CN113924132B - 用于伤口护理的新型多糖基水凝胶支架 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含多糖聚合物网络和胶原的水凝胶，特别是用于伤口治疗的水凝胶。本发明还涉及包含该水凝胶的伤口敷料和细胞培养系统以及它们在伤口治疗中的用途。

Description

用于伤口护理的新型多糖基水凝胶支架
技术领域
本发明涉及一种包含多糖聚合物网络和胶原的水凝胶，特别是用于伤口治疗的水凝胶。本发明还涉及包含该水凝胶的伤口敷料和细胞培养系统以及它们在伤口治疗中的用途。
背景技术
人体能够在受伤后通过复杂过程以最小的疤痕恢复皮肤完整性，该复杂过程涉及凝血和止血、炎症、增殖和重塑。然而，愈合过程可能被局部或全身因素中断，并且可能需要药物治疗。
因此，已开发出多种伤口护理产品来改善那些遭受伤口之苦的人的生活质量。伤口敷料为伤口提供最佳的微环境，或者通过递送生物活性分子来加速伤口愈合。
伤口护理产品的当前技术水平反映了从简单敷料(即绷带)到包含药物活性成分的活性产品和装置的转变。例如为愈合提供潮湿环境、最大程度地降低感染风险以及去除多余的不需要的流体，已证实可发挥关键作用。从一系列先进产品中可以明显看出，水凝胶敷料占主导地位。凝胶的高含水量与伤口的暴露表面特别相容，并且显著增强愈合。通过使用包含相对高浓度的亲水性聚合物材料的凝胶，该凝胶可以特别有效地起到吸水的作用，例如吸收在敷料与伤口接触时的使用中的伤口渗出物。因为凝胶是含水系统，所以敷料的使用不会引起不期望的伤口整体干燥的效果。
水凝胶由源自天然或合成来源的物理或化学交联聚合物组成。这些水凝胶中的大部分是合成来源的，具有有限的细胞相容性和生物降解能力。另一个巨大分歧存在于依赖动物来源的材料来支持细胞生长，这继续带来诸如免疫原性和感染风险的问题。
植物多糖聚合物诸如结冷胶已被用于制造水凝胶。结冷胶水凝胶是生物相容的，并表现出良好的组织工程机械性能。例如，Cencetti等人开发了由结冷胶和硫酸化透明质酸组成的水凝胶，该水凝胶充当结构和防粘组分(Cencetti等人，2011年，J.Mater.Sci.，第22卷：第263-271页)。Cerqueira等人描述了用于通过细胞粘附进行伤口治疗的透明质酸/结冷胶海绵状水凝胶。然而，示出了最多仅两天的细胞培养的数据(WO2014/167513；Cerqueira等人，2014年，ACS Appl.Mater.Interfaces；第6卷：第19668-19679页)。
Shin等人通过使用与细胞相容的两种改性生物大分子结冷胶甲基丙烯酸酯和明胶甲基丙烯酰胺的两步光交联，开发了双网络水凝胶(Shin等人，2012年，biomaterials，第33卷第11期：第3143-3152页)。在这项研究中，细胞存活率仅显示几天。Mat Amin等人将TiO2颗粒掺入结冷胶水凝胶中以改善细胞粘附。然而，TiO2纳米颗粒的掺入仅改善细胞在水凝胶上的初始附着，并且不允许细胞的长期生长(Mat Amin等人，2012年，Macromolecular bioscience，第12卷：第374-382页)。
因此，仍然需要开发具有生物相容性多糖水凝胶的更有效的解决方案，该生物相容性多糖水凝胶包含用于细胞锚着的附着位点，从而允许细胞的长期生长。
发明内容
本发明人开发了由结冷胶与胶原的互穿聚合物网络(IPN)组成的新型多糖聚合物水凝胶，以形成互穿水凝胶。低浓度胶原的存在显著改善了细胞的长期存活。此外，本发明人还表明，藻类生长因子(诸如小球藻(chlorella)生长因子)提高了结冷胶水凝胶内所包封的细胞的细胞存活率。
因此，本发明涉及一种水凝胶，该水凝胶包含多糖聚合物网络和胶原，优选地包含交联的多糖聚合物和胶原的互穿聚合物网络，以用于对其有需要的受试者的伤口治疗。在一个优选的实施方案中，所述水凝胶包含小于0.2％(w/v)的胶原。在另一个优选的实施方案中，所述多糖聚合物为结冷胶。根据本发明使用的水凝胶优选地包含0.1％(w/v)至10％(w/v)的结冷胶。在另一个优选的实施方案中，水凝胶的结冷胶通过Mg2+交联。根据本发明使用的水凝胶还可包含藻类生长因子，优选小球藻生长因子，更优选0.1％至1％(w/v)的小球藻生长因子。
本发明还涉及伤口敷料，该伤口敷料包含根据本发明的水凝胶，以及优选地包含藻类生长因子，更优选地包含小球藻生长因子。所述伤口敷料还可包含药学上可接受的载体。本发明还涉及用于对其有需要的受试者的伤口治疗的伤口敷料。
在另一方面，本发明涉及包含多糖聚合物网络和胶原以及藻类生长因子(优选小球藻生长因子)的水凝胶。
最后，本发明涉及包含如上所述的水凝胶和包含藻类生长因子的细胞培养基的细胞培养系统，优选地所述细胞培养基不含血清或白蛋白。
附图说明
图1：包封在用0.4％结冷胶和0.02％或0.03％MgCl2形成的结冷胶水凝胶内的HDF的细胞存活率。示出了平均值(n＝3)和SD。
图2：结冷胶-胶原互穿聚合物网络(IPN)水凝胶的物理特性。IPN水凝胶的横截面在A)100x、B)150x和C)200x缩放(比例尺：100μm)下的SEM。D)符合圆柱形状的IPN水凝胶的图像(比例尺：1cm)。E)(从左到右)0.4％结冷胶，0.4％结冷胶和1mg/mL胶原的混合物，在37℃下加热30分钟的0.4％结冷胶和1mg/mL胶原的混合物，以及在37℃下加热30分钟然后与0.02％MgCl2交联的0.4％结冷胶和1mg/mL胶原的混合物。F)IPN水凝胶在28天持续时间内的降解(重量减轻)。示出了平均值(n＝3)和平均值的标准误差(SEM)。将所有样品浸泡在相应的溶液中，并在37℃下温育，同时以60rpm温和搅拌。
图3：A)IPN水凝胶的细胞粘附3D微环境的有效性。用CLSM研究包封在IPN水凝胶内的ADSC的行为。用Phalloidin-iFluor 488试剂对细胞的F-肌动蛋白(细胞骨架)进行染色，并捕获包封的ADSC的z堆叠图像以分析整个IPN水凝胶的3D网络。ADSC均匀分布在整个水凝胶中。从第1天开始观察到丝状伪足，并且ADSC在21天的温育中继续增殖和扩散。在4孔室载玻片内制备载有细胞的IPN水凝胶将所有样品在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中温育，并且每2-3天更换一次培养基(周一、周三和周五)。比例尺：100μm。B)纯结冷胶水凝胶的细胞粘附3D微环境的有效性。观察包封的hMSC的行为。用Phalloidin-iFluor 488试剂对细胞的F-肌动蛋白(细胞骨架)进行染色，并用CLSM捕获z堆叠图像以分析整个载有细胞的纯结冷胶水凝胶。在接种后立即观察到细胞均匀分布在整个水凝胶中。从第1天开始观察到丝状伪足，并且细胞在整个温育期间继续增殖和扩散。将所有样品在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中温育，并且每2-3天更换一次培养基(周一、周三和周五)。比例尺：100μm。
图4：与补充有或未补充有CGF的细胞培养基接触的纯结冷胶或IPN水凝胶中包封的HDF的细胞存活率。将细胞以1×106个细胞/mL水凝胶的密度接种于96孔板中。细胞存活率以相对于第0天的百分比表示。示出了平均值(n＝3)和平均值的标准误差(SEM)。将所有样品在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中温育，并且每2-3天更换一次培养基(周一、周三和周五)。
图5：纯结冷胶水凝胶的细胞环境。包封的A)hMSC和B)ADSC的细胞存活率(*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001)。示出了平均值(n＝3)和SD。
图6：包封在结冷胶-胶原IPN水凝胶内并且在补充有各种浓度FBS和CGF的培养基中温育的ADSC的细胞存活率。将细胞以1×106个细胞/mL水凝胶的密度接种于48孔板中。在第0天、第1天、第3天、第7天、第14天和第21天，使用CellTiter AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS)测量ADSC的存活率。通过表达第1天、第3天、第7天、第14天和第21天相对于第0天的存活率来确定细胞增殖。示出了平均值(n＝3)和平均值的标准误差(SEM)。将所有样品在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中温育，并且每2-3天更换一次培养基(周一、周三和周五)。
图7：通过体外划痕试验评估载有ADSC的IPN水凝胶的伤口愈合潜力。A)HDF在48小时内迁移到受伤区域的代表性图像，该受伤区域由产生0.9mm无细胞距离的机械插入物的存在而形成。将HDF暴露于正常培养基、ADSC平衡培养基、凝胶平衡培养基或无血清培养基。用载有ADSC的水凝胶培养无血清培养基72小时后收集ADSC平衡培养基，而用无细胞水凝胶培养无血清培养基72小时后收集凝胶平衡培养基。将含有FBS的非平衡培养基用作阳性对照(正常)，并且将不含有FBS的非平衡培养基用作阴性对照(无血清)。所有培养基均含有10ng/mL的TNF-α。B)暴露于ADSC平衡培养基的HDF的迁移与暴露于正常培养基的HDF的迁移无统计学上显著的差异(*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001)。然而，暴露于ADSC平衡培养基的HDF的迁移在统计学上显著不同于暴露于凝胶平衡培养基的HDF。示出了平均值(n＝3)和平均值的标准误差(SEM)。将所有样品在37℃下在具有5％CO2的潮湿气氛中温育。
图8：人TSG-6的ELISA测定。A)人TSG-6ELISA的校准曲线。Log10(吸光度)＝0.5104*Log10[人TSG-6]ng/mL-0.8578。未知的人TSG-6浓度可由下式计算：[TSG-6]ng/mL＝10^([log(abs450)+0.8578]/0.5104)。B)在正常培养基、ADSC条件培养基、凝胶条件培养基和无血清培养基中检测到的人TSG-6的浓度。根据校准曲线计算值。发现ADSC平衡培养基比其他形式的培养基含有统计学上显著更高量的人TSG-6(*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001)。示出了平均值(n＝5)和SD。
图9：体内全层烧伤创面形成过程。
具体实施方式
本发明人开发了一种包含多糖聚合物网络和胶原的新型水凝胶，从而允许细胞的长期存活。因此，本发明涉及包含多糖聚合物网络和胶原的水凝胶。
如本文所用，术语“水凝胶”是指通过可溶性聚合物的化学或物理交联产生的亲水性大分子网络，其赋予水凝胶吸收和保持高水含量的能力，获得粘弹性特性并有利于氧气、营养物质和废物的运输。
根据本发明，该水凝胶包含多糖聚合物网络。如本文所用，术语“多糖”是指多糖及其衍生物。
多糖是指由通过糖苷键连接在一起的重复单元形成的聚合碳水化合物结构。这些结构可为线性的并且可包含各种程度的支化。术语“多糖”是指单一多糖或两种或更多种多糖的混合物。在一个优选的实施方案中，所述多糖为单一多糖。根据本发明，该多糖优选地选自动物来源的多糖、植物来源的多糖、藻类来源的多糖、细菌来源的多糖；以及它们的任何混合物，优选地植物来源的多糖。更优选地，该多糖选自黄原胶、结冷胶、λ-角叉菜胶和κ-角叉菜胶、ι-角叉菜胶、藻酸盐、果胶、羧甲基纤维素、琼脂、阿拉伯树胶、透明质酸盐、葡聚糖以及它们的任何混合物，优选地选自结冷胶、黄原胶、角叉菜胶、瓜尔胶和葡聚糖。
在一个优选的实施方案中，所述多糖为结冷胶。结冷胶是由少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)分泌的多糖，其最初描述于Moorhouse R.等人，1981年，ACSsymposium Series.，第150期，第111页。它由包含摩尔比为2:1:1的β-D-葡萄糖、β-D-葡糖醛酸和α-L-鼠李糖的单体的四糖重复单元组成。它通常以两种形式存在：一种具有高酰基含量，这是细菌分泌的粗产物；另一种由于加工而具有低酰基含量，这是更广为人知的。结冷胶包括但不限于低酰基结冷胶、高酰基结冷胶、化学改性的结冷胶或这些结冷胶聚合物的任何混合物。优选地，所述结冷胶为低酰基结冷胶。
多糖水凝胶可通过将多糖与交联剂混合而获得。在一个优选的实施方案中，当多糖为结冷胶时，离子交联剂为阳离子，更优选地为二价阳离子。所述二价阳离子可选自：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Sr2+、Zn2+、Ra2+、Be2+，优选Mg2+。所述二价阳离子(优选Mg2+)的浓度为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)，更优选地为0.02％(w/v)。
在更好结果的实施方案中，多糖在本发明的水凝胶(优选结冷胶)中的浓度可为0.1％至10％(w/v)，优选地为0.2％至5％(w/v)，更优选地为0.2％至2.5％(w/v)，或为0.2％至1％(w/v)。甚至更优选地，结冷胶在水凝胶中的浓度为0.4％(w/v)。
具体地讲，诸如结冷胶或角叉菜胶的多糖需要离子的存在才能形成稳定的水凝胶。多糖可在促进其链线性化的温度下均匀分散在溶剂中，并且可通过降低温度和在离子的存在下形成水凝胶。根据本发明，合适的溶剂为水溶液，优选地为水、细胞培养基、盐水溶剂或它们的混合物。根据本发明使用的水可以是纯化水或无菌水。
除了由温度催化的胶凝之外，还可通过改变水溶液的pH来形成多糖水凝胶。
本发明人表明，包含由胶原与结冷胶形成的完全互穿网络的水凝胶改善了细胞的长期存活。因此，根据本发明的水凝胶包含胶原。在一个优选的实施方案中，所述水凝胶包含完全互穿聚合物网络，该完全互穿聚合物网络包含交联多糖聚合物和交联胶原。该胶原可选自天然胶原，诸如I型、II型或III型天然胶原、无端肽(atelopeptide)胶原和再生胶原。在一个优选的实施方案中，该胶原是I型胶原。在一个优选的实施方案中，水凝胶包含小于0.2％(w/v)，优选0.2％至0.1％(w/v)的胶原，更优选0.1％的胶原。优选地，水凝胶包含小于0.20％的I型胶原，更优选0.2％至0.1％，更优选0.1％的I型胶原。
水凝胶可另外包含一种或多种活性治疗剂或抗微生物剂。合适的治疗剂包括生长因子、止痛剂、局部麻醉剂和类固醇。合适的抗微生物剂包括防腐剂诸如银化合物(例如，磺胺嘧啶银)和氯己定，以及抗生素。
本发明人表明，本发明的具有藻类生长因子的水凝胶特别改善了细胞存活。因此，在一个具体实施方案中，将藻类生长因子掺入到本发明的水凝胶中。这可通过用藻类生长因子溶液处理水凝胶或通过在胶凝之前将多糖与包含藻类生长因子的溶剂混合来实现。
藻类提取物在细胞上表现出生长促进并且在本文中被称为藻类生长因子。根据本发明，藻类生长因子是指来自藻类细胞的任何级分、提取物或分离或纯化的分子。在一个实施方案中，该组分为蛋白质或核酸。在另一个实施方案中，该组分为植物化学物质。在另一个实施方案中，该组分为藻类的级分。提取物可根据本领域已知的合适技术来制备，例如通过碱溶解或有机溶剂提取、高压均化、如US 5.330.913中所述的珠磨。在WO2016/009145中描述了用于提取藻类、特别是小球藻的优选方法。
所谓“藻类”是指光合作用真核生物，包括从单细胞微藻属(诸如小球藻和硅藻)到多细胞形式的生物体。根据本发明，该藻类优选地为绿藻，更优选地来自绿藻(chlorophyta)门。在一个优选的实施方案中，所述藻类是小球藻，其是指单细胞绿藻的一个属。小球藻属物种包括但不限于chlorella acuminate、南极小球藻(chlorellaantartica)、拟杆菌小球藻(chlorella bacteroidea)、葡萄样小球藻(chlorellabotryoides)、chlorella chlorelloides、chlorella colonialis、chlorellaconglomerate、chlorella elongata、chorella faginea、chlorella gloriosa、chlorellahelizoae、水溪小球藻(chlorella infusionum)、chlorella ewinii、海洋小球藻(chlorella marina)、微小小球藻(chlorella miniata)、夜间小球藻(chlorellanocturna)、chlorella nordstedti、蛋白核小球藻(chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(chlorella vulgaris)和索罗金小球藻(chlorella sorokiniana)，优选地为索罗金小球藻、普通小球藻或原始小球藻(chlorella protothecoides)。许多已知的小球藻物种可见于数据库AlgaeBase(Guiry,M.D.和Guiry,G.M.，2019年，AlgaeBase.World-wideelectronic publication,National University of Ireland,Galway。http:// www.algaebase.org)。
在一个优选的实施方案中，小球藻生长因子是来自小球藻，优选地来自索罗金小球藻、普通小球藻或原始小球藻，更优选地来自普通小球藻的级分或提取物。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的水凝胶包含0.05％至10％、或0.05％至5％的小球藻生长因子，优选地0.1％至2％(w/v)，更优选地0.33％至1％(w/v)。
本发明的水凝胶表现出良好的机械性能，尤其是在弹性特性和储存能量方面。具体地讲，在1Hz和25℃下测量的水凝胶的储能模量(G′)为100至5000Pa，优选地为500至5000Pa、1000至3000Pa或2000至3000Pa，更优选地为2000至2500Pa。使用振荡流变仪(MCR302，Antor Paar，Austria)并如实施例中所述使用板-板几何结构(直径＝8mm，工作间隙＝1mm)测量根据本发明的储能模量(G′)。
制备水凝胶的方法
根据本发明的水凝胶的制备包括将多糖溶解在具有胶原的溶剂中以及使用交联机制进行网状化。
在一个具体实施方案中，多糖水凝胶为结冷胶水凝胶并且通过热交联和/或离子交联制备。在一个优选的实施方案中，本发明的结冷胶水凝胶通过如下方式制备：在高于聚合物临界胶凝温度(通常为90℃)的温度下将结冷胶溶解于溶剂中，并将温度降低至低于聚合物临界胶凝温度，并且/或者将结冷胶溶液与离子交联剂混合。
在一个优选的实施方案中，所述水凝胶为包含胶原和多糖聚合物的完全互穿聚合物网络，所述多糖聚合物在已经交联的胶原存在的情况下交联。因此，可在将温度降至低于聚合物临界胶凝温度之后并在将结冷胶溶液与离子交联剂混合以形成互穿网络之前添加胶原。
在一个优选的实施方案中，将结冷胶在90℃加热以解开无规链，然后在37℃冷却以形成双螺旋，并且添加冰冷中和的胶原并混合到结冷胶溶液中，然后与MgCl2交联。
具体地讲，多糖在本发明的水凝胶(优选结冷胶)中的浓度可为0.1％至10％(w/v)，优选地为0.2％至5％(w/v)，更优选地为0.2％至2.5％(w/v)，或为0.2％至1％(w/v)。甚至更优选地，结冷胶在水凝胶中的浓度为0.4％(w/v)。
在一个优选的实施方案中，水凝胶包含小于0.2％(w/v)，优选0.2％至0.1％(w/v)的胶原，更优选0.1％的胶原。优选地，水凝胶包含小于0.2％的I型胶原，更优选0.2％至0.1％的I型胶原，更优选0.1％的I型胶原。
在一个优选的实施方案中，用于制备水凝胶的溶剂为水基溶剂，例如去离子水、磷酸盐缓冲溶液等。
在一个具体实施方案中，该溶剂包含藻类生长因子，并且小球藻生长因子相对于水凝胶的最终浓度为0.05％至10％(w/v)或0.05％至5％的小球藻生长因子，优选地为0.1％至2％(w/v)，更优选地为0.33％至1％(w/v)。
在一个优选的实施方案中，该离子交联剂为阳离子，优选地为二价阳离子，更优选地选自：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Sr2+、Zn2+、Ra2+、Be2+，优选Mg2+。
伤口敷料
在另一方面，本发明涉及包含本发明的水凝胶的伤口敷料。该伤口敷料允许将本发明的水凝胶放置成与伤口接触。在一个具体实施方案中，该伤口敷料包含背衬层和作为吸收材料的本发明的水凝胶。该背衬层提供对微生物穿过敷料的屏障。该背衬层可为液体不可透过的或半透过的。优选地，该背衬层可透过氧气和水蒸汽，但不可透过液态水或伤口渗出物。该背衬层也是微生物不可透过的。该伤口敷料还可包括该背衬层上的面向吸收层的粘合剂层。优选地，粘合剂层从吸收层向外延伸以在背衬层上形成涂有粘合剂的边缘。粘合剂层和/或背衬层将吸收垫保持在伤口上，并有助于保持伤口周围的无菌环境。该粘合剂层和背衬层通常为薄且柔性的。
在一个具体实施方案中，包含本发明的水凝胶的伤口敷料可包含一种或多种活性治疗剂或抗微生物剂。在一个具体实施方案中，所述活性剂或抗微生物剂可添加到水凝胶内或单独添加到伤口敷料中。在一个优选的实施方案中，伤口敷料还包含如上所述的藻类生长因子。因此，该藻类生长因子可包含在水凝胶中或单独添加在伤口敷料中。
在另一个具体实施方案中，根据本发明的伤口敷料可包含可接受的局部用载体。术语“可接受的局部用载体”涵盖药学上可接受的载体和美容上可接受的载体，并且涵盖适于将活性组分递送到皮肤的基本上无刺激性的相容组分。如本文所用，术语“相容的”是指载体的组分必须能够以不存在相互作用的方式与水凝胶混合，该相互作用将显著降低水凝胶在用于治疗伤口期间的功效。当然，这些载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适于长期局部施用于人类或低等动物皮肤。
治疗用途
根据本发明的水凝胶或伤口敷料可用于治疗对其有需要的受试者的伤口。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物。可受益于本发明所公开的治疗方法的哺乳动物物种包括但不限于人类、非人灵长类动物(诸如猿、黑猩猩、猴和猩猩)、驯养的动物(包括狗和猫)，以及牲畜(诸如马、牛、猪、绵羊和山羊)，或其他哺乳动物物种，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、仓鼠等。
术语“伤口”用于泛指皮肤和粘膜的损伤。具体地讲，术语“伤口”是指身体的受损区域，诸如皮肤或肉中的切口、洞和烧伤。伤口可以是慢性伤口或急性伤口。急性伤口是由于事故或手术损伤而突然发生的皮肤、粘膜损伤。慢性伤口是不能有序及时愈合的伤口。慢性伤口包括但不限于静脉和动脉溃疡、糖尿病性溃疡、压疮、辐射中毒、感染或局部缺血。
如本文所用，术语“治疗”是指旨在改善患者状态的任何行为。在某些实施方案中，此类术语是指伤口愈合的改善。如本文所用，术语“伤口愈合”是指皮肤或粘膜在损伤后自我修复的复杂过程。
在相关方面，本发明涉及本发明的水凝胶或伤口敷料在制备用于治疗伤口的药物中的用途。
在又一方面，本发明涉及治疗对其有需要的受试者的伤口的方法，该方法包括将治疗有效量的根据本发明的水凝胶或伤口敷料局部施用于受试者的伤口表面。局部施用包括施用到皮肤和粘膜上。
这种局部施用可作为单一剂量或以多个指定间隔给予的重复剂量。本领域技术人员将容易理解，优选的剂量方案将随被治疗的损伤的类型和严重程度而变化。
所谓“治疗有效量”是指在实现所需治疗结果(诸如加速伤口愈合)所需的剂量和时间段内有效的量。该水凝胶或包含该水凝胶的伤口敷料的治疗有效量可根据以下因素而变化：诸如伤口类型(机械或热、全部或部分厚度等)、伤口尺寸、伤口的深度(如果是全厚度的)、感染的不存在或存在、自受伤以来经过的时间，以及患者的年龄、身体状况、其他疾病状态的存在和营养状况。
可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。治疗有效量通常也是其中产品或药物组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。
细胞培养系统
本发明的水凝胶适用于培养和支持细胞。因此，本发明还涉及包含本发明的水凝胶和包含藻类生长因子的培养基的细胞培养系统。具体地讲，该细胞培养系统包含水凝胶和培养基，该水凝胶包含多糖聚合物网络和胶原，该培养基包含藻类生长因子。
具体地讲，该细胞培养系统可以是2D或3D细胞培养系统。在2D细胞培养系统中，将细胞培养在细胞培养基中的本发明水凝胶上。在3D培养系统中，将细胞包埋在细胞培养基中的本发明水凝胶内。
该细胞培养基可包含基础培养基，该基础培养基包含允许培养和支持细胞的至少一种或多种组分。多种基础培养基可商购获得，并且是本领域技术人员熟知的。该培养基可以是最低限度培养基，具体地包含矿物盐、氨基酸、维生素和细胞必需的碳源以及用于调节pH的缓冲体系。能够用于根据本发明的方法的基础培养基包括，例如但不限于，DMEM/F12培养基、DMEM培养基、RPMI培养基、Ham's F12培养基、IMDM培养基和KnockOutTMDMEM培养基(Life Technologies)。根据所用的培养基，可能需要或期望添加谷氨酰胺、维生素C、一种或多种抗生素(诸如链霉素、青霉素)和/或抗真菌剂诸如Fungizone(两性霉素B)。
根据一个优选的实施方案，培养基包含如上所述的藻类生长因子。
在更优选的实施方案中，培养基不包含动物来源的血清或血清白蛋白。所述血清可以是人患者血清或混合的人血清、胎牛血清或牛血清。所述白蛋白可以是人血清白蛋白、牛血清白蛋白。
可使用本发明的细胞培养基培养的细胞包括干细胞、诱导多能干细胞、祖细胞和分化细胞。
涉及其中可使用本发明的水凝胶的细胞培养的应用的示例，包括但不限于，细胞和组织在更接近体内存在的环境中体外增殖(例如作为研究工具)、药物化合物的筛选和此类细胞培养物或组织的体外毒理学测定、细胞疗法、细胞递送、药物递送、生化替代、生物活性分子的产生、组织工程(例如，离体器官模型、组织外植体、体内组织再生)、生物材料和临床试验。
本发明的以下实施例不以任何方式限于本专利申请中所述的实施方案，并且本领域的技术人员将能够在不偏离权利要求中描述的主要思想的情况下预测对其的许多可能的改变。
实施例
1.材料
低酰基结冷胶(GelzanTMCM，G1910)、氯化镁(MgCl2，208337)、磷酸二氢钠(NaH2PO4，S8282)、氢氧化钠(NaOH，S8045)、碳酸氢钠(NaHCO3，S5761)、氯化钾(KCl，P9541)、低葡萄糖(D5523)和高葡萄糖(D1152)达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、溶液(A6964)、青霉素/链霉素(P4333)、多聚甲醛(PFA，P6148)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)购自Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)。氯化钠(NaCl，S34900)获自Unichem Ltd(Mumbai，Maharashtra，India)，所有盐均以无水形式接收。大鼠尾部1型胶原(SC-136157)购自SantaCruz Biotechnology,Inc.(Dallas，TX，USA)。胎牛血清(FBS)获自Hyclone(South Logan，UT，USA)。去离子水是来自Adrona Crystal多用途水纯化系统(Adrona Crystalmultipurpose water purification system)(Riga，Latvia)的滤液。超纯级磷酸盐缓冲盐水(10x PBS)购自Vivantis Technologies Sdn Bhd(Subang Jaya，Selangor DarulEhsan，Malaysia)。0.22μm过滤装置获自Sartorius AG(/>Germany)。CellTiterAQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS)购自Promega(Madison，WI，USA)。Triton-X获自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA，USA)。Phalloidin-iFluor 488试剂(ab176753)获自Abcam(Cambridge，UK)。4孔室载玻片及其相应的室盖玻片购自Thermo FisherScientific(Waltham，MA，USA)。TSG-6ELISA试剂盒购自RayBiotech(Peachtree Corners，GA，USA)。
人真皮成纤维细胞(HDF)、人间充质干细胞(hMSC，PT-2501)和脂肪来源干细胞(ADSC，PT-5006)购自Lonza Bioscience(Singapore)。所有干细胞供体的支原体、细菌、酵母菌和真菌检测均呈阴性。HIV-1、乙型肝炎和丙型肝炎的hMSC保证通过5次传代，以表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，不表达CD14、CD19、CD34和CD45。ADSC保证通过5次传代，以表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，不表达CD14、CD31和CD45。
2.结冷胶水凝胶的制备
通过将干燥结冷胶(GelzanTMCM，G1910，Sigma-Aldrich)以0.762％(w/v)的浓度溶解于水中来制备结冷胶溶液。将315μL结冷胶溶液在干燥热浴上于90℃下温育30分钟。然后将结冷胶溶液在干燥热浴上于37℃下温育至少15分钟。
新鲜制备中和的3.33mg/mL 1型胶原(sc-136157，Santa Cruz Biotechnology,Inc)。将180μL胶原溶液转移到315μL结冷胶溶液中。
当结冷胶在胶原之前交联(全同步IPN(首先交联结冷胶))时，在室温下将离子交联剂MgCl2加入混合物中，最后将混合物在37℃下加热30分钟以进行胶原原纤维形成。
当胶原在结冷胶之前交联(全同步IPN(首先交联胶原))时，将混合物在37℃下温育20至30分钟。在转移到结冷胶-胶原溶液中之前，用0.114％(w/v)的MgCl2制备离子交联剂溶液，并将溶液在室温下静置5分钟。
结冷胶、MgCl2和胶原的最终浓度分别为0.4％(w/v)、0.02％(w/v)和1mg/mL。
3.结冷胶水凝胶的胶凝
3.1流变测定法
使用振荡流变仪(MCR 302，Antor Paar，Austria)并使用板-板几何结构(直径＝8mm，工作间隙＝1mm)进行水凝胶的流变学表征。在每次测试之前，将100μL新鲜制备的水凝胶快速转移到流变仪的底板上。每种水凝胶组合物使用三种不同的样品进行测试。将上锥板降低至与底板的间隙为1mm后，使水凝胶样品稳定1分钟。所有测量均在25℃下进行。
总是首先进行振幅扫描，以确定线性粘弹性区域(LVR)的极限。该极限为这样的剪切应变百分比：低于该百分比可在不使样品变形的情况下进行频率扫描。在1Hz的恒定频率下，在0.1％至100％的剪切应变范围内获得储能模量(G′)和损耗模量(G″)。使用标尺在标绘的图上确定线性极限。
通过频率扫描研究水凝胶的剪切依赖性行为和内部结构。G′和G″模量测量从最小频率到最大频率在0.1rad/s至100rad/s之间完成。在每次测量开始之前，将剪切应变设置为低于预定LVR的常数。
为了了解IPN水凝胶的依赖于温度和时间的胶凝行为，进行恒定的动态力学流变测定。温度和时间扫描均在1％的恒定剪切应变和1Hz的恒定频率下进行。对于温度扫描，以-2℃-1进行50℃至10℃的测量。而对于时间扫描，水凝胶样品没有时间进行平衡，并且每5秒最多至2分钟进行一次G′/G″测量。
流变学扫描的结果显示在图表中，其中G′和G″标绘在y轴上，并且相应的参数标绘在x轴上，两个轴均在对数标度上。
3.2凝胶收率法
对于凝胶收率，将600μL水凝胶(n＝3)吸干并在冻干前称重(Wi)。在37℃下将冻干水凝胶浸泡在600μL去离子水中，同时以60rpm持续搅拌3天。然后将重构的湿水凝胶吸干并重新称重(Wr)。根据以下公式确定凝胶收率百分比：
3.3结果
细胞行为很大程度上受水凝胶支架刚度的影响(Bischofs,I.B.和U.S.Schwarz.，PNAS，2003年，第100卷第16期：第9274-9279页；Fratzl,P.和F.G.Barth.，Nature，2009年，第462卷第7272期：第442页；Ahearne,M.，Interface focus，2014年，第4卷第2期：第20130038页)。G′(储能模量)越高，材料刚度越高。Enger等人提出储能模量小于3,000Pa的较软材料不引起自发分化(Engler,A.J.等人，Cell，2006年，第126卷第4期：第677-689页)。另一方面，较软的凝胶可能无法建立促进细胞粘附的细胞环境(Discher,D.E等人，Science，2005年，第310卷第5751期：第1139-1143页)，只有储能模量高于2,000Pa至3,000Pa的较高刚度水凝胶有助于细胞粘附和扩散(Yeung,T.等人，Cell motility and thecytoskeleton，2005年，第60卷第1期：第24-34页)。另外，先前的研究表明，将明胶(胶原的化学衍生物)掺入到现有的水凝胶网络中使其储能模量增加了2.4倍至3.4倍(Miao,T等人，Journal of Materials Chemistry B，2015年，第3卷第48期，第9242-9249页)。因此，为了确保所得互穿聚合物网络(IPN)水凝胶的储能模量落在细胞扩散和非自发分化的最佳范围内，选择0.4％(w/v)结冷胶和0.02％(w/v)MgCl2的浓度(表1)。
表1：a)线性粘弹性范围(LVR)由水凝胶样品在25℃下以1Hz恒定频率进行的振幅扫描确定。记录剪切应变百分比值。
b)由水凝胶样品在LVR的上限和25℃下进行的振荡频率扫描确定储能模量(G′)。记录1Hz下的值。结果表示为平均值(n＝3)±SD。
由于潜在的细胞毒性问题，不选择0.4％(w/v)结冷胶和0.03％(w/v)MgCl2的组合(图1)。
形成IPN最常用的技术是原位制备，其中在同步进行正交交联之前，将聚合物混合在溶液中。然而，胶原与结冷胶的混合可降低结冷胶上用于离子交联的羧酸根基团的接近度。没有形成包含2mg/mL胶原的半IPN(表2)。为了克服这个问题，发明人提出降低胶原的浓度。当胶原浓度降至1mg/mL时，形成弱水凝胶。
接下来，发明人尝试形成完整的IPN水凝胶，以减少胶原从结冷胶水凝胶网络的快速渗出。如果结冷胶在胶原之前交联，则尝试不成功。当顺序颠倒时，成功地制造了平均储能模量为2353.9±110.2Pa的全同步IPN水凝胶。随后将该IPN氢用于以下实验中。
表2：基于胶凝的可行性和所得水凝胶的流变性优化IPN水凝胶的胶凝方案。
平均储能模量为2353.9±110.2Pa的结冷胶-胶原IPN水凝胶的流变性在下表3中示出。
表3：结冷胶-胶原IPN水凝胶的组成和流变性。a)线性粘弹性范围(LVR)由水凝胶样品在25℃下以1Hz恒定频率进行的振幅扫描确定。记录剪切应变百分比值。b)储能模量(G′)由水凝胶样品在LVR的上限和25℃下以1Hz频率进行的振荡频率扫描确定。c)胶凝温度由水凝胶样品在25℃下以1％的恒定剪切应变和1Hz的恒定频率下进行的温度扫描确定。以每次测量-2℃进行50℃至10℃的测量。d)胶凝时间由水凝胶样品在25℃下以1％的恒定剪切应变和1Hz的恒定频率下进行的时间扫描确定。以5秒的间隔进行连续测量，直到总共120秒。
因此，2353.9±110.2Pa的储能模量非常适合间充质干细胞。
获得的胶凝温度和时间的结果提供了关于后续临床应用的重要信息。皮肤表面上的温度为34℃。由于结冷胶表现出冷胶凝机制，加入交联剂后，IPN水凝胶可直接在皮肤上形成。快速胶凝时间可用于IPN水凝胶在可注射系统中的使用。
凝胶收率反映了水凝胶网络的稳健性。较高的凝胶收率表明，水凝胶能够响应其含水量的吸收和蒸发而膨胀和收缩。胶原的掺入使结冷胶水凝胶的凝胶收率从85.9％±5.2％增加至95.8％±1.52％(表4)。
表4：IPN和纯结冷胶水凝胶的组成、胶凝时间和凝胶收率。a)凝胶收率表示为[(W2÷W1)×100]％，由此，W1＝冷冻干燥(冻干)前水凝胶的湿重，并且W2＝冷冻干燥后重构的水凝胶的湿重。
3.4扫描电子显微镜检查法
3.4.1方法
首先将冻干的水凝胶样品在液氮中冷冻，然后在其横截面处分离。然后，将切开的水凝胶快速安装到销棒上，使其横截面面向电子发射源。随后用金溅射涂覆样品，并用JEOLJSM 6510扫描电子显微镜(JEOL Ltd，Akishima，Tokyo，Japan)检查。参考内置比例尺计算最大孔径。对每个样本的横截面的至少3个不同位置进行成像。在3种不同的光学变焦下重复该过程。
3.4.2结果
IPN水凝胶的多孔结构将允许营养物质、代谢物和其他重要调节分子在包封的细胞和细胞外介质之间转运(图2A至图2C)。
3.5体外水凝胶降解研究
3.5.1方法
当0.35g NaH2PO4、0.68g NaCl、2.5g NaHCO3和0.22g KCl溶解于100mL去离子水(pH＝8.00±0.05)中时，制备模拟伤口流体(SWF)。
对于体外降解研究，在吸干并转移到15mL Falcon管中(n＝3)之前在2mLEppendorf管中形成600μL水凝胶。在转移之前和之后称量每个Falcon管以确定水凝胶的初始重量(Wi)。将水凝胶浸入2mL的1X PBS、培养基或SWF中，在37℃和60rpm的恒定搅拌下温育总共28天。在第1天、第3天、第7天、第10天、第14天和第28天，将Falcon管以4000rpm离心2分钟，滗出上清液，并将剩余的水凝胶吸干并称重(Wd)。通过以下公式(公式(1))计算湿水凝胶在每个时间点的质量相对于第0天的质量的差异。在每个时间点之后补充2mL新鲜的1XPBS、培养基或SWF，直到温育的第28天。
质量变化％＝(Wd/Wi)×100(1)
Wi–初始湿水凝胶重量
Wd–每个时间点的湿水凝胶重量
3.5.2结果
定性倒置试验显示，结冷胶和结冷胶-胶原是透明、自由流动的溶液。当结冷胶-胶原混合物在37℃下加热30分钟时，形成能够保持其自身重量的固体质量。在随后与MgCl2交联时保留相同的固体质量。当Eppendorf管倒置时透明内容物不流动，定性地表明IPN水凝胶的胶凝(图2D至图2E)。
随时间推移的重量损失用作水凝胶降解的量度。对于物理交联的水凝胶，由于通过离子交换机制逐渐破坏交联，观察到降解。然后游离的聚合物材料扩散到溶剂中，导致凝胶质量降低。在用SWF温育12天后，还剩余超过80％的IPN水凝胶(图2F)。因此，它们可能能够在伤口床上保持结构完整性至少一周。
4.体外表征：包封的细胞的细胞附着。
4.1评估包封的细胞的细胞附着的方法
对于形态学研究，将200μL包含1000个细胞/μL的水凝胶加入8室(HDF)和4室载玻片(干细胞)的每个孔(n＝2)中。将400μL培养基添加到每个载有HDF的水凝胶中，同时将800μL培养基添加到每个载有干细胞的水凝胶中。在同一天(第0天)对细胞染色并成像。为了使温育不同持续时间的细胞可视化，它们以倒计数的方式接种。
根据制造商的方案对细胞染色。简而言之，小心地抽吸细胞培养基以避免任何水凝胶移位。用1X PBS冲洗每种水凝胶一次，以除去酚红。为了固定包封的细胞，将载有细胞的水凝胶与200μL(HDF)或500μL(干细胞)的4％甲醛在PBS中一起温育30分钟。之后，将细胞与相同体积的0.1％(v/v)Triton X-100一起温育5分钟以增加细胞渗透性。然后将透化的细胞与1x鬼笔环肽缀合物工作溶液在黑暗中温育90分钟。随后，将所有染色的细胞用1xPBS彻底洗涤三次，以除去过量的鬼笔环肽缀合物，这是避免在水凝胶网络内留下截留残余物的关键步骤。
使用Olympus FluoView FV1000(Olympus，Japan)共焦激光扫描显微镜(CLSM)，使用20x/1.45油物镜，以543nm HeNe激光器作为激发源捕获共焦z堆叠图像。图像以4×3帧的瓷砖扫描(Tile Scan)模式拼接。图像由Imaris 9.1.3(Belfast，UK)进行数字堆叠以产生水凝胶中包封的细胞的3D图像。
4.2结果
在不含胶原的结冷胶水凝胶上培养的高密度成纤维细胞(HDF)(下图)从第0天到第7天不显著扩散和繁殖。相反，在包含胶原的结冷胶水凝胶上培养的HDF可扩散和繁殖(通过细胞密度的增加来指示)。
3D共焦图像允许观察包封的细胞如何在水凝胶内扩散。间充质干细胞开始扩散并在IPN水凝胶基质中形成细胞突起(图3A)。而包封在纯结冷胶水凝胶中的细胞在整个温育期间保持其圆形形态(图3B)。这证明胶原网络的存在允许粘附细胞诸如MSC附着和扩散。细胞与基质的粘附对于粘附细胞的细胞稳态至关重要。在没有粘附基质的情况下，它们开始经历称为失巢凋亡的程序性细胞死亡。
5.体外表征：包封的细胞的细胞增殖
5.1评估包封的细胞的细胞增殖的方法
为了确定包封在水凝胶内的哺乳动物细胞系的细胞存活率，进行MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(3-羧基甲氧基苯基)-2(4-磺酸苯基)-2H-四唑鎓)测定。活的并因此代谢活跃的细胞能够通过它们的线粒体脱氢酶将MTS转化成褐色甲臜产物。
简而言之，在细胞包封后的不同时间点(n＝3)，每100μL培养基加入10μL MTS。对于HDF和脂肪来源干细胞(ADSC)，MTS在第0天(包封后6小时)、第1天、第3天或第7天添加；对于MSC，MTS在第0天、第1天、第3天、第7天、第14天或第21天添加。将细胞在37℃下并且在空气中含5％CO2的潮湿气氛中进一步温育3小时。温育后，将每个孔的100μL上清液转移至透明、圆形、平底96孔板中的新孔中。
在多孔酶标仪(Hidex Sense，Turku，Finland)上以OD490进行与活细胞数量成线性比例的总代谢活性的测量。将以相同方式处理的无细胞水凝胶用作“空白”。通过相对于第0天的值在第1天、第3天和第7天表达空白校正的OD490值来确定细胞增殖。对于干细胞(hMSC和ADSC)，在第0天、第1天、第3天、第7天、第14天和第21天的时间点重复整个实验(n＝3)。
5.2结果
如图4所示，当将HDF包封在纯结冷胶水凝胶(全血清)中时，细胞生长受到抑制，但未观察到细胞死亡。CGF确实提高了细胞存活率，但没有显著提高细胞存活率。
当向包封在纯结冷胶水凝胶中的HDF、ADSC或MSC提供无血清培养基时，观察到细胞死亡(图4和图5)。CGF确实减慢了死亡速率。当向包封在IPN水凝胶中的HDF提供无血清培养基时，也观察到细胞死亡。然而，CGF的存在使细胞恢复活力，始终维持生长。当在包含胶原并形成互穿网络的结冷胶水凝胶上培养HDF时，用CGF代替血清，细胞生长持续7天。
血清的存在掩盖了CGF对包封的ADSC的增殖作用。在10％(v/v)FBS的存在下，ADSC的细胞存活率未显著增加(图6)。另外，在不存在血清的情况下，包封的干细胞迅速死亡，细胞活力在培养3周后继续降低至10％以下。1g/L CGF的存在减慢了死亡速率，但并没有逆转作用过程。
通过去除培养基中的一半血清，包封的ADSC迅速死亡，细胞存活率在培养21天后为30.4％±4.68％。令人惊讶的是，1g/L CGF在这种条件下保留了包封的ADSC的存活率。当低血清培养基补充1g/L CGF时，细胞存活率达到124.0％±7.57％，表明细胞增殖。
6.划痕试验
6.1划痕试验方法
为了评估包封在IPN水凝胶内的ADSC在暴露于炎性细胞因子如TNF-α时是否可分泌旁分泌伤口愈合因子，进行了体外2D划痕试验。首先，通过在2mL无血清DMEM中温育600μL的含有6×105个包封的ADSC的IPN水凝胶72小时来制备ADSC平衡培养基。从透明、圆形、平底6孔板的5个单独的孔中收集总共10mL的ADSC平衡培养基。使用无细胞IPN水凝胶以相同方式制备凝胶平衡培养基。在收集培养基后，将它们以1500rpm离心10分钟，并且将上清液储存在-80℃下直至进一步使用。将补充有FBS的非平衡培养基用作阳性对照(正常培养基)，并且将不含有FBS的非平衡培养基用作阴性对照(无血清培养基)。所有培养基均含有10ng/mL的TNF-α以诱导TSG-6的分泌。
使用CytoSelectTM24孔伤口愈合检测试剂盒(Cell Biolabs Inc.，San Diego，CA，USA)根据制造商的方案进行划痕试验。简而言之，将500μL的HDF悬浮液以5×105个细胞/mL正常培养基加入24孔板的每个孔中。放置塑料插入物以确保在每个孔中形成具有限定的0.9mm间隙的一致的伤口范围(“受伤”区域)。将细胞在37℃下并且在空气中含5％CO2的潮湿气氛中温育直至形成单层。
此后，小心地移除塑料插入物，并且用无菌1x PBS冲洗细胞三次。冲洗后立即将500μL的ADSC平衡培养基、凝胶平衡培养基、正常培养基或无血清培养基加入指定的孔(n＝3)中。用光学显微镜(Olympus CKX41，Shinjuku，Tokyo，Japan)监测伤口闭合的不同速率。在0(Li)、6、12、24和48小时的不同时间点捕获伤口间隙的图像。通过以下公式确定迁移速率：
伤口闭合％＝(Li-Lc)/Li×100；
Li表示伤口间隙的初始长度
Lc表示每个时间点的伤口间隙的长度
6.2结果
响应于血清中存在的生化前体，HDF在温育48小时后迁移并覆盖至多82.4％±2.57％的“受伤区域”。然而，缺乏血清补充显著阻止了HDF的迁移，实现了仅18.9％±3.93％的伤口闭合百分比。相反，ADSC平衡的无血清培养基似乎为HDF提供趋化刺激，在实验期间促进“伤口闭合”高达71.5％±2.08％(图7A至图7B)。无细胞IPN水凝胶不提供任何可促进细胞生长或迁移的基质。温育48小时后，暴露于凝胶平衡培养基的HDF的伤口闭合百分比仅达到22.1％±6.21％。这些结果表明，包封在IPN水凝胶中的ADSC分泌生物活性因子，诱导显著的HDF生长和迁移。这可被关联以增强生理伤口愈合过程中的伤口闭合速率。
7.人TSG-6的ELISA测定
7.1方法
用得自RayBiotech(Peachtree Corners，GA，USA)的ELISA测试试剂盒，采用制造商的方案，检测用TNF-α刺激后从载有ADSC的IPN水凝胶(n＝5)中释放的抗炎TSG-6蛋白的定量。
通过在2mL无血清DMEM中温育600μL的含有6×105个包封的ADSC的IPN水凝胶72小时来制备ADSC条件培养基。从透明、圆形、平底6孔板的5个单独的孔中收集总共10mL的ADSC条件培养基。使用无细胞IPN水凝胶以相同方式制备凝胶条件培养基。在收集培养基后，将它们以1500rpm离心10分钟，并且将上清液储存在-80℃下直至进一步使用。将补充有FBS的非条件培养基用作阳性对照(正常培养基)，并且将不含有FBS的非条件培养基用作阴性对照(无血清培养基)。所有培养基均含有10ng/mL的TNF-α以诱导TSG-6从包封的ADSC中的分泌。
7.2结果
TSG-6是由ADSC分泌的强效抗炎旁分泌因子。来自包封在IPN水凝胶内的人ADSC的人TSG-6的检测表明，整个生物伤口敷料构建体在施用并随后暴露于烧伤创面上的伤口细胞因子TNF-α时可释放抗炎的旁分泌因子并表现出潜在的抗炎旁分泌活性。
8.体内全层烧伤创面形成过程(图9)
吸入诱导麻醉用5％异氟烷(AttaneTM，JD Medical，USA)实现，并维持在1.5％异氟烷。使用VeetTM脱毛膏(Reckitt Benckiser Group，UK)干净地去除小鼠右下后背部区域的毛发。产生全层烧伤。在烧伤创面形成之前30分钟术前皮下(SC)给予丁丙诺啡(0.1mg/KgBW)。接下来，将不锈钢棒(96.2g)在100℃水浴中加热15分钟，然后将其6mm×5mm的模板热表面放置在每只小鼠剃光的后背部30秒。术后SC给予丁丙诺啡每8小时一次，持续48小时。此后，通过去除焦痂来切除烧伤创面，然后用60μL水凝胶处理伤口。所有伤口(包括对照)均用次级Tegaderm伤口敷料覆盖。止痛SC丁丙诺啡每12小时给予一次，直到兽医进一步评估。在整个实验中，将小鼠单独圈养在环境丰容的笼子中。它们通过吸入CO2实施安乐死，然后在指定的时间点进行颈椎脱臼。

Claims (15)

1.一种包含结冷胶聚合物网络和胶原的水凝胶，所述水凝胶用于对其有需要的受试者的伤口治疗，其中所述水凝胶包含完全互穿聚合物网络，所述完全互穿聚合物网络包含交联的胶原和交联的结冷胶聚合物网络，
其中所述水凝胶包含0.2%(w/v)至5%(w/v)的结冷胶和小于0.2%(w/v)的胶原，并且
其中所述完全互穿聚合物网络是通过在已经交联的胶原存在的情况下交联所述结冷胶获得的。
2.根据权利要求1用于所述用途的水凝胶，其具有在1Hz和25℃下测量的为100至5000Pa的储能模量(G′)。
3.根据权利要求1用于所述用途的水凝胶，所述水凝胶包含0.1至0.2%（w/v）的胶原。
4.根据权利要求1用于所述用途的水凝胶，所述水凝胶包含0.2%（w/v）至2.5%（w/v）的结冷胶。
5.根据权利要求1用于所述用途的水凝胶，其中所述结冷胶通过Mg2+来交联。
6.根据权利要求1用于所述用途的水凝胶，其中所述水凝胶还包含藻类生长因子。
7.根据权利要求6用于所述用途的水凝胶，其中所述藻类生长因子为小球藻生长因子。
8.根据权利要求6用于所述用途的水凝胶，所述水凝胶包含0.1%至1%的小球藻生长因子。
9.一种伤口敷料，所述伤口敷料包含根据权利要求1所述的水凝胶。
10.根据权利要求9所述的伤口敷料，所述伤口敷料包含藻类生长因子。
11.根据权利要求9所述的伤口敷料，其包含小球藻生长因子。
12.根据权利要求9所述的伤口敷料，所述伤口敷料还包含药学上可接受的载体。
13.根据权利要求9所述的伤口敷料，所述伤口敷料用于对其有需要的受试者的伤口治疗。
14.一种细胞培养系统，所述细胞培养系统包含根据权利要求1所述的水凝胶，以及包含藻类生长因子的细胞培养基。
15.根据权利要求14所述的细胞培养系统，其中所述细胞培养基不含血清或白蛋白。
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