CN102670654A - 一种用于创面修复的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于创面修复的干细胞制剂及其制备方法。该干细胞制剂以脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞为活性细胞,加入生物相容性良好的高分子材料海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉作为细胞稳定剂;本发明干细胞制剂具有较高的细胞活率,且作用持久,突破了间充质干细胞用于治疗的有效性的技术瓶颈。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂领域,特别涉及一种用于创面修复的干细胞制剂及其制备方法。
背景技术
有研究报道,严重创伤,大面积烧伤、整形术后的创面覆盖已经成为了一个十分重要的问题,除了患者自体植皮外,人们采用过同种异体植皮,以及其他相关修复材料来覆盖创面,但是无论自体或异体皮肤移植均受到供体来源和免疫排斥反应的限制。亟待寻找一种理想的无排斥反应、促进皮肤损伤修复、促进皮肤再生的天然药物。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一组源于基质的异质细胞群,可以从人体大多数组织获取。大量实验研究显示,间充质干细胞具有表皮细胞分化潜能,可促进受创皮肤的愈合。骨髓源性间充质干细胞由于存在病毒污染的隐患,且随着供者年龄增长,其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势,不适合批量制备。而来源于人脐带、胎盘或羊膜的间充质干细胞,成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制,成为了骨髓源间充质干细胞的很好的替代物;它们具有自我更新、组织修复、免疫调节能力,可以向中胚层谱系分化,例如分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等,此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化,例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化;而且细胞在体外易于扩增,扩增后分化能力、增殖能力保持稳定,适合大规模制备。
目前临床上已有将MSCs应用于病人的报道,在深度烧伤的患者的创面涂布自体MSCs悬液,能够促进皮肤再生和血管的新生。但是单纯的细胞悬液很难附着在创口表面持续发生作用,并且单纯的细胞悬液中活细胞的数量随着用药时间的延长而降低,不能保证足够的活细胞发挥治疗作用。
申请号为200810136415.6的发明专利公开了一种使用甲基纤维素作为细胞基质的人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法,但是该发明含有抗生素庆大霉素,不适用于抗生素过敏人群;而且涂抹剂快速配制中含有动物源成分胎牛血清,有可能造成过敏以及具有动物源性安全隐患;快速配制中操作步骤多,过程繁杂,带来微生物污染风险,运输前不能按照药典要求完成2周的无菌检测,制品质量无法保证。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷,本发明提供了一种活性稳定的用于创面修复的干细胞制剂及其制备方法,为治疗皮肤损伤提供了有效的治疗手段。
具体地,本发明提供了一种用于创面修复的干细胞制剂,所述干细胞制剂包含脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞以及高分子稳定剂,所述高分子稳定剂选自海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉。
所述脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞由脐带、胎盘或羊膜等组织,经体外分离、筛选、传代、扩增后制备而得,它们贴壁生长,表达CD29、CD73、CD90、CD105等细胞表面蛋白分子,而不表达CD11b、CD34、CD45、HLA-DR等细胞表面蛋白分子;它们具有自我更新、组织修复、免疫调节能力,可以向中胚层谱系分化,如向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化,也可以向其它胚层谱系分化,如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。
高分子材料海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉生物相容性良好,可作为稳定剂制备外用药物制剂,已在临床上广泛应用,如重组人干扰素α2b凝胶、重组人干扰素α2b喷雾剂、重组人表皮生长因子外用溶液、重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶等。本发明将上述高分子材料用于上述脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞的稳定剂,可以保持间充质干细胞在有效期内的细胞活率。
优选地,上述干细胞制剂中所述间充质干细胞的含量为每毫升含0.4×106~2.5×107个细胞。
优选地,上述干细胞制剂还包含细胞防冻剂和保湿剂。
所述细胞防冻剂优选DMSO,所述保湿剂优选丙二醇或丙三醇。
本发明的另一个目的在于提供一种上述干细胞凝胶制剂的制备方法,采用如下方案:
步骤1:用细胞培养基将所述脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞制成细胞悬液;
步骤2:将经过无菌处理的高分子稳定剂加入细胞培养基中制成凝胶溶液;
步骤3:将步骤2制得的凝胶溶液加入步骤1制得的细胞悬液中制得干细胞凝胶制剂。
作为优选,步骤1所得细胞悬液中所述间充质干细胞的含量为每毫升含1.2×106~7.5×107个细胞。
作为优选,步骤1和步骤2中所述细胞培养基为无血清的DMEM或DF12培养基。
更优选地,步骤2所述细胞培养基还包含细胞防冻剂和保湿剂;所述细胞防冻剂优选为DMSO,所述保湿剂优选为丙二醇或丙三醇。
作为优选,步骤3所述凝胶溶液与细胞悬液的体积比为2∶1
优选地,上述方案的具体操作步骤如下:
(1)细胞悬液的制备:从脐带、胎盘或羊膜分离、纯化所述间充质干细胞,使用含10%胎牛血清的DMEM或DF12培养基(完全培养基)常规培养,待细胞融合度达90%左右时,用胰蛋白酶消化,使用上述完全培养基进行中止,离心收集细胞,再用无血清DMEM或DF12培养基悬浮细胞沉淀,调整细胞悬液中所述间充质干细胞的含量,为每毫升细胞悬液含1.2×106~7.5×107个所述间充质干细胞;
(2)凝胶制备:称取1~10g海藻酸钠,于121℃高压灭菌15分钟后加入到含10%DMSO、5%丙二醇的100ml无血清DMEM或DF12培养基中,制成均一的海藻酸钠凝胶溶液;
(3)干细胞制剂的配制:将上述凝胶制剂逐滴添加到上述细胞悬液中,边添加,边进行混合,所述凝胶制剂与细胞悬液的体积比为2∶1;混合均匀后,分装到预充注射器中,放到-80℃冰箱中冻存待用。
使用时,将装有上述干细胞凝胶制剂的预充注射器从-80℃冰箱中取出,立即在37℃水浴中复苏,将干细胞凝胶从注射器中打出,均匀涂抹于患处。
本发明将高分子材料凝胶添加到活细胞悬液中,可以提高细胞活率,延长细胞存活时间,达到长时间促进表皮细胞生长,缩短创口愈合时间,促进经久不愈的溃疡愈合等作用。
本发明可通过调节处方和粘度,制成喷雾剂或擦剂,分装于不同形式的容器中。
本发明所述干细胞制剂具有以下优势:
(1)采用高分子材料作为细胞稳定剂,保证了有效期内的细胞活率,突破了间充质干细胞用于治疗的有效性的技术瓶颈;
(2)配方中不含动物源成分,不含抗生素、防腐剂;凝胶制备后采用低温保存方式,可以有充足的时间进行放行检验,满足药典法微生物检测、支原体检测的时间要求,保证了制品质量;
(3)通过冷链运输,制品达到用户处,无需繁杂操作,只需37℃水浴复苏细胞后,打开,直接用于患处。
附图说明
图1为本发明干细胞制剂对兔皮肤损创面的影响。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1本发明所述干细胞制剂的制备
细胞悬液的制备:使用含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基),于37℃、5%CO2的条件下对兔脐带间充质干细胞进行常规培养,待细胞融合度达到90%左右时,用0.25%的胰蛋白酶进行消化,后用上述完全培养基中止,将所得细胞悬液进行离心,弃上清,再用无血清DMEM培养基对细胞沉淀进行悬浮,调整细胞悬液中兔脐带间充质干细胞的含量,为每毫升细胞悬液含1.5×107个兔脐带间充质干细胞,配成均一细胞悬液待用;
凝胶制备:称取10g海藻酸钠,121℃高压灭菌15分钟后加入到含10%DMSO、5%丙二醇的100ml无血清培养基中,配制均一的海藻酸钠凝胶溶液;
干细胞制剂的制备:将上述配好的凝胶制剂逐滴添加到细胞悬液中,所述凝胶溶液与细胞悬液的体积比为2∶1,边添加,边进行混合,直到混合均匀后,分装到预充注射器中,放到-80℃冰箱中冻存待用。
所得干细胞制剂中兔脐带间充质干细胞的含量为每毫升含5×106个细胞。
实施例2本发明所述干细胞制剂的制备
细胞悬液的制备:使用含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基),于37℃、5%CO2的条件下对兔脐带间充质干细胞进行常规培养,待细胞融合度达到90%左右时,用0.25%的胰蛋白酶进行消化,后用上述完全培养基进行中止,将所得细胞悬液进行离心,弃上清,再用无血清DMEM培养基对细胞沉淀进行悬浮,调整细胞悬液中兔脐带间充质干细胞的含量,为每毫升细胞悬液含3×106个兔脐带间充质干细胞,配成均一细胞悬液待用;
凝胶制备:称取10g海藻酸钠,121℃高压灭菌15分钟后加入到含10%DMSO、5%丙二醇的100ml无血清培养基中,配制均一的海藻酸钠凝胶溶液;
干细胞制剂的制备:将上述配好的凝胶制剂逐滴添加到细胞悬液中,所述凝胶溶液与细胞悬液的体积比为2∶1,边添加,边进行混合,直到混合均匀后,分装到预充注射器中,放到-80℃冰箱中冻存待用。
所得干细胞制剂中兔脐带间充质干细胞的含量为每毫升含1×106个细胞。
实施例3本发明所述干细胞制剂的制备
细胞悬液的制备:使用含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基),于37℃、5%CO2的条件下对兔脐带间充质干细胞进行常规培养,待细胞融合度达到90%左右时,用0.25%的胰蛋白酶进行消化,后用上述完全培养基进行中止,将所得细胞悬液进行离心,弃上清,再用无血清DMEM培养基对细胞沉淀进行悬浮,调整细胞悬液中兔脐带间充质干细胞的含量,为每毫升细胞悬液含7.5×107个兔脐带间充质干细胞,配成均一细胞悬液待用;
凝胶制备:称取5g海藻酸钠,121℃高压灭菌15分钟后加入到含10%DMSO、5%丙三醇的100ml无血清培养基中,配制均一的海藻酸钠凝胶溶液;
干细胞制剂的制备:将上述配好的凝胶制剂逐滴添加到细胞悬液中,所述凝胶溶液与细胞悬液的体积比为2∶1,边添加,边进行混合,直到混合均匀后,分装到预充注射器中,放到-80℃冰箱中冻存待用。
所得干细胞制剂中兔脐带间充质干细胞的含量为每毫升含2.5×107个细胞。
实施例4本发明所述干细胞制剂对受创皮肤的影响
造模:选取6只成年兔为动物造模对象,背部备毛,制造直径为3cm全皮损创面,每只兔子制造4处损创面,分别设置为:
(1)空白对照组,以PBS溶液为空白对照;
(2)DF12组,以DF12培养基为背景对照;
(3)干细胞凝胶制剂高剂量组,采用实施例1所得干细胞制剂,所含细胞浓度为5×106个/ml;
(4)干细胞凝胶制剂低剂量组,采用实施例2所得干细胞制剂,所含细胞浓度为1×106个/ml。
每组在创面上分别给予200μl受试物,涂抹均匀,覆盖纱布,包扎。正常饲养28天,每隔2-3日测量创面大小。比较各组皮肤恢复的程度,结果见图1。
结果:细胞凝胶在第6天开始显效,伤口愈合速度快于DF12组和空白对照组,提示细胞凝胶制剂能促进伤口愈合,缩短病程;而单纯的细胞悬液,放置24h后几乎无细胞存活。
结论:与单纯的细胞悬液相比,该细胞凝胶制剂保持了有效期内的细胞活率,活性稳定,可持续发挥治疗效应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于创面修复的干细胞制剂,包含脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞以及高分子稳定剂,所述高分子稳定剂选自海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉。
2.如权利要求1所述的干细胞制剂,其中所述间充质干细胞的含量为每毫升含0.4×106~2.5×107个细胞。
3.如权利要求1所述的干细胞制剂,其特征在于,还包含细胞防冻剂和保湿剂。
4.如权利要求3所述的干细胞制剂,其特征在于,所述细胞防冻剂为DMSO,所述保湿剂为丙二醇或丙三醇。
5.一种如权利要求1所述干细胞凝胶制剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:用细胞培养基将所述脐带、胎盘或羊膜间充质干细胞制成细胞悬液;
步骤2:将经过无菌处理的高分子稳定剂加入细胞培养基中制成凝胶溶液;
步骤3:将步骤2制得的凝胶溶液加入步骤1制得的细胞悬液中制得干细胞凝胶制剂。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤1所制细胞悬液中所述间充质干细胞的含量为每毫升含1.2×106~7.5×107个细胞。
7.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤1和步骤2中所述细胞培养基为无血清的DMEM或DF12培养基。
8.如权利要求5或7所述的制备方法,其特征在于,步骤2所述培养基中还包含细胞防冻剂和/或保湿剂。
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述细胞防冻剂为DMSO,所述保湿剂为丙二醇或丙三醇。
10.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤3中所述凝胶溶液与细胞悬液的体积比为2∶1。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120919 |