에서 임의의 양상 및 실시형태에 따라 상처 부위에 막을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 12주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 5 내지 6주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 28일까지 50% 이상만큼 상처 크기의 감소를 촉진시키는데 효과적이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 만성 상처를 치료하는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 융모막은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형;
투여하는 단계는 만성 상처의 치유를 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포(viable therapeutic cell), 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 급성 상처를 치료하는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 융모막은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형;
투여하는 단계는 급성 상처의 치유를 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
상처 치료, 가속화된 상처 치료, 및/또는 만성 상처 치료에 관한 상기 양상의 실시형태에서, 상처는 열상, 찰과상, 화상, 창상, 구멍, 발사체에 의해 야기되는 상처, 표피 상처, 피부 상처, 만성 상처, 급성 상처, 외부 상처, 내부 상처, 선천성 상처, 궤양, 욕창, 당뇨성 궤양, 터널 상처, 수술 절차 동안 또는 수술 절차에 부가하여 야기된 상처, 정맥 피부 궤양, 및 무혈관성 괴사로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 방법에 관한 상기 양상의 실시형태에서, 막은: (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소; (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가; (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소; (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가; (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소; (vi) 세포 증식의 증가; (vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는 (viii) 세포 이동의 증가 중 하나 이상을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진시킬 수 있다.
다른 양상에서, 개시내용은 대상체에게 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 염증성 안질환을 치료하는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형;
상기 투여는 염증성 안 질환을 치료하는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
본 양상의 일부 실시형태에서, 염증성 안질환은 염증을 특징으로 하는 상처 또는 질환이다.
다른 양상에서, 개시내용은 대상체에게 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
상기 투여는 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
본 양상의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 조직 이식편 절차, 힘줄 수술, 인대 수술, 골 수술 및 척수 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 수술 절차와 병용하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 조직은 인간 조직이다. 추가 실시형태에서, 인간 조직은 연골, 피부, 인대, 힘줄 또는 뼈이다. 이 양상 및 다양한 실시형태에서, 막은 조직 재생을 직접적으로 또는 간접적으로 자극할 수 있다.
다른 양상에서, 개시내용은 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 반응을 조절하는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
상기 투여는 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
양상에서, 개시내용은 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 프로테아제 활성을 조절하는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
상기 투여는 프로테아제의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나 프로테아제 저해제의 양 및/또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
추가 양상에서, 개시내용은 반응 산소종(reactive oxygen species: ROS)의 양 및/또는 활성을 감소시키고, 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
상기 투여는 ROS의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
다른 양상에서, 개시내용은 상처에 동결보존된 융모막 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 신생혈관생성을 증가시키는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
상기 투여는 신생혈관생성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자의 양을 제공한다.
다른 양상에서, 개시내용은 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 세포 이동을 증가시키는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
상기 투여는 세포 이동을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자의 양을 제공한다.
또 다른 양상에서, 개시내용은 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는 세포 증식을 증가시키는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고,
상기 투여는 세포 증식을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자의 양을 제공한다.
양상에서, 개시내용은 대상체에게 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 융모막은:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고,
상기 투여는 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
염증성 반응을 조절하며, 프로테아제 활성을 조절하고, 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키며, 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키고, 신생혈관생성을 증가/촉진시키며, 세포 이동을 증가시키고, 세포 증식을 증가시키거나 또는 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법에 관한 임의의 상기 양상에서, 막의 투여는 상기 방법을 직접적으로 또는 간접적으로 자극 또는 유도할 수 있다.
다른 양상에서, 개시내용은 하기를 포함하는 상처 또는 조직 결함의 치료를 위한 키트를 제공한다:
A) 약제학적으로 허용가능한 용기에서 본 명세서에 기재된 임의의 양성 및 실시형태에 따른 막; 및
B) 상처 또는 조직 결함을 치료하기 위해 막을 투여하기 위한 설명서.
실시형태에서, 키트는 부가물을 추가로 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 부가물은 하나 이상의 항생제, 완화제, 각질용해제, 습윤제, 항산화제, 보존제, 치료제, 붕대, 도구, 절단 장치, 완충제, 해동 매질, 조절 매질, 겸자, 용기 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
상기 개시내용은 하기 설명 및 비제한적 실시예로부터 명확해질 수 있는 다른 양상 및 실시형태를 제공한다.
도 1은 다양한 냉동 방법 및 다양한 양의 동결보존 용액의 냉동 속도를 도시한 도면. 도 1a 내지 도 1d는 -80℃에서 냉동 전 4℃에서 30분 냉장 단계에 수반된다. 도 1e 내지 도 1h는 -80℃에서 직접적 냉동을 나타낸다.
도 2는 다양한 양의 동결보존 용액과 함께 저장될 때 양막의 세포 처리 회수(a) 및 세포 생존도(b)를 도시한 도면.
도 3은 다양한 양의 동결보존 용액과 함께 저장될 때 융모막의 세포 처리 회수(A) 및 세포 생존도(B)를 도시한 도면.
도 4는 융모양막의 세포 생존도에 대한 동결보존 효과를 나타낸다.
도 5는 양막(A) 및 융모막(B)의 세포 회수 처리(동결보존)에 대한 냉장 시간 및 냉동 매개변수 효과를 도시한 도면.
도 6은 양막에 대한 세포 생존도에 대한 냉장 시간 및 냉동 매개변수의 효과를 도시한 도면.
도 7은 생존가능한/죽은 균주를 이용하여 염색한 새로운 양막(A 및 C) 및 융모막(E)뿐만 아니라 동결보존된 양막(B 및 D) 및 융모막(F)의 대표적인 이미지를 도시한 도면. 생존 세포는 녹색으로 나타내는 반면, 죽은 세포는 적색으로 나타낸다.
도 8은 중간체의 제조로부터의 다양한 태반막(영양막, 융모 영양막 (CT), 융모 영양막과 함께 양막(ACT), 양막(AM), 융모막(CM) 및 융모막과 함께 양막(A/C))에 의해 자극되는 T-세포로부터 IL-2Rα의 발현을 측정하는 혼합 림프구 반응(MLR) 분석으로부터의 결과를 도시한 도면.
도 9는 동결보존 후 중간체 및 태반막(양막(AM), 융모막(CM), 양막+융모막(A/C))의 제조로부터의 다양한 태반막에 의해 자극되는 T-세포로부터의 IL-2Rα의 발현을 측정하는 MLR 분석으로부터의 결과를 도시한 도면.
도 10A 및 도 10B는 다양한 막 제조(양막+융모막+영양막(ACT), 융모막+영양막(CT), 영양막(T), 양막(AM) 및 융모막(CM))로부터 방출된 지질다당류(lipopolysacchride: LPS) 자극 TNF-α를 도시한 도면.
도 11은 고수준의 TNF-α가 분비된 융모 영양막(CT)에 의한 T-세포 자극으로부터의 IL-2Rα의 발현을 도시한 도면.
도 12는 플라스틱 접착 양막(a) 및 융모막(b)으로부터 단리된 배양된 세포의 이미지를 도시한 도면. 인간 골수 흡입물로부터 단리된 MSC를 비교(c)를 위해 나타낸다. 태반 유래 세포의 골형성 가능성을 알칼리 포스파타제(d)에 대한 보라색 염색에 의해 도시한다.
도 13은 동결보존된 양막에 비교하여 새로운 양막에서 VEGF의 발현을 도시한 도면.
도 14a는 양막 세포분쇄액 중의 IFN-2α 및 TGF-β3의 발현을 도시한 도면. 도 14b 및 도 14c는 융모막 세포분쇄액 중의 IFN-2α 및 TGF-β3의 발현을 도시한 도면. 도 14d 및 도 14e는 민싱한 융모막 태반 조성물 중의 IFN-2α 및 TGF-β3의 발현을 도시한다.
도 15a 내지 도 15b는 양막 세포분쇄액 중의 BMP-2, BMP-4, PLAB, PLGF(a) 및 IGF-1(b)의 발현을 도시한 도면. 도 15c 내지 도 15d는 융모막 세포분쇄액 중의 BMP-2, BMP-4, BMP-7, PLAB, PLGF(c) 및 IGF-1(d)의 검출을 도시한 도면. 도 15e 내지 도 15f는 융모막으로부터 유래된 태반 조성물 중의 BMP-2, BMP-4, BMP-7, PLAB, PLGF(e) 및 IGF-1(f)의 검출을 도시한 도면.
도 16은 양막(AM), 융모막(CM) 및 상업적으로 입수가능한 생성물 중의 EGF(a), IGFBP1(b) 및 아디포넥틴(c)의 발현을 도시한 도면.
도 17은 양막, 융모막 및 상업적으로 입수가능한 생성물 중의 MMP 대 TIMP 비를 도시한 도면.
도 18은 2명의 별도의 태반 공여자로부터의 조직 추출물 또는 상청액으로부터 유래된 양막(AM) 및 융모막(CM) 중의 bFGF 수준(A) 및 융모막(CM) 샘플 중의 bFGF 발현(B)을 도시한 도면.
도 19는 양막이 TNF-α에 노출될 때 고수준의 항염증 사이토카인 PGE2를 생성한다는 것을 입증하는 도면.
도 20은 동결보존된 양막이 IL-1α(a) 및 TNF-α(b)와 같은 가용성 전염증 사이토카인의 방출을 저해하고, 활성화된 면역 세포와 함께 공동 배양될 때 항염증 IL-10(c)의 방출을 상향조절한다는 것을 도시한 도면.
도 21은 양막이 방출된 보라색 염료의 감소에 의해 알 수 있는 바와 같은 MMP 활성을 저해하는 통계적으로 유의한(* p<0.05) 능력을 나타낸다는 것을 도시한 도면.
도 22A는 동결보존된 양막에 의한 엘라스타제의 저해를 도시한 도면. 도 22B는 가공된(민싱된) 융모막 조성물에 의한 엘라스타제의 저해를 도시한 도면.
도 23은 동결보존된 양막 및 아스코르브산(강한 항산화제)의 항산화제 능력을 도시한 도면.
도 24는 동결보존된 양막이 초기 세포자멸사 인간 진피 섬유아세포(HDF)를 구할 수 있음을 도시한 도면. 세포자멸사 세포는 염색질 및 핵 단편화의 그들의 응축에 기인하여 밝은 청색 점으로서 나타난다.
도 25a는 동결보존된 양막(양막)이 관을 형성하기 위해 인간 제대정맥 내피세포(Umbilical Vein Endothelial Cell: HUVEC)를 촉진시키고, 형성된 관의 수는 음성 대조군(음성 대조군)보다 유의하게 더 크다는 것을 도시한 도면. 도 25b 내지 도 25c는 배양물에서 14일까지 동안 태반 조성물에서 bFGF(b) 및 VEGF(c)의 발현을 도시한 도면. 도 25(d)는 태반 조성물이 저산소 조건에 노출될 때 VEGF 생성의 증가를 도시하는 도면.
도 26은 셀 바이오랩스(Cell Biolabs) 24-웰 사이토셀렉트(Cytoselect) 상처 치유 분석을 도시한 도면.
도 27은 양막, 융모막 또는 양막/융모막 제제의 조합으로부터의 5% 조정배지로 처리한 인간 진피 미세혈관 내피 세포(HMVEC)의 대표적인 이미지를 도시한 도면.
도 28은 동결보존된 양막(양막)에 의한 내피세포 이동의 촉진을 도시한 도면.
도 29는 동결보존된 양막(양막)에 의한 섬유아세포 세포 이동의 촉진을 도시한 도면.
도 30은 동결보존된 양막(양막)에 의한 병에 걸린 각질세포 이동의 촉진을 도시한 도면.
도 31A 및 도 31B는 본 기술의 태반 조성물의 증식 능력을 도시한 도면.
도 32a 내지 도 32e는 환자 1에서 당뇨성 족부 궤양을 치료하기 위한 태반 생성물의 현저한 효능을 도시한 도면.
도 33A 내지 도 33D는 환자 2에서 당뇨성 족부 궤양을 치료하기 위한 태반 생성물의 현저한 효능을 도시한 도면.
도 34는 완전한 상처 봉합을 나타내는 임상 연구 결과가 대조군(47명의 환자 중 10명, 21.0% 상처봉합, p=0.0001)에 비해 태반 생성물(50명의 환자 중 31명, 62.0% 상처봉합)을 받은 환자에서 상당히 더 높았다는 것을 도시한 도면.
도 35는 대조군에 비해 태반 생성물에 대한 12주 평가 기간 동안 완전한 상처 치유의 통계적으로 더 큰 가능성을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 도시한 도면(p<0.0001).
도 36은 태반 생성물에 의한 치료를 받은 환자가 대조군 아암에 비해 완전한 상처 봉합을 달성하기 위해 통계적으로 더 소수의 적용을 필요로 한다는 것을 도시한 도면(p=0.0001).
도 37은 12주까지 태반 생성물 치료법을 받은 대조군(n=26) 내 환자를 나타내는 카플란-마이어 분석이 67.8%의 상처봉합 확률을 가진다는 것을 도시한 도면.
도 38A 내지 도 38F는 본 명세서에 개시된 동결보존된 막을 혼입하는 힘줄의 수술적 수복을 위한 방법의 일반적 개요를 도시한 도면.
도 39A 내지 도 39F는 본 명세서에 개시된 동결보존된 막을 혼입하는 건증의 수술적 수복을 위한 방법의 일반적 개요를 도시한 도면.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 다음의 정의를 적용한다:
"예시적인" (또는 "예를 들어" 또는 "예로서")는 비제한적 예를 의미한다.
"융모막 조직" 또는 "융모막"은 태반 조직, 예를 들어, 영양막, 벽쪽 중배엽, 또는 이들의 조합물로부터의 융모막 또는 이의 일부를 의미한다.
"양막 조직" 또는 "양막"은 태반 조직으로부터의 양막 또는 이의 일부, 예를 들어, 상피층; 기저막; 치밀층; 섬유아세포층; 및 중간(스펀지) 층으로부터의 양막 또는 이의 일부를 의미한다.
"태반 생성물" 또는 "태반막"은 본 명세서에 개시되고 청구된 태반 생성물을 의미한다. 상기 용어는 태반막, 동결보존된 태반막, 동결보존된 융모양막, 동결보존된 융모막 및 동결보존된 양막을 포함하는 용어를 포함하고, 이들 용어와 상호호환적으로 사용될 수 있다. 태반 생성물은 조직 재생 및 상처 수복을 위해 사용될 수 있다.
"면역원성이 고갈된", "면역원성 세포가 고갈된" 또는 "면역원성 인자가 고갈된" 막 및 태반 생성물 또는 "고갈된 양의 기능성 면역원성 세포" 또는 "고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형"을 함유하는 막 및 태반 생성물은 일반적으로 생존 치료 세포를 보유하고/하거나 조직 상해(또는 결함)의 치료에 대한 치료 효능을 보유하며, 또한 적어도 1종의 면역원성 세포 유형(예를 들어, CD14+ 대식세포, 영양막 및/또는 모체 혈액 세포) 및/또는 천연 태반, 양막, 또는 융모막 내에 달리 존재하는 면역원성 인자가 없거나, 실질적으로 없거나 고갈된 본 기술의 하나 이상의 태반 생성물을 지칭한다. 면역원성 세포 유형 및/또는 면역원성 인자가 없거나, 실질적으로 없거나 또는 고갈된 막(본 명세서에 기재된 기술의 막과 유사)은 일부 양의 면역원성 세포/인자를 보유할 수 있지만, 보유된 양이 기능성 반응을 생성하는데 불충분한 수준에 있는(예를 들어, 검출가능한 양 미만으로, 무시할만한 양으로, 기능성 면역 반응을 생성하는데 불충분한 양으로) 막을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "세포외 기질" 또는 "ECM"은, 예를 들어, 양막, 융모막 및/또는 융모양막을 포함하는 태반 조직과 같은 조직과 관련된 세포외 기질의 임의의 하나 이상의 성분을 지칭한다. 상기 용어는 ECM, 예컨대 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 하이알루로난, 황산더마탄, 황산헤파린, 황산코드로이딘, 데코린 및 엘라스틴뿐만 아니라 ECM 중에 존재할 수 있는 가용성/기능성 치료 인자(예를 들어, 단백질 및 이의 단편을 포함함)의 구조적 성분을 포함할 수 있다.
"MSC"는 간충직 줄기 세포를 의미하며, 태아, 신생아, 성인 또는 출산후를 포함한다. "MSC"는 양막 MSC(AMSC) 및 융모막 MSC(CMSC)를 포함한다. MSC는 일반적으로 CD73, CD70, CD90, CD105 및 CD166 중 하나 이상을 발현시키고; 일반적으로 CD45 및 CD34를 발현시키지 않는다. MSC는 중배엽 계통(골형성, 연골원 및 지방세포화)로 분화된다.
"천연 세포" 또는 "조직 세포"는 태반막에 대해 천연이거나, 존재하거나 또는 내인성인 세포, 즉, 양막 또는 융모막을 포함하는 태반막에 외인성으로 첨가되지 않는 세포를 의미한다.
"천연 인자"는 태반막에 대해 천연이거나, 존재하거나 또는 내인성인 태반막 인자, 즉, 태반막에 외인성으로 첨가되지 않은 인자를 의미한다.
"실질적으로 없는"은 단지 무시할만한 양으로 존재하거나 또는 전혀 존재하지 않음을 의미한다. 예를 들어, 세포가 풍부할 때, 비가공 샘플 내에서 적어도 약 20% 또는 약 10% 미만 또는 약 1% 미만이다.
"치료 세포 " 또는 "유리한 세포"는 태반막의 기질층 및/또는 상피층에 존재하는 세포 및 성분을 포함하고, (양막을 포함하는 막에 대해) 예를 들어, 세포, MSC, 섬유아세포 및/또는 상피세포를 포함한다.
"치료 인자"는 상처 치유를 촉진시키는 태반-, 융모막 또는 양막-유래 인자를 의미한다. 치료 인자는 또한 세포 성장인자/단백질, 조직 수복 인자/단백질뿐만 아니라 상처 치유를 일반적으로 촉진시키는 다른 인자 및 단백질로서 분류될 수 있는 분자를 포함한다. 치료 인자의 비제한적 예는 인자, 항균성 인자, 화학유인물질, 리모델링 단백질, 예컨대 프로테아제 및 프로테아제 저해제, 면역조절 인자, 케모카인, 사이토카인, 성장인자 또는 다른 인자를 포함한다. 치료 인자는 또한 신생혈관생성, 세포 증식 및 상피화를 촉진시키는 인자를 포함한다. 이러한 인자의 비제한적 예는 TGFα, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, EGF, HB-EGF, VEGF, VEGF-C, VEGF-D, HGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PLGF, PEDF, Ang-2, IGF, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, 아디포넥틴, α2-마크로글로불린, FGF(예를 들어, FGF-2/bFGF, KGF, KDG/FGF-7), 기질 메탈로프로테이나제(예를 들어, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13), 메탈로프로테이나제의 조직 저해제(예를 들어, TIMP1, TIMP2), 트롬보스포딘(예를 들어, TSP1, TSP2), 피브로넥틴, IL-1RA, NGAL, 디펜신, G-CSF, LIF, IFN2α, PLAB 및 SDF1b를 포함한다. 용어 "치료 인자"는 용어 "태반 인자"와 상호호환적으로 사용될 수 있다.
"기질 세포"는 신생아 간충직 줄기 세포 및 신생아 섬유아세포로 구성된 존재하는(선택적으로 천연 비율로) 세포의 혼합 집단을 지칭한다. 신생아 간충직 줄기 세포와 신생아 섬유아세포는 둘 다 면역특권화되며; 둘 중 어떤 것도 면역 반응을 촉발하는 면역원성 세포 유형으로 존재하는 세포 단백질을 발현시키지 않는다.
"기질층"은 상피층을 함유하지 않는 태반막 내 층을 지칭한다.
"시험관내" 는 세포의 배양 확장을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 생존가능한 유기체 밖에서(예를 들어, 인공 배양 배지를 이용하는 조직 배양 조건 하에서) 수행된 실험 및/또는 절차를 기재한다.
"생체내"는 유기체, 예를 들어, 동물 또는 인간 내에서 수행되는 실험 및/또는 절차를 기재한다.
"동결보존" 또는 "동결보존적" 또는 "동결보호제"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되며, 냉동 공정 동안 손상(예를 들어, 세포 손상)을 방지하는 것을 돕는 물질이다. 적합한 동결보존제는 다이메틸설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로판다이올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 1,2-프로판다이올(PROH) 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 동결보존제는, 예를 들어, 폴리비닐 피롤리다이온, 하이드록시에틸 전분, 다당류, 단당류, 알긴산염, 트레할로스, 라피노스, 덱스트란, 인간 혈청 알부민, 피콜, 리포단백질, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 자가 혈장 또는 이들의 조합물로부터 선택된, 예를 들어, 하나 이상의 비세포 침투성 동결보존제를 포함한다. 유용한 동결보존제의 다른 예는 문헌[Cryopreservation (BioFiles, Volume 5, Number 4 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(등록상표) Datasheet)]에 기재되어 있다.
"동결보존 용액" 또는 "동결보존 매질"는 적어도 1종의 동결보존제를 포함하는 조성물을 지칭한다. 동결보존 용액 또는 매질은 추가 성분, 예를 들어, 혈청 알부민, 약제학적으로 허용가능한 담체, 완충제, 전해질 용액 또는 식염수(예를 들어, 인산염 완충 식염수)를 지칭한다. 동결보존 용액 또는 매질은 용액, 슬러리, 현탁액 등일 수 있다.
일반적 의미에서, 본 명세서에 기재된 기법은 조작된 태반 조직을 포함하는 태반 생성물을 제공한다. 예를 들어, 태반 생성물은 동결보존된 융모막, 동결보존된 양막 및/또는 동결보존된 융모양막을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 동결보존 방법은 다량의 생존가능한 태반 세포(즉, 태반 조직(들)에 대해 천연인 세포)를 보유하고, 면역원성 세포 및 면역원성 세포와 관련된 인자의 고갈을 제공한다. 이와 같이, 본 개시내용은 태반 생성물, 및 특히 다수의 유리한 치료방법에서의 용도를 발견하는 생존 세포, 치료 인자, 세포외 기질 및 감소된 면역원성의 조합을 포함하는 동결보존된 양막, 융모막 및/또는 융모양막을 포함하는 막에 관한 것이다. 이하에 논의하는 특정 양상에서, 막은 상처 또는 조직 결함에 적용될 수 있고, 생존 세포, 치료 인자, 적용되는 막에 대해 영역 내 변화를 직접적으로 또는 간접적으로 유도할 수 있는 세포외 기질(예를 들어, 적응 의약)의 양을 제공한다. 예를 들어, 막은 (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소; (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가; (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소; (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가; (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소; (vi) 세포 증식의 증가; (vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는 (viii) 세포 이동의 증가 중 임의의 하나 이상을 촉진시킴으로써 상처 치유의 정상 단계를 제공하거나 또는 촉진시킬 수 있는 양으로 생존 세포, 치료 인자 및 세포외 기질을 제공함으로써 만성상처와 같은 상처의 개선된 치유를 제공할 수 있다. 만성 상처 환경이 1) 고수준의 전염증 사이토카인, 2) 저수준의 항염증 사이토카인, 3) 고수준의 프로테아제 및 저수준의 그들의 저해제뿐만 아니라 4) 균형에 맞는 고수준의 산화제 및 저수준의 항산화제 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있기 때문에, 본 명세서에 개시된 동결보존된 막의 특징 및 기능성은 이러한 용도에 잘 적합화된다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 당뇨성 족부 궤양, 정맥 다리 궤양 및 화상과 같은 상처 치유에서의 용도를 포함하는 임상 용도를 위한 태반 생성물을 개시한다. 제조 방법은 선택적으로 태반막으로부터의 본질적으로 모든 잠재적 면역원성 세포를 제거하는 한편, 상처 치유에서 중요한 역할을 하는 특정 세포를 보존한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 선택적으로 제활력화된(devitalized) 태반 생성물을 개시한다. 일부 실시형태에서, 태반 생성물은 실질적으로 모든 면역원성 세포가 선택적으로 없을 수 있다. 실시형태에서, 막은 배양물 확장 세포를 함유하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 또는 본 명세서에 개시되거나 또는 달리 공지된 적어도 1종의 치료인자 또는 2종 이상의 치료 인자, 예를 들어, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 1(IGFBP1) 또는 아디포넥틴의 조합물을 포함하는 태반 생성물을 제공한다. 실시형태에서, 태반 생성물은 상피 성장 인자(EGF) 및/또는 IGFBP1을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 본 개시내용은 항염증 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 태반 생성물을 제공한다. 실시형태에서, 본 개시내용은 항산화 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 태반 생성물을 제공한다. 실시형태에서, 본 개시내용은 접착 및 섬유증을 감소시키고, 일반적으로 흉터방지 활성을 촉진시키는데 사용될 수 있는 태반 생성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 개시내용은 세포 이동을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 태반 생성물을 제공한다. 일부 실시형태에서,본 개시내용은 맥관 구조의 형성을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 태반 생성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 상처 치유 촉진을 위한 인자의 1차 공급원인 특정 유리한 세포의 생존도를 보존하는 한편, 면역원성 세포(예를 들어, 사멸 또는 비면역원성의 제공)를 선택적으로 고갈시키는 태반 생성물을 동결건조시키는 방법을 개시한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 제조된 태반 생성물의 면역원성을 시험하기 위한 생분석을 개시한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 시험관내에서 나타낸 것과 비슷한 MMP 대 TIMP의 치료비를 나타내는 태반 생성물을 개시한다. 본 발명자들은 약 7 내지 10 내지 1의 MMP-9와 TIMP1의 비를 나타내는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 α2-마크로글로불린을 포함하는 태반 생성물을 개시한다.
일부 실시형태에서, 이제 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제 및 메탈로프로테아제를 비활성화시킬 수 있는 태반 생성물이 제공된다. 다른 실시형태에서, 이제 세린 프로테아제를 비활성화시키는 태반 생성물이 제공된다. 이제 시스테인 프로테아제를 비활성화시키는 태반 생성물이 제공된다. 추가 실시형태에서, 이제 아스파르트산 프로테아제를 비활성화시키는 태반 생성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 이제 메탈로프로테아제를 비활성화시키는 태반 생성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 bFGF를 포함하는 태반 생성물을 개시한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 상처 치유에 바람직한 MMP 대 TIMP 비를 나타내는 태반 생성물을 개시한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 태반 생성물의 상처 치유 가능성을 평가할 수 있는 세포 이동 분석을 개시한다.
IGFBP1 및 아디포넥틴은 상처 치유에 중요한 본 명세서에 상정된 인자 중에 있다. 본 명세서에 개시된 기법에 따라 제조된 태반 생성물로부터 유래된 단백질의 평가는 EGF가 더 다량의 이들 조직에서 분비된 주요 인자 중 하나라는 것을 나타낸다. 추가적으로, 현재 개시된 양막에서 검출된 고수준의 EGF와 함께 상처 치유를 위한 EGF의 중요성은 본 개시내용에 의해 임상 용도를 위해 제조된 막 생성물의 평가를 위한 효력 마커로서 EGF의 선택을 뒷받침한다.
본 기술은 면역원성 세포를 선택적으로 고갈시키고, 다른 유리한 세포(간충직 줄기 세포, 상피세포 및 섬유아세포 중 적어도 하나 이상을 포함)의 생존도를 보존하는 태반 생성물에 대한 동결보존 절차를 개시한다. 일부 실시형태에서, 유리한 세포는 치유의 촉진을 위한 인자의 1차 공급원이다.
태반 생성물, 그들의 유용성 및 그들의 면역적합성은 놀랍게도 모 영양막의 결핍 및 CD14+ 태아 대식세포의 선택적 제거에 의해 향상된다. 면역적합성은 당업자에 의해 통상적으로 공지된 임의의 수단에 의해 입증될 수 있고, 이러한 입증은 혼합 림프구 반응(MLR)에 의해 그리고 지질다당류(LPS)-유도 종양 괴사 인자(TNF)-a 분비에 의해 수행될 수 있다.
본 태반 생성물은 선택적으로 실질적인 농도로 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic 섬유아세포 Growth Factor: bFGF)를 함유한다.
본 태반 생성물은 세포 이동 및/또는 상처 치유를 자극하는 인자를 제공하고/하거나 선택적으로 분비한다. 이러한 인자의 존재는 임의의 통상적으로 인식되는 방법에 의해 입증될 수 있다.
예를 들어, 상업적으로 입수가능한 상처 치유 분석이 존재하며(셀 바이오랩스(Cell Biolabs)) 세포 이동은 인간 진피 미세혈관 내피 세포(HMVEC-d)(론자 인코포레이티드(Lonza Inc.))를 이용함으로써 평가될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 태반 생성물로부터의 조정배지는 세포 이동을 향상시킨다.
본 명세서에 개시된 태반 생성물은 힘줄 수복, 연골 수복(예를 들어, 태퇴골과, 경골 고평부), 관/뼈 계면에서의 ACL 대체, 치아 조직 증가물, 누공(예를 들어, 크론병, G-관, 기관식도), 접착 장벽에서의 상실 조직(예를 들어, 비중격 수복, 진찰상 질벽 수복, 복벽 수복, 종양 절개), 진피 상처(예를 들어, 부분층 화상, 독성 표피 괴사융해, 수포성 표피 박리증, 괴저성 농피증, 궤양, 예를 들어, 당뇨성 궤양(예를 들어, 족부) 및 정맥 다리 궤양), 수술 상처, 탈장 수복, 힘줄 수복, 방광 수복, 뼈막 대체물, 켈로이드, 기관 열상, 상피 결함 및 고막의 수복 또는 대체물을 포함하는 다수의 상처를 치료함에 있어서 유용하다.
본 명세서에 개시된 태반 생성물은 상처 치유 과정에 유리한 다음의 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
a. ㎠ 당 대략의 세포 수는 약 500 내지 약 360,000; 약 10,000 내지 약 360,000; 약 10,000 내지 약 200,000; 또는 약 20,000; 약 25,000; 약 30,000; 약 35,000; 약 40,000; 약 45,000; 약 50,000; 약 55,000; 약 60,000; 약 65,000; 약 70,000; 약 75,000; 약 80,000; 약 85,000; 약 90,000; 약 95,000; 약 100,000; 약 105,000; 약 110,000; 약 115,000; 약 120,000; 약 125,000; 약 130,000; 약 135,000; 약 140,000; 약 145,000; 약 150,000; 약 155,000; 약 160,000; 약 165,000; 약 170,000; 약 175,000; 약 180,000; 약 185,000; 약 190,000; 또는 약 195,000이다.
b. 약 40 내지 약 500㎛의 두께,
c. 얇은 기저막,
d. 저 면역원성,
e. 동결보존된/동결보존성, 및
f. 인간 융모막 줄기 세포(hCMSC).
본 발명자들은 이제 배양물 확장 세포를 함유하지 않는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 IGFBP1을 포함하는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 아디포넥틴을 포함하는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 상처 치유에 바람직한 프로테아제 대 프로테아제 저해제의 비를 나타내는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 상처 치유 과정에 대한 치유의 촉진을 위한 인자의 1차 공급원인 한편 융모막으로부터 면역원성 세포를 선택적으로 고갈시키는 유리한 세포의 생존도를 보존하는 태반 생성물을 동결보존하는 방법의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 제조된 태반 생성물의 면역원성을 시험하기 위한 생분석의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 생체내에서 나타낸 것과 비슷한 MMP 대 TIMP 비를 나타내는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다. 본 발명자들은 이제 약 7 내지 10 내지 1의 MMP-9와 TIMP1의 비를 나타내는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 α2-마크로글로불린을 포함하는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 및 메탈로 프로테아제를 비활성화시키는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다. 본 발명자들은 이제 세린 프로테이나제를 비활성화하는 태발 생성물의 개발을 위한 필요를 동정하였다. 본 발명자들은 이제 시스테인 프로테이나제를 비활성화하는 태발 생성물의 개발을 위한 필요를 동정하였다. 본 발명자들은 이제 아스파르트산 프로테이나제를 비활성화하는 태발 생성물의 개발을 위한 필요를 동정하였다. 본 발명자들은 이제 메탈로 프로테이나제를 비활성화하는 태발 생성물의 개발을 위한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 bFGF를 포함하는 태반 생성물의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 태반막 생성물의 가능성을 평가하기 위한 세포 이동 분석의 개발에 대한 필요를 동정하였다.
본 발명자들은 이제 간충직 줄기 세포 및 섬유아세포를 포함하는 상처 치유를 위한 태반 생성물의 발생에 대한 필요를 동정하였다.
태반 생성물
개요
일 양상에서, 개시내용은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 융모막의 동결보존 및 후속적 해동 후에 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형.
다른 양상에서, 개시내용은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 융모막의 동결보존 및 후속적 해동 후에 하기를 포함한다:
A) 생존 세포, 하나 이상의 치료 인자, 및 세포외 기질을 포함하는 기질층,
B) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형; 여기서, 세포의 40% 초과는 생존 세포이다.
다른 양상에서, 상기 개시내용은 하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 하나 이상의 조직 성분은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자; 및
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질;
융모막은 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포 유형을 가지며; 1종 이상의 조직 성분이 치료적 이점을 제공하는데 효과적인 양으로 존재한다.
일 양상에서, 상기 개시내용은 하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 제공하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 하나 이상의 조직 성분은 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 조직 세포는 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자; 및
C) 융모막에 대해 천연인 세포외 기질;
융모막은 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 유형을 가지며; 1종 이상의 조직 성분이 하기에 효과적인 양으로 존재한다:
(i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 감소시키는 것;
(ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 증가시키는 것;
(iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키는 것;
(iv) 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키는 것;
(v) 프로테아제의 양 및/또는 활성을 감소시키는 것;
(vi) 세포 증식을 증가시키는 것;
(vii) 신생혈관생성을 증가시키는 것; 및/또는
(viii) 세포 이동을 증가시키는 것.
다른 양상에서, 개시내용은 동결보존된 태반을 포함하는 막을 제공하되, 태반의 동결보존 및 후속적 해동 후에 하기를 포함한다:
A) 조직 세포(상기 태반 세포는 양막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과는 생존가능함);
B) 태반막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
C) 태반에 대해 천연인 세포외 기질; 및
D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형.
동결보존된 태반막을 포함하는 양상의 일부 실시형태에서, 태반막은 양막 및 융모막을 포함한다.
상기 양상의 일부 실시형태에서, 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포는 면역 반응을 생성하는데 충분한 수준 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성한다. 일부 실시형태에서, 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포는 검출가능한 한계 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포는 모체 혈액 세포, 신생아 혈액 세포, 제대혈 세포, 영양막 및 조직 대식세포 중 임의의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 추가 실시형태에서, 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포는 하나 이상의 조직 대식세포를 포함한다. 조직 대식세포는 임의의 특성규명된 대식세포, 예를 들어, CD11b+, CD14+, CD18+, CD40+ 및 CD86+ 및/또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직 대식세포를 가질 수 있다. 추가 실시형태에서, 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포는 면역 반응을 생성하는데 충분한 수준 미만의 양으로 하나 이상의 면역원성 인자(예를 들어, TNF-α, 및/또는 본 명세서에 기재되건 또는 달리 공지된 다른 면역원성 인자)를 생성한다. 추가 실시형태에서, 면역원성 인자는 무시할만한 또는 검출가능한 한계 미만의 양으로 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생존 세포의 10% 미만은 기능성 면역원성 세포이다(예를 들어, 생존 세포의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만 또는 1% 미만).
상기 양상의 실시형태에서, 막은 조직 세포를 포함하되, 상기 조직 세포의 약 50% 내지 약 100%는 살아있다. 일부 실시형태에서, 상기 조직 세포의 약 60% 내지 약 100%는 살아있다. 추가 실시형태에서, 상기 조직 세포의 약 70% 내지 약 100%는 살아있다. 추가 실시형태에서, 생존 세포는 간충직 줄기 세포(MSC), 섬유아세포 및/또는 상피세포를 포함할 수 있다.
상기 양상의 다양한 실시형태에서, 막은 시험관내 또는 생체내 (i) 내지 (viii)의 임의의 활성을 촉진시키는데 효과적인 양으로 1종 이상의 조직 성분(예를 들어, 생존 세포, 하나 이상의 치료 인자, 및/또는 세포외 기질)을 제공한다.
시험관내 생존가능한 유기체 밖에서(예를 들어, 인공 배양 배지를 이용하는 조직 배양 조건 하에서) 수행된 실험 및/또는 절차를 기재한다. 생체내는 유기체, 예를 들어, 동물 또는 인간 내에서 수행되는 실험 및/또는 절차를 기재한다.
상기 기재한 양상의 다양한 실시형태는 막이 전달 기질에 고정되도록 전달 기질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 양상의 실시형태에서, 막은 후속적 해동 전에 장기간의 시간 동안 저장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 장기간의 시간은 본 명세서에 기재된 다양한 시간 기간 동안의 이들의 다른 매달 및 일수 변형을 포함하여, 약 6개월 내지 약 36개월 이상, 대안적으로는 약 6개월 내지 적어도 약 24개월 이상, 대안적으로는 약 6개월 내지 적어도 약 25개월 이상, 대안적으로는 약 6개월 내지 적어도 약 적어도 약 12개월 이상, 대안적으로는 약 6개월 내지 약 10개월, 대안적으로는 약 6개월, 대안적으로는 약 3개월 내지 약 6개월, 대안적으로는 약 1개월 내지 약 3개월이다. 이들 실시형태에서, 조직 세포의 생존도는 해동 시 실질적으로 유지된다. 일부 실시형태에서, 조직 세포의 생존도는 냉동 저장 되었을 때 적어도 약 24개월 동안 실질적으로 유지된다.
상기 양상의 실시형태에서, 막은 해동될 수 있고 본 명세서에 기재된 바와 같은 해동 방법의 시작 30분 내에 또는 일반적으로 공지된 방법으로부터 변형된 바와 같이 사용을 위한 준비가 될 수 있다.
상기 양상의 일부 실시형태에서, 막은 해동 후 1시간까지 식염수 중에서 저장될 수 있고, 약 70% 생존 세포를 여전히 유지할 수 있다.
본 기술의 일 실시형태는 동결보존 용액 및 융모막을 포함하는 태반 생성물을 제공하되, 융모막은 천연 치료 세포 및 천연 치료 인자를 포함하고, 동결보존 용액은 동결보존된 생성물을 제공하는데 효과적인 동결보존제의 양을 포함한다. 이 실시형태에 따르면, 융모막은 다음의 면역원성 세포 유형 중 적어도 하나 이상, 예컨대 영양막, CD14+ 대식세포 및 모체 혈액 세포가 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, 융모막은 천연 융모막의 구조를 나타내는 하나 이상의 층을 포함한다(예를 들어, 균질화되지 않거나 콜라게나제로 처리되지 않음).
일 실시형태에서, 태반 생성물은 상처에 대해 진피 적용에 적합하다.
본 명세서에 제공된 교시에 의해, 당업자는 이제 본 태반 생성물을 생성할 수 있다. 본 개시내용은 본 태반 생성물의 기술적 특징을 생성하는 제조방법을 제공한다. 따라서, 일 실시형태에서, 태반 생성물은 본 명세서에 교시된 단계들에 의해 제조된다. 본 태반 생성물은 본 명세서에 교시된 방법에 의해 제조된 생성물로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 기술의 생성물은 선별 단계들; 예를 들어, 기재된 기술적 특징 및 우수한 특성을 지니는 제제에 대한 선별 단계들에 의존하는 방법을 통해 생성될 수 있었다.
일부 실시형태에서, 동결건조된 융모막은 다음의 기술적 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a. 생존가능한 치료적 천연 세포는 하나 이상의 계통(예를 들어, 골형성, 지방세포화 및/또는 연골원 계통)의 세포로 분화할 수 있다,
b. 천연 치료 인자는 IGFBP1을 포함한다,
c. 천연 치료 인자는 아디포넥틴을 포함하며, 천연 치료 인자는 α2-마크로글로불린을 포함한다,
d. 천연 치료 인자는 bFGF를 포함한다,
e. 천연 치료 인자는 MMP-9 및 TIMP1을 포함한다,
f. 천연 치료 인자는 약 7 내지 약 10의 비로 MMP-9 및 TIMP1을 포함한다,
g. 태반 생성물은 배양 확장된 세포를 포함하지 않는다,
h. 동결보존 매질은 약 15mL 또는 15mL 초과의 양으로 존재할 수 있다,
i. 동결보존물은 DMSO를 포함한다,
j. 동결보존물은 존재하는 대다수의 동결보존물 중에 DMSO를 포함한다,
k. 동결보존 용액은 알부민을 추가로 포함하되, 선택적으로 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다,
l. 동결보존은 DMSO 및 알부민(예를 들어, HSA)을 포함하다,
m. 융모막은 약 5,000 내지 약 500,000개 세포/㎠, 약 5,000 내지 약 240,000개 세포/㎠ 또는 약 20,000 내지 약 60,000개 세포/㎠ 를 포함한다,
n. 융모막은 5,000 내지 약 500,000개 세포/㎠, 약 20,000 내지 약 200,000개 세포/㎠를 포함하며, 세포 생존도는 적어도 약 70%이다,
o. 융모막의 ㎠ 당 적어도: 약 7,400 또는 약 15,000 또는 약 23,217, 또는 약 35,000, 또는 약 40,000 또는 약 47,800개의 기질 세포를 포함한다,
p. 융모막의 ㎠ 당 적어도 약 5,000 내지 약 50,000의 기질 세포를 포함한다,
q. 태반 생성물의 ㎠ 당 약 4% 내지 약 46%의 생존가능한 비배양 확장된 섬유아세포를 포함한다,
r. 기질 세포를 포함하되, 적어도 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 74.3%, 또는 약 83.4 또는 약 90%, 또는 약 92.5% 또는 약 100%의 기질 세포는 냉동-해동 주기 후에 살아있다,
s. 융모막은 두께가 약 40㎛ 내지 약 400㎛이다,
t. 하기 중 임의의 것 미만으로 분비된다: 조직 배양 배지에서 조직 생성물의 2㎝ x 2㎝ 조각을 배치시키고 약 20 내지 약 24 시간 동안 박테리아 지질다당류에 대해 조직 생성물을 노출시킬 때 조직 배양 배지 내로 350pg/㎠, 225pg/㎠, 100pg/㎠ 또는 70pg/㎠ 이하의 TNF-α,
u. 냉장, 동결보존 및 해동 후, 하기 중 임의의 것 미만으로 분비된다: 조직 배양 배지에서 조직 생성물의 2㎝ x 2㎝ 조각을 배치시키고 약 20 내지 약 24 시간 동안 박테리아 지질다당류에 대해 조직 생성물을 노출시킬 때 조직 배양 배지 내로 350pg/㎠, 225pg/㎠, 100pg/㎠ 또는 70pg/㎠ 이하의 TNF-α,
v. 융모막의 모체측은 세포외 기질 단백질의 단편을 포함하되, 선택적으로 융모막은디스파제 II로 처리되었거나 또는 단백질 단편의 실질적인 부분은 말단 류신 또는 페닐알라닌을 포함한다,
w. 추가로 양막을 포함한다,
x. 추가로 양막을 포함하되, 양막은 양막 상피세포를 포함한다,
y. 추가로 양막을 포함하되, 양막 및 융모막은 천연 입체배치와 결합된다,
z. 추가로 양막을 포함하되, 양막 및 융모막은 천연 입체배치에 부착되지 않는다,
aa. 추가로 양막을 포함하되, 융모막은 양막에 대해 약 2 내지 약 4배 초과의 기질 세포를 포함한다,
bb. 양막을 포함하지 않는다,
cc. 융모막은 동일한 태반으로부터 유래된 동일한 면적의 양막에 비해 약 2 내지 약 4배 더 많은 기질 세포를 포함한다, 그리고
dd. 상처에 대한 진피 적용에 적합하다.
세포
본 기술에 따르면, 태반 생성물은 융모막의 천연 치료 세포를 포함한다. 세포는 하나 이상의 섬유아세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 천연 치료 세포는 생존가능한 기질 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 천연 치료 세포는 생존가능한 MSC를 포함한다.
일 실시형태에서, 천연 치료 세포는 생존가능한 섬유아세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 천연 치료 세포는 생존가능한 MSC 및 생존가능한 섬유아세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 생존가능한 치료적 천연 세포는 하나 이상의 계통(예를 들어, 골형성, 지방세포화 및/또는 연골원 계통)의 세포로 분화할 수 있는 생존 세포이다.
일 실시형태에서, 융모막은 약 10,000 내지 약 360,000개 세포/㎠ 또는 약 40,000 내지 약 90,000개 세포/㎠를 포함한다.
일 실시형태에서, 융모막은 융모막의 ㎠ 당 적어도: 약 7,400 또는 약 15,000 또는 약 0,000, 또는 약 35,000, 또는 약 40,000 또는 약 47,800개의 기질 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 융모막은 융모막의 ㎠ 당 적어도 약 5,000 내지 약 50,000의 기질 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 융모막은 기질 세포를 포함하되, 적어도 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 74.3%, 또는 약 83.4 또는 약 90%, 또는 약 92.5% 또는 약 100%의 기질 세포는 냉동-해동 주기 후에 살아있다.
일 실시형태에서, 융모막은 기질 세포를 포함하되, 약 40% 내지 약 92.5%의 기질 세포가 냉동-해동 주기 후에 살아있다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 총 세포의 약 50% 내지 약 90%에서 섬유아세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 융모막은 선택적으로 TNFα 방출의 LPS 자극에서 실질적인 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 약 5% 미만 또는 약 1% 미만 또는 약 0.5% 미만의 양으로 CD14+ 대식세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 동일한 태반으로부터 유래된 양막에 비해 약 2 내지 약 4배 초과의 기질 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 양막을 추가로 포함하되, 태반 생성물은 양막에 비해 약 2 내지 약 4배 초과의 기질 세포를 함유한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 추가로 양막을 포함하되, 양막은 양막 상피세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 영양막이 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 기능성 CD14+ 대식세포가 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 모체 혈액 세포가 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 영양막, 기능성 CD14+ 대식세포, 및 모체 혈액 세포가 실질적으로 없다. 선택적으로, 태반 생성물은 생존가능한 기질 세포를 포함한다. 선택적으로, 태반 생성물은 생존가능한 MSC를 포함한다. 선택적으로, 태반 생성물은 생존가능한 섬유아세포를 포함한다. 선택적으로, 태반 생성물은 생존가능한 MSC 및 생존가능한 섬유아세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 모체 혈액 세포가 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 모체 혈액 세포 및/또는 영양막이 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 융모막 내 총 세포 수에 비해 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 3% 내지 약 12%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 15%의 양으로 MSC를 포함한다. 선택적으로, MSC의 적어도 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 100%는 냉동-해동 주기 후에 살아있다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 융모막 내 총 세포 수에 비해 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 또는 약 70% 내지 약 85%의 양으로 섬유아세포를 포함한다. 선택적으로, 섬유아세포의 적어도: 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 100%는 냉동-해동 주기 후에 생존 가능하다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 약 임의의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.1% 미만의 양으로 기능성 대식세포를 포함한다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 약 9:2 내지 약 17:3의 비로 섬유아세포 및 MSC를 포함한다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 적어도 약 1,500개 세포/㎠, 적어도 약 3,000개 세포/㎠, 약 15,000 내지 약 9,000개 세포/㎠, 또는 약 3,000 내지 약 9,000개 세포/㎠의 양으로 MSC를 포함한다. 선택적으로, MSC의 적어도 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 100%는 냉동-해동 주기 후에 살아있다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 적어도 약 7,000개 세포/㎠, 적어도 약 14,000개 세포/㎠, 약 7,000 내지 약 51,000개 세포/㎠, 또는 약 14,000 내지 약 51,000개 세포/㎠의 양으로 섬유아세포를 포함한다. 선택적으로, 섬유아세포의 적어도: 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 100%는 냉동-해동 주기 후에 생존 가능하다.
일 실시형태에서, (태반 생성물의) 융모막은 약 3,000개 세포/㎠ 미만 또는 약 1,000개 세포/㎠ 미만의 양으로 기능성 대식세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 배양 확장된 세포가 실질적으로 없다.
태반 인자
본 기술에 따르면, 태반 생성물은 실시예를 포함하는 다양한 양상 및 실시형태에서 상기 정의되고 달리 기재한 바와 같은 융모막의 천연 치료 인자를 포함한다. 표 11은 시험한 치료 인자 및 그들의 기능의 목록을 제공한다.
일 실시형태에서, 인자는 VEGF, PDFG, HGF, SDF-1, KGF, IGFBP1, 아디포넥틴, α2-마크로글로불린, bFGF, MMP-9 및 TIMP1 등을 포함한다. 선택적으로, 인자는 천연 융모막 또는 이의 층(예를 들어, ± 10% 또는 20%)과 실질적으로 유사한 양/㎠로 존재한다.
일 실시형태에서, 인자는 약 7 내지 약 10(예를 들어, 약 7)의 비로 MMP-9 및 TIMP1을 포함한다. 선택적으로, 인자는 천연 융모막 또는 이의 층(예를 들어, ± 10% 또는 20%)과 실질적으로 유사한 양/㎠로 존재한다.
일 실시형태에서, 인자는 표 11에 열거된 인자 중 하나 이상(예를 들어, 대다수 또는 모두)을 포함한다. 선택적으로, 인자는 천연 융모막 또는 이의 층과 실질적으로 유사한 비로 존재한다. 선택적으로, 인자는 천연 융모막 또는 이의 층(예를 들어, ±10% 또는 20%)과 실질적으로 유사한 양/㎠로 존재한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 천연, 비가공 융모막보다 실질적으로 더 적은 TNF-α/㎠를 분비한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 LPS에 의한 자극 시 천연 태반 생성물보다 실질적으로 더 적은 TNF-α/㎠를 분비한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 하기 중 임의의 것 미만으로 분비된다: 조직 배양 배지에서 조직 생성물의 2㎝ x 2㎝ 조각을 배치시키고 약 20 내지 약 24 시간 동안 박테리아 지질다당류에 대해 조직 생성물을 노출시킬 때 조직 배양 배지 내로 420pg/mL, 350pg/mL, 280pg/mL 또는 70pg/mL TNF-α.
일 실시형태에서, 냉장, 동결보존 및 해동 후에, 태반 생성물은 하기 중 임의의 것 미만으로 분비된다: 조직 배양 배지에서 조직 생성물의 2㎝ x 2㎝ 조각을 배치시키고 약 20 내지 약 24 시간 동안 박테리아 지질다당류에 대해 조직 생성물을 노출시킬 때 조직 배양 배지 내로 40pg/mL, 350pg/mL, 280pg/mL 또는 70pg/mL TNF-α.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 TNF-α의 외인성으로 첨가된 저해제를 추가로 포함한다. 선택적으로, TNF-α의 저해제는 PGE2이다.
일 실시형태에서, 생성물은 항생제 또는 항생제 칵테일로 처리될 수 있다. 항생제 칵테일의 하나의 비제한적 예는 황산겐타미신, 반코마이신 HCl 및 암포테리신 B를 포함한다.
구성
본 기술의 태반 생성물은 천연 융모막의 구조를 나타내는 기질층을 포함한다. 본 명세서에 제공된 교시에 의해, 당업자는 천연 구조를 나타내는 태반층, 예를 들어, 균질화되지 않거나 또는 층을 실질적으로 파괴하는 콜라게나제 또는 다른 효소로 처리되지 않은 층을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 천연 구조를 지니는 기질층을 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 천연 구조를 지니는 기저막을 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 천연 구조를 지니는 망상층을 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 천연 구조를 지니는 망상층 및 기저층을 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 영양막이 실질적으로 없다. 일 실시형태에서, 태반 생성물은 천연 구조를 지니는 기저막을 포함하고, 융모막은 영양막이 실질적으로 없다. 선택적으로, 융모막과 접촉 시 모 부분은 세포외 기질 단백질의 단편을 포함한다. 선택적으로, 태반 생성물은 디스파제(예를 들어, 디스파제 II)로 처리되었고/되었거나 세포외 기질 단백질 단편의 실질적인 부분은 말단 류신 또는 페닐알라닌을 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 두께가 약 40㎛ 내지 약 400㎛이다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 양막을 추가로 포함한다. 선택적으로, 태반 생성물 내 양막 및 융모막은 천연 입체배치와 결합된다. 대안적으로, 양막 및 융모막은 천연 입체배치에서 서로 부착되지 않는다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 양막을 포함하지 않는다.
제형
본 기술에 따르면, 태반 생성물은 동결보존 매질과 함께 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 동결보존 용액은 하나 이상의 세포-침투성 동결보존제, 하나 이상의 비세포-침투성 동결보존제, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
선택적으로, 동결보존 용액은 DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 또는 이들의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 세포-침투성 동결보존제를 포함한다.
선택적으로, 동결보존 매질은 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 다당류, 단당류, 당 알코올, 알긴산염, 트레할로스, 라피노스, 덱스트란, 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 비세포-침투성 동결보존제를 포함한다.
유용한 동결보존제의 다른 예는 문헌["Cryopreservation" (BioFiles, Volume 5, Number 4 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(등록상표) 데이터시트)]에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 동결보존 매질은 세포-침투성 동결보존제를 포함하되, 대다수의 세포-침투성 동결보존제는 DMSO이다. 선택적으로, 동결보존 매질은 실질적인 양의 글리세롤을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 동결보존 매질은 DMSO를 포함한다. 선택적으로, 동결보존 매질은 글리세롤을 다량으로 포함하지 않는다. 선택적으로, 동결보존 매질은 실질적인 양의 글리세롤을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 동결보존 매질은 알부민(예를 들어, HSA 또는 BSA), 전해질 용액(예를 들어, 플라즈마-라이트(Plasma-Lyte)), 또는 이들의 조합물과 같은 추가적인 성분을 포함한다.
일 실시형태에서, 동결보존 매질은 1용적% 내지 약 15용적% 알부민 및 약 5용적% 내지 약 20용적% 동결보존제(예를 들어, 약 10용적%)를 포함한다. 선택적으로, 동결보존제는 DMSO를 포함한다. 일부 실시형태에서, 동결보존 매질은 약 5% 내지 약 100%의 동결보존제, 대안적으로 약 5% 내지 약 20%를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 약 20mL 또는 약 50mL 초과의 동결보존 매질로 제형화된다. 선택적으로, 동결보존 용액은 적어도 1종의 동결보존제(또는 동결보존 제제)를 포함한다. 일부 양상에서, 적어도 1종의 동결보존제는 DMSO를 포함한다(예를 들어, 1종 이상의 동결보존제가 있다면, DMSO는 다량의 총 동결보존제에서 발견된다). 선택적으로, 동결보존 매질은 실질적인 양의 글리세롤을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결보존 용액을 포함한다. 동결보존 용액은, 선택적으로 막 고정 조성물로서(예를 들어, 나이트로셀룰로스 상에서) 태반 생성물을 함유하는 용기에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 후속 냉동 단계 동안 막을 보호하기 위해 충분한 양의 동결보존 용액이 첨가된다. 동결보존 용액에 의한 막의 주입은 막 내에 함유된 세포의 생존도를 유지한다. 적합한 동결보존 용액이 당업계에 공지되어 있지만, 일 실시형태에서, 동결보존제는 하나 이상의 세포-침투성 동결보존제, 하나 이상의 비세포 침투성 동결보존제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 동결보존 매질에서의 저장을 포함한다. 적합한 동결보존제는 DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로판다이올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 1,2-프로판다이올(PROH) 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동결보존 용액은 폴리비닐 피롤리다이온, 하이드록시에틸 전분, 다당류, 단당류, 알긴산염, 트레할로스, 라피노스, 덱스트란, 인간 혈청 알부민, 피콜, 리포단백질, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 자가 혈장 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 비세포 침투성 동결보존제를 함유할 수 있다. 유용한 동결보존제의 다른 예는 문헌[Cryopreservation (BioFiles, Volume 5, Number 4 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(등록상표) Datasheet)]에 기재되어 있다.
예를 들어, 적합한 동결보존 용액은 용액의 적어도 약 0.001용적% 내지 100용적%, 적합하게는 약 2용적% 내지 약 20용적%, 바람직하게는 약 5용적% 내지 약 10용적%의 양으로 동결보존제, 예를 들어 DMSO를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 동결보존 용액은 적어도 약 2% 동결보존제(예를 들어, DMSO)를 포함한다. 추가로, 동결보존 용액은 혈청 알부민 또는 다른 적합한 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결보존 용액은 약 1% 내지 약 20% 혈청 알부민 또는 다른 적합한 단백질, 대안적으로는 약 1% 내지 약 10%을 포함한다. 냉동-해동 과정 동안 막을 안정화시키기 위해 그리고 세포에 대한 손상을 감소시켜 생존도를 유지하기 위해 혈청 알부민 또는 다른 적합한 단백질이 제공된다. 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민일 수 있다. 동결보존 용액은 생리 완충제 또는 식염수, 예를 들어, 인산염 완충 식염수를 추가로 포함할 수 있다.
동결보존 과정 동안, 용기는 태반막을 뒤덮기 위한 충분한 양의 동결보존 용액으로 충전될 수 있다. 동결보존 용액의 양은, 예를 들어, 사용되는 용기의 유형 및 봉입뿐만 아니라 보존될 막의 크기를 포함하는 다수의 인자에 필연적으로 의존할 수 있다. 조성물/장치 위에 놓이는데(또는 뒤덮는데) 필수적인 동결보존 용액의 양이 낮을수록, 조성물은 더 빠르게 해동될 수 있다. 따라서, 냉동 해동 동안 세포 생존도를 손상시키는 일 없이 막의 상부 범위에 대해 허용되는 최소한의 양의 동결보존 용액을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 사용되는 막이 더 작고 용기가 더 작을수록, 더 적은 동결보존 용액이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약 7mL 내지 약 50ml, 대안적으로는 약 10mL 내지 약 50ml, 대안적으로는 약 15mL 내지 약 50ml, 대안적으로는 약 15mL 내지 약 25 ml의 양으로 동결보존 용액을 함유하는 백(bag)이 사용될 수 있다. 일 바람직한 실시형태에서, 약 15mL의 동결보존 용액이 용기 또는 백에 첨가된다. 동결보존 용액의 양은 막을 완전히 침지시키는데 충분할 수 있다. 양은 사용되는 백의 크기 및 동결보존된 막의 크기에 의존할 것이다. 작은 백이 작은 막(예를 들어, 2㎝ x 2㎝ 막보다 더 작음)과 함께 사용된다면, 약 3mL 내지 약 10ml, 대안적으로 3mL 내지 약 7mL의 동결보존 용액이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약 7mL 내지 약 50ml, 대안적으로는 약 5mL 내지 약 20ml, 대안적으로는 약 7mL 내지 약 20ml, 대안적으로는 약 7mL 내지 약 15 ml를 함유하는 용기가 사용된다. 동결보존 용액의 양은 용기 내의 막을 충분히 침지시키는데 충분할 수 있다. 양은 사용되는 용기의 크기 및 동결보존된 막의 크기에 의존할 것이다.
일부 실시형태에서, 동결보존 용액의 양은 냉동 및 후속적 해동 절차 동안 세포를 보호하는데 충분하다. 일부 실시형태에서, 적어도 70% 세포 생존도는 냉동-해동 후에 유지된다. 일부 양상에서, 적어도 75% 세포 생존도가 유지되며, 대안적으로 약 80% 세포 생존도가 유지되고, 대안적으로 85% 세포 생존도가 유지되며, 대안적으로 약 90% 세포 생존도가 유지되고, 대안적으로 약 95% 세포 생존도가 유지되며, 대안적으로 약 100% 세포 생존도가 유지된다. 일부 실시형태에서, 막의 생존도는 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 75%, 적어도 78%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 92%, 및 그 사이의 백분율이다.
일부 실시형태에서, 동결보존 용액의 양은 막의 구조적, 구성적 및 또는 3-D 구조를 보호하는데 충분하다. 이들 예에서, 동결보존 용액은 0.01% 내지 약 100%, 대안적으로는 약 2% 내지 약 100%의 양으로 동결보존제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 동결보존 용액은 다당류 또는 단당류를 함유한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 나이트로셀룰로스 종이 상에 배치된다.
일 실시형태에서, 막은 복수의 부문으로 절단될 수 있다. 선택적으로, 막은 막 유형 및 특정 최종 용도 또는 해당 막의 용법에 따라서 임의의 적합한 크기일 것이고, 주문제작될 수 있다. 막의 적합한 크기는 약 1.5㎝ x 약 1.5㎝, 약 2㎝ x 약 2㎝, 약 3㎝ x 약 3cm, 약 4㎝ x 약 4㎝, 약 5㎝ x 약 5㎝, 약 6㎝ x 약 6㎝, 약 7㎝ x 약 7㎝, 약 8㎝ x 약 8㎝, 약 7.5㎝ x 약 15㎝, 약 1. 5㎝ x 약 2㎝, 약 1.5㎝ x 약 3㎝, 약 2㎝ x 약 3㎝, 약 3㎝ x 약 4㎝, 약 2㎝ x 약 5㎝, 약 3㎝ x 약 5㎝, 약 4㎝ x 약 5㎝, 약 5㎝ x 약 7㎝, 약 5㎝ x 약 10㎝, 약 5㎝ x 약 15㎝, 약 7.5㎝ x 약 15㎝를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 0.1㎝ 내지 1 cm의 증분으로 임의의 변형 또는 크기 및 범위를 포함한다.
동결보존된 막은 놀랍게 긴 저장수명 또는 안정성을 가지며, 장기간의 시간 동안 냉동될 때 생존 세포를 보유한다. 동결보존된 생성물은 일단 해동되면 높은 세포 생존도의 체류(생존 세포의 적어도 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상의 체류)로 2년 이상 동안 약 -20℃ 내지 약 -196℃(예를 들어, -45 내지 약 -80℃)로 저장될 수 있다. 일부 양상에서, 동결보존된 막은 고 체류의 생존 세포(예를 들어, 적어도 40% 생존 세포, 대안적으로 적어도 50% 생존 세포, 대안적으로 적어도 약 70% 생존 세포, 대안적으로 적어도 약 80%, 약 85%, 90% 또는 100% 생존 세포와 함께 해동하기 전 적어도 약 3개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 24개월, 적어도 약 25개월, 적어도 약 36개월 동안 약 -20℃ 내지 약 -196℃(예를 들어, -45 내지 약 -80℃)에서 저장될 수 있다.
다른 양상에서, 개시내용은 하기를 포함하는 상처 또는 조직 결함의 치료를 위한 키트를 제공한다:
A) 약제학적으로 허용가능한 용기에서 본 명세서에 기재된 임의의 양성 및 실시형태에 따른 막; 및
B) 상처 또는 조직 결함을 치료하기 위해 막을 투여하기 위한 설명서.
실시형태에서, 키트는 하나 이상의 항생제, 완화제, 각질용해제, 습윤제, 항산화제, 보존제, 치료제, 붕대, 도구, 절단 장치, 완충제, 해동 매질, 조절 매질, 겸자, 용기 및 이들의 조합물로부터 선택되는 부가물을 포함할 수 있다.
제조
개요
본 기술의 태반 생성물은 본 명세서에 교시된 기술적 특징을 제공하는 임의의 적합한 방식으로 태반으로부터 제조될 수 있다. 본 기술에 따라, 태반 생성물은 적어도 면역적합성인 융모막을 포함한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된다:
a. 태반을 얻는 단계,
b. 태반의 면역원성을 선택적으로 고갈시키는 단계; 및
c. 태반막을 동결보존하는 단계.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된다:
a. 태반을 얻는 단계;
b. 태반막으로부터 영양막의 실질적인 일부를 제거하는 단계; 및
c. 태반막을 동결보존하는 단계.
선택적으로, 상기 방법은 태반으로부터 융모막 또는 양막 또는 이의 일부를 제거하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 태반막으로부터 상피 세포의 실질적인 일부를 제거하는 일 없이 태반으로부터 양막 또는 융모막을 제거하는 단계를 포함한다.
선택적으로, 태반막으로부터 영양막의 실질적인 일부를 제거하는 단계는 태반을 프로테아제(예를 들어, 디스파제 또는 디스파제 II)와 같은 소화 효소로 처리하는 단계, 태반막으로부터 영양막을 (예를 들어, 스크레이핑함으로써) 기계적으로 제거하는 단계 또는 이들의 조합을 포함한다.
선택적으로, 상기 방법은, 예를 들어, 적혈구 세포를 용혈시킴으로써, 혈병을 제거함으로써, 또는 이들의 조합에 의해 태반으로부터 모체 혈액 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
선택적으로, 상기 방법은 태반막을 하나 이상의 항생제로 처리하는 단계를 포함한다.
선택적으로, 상기 방법은 선택적으로 TNFα 방출의 LPS 자극에서 실질적인 감소에 의해 입증되는 바와 같이 CD14+ 대식세포의 선택적 고갈 단계를 포함한다.
선택적으로, 태반막을 동결건조시키는 단계는 하나 이상의 세포-침투성 동결보존제, 하나 이상의 비세포-침투성 동결보존제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 동결보존 매질 내 태반을 냉동시키는 단계를 포함한다.
선택적으로, 태반을 동결건조시키는 단계는 약 2℃ 내지 약 8℃에서 일정 시간 기간 동안 배치시키고, 이어서 냉동시킴으로써, 선택적으로 TNFα 방출의 LPS 자극에서 실질적인 감소에 의해 입증되는 바와 같이 CD14+ 대식세포를 선택적으로 고갈시키는 것을 포함한다.
본 기술의 예시적인 태반 생성물 붕대 또는 상처 드레싱과 함께 제조될 수 있거나 이들을 구비할 수 있다.
면역적합성 및 선택적 고갈
일 실시형태에서, 본 기술의 태반 생성물은 면역적합성이다. 면역적합성은 태반으로부터 면역원성 세포 또는 인자 또는 면역원성(또는 이의 융모막)을 제거하는 임의의 선택적 고갈 단계에 의해 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 기능성 면역원성 세포를 선택적으로 고갈시킴으로써 면역적합성으로 된다. 태반은 태반(또는 이의 융모막)으로부터 면역원성 세포를 선택적으로 제거하는 한편 치료 세포를 유지함으로써 면역적합성으로 될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 세포는 면역원성 세포를 사멸시킴으로써 또는 그것으로부터 태반의 정제에 의해 제거될 수 있다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 영양막을 선택적으로 고갈시킴으로써, 예를 들어, 영양막 층의 제거에 의해 면역적합성으로 된다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은, 선택적으로 TNFα 방출의 LPS 자극의 실질적인 감소에 의해 또는 MLR 분석에 의해 입증된 바와 같이 기능성 CD14+ 대식세포의 선택적 고갈에 의해 면역적합성으로 된다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 모체 혈액 세포의 선택적 고갈에 의해 면역적합성으로 된다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 기능성 CD14+ 대식세포, 영양막 및 모체 혈액 세포의 선택적 고갈에 의해 면역적합성으로 된다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은, 선택적으로 TNFα 방출의 LPS 자극의 실질적인 감소에 의해 또는 MLR 분석에 의해 입증된 바와 같이 영양막 및/또는 CD14+ 대식세포의 선택적 고갈에 의해 면역적합성으로 된다.
영양막 제거
일 실시형태에서, 면역적합성(또는 선택적 고갈)은 태반 생성물로부터 영양막의 제거 또는 고갈에 의해 수행된다. 놀랍게도, 이러한 태반 생성물은 다음의 우수한 특징 중 하나 이상을 가진다:
a. 실질적으로 비면역원성임;
b. 현저한 치유를 제공함; 그리고
c. 향상된 치료적 효능을 제공함.
일 실시형태에서, 영양막이 제거되는 한편, 융모막의 기질층이 유지된다.
영양막은 태반 생성물의 영양막 함량을 실질적으로 감소시키는 임의의 적합한 방식으로 제거될 수 있다. 선택적으로, 영양막은 융모막으로부터의 하나 이상의 치료 성분의 실질적인 부분(예를 들어, MSC, 치료 인자 등)을 제거하는 일 없이 선택적으로 제거되거나 또는 달리 제거된다. 선택적으로, 대다수의(예를 들어, 실질적으로 모든) 영양막이 제거된다.
영양막을 제거하는 한 가지 방법은 소화 효소, 예컨대 디스파제(예를 들어, 디스파제 II)를 이용하여 태반(예를 들어, 융모막 또는 양막-융모막)을 치료하는 단계 및 태반으로부터 영양막을 분리시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 분리시키는 단계는 박리 또는 스크레이핑과 같은 기계적 분리를 포함한다. 선택적으로, 스크레이핑은 손가락과 같은 연성 기구를 이용하는 스크레이핑을 포함한다.
영양막을 제거하는 일 방법은 약 30 내지 약 45분 동안 디스파제로 융모막을 처리하여 태반으로부터 영약막을 분리시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 디스파제는 약 1% 미만(예를 들어, 약 0.5%)의 용액 중에서 제공된다. 선택적으로, 분리시키는 단계는 박리 또는 스크레이핑과 같은 기계적 분리를 포함한다. 선택적으로, 스크레이핑은 손가락과 같은 연성 기구를 이용하는 스크레이핑을 포함한다.
태반(예를 들어, 융모막)으로부터 영양막을 제거하는 유용한 방법은 Portmann-Lanz et al. ("Placental mesenchymal stem cells as potential autologous graft for pre- and perinatal neuroregeneration"; American Journal of Obstetrics and Gynecology (2006) 194, 664-73), ("Isolation and characterization of mesenchymal cells from human fetal membranes"; Journal Of Tissue Engineering And Regenerative Medicine 2007; 1: 296-305.), 및 (Concise Review: Isolation and Characterization of Cells from Human Term Placenta: Outcome of the First International Workshop on Placenta Derived Stem Cells")에 의해 기재된다.
일 실시형태에서, 영양막은 동결보존 전에 제거된다.
대식세포 제거
일 실시형태에서, 기능성 대식세포는 태반 생성물이 고갈되거나 또는 제거된다. 놀랍게도, 이러한 태반 생성물은 다음의 우수한 특징 중 하나 이상을 가진다:
a. 실질적으로 비면역원성임;
b. 현저한 치유를 제공함; 그리고
c. 향상된 치료적 효능을 제공함.
기능성 대식세포는 태반 생성물의 대식세포 함량을 실질적으로 감소시키는 임의의 적합한 방식으로 제거될 수 있다. 선택적으로, 대식세포는 태반으로부터의 하나 이상의 치료적 성분의 실질적인 부분(예를 들어, MSCs, 치료 인자 등)을 제거하는 일 없이 선택적으로 제거되거나 또는 달리 제거된다. 선택적으로, 대다수(예를 들어, 실질적으로 모든) 대식세포는 제거된다.
면역 세포, 예컨대 대식세포를 제거하는 한 가지 방법은 빠른 냉동 속도, 예컨대 60 내지 100℃/분에 의해 면역 세포를 사멸시키는 단계를 포함한다. 면역 세포를 제거하는 다른 방법은 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 8℃, 선택적으로 약 4℃에서 세포를 유지함으로써, 그리고 이어서, 약 1℃/분의 속도로 면역 세포를 냉동시킴으로써(예를 들어, 약 -20℃ 이하, 예를 들어 약 -20℃ 내지 약 -196℃에서)면역 세포를 사멸시키는 단계를 포함한다.
면역 세포가 빠른 냉동 속도에 의해 제거될 수 있지만, 이러한 방법은 또한 기질 세포(예를 들어, MSC)와 같은 치료 세포에 유해할 수 있다. 본 발명자들은 태반막을 일정 시간 기간 동안(약 3분 내지 약 240분 동안, 예를 들어, 적어도 약 10분 동안, 예컨대 약 30 내지 60분 동안) 상기 냉동 온도에서(예를 들어,2℃ 내지 8℃에서 인큐베이션) 배치시키는 단계, 이어서 태반을 냉동시킴으로써(예를 들어, -20 내지 약 -196, 예를 들어, -80℃±5℃에서 인큐베이션) CD14+ 대식세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 방법을 개발하였다. 선택적으로, 냉동시키는 단계는 10°/분 미만(예를 들어, 약 5°/분 미만, 예컨대 약 1°/분 미만)의 속도로 냉동시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반막을 약 2℃ 내지 약 8℃에 배치시키는 단계는 동결보존 매질이 태반 조직을 침투하도록(예를 들어 평형상태가 되도록) 충분한 시간 기간 동안 동결보존 매질(예를 들어, DMSO를 함유) 중의 태반막을 침지시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 냉동시키는 단계는 약 1°/분의 속도로 온도를 감소시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 냉동시키는 단계는 10°/분 미만(예를 들어, 약 5°/분 미만, 예컨대 약 1°/분)의 속도로 냉동시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 약 2℃ 내지 약 8℃에서 태반막을 배치시키는 단계는 약 -10℃ 내지 15℃ 온도에서(예를 들어, 약 2℃ 내지 약 8℃ 에서)동결보존 매질(예를 들어, DMSO를 함유) 중에서 적어도 약 3분 내지 약 240분 동안, 예를 들어 하기 중 임의로 태반막을 침지시키는 단계를 포함한다: 10분, 20분, 30분, 40분 또는 50분. 다른 실시형태에서, 약 2℃ 내지 약 8℃에서 태반막을 배치시키는 단계는 하기 중 어떤 것에 대해 약 -10 내지 15℃의 온도에서(예를 들어, 2 내지 8℃에서) 동결보존 매질(예를 들어, DMSO를 함유) 중에서 태반막을 침지시키는 단계를 포함한다: 10 내지 120, 20 내지 90분 또는 30 내지 60분. 선택적으로, 냉동시키는 단계는 10°/분 미만(예를 들어, 약 5°/분 미만, 예컨대 약 1°/분 미만)의 속도로 냉동시키는 단계를 포함한다.
모체 혈액 세포의 제거
일 실시형태에서, 모체 혈액 세포(또는 혈관 조직)는 태반 생성물이 고갈되거나 또는 태반 생성물로부터 제거된다. 놀랍게도, 이러한 태반 생성물은 다음의 우수한 특징 중 하나 이상을 가진다:
a. 실질적으로 비면역원성임;
b. 현저한 치유를 제공함; 그리고
c. 향상된 치료적 효능을 제공함.
모체 혈액 세포는 태반 생성물의 이러한 세포 함량을 실질적으로 감소시키는 임의의 적합한 방식으로 제거될 수 있다. 선택적으로, 모체 혈액 세포는 태반으로부터의 하나 이상의 치료 성분(예를 들어, MSC)의 실질적인 일부, 혈관형성 인자, 항산화제, 항염증제 등을 포함하는 치료 인자)를 제거하는 일 없이 선택적으로 제거되거나 또는 달리 제거된다.
일 실시형태에서, 모체 혈액 세포의 제거는 탯줄의 반대편 상의 태반 스커트 주위를 절단함으로써 태반으로부터 융모막을 분리시키는 단계를 포함한다. 태반의 제대측 상의 융모막은 이 측면 상의 혈관신생에 기인하여 제거되지 않는다.
일 실시형태에서, 모체 혈액 세포의 제거는 거대 혈병 및 임의의 과량의 혈액 세포를 제거하기 위해 융모막을(예를 들어, PBS와 같은 완충제를 이용하여) 린스하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 모체 혈액 세포의 제거는 항응고제(예를 들어, 시트르산염 덱스트로스 용액)을 이용하여 융모막을 처리하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 모체 혈액 세포의 제거는 탯줄의 반대편 상의 태반 스커트 주위를 절단함으로써 태반으로부터 융모막을 분리시키는 단계 및 융모막을 (예를 들어, PBS와 같은 완충제를 이용하여) 린스하여 총 혈병 및 임의의 과량의 혈액 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 모체 혈액 세포의 제거는 탯줄의 반대편 상의 태반 스커트 주위를 절단함으로써 태반으로부터 융모막을 분리시키는 단계 및 항응고제(예를 들어, 시트르산염 덱스트로스 용액)로 융모막을 처리하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 모체 혈액 세포의 제거는 탯줄의 반대편 상의 태반 스커트 주위를 절단함으로써 태반으로부터 융모막을 분리시키는 단계 및 융모막을 (예를 들어, PBS와 같은 완충제를 이용하여) 린스하여 총 혈병 및 임의의 과량의 혈액 세포를 제거하는 단계 및 융모막을 항응고제(예를 들어, 시트르산염 덱스트로스 용액)로 처리하는 단계를 포함한다.
TNFα 방출의 LPS 자극에서 실질적인 감소에 의해 입증되는 바와 같은 면역원성의 선택적 고갈.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 LPS 자극 TNF-α 방출의 감소에 의해 입증되는 바와 같이 면역원성이 선택적으로 고갈된다. 일 실시형태에서, 태반 생성물은 대식세포가 선택적으로 고갈된다.
일 실시형태에서, TNF-α는 대식세포의 사멸 또는 제거에 의해 고갈된다.
일 실시형태에서, TNF-α는 항-TNF-α 항체에 의한 처리에 의해 고갈된다.
일 실시형태에서, TNF-α는 TNF-α 분비를 억제하는 PGE2에 의한 처리에 의해 기능성으로 고갈된다.
일부 실시형태에서, TNF-α는 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100% 저해된다.
보존
본 기술의 태반 생성물은 새롭게 사용될 수 있거나 또는 일정 시간 동안 보존될 수 있다. 놀랍게도, 본 기술에서 동결보존은 면역적합성 태반 생성물을 초래한다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 동결보존된다. 태반 생성물은 동결보존제 용액 중의 냉동 온도에서(약 -20℃ 내지 약 -196℃, 예를 들어, 약 -80℃±5℃에서) 인큐베이션에 의해 동결보존될 수 있다.
동결보존은, 예를 들어 태반 생성물을 약 2℃ 내지 약 8℃에서 3분 내지 약 240분 동안, 예를 들어, 30 내지 60분 동안 인큐베이션시키는 것, 및 이어서, 약 -20℃ 내지 약 -196℃에서, 예를 들어, 약 -80℃에서 사용까지 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 태반 생성물은 사용을 위해 해동될 수 있다. 선택적으로, 태반 생성물은 세포 생존도가 냉동-해동 주기 후에 놀랍게도 잘 유지되는 방식으로 동결보존된다.
일 실시형태에서, 동결보존은 하나 이상의 세포-침투성 동결보존제, 하나 이상의 비세포-침투성 동결보존제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 동결보존 매질 중의 저장을 포함한다. 선택적으로, 동결보존 매질은 DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 또는 이들의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 세포-침투성 동결보존제를 포함한다. 선택적으로, 동결보존 배지는 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 다당류, 단당류, 당 알코올, 알긴산염, 트레할로스, 라피노스, 덱스트란, 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 비세포-침투성 동결보존제를 포함한다. 유용한 동결보존제의 다른 예는 문헌["Cryopreservation" (BioFiles, Volume 5, Number 4 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(등록상표) 데이터시트)]에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 동결보존 매질은 세포-침투성 동결보존제를 포함하되, 대다수의 세포-침투성 동결보존제는 DMSO이다. 선택적으로, 동결보존 매질은 실질적인 양의 글리세롤을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 동결보존 매질은 DMSO를 포함한다. 선택적으로, 동결보존 매질은 글리세롤을 다량으로 포함하지 않는다. 선택적으로, 동결보존 매질은 실질적인 양의 글리세롤을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 동결보존 매질은 알부민(예를 들어, HSA 또는 BSA), 전해질 용액(예를 들어, 플라즈마-라이트(Plasma-Lyte)), 식염수 용액 또는 이들의 임의의 조합물과 같은 추가적인 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결보존 용액을 포함한다. 동결보존 용액은 막 고정 장치 또는 조성물을 함유하는 용기에 첨가된다. 바람직하게는, 후속 냉동 단계 동안 막을 보호하기 위해 용기에 충분한 양의 동결보존 용액이 첨가된다. 적합한 동결보존 용액은 당업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 동결보존제는 하나 이상의 세포-침투성 동결보존제, 하나 이상의 비세포 침투성 동결보존제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 동결보존 매질 중의 저장을 포함한다. 적합한 동결보존제는 DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로판다이올, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 1,2-프로판다이올(PROH) 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동결보존 용액은 폴리비닐 피롤리다이온, 하이드록시에틸 전분, 다당류, 단당류, 알긴산염, 트레할로스, 라피노스, 덱스트란, 인간 혈청 알부민, 피콜, 리포단백질, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시에틸 전분, 자가 혈장 또는 이들의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 비세포 침투성 동결보존제를 함유할 수 있다. 유용한 동결보존제의 다른 예는 문헌[Cryopreservation (BioFiles, Volume 5, Number 4 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(등록상표) Datasheet)]에 기재되어 있다.
예를 들어, 적합한 동결보존 용액은 적어도 약 0.001용적% 내지 100용적%, 적합하게는 약 2용적% 내지 약 20용적%, 바람직하게는 약 5용적% 내지 약 10용적%의 양으로 적어도 1종의 동결보존제(예를 들어 DMSO)를 포함한다. 일부 예에서, 동결보존 용액은 적어도 약 2% 세포-침투성 동결보존제를 포함한다. 추가로, 동결보존 용액은 혈청 알부민 또는 다른 적합한 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결보존 용액은 약 1% 내지 약 20% 혈청 알부민 또는 다른 적합한 단백질, 대안적으로는 약 1% 내지 약 10%를 포함한다. 일 실시형태에서, 동결보존 매질은 1용적% 내지 약 15용적% 알부민 및 약 5용적% 내지 약 20용적% 동결보존제(예를 들어, 약 10용적%)를 포함한다. 선택적으로, 동결보존 용액은 DMSO를 포함한다(예를 들어, 하나 이상의 동결보존제를 지니는 용액 중에서, DMSO는 다량의 동결보존제 중에서 발견된다). 냉동-해동 과정 동안 막을 안정화시키기 위해 그리고 세포에 대한 손상을 감소시켜 생존도를 유지하기 위해 혈청 알부민 또는 다른 적합한 단백질이 제공된다. 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민일 수 있다. 동결보존 용액은 생리 완충제 또는 식염수, 예를 들어, 인산염 완충 식염수를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 동결보존은 나이트로셀룰로스 종이 상에 태반막을 배치시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 태반막은 동결보존 전에 복수의 부문으로 절단된다. 선택적으로, 부문은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 태반막을 배치시키기 전에 나이트로셀룰로스 종이 상에 배치된다.
사용 방법
상기 논의한 바와 같이, 태반 생성물, 및 특히 본 명세서에 기재된 동결보존된 막(예를 들어, 양막, 융모막 및/또는 융모양막)은 다수의 유리한 치료적 활성 및 효과를 촉진시키는데 효과적인 생존 세포, 치료 인자 및 세포외 기질의 양을 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법에서, 막은 다수의 치료 인자를 제공할 뿐만 아니라 동일 또는 유사한 치료적 이점을 제공하는, 치료 인자, 생존 세포 및 세포외 기질의 양을 제공하기 위해 세포를 촉진시킬 수 있는 환경에 적용되고 제공될 수 있다.
따라서, 일 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 상처 부위에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 상처를 치료하는 방법을 제공하되, 투여 시, 막은 하기 중 하나 이상을 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다:
(i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소;
(ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가;
(iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소;
(iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가;
(v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소;
(vi) 세포 증식의 증가;
(vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는
(viii) 세포 이동의 증가.
다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 양상 및 실시형태에 따라 사아처 부위에 막을 투여하는 단계를 포함하는 상처 치유를 가속화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 12주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 5 내지 6주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 28일까지 50% 이상만큼 상처 크기의 감소를 촉진시키는데 효과적이다. 실시형태에서, 투여하는 단계는 표준 상처 치료에 비해 적어도 약 44%만큼 상처 봉합률을 개선시키는데 효과적이다.
표준 상처 치료 또는 상처 치료를 위한 표준 관리는 본 명세서에 기재된 바와 같은 막 또는 생성물을 혼입하지 않는 임의의 치료를 지칭하고 포함할 수 있다. 적합한 표준 상처 치료는 당업계에 공지되어 있고, 드레싱의 적용(예를 들어, 거즈, 붕대, 장벽 또는 검출 가능하지 않은 또는 소수의 생존 세포를 함유하는 생체공학처리된 막), 괴사 조직 제거, 항생제, 살브(salve), 연고 등 및 이들의 임의의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 표준 상처 치료는 상처 드레싱 또는 붕대 및 오프로딩 장치와 함께 괴사 조직 제거를 포함할 수 있다..
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 상처 치유 치료 전에 난치성인 상처에 대해 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에서 임의의 양상 및 실시형태에 따라 상처 부위에 막을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 12주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 5 내지 6주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 28일까지 50% 이상만큼 상처 크기의 감소를 촉진시키는데 효과적이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 상처부위에 투여하는 단계를 포함하는 만성 상처를 치료하는 방법을 제공하되, 투여하는 단계는 만성 상처의 치유를 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
상처 치료, 가속화된 상처 치료, 및/또는 만성 상처 치료에 관한 상기 양상의 실시형태에서, 상처는 열상, 찰과상, 화상, 창상, 구멍, 발사체에 의해 야기되는 상처, 표피 상처, 피부 상처, 만성 상처, 급성 상처, 외부 상처, 내부 상처, 선천성 상처, 궤양, 욕창, 당뇨성 궤양, 터널 상처, 수술 절차 동안 또는 수술 절차에 부가하여 야기된 상처, 정맥 피부 궤양, 및 무혈관성 괴사로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 상처 치유 방법에 관한 상기 양상의 실시형태에서, 막은: (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소; (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가; (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소; (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가; (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소; (vi) 세포 증식의 증가; (vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는 (viii) 세포 이동의 증가 중 하나 이상을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진시킬 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 염증성 안질환을 치료하는 방법을 제공하되, 투여는 염증성 안질환을 치료하는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 본 양상의 실시형태에서, 상기 방법은 상피화를 촉진시키고/시키거나, 통증을 감소시키고/시키거나 일반적으로 눈 조직의 염증을 감소시키는 것과 관련될 수 있는 임의의 기법을 이용하여 막의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어 막은 수술은 수술 인레이(inlay) 또는 이식편 기법을 통해, 온레이 또는 패치 기법을 통해 또는 인레이와 온레이 기법의 병용을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 눈 수술(예를 들어, 광회절 각막 절제술(PRK)), 눈 외상(예를 들어, 열상, 화상 또는 찰과상), 또는 안 조직에서 염증의 양을 초래할 수 있는 염증 또는 치료를 특징으로 하는 안 질환과 관련될 수 있다. 본 방법에 의해 포함되는 "염증성 안질환"을 포함하는 적응증의 비제한적 예는 각막 또는 결막 표면(들)의 일반적 수복/재구성, 예를 들어, 지속적 상피 결함, 각막 궤양; 각막 이식; 데스메막 탈출증; 각막 천공; 상피 또는 상피하부 병변 또는 종양의 절개 후 결함(결막 종양, 결막 상피내 종양, 상피하 병변, 대상 각막병증, 흉터, 눈꺼풀의 가장자리와 평행한 결막 주름); 급성 화학적 화상; 급성 각막염; 통증성 물집각막병증; 부분적 또는 완전한 윤부 줄기세포 결핍증(줄기 세포 이식이 있음); 급성 스티븐슨 존슨 증후군; 검구유착; 뇌궁 재건; 무안구증; 여과포복원술; 공막연화증; 및 익상편을 포함한다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Meller, D., et al., Dtsch. Arztebl. Int., (2011); 108(14):243-248] 참조).
다른 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법을 제공하되, 투여는 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질, 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 본 양상의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 조직 이식편 절차, 힘줄 수술, 인대 수술, 골 수술 및 척수 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 수술 절차와 병용하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 조직은 인간 조직이다. 추가 실시형태에서, 인간 조직은 연골, 피부, 인대, 힘줄 또는 뼈이다. 이 양상 및 다양한 실시형태에서, 막은 조직 재생을 직접적으로 또는 간접적으로 자극할 수 있다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 상처에 본 명세서에 개시된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 염증 반응을 조절하는 방법을 제공하되, 상기 투여는 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 증가시키데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 실시형태에서, 전염증 사이토카인은 TNF-α 및 IL-1α, 또는 이들의 조합물로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 항염증 사이토카인은 IL-10 또는 PGE2 또는 이들의 조합물로부터 선택될 수 있다.
양상에서, 본 개시내용은 상처에 본 명세서에 기재된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 프로테아제 활성을 조절하는 방법을 제공하되, 투여는 프로테아제 활성을 감소시키고/시키거나 프로테아제 저해제의 양 및/또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 실시형태에서, 프로테아제는 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 엘라스타제, 또는 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 프로테아제 저해제는 기질 메탈로프로테이나제(TIMP)의 조직 저해제를 포함한다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 상처에 본 명세서에 기재된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 반응성 산소종(ROS)의 양 및/또는 활성을 감소시키는 방법을 제공하되, 투여는 ROS의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 막에 의해 제공되는 항산화제 능력은 약 250mM까지 아스코르브산의 용액과 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막은 산화제-유도 세포자멸사로부터 세포를 구할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막은 산화제에 노출되고/되거나 산화적 손상을 겪은 후에 세포가 세포자멸사를 겪는 것을 감소시키거나 또는 예방할 수 있다. 일부 양상에서, 생성물은 적어도 약 50%, 대안적으로 적어도 약 60%, 대안적으로 적어도 약 70%, 대안적으로 적어도 약 80%, 대안적으로 적어도 약 90% 만큼 산화제 유도 세포자멸사를 겪는 세포의 양을 감소시킬 수 있다.
다른 양상에서, 개시내용은 상처에 본 명세서에 기재된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 신생혈관생성을 증가시키는 방법을 제공하되, 투여는 신생혈관생성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 막은 혈관 표피 성장 인자(VEGF) 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bEGF) 또는 이들의 조합물의 양 및/또는 활성의 증가를 제공한다. 일부 실시형태에서, 막은 혈관 형성을 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, 막은 조직 내에서 폐쇄된 관 또는 혈관의 형성을 촉진 및/또는 향상시킬 수 있다. 시험관내 막은 HUVEC에 의한 폐쇄 관의 형성을 촉진시킨다.
다른 양상에서, 개시내용은 상처에 본 명세서에 기재된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 세포 이동을 증가시키는 방법을 제공하되, 투여는 세포 이동을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 막은 내피세포, 섬유아세포 및 상피세포, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 세포 이동을 유도한다.
또 다른 양상에서, 개시내용은 상처에 본 명세서에 기재된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 세포 증식을 증가시키는 방법을 제공하되, 투여는 세포 증식을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공한다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 막을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공하되, 투여는 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공한다. 본 방법의 실시형태에서, 막은 흉터 형성을 예방 또는 감소시키는데 효과적인 양으로 IFN-2α 및/또는 TGF-β3 의 양 또는 활성을 증가시킬 수 있다.
염증성 반응을 조절하며, 프로테아제 활성을 조절하고, 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키며, 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키고, 신생혈관생성을 증가/촉진시키며, 세포 이동을 증가시키고, 세포 증식을 증가시키거나 또는 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법에 관한 임의의 상기 양상에서, 막의 투여는 상기 방법을 직접적으로 또는 간접적으로 자극 또는 유도할 수 있다.
본 기술의 태반 생성물은 임의의 조직 손상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 치료방법은, 예를 들어, 치료가 필요한 대상체에게 본 기술의 태반 생성물을 투여함으로써 제공될 수 있다.
본 기술의 전형적인 투여 방법은 국소 투여이다. 본 기술의 투여하는 단계는 접근이 수술적 절차에 의해 획득되는 내부 조직에 대한 투여를 선택적으로 수반할 수 있다.
태반 생성물은 자가로, 동종이계로 또는 이종으로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 태반 생성물은 대상체에게 상처를 치료하기 위해 투여된다. 선택적으로, 상처는 열상, 찰과상, 열적 화상 또는 화학적 화상, 창상, 구멍 또는 발사체에 의해 야기되는 상처이다. 선택적으로, 상처는 표피 상처, 피부 상처, 만성 상처, 급성 상처, 외부 상처, 내부 상처, 선천성 상처, 궤양 또는 욕창이다. 이러한 상처는 우연적 또는 고의적, 예를 들어, 수술 절차 동안 또는 수술 절차에 부속하여 야기되는 상처일 수 있다. 선택적으로, 상처는 투여 전에 수술에 의해 봉합된다.
일 실시형태에서, 본 태반 생성물은 화상을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 선택적으로, 화상은 1도 화상, 2도 화상(부분층 화상), 3도 화상(전체층 화상), 화상 상처의 감염, 절개 및 비절개 화상 상처의 감염, 이미 이식 또는 치유된 상처로부터의 상피 손실, 또는 화상 상처 농가진이다.
일 실시형태에서, 본 태반 생성물은 대상체에게 궤양, 예를 들어, 당뇨성 궤양(예를 들어, 족부 궤양)을 치료하기 위해 투여된다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 대상체의 피부 위에, 예를 들어 각질층 상에, 상처 부위에 태반 생성물을 직접적으로 배치시킴으로써 투여되고, 따라서 상처는, 예를 들어, 접착 테이프를 이용하여 뒤덮일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 태반 생성물은 이식물로서, 예를 들어, 피하 이식물로서 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 주름 또는 노화의 다른 특징을 감소시키기 위해 표피에 투여된다. 이러한 치료는 또한 소위 미용 수술(예를 들어, 융비술, 주름살 절제 등)과 유용하게 병용된다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 진피 제거 절차 또는 진피 마모 절차(예를 들어, 레이저 제거, 열 제거, 전기적 제거, 심부 진피 제거, 진피하 제거, 부분적 제거 및 미세진피 마모)와 관련된 치유를 가속화하기 위해 표피에 투여된다.
본 기술의 태반 생성물로 치료될 수 있는 다른 병리는 외상성 상처(예를 들어, 민간 및 군대 상처), 수술적 흉터 및 상처, 척추 고정술, 척수 손상, 무혈관성 괴사, 재건 수술, 제거 및 허혈을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 기술의 태반 생성물은 조직 이식편 절차에서 사용된다. 선택적으로, 태반 생성물은 이식편의 일부에 적용되고, 이어서, 생물학적 기재에 (예를 들어, 기재에 대한 치유 및/또는 부착을 촉진시키기 위해) 부착된다. 비제한적 예로서, 조직, 예컨대 피부, 연골, 인대, 힘줄, 뼈막, 연골막, 활막, 근막, 장간막 및 건이 조직 이식편으로서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 태반 생성물은 힘줄 또는 인대의 치유를 촉진시키기 위해 힘줄 또는 인대에서 사용된다. 선택적으로, 태반 생성물은 뼈에 부착된 힘줄 또는 인대의 일부에 적용된다. 수술은, 예를 들어, 무릎 수술, 어깨, 다리 수술, 팔 수술, 팔꿈치 수술, 손가락 수술, 손 수술, 손목 수술, 발가락 수술, 족부 수술, 발목 수술 등을 포함하는 임의의 힘줄 또는 인대 수술일 수 있다. 예를 들어, 태반 생성물은 힘줄 또는 인대의 뼈에 대한 고정을 촉진시키기 위한 이식 또는 재건 절차에서 힘줄 또는 인대에 적용될 수 있다.
본 발명자들의 통찰 전체적으로, 놀랍게도 본 기술의 태반 생성물이 힘줄 및 인대 수술을 위한 우수한 치료(예를 들어, 치유, 치유 시간 및/또는 치유 강도)를 제공한다는 것을 발견하였다. 힘줄 및 인대 수술은 힘줄 또는 인대의 뼈에 대한 고정을 수반할 수 있다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 본 태반 생성물에서 MSC의 골형성 및/또는 연골원 가능성이 힘줄 또는 인대의 치유 과정 및 치유 강도를 촉진시킨다는 것을 믿는다. 본 발명자들은 본 태반 생성물이 뼈막 기반 치료법에 대한 대안의 또는 부가적인 치료를 제공한다는 것을 믿는다. 예를 들어, 유용한 뼈막 기반 치료는 문헌[Chen et al. ("Enveloping the tendon graft with periosteum to enhance tendon-bone healing in a bone tunnel: A biomechanical and histologic study in rabbits"; Arthroscopy. 2003 Mar;19(3):290-6), Chen et al. ("Enveloping of periosteum on the hamstring tendon graft in anterior cruciate ligament reconstruction"; Arthroscopy. 2002 May-Jun;18(5):27E), Chang et al. ("Rotator cuff repair with periosteum for enhancing tendon-bone healing: a biomechanical and histological study in rabbits"; Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy Volume 17, Number 12, 1447-1453)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참고로 포함된다.
힘줄 또는 인대 수술 방법의 비제한적 예로서, 힘줄은 태반막에 폐쇄되고/되거나 감싸지거나 또는 봉입되고, 힘줄은 뼈에 부착된다. 선택적으로, 힘줄은 뼈에 부착되기 전에 뼈 터널 내로 배치된다.
일 실시형태에서, 힘줄 또는 인대 수술은 이식편 절차이되, 태반 생성물은 이식편에 적용된다. 선택적으로, 이식편은 동종이식편, 이종이식편, 또는 자가 이식편이다.
일 실시형태에서, 힘줄 또는 인대 수술은 찢어진 인대 또는 힘줄의 수복이되, 태반 생성물은 찢어진 인대 또는 힘줄에 적용된다.
태반 생성물이 적용될 수 있는 힘줄의 비제한적 예는 손가락폄근 힘줄, 햄스트링 힘줄, 이두박근 힘줄, 아킬레스건, 신근, 및 회전근개 힘줄을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 기술의 태반 생성물은 상처 부위에 태반 생성물을 적용함으로써 섬유증을 감소시키는데 사용된다.
일 실시형태에서, 본 기술의 태반 생성물은 항 접착 상처 장벽으로서 사용되되, 태반 생성물은 상처 부위에, 예를 들어, 섬유증(예를 들어, 수술후 섬유증)을 감소시키기 위해 적용된다.
태반 생성물이 적용될 수 있는 상처 부위의 비제한적 예는 수술로 유도되거나 또는 척추, 추궁절제술, 무릎, 어깨 또는 분만, 외상 관련 상처 또는 손상, 심혈관 절차를 수반하는 수술과 관련된 것을 포함하여, 신생혈관생성 자극, 뇌/신경학적 절차, 화상 및 상처 치유 및 안과적 절차를 필요로 한다. 예를 들어, 선택적으로, 상처 부위는 척추의 수술과 관련되며, 태반 생성물의 기질측은 경막(예를 들어, 경막과 접하는 기질측)에 적용된다. 상처 부위 및/또는 방법의 선택을 포함하는 이러한 절차에 대한 방향은 본 명세서에 참고로 포함되는, 예를 들어, WO 2009/132186 및 미국 특허 제2010/0098743호에서 찾을 수 있다.
본 기술의 태반 생성물은 선택적으로 상처의 접착 또는 섬유증을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 수술후 섬유증은 모든 수술적 상처 치유의 자연적 결과이다. 예로서, 수술후 경막외 접착은 추궁절제술 수술 몇 개월 후에 전형적으로 나타나는 지각과민의 재발을 야기하는 척수경막낭 및 신경근의 테터링, 견인 및 압박을 야기한다. 흉터 조직의 제거를 위한 반복된 수술은 흉터 조직에 의해 둘러싸이는 신경 구조를 동정하는 것의 어려움 때문에 불량한 결과 및 증가된 손상 위험과 관련된다. 따라서, 경험적 및 임상 연구는 경막 및 신경근에 대한 흉터 조직의 접착을 방지하는 것에 주로 중점을 두었다. 척추 접착은 척추 수술의 부전에서 주요 기여 인자로서 연루되었다. 섬유증 흉터 조직은 재발 통증 및 신체장애와 관련될 수 있는 신경근의 압박 및 테터링을 야기한다.
이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 적어도 부분적으로, 태반 생성물이 감소된 수의 면역 세포뿐만 아니라 증가된 수의 세포 인자(예를 들어, TGF-β3, HGF, VEGF, HE, 하이알루론산 등)를 포함하는 환경을 제공하도록 인시추로 작용할 수 있기 때문에 본 명세서에 교시된 태반 생성물이 상처의 접착 또는 섬유증을 감소시키는데 유용하다는 것을 믿는다. 본 기술의 상처 드레싱 및 과정의 한 가지 이점은 수술 후 및 특히 등 수술 후 접착을 방지하기 위해 사용될 수 있는 항-접착 장벽이 제공된다는 점이다.
앞 단락들에서, 단수의 사용은 구체적으로 표시된 경우를 제외하고 복수를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 단어는 달리 구체화되지 않는 한, "하나 이상의"를 의미한다. 추가로, 본 기술의 양상이 대안의 목록과 관련하여 기재되는 경우, 상기 기술은 대안의 그리고 이들 중 하나 이상의 임의의 조합의 목록의 임의의 개개 구성원 또는 하위 그룹을 포함한다.
공개된 특허출원을 포함하는 모든 특허 및 간행물의 개시내용은 각각의 특허 및 간행물이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 기술의 범주는 상기 기재한 구체적 실시형태로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 기술은 특히 기재되고 여전히 수반하는 청구범위의 범주 내인 것 이외로 실행될 수 있다.
마찬가지로, 다음의 실시예는 본 기술을 더 완전히 예시하기 위해 제시한다. 그러나 그들은 본 명세서에 개시된 넓은 범주의 기법으로 제한되는 것으로서 어떠한 방법으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 기재된 기법 및 그의 이점은 다음의 실시예를 참고로 하여 더 용이하게 이해될 것이다. 이들 실시예는 본 기술의 구체적 실시형태를 기재하기 위해 제공된다. 이들 구체적 실시예를 제공함으로써, 본 기술의 범주 및 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 현재 기재된 기술의 전체 범주는 본 명세서에 첨부된 청구범위에 의해 정해지는 대상 및 임의의 변경, 변형 또는 해당 청구범위의 동등물을 포함한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 기술의 다른 특징 및 실시형태는 그의 의도된 범주를 제한하기보다는 본 기술의 예시를 위해 제공되는 다음의 실시예로부터 명확하게 될 것이다.
실시예
제조 과정
실시예 1 양막 생성물의 예시적인 제조 과정
일 실시형태에서, 및 본 명세서에 논의되는 바와 같이, 본 개시내용은 분만 후 태반으로부터의 양막을 포함하는 태반 생성물(또는 대안적으로, 다음의 실시예에서 "막")의 제조방법에 관한 것이다. 하나의 이러한 방법은 하기를 포함한다:
a. 태반 표면에 가까운 탯줄의 제거,
b. 태반 스커트에 대한 양막의 둔적박리,
c. 태반을 뒤집어서 양막을 완전히 제거,
d. PBS 중에서 양막을 린스하여 적혈구를 제거,
e. 양막을 11% ACD-A 용액으로 1회 린스하여 적혈구의 제거를 도움,
f. 양막을 PBS로 린스하여 ACD-A 용액을 제거,
g. PBS를 사용하여 양막으로부터 임의의 남아있는 혈액을 제거,
h. 양막의 상피 또는 기질층의 부분이 아닌 임의의 다른 성분을 부드럽게 제거,
i. PBS 중에 양막을 넣고 한쪽으로 치워둠,
j. 양막을 항생제 용액을 함유하는 보틀 내에 넣고, 37℃±2℃에서 24 내지 28시간 동안 인큐베이션시킴,
k. 인큐베이터로부터 보틀을 제거하고, 막을 PBS로 린스하여 항생제 용액을 제거함,
l. 강화된 나이트로셀룰로스 종이 상에 양막(상피측 올림)을 두고, 맞는 크기로 절단함,
m. FP-90 동결백 내에 넣고 열 밀봉시킴,
n. 주사기를 통해 백에 50mL 동결보존 용액을 첨가하고, 주사기를 이용하여 백 내에 갖혀있는 임의의 공기를 제거함,
o. FP-90 백 상의 용액 라인을 관 밀봉시킴,
p. 백을 2차백 내로 넣고, 열 밀봉시킴,
q. 유닛을 패키징 카톤 내로 넣음,
r. 2 내지 8℃에서 30 내지 60분 동안 냉장시키고, 스티로폼 용기 내 -80℃±5℃에서 냉동시킴.
실시예 2 융모막 생성물의 예시적인 제조과정
분만 후 태반으로부터 융모막 및 선택적으로 양막을 포함하는 태반 생성물을 제조하는 한 가지 방법:
a. 태반 표면에 가까운 탯줄의 제거,
b. 태반 스커트에 대한 양막의 둔적박리,
c. 태반을 뒤집어서 양막을 완전히 제거,
d. 태반 스커트 주위를 절단함으로써 융모막을 제거,
e. PBS 중에서 막을 둘 다 린스하여 적혈구를 제거,
f. 막을 둘 다 11% ACD-A 용액으로 1회 린스하여 적혈구의 제거를 도움,
g. 막을 둘 다 PBS로 린스하여 ACD-A 용액을 제거,
h. 200ml 0.5% 디스파제용액 중에서 37℃±2℃로 30 내지 45분 동안 융모막을 처리함,
i. 디스파제 처리가 완전하게 될 때, 융모막을 PBS로 린스하여 디스파제 용액을 제거,
j. 영양막층을 융모막으로부터 부드럽게 제거,
k. 융모막을 항생제 용액을 함유하는 보틀 내에 넣고, 37℃±2℃에서 24 내지 28시간 동안 인큐베이션시킴,
l. 인큐베이터로부터 보틀을 제거하고, 융모막을 PBS로 린스하여 항생제 용액을 제거함,
m. 강화된 나이트로셀룰로스 종이 상에 융모막을 두고, 맞는 크기로 절단함,
n. 각각의 조각을 FP-90 동결백 내에 넣고 열 밀봉시킴,
o. 주사기를 통해 백에 50mL 동결보존 용액을 첨가하고, 주사기를 이용하여 백 내에 갖혀있는 임의의 공기를 제거함,
p. FP-90 백 상의 용액 라인을 관 밀봉시킴,
q. 백을 2차 백 내로 넣고, 열 밀봉시킴,
r. 유닛을 패키징 카톤 내로 넣음,
s. 2 내지 8℃에서 30 내지 60분 동안 냉장시킴,
t. 스티로폼 용기 내 -80℃±5℃에서 냉동시킴.
실시예 3 융모양막 생성물의 예시적인 제조방법
본 개시내용은 하기를 포함하는, 분만 후 태반으로부터의 양막 및 융모막을 포함하는 태반 생성물의 제조방법을 제공한다:
a. 태반 표면에 가까운 탯줄의 제거,
b. 태반 스커트에 대한 양막의 둔적박리,
c. 태반을 뒤집음,
d. 태반 스커트 주위를 절단함으로써 융모막 및 부착된 양막(융모양막)을 제거,
e. PBS 중에서 막을 둘 다 린스하여 적혈구를 제거,
f. 막을 둘 다 11% ACD-A 용액으로 1회 린스하여 적혈구의 제거를 도움,
g. 막을 둘 다 PBS로 린스하여 ACD-A 용액을 제거,
h. 막을 항생제 용액을 함유하는 보틀 내에 넣고, 37℃±2℃에서 24 내지 28시간 동안 인큐베이션시킴,
i. 인큐베이터로부터 보틀을 제거하고, PBS로 린스하여 항생제 용액을 제거함,
j. 영양막층을 융모막으로부터 부드럽게 제거,
k. 강화된 나이트로셀룰로스 종이 상에 융모양막을 두고, 맞는 크기로 절단함,
l. 각각의 조각을 FP-90 동결백 내에 넣고 열 밀봉시킴,
m. 주사기를 통해 백에 50mL 동결보존 용액을 첨가하고, 주사기를 이용하여 백 내에 갖혀있는 임의의 공기를 제거함,
n. FP-90 백 상의 용액 라인을 관 밀봉시킴,
o. 백을 2차 백 내로 넣고, 열 밀봉시킴,
p. 유닛을 패키징 카톤 내로 넣음,
q. 2 내지 8℃에서 30 내지 60분 동안 냉장시킴,
r. 스티로폼 용기 내 -80℃±5℃에서 냉동시킴.
실시예 4 예시적인 막 제조방법
현재 개시된 제조절차에 따른 융모막을 포함하는 태반 생성물 막의 제조를 위한 한 가지 방법에 관한 추가의 상세한 설명을 이하에 제공한다.
태반을 생물학적 안전 캐비닛 내에서 처리하였다. 우선 탯줄을 제거하고 나서, 양막을 둔적박리를 이용하여 밑에 있는 융모막으로부터 박리시켰다. 후속적으로, 융모막을 탯줄의 반대편 상의 태반 스커트 주위를 절단함으로써 제거하였다. 태반의 제대측 상의 융모막은 이 측면 상의 혈관신생에 기인하여 제거되지 않았다. 융모막을 인산염 완충 식염수(PBS)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 깁코 인비트로젠(Gibco Invitrogen))로 린스하여 덩어리 혈병 및 임의의 과량의 혈액 세포를 제거한다. 이어서, 막을 식염수(일리노이주 디어필드에 소재한 박터 헬스케어 코포레이션(Baxter Healthcare Corp)) 중의 11% 항응고제 시트르산염 덱스트로스 용액(USP) 화학식 A(ACD-A)(일리노이주 디어필드에 소재한 박터 헬스케어 코포레이션)으로 세척하여 남아있는 혈액 세포를 제거하였다.
이어서, 융모막을 37℃±2℃에서 30 내지 45분 동안 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)(메릴랜드주 워커스빌에 소재한 론자(Lonza))에서 200mL의 0.5% 디스파제(매사추세츠주 베드포드에 소재한 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 중에서 인큐베이션시켜 융모막과 인접한 영양막층 사이의 연결을 분해시켰다. 일단 융모막 인큐베이션 기간이 완료되면, 융모막을 PBS로 린스하여 디스파제 용액을 제거하였다. 후속적으로, 영양막층을 박리 또는 스크레이핑에 의해 부드럽게 제거하였다.
이어서, 융모막을 37℃±2℃에서 24 내지 28시간 동안 DMEM에서 황산 겐타마이신(50㎍/mL)(일리노이주 샴버그에 소재한 아브락시스 파마슈티칼 프로덕츠(Abraxis Pharmaceutical Products)), 반코마이신 HCl(50㎍/mL)(일리노이주 레이크 포레스트에 소재한 호스피라), 및 암포테리신 B(2.5㎍/mL)(미조리주 세인트루이스에 소재한 시그마알드리치(Sigma Aldrich))로 이루어진 항생제 용액 500mL 중에서 각각 소독시켰다. 인큐베이션 플라스크와 함께 통기캡을 사용하였다. 인큐베이션 기간 후에, 막을 PBS로 세척하여 임의의 잔여 항생제 용액을 제거하였다.
막을 옵티트란(Optitran) BA-S 85 강화 나이트로셀룰로스 종이(독일 대셀에 소재한 와트만(Whatman)) 상에 고정시키고, FP-90 동결백(노스캐롤라이나주 윈스턴세이럼에 소재한 카터 메디컬 리미티드(Charter Medical Ltd.)) 내로 패키징하기 전에 적절한 크기로 절단하였다. 일단 막 단위를 FP-90 동결백에 넣고 동결백을 열 밀봉시키면, 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(아일랜드 갈웨이에 소재한 바이오니케 테오 인베린 코포레이션(Bioniche Teo. Inverin Co.)) 및 5% 인간 혈청 알부민(HSA)(캘리포니아주 웨스트 레이크 빌리지에 소재한 박터)을 함유하는 50mL의 동결보존 용액을 중심 튜빙 라인을 통해 첨가하였다. 임의의 과량의 공기를 제거하고 나서, 후속적으로 튜빙 라인을 밀봉시켰다.
FP-90 동결백을 만거 백(10인치 x 6인치)(펜실베니아 뉴브리튼에 소재한 만거 인더스트리즈(Mangar Industries)) 내로 넣고 나서, 이어서, 열 밀봉시켰다. 만거 백을 패키징 카톤 내에 넣었다(10.5 인치 x 6.5 인치 x 0.6 인치)(뉴욕주 로체스터에 소재한 다이아몬드 패키징(Diamond Packaging)). 스티로폼 용기 내 -80℃±5℃에서 냉동시키기 전에 모든 카톤을 2 내지 8℃에서 30 내지 60분 동안 냉장시켰다.
실시예 4.1 나이트로셀룰로스 종이 상에 고정된 막에 대한 해동 시간.
본 명세서에 기재된 동결보존된 막은 다른 동결보존된 생성물보다 더 빠르게 해동되는 특성을 나타낼 수 있다. 빠른 해동 프로파일은 본 명세서에 기재된 막이 요구 시 용도 및 적용을 위해 효율적으로 그리고 효과적으로 사용되는 것을 가능하게 한다. 하나의 해동 프로토콜을 이하에 논의한다.
초저온 냉동고 (-80℃)로부터 꺼낸 나이트로셀룰로스 종이 상에서 패키징한 2로트의 태반 조직으로부터 2개의 샘플을 취하였다.
실온의 물로 채운 해동 수반 내에 태반 조직을 함유하는 동결백을 넣었다.
관찰가능한 얼음 결정이 남아있지 않을 때 결정한 해동 시간을 기록하였다.
결과
50mL 동결보존 용액을 이용하여 동결보존된 태반막 생성물에 대한 해동 시간.
공여자 해동시간(분)
A 24
B 28
평균 26
해동이 완전하게 되는 동안, 모든 얼음 결정은 사라져야 한다. 다르게는, 얼음의 중량은 막이 찢어지게 하거나 또는 막이 나이트로셀룰로스 종이를 떨어지게 하여 해동이 완료된 때 자기 접힘을 야기할 수 있다. 결과를 상기 표 1에 나타내며, 평균 해동 시건은 26분이고, 따라서 본 명세서에 기재된 동결보존된 막에 대한 "요구 시" 용도 및 적용을 용이하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 5. 융모양막 생성물의 예시적인 제조방법
현재 개시된 제조 절차에 따라 양막 생성물 및 융모막을 포함하는 태반 생성물의 한 가지 제조방법은 다음과 같다:
태반을 생물학적 안전 캐비닛 내에서 처리하였다. 우선 탯줄을 제거하고 나서, 양막에 부착된 융모막을 태반 스커트로부터 절단하였다. 막을 둘 다 인산염 완충 식염수(PBS)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 깁코 인비트로젠(Gibco Invitrogen))로 린스하여 덩어리 혈병 및 임의의 과량의 혈액 세포를 제거한다. 이어서, 막을 식염수(일리노이주 디어필드에 소재한 박터 헬스케어 코포레이션(Baxter Healthcare Corp)) 중의 11% 항응고제 시트르산염 덱스트로스 용액(USP) 화학식 A(ACD-A)(일리노이주 디어필드에 소재한 박터 헬스케어 코포레이션)으로 세척하여 남아있는 혈액 세포를 제거하였다.
이어서, 융모양막을 37℃±2℃에서 24 내지 28시간 동안 DMEM에서 황산 겐타마이신(50㎍/mL)(일리노이주 샴버그에 소재한 아브락시스 파마슈티칼 프로덕츠(Abraxis Pharmaceutical Products)), 반코마이신 HCl(50㎍/mL)(일리노이주 레이크 포레스트에 소재한 호스피라), 및 암포테리신 B(2.5㎍/mL)(미조리주 세인트루이스에 소재한 시그마알드리치(Sigma Aldrich))로 이루어진 항생제 용액 500mL를 지니는 통기 플라스크에서 각각 소독시켰다. 인큐베이션 기간 후에, 막을 PBS로 세척하여 임의의 잔여 항생제 용액을 제거하였다. 융모막의 영양막층을 둔적박리를 이용하여 부드럽게 제거하였다.
막을 옵티트란(Optitran) BA-S 85 강화 나이트로셀룰로스 종이(독일 대셀에 소재한 와트만(Whatman)) 상에 고정시키고, FP-90 동결백(노스캐롤라이나주 윈스턴세이럼에 소재한 카터 메디컬 리미티드(Charter Medical Ltd.)) 내로 패키징하기 전에 적절한 크기로 절단하였다. 일단 막 단위를 FP-90 동결백에 넣고 동결 백을 열 밀봉시키면, 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(아일랜드 갈웨이에 소재한 바이오니케 테오 인베린 코포레이션(Bioniche Teo. Inverin Co.)) 및 5% 인간 혈청 알부민(HSA)(캘리포니아주 웨스트 레이크 빌리지에 소재한 박터)를 함유하는 50mL의 동결보존 용액을 중심 튜빙 라인을 통해 첨가하였다. 임의의 과량의 공기를 제거하고 나서, 후속적으로 튜빙 라인을 밀봉시켰다.
FP-90 동결백을 만거 백(10인치 x 6인치)(펜실베니아 뉴브리튼에 소재한 만거 인더스트리즈(Mangar Industries)) 내로 넣고 나서, 이어서, 열 밀봉시켰다. 만거 백을 패키징 카톤 내에 넣었다(10.5 인치 x 6.5 인치 x 0.6 인치)(뉴욕주 로체스터에 소재한 다이아몬드 패키징(Diamond Packaging)). 스티로폼 용기 내 -80℃±5℃에서 냉동시키기 전에 모든 카톤을 2 내지 8℃에서 30 내지 60분 동안 냉장시켰다.
실시예 6 태반막의 효소 분해 후 세포 수 및 세포 생존도의 정량적 평가
양막 및 융모막 및 (상기로부터의) 본 태반 생성물을 과정 전체적으로 세포 수 및 세포 생존도에 대해 평가하였다. 이들 분석을 (항생제 처리 단계 전) 새로운 태반 조직, 항생제 처리 후 태반 조직 및 해동 후 생성물 단위에 대해 수행하였다. 세포를 효소 분해를 이용하여 태반막으로부터 단리시켰다. 동결보존된 생성물 단위에 대해, FP-90 동결백을 우선 패키징 카톤 및 만거백으로부터 제거하였다. 이어서, FP-90 동결백을 실온의 물욕에서 2 내지 3분 동안 해동시켰다. 초기 실험은 37℃±2℃ 수욕의 사용을 수반하였다. 해동 후, 태반막을 FP-90 동결백으로부터 제거하고 나서, 최소 1분 및 최대 60분 동안 식염수를 함유하는 저장소(일리노이주 디어필드에 소재한 박터 헬스케어 코포레이션) 내에 넣었다. 각각의 막을 분해 전 강화된 나이트로셀룰로스 종이로부터 분리시켰다.
양막을 로커(rocker) 상에서 37℃±2℃로 20 내지 40분 동안 40mL의 0.75% 콜라게나제(뉴저지주 레이크우드에 소재한 워싱턴 바이오케미컬 코포레이션(Worthington Biochemical Corp.)) 용액을 이용하여 분해시켰다. 콜라게나제 분해 후에, 샘플을 2000rpm에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고 나서, 30mL의 0.05% 트립신-EDTA(메릴랜드주 워커스빌에 소재한 론자(Lonza))를 첨가하고 나서, 로커 상에서 37℃±2℃로 추가 5 내지 15분 동안 인큐베이션시켰다. 트립신을 사용전에 수욕에서 37℃±2℃로 가온시켰다. 트립신 분해 후에, 상청액을 100㎛ 세포 스트레이너(strainer) 나일론 필터를 통해 여과시켜 임의의 파편을 제거하였다. 15ml DMEM을 스트레이너를 통해 동일한 원심관 내로 통과시켰다. 2000rpm에서 10분 동안 원심분리를 수행하고 나서, 상청액을 제거하였다. 세포 펠렛을 펠렛 크기와 비례하는 DMEM의 용적을 이용하여 재구성하고 나서, 20μL의 재현탁 세포 현탁액을 계수화를 위해 80μL의 트립신 블루(미조리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 알드리치)와 혼합하였다. 세포 계수 샘플을 혈구계 내에 넣고, 현미경을 이용하여 평가하였다.
융모막을 로커(rocker) 상에서 37℃±2℃로 20 내지 40분 동안 25mL의 0.75% 콜라게나제 용액을 이용하여 분해시켰다. 콜라게나제 분해 후에, 상청액을 100㎛ 세포 스트레이너(strainer) 나일론 필터를 통해 여과시켜 임의의 파편을 제거하였다. 2000rpm에서 10분 동안 원심분리를 수행하고 나서, 상청액을 제거하였다. 세포 펠렛을 펠렛 크기와 비례하는 DMEM의 용적을 이용하여 재구성하고 나서, 20μL의 재현탁 세포 현탁액을 계수화를 위해 80μL의 트립신 블루와 혼합하였다. 세포 계수 샘플을 혈구계 내에 넣고, 현미경을 이용하여 평가하였다.
막의 초기 특성을 결정하기 위한 임의의 가공 전에 태반막을 분석하였다. 표 2는 32개의 태반 로트로부터의 양막 및 융모막에 대한 ㎠ 당 평균 세포 및 세포 생존도 값을 포함한다.
평균적으로, 양막에 대해 ㎠ 당 91,381개의 생존 세포가 있으며 대응하는 평균 세포 생존도는 84.5%였다. 융모막에 대해, ㎠ 당 51,614개의 생존 세포가 있으며, 대응하는 세포 생존도는 86.0%였다.
Figure pct00001
이들 데이터는 본 기술의 특정 실시형태에 의해 유용한 세포 수; 예를 들어, 약 10,000 내지 약 360,000개 세포/㎠를 함유하는 양막을 포함하는 태반 생성물을 예시한다. 양막은 상피세포 및 기질 세포로 이루어지기 때문에, 상피세포 대 기질 세포의 비를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 3개의 태반 로트로부터의 양막을 분석하였다. 우선, 5㎝ x 5㎝ 조각의 양막을 30분 동안 수욕에서 37℃±2℃로 대략 25mL의 0.05% 트립신-EDTA(메릴랜드주 워커스빌에 소재한 론자)를 이용하여 분해시켰다. 인큐베이션 단계 후에, 막으로부터 세포를 부드럽게 스크레이핑함으로써 상피세포를 제거하였다. PBS(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 깁코 인비트로젠)을 이용하여 린스한 후에, 후속적으로 막을 융모막과 동일한 방식으로(상기 기재) 분해시켰다. 추가로, 다른 무결함 5㎝ x 5㎝ 조각의 양막을 표준 절차(상기 기재)를 이용하여 분해시켜 총 세포 수를 결정하였다. 이어서, 기질 세포의 백분율을 상피세포가 제거된 양막으로부터의 세포 수를 무결함 막으로부터의 세포 수로 나눔으로써 결정하였다.
결과는 총 세포의 19%가 기질 세포라는 것을 나타낸다. 따라서, 대략 17,362개의 기질 세포가 대략 74,019개의 상피세포를 지니는 양막 내에 존재한다. 이들 데이터는 양막에 비해 융모막 내 대략 3배 이상의 기질 세포가 있다는 것을 나타내었다. 이 비는 융모막 및 양막을 포함하는 태반 생성물을 제공하는 본 기술의 특정 실시형태와 일치되되, 융모막은 양막에 비해 약 2 내지 4배 더 많은 기질 세포를 포함한다.
㎠ 당 생존 세포 및 세포 생존도를 항생제 처리 단계 후에 평가하였다. 처리 세포 회수를 항생제 처리(본 명세서에 기재한 기법에서 이전에 기재한 바와 같음) 전 및 후의 생존 세포 수와 비교함으로써 계산하였다. 표 3은 이들 분석으로부터의 결과를 제공한다.
Figure pct00002
실시예 7 태반 생성물 동결보존 절차의 개발
동결보존은 조직 및 살아있는 세포의 공급원을 제공하는 방법이다. 동결보존의 주된 목적은 저온 냉동 및 저장 동안 생물학적 물질에 대한 손상을 최소화하는 것이다. 일반적 동결보존 규칙이 모든 세포, 조직 및 기관에 대해 적용가능하지만, 특정 동결보존 용액 및 절차가 생물학적 물질의 각각의 유형에 대해 개발되어야 한다. 본 출원은 태반막으로부터 면역원성 세포를 선택적으로 고갈시키고 치유 촉진을 위한 인자의 주된 공급원인 다른 유리한 세포의 생존도를 보존할 수 있는 태반막 생성물에 대한 동결보존 절차를 개시한다.
태반막에 대한 동결 보존 방법 개발 동안, 본 발명자들은 동결보존 용액의 용적, 냉동 전 조직 평형상태의 효과, 및 냉동 절차를 위한 냉각 속도를 포함하는 동결보존의 중요한 매개변수를 평가하였다.
면역억제의 부재 시 조직 동종이식편의 수용은 조직 내 존재하는 부수체(satellite) 면역 세포의 수에 의존할 것이다. 동결보존은 조직 면역원성을 감소시키기 위해 이용될 수 있는 접근이다. 이 접근은 DMSO의 존재 하에서 냉동 손상에 대한 상이한 세포 유형의 차별적인 감수성에 기반하며; 백혈구는 빠른 냉각 속도에 민감하다. 냉동 속도 1℃/분은 면역 세포를 포함하는 세포 및 조직에 대해 최적으로 고려된다. 빠른 냉동 속도, 예컨대 60 내지 100℃/분은 면역 세포를 제거한다. 그러나, 이런 유형의 절차는 본 기술에 따른 보존에 대해 바람직한 다른 조직 세포에 대해 유해하다. 개발된 동결보존 절차는 10% DMSO를 함유하는 동결보존 매질을 이용하는데, 이는 물이 저온에서 결정을 형성할 때 세포를 파괴로부터 보호하는 중요한 성분이다. 동결보존의 제2 단계는 동결보존 매질 중의 태반막의 완전한 평형상태였으며, 이는 30 내지 60분 동안 4℃에서 동결보존 매질 중의 막의 침지에 의해 달성된다. 이 단계는 DMSO가 태반 조직을 침투하게 한다. 일부 데이터는 냉동 전 조직 평형상태가 림프구의 생존에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타내지만(예를 들어, 문헌[Taylor & Bank, Cryobiology, 1988, 25:1]); 그러나, 이 데이터는 조직 평형상태 후조차 대식세포의 실질적인 수가 생존한다는 것을 나타낸다.
예상치 못하게 약 2℃ 내지 약 8C에서 DMSO-함유 용액 중의 30 내지 60분 태반막 평형상태는, 이들 유형의 세포가 약 1℃/분의 속도에서조차 냉동을 견뎌낼 수 없도록, 냉동에 대해 대식세포와 같은 면역세포의 민감성을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
막 생성물의 잠재적 동결보존 조건의 온도 프로파일을 분석하기 위해 온도 맵핑 실험을 수행하였다. 이들 결과를 도 1에 도시한다. 여덟(8)개의 FP-90 동결백을 20mL 또는 50mL의 동결보존 용액으로 채우고 나서, 온도 프로브를 각각의 동결백 내부에 넣었다. 매개변수의 제1 세트(각각 도 1a 내지 도 1d의 조건 1 내지 4)를 냉동(-80℃ ± 5℃) 전 30분 냉장(2 내지 8℃) 단계를 수반하였다. 추가로, 분석은 스티로폼 용기 내에서 또는 냉동고 저장에서의 동결백 냉동을 수반하였다. 매개변수의 제2 세트(각각 도 1e 내지 도 1h의 조건 5 내지 8)는 스티로폼 용기 내에서 또는 냉동고 저장에서 동결백의 직접적 냉동(-80℃±5℃)을 수반하였다. 결과는 조건 6 및 조건 2가 대부분의 점진적인 온도 감소를 나타내었다는 것을 나타내었다. 점진적 온도 감소는 전형적으로 세포 생존도를 보존하기 위해 요망된다. 조건 6과 조건 2 사이의 차이는 조건 2가 30분 냉장 단계를 포함하였다는 것이다. 따라서, 냉동 시 잠열 진행의 경우, 온도는 냉동의 시작으로부터 -4℃까지의 감소를 추가로 시험하였다. 조건 6에 대해, 이 기간 동안 냉각 속도는 대략 -1℃/분이었다. 조건 2에 대한 냉각 속도는 동일한 시간틀 동안 대략 -0.4℃/분이었다. 따라서, 더 느린 냉각 속도가 최적의 세포 생존도를 유지하기 위해 일반적으로 요망되기 때문에, 조건 2를 비제한적 동결보존 과정 내로의 혼입을 위해 선택하였다.
도 2a는 처리(동결보존) 양막에 대한 세포 회수에 대한 동결보존 용액 용적의 효과를 도시한다. 도 2b는 양막에 대한 세포 생존도에 대한 동결보존 용액의 효과를 도시한다.
처리(동결보존) 세포 회수를 동결보존(본 명세서에서 이전에 기재한 바와 같음) 전 및 후의 생존 세포 수와 비교함으로써 계산하였다. 본 의도는 최대 세포 회수를 제공하는 동결보존 조건을 동정하는 것이었다. 그러나, 이용된 분석(트립신 블루 제외)은 태반의 상이한 부분으로부터 조직 샘플을 취하는 것을 필요로 하며, 각각의 조직 샘플이 상이한 세포 수를 함유하기 때문에, 정확한 세포 회수 측정을 얻는 것은 불가능하다. 이는 본 발명자들이 접한 큰 범위의 처리 세포 회수(10% 내지 410%)를 설명한다. 반면에, 세포 생존도는 살아있는 세포 수를 조직의 동일한 조각 내 총 세포 수와 비교함으로써 계산하였다. 따라서, 세포 생존도를 사용하여 동결보존 절차의 매개변수를 최적화하였다.
도 2b에 도시한 바와 같이, 50mL 용적의 동결보존 용액 용적은 5x5 태반막에 대한 10mL 및 20mL에 비교하여 동일한 세포 회수를 제공하였다. 이들 데이터는 10mL 동결보존 매질 용적이 본 기술에 따라 세포 생존도가 70% 초과인 태반 생성물을 제공하는데 충분하다는 것을 나타낸다. 도 3A 및 도 3B에 의해 알 수 있는 바와 같이 동일한 결과를 융모막에 대해 얻었다.
동결보존 방법이 무결함 융모양막의 보존에 적용될 수 있었는지의 여부를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 융모양막을 새로운 태반으로부터 절단하였고, 항생제 중에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서, 영양막층을 제거하고 나서, 막을 2cm x 2cm 조각으로 절단하였다. 두 막이 무결함으로 남아있도록 전체 과정 내내 관리하였다. 새로운 그리고 동결보존된 태반막을 제조하고 나서, 세포 생존도를 측정하기 위한 표색 분석인 MTT 분석(바이오티움(Biotium) 30006)을 이용하여 세포 생존도를 측정하였다. 분석 메커니즘은 가용성 테트라졸륨염의 청색 포마잔 침전으로의 대사 환원이 무결함 미토콘드리아 기능을 지니는 생존 세포의 존재에 의존한다는 사실에 기반한다. 샘플을 MTT 분석 매질 중에서 3 내지 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 전환 기간의 마지막에, 샘플을 DMSO 중에서 1시간 동안 37℃에서 추출하였다. 추출 기간의 마지막에, 0.2mL의 각각의 추출물을 96-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 세포 생존도에 비례하는 흡수성을 블랭크로서 DMSO 추출 완충제를 이용하여 570㎚에서 플레이트 판독기(스펙트라맥스(Spectramax) 340PC, 몰레큘러 디바이스(Molecular Devices)) 상에서 흡수하였다. 도 4는 새로운 그리고 해동된 동결보존된 샘플로부터 얻은 MTT 값을 나타낸다. 데이터로부터 나타낸 바와 같이, 세포 생존도는 새로운 동결보존 융모양막 샘플과 해동 후 동결보존 융모양막 샘플 사이에 상당한 차이를 나타내지 않았다.
동결보존 처리 후 세포 회수를 최대화하는 상이한 잠재적 냉동 조건을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 도 5A(양막) 및 도 5B(융모막)은 융모막에 대한 처리(동결보존) 세포 회수에 대해 냉장시간 및 냉동매개변수의 효과를 나타내는 이들 결과를 도시한다. 3개의 조건을 분석하였다. 이들 조건은 온도 맵핑 연구와 관련되었다. 제1 조건은 냉동고 내에서 저장 시 생성물 단위를 직접적으로 냉동시키는 단계를 수반하였다(-80℃±5℃). 제2 조건은 또한 직접 냉동을 포함하였지만, 생성물 단위는 냉동기 내의 스티로폼 용기에 넣는다. 제3 조건은 냉동 단계 30분 전의 냉장(2℃ 내지 8℃) 기간을 포함하였다. 양막에 대해, 3개의 태반 로트를 평가하였다. 두(2)개의 태반 로트를 융모막에 대해 분석하였다. 결과는 제3 조건이 막 유형 둘 다에 대해 최적이라는 것을 나타내었다.
양막의 세포 생존도에 대한 냉장 시간 및 냉동 매개변수의 효과를 또한 시험하였다. 흡광도가 세포 생존도에 비례하는 경우 상기 기재한 MTT 분석을 이용하여 세포 생존도를 측정하였다. 4가지 온도 평형상태 시간을 시험하였다: 직접 냉동(0 hr), 1시간 또는 4시간 동안의 냉장고(4℃) 내 평형상태 및 4시간 동안 실온에서의 평형상태. 각각의 조건에 대해, 냉동고 저장 시 또는 스티로폼 박스에서 직접적으로 생성물을 냉동시키는 것을 또한 시험하였다. 도 6은 연구 결과를 도시하며, 양막을 4℃에서 1시간까지 동안 저장하고, 이어서, 스티로폼 박스 내에서 냉동시켰을 때, 가장 높은 세포 생존도가 얻어진다는 것을 나타낸다. 이 조건은 가장 크게 처리된 세포 회수 및 세포 생존도를 제공함에 따라 추가 개발을 위해 선택하였다.
양막 및 융모막에 대해 평가한 모든 동결보존 매개변수를 표 4 및 표 5에 요약한다.
이들 실험으로부터의 세포 생존도의 평가는 제조 과정에 대한 최종 매개변수의 선택을 초래하였다. 추가로, 모든 평균 세포 생존도 값은 70% 이상이었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
이들 데이터는 약 40,000 내지 약 90,000 또는 내지 약 260,000개 세포/㎠을 함유하는 양막을 포함하는 태반 생성물 막을 제공하는 본 기술의 특정 실시형태와 일치된다.
실시예 8. 최종 융모막 조성물의 안정성 시험
본 기술의 하나의 독특한 양상은 동결보존 방법이 장기간의 시간 동안 세포 생존도를 보존할 수 있다는 것이다. 세포 생존도가 저장 2년 후 유지되는지의 여부를 결정하기 위해, 융모막을 처리하고(예를 들어, 민싱, 선택적으로 분해) 동결건조시켰다.
동결건조 처리된 융모막 조성물의 안정성을 시험하여 -80℃에서 24개월의 장기간 저장동안 가능한 생성물 분해를 평가하였다. 생성물 분해 지표는 감소된 수의 생존 세포 및 감소된 세포 생존도이다. 초기 냉동 완료 후 그리고 태반 생성물의 3개 로트에 대한 냉동 후 24개월 에 생존 세포의 수 및 세포 생존도를 결정하였다. 추가로, 멸균 시험을 냉동 후 12개월 및 24개월에 수행하였다.
융모막이 시트로서 패키징하지 않고, 대신에 민싱한 것을 제외하고, 3개의 태반을 실시예 2에 기재한 절차에 따라 별도로 처리하고, 붕규산 유리 바이알에 패키징하며, -80℃에서 식염수 중의 5% DMSO 중에서 냉동시켰다. 각각 3개 로트의 태반 조성물을 초기 냉동 완료 후 그리고 냉동 후 24개월에 직접 해동시키고, 혈구계산판 및 트립판 블루 염색을 이용하여 생존 및 사멸 세포를 계수화하였다. 각각의 샘플에 대해 세포 생존도를 계산하였다. 결과를 표 6에서 나타낸다.
최종 조성물은 -80℃에서 저장 24시간 후 분해가 최소 내지 전혀 없음을 나타내었다. 초기 동결보존 2년 후에, 모든 로트는 mL 당 100,000개 초과의 생존 세포를 여전히 함유하였고, 세포 생존도는 적어도 70%였다.
Figure pct00007
각각의 로트의 샘플을 또한 냉동 후 2회의 상이한 시점에 멸균에 대해 시험하였다(12개월 및 24). 시험을 승인 시험 시설에 의해 수행하였다. 모든 샘플은 음성을 시험하였다(표 7).
냉동 후 상이한 시점에 최종 생성물에 대한 멸균 결과
로트 수 12개월 24개월
로트 1 음성 음성
로트 2 음성 음성
로트 3 음성 음성
실시예 9 조직 염색에 의한 세포 생존도의 정량적 평가
양막 및 융모막을 라이브/대드(LIVE/DEAD)(등록상표) 생존도/세포독성 키트(오리건주 유진에 소재한 몰레큘러 프로브 인코포레이티드(Molecular Probes Inc.))를 이용하여 염색하여 세포 생존도를 정량적으로 평가하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 염색을 수행하였다. 대략 0.5㎝ x 0.5㎝의 막 세그먼트를 사용하였다. 형광현미경을 이용하여 염색막의 평가를 수행하였다. 강하고 균일한 녹색 형광은 살아있는 세포의 존재를 나타내었고, 밝은 적색광은 사멸 세포의 존재를 나타내었다. 새로운 양막 및 융모막뿐만 아니라 동결보존된 양막 및 융모막의 이미지는 제조 과정이 해동 후 막의 표현형 특징을 변경시키지 않았다는 것을 입증하였다.
도 7은 새로운 양막의 상피층(A), 동결보존된 양막의 상피층(B), 새로운 양막의 기질층(C), 동결보존된 양막의 기질층(D), 새로운 융모막(E) 및 동결보존된 융모막(F)의 대표적인 이미지를 포함한다. 살아있는 세포는 녹색이며, 사멸 세포는 적색이다. 이들 이미지는 제조과정이 막의 표현형 특징 및 해동 후 막 내의 생존 세포 유형(상피 및 기질 세포)의 비율을 변경시키지 않았다는 것을 입증하였다.
실시예 10 예시적인 제조과정은 태반막으로부터 면역원성 요소를 제거한다
인간 양막 및 융모막의 하나의 독특한 특징은 태아순환으로부터 백혈구의 이동을 방지하는 태아 혈관의 부재이다. 태아측에서, 융모양막 중배엽 층 내에 존재하는 대식세포는 면역 세포의 집단만을 나타낸다. 따라서, 양막 및 융모막 내 존재하는 태아 대식세포는 조직 면역원성의 주된 공급원이다. 그러나, 양막 내 대식세포의 수는 융모막보다 상당히 더 낮으며(Magatti et al, Stem Cells, 2008, 26: 182), 이는 양막의 낮은 면역원성 및 공여자와 수용자 사이의 매칭 없이 HLA를 가로지르는 그의 능력을 설명한다(Akle et al, Lancet, 1981, 8254:1003; Ucakhan et al., Cornea, 2002, 21:169). 대조적으로, 융모막은 면역원성이 고려된다. 결막 결함의 복원성형을 위해 양막을 융모막과 함께 사용하는 연구에서, 성공률은 낮았다(De Roth Arch Ophthalmol, 1940, 23: 522). 이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 다른 면역원성 세포 유형 중에서 모 영양막 및 CD14+ 태아 대식세포의 태반막으로부터의 제거는 시험관내 림프구의 활성화를 방지한다는 것을 믿는다. 모 영양막의 제거는 직접적 세정에 의해 달성될 수 있는 반면, 이 기법에 기재된 동결보존 처리는 CD14+ 세포를 제거한다.
면역원성 시험을 사용하여 안전한 임상 치료로서 태반 생성물 막을 특성규명하였다. 2가지 생체분석(혼합 림프구 반응(MLR) 및 지질다당류(LPS)-유도 종양 괴사 인자(TNF)-α 분비)를 사용하여 상이한 제조 단계에서 태반 생성물의 면역원성을 시험하였다.
실시예 10.1 혼합 림프구 반응(MLR)
MLR은 세포 및 조직 면역원성을 시험하기 위해 널리 사용되는 시험관내 분석 유형이다. 분석은 실험 조직 배양 플레이트의 웰 내에서 함께 혼합할 때 다른 개체로부터 유래된 동종이계 세포 및 조직(자극제)의 표면 상에서 발현된 동종이계 인간 백혈구 항원(HLA) 및 다른 항원 분자를 인식하는 한 개체로부터 유래된 면역 세포(반응자)의 능력에 기반한다. 동종이계 세포 및 조직에 의한 자극에 대한 면역 세포의 반응을 다양한 방법, 예컨대 특정 사이토카인(예를 들어, 인터류킨(IL-2)의 분비, 특정 수용체(예를 들어, IL-2R)의 발현 또는 세포 증식을 이용하여 측정할 수 있으며, 이들 모두는 활성화된 면역 세포의 특징이다.
현재 개시된 제조 과정의 상이한 단계들을 나타내는 태반 조직 샘플을 면역원성 시험을 위해 사용하였다. 이들 샘플은 출발 물질로서 융모 영양막(ACT)을 지니는 양막을 포함하였고, 분리된 융모 영양막(CT), 융모막(CM), 영양막(T), 양막(AM), 및 양막과 융모막(A/C) 둘 다를 정제하고 동결보존된(최종 생성물) 조직을 시험하였다.
MLR 분석을 위해, 태반 조직으로부터의 세포를 280U/mL의 II형 콜라게나제(워싱턴(Worthington), 카탈로그 번호 4202)를 이용하여 단리시켰다. 조직을 60 내지 90분 동안 37℃±2℃에서 효소를 이용하여 처리하고 나서, 얻어진 세포 현탁액을 100㎛ 필터를 통해 여과시켜 조직 파편을 제거하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 베크만(Beckman), TJ-6을 이용하여 2000rpm에서 10분 동안 원심분리시키고, DPBS를 이용하여 2회 세척하였다. 각각의 세척 후에 상청액을 폐기하고, 세포를 2mL의 DMEM(인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 번호 11885) 중에서 재현탁시키고 나서, 트립판 블루 염료(인비트로젠, 카탈로그 번호 15250-061)의 존재 하에 세포를 계수화함으로써 세포 수 및 세포 생존도에 대해 평가하였다. 태반 유래 세포를 5% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충한 DMEM 중의 24-웰 배양 플레이트 내 1:5의 비로 동종이계 hPBMC와 혼합하고 나서, 37℃±2℃에서 5% CO2, 95% 습도를 함유하는 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(hPBMC)를 단독으로 음성 대조군으로서 사용하였고, 2명의 상이한 공여자로부터 유래된 hPBMC의 2개 세트의 혼합물을 양성 MLR 대조군으로서 사용하였다. 4일의 인큐베이션 후에, 세포를 웰로부터 수집하고, 프로테아제 저해제 칵테일(로슈(Roche), 카탈로그 번호 11836153001)로 보충한 용해 완충제(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 C2978)를 이용하여 용해시키고 나서, IL-2Rα를 제조업자의 프로토콜에 따라 IL-2Rα ELISA 키트(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 번호 SR2A00)를 이용하여 세포 용해물 중에서 측정하였다.
IL-2Rα 수준은 동종이계 세포에 의해 발현된 면역원성 분자에 반응하는 T 세포의 활성화 측정이다. 도 8 및 도 9에 제시된 결과는 최종 생성물의 낮은 면역원성을 야기하는 태반막의 제조방법을 입증한다.
도 8은 제조과정이 태반 생성물의 면역원성을 연속적으로 감소시킨다는 것을 입증한다. 제조과정의 상이한 단계를 나타내는 샘플을 hPBMC와 함께 4일 동안 공동배양시켰다. IL-2Rα를 T-세포 활성화의 마커로서 세포 용해물 중에서 측정하였다. 음성 대조군은 면역 세포 활성화의 기저 수준을 나타낸다: 하나의 공여자로부터 유래된 PBMC를 단독으로 배양시켰다. 양성 대조군: 2명의 상이한 공여자로부터 유래된 PBMC의 혼합물.
도 9는 동결보존 시 면역원성의 상당한 감소에 의해 입증되는 바와 같이 면역원성의 선택적 고갈이 본 태반 생성물을 생성하는 본 동결보존 과정으로부터 초래된다는 것을 입증한다.
실시예 10.2 태반막 세포에 의한 LPS-유도 TNF-α 분비
본 명세서에 기재된 바와 같이, 양막 및 융모막 내 존재하는 태아 대식세포는 조직 면역원성의 주된 공급원이다. 이론에 의해 구속되는 일 없이,본 발명자들은 태반막으로부터 CD14+ 태아 대식세포가 림프구의 활성화를 방지하고, 염증 사이토카인 분비 및 조직 면역원성 수준을 감소시킨다는 것을 믿는다. 태아 태반막 내 대식세포는 TNF-α와 같은 염증 사이토카인의 분비에 의한 박테리아 LPS에 반응한다. 따라서, LPS에 반응하는 TNF-α의 분비는 각각의 중요한 제조 단계에서 태반막의 조직 면역원성을 특성규명하기 위해 본 명세서에서 사용한다. 각각의 제조 단계로부터의 샘플은 영양막(T), 양막과 융모 영양막(ACT), 융모 영양막(CT), 융모막(CM), 및 양막(AM)을 포함하였다.
중간물 및 최종 생성물을 나타내는 태반막 조각(2㎝ x 2cm)을 조직 배양 배지에 넣었고, 20 내지 24시간 동안 박테리아 LPS(1㎍/mL)에 노출시켰다. 이어서, 조직 배양 상청액을 수집하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 TNF-α ELISA 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 TNF-α의 존재에 대해 시험하였다. 고수준의 TNF-α의 분비에 의해 LPS에 반응하는 단핵구를 함유하는 것으로 알려진 인간 hPBMC(세라케어(SeraCare))를 양성 대조군으로서 사용하였다. LPS 없이 hPBMC 및 태반 조직을 분석에서 대조군으로서 포함시켰다. 이 분석에서, 자발적 그리고 LPS-유도 TNF-α 분비 둘 다에 대해 약 70pg/㎠(280pg/mL에 대응) 초과의 배양 배지에서 검출된 TNF-α를 면역원성으로 고려하였다(문헌[Fortunato, et al.1996] 참조).
도 10A 및 도 10B에 도시한 바와 같이, 제조과정은 태반 생성물의 면역원성을 연속적으로 감소시킨다. AM 및 CM은 1397.1 및 917.2pg/ml에서 각각 ACT 및 CT에 비교하여 23.5 및 40pg/ml TNF-α 분비만을 가졌다. LPS가 없는 배지에서 배양시킨 조직은 TNF-α 분비의 기저 수준을 나타낸다. 고수준의 TNF를 분비하는 것으로 알려진 PBMC를 양성 대조군으로서 사용하였다.
융모영양막(CT)은 무결함 영양막과 함께 융모막을 포함한다. 고수준의 TNF-α를 분비한 CT 막을 2명의 상이한 PBMC 공여자에 대해 MLR에서 시험하였다(도 11). CT 세포를 4일 동안 PBMC와 함께 배양시켰다. IL-2Rα를 T-세포 활성화의 마커로서 세포 용해물 중에서 측정하였다. 양성 대조군: 2명의 상이한 공여자로부터 유래된 PBMC의 혼합물. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이 이 분석 결과는 MLR 데이터와의 상관관계를 나타내었다: LPS에 반응하여 고수준의 TNF-α를 생성하는 조직은 MLR 분석에서 면역원성이다.
결론적으로, 저수준의 TNF-α 및 AM 및 CM에 의한 LPS에 대한 반응의 부재는 본 기법에 기재한 예시적인 동결보존 방법이 양막 및 융모막으로부터 생존가능한 기능성 대식세포를 제거한다는 것을 나타내는데, 이는 이러한 동종이계 생성물의 안전성을 보장한다는 것을 나타낸다.
태반막 내에 존재하는 세포의 특성규명
실시예 11 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 태반 세포의 분석
양막 및 융모막의 세포 조성물을 아는 것은 상처 치유 및 면역원성에서 잠재적 기능성 역할의 철저한 이해를 연구하는데 중요하다. 이전의 보고는 양막과 융모막이 둘 다 다중 세포 유형을 함유한다는 것을 입증하였다. 양막과 융모막 둘 다에 대해 동정한 기질 세포에 추가로, 양막은 또한 상피세포를 함유한다. 양막 또는 융모막 중 하나 내에 태아 혈관이 없지만, 막은 둘 다 상주하는 태아 대식세포를 포함한다. 모체 혈액 순환 및 탈락막에 대한 근접성은 면역원성 세포(모 백혈구 및 영양막 세포)의 잠재적 공급원을 제공하며, 따라서 면역원성의 잠재적 공급원이다. 양막 및 융모막의 세포 조성물을 조사하기 위해, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 수행하였다. 데이터는 양막에 대한 태아 상피 세포 및 섬유아세포, 및 융모막에 대한 기질 세포에 추가로 기질 세포의 존재를 입증하였다. 현재 개시된 태반 조성물의 한 가지 독특한 특징은 (상피세포 및 섬유아세포에 추가로) 상처 치유에 중요한 3가지 세포 유형 중 하나가 되는 것으로 나타난 MSC의 존재이다.
실시예 11.1 FACS 절차: 단일 세포 현탁액 제조
정제된 양막 및 융모막을 FACS를 통한 세포 표현형 분석을 위해 사용하였다. 양막 및 융모막으로부터의 세포를 280U/mL 콜라게나제 II형(워싱턴, 카탈로그 번호 4202)을 이용하여 단리시켰다. 조직을 60 내지 90분 동안 37℃±2℃에서 효소를 이용하여 처리하고 나서, 얻어진 세포 현탁액을 100㎛ 필터를 통해 여과시켜 조직 파편을 제거하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 베크만(Beckman), TJ-6을 이용하여 2000rpm에서 10분 동안 원심분리시키고, DPBS를 이용하여 2회 세척하였다. 상청액을 각각의 세척 후 폐기하고 나서, 세포를 2mL의 FACS 염색 완충제(DPBS + 0.09% NaN3 +1% FBS) 중에서 재현탁시켰다.
실시예 11.2 특정 세포 마커에 대한 면역표지 세포
일단 단일 세포 현탁액을 실시예 11.1에 따라 제조하면, 100μL의 FACS 염색 완충제 중의 최소 1x105개 세포를 형광염료로 표지한 항체로 처리하였다. 표 8은 사용한 항체의 설명을 제공한다. 세포 표면 마커에 대해, 세포를 암실 실온에서 30분 동안 항체와 함께 인큐베이션시킨 후, 베크만(Beckman) TJ-6 원심분리를 이용하여 5분 동안 1300rpm에서 원심분리에 의해 FACS 염색 완충제를 이용하여 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 400μL의 FACS 염색 완충제 중에서 재현탁시키고 나서, BD FACS칼리버(BD FACSCalibur) 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 세포 생존도를 평가하기 위해, 10μL의 7-AAD(7-아미노-악티노마이신 D) 시약(BD, 카탈로그 번호 559925)을 초기 FACS 분석 직후에 첨가하고 다시 분석하였다. 세포내 염색을 위해, 세포를 침투시키고, 제조업자의 권고(BD 사이토픽스/사이토펌(BD Cytofix/Cytoperm), 카탈로그 번호 554714)에 따라 표지하고 나서, BD FACS칼리버 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 12 태반 세포의 표현형 분석
양막과 융모막 둘 다의 단일 세포 현탁액의 FACS 분석은 막이 둘 다 MSC의 존재와 연루된 간충직 줄기 세포에 특이적인 세포 발현 마커, 예컨대 CD105 및 CD166(표 8에 언급)을 함유한다는 것을 입증한다. 추가로, CD14를 발현시키는 매우 소수의 태반 대식세포를 검출하였다. CD14+ 태반 대식세포 상에서 더 발현될 가능성이 있는 일부 면역원성 마커를 검출하였지만, 이들 마커 범위는 매우 넓다. 이들 범위를 다음에 의해 설명할 수 있다: 1) 태반 공여체 사이의 세포 수의 높은 가변성; 및 2) 세포 현탁액 중의 높은 그리고 가변적인 세포 및 조직 파편의 존재를 포함하는 기술적 문제. 파편을 개폐할 수 있지만, 크기가 세포와 비슷한 파편 입자는 각각의 시험 마커에 대해 계산한 %의 정확성에 영향을 미칠 것이다. 추가로, 표 10은 합류(계대 0 세포)까지 37℃±2℃에서 DMEM 중의 10% FMS 중에서 배양시킨 양막 및 융모막으로부터 단리시킨 세포의 FACS 분석을 제공한다.
이들 데이터는 양막 및 융모막으로부터 유래된 세포가 배양 후 MSC와 유사한 표현형을 보유한다는 것을 입증하였다. 결론적으로, 태반 조직 내 기질 세포의 존재를 FACS 분석에 의해 확인하였다.
이들 데이터는 MSC를 함유하는 양막을 포함하는 태반 생성물을 제공하는 본 기술의 특정 실시형태와 일치된다.
선택적 CD 마커에 기반한 태반막의 세포 조성물의 특성규명.
마커 양막(범위%) 융모막(범위%)
MSC 마커 CD105
CD166		 72.1-88.2
17.3-58.0		 6.4-78.5
4.8-51.5
조혈세포 마커 CD14
CD45		 6.93-10.5
4.4-9.9		 0.9-6.1
4.6-14.7
면역 공-
자극 인자 		HLA-DR
CD86
CD40		 0-5.6
24.3-49.6
7.0-68.7		 0-14.7
4.9-22.5
2-5.8
영양막 마커 사이토케라틴-7 1.36-4.66 2.71-23.07
태반 로트 D16으로부터 배양 세포(계대 0)의 FACS 분석.
세포 표면 마커 양막(%) 융모막(%)
CD45 2.18 0.53
CD166 92.77 82.62
CD105 83.02 86.73
CD49a 92.28 92.26
CD73 89.57 94.57
CD41a -0.03 -0.05
CD34 -0.23 -0.25
HLA-DR -0.23 -0.19
CD19 -0.19 -0.22
CD14 -0.25 -0.27
CD90 99.12 98.00
실시예 13 태반 생성물로부터 유래된 세포의 접착.
특정 세포 마커의 존재에 추가로, 그것이 정상 배양 조건 하에서 접착 특성을 나타내고 섬유아세포 유사 형태를 가진다면 MSC로서 분류할 수 있다. 세포를 본 기술에 기재한 바와 같은 양막 및 융모막으로부터 단리시키고, MSC 배지에 플레이팅 하고 나서, 그들이 합류에 도달될 때까지 37℃±2℃에서 배양시켰다. 이어서, 스틱 배양 접시에 접착되는 그들의 능력을 평가하였다.
도 12는 양막(도 12a) 및 융모막(도 12b)으로부터 단리 및 배양한 세포의 플라스틱 접착을 입증하는데, 이는 인간 골수 흡입물로부터 단리 및 확장된 MSC와 유사하다(도 12c). 이들 데이터는 양막 및 융모막으로부터 유래된 세포가 MSC와 유사한 표현형을 보유한다는 것을 나타낸다.
추가로, MSC는 또한 상이한 결합조직 유형으로 분화되는 그들의 능력에 의해 나타낸다. 따라서, 골형성 분화를 겪는 태반 유래 세포의 능력을 시험하였다. 태반 세포를 단리시키고 나서, 그들이 합류에 도달될 때까지 37℃±2℃에서 배양시켰다. 이어서, 골형성 배지를 배양물에 첨가하고 나서, 알칼리 포스파타제의 발현을 측정하였다. 알칼리 포스파타제는 뼈의 무기염화에 수반된 효소이며, 잘 알려진 골형성 마커이다. 도 12d는 몇몇 세포를 알칼리 포스파타제 발현을 나타내는 보라색 염료를 이용하여 염색한다는 것을 나타낸다. 이는 태반막 내 존재하는 MSC가 그들의 분화 가능성을 보유한다는 것을 입증한다.
치료 인자
실시예 14 동결보존은 태반막에서 치료인자 수준을 손상시키지 않는다
본 발명자들은 동결보존 처리가 상처 치유에 중요한 성장인자 수준에 영향을 미치는지의 여부를 처음 연구하였다. 혈관 내피성장인자(VEGF)를 선택하였는데, 그것이 신생혈관생성을 촉진시키는데 중요하기 때문이다. VEGF을 8M 구아니딘 염산염(GuHCl) 용액, 비드 균질기, 및 24 시간 동안 GuHCl 용액과 함께 인큐베이션을 이용하여 추출하였다. 새로운 양막 및 동결보존된 양막 생성물(본 기술에 의해 기재한 바와 같음)로부터의 VEGF 발현을 제조업자의 프로토콜에 따라 효소-결합 면역흡착분석(ELISA)을 이용하여 측정하였다. 도 13의 결과는 본 기술에 기재한 절차를 이용하여 막을 동결보존함으로써, 새로운 막에 비해 성장인자 발현의 상실이 없다는 것을 나타낸다.
실시예 15 치료 인자 분석
양막 및 융모막의 단백질 프로파일을 서치라이트 멀티플렉스(SearchLight Multiplex) 화학발광 어레이 또는 ELISA를 이용하여 연구하였다. 조직막 추출물 내의 그리고 배양 배지 내 조직에 의해 분비되는 단백질의 존재를 연구하였다. 시험은 상처 치유에 중요한 단백질 분석으로 이루어졌다. 동정한 단백질 목록을 표 11에 기재한다.
Figure pct00010
실시예 15.1 치료 인자 프로파일링을 위한 양막 및 융모막 샘플의 제조
양막 및 융모막을 단리시키고, 본 명세서에서 실시예 1 및 2에서 개시한 제조 프로토콜에 따라 -80℃±5℃에서 패키징하였다. 이어서 패키징한 막을 37℃±2℃ 수욕에서 해동시키고 나서, DPBS로 3회 세척하였다. 막을 8㎠ 조각으로 절단하였다. 조직 용해물 샘플에 대해, 막의 하나의 8㎠ 조각을 액화 질소 중에서 순간 냉동시키고, 막자사발을 이용하여 분쇄하였다. 분쇄한 조직을 1.5mL 마이크로원심분리관에 옮기고 나서, 프로테아제 저해제(로슈, 카탈로그 번호 11836153001)와 함께 500μL의 용해 완충제(세포 신호전달 기법, 카탈로그 번호 9803)를 첨가하고 나서, 빈번하게 교반시키면서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 조직 용해물을 16000g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 수집하고 나서, 오숀 바이오시스템즈(Aushon Biosystems)에 의한 단백질 어레이 분석을 위해 보냈다. 상청액 샘플에 대해, 막의 1개의 8㎠ 조각을 12-웰 접시의 웰에 플레이팅하고 나서, 2mL의 DMEM +1% HSA+ 항생제/항진균제를 첨가하고 나서, 37℃±2℃에서 3, 7 또는 14일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 조직 및 배양 배지를 15mL 원심관에 옮기고 나서, 2000rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 배양 상청액을 수집하고 나서, 오숀 바이오시스템즈에 의한 단백질 어레이 분석을 위해 보냈다.
실시예 15.2 조직 용해물 중에 존재하는 치료 인자
태반 생성물 용해물을 조직 수복에 중요한 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 표 12는 본 기술의 예시적인 태반 조직 생성물의 용해물의 생화학적 프로파일을 도시한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 15.3 14일의 기간에 걸친 치료 인자의 지속적 방출
본 기술의 태반 생성물은 또한 상처 치유 치료에 바람직한 지속적 효과를 입증한다. 세포외 기질 및 본 명세서에 기재된 양막 내의 생존 세포의 존재는 적어도 14일 동안 제공될 상처 치유에 중요한 것으로 알려진 단백질의 칵테일을 허용한다. 양막을 해동시키고, 조직 배양 웰 상에 플레이팅하고 나서, 37℃±2℃에서 3, 7 및 14일 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 시점에, 배양 상청액 샘플을 수집하고 나서, 실시예 15.1에 기재한 바와 같은 단백질 어레이 분석을 통해 측정하였다. 표 13은 단백질 어레이 분석을 통해 측정한 바와 같이 3, 7 및 14일에 양막 로트의 조직 배양 상청액 중의 다양한 선택 인자 수준을 설명한다.
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 15.4 양막 내 인터페론 2α(IFN-2α) 및 형질전환 성장 인자-β3 (TGF-β3)의 존재
인터페론-α 및 TGF-β3은 다양한 조직에서 섬유증을 감소시키는 것으로 알려진 사이토카인/성장인자이다. 임상적으로, IFN-2α 및 TGF-β3은 흉터 및 구축 형성의 방지에 의해 상처 치유를 조절하는 것으로 시사되었다(Ishida, Kondo et al. 2004; Ferguson, Duncan et al. 2009). IFN-2α는 섬유아세포 증식을 저해하고, 콜라겐 및 피브로넥틴 합성 및 섬유아세포-매개 상처 구축을 감소시키는 역할을 할 수 있다(Wang, Crowston et al. 2007). 임상적으로, IFN-2α는 피하로 투여되고 흉터질을 개선시키는 것으로 나타났다(Nedelec et al, Lab Clin Med 1995, 126:474). TGF-β3은 세포외 기질의 침착을 조절하고, 설치류 경피 상처 모델에서 주사할 때 흉터 형성을 감소시키는 것으로 나타났다. 임상적으로, TGF-β3은 상처 부위에 주사할 때 흉터 외괸을 개선시키는 것으로 나타났다(Occleston et al., J Biomater Sci Polym Ed 2008, 19:1047). TGF-β3은 섬유아세포-근섬유아세포 분화를 조절하고, 전섬유화(profibrotic) 유전자 전사를 제한하는 TGF-β1 길항제로서 작용한다(Chang, Kishimoto et al. 2014).
본 기술에 기재된 태반 생성물을 IFN-2α 및 TGF-β3의 존재에 대해 분석하였다. 간략하게, 해동 후에, 막을 균질화시키고, 16,000g에서 원심분리시켜 얻어진 상청액을 수집한다. 상청액을 맙테크(MabTech)(IFN-2α) 및 알앤디 시스템즈(TGF-β3)로부터의 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트 상에서 분석하였다. 도 14는 양막(a) 및 융모막(b 및 c) 세포분쇄액 중의 IFN-2α 및 TGF-β3의 상당한 발현을 나타낸다.
추가로, 처리된 융모막(예를 들어, 민싱, 선택적으로 분해된)을 IFN-2α 및 TGF-β3의 존재에 대해 분석하였다. 간략하게, 처리된 융모막을 해동시키고, 16,000rcf에서 원심분리시켜 상청액을 수집하였다. 상청액을 맙테크(MabTech)(IFN-2α) 및 알앤디 시스템즈(TGF-β3)로부터의 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트 상에서 분석하였다. 도 14d 및 도 14e는 융모막으로부터 유래된 막 및 태반 조성물 중의 IFN-2α 및 TGF-β3의 상당한 발현을 나타낸다.
실시예 15.5 양막 내 태반 성장 인자 PLGF (PLGF) 및 인슐린 성장 인자-1 (IGF-1)의 존재
이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 상처 수복을 위한 본 태반 생성물의 효능이 중요한 세포 처리를 조절함으로써 다양한 조직의 발생 및 항상성에서의 BMP, IGF-1 및 PLGF의 역할에 부분적으로 기인한다는 것을 믿는다. BMP-2 및 BMP-4는 세포 성장을 촉진시키는 것에 추가로 MSC의 조골세포로의 분화를 자극할 수 있고; 태반 BMP 또는 PLAB는 배아 발생을 매개하는 것으로 시사된 BMP 패밀리의 신규한 구성원이다. 인슐린-유사 성장인자 1(IGF-1)은 골전구 세포의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있다. 태반 유래 성장 인자(PLGF)는 조골세포에 대한 미토겐으로서 작용할 수 있다.
본 기술에 기재된 태반 생성물은 조직 수복 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 간략하게, 해동 생성물을 DMEM + 10% FBS 중에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 막을 배양 배지와 함께 비드 균질기 내에서 균질화시켰다. 세포분쇄액을 원심분리시키고 나서, 상청액을 알앤디 시스템즈로부터의 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트 상에서 분석하였다.
실시예 15.6 처리된 융모막 조성물 중의 조직 수복 단백질의 존재
동결보존막을 조직 수복 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 간략하게, 양막 및 융모막으로부터 유래된 태반 조성물을 37℃±2℃에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 배양 배지 내 비드 균질기를 이용하여 균질화시켰다. 세포분쇄액을 원심분리시키고 나서, 상청액을 알앤디 시스템즈로부터의 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트 상에서 분석하였다.
도 15는 양막(a 및 b) 및 융모막(c 및 d)의 몇몇 공여자에서 BMP-2, BMP-4, BMP-7, PLAB, PLGF 및 IGF-1의 상당한 발현을 나타낸다. 추가로, 처리된 융모막(예를 들어, 민싱, 선택적으로 분해된)을 조직 수복 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 도 15(e 및 f)는 이들 조직 수복 단백질의 존재도 마찬가지로 도시한다.
이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 상처 수복을 위한 태반 조성물(예를 들어, 융모막을 포함 또는 융모막으로부터 유래)의 효능이 중요한 세포 처리를 조절함으로써 다양한 조직의 발생 및 항상성에서의 BMP, IGF-1 및 PLGF의 역할에 부분적으로 기인한다는 것을 믿는다. BMP-2 및 BMP-4는 세포 성장을 촉진시키는 것에 추가로 MSC의 조골세포로의 분화를 자극할 수 있고; 태반 BMP 또는 PLAB는 배아 발생을 매개하는 것으로 시사된 BMP 패밀리의 신규한 구성원이다. 인슐린-유사 성장인자 1(IGF-1)은 골전구 세포의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있다. 태반 유래 성장 인자(PLGF)는 조골세포에 대한 미토겐으로서 작용할 수 있다.
실시예 15.7 양막 내 α2-마크로글로불린의 존재
α2-마크로글로불린은 모두 4가지의 메커니즘적 분류로부터의 프로테이나제(세린 프로테이나제, 시스테인 프로테이나제, 아스파르트산 프로테이나제 및 메탈로프로테이나제)를 비활성화시키는 혈장 단백질로서 알려져 있다. 이 단백질의 다른 중요한 기능은 사이토카인 및 성장인자의 저장소로서 작용하는데, 이의 예는 TGF, PDGF 및 FGF를 포함한다. 당뇨성 궤양 또는 정맥 궤양과 같은 만성 상처에서, 고량의 프로테아제의 존재가 성장인자의 빠른 분해 및 상처 치유의 지연을 야기한다. 따라서, 만성 상처 치유에 대해 설계한 생성물 중의 α2-마크로글로불린의 존재가 유리할 것이다. 단백질 어레이 분석 결과는 양막 및 융모막이 α2-마크로글로불린을 함유한다는 것을 나타낸다(표 14). 이들 예비 데이터는 공여자 사이의 높은 가변성을 나타내지만, 상처 치유에서 이 단백질의 중요성은 단백질 어레이 대신 단일 분석물 ELISA를 이용하는 태반 조직 내 α2-마크로글로불린의 추가적인 평가를 촉진시켰는데, 이는 프로파일링을 위한 하나의 샘플 내 다중 단백질의 존재를 평가하는데 유용한 도구이다.
이들 데이터는 α2-마크로글로불린을 함유하는 양막을 포함하는 태반 생성물을 제공하는 본 기술의 특정 실시형태와 일치된다.
태반 조직 단백질 추출물 내 α2-마크로글로불린의 발현.
샘플 α 2-마크로글로불린 (pg/mL/ 8㎠)
AM75 7
CM75 790
AM78 53042
CM78 1014
실시예 16 예시적인 태반 조직 및 2개의 상업적으로 입수가능한 생성물에서 치료 인자의 비교
비교를 위해, 살아있는 세포, 더마그래프트 및 애플리그라프를 함유하는 2개의 상업적으로 입수가능한 생성물의 프로파일을 서치라이트 멀티플렉스(SearchLight Multiplex) 화학발광 어레이를 이용하여 마찬가지로 분석하였다.
실시예 16.1 예시적인 태반 조직 및 2개의 상업적으로 입수가능한 생성물의 비교를 위한 프로토콜
더마그래프트를 시험하기 위해, 막을 해동시키고, 제조업자의 설명서에 따라 세척하였다. 더마그래프트막을 7.5㎠ 조각으로 절단하였다. 조직 용해물에 대해, 막의 하나의 7.5㎠ 조각을 액화 질소 중에서 순간 냉동시키고, 막자사발을 이용하여 분쇄하였다. 분쇄한 조직을 1.5mL 마이크로원심분리관에 옮기고 나서, 프로테아제 저해제(로슈, 카탈로그 번호 11836153001)와 함께 500μL의 용해 완충제(세포 신호전달 기법, 카탈로그 번호 9803)를 첨가하고 나서, 빈번하게 교반시키면서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 16000g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 수집하고 나서, 오숀 바이오시스템즈(Aushon Biosystems)에 의한 단백질 어레이 분석을 위해 보냈다. 조직 배양물에 대해, 막의 1개의 7.5㎠ 조각을 12-웰 접시의 웰에 플레이팅하고 나서, 2mL의 DMEM +1% HSA+ 항생제/항진균제를 첨가하고 나서, 37℃±2℃ 에서 3, 7 또는 14일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 조직 및 배양 배지를 15mL 원심관에 옮기고 나서, 2000rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 배양 상청액을 수집하고 나서, 오숀 바이오시스템즈에 의한 단백질 어레이 분석을 위해 보냈다.
애플리그라프를 시험하기 위해, 막을 7.3㎠ 조각으로 절단하였다. 조직 용해물에 대해, 막의 하나의 7.3㎠ 조각을 액화 질소 중에서 순간 냉동시키고, 막자사발을 이용하여 분쇄하였다. 분쇄한 조직을 1.5mL 마이크로원심분리관에 옮기고 나서, 프로테아제 저해제(로슈, 카탈로그 번호 11836153001)와 함께 500μL의 용해 완충제(세포 신호전달 기법, 카탈로그 번호 9803)를 첨가하고 나서, 빈번하게 교반시키면서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 16000g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 수집하고 나서, 오숀 바이오시스템즈(Aushon Biosystems)에 의한 단백질 어레이 분석을 위해 보냈다. 조직 배양물에 대해, 막의 1개의 7.3㎠ 조각을 12-웰 접시의 웰에 플레이팅하고 나서, 2mL의 DMEM + 1% HSA+ 항생제/항진균제를 첨가하고 나서, 37℃±2℃ 에서 3, 7 또는 14일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 조직 및 배양 배지를 15mL 원심관에 옮기고 나서, 2000rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 배양 상청액을 수집하고 나서, 오숀 바이오시스템즈에 의한 단백질 어레이 분석을 위해 보냈다.
실시예 16.2 예시적인 태반 조직 및 상업적으로 입수가능한 생성물의 제3일 상청액 중에 존재하는 치료 인자
단백질 어레이 데이터 분석은 대다수의 선택된 시험 인자(표 12를 지칭)를 양막, 융모막, 애플리그라프 및 더마그래프트에서 발현시켰다. 3종의 단백질을 애플리그라프 및 더마그래프트에서 검출가능하지 않은 양막 및/또는 융모막에 대해 독특한 것으로 동정하였다. 이들 단백질은 EGF, IGFBP1 및 아디포넥틴이다. 상처 치유를 위해 모두 3종의 단백질이 중요하다. 도 16은 양막(AM), 융모막(CM) 및 상업적으로 입수가능한 생성물에서 EGF(A), IGFBP1(B), 및 아디포넥틴(C)의 발현을 도시한다. AM75 및 AM78은 본 기술(예를 들어, 동결보존)의 동결보존된 태반 생성물인 반면, CM75 및 CM78은 동결보존된 융모막 생성물이다. 이들 단백질은 상처 치유를 위한 본 태반 생성물의 치료 효능을 가능하게 하는 것으로 본 발명자들에 의해 믿어진다.
이들 데이터는 EGF, IGFBP1, 및/또는 아디포넥틴을 함유하는 양막을 포함하는 태반 생성물을 제공하는 본 기술의 특정 실시형태와 일치된다.
표 15는 본 기술의 예시적인 태반 생성물 막의 상청액 및 2종의 상업적으로 입수가능한 생성물(음성 배경의 차감 후에 8㎠ 마다 조절된 결과)의 생화학적 프로파일을 도시한다. AM75 및 AM 78은 본 기술의(예를 들어, 동결보존된) 태반막 생성물이며, CM75 및 CM78은 동결보존된 융모막 생성물이다.
Figure pct00015
MMP와 TIMP는 둘 다 상처 치유에 중요한 인자이다. 그러나, 이들 단백질의 발현은 고도로 조절되고 조정되어야 한다. TIMP에 대한 과량의 MMP는 불량한 만성 상처 치유의 마커이다. 본 발명자들은 MMP 및 TIMP의 발현 및 양막 및 융모막에서 그의 비를 연구하였고, 그를 애플리그라프 및 더마그래프트에서 발현 프로파일에 비교하였다.
표 15 및 도 17의 결과는 모든 막이 MMP 및 TIMP를 발현시키지만; 그러나 해동된 태반 생성물에서의 비가 상당히 더 낮다는 것을 나타내었다. 따라서, 이들 막은 상처 치유에 더 유리할 것이다(도 17).
축적된 데이터는 MMP 대 TIMP 비가 비치유 상처의 경우에 더 높다는 것을 나타낸다. 예를 들어, MMP-9와 TIMP1 사이의 비는 양호한 치유를 위한 것에 대해 대략 7 내지 10이고, 불량한 치유에 대해 18 내지 20 이상이다. 태반 조직, 애플리그라프 및 더마그래프트에 의해 분비되는 MMP와 TIMP 사이의 비의 분석은 양막 및 융모막 생성물이 상처 치유에 바람직한 대략의 비 7로 MMP 및 TIMP를 함유한다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 더마그래프트는 비가 20 초과이며, 애플리그라프는 비가 200 초과이다.
이들 데이터는 약 7 내지 10 대 1의 비로 MMP-9 및TIMP1을 함유하는 양막을 포함하는 태반 생성물을 제공하는 본 기술의 특정 실시형태와 일치된다.
실시예 17 양막 조직 효능을 위한 마커로서 EGF의 확립
EGF는 상처 치유에 중요한 인자이다(Schultz et al., 1991, Komarcevic, 2000, 및 Hong et al., 2006). EGF가 없음 또는 감소된 양은 만성 상처의 한 가지 특징이다(Harding et al., 2002). 본 출원에 의해 개시된 개발된 제조 과정에 따라 제조된 양막으로부터 유래된 단백질의 평가는 EGF가 이들 조직에 의해 더 다량으로 분비된 주된 인자 중 하나라는 것을 나타낸다. 현재 개시된 양막에서 검출된 고수준의 EGF와 함께 상처 치유를 위한 EGF의 중요성은 본 개시내용에 의해 임상 용도를 위해 제조된 막 생성물의 평가를 위한 효력 마커로서 EGF의 선택을 뒷받침한다. 알앤디 시스템즈사로부터의 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트를 양막에 의해 분비된 EGF를 측정하기 위한 그의 적합성의 평가를 위해 선택하였다. ELISA 정량화는 생분석 검정 타당성에 대한 FDA 및 ICH 가이드에 의해 확립된 표준을 충족시킨다(Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), 1994; ICH Harmonized Tripartite Guideline and Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, 2001). 본 방법에 의해 EFG의 발현에 대해 평가한 양막은 단백질 어레이 데이터를 확인하였고, EGF가 이들 조직에서 임상적으로 상당한 수준에서 발현된 독특한 인자였다는 것을 추가로 입증하였다.
실시예 17.1 EGF의 양막 조직 발현
단백질 어레이 분석은 EGF가 양막에서 독특하게 발현되었지만, 융모막에서는 그렇지 않다는 초기 증거를 제공하였다(표 16). 양막에서 측정된 EGF의 수준은 임상적 의미를 가진다.
다수의 공여자로부터의 양막 및 융모막 내 EGF의 발현 범위를 나타내는 단백질 어레이 데이터
양막 (pg/ml) 융모막 (pg/ml)
EGF 127.3-361.4 0-0.8
이들 데이터는 양막이 선택적으로 실질적인 양으로 EGF를 함유하는 한편, EGF가 융모막에서 검출되지 않는다는 것을 나타내는 경향이 있다.
17.2 융모막 조직 효능을 위한 마커로서 bEGF의 확립
bFGF는 신생혈관생성, 조직 수복 및 상처 치유를 포함하는 다양한 세포 처리를 조절한다(Presta et al., 2005, Reuss et al., 2003, 및 Su et al., 2008). 상처 치유 모델에서, bFGF는 상처 봉합을 증가시키고, 상처 부위에서 혈관 형성을 향상시키는 것으로 나타났다(Greenhalgh et al., 1990). 현재 개시된 제조방법에 의해 제조된 양막 및 융모막으로부터 유래된 단백질의 평가는 bFGF가 태반 조직 단백질 추출물 내 주요 인자 중 하나라는 것을 나타내었다. 도 18A는 2명의 별도의 태반 공여자로부터의 태반막의 단백질 프로파일 평가 동안 검출된 두 공여자로부터의 양막 (AM) 및 융모막(CM)에 의한 bFGF의 발현을 도시한다.
상처 치유를 위한 bFGF의 중요성은 본 개시내용에 의한 임상 용도를 위해 제조된 융모막 생성물의 평가를 위한 효능 마커로서 bFGF의 선택을 뒷받침한다. 알앤디 시스템즈사로부터의 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트를 태반막에 의해 분비된 bEGF를 측정하기 위한 그의 적합성의 평가를 위해 선택하였다. ELISA 방법 정량화 실험을 생분석 검정 타당성을 위한 FDA 및 ICH 가이드라인에 따라 설계하였다(Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1), 1994; ICH Harmonized Tripartite Guideline and Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, 2001).
융모막 내 bFGF 발현
융모막 제조에서 bEGF의 측정은 신뢰가능하고 재생가능한 것으로 증명되었다. 비드 균질기를 이용하여 태반 조직 추출물을 제조하였다. 조직 상청액 샘플에 대해, 조직을 배지와 함께 배양하고 나서, 상청액을 수집하였다. bFGF의 선택을 평가하였다. 다수의 공여자에서 bEGF의 측정은 이런 정량화 방법이 임상 상황에서 사용하기 위해 제조한 현재 개시한 조직 생성물의 효능을 평가하는 가치있는 방법이라는 것을 나타내었다. 도 18B는 2명의 별도의 태반 공여자로부터의 조직 추출물 또는 상청액으로부터 유래된 융모막 조직 샘플 내 bFGF의 대표적인 발현을 나타낸다. 결과를 다수의 조직 제조에서 재현하였다.
이들 데이터는 본 방법이 bFGF를 함유하는 융모막을 포함하는 태반 생성물 막을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다.
기능 연구:
실시예 18 태반막의 면역조절 효과
만성 상처는 정상 치유 단계를 통해 진행되지 못하고 종종 염증 단계에서 멈춰진다(Maxson, Lopez et al. 2012). 만성 상처 환경의 특징은 1) 고수준의 전염증 사이토카인, 예컨대 TNF-α 및 IL-1α, 2) 저수준의 항염증 사이토카인, 3) 고수준의 프로테아제 및 저수준의 그들의 저해제뿐만 아니라 4) 균형에 맞는 고수준의 산화제 및 저수준의 항산화제를 포함한다. 따라서 손상 부위에서 염증 제어는 치유 과정을 재시작/진행하기 위한 열쇠이다. 항염증 활성에 대한 태반막의 효능을 상처 치유에 대해 연구하였다.
실시예 18.1 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 자극
조직 샘플을 1ng/ml의 TNF-α(전염증 인자)와 함께 또는 이것 없이 18시간 동안 배양시켰다. 상청액을 수집하고 나서, 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 농도를 PGE2 단클론성 효소 면역분석(EIA) 키트(카이만(Cayman))를 이용하여 측정하였다. 도 19는 본 발명자들의 태반막 생성물(양막 생성물)이 TNF-α에 노출될 때 고수준의 항염증 사이토카인 PGE2를 생성한다는 것을 나타내었다.
실시예 18.2 말초혈액 단핵 세포(PBMC) 분석
PBMC를 세라케어 라이프 사이언시즈사(SeraCare Life sciences)로부터 얻었다. 모든 실험을 웰 당 1mL 분석 매질에서 106개 단핵 세포와 함께 24웰 플레이트에서 2회 중복하여 수행하였다. 전염증 사이토카인의 저해 효과를 시험하기 위해, T 세포 미토겐 - 항-CD3 단클론성 항체(CD3) 및 항-CD28 단클론성 항체(CD28)를 mL 당 1㎍으로 첨가하여 면역 세포를 활성화하였다. 이어서, 조직 샘플을 습한 분위기에서 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 활성화된 PBMC와 함께 인큐베이션시켰다. TNF-α 및 IL-1α 생성을 ELISA 듀오셋(Duoset) 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 상청액 중에서 측정하였다. 항염증 인자 IL-10의 방출을 시험하기 위해, 본 발명자들은 100ng/ml LPS와 함께 4시간 동안 PBMC를 사전 자극하고, 이어서, 추가 24시간 동안 자극 PBMC과 함께 조직 샘플을 인큐베이션시켰다(10ng/mL TNF-α와 함께 밤새 사전자극). IL-10 듀오셋 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 IL-10을 상청액에서 검출하였다. LPS 자극이 없는 PBMC는 음성 대조군으로서 포함시켰다. 태반막 생성물은 가용성 전염증 사이토카인(TNF-α, 및 IL-1α)의 방출을 크게 저해하였고, 활성화된 면역 세포와 함께 공동배양하였을 때 항염증 IL-10의 방출을 상향조절하였다(도 20에서 나타냄).
실시예 18.3 양막에 의한 프로테아제의 상승된 수준의 조절
만성 상처에서 연장된 염증 반응은 특히 MMP 및 호중구 엘라스타제 활성이 증가된 강화된 프로테아제 반응을 생성한다. MMP 및 엘라스타제는 정상 생리학적 및 병리적 과정, 예컨대 기저막의 분해, ECM의 리모델링, 결합조직 전환, 신생혈관생성, 재생 및 상처 수복에 연루된다. 그러나, 과량의 MMP 및 엘라스타제는 ECM 성분을 파괴하며, 치유에 필수적인 성장인자 및 그들의 수용체를 손상시킨다. 이 연구에서, 본 발명자들은 태반막 생성물이 MMP 및 엘라스타제의 저해를 매개하는지의 여부를 연구하였다.
MMP 활성을 위한 아조콜 분석
아조콜은 보라색 아조염료가 스며든 불용성, 분쇄된 콜라겐이다. 단백질 분해 시, 가용성 아조 염료는 방출되며, 550㎚에서 흡광도에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 아조콜은 환경에서 프로테아제 활성을 시험하기 위한 색원체 비특이적 기질로서 종종 사용된다. 상기 분석은 지앙(Jiang) 등에 의해 개발된 변형 방법을 이용하여 수행되었다(Jiang, Tan et al. 2007). 아조콜을 세척하고 나서, 최종 농도 1.5㎎/mL로 10mM PBS, pH 7.4에서 현탁시켰다. 콜라게나제 IV를 양성 대조군으로서 사용하였는데, 그의 두 활성 형태, 즉, MMP-2 및 MMP-9(각각 72kD 및 92kD)가 불량한 치유와 관계 있는 만성 다리 궤양으로부터의 상처에서 발현이 상승된 것으로 나타났기 때문이다(Trengove, Stacey et al. 1999). 양막 생성물을 5시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 부드러운 끝에서 끝으로의 회전 하에 0.1%(w/v) 콜라게나제 IV(라이크 테크놀로지즈(Life Technologies)) 및 아조콜 현탁액과 함께 인큐베이션시켰다. 반응을 10,000 xg에서 8시간 동안 샘플을 원심분리시킴으로써 중단시켰다. 상청액 용액의 흡광도를 ELISA 판독기(스펙트라맥스(spectramax))를 이용하여 550nm에서 측정하고, 양측 스튜던트 t 검정을 수행하여 통계학적 유의도를 결정하였다(p<0.05). 도 21은 동결보존된 양막이 MMP 활성을 유의하게 저해할 수 있다는 것을 입증한다.
호중구 엘라스타제 분석
양막 생성물을 1% FBS와 함께 24시간 동안 DMEM 중에서 100ng 정제된 인간 호중구 엘라스타제(시그마(Sigma))와 함께 사전조건화시켰다. 사전 조건화된 조직 샘플 및 100ng 새로운 호중구 엘라스타제를 4시간 동안 37℃에서 0.5M NaCl, 10% DMSO 및 1mM 엘라스타제 기질(시그마)을 함유하는 0.1M HEPES 완충제의 최종 용적 500μl, pH 7.4에서 인큐베이션시켰다. 기질 분해를 OD405를 측정함으로써 연속적으로 모니터링하였다. 도 22A는 동결보존된 양막이 엘라스타제 활성을 대략 94%까지 저해하였다는 것을 도시한다.
민싱한 융모막 조성물의 샘플을 해동시키고, HEPES 완충제 중의 인간 호중구 엘라스타제와 최종 농도 0.01mM로 그리고 엘라스타제 기질을 최종 농도 5.7 mM로 합쳤다(N-메톡시숙신일-Ala-Ala-Pro-Val-P-나이트로아닐라이드, 시그마(Sigma) # M4765). 양성 대조군에 대해, 동결보호제(5% DMSO, 식염수 중의 5% HSA)를 태반 조성물 대신 사용하였다. 샘플을 밤새 진탕시키면서 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다.
405㎚에서 OD를 측정함으로써 기질 분해를 측정하였다. 결과를 도 22B에 나타낸다. 효소 기질 가수분해는 흡광도의 증가를 초래한다. 효소 기질 가수분해는 양성 대조군에 비해 민싱한 태반 조성물에서 더 낮아서, 프로테아제의 저해를 통해 만성 상처 환경을 조절하는 민싱한 태반 조성물의 능력을 확인하였다.
실시예 18.4 상처에서 ROS의 중화
면역 세포, 예컨대 호중구 및 대식세포는 반응성 산소종(ROS)을 생성한다. 저농도의 ROS는 미생물에 대해 신호전달 및 방어를 제공한다. 그러나, 다량의 ROS는 세포외 구조 단백질, 지질 및 DNA를 손상시킬 뿐만 아니라, MMP, 세린 프로테아제 및 염증 사이토카인의 발현을 향상시키는데, 이는 상처 치유를 손상시킨다. 본 발명자들은 항산화제 능력 키트를 이용하여 태반막 생성물의 총 항산화제 능력을 처음으로 연구하였다. 게다가, 태반막 생성물이 산화제 유도 세포자멸사로부터의 진피 섬유아세포를 보호할 수 있는지의 여부를 시험하였다.
항산화제 분석
양막 생성물로부터의 조정배지의 항산화제 활성을 제조업자의 설명서에 따라 항산화제 분석 키트(시그마 CS0790)를 이용하여 측정하였다. 상기 방법은 산화적 조건에 노출될 때 녹색 신호를 생성하는 ABTS로부터의 라디칼 양이온 ABTS+의 방출에 기반한다. 생성된 색 강도의 저해는 샘플의 항산화제 능력과 관련될 수 있다. 도 23은 양막 생성물이 250μM 아스코르브산만큼 강한 항산화제 능력을 가진다는 것을 입증한다.
세포 생존 분석
세포 생존 분석을 김(Kim) 등에 의해 보고된 변형 방법을 이용하여 시험하였다(Kim, Park et al. 2008). 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)(론자)를 24-웰 플레이트에서 5 x 104개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 0.1% FBS로 보충한 DMEM 중에서 24시간 동안 영양을 차단하였다. 후속적으로, 유기 하이드로퍼옥사이드인 tert-뷰틸 하이드로퍼옥사이드(tbOOH)를 3시간 동안 NHDF에 대한 산화적 손상을 유도하기 위한 산화제로서 사용하였다. tbOOH 함유 배지를 정상 배양 배지로 대체하고 나서, 양막 생성물을 HDF와 함께 인큐베이션시켜서 구조 과정을 시작한다. 양성 대조군을 250 μM 아스코르브산으로 대체하였다. 4시간 후에, NHDF를 10㎍/ml 호크스트(Hoechst)와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 그리고 ImageJ(NIH)를 이용하는 형광 현미경에 의해 강하게 응축된 염색질 및/또는 단편화된 핵을 갖는 세포의 백분율을 스코어링함으로 세포자멸사를 결정하였다. 도 24는 양막 생성물이 해당 초기 세포자멸사 HDF를 80%까지 구할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 19.1 태반막 생성물은 신생혈관생성을 향상시킨다
신혈관형성은 상처 치유 과정에서 중대한 단계이다. 새로운 혈관의 형성은 일시적인 과립화 기질의 생성 및 각질세포의 생존을 위한 충분한 영양소 공급과 함께 섬유아세포를 제공하는데 필수적이다.
관 형성
양막 생성물의 혈관형성 가능성을 시험하기 위해, HUVEC(론자)를 양막 생성물, 매트리겔(Matrigel)(BD)-코팅 배양 웰 상에서 104개 세포/웰의 농도로 양막 생성물로부터 유도된 조정 배지를 이용하여 파종시켰다. 조정배지를 3일 동안 2% FBS로 보충한 내피세포 성장 배지 EBM(론자)에서 배양 양막 생성물에 의해 얻었다. 성장인자의 모든 필수 칵테일로 보충한 EBM을 양성 대조군으로 사용하였다. 8시간 인큐베이션 후에, 각각의 샘플로부터의 필드를 도립 현미경에 의해 무작위로 촬영하고, 폐쇄관의 수를 계수화하고 나서, 이미지J(NIH)에 의해 플롯팅하였다.
도 25a는 양막 생성물로부터의 조정배지가 양성 대조군과 동일하게 관 형성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
실시예 19.2 융모막 생성물은 최소 14일 동안 신생혈관생성 성장 인자를 발현시킨다
민싱된 융모막 조성물은 상처 치유 치료에 바람직한 지속가능한 효과를 입증한다. 융모막으로부터 유래된 태반 조성물 내의 세포외 기질 및 생존 세포의 존재는 적어도 14일 동안 제공될 상처 치유 및 신생혈관생성에 중요한 것으로 알려진 단백질의 칵테일을 가능하게 한다.
처리한 동결보존 융모막 조성물을 해동시키고, 조직 배양 웰 상에 플레이팅하고 나서, 37℃±2℃에서 3, 7 및 14일 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 시점에, 조성물의 샘플을 수집하고 나서, 16,000rcf에서 10분 동안 원심분리시켜 상청액을 수집하였다. 이어서, 상청액을 bFGF 및 VEGF에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 도 25b 내지 도 25c는 2명의 제3일, 제7일 및 제14일에 상처 치유 단백질인 bFGF 및 VEGF의 지속기간을 도시한다. bFGF의 발현은 시간에 따라 감소되지만, 상당한 수준의 bFGF가 14일에 안정적으로 존재한다는 것을 주목하여야 한다. 흥미롭게도, VEGF의 발현은 시간에 따라 증가되는데, 이는 융모막으로부터 유도된 태반 조성물 내에서 생존 세포로부터 VEGF의 계속된 활성 발현에 기인할 수 있다.
저산소성 조건은 VEGF의 생성을 증가시킨다
민싱한 융모막을 저산소성 환경에 대한 반응에 대해 시험하여, 만성 상처에서 발견되는 저산소성 조건을 모방하였다.
처리한(예를 들어, 민싱한) 동결보존 융모막 조성물을 해동시키고 나서, DMEM과 함께 2개의 48웰 배양 플레이트의 웰에 두었다. 하나의 플레이트를 정상 산소증 조건(37℃, 5% CO2, 대략 20% O2) 하에 두고, 제2 플레이트를 저산소성 조건(37℃, 5% CO2, 1% O2) 하에 두었다. 이들 조건 하에서 48시간 인큐베이션 후에 플레이트를 수집하고 나서, 샘플을 수집하였다. 샘플을 16,000 rcf에서 10분 동안 마이크로원심분리기에서 원심분리시켰다. 상청액의 VEGF 함량을 ELISA에 의해 측정하였다. 결과를 도 25D에서 입증한다.
도 25d에서 나타낸 바와 같이, 조성물은 신생혈관생성 성장 인자 VEGF의 생성을 200%까지 증가시킴으로써 저산소성 환경에 반응하였다.
실시예 20 태반 조직은 세포 이동 및 상처 치유를 향상시킨다
상처 치유 과정은 고도로 복잡하며, 성장인자에 의해 제어된 일련의 구조화된 사건을 수반한다(Goldman, 2004). 이들 사건은 증가된 혈관신생, 염증 면역세포에 의한 침윤 및 세포 증식의 증가를 포함한다. 상처 치유의 시작 단계는 개개 세포가 상처에 대해 양극화되고, 상처 영역에 근접하고 주위 조직을 재구성하기 위해 상처 영역 내로 이동하는 능력에 관해 다룬다. 3가지 유형의 세포가 세포 이동 과정에서 주로 수반된다. 그들은 혈관 내피세포, 섬유아세포 및 각질세포이다. 혈관 내피세포는 상처 영역으로 이동하며, 적절한 상처 치유를 위해 필수적인 산소 및 영양소를 제공하는 새로운 혈관을 형성한다. 섬유아세포는 다양한 결합조직 성분을 재구성하기 위해 과립화 조직을 형성하도록 상처 부위에 이동할 필요가 있다. 재상피화(상처봉합)는 각질세포의 지향성 이동을 필요로 한다. 따라서, 본 발명자들은 오시리스(Osiris)에서 생산된 양막 및 융모막으로부터 분비된 인자가 3가지 유형의 세포 이동 및 상처 필드 봉합을 촉진시키는지의 여부를 결정하는 것을 추구하였다. 이를 달성하기 위해, 본 발명자들은 도 26(셀 바이오랩스(Cell Biolabs)) 및 트랜스웰(transwell) 세포 이동 분석에서 알 수 있는 바와 같이 상업적으로 입수가능한 상처 치유 분석을 이용하였다. 세포주는 인간 미세혈관 내피세포(HMVEC, 론자 인코포레이티드(Lonza Inc.)), 인간 제대 내피세포(HUVEC, 론자 인코포레이티드), 인간 진피 섬유아세포 (HDF, 론자 인코포레이티드) 및 병에 걸린 인간 각질세포(D-HEK 론자 인코포레이티드)를 포함한다. 결과는 모두 3가지 유형의 세포의 세포 이동이 태반막으로부터의 조정배지에 의한 처리에 의해 향상된다는 것을 나타낸다.
실시예 20.1 태반막 조정배지는 내피세포 이동 및 상처 필드 봉합을 지지한다
트립신화를 통해 세포를 수집하고 나서, 펠렛화하고, 계수화한 후 2X105개 세포/mL의 밀도로 완전한 각질세포 배지에서 재현탁시켰다. 이어서, 250ul(5X104개 세포)의 세포 현탁액을 상처 치유 삽입물(사이토셀렉트 24웰 상처 치유 분석 플레이트, 셀 바이오랩스(Cell Biolabs))을 함유하는 웰의 각각의 측면에 피펫팅한다. 세포를 완전 배지에서 24시간 동안 성장시켰다. 24시간 후에, 상처 삽입물을 제거한다. 동시에, 완전한 각질세포 배지를 제거하고 나서, 실험 배지로 대체한다. 완전 각질세포 배지 및 기저 각질세포 배지를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 실험 배지를 만들기 위해, 태반막을 조직 배양 인큐베이터에서 1% 인간 혈청 알부민(HSA)과 함께 DMEM 중에서 3일 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 얻어진 조직 및 배지를 에펜도르프관에 넣고 나서, 마이크로원심분리기에서 고속으로 회전시켰다. 상청액을 수집하고 나서, 사용시까지 -80 C에서 저장하였다. 이동 및 상처 치유 연구를 위해, 태반막으로부터의 조정배지를 기저 각질 세포에서 1:20으로 희석시킨 후, 실험 웰에 첨가한다. 18시간 후, 배지를 제거하고 나서, 세포를 4% 파라폼알데하이드 중에서 20분 동안 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한다. 이어서, 각각의 웰에서 상처 필드를 촬영한다. 상처 필드의 양에 의해 결정되는 상처 치유는 조정배지가 웰에 첨가되기 전에 취해지는 대조군 사진에 비해 실험의 마지막에 여전히 가시적이다.
양막 및 융모막으로부터의 조정배지를 사용하여 이들 막이 내피세포 이동 및 상처 필드 봉합을 촉진하는 가능성을 평가하였다. 태반 양막, 융모막, 및 양막/융모막의 조합물로부터의 조정배지는 실험 상처 필드 내로의 내피 세포 이동을 뒷받침하였다(도 27)
실시예 20.2 태반막 조정배지는 내피세포, 섬유아세포, 및 각질세포 이동을 뒷받침한다.
트랜스웰 세포 이동 분석
8㎛ 포어(BD)를 이용하는 플루로블록 트랜스웰 시스템을 이용하여 인간 제대 정맥 내피 세포, 인간 정상 진피 섬유아세포 및 인간 질환 각질세포(II형 당뇨병)(론자) 상에서 이동 분석을 수행하였다. 100,000개 세포를 0.1% FBS와 함께 DMEM 중에서 현탁시키고 나서, 트랜스웰의 상부챔버에 첨가하여 유사분열을 저지하였다. 다음 날, 조직 샘플로부터 유도된 조정배지를 하부 챔버에 첨가하고 나서, 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 필터를 통해 이동된 세포를 고정시키고 나서, 칼세인(몰레큘러 프로브(Molecular Probe))에 대해 염색하였다. 필드를 형광 도립 현미경에 의해 시각화시키고 나서, 10x 확대 하에 4개의 무작위로 선택한 필드로부터 사진을 촬영하였다. 본 발명자들의 결과는 양막 생성물이 내피세포(도 27 및 28), 섬유아세포(도 29), 및 각질세포(도 30)의 이동을 촉진시킨다는 것을 입증하였다.
실시예 20.3 민싱한 태반 조성물의 세포 증식
민싱한 융모막 조성물의 세포 증식 능력을 시험하였다. 태반 세포를 파종하고 나서 14일 동안 배양시켰다.
처리한 융모막(예를 들어, 민싱, 선택적으로 분해) 조성물을 해동시키고 나서, 37℃에서 로킹하면서 20분 동안 분해시켰다. 각각의 샘플을 250U/mL 세르바(Serva)형 II 콜라게나제 또는 250U/mL 워싱턴(Worthington)형 II 콜라게나제에서 분해시킨다. 분해된 조성물을 100㎛ 세포 스트레이너 위에 붓고 나서, 스트레이너를 DMEM으로 세척하였다. 분해된 조성물을 10 ± 분 동안 411 rcf에서 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, DMEM 중에서 재현탁시켰다. 각각의 세포 현탁액을 트리판 블루 배제에 의해 혈구계수기를 이용하여 계수화하였다.
처리한 세포의 각각의 그룹을 T25 플라스크에 파종하고 나서, 인큐베이터에서 14일 동안 배양시켰다. 결과를 도 31A 내지 도 31B에서 알 수 있다. 민싱한 태반 조성물로부터 유래된 세포는 세포 배양물에서 14일 후에 세포 콜로니를 확립하였다.
임상 연구
실시예 21 당뇨성 족부 궤양을 치료하기 위한 태반 생성물의 용도
목적: 인간 섬유아세포 또는 인간 섬유아세포 및 각질세포의 조합물을 함유하는 생체공학처리된 피부 대체물에도 불구하고, 공개된 비율의 만성 상처 치유는 이들 새로운 치료법에 대해서조차 저항성인 모든 상처의 거의 절반으로 낮게 남아있다. 하지절단 후 5년 사망률이 39% 내지 68%가 됨에 따라 당뇨성 족부 궤양으로부터의 이환율 및 사망률은 실질적이다. (Page J. J of Foot & Ankle Surgery 2002; 41(4):251-259; Isumi Y., et al. Diabetes Res 및 Clin Practice 2009; 83:126-131).
필수적 혈관형성 및 항염증 성장인자를 제공하는 동결보존된 태반막 생성물을 절단의 위험에 있는 만성 피부 궤양을 지니는 환자의 결과를 개선시키기 위한 노력에 도입하였다.
목적: 이용가능한 치료법에 대해 비반응성이며 절단의 위험에 있는 만성 당뇨성 족부 궤양을 지니는 환자는 치료가 고려되었다. 모든 상처를 동결보존된 태반막의 적용 전에 공격적으로 제거하였다. 환자를 정기적으로 평가하고, 본 기술의 막 생성물의 적용은 치료하는 의사의 재량이다. 오프로딩(Offloading)은 환자 둘 다에서 권장되었다.
도입
미국 식품 의약 관리국(United States Food and Drug Administration: FDA)에 따라, 만성, 피부 궤양을 지속가능한 구조적, 기능성 및 미용적 봉합을 생성하는 정돈된 그리고 시기적절한 일련의 사건을 통해 진행되지 않은 상처로서 정의한다(2). 가장 통상적인 만성 상처는 욕창 및 다리 궤양을 포함한다. 말초 신경병증, 기형 및 작은 외상의 트라이어드는 족부 궤양을 야기하는 발작의 가장 빈번한 원인으로서 나타났다. 치유율에 대해, 만성 상처에 대한 적절한 벤치마크는 매주 10 내지 15%의 크기 감소, 또는 1개월 기간에 걸쳐 50%의 크기 감소이다. 당뇨병이 있는 거대 건강유지조직의 8,905명의 환자의 램세이(Ramsey) 등에 의해 수행된 3년 후향 코호트 연구는 궤양의 5.8% 누적 발생률을 보고하였다. 진단 시, 이들 환자 중 15%는 골수염이 발생되었고, 16%는 하지의 부분 절단이 필요하였다.
하지절단의 대략 80% 내지 85%는 족부 궤양에 의해 진행된다. 하지절단 후 5년 사망률이 39% 내지 68%이됨에 따라 당뇨성 족부 궤양으로부터의 이환율 및 사망률은 실질적이다. (2). 이들 사망률은 유방암, 결장암 및 전립선암에 대한 5년 사망률보다 더 높다.
만성 당뇨성 궤양화의 치료를 위한 생체공학처리된 조직의 모든 진보에도 불구하고, 치료법에 대해 내성이 있고, 만성 상처를 야기하는 궤양이 있는 환자는 많다. 이들 더 새로운 치료법의 단지 50%에 접근하는 치유율 때문에, 재생 의학에서 줄기 세포의 사용은 특히 최근에 관심의 대상이 되었다. 궁극적인 목적은 기능성 피부의 회복을 촉진시키는 것이다. 예비 연구는 피아미(Fiami) 등에 의해 수행되는데, 그들은 탯줄 혈액으로부터 간충직 줄기 세포를 단리시키고, 그들을 탈상피화된 진피 조각에 접종하였다. 이 예비 연구 결과는 말초 줄기 세포가 신생혈관형성을 생존 및 발현시킬 수 있다는 것을 나타내었다. 조직 수복을 위한 가능성을 나타내는 것에 추가로, 간충직 줄기 세포는 낮은 면역원성을 나타내며, 공여자와 수용자 사이의 적합성 시험을 겪는 일 없이 보편적으로 이식될 수 있다.
이 연구에서, 현저한 치유의 임상 증거는 절단이 고려되는 2개의 만성 상처의 치료를 위해 동결보존된 막 생성물을 이용한다. 근본적인 상처 관리는 여전히 적절한 괴사 조직 제거, 오프로딩, 수분환경 유지 및 적절한 관류 및 감염 제어를 포함하는 임의의 치료 프로토콜에서 종합적인 상처 치유의 주춧돌이다.
물질
천연 상피세포, 및 신생아 섬유아세포, 세포외 기질(ECM) 및 간충직 줄기 세포(MSC)로 이루어진 기질층의 이중층을 포함하는 양막으로부터 유래된 동종이식편을 포함하는 동결보존된 태반막을 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성하였다.
사지구제술: 사례 1
이력 및 신체검사
오른쪽 발 네 번째와 다섯 번째 발가락 사이의 배측면 상의 수포형성, 부종 및 통증 및 다섯 번째 발가락 측면의 작은 병변을 지니는 70세 남성이 응급실로 내원하였다. 환자는 참석 2주 전 영역에 대한 작은 외상의 이력을 보고하였다. 환자는 II형 진성 당뇨병, 고혈압, 심부전, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 1주 3회 혈액투석 치료를 받는 만성 신장 질환이 있었다. 환자는 대동맥-정맥 이식편 대체의 수술 이력이 있었다. 그는 알코올, 담배 또는 약물 사용의 임의의 이력을 부인하였다. 신체검사는 활성 화농성 배농 또는 악취을 나타내지 않았고, 촉진 시 무름을 나타내지 않았다. 혈관 검사는 족배 동맥 및 후경골 동맥에서 촉진할 수 없는 맥박을 나타내었다. 도플러 검사는 이상 후경 골동맥과 함께 단상성 족배 동맥 맥박을 나타내었다. 다섯 번째 발가락은 괴저 변화가 있으며, 촉진 시 차가웠다. 네 번째 발가락에서 허혈성 변화가 있었다. 방사선 촬영 평가는 네 번째 간극의 연조직 기체뿐만 아니라 다섯 번째 발가락 끝을 나타내는 산발적 공기 밀도를 나타내었다.
수술전 관리
환자는 적절한 신장 투약 시 반코마이신 및 피페라실린 및 타조박탐의 정맥내 항생제를 시작하였다.
수술 관리
환자는 네 번째 사이틈의 절개 및 배출을 수행한 수술실로 갔고, 중족골 수준에 대한 부분적인 다섯 번째 광선 절개를 합병증 없이 수행하였다. 상처를 개방된 채로 두었고, 멸균 정상 식염수를 이용하여 습윤화한 멸균 거즈로 채우고 나서, 멸균 압박 드레싱으로 덮었다. 수술 중 소견은 화농 및 악취를 지니는 주변 조직의 융해괴사를 나타내었다. 환자는 2회의 후속적 수술 괴사 조직 제거를 겪었으며, 두번째는 제4 및 제5 중족골의 추가적인 제거를 야기하였다. 제3 수술에서, 괴사성 연조직의 추가적인 괴사 조직 제거 및 네 번째 발가락의 절단을 수행하였다. 2010년 5월 20일에, 동결보존된 태반막을 이용하는 치료를 개시하였다. 이식편 배치 전에, 환자는 상당한 잔여 협착증 없이 슬와동맥 및 비골동맥의 성공적인 재개를 겪었다.
수술후 과정
환자는 병원에서 퇴원하고 2일 내에 그의 족부 수술의사의 사후지도를 받았다. 초기 시험 시, 감염의 임상징후가 없었으며, 근위 배측 절개는 접합된 것으로 나타났다. 세번째 발가락은 거무스름하며 겉모습이 차가웠다. 방사선 사진을 촬영하였는데, 이는 연조직 가스 또는 급성 골수염의 증거를 나타내지 않았다. 건식 멸균 드레싱을 적용하였다. 환자는 통원치료실에서의 6회의 추가 방문에서 동결보존된 태반막의 적용을 받았다. 각각의 적용 전에, 농양, 봉와직염, 배농, 혈종형성 및 감염에 대해 상처를 평가하였다. 각각의 방문 시, 상처는 크기가 감소되었고, 이전의 방문에 비해 사실 상 더 많은 과립을 나타내었다. 세번째 적용 시, 상처는 크기가 50% 감소되었다.
19주에, 상처는 봉합되었고, 환자는 교정구두만을 사용하면서 환부 사지에 대해 체중부하를 유지하도록 지시받았다.
주목할 만한 상처 치유의 사진은 도 32에 나타낸 바와 같이 본 기술의 태반 생성물에 의해 매개된다. 패널 a: 동결보존된 태반막 생성물의 첫 번재 적용; b: 첫 번째 동결보존된 태반막 적용의 8주 후; c: 첫 번째 동결보존된 태반막 생성물 적용의 10 1/2주 후; d: 첫 번째 동결보존된 태반막의 12주 후에, 본 막 생성물 적용; e: 첫 번째 동결보존된 태반막의 19주 후에, 본 막 생성물 적용.
사지구제술: 사례 2
이력 및 신체검사
방문 몇 주 전에 이전의 외상에 대해 큰 웨양을 지니는 44세의 남성이 통원치료실로 내원하였다. 환자는 말초 신경병증, 고혈압, 이상지질혈증 및 골수염과 합병된 과거 5년동안의 진성 당뇨병 이력이 있었다. 과거의 수술 이력은 복부대동맥류 수복 및 환상절제술을 포함하였다. 신체검사시, 궤양은 4.0㎝ x 2.0㎝ x 1.5㎝로 측정되었고, 힘줄이 노출된 끝마디뼈를 살펴보았다. 상승적 봉와직염 또는 림프관염이 없었으며, 온도 구배는 증가되지 않았다. 모세관 충진 시간, 모발 성장 및 조직 긴장도는 모두 정상이었다. 족배 동맥 및 후경골 동맥에서 뚜렷한 맥박이 있었다. 방사선 촬영 검사는 연조직 가스에 대해 음성이었다. 자기 공명 이미징은 끝마디뼈에 인접한 배측 연조직 영역에서 작은 연조직 농양을 지니는 엄지 발가락의 첫마디뼈 및 끝마디뼈의 원위 양상에서 골수염을 나타내었다.
수술전 관리
환자는 정맥내 항생제를 시작하였다. 그는 모든 비생존 가능 조직의 절제 괴사 조직 제거 및 본 발명의 막 생성물의 적용을 위해 수술실로 갔다.
수술 관리
궤양을 날카로운 절개와 버사제트(VERSAJET)(상표명) 둘 다의 이용에 의해 건강한 조직으로 절제술을 시행하여, 발바닥으로 노출된 첫마디 뼈의 두부를 남겨두었다. 이어서, 동결보존된 태반막 생성물을 상처층 위에 두었고, 뼈를 노출시켰다. 환자는 합병증 없이 절차를 견뎠다. 환자는 정맥내 항생제 치료법의 5주 과정에 대한 수술 다음 날 병원에서 퇴원하였다.
수술후 과정
환자는 환부가 있는 사지에 엄격하게 체중부하가 남아있지 않도록 지시받았고, 수술후 제6일에 후속조치를 위해 복귀하였다. 드레싱은 깨끗하고, 건조하였으며 완전하였다. 농양, 봉와직염, 불편함 또는 배농과 같은 수술후 합병증이 없었고, 감염의 임상 징후는 없었다. 환자는 다음 8주의 과정에 걸쳐 동결보존된 태반막 생성물의 총 7회 적용을 받았다. 각각의 방문 시, 상처를 감염의 임상 징후에 대해 살펴보았다. 각각의 방문 시 평가는 상처 기재에 대한 과립화 조직의 현저한 발생 및 크기의 상당한 감소를 나타내었다. 동종이식편 조직의 초기 적용 8주 후에 상처는 봉합되었다.
주목할 만한 상처 치유의 사진은 도 33에 나타낸 바와 같이 본 기술의 태반 생성물에 의해 매개된다. 패널 A: 골수염, 노출된 힘줄, 뼈에 대한 조사. 수술 괴사 조직 제거 후에 첫 번째 동결보존된 태반막 이식편을 적용하였다; B: 동결보존된 태반막 이식편의 1회 적용 후 상태, 상처는 사실상 과립이며, 감염의 징후는 없다. [내용의 핵심을 알 수 없음] 동결보존된 태반막 이식편, 상처는 둘레 및 깊이가 상당히 더 작다; D: 수술적 개입 6주 후에, 상처는 거의 봉합됨, E; 8주에 그리고 동결보존된 태반막 이식편의 7회 적용 시, 상처는 봉합된다.
결론
과거 몇 십년 간의 피부 조직 공학에서의 엄청난 진보에도 불구하고, 현재의 치료법은 만성 당뇨성 궤양화의 치료에서 효능이 제한되었다. 두 환자의 이런 사례 보고에서 나타난 바와 같이, 줄기 세포를 함유하는 진보된 치료법의 사용은 절개 대신 이들 환자를 궁극적으로 치유하고, 사망률을 감소시키며, 동시에 현재 시판 중인 표준 치료에 대한 비용 효과적인 대안이 되는데 유용함을 증명할 수 있다. 이 사례 보고에서 강조된 환자 둘 다 본 기술의 막 생성물의 7회 적용을 받았다. 환자 둘 다에서 완전하게 치유되었다. 치료와 관련된 합병증은 보고되지 않았고, 본 발명의 막 생성물은 절개 위험에 있는 당뇨성 족부 궤양을 지니는 2명의 환자의 초기 평가에서 안전하고 효과적이었다. 이들 결과는 저항성의, 만성 상처를 지니는 환자가 이 새로운 치료법을 고려하여야 한다는 것을 나타낸다.
실시예 22 장래 임상 시험 연구에서 만성 당뇨성 족부 궤양의 치료를 위한 그라픽스의 효능 및 안전성 평가
당뇨성 족부 궤양은 상당한 이환율 및 증가된 건강관리 비용을 야기한다 전세계적 유행병이다. 이 연구는 만성 당뇨성 족부 궤양을 치유하기 위한 표준 상처 관리(N=47)에 비교하여 동결보존된 태반막(N=50)의 효능 및 안전성을 평가하였다. 이 실시예는 만성 당뇨성 족부 궤양의 치료를 위해 양막으로부터 유래된 본 명세서에 기재된 바와 같은 동결보존된 태반막 생성물(예를 들어, 그라픽스(Grafix)(등록상표), 메릴랜드주 컬럼비아에 소재한 오시리스 세라퓨틱스(Osiris Therapeutics))의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 전향적, 다중심, 무작위, 단일 맹검 임상 시험의 부분이다. 본 연구는 1975 헬싱키 선언의 윤리 가이드라인을 따랐고, 임상연구 등록 사이트(ClinicalTrials.gov)에 등록하였다(NCT01596920). 환자는 등록 전에 표준 IRB 승인 동의서를 검토하고 서명하였다. 환자는 2012년 5월부터 2013년 4월까지 등록되었다.
중요한 포함 기준은 확인된 I형 또는 II형 당뇨병, 환자 연령 18세 내지 80세, 4주 내지 52주에 존재하는 상처 지수, 발바닥 또는 발등 표면 상의 복사뼈 아래에 위치된 상처, 및 1㎠ 내지 15㎠의 궤양을 포함하였다. 주요 제외 기준은 12% 초과의 헤모글로빈 A1c, 골수염 또는 봉와직염을 포함하는 활성 감염의 증거, 발목상완지수 < 0.70 또는 > 1.30, 또는 발가락 상완 지수 ≤ 0.50 또는 부적절한 동맥 박동에 의한 환부 족부에 대한 부적절한 순환, 노출된 근육, 힘줄, 뼈 또는 관절낭에 의한 도플러 연구, 및 선별 기간 동안 상처 면적의 30% 이상 감소를 포함하였다.
일(1)주 선별 기간 후에, 환자를 동결보존된 태반 생성물 또는 대조군 치료 아암에 대해 1:1 비로 무작위화하였다. 태반 생성물 치료에 대해 무작위화된 환자는 84일까지 1주(± 3일) 1회(맹검 치료기) 태반 생성물의 적용을 받았다. 대조군의 환자는 84일까지 동안 1주(± 3일) 1회 표준 상처 치료법을 받았다. 모든 상처를 적절하게 세정하고, 각각의 매주 방문 시 메수, 조직 니퍼 및/또는 큐렛에 의해 상처로부터 모든 비생존성 연조직을 제거하도록 수술에 의해 제거하였다. 태반 생성물 그룹으로 무작위화한 환자에 대해, 동결보존된 태반막을 상처 및 가장자리와 완전하게 접촉되게 두었다. 그룹 둘 다에서 상처는 수술적 괴사 조직 제거, 오프로딩 및 비접착 드레싱을 포함한 표준 상처 관리를 받았다. 모든 환자는 비접착 드레싱을 받았다: 중등증의 배농 상처에 대해 어댑틱(ADAPTIC)(등록상표)(영국 개트윅에 소재한 시스타제닉스사(Systagenix)) 및 식염수를 적신 거즈 또는 알레빈(ALLEVYN)(등록상표)(영국 런던에 소재한 스미스 앤드 네퓨사(Smith and Nephew)). 이어서, 외부 드레싱을 적용하였다. 환자는 발바닥 상처에 대해 워커 부츠 또는 상처가 발등 또는 발목 상에 있었다면 수술후 신발을 제공받았다. 맞춤 오프 로딩 부츠는 부서 조사자의 재량으로 처방될 수 있다. 추가로, 사용한 오프-로딩 장치는 상처 크기 또는 위치의 변화를 수용하는데 필요하다면 바꿀 수 있었다.
환자를 임상 부서에서 매주 평가하였다. 이어서, 완전한 상처 봉합을 달성한 환자를 후속조치기 동안, 처음 1개월 동안 2회 그리고 이어서 2회의 추가 방문 동안 매달 계속해서 평가하였다. 맹검 치료기의 마지막까지 봉합되지 않은 상처의 대조군 환자는 태반 생성물(그라픽스(GRAFIX)(등록상표))이 84일까지 매주 적용된 개방 표지 치료기의 태반 생성물을 받을 수 있었다. 맹검 치료기, 후속조치 방문 시뿐만 아니라 개방 표지 치료기 동안 각각의 방문 시 결과 및 안전성 평가를 하였다.
연구의 1차 종말점은 지수 상처의 완전한 상처봉합 평가였다. 완전한 상처 봉합을 부서 조사자에 의해 결정된 바와 같이 상처 배액이 없는 100% 재상피화로서 정의하였다. 상처봉합의 확인은 초기 후속조치 방문 2주 후에 이루어졌다. 상처 봉합은 디지털화된 아세트산염 트레이싱 및 사진을 통해 모든 상처를 검토한 2명의 맹검 상처 관리 전문가가 있는 중앙 상처 코어 연구소(central wound core laboratory)를 통해 독립적으로 확인하였다. 2차 목적은 태반 생성물을 받은 환자 대 카플란-마이어 분석에 의해 측정한 바와 같은 대조군을 받은 환자 중의 초기 상처봉합에 대한 시간을 포함하였다. 28일까지 상처 크기의 50% 이상 감소, 봉합에 필요한 적용의 수, 및 초기 상처 치유 후 상처 재발을 달성한 환자의 비율을 또한 결정하였다. 개방 표지 치료기에서, 맹검 치료기에서 대조군에 있는 환자에 대한 태반 생성물에 의한 상처 봉합을 평가하였다. 안전성 평가는 국립암연구소(NCI)의 유해사건에 대한 통상적인 용어 기준(CTCAE) 버전 3에서 약술한 바와 같은 유해 사건의 수, 유형 및 중증도를 포함하였다.
샘플 크기 및 통계학적 분석: 연구 샘플 크기는 대조군 아암에서 30% 및 태반 생성물 그룹에서 50%의 추정 봉합률(중퇴율 30%)에 기반한다. 이들 추정 하에서, 각각의 치료 아암에서 94명의 완료 환자는 80% 검증력으로 0.05의 양측 제1종 오류를 충족할 필요가 있었다. 사전 구체화된 중간 분석을 50% 등록에서 계획하였다. 중간 분석은 오브라이언-플레밍(O'Brien-Fleming) 경계 형상을 이용하는 에머손-플레밍 대칭 그룹(Emerson-Fleming symmetric group)에 기반하여 단측 우수성 설계를 이용하였다(Emerson and Fleming, 1989). 분석을 비맹검 통계학자에 의해 수행하였고, 맹검 검토 위원회에 보고하였다. 중간 분석 후, 맹검 검토 위원회는 대조군 아암에 비한 태반 생성물의 압도적인 우수성 때문에 연구 등록을 종결할 것을 권고하였다.
치료의향분석 기준에 대해 SAS 버전 9.2를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 기준 인구통계학 및 임상 변수를 연구의 각각의 처리 아암에 대해 요약하였다. 평균, 표준편차, 중앙값 및 대상수, 범주 변수를 포함한 연속적 변수 분포의 설명적 개요는 빈도 및 백분율에 대해 요약하였다. 처리군 요약을 모든 연구 부서에 걸쳐 구성하였다. 연속적 측정을 위한 범주적 변수 및 분산 분석(ANOVA) 기법에 대한 카이 제곱 검정을 이용하여 처리군 간의 통계학적 비교를 수행하였다. 콕스(Cox) 비례 위험 회귀 분석을 시간 대 사건(상처봉합) 데이터에 대해 수행하였다.
결과
환자 인구통계학 및 기준 특징을 표 17에 제시한다. 선별 동안, 139명의 환자를 평가하였다. 선별되지 못한 42명의 환자가 있으며, 이 중 6명은 30% 이상의 상처 면적 감소가 있었기 때문에 기간 중의 1주 실행 후에 자격을 잃었다. 97명의 환자를 후속적으로 무작위화하였고, 50명은 태반 생성물을 받았으며, 47명은 표준 상처 치료법을 받았다. 2개의 치료군 간의 기준 특징에서 상당한 차이가 없었다. 계획한 중간 분석은 대조군에 비해 1차 및 2차 종말점에 대해 태반 생성물을 받은 환자 중에서 압도적인 효능을 나타내었다(표 18). 중간 분석 후, 맹검 검토 위원회는 압도적인 우수성 때문에 연구 등록을 종결할 것을 권고하였다.
효능 평가
맹검 처리기 완저한 상처 봉합을 달성한 환자의 비율은 도 34에서 도시한 바와 같이 대조군(47명 중 10명, 21.0%, p=0.0001)에 비해 태반 생성물(50명 중 31명, 62.0%)을 받은 환자에서 상당히 더 높았다. 대조군에 비해 태반 생성물 환자에 대한 완전한 치유를 위한 오즈비(odds ratio)는 6.037이었다(95% CI 2.449-14.882). 태반 생성물 그룹은 도 35에서 도시된 바와 같이 봉합된 그룹 둘 다에서 상처 중의 대조군(42 대 69.5일, p=0.019)에 비해 완전한 상처봉합에 대해 상당히 더 빠른 중앙값 시간을 가졌다. 카플란-마이어 분석은 태반 생성물에 대한 12주 평가 기간 동안 완전한 상처 치유의 통계적으로 더 큰 가능성을 도시한다(도 35). 태반 생성물 그룹에 대한 봉합 확률은 표준 관리 그룹에 대한 27.1%에 비교하여 67.1%였다(로그-순위법, p<0.0001). 태반 생성물 환자는 도 36에 도시한 바와 같이 대조군 아암의 환자에 비해 봉합을 달성하는데 더 적게 연구 방문(즉, 적용)을 필요로 하였다(6 대 12, p<0.001). 제28일까지 상처 크기의 적어도 50% 감소를 지니는 환자의 비교는 태반 생성물 그룹에서 50명의 환자 중 31명(62.0%)이 대조군에서의 47명 중 19명(40.4%)에 비해 이 감소를 달성하였다는 것을 나타내었다(p=0.035). 대조군으로부터 빠진 11명(23.4%)의 환자에 비해 태반 생성물 그룹의 완료 전 연구에서 빠진 8 명(16%)의 환자가 있었다.
처음 12주 연구 기간 동안 봉합된 DFU의 상처 재발을 평가하였다. 총 12주 동안 제2주, 제4주에 그리고 4주마다의 후속조치는 궤양이 대조군에서의 70.0%(10명 중 7명 환자)에 비해 태반 생성물 그룹의 환자 82.1%(28명 환자 중 23명)에서 봉합된 채로 남아있었다는 것을 나타내었다(p=0.42).
개방 표지기: 처음 12주 치료 기간 동안 치유되지 않은 대조군 아암의 환자는 태반 생성물 치료법을 12주까지 받도록 크로스오버 할 수 있었다(n=26). 태반 생성물 치료법을 받은 후에, 봉합 확률은 67.8%이고, 이들 환자의 봉합에 대한 중앙값 시간은 42일이었다. (도 37)
회귀 분석: 콕스 비례 위험 회귀 분석을 치료군, 궤양의 지속시간, 기준 궤양 면적, 글루코스 제어(당화 헤모글로빈), 궤양 위치 및 공변량으로서 BMI를 이용하여 수행하였다. 이들 변수에 대한 조절 후에, 태반 생성물이 봉합에 대한 시간에 대해 상당한 효과를 갖는 것을 발견하였다(p<0.0001). 위험비는 4.77였는데(95% CI 2.279, 9.971), 이는 표준 상처 치료법에 대해 태반 생성물에 의한 봉합의 우수한 오즈를 나타낸다.
안전성 평가: 전반적으로, 대조군 환자에 비해 적어도 하나의 유해 사건을 경험한 태반 생성물 환자는 더 소수였다(44.0% 대 66.0%, p=0.031). 태반 생성물에 대해 무작위화된 환자 중에서, 상처 관련 감염을 지니는 환자는 상당히 더 적었고(18.0% 대 36.2%, p=0.044), 상처 감염과 관련된 심각한 유해 사건이 더 적으며(8% 대 21.3%, p=0.084) 대조군보다 태반 생성물 그룹에서 감염과 관련된 입원은 더 적었다(6% 대 15%, p=0.15). (표 19).
논의
인 연구의 결과는 본 명세서에 개시한 바와 같은 태반생성물의 매주 적용이 당뇨성 족부 궤양의 치유율을 효과적으로 개선시키며, 표준 상처 치료법에 비해 당뇨성 족부 합병증을 감소시켰다는 것을 입증한다. 이 연구에서, 모든 1차 및 2차 종말점은 지금까지 통계학적으로 유의한 사전 구체화된 중간 분석을 충족시키는 다중심 DFU 시험에서만 태반 생성물의 임상적 이점을 나타내었다. 이는 또한 당뇨성 족부 궤양의 치료를 위해 인간 양막을 연구하기 위한 다중심 무작위 제어 시험(RCT)의 첫 번째 보고이다. 추가적으로, 본 발명자들의 지식에 대해, 이는 진보된 피부 대체물에 대한 첫 번째의 거대, 다중심 RCT이며, 여기서 1차 종말점, 100% 재상피화는 서드 파티(3rd party) 맹검 상처 관리 전문가에 의해 확인하여, 추가로 잠재적 편향을 추가로 제거하고, 종말점 결과의 신뢰성을 증가시켰다. 태반 생성물 그룹은 도 34에서 도시한 바와 같이 상당히 더 높은 완전한 봉합률(191% 상대적 개선)을 가졌다.
이 연구에서, 수술 괴사 조직 제거를 연구 방문 시 모든 환자에 대해 행하였다. 다른 연구는 소수의 DFU가 3상 DFU 시행에서 수술 괴사 조직 제거를 받았다는 것과(Steed, D.L., et al., Effect of extensive debridement and treatment on the healing of diabetic foot ulcers. Diabetic Ulcer Study Group. J Am Coll Surg, 1996. 183(1): p. 61-4; Saap, L.J. and V. Falanga, Debridement performance index and its correlation with complete closure of diabetic foot ulcers. Wound Repair Regen, 2002. 10(6): p. 354-9), 상처 괴사 조직 제거의 빈도가 상처 치유와 관련된다는 것을 보고하였다. (문헌[Steed et al., 상기 참조, 표 20] 참조).
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 23 힘줄수복 방법에서 동결보존된 막
동결보존된 막을 이식을 위한 준비가될 때까지 -80˚C(±5˚C)에서 유지한다. 냉동막을 해동시키고 나서, 패키징 삽입물을 제공하는 프로토콜을 이용하여 린스한다. 추가적인 정보를 오시리스 세라퓨틱스에 의해 제공되는 그래픽스 제조 가이드(Grafix Preparation Guide)에서 찾을 수 있다. 해동 후, 린스 단계를 수행하고 나서, 이식편을 사용 1시간 전까지 린스 수반에 보유할 수 있다. 일단 막이 해동되고 린스되면, 이식을 위한 준비가 된다.
동결보존된 막이 방향성(예를 들어, 양막)을 갖는지의 여부에 따라서, 패키징은 막의 방향성을 나타낼 수 있다(예를 들어, 측면이 상피이거나 또는 비접착측이고/이거나 기질 또는 막의 접착측임). 양막을 이용할 때, 기질층은 수복된 조직 표면과 접촉되도록 배치될 수 있다.
다음의 기법은 힘줄 수복 커버링 후 본 명세서에 개시된 동결보존된 막을 이용할 때 성공적으로 증명되는 것으로 예상되는 예를 제공한다.
적용을 위한 막의 제조
적용 과정의 시작 전에, 상처 및 수복 부위의 임의의 관류가 완료되어야 하며, 임의의 흡인이 수행되어야 한다. 이는 막이 흡인 시 포획되지 않거나 적용 후 파괴되지 않는 것을 보장한다. 동결보존된 막(예를 들어, 나이트로셀룰로스)과 함께 포함된 임의의 장착 지지체는 해동이 완료된 후 조심해서 제거한다. 나이트로셀룰로스 지지체 상에 동결보존된 양막을 포함하는 막이 제공될 때, 분취 방법은 하기를 포함할 수 있다:
1. 2-인치 리본(가단성 있음)을 이용하여, 막의 상피측을 리본과 접촉되게 배치시킨다. 이 위치에서, 막의 기질측을 막 상부 상의 나이트로셀룰로스 프레임을 이용하여 노출시킨다.
2. 단일 또는 2개의 비외상성 겸자를 이용하고, 막을 (예를 들어, 손가락을 이용하여) 안정화시키는 동안, 나이트로셀룰로스 프레임을 막으로부터 천천히 당기기 시작한다. 볼링/수축을 방지하기 위해 그리고 기질층의 적절한 동정을 보장하기 위해 항상 막을 리본과 접촉되도록 유지하는 것이 바람직할 수 있다.
3. 일단 후판을 제거하면, 겸자, 손가락 또는 프리엘리베이터(freer-elevator)를 이용하여 막을 조심해서 주름을 편다. 막은 이제 기질층이 위에 있고, 힘줄에 전달될 준비가 된다. 예를 들어, 도 38 A 내지 B 참조.
힘줄에 대한 막의 전달
힘줄의 수술적 수복 후에, 수복된 힘줄 세그먼트를 조심스럽게 집어넣어서 리본이 수복 부위 아래로 통과하게 한다. 막의 기질측은 이제 수복된 힘줄과 접할 것이다. (도 38 C). 비외상 겸자를 이용하여, 막의 하나의 전체 측면을 조심해서 들어올려 그것이 힘줄 세그먼트 위에 놓이게 할 것이다. 막(접착측)은 힘줄에 자연스럽게 접착될 것이지만, 주름을 펴고 필요하다면 재위치시킬 수 있다. (도 38 D). 겸자 또는 다른 기기 중 하나를 이용하여 적용된 막을 안정화시키는 동안, 남아있는 막 부분을 반대 방향으로 싸서 남아있는 힘줄 세그먼트를 감싼다. 임의의 여분의 막은 이전에 막이 적용된 부문과 겹쳐지게 할 수 있다. (도 38 E). 이 적용은 장벽 시스(sheath)에서 수복된 힘줄을 완전히 둘러쌀 것이다. 기질층의 접착 특성 및 임의의 재흡수성 봉합으로부터의 잠재적 염증 반응 때문에, 이러한 봉합은 이식편이 제자리에 유지되는데 권장되지 않을 수도 있다.
힘줄이 여전히 들어가 있는 동안, 리본을 조심해서 제거하고, 힘줄을 시스 내로 다시 재배치시킬 것이다. 힘줄 시스를 봉합 시 막을 부적절하게 혼입하지 않도록 조심해서 봉합한다. (도 38F). 관류 또는 흡인이 필요한 것으로 증명되면, 막의 예리한 관찰은 막 파괴 또는 손실을 피하는데 필수적일 것이며, 또는 레이-테크(Ray-tec) 스펀지를 이용하여 조심해서 닦는 것이 권장될 수 있다. 흡인 사용의 제한은 막 파괴 가능성을 감소시키는 것으로 예상된다.
논의
힘줄 파열의 수술적 재구성은 대부분의 족부 및 발목 수술 실행에서 흔하다. 가장 흔한 수술 후 합병증 중 하나는 연조직 구조 주위에 대한 수복 힘줄의 접착이다. 본 명세서에 개시된 동결보존된 막, 예를 들어, 동결보존된 양막을 포함하는 막은 자연적으로 항접착성 및 항염증 특성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서 염증 및 반흔 형성의 결과적인 증가가 해로운 영역에서 사용하는 것이 이상적으로 적합하다. 막은 증가된 구조적 무결성을 반드시 제공하지는 않을 것이고, 그렇게 해서, 힘줄 파열 수복에서 막의 단 하나의 용도는 구조적 강화가 필요하지 않을 때, 또는 구조적 강화를 제공하는 다른 생성물과 조합하여 막을 이용할 때 적절하다. 최근의 연구는 동결보존된 막을 무세포 진피 이식편 및 PRP와 함께 사용하였을 때 진피 이식편의 숙주 혼입률이 개선되었다는 것을 나타내었다. 연구는 이식 부위의 생리적으로 동일한 조직 내로 이식편의 조직학적 리모델링을 시사한다. 더 나아가, 증가된 혼입 속도, 조직 분화 및 리모델링을 관찰하였다. 이들 특징은 조직 접착의 저해/방지, 수술후 기간 동안 흉터의 저해/방지, 및 힘줄 수복에 관한 용도로 동결보존된 막을 사용하게 한다.
실시예 23.1 힘줄수수 방법에서 동결보존된 막
통증이 있는 결절 및 만성 건증을 지니는 72세의 여성 환자가 내원하였다. 환자는 결절을 제거하는 수술을 받았다(도 39A). 동결보존된 막을 상기 논의한 바와 같이 해동시킬 수 있고, 바늘과 같은 형태로 말았다(도 39B). 이어서, 막을 힘줄 내부에 삽입하고 나서, 힘줄을 봉합사를 이용하여 봉합시킨다(도 39C). 막은 가속화된 상처 치유 및 조직 수복을 촉진시킬 뿐만 아니라 수복된 힘줄에 대한 접착을 방지할 것으로 예상된다.
참고문헌
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Claims (79)

  1. 동결건조된 융모막을 포함하는 막으로서, 동결건조 및 후속적 해동 후에, 상기 융모막은 하기를 포함하는, 동결건조된 융모막을 포함하는 막:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포;
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 모체 혈액 세포, 신생아 혈액 세포, 조직 대식세포 및 영양막으로부터 선택되는, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  3. 제2항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 CD11b+, CD14+, CD18+, CD40+ 및 CD86+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조직 대식세포를 포함하는, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  4. 제1항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 면역 반응을 생성하는데 충분한 수준 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성하는, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  5. 제4항에 있어서, 상기 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 350pg/㎠ 이하의 양으로 TNF-α를 생성하는, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  6. 제1항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 검출가능한 한계 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성하는, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  7. 제2항에 있어서, 상기 막은 태반 영양막이 실질적으로 고갈된, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포외 기질은 하나 이상의 세포외 기질 단백질을 포함하는, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  9. 제1항에 있어서, 상기 생존 세포(viable cell)는 하나 이상의 상피세포, 간충직 줄기 세포, 섬유아세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조직 세포의 약 50% 내지 약 100%는 생존가능한, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조직 세포의 약 60% 내지 약 100%는 생존가능한, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조직 세포의 약 70% 내지 약 100%는 생존가능한, 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  13. 제1항에 있어서, 생존 세포의 10% 미만은 기능성 CD14+ 대식세포인, 동결보존된 양막을 포함하는 막.
  14. 제1항에 있어서, 생존 세포의 1% 미만은 기능성 CD14+ 대식세포인, 동결보존된 양막을 포함하는 막.
  15. 동결건조된 융모막을 포함하는 막으로서, 동결건조 및 후속적 해동 후에, 상기 융모막은,
    A) 생존 세포, 하나 이상의 치료 인자, 및 세포외 기질을 포함하는 기질층; 및
    B) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하되,
    상기 기질층 내 세포의 40% 초과는 생존 세포인, 동결건조된 융모막을 포함하는 막.
  16. 동결보존된 태반막을 포함하는 막으로서, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 태반막은 하기를 포함하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막:
    A) 조직 세포로서, 상기 태반막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포;
    B) 상기 태반막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 태반에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형.
  17. 제16항에 있어서, 상기 태반막은 양막 및 융모막을 포함하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  18. 제16항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 모체 혈액 세포, 신생아 혈액 세포, 조직 대식세포 및 영양막으로부터 선택되는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  19. 제18항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 CD11b+, CD14+, CD18+, CD40+ 및 CD86+로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조직 대식세포를 포함하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  20. 제16항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 면역 반응을 생성하는데 충분한 수준 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  21. 제20항에 있어서, 상기 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 350pg/㎠ 이하의 양으로 TNF-α를 생성하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  22. 제16항에 있어서, 상기 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형은 검출가능한 한계 미만의 양으로 면역원성 인자를 생성하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  23. 제16항에 있어서, 상기 막은 태반 영양막이 실질적으로 고갈된, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  24. 제16항에 있어서, 상기 세포외 기질은 하나 이상의 세포외 기질 단백질을 포함하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  25. 제16항에 있어서, 상기 생존 세포는 하나 이상의 상피세포, 간충직 줄기 세포, 섬유아세포, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  26. 제16항에 있어서, 상기 조직 세포의 약 50% 내지 약 100%는 생존가능한, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  27. 제16항에 있어서, 상기 조직 세포의 약 60% 내지 약 100%는 생존가능한, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  28. 제16항에 있어서, 상기 조직 세포의 약 70% 내지 약 100%는 생존가능한, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  29. 제16항에 있어서, 생존 세포의 10% 미만은 기능성 CD14+ 대식세포인, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  30. 제16항에 있어서, 생존 세포의 1% 미만은 기능성 CD14+ 대식세포인, 동결보존된 태반막을 포함하는 막.
  31. 하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막으로서, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 하나 이상의 조직 성분은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자; 및
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질을 포함하되;
    상기 융모막은 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포 유형을 가지며;
    상기 하나 이상의 조직 성분은 치료적 이점을 제공하는데 효과적인 양으로 존재하는, 하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  32. 하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막으로서, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 하나 이상의 조직 성분은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포;
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자; 및
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질을 포함하되,
    상기 융모막은 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포 유형을 가지며;
    상기 하나 이상의 조직 성분은,
    (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나;
    (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나;
    (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나;
    (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나;
    (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나
    (vi) 세포 증식을 증가시키고/시키거나;
    (vii) 신생혈관생성을 증가시키고/시키거나;
    (viii) 세포 이동을 증가시키는데 효과적인 양으로 존재하는,
    하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  33. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 조직 성분은 시험관내에서:
    (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소;
    (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가;
    (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소;
    (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가;
    (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소;
    (vi) 세포 증식의 증가;
    (vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는
    (viii) 세포 이동의 증가를 촉진하는데 효과적인 양으로 존재하는,
    하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  34. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 조직 성분은 생체내에서:
    (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소;
    (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가;
    (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소;
    (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가;
    (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소;
    (vi) 세포 증식의 증가;
    (vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는
    (viii) 세포 이동의 증가를 촉진시키는데 효과적인 양으로 존재하는,
    하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  35. 제31항에 있어서, 상기 막이 치료적 이점이 필요한 대상체에게 적용될 때, 상기 하나 이상의 조직 성분은:
    (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나;
    (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나;
    (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나;
    (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나;
    (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나;
    (vi) 세포 증식을 증가시키고/시키거나;
    (vii) 신생혈관생성을 증가시키고/시키거나;
    (viii) 세포 이동을 증가시키는데 효과적인 양으로 존재하는,
    하나 이상의 조직 성분을 갖는 동결보존된 융모막을 포함하는 막.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융모막은 전달 기질에 고정되는, 막.
  37. 제36항에 있어서, 상기 전달 기질은 나이트로셀룰로스인, 막.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존된 융모막은 후속적 해동 전에 장기간의 시간 동안 저장되는, 막.
  39. 제38항에 있어서, 상기 장기간의 시간은 약 6개월 내지 적어도 약 36개월인, 막.
  40. 제38항에 있어서, 상기 조직 세포의 생존도는 해동 시 실질적으로 유지되는, 막.
  41. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 세포의 상기 생존도는 냉동 저장 되었을 때 적어도 약 24개월 동안 실질적으로 유지되는, 막.
  42. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존된 융모막은 해동되고, 해동 방법의 시작 30분 내에 사용을 위한 준비가 될 수 있는, 막.
  43. 대상체에서 상처의 치료방법으로서, 상처 부위에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하되;
    투여 시 상기 막은 하기 중 하나 이상을 촉진시키는데 효과적인 양으로 상기 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 상처의 치료방법:
    (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소;
    (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가;
    (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소;
    (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가;
    (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소;
    (vi) 세포 증식의 증가;
    (vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는
    (viii) 세포 이동의 증가.
  44. 제43항에 있어서, 상기 상처는 열상, 찰과상, 화상, 창상, 구멍, 발사체에 의해 야기되는 상처, 표피 상처, 피부 상처, 만성 상처, 급성 상처, 외부 상처, 내부 상처, 선천성 상처, 궤양, 욕창, 당뇨성 궤양, 터널 상처, 수술 절차 동안 또는 수술 절차에 부가하여 야기된 상처, 정맥 피부 궤양, 척수손상, 눈 상처, 눈 손상, 귀 손상, 이비인후과 상처 또는 손상, 눈 손상 및 무혈관성 괴사의 군으로부터 선택되는 군으로부터 선택된, 상처의 치료방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 상처는 열상, 화상, 만성 상처, 급성 상처, 당뇨성 궤양, 수술 절차 동안 또는 수술 절차에 부가하여 야기된 상처 및 정맥 피부 궤양으로 이루어진 군으로부터 선택된, 상처의 치료방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 막은 하기 중 하나 이상을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진시키는, 상처의 치료방법:
    (i) 전염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 감소;
    (ii) 항염증 사이토카인의 양 및/또는 활성의 증가;
    (iii) 반응성 산소종의 양 및/또는 활성의 감소;
    (iv) 항산화제의 양 및/또는 활성의 증가;
    (v) 프로테아제의 양 및/또는 활성의 감소;
    (vi) 세포 증식의 증가;
    (vii) 신생혈관생성의 증가; 및/또는
    (viii) 세포 이동의 증가.
  47. 치유가 필요한 상처를 갖는 대상체에서 상처 치유를 가속화시키는 방법으로서,
    a) 상처 부위에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 막을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 12주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적인, 상처 치유를 가속화시키는 방법.
  48. 치유가 필요한 상처를 갖는 대상체에서 상처 치유를 가속화시키는 방법으로서,
    a) 상처 부위에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 막을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 5 내지 6주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적인, 상처 치유를 가속화시키는 방법.
  49. 치유가 필요한 상처를 갖는 대상체에서 상처 치유를 가속화시키는 방법으로서,
    a) 상처 부위에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 막을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 28일까지 50% 이상만큼 상처 크기의 감소를 촉진시키는데 효과적인, 상처 치유를 가속화시키는 방법.
  50. 치유가 필요한 상처를 갖는 대상체에서 상처 봉합률을 개선시키는 방법으로서,
    a) 상처 부위에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 막을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 투여하는 단계는 표준 상처 치료에 비해 적어도 약 44%만큼 상처봉합율을 개선시키는데 효과적인, 상처 봉합률을 개선시키는 방법.
  51. 상처 치유 치료 전에 난치성인 상처에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서,
    a) 상처 부위에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 막을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 투여하는 단계는 초기 투여하는 단계 후 12주까지 상처 봉합을 촉진시키는데 효과적인, 상처 치유 치료 전에 난치성인 상처에 대해 대상체를 치료하는 방법.
  52. 만성 상처의 치료방법으로서, 상처 부위에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고,
    상기 투여하는 단계는 만성 상처의 치유를 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포(viable therapeutic cell), 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 만성 상처의 치료방법.
  53. 대상체에서 염증성 안질환을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
    상기 투여는 염증성 안 질환을 치료하는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 염증성 안질환을 치료하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 염증성 안질환은 염증을 특징으로 하는 상처 또는 질환인, 대상체에서 염증성 안질환을 치료하는 방법.
  55. 대상체에서 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고,
    상기 투여는 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 방법은 조직 이식편 절차, 힘줄 수술, 인대 수술, 골 수술 및 척수 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 수술 절차와 병용하여 사용되는, 대상체에서 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 조직은 인간 조직인, 대상체에서 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 인간 조직은 연골, 피부, 인대, 힘줄 또는 뼈인, 대상체에서 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 막은 조직 재생을 직접적으로 또는 간접적으로 자극하는, 대상체에서 조직 수복 및/또는 조직 재생을 촉진시키는 방법.
  60. 염증성 반응을 조절하는 방법으로서, 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고,
    상기 투여는 전염증 사이토카인의 양을 감소시키고/시키거나 항염증 사이토카인의 양을 증가시키는데 효과적인 양으로 상기 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 염증성 반응을 조절하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 전염증 사이토카인은 TNF-α 및 IL-1α 저해, 또는 이들의 조합물로 본질적으로 이루어진, 염증성 반응을 조절하는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 항염증 사이토카인은 IL-10 또는 PGE2 또는 이들의 조합물로 본질적으로 이루어진, 염증성 반응을 조절하는 방법.
  63. 프로테아제 활성을 조절하는 방법으로서, 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
    상기 투여는 프로테아제 활성을 감소시키고/시키거나 프로테아제 저해제의 양을 증가시키는데 효과적인 양으로 상기 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 프로테아제 활성을 조절하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 프로테아제는 기질 메탈로프로테이나제(MMP) 및 엘라스타제, 또는 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로테아제 활성을 조절하는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로테아제 저해제는 기질 메탈로프로테이나제(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase: TIMP)의 조직 저해제를 포함하는, 프로테아제 활성을 조절하는 방법.
  66. 반응성 산소종(reactive oxygen species: ROS)의 양 및/또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
    상기 투여는 ROS의 양 및/또는 활성을 감소시키고/시키거나 항산화제의 양 및/또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 생존 세포, 세포외 기질 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자는 아스코르브산의 250mM 용액과 동일한 항산화제 능력을 제공하는데 효과적인 양으로 제공되는, 반응성 산소종의 양 및/또는 활성을 감소시키는 방법.
  68. 신생혈관생성을 증가시키는 방법으로서, 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
    상기 투여는 신생혈관생성을 증가시키는데 효과적인 양으로 상기 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 신생혈관생성을 증가시키는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자는 혈관 표피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor: bEGF) 또는 이들의 조합물의 양 및/또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 제공되는, 신생혈관생성을 증가시키는 방법.
  70. 상처 부위에 대한 세포 이동을 증가시키는 방법으로서, 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
    상기 투여는 세포 이동을 증가시키는데 효과적인 양으로 상기 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 상처 부위에 대한 세포 이동을 증가시키는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 세포 이동은 내피세포, 섬유아세포 및 상피세포, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함하는, 상처 부위에 대한 세포 이동을 증가시키는 방법.
  72. 세포 증식을 증가시키는 방법으로서, 상처에 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 면역원성 세포의 하나 이상의 유형을 포함하고;
    상기 투여는 세포 증식을 증가시키는데 효과적인 양으로 상기 생존 세포, 세포외 기질, 및/또는 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 세포 증식을 증가시키는 방법.
  73. 대상체에서 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 동결보존된 융모막을 포함하는 막을 투여하는 단계를 포함하되, 동결보존 및 후속적 해동 후에, 상기 융모막은:
    A) 조직 세포로서, 상기 융모막에 대해 천연이며, 상기 조직 세포의 40% 초과가 생존가능한, 상기 조직 세포
    B) 상기 융모막에 대해 천연인 하나 이상의 치료적 인자;
    C) 상기 융모막에 대해 천연인 세포외 기질; 및
    D) 고갈된 양의 기능성 CD14+ 대식세포를 포함하고;
    상기 투여는 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는데 효과적인 양으로 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자를 제공하는, 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자는 흉터 형성을 예방 또는 감소시키는데 효과적인 양으로 IFN-2α를 증가시키는데 효과적인 양으로 존재하는, 대상체에서 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 생존 치료 세포, 세포외 기질 및 하나 이상의 치료 인자는 흉터 형성을 예방 또는 감소시키는데 효과적인 양으로 TGF-β3을 증가시키는데 효과적인 양으로 존재하는, 대상체에서 흉터 또는 구축 형성을 예방 또는 감소시키는 방법:
  76. 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상처에 대한 상기 막의 투여는 상기 방법을 직접적으로 또는 간접적으로 자극 또는 유도하는, 방법.
  77. 하기를 포함하는 상처 또는 조직 결함의 치료를 위한 키트:
    A) 약제학적으로 허용가능한 용기에서의 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 막; 및
    B) 상기 상처 또는 조직 결함을 치료하기 위해 막을 투여하기 위한 설명서.
  78. 제77항에 있어서, 상기 키트는 부가물을 더 포함하는, 상처 또는 조직 결함의 치료를 위한 키트.
  79. 제78항에 있어서, 상기 부가물은 하나 이상의 항생제, 완화제, 각질용해제, 습윤제, 항산화제, 보존제, 치료제, 붕대, 도구, 절단 장치, 완충제, 해동 매질, 조절 매질, 겸자, 용기 및 이들의 조합물로부터 선택되는, 상처 또는 조직 결함의 치료를 위한 키트.
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