JP2022533544A - 創傷治療のための新規な多糖類をベースとしたヒドロゲルスキャフォールド - Google Patents

Abstract

【解決手段】 本発明は、特に創傷治療に使用するための多糖類ポリマーネットワークとコラーゲンとを含むヒドロゲルに関する。本発明はまた、ヒドロゲルを含む創傷被覆材及び細胞培養系、並びに創傷治療におけるそれらの使用にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、特に創傷治療に使用するための多糖類ポリマーネットワークとコラーゲンとを含むヒドロゲルに関する。本発明はまた、ヒドロゲルを含む創傷被覆材及び細胞培養系、並びに創傷治療におけるそれらの使用にも関する。

人体は、損傷した後に、凝固及び止血、炎症、増殖、及び再構築を含む複雑なプロセスを介して、最小限の瘢痕で皮膚の完全性を回復することができる。しかしながら、治癒のプロセスは、局所的又は全身的な要因によって阻害されることがあり、医療的処置が必要な場合がある。

したがって、創傷に苦しむ人々の生活の質を改善するために、様々な創傷治療製品が開発されてきた。創傷被覆材は、創傷に最適な微小環境を提供するか、又は創傷の治癒を促進する生体活性分子を送達することによって最適な微小環境を提供する。

創傷治療製品における現在の最新技術は、単純な創傷被覆材（すなわち包帯）から医薬的に活性な成分が組み込まれた活性な製品及びデバイスへの移行を反映している。治癒のために湿潤した環境を提供すること、感染リスクを最小限に抑えること、余分な不必要な水分を除去することなどの重要な役割を果たすことが証明されている。先進的な製品の領域では、ヒドロゲル創傷被覆材の優位性は明らかである。特にゲルの高い含水量は創傷の露出した表面との適合性を有し、治癒を著しく向上させる。比較的高い濃度の親水性ポリマー材料を含むゲルの使用により、ゲルは創傷被覆材として使用したときに、創傷と接触している間に、特に水分、例えば創傷滲出液を取り込むように効果的に機能することができる。ゲルは水性の系であるため、創傷被覆材として使用しても、創傷を全体的に乾燥させるような望ましくない効果は有さない。

ヒドロゲルは、天然又は合成由来の物理的又は化学的に架橋されたポリマーから構成される。これらのヒドロゲルの大部分は合成由来であり、細胞適合性及び生分解性は限定される。別の大きな欠陥は、細胞の増殖を支援するための動物由来の材料への依存であり、それは免疫原性及び感染のリスクなどの問題を引き起こし続けている。

ジェランガムなどの植物性多糖類ポリマーが、ヒドロゲルの製造に使用されてきた。ジェランガムヒドロゲルは生体適合性であり、組織工学のための良好な機械的特性を示す。例えば、Ｃｅｎｃｅｔｔｉらは、ジェランガムと構造及び抗付着成分として機能する硫酸化ヒアルロナンとで構成されたヒドロゲルを開発した（Ｃｅｎｃｅｔｔｉら，２０１１，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．；２２：２６３～２７１）。Ｃｅｒｑｕｅｉｒａらは、細胞の付着による創傷治療に使用するためのヒアルロン酸／ジェランガムのスポンジ様ヒドロゲルを記載している。しかしながら、細胞培養物についてのデータは２日間のみしか示されていなかった（国際公開第２０１４／１６７５１３号，Ｃｅｒｑｕｅｉｒａら，２０１４，ＡＣＳ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，６：１９６６８～１９６７９）。

Ｓｈｉｎらは、２つの変性生体高分子、ジェランガムメタクリレートとゼラチンメタクリルアミドの２段階の光架橋を使用して、細胞適合性の二重ネットワークのヒドロゲルを開発した（Ｓｈｉｎら，２０１２；ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ；３３（１１）：３１４３～３１５２）。この研究では、数日間のみの細胞生存率が示された。Ｍａｔ Ａｍｉｎらは、ジェランガムヒドロゲル中にＴｉＯ２の粒子を組み込んで細胞の付着性を改善している。しかしながら、ＴｉＯ２ナノ粒子の組み込みは、ヒドロゲル上の細胞の初期の付着を改善するだけで、長期の細胞増殖を可能にはしていない（Ｍａｔ Ａｍｉｎら，２０１２，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１２：３７４～８２）。

したがって、長期の細胞増殖を可能にする細胞の固定化のための付着部位を有する生体適合性多糖類ヒドロゲルのより効果的な解決策を開発する必要性が残っている。

本発明者らは、コラーゲンとジェランガムの相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）からなる新しい多糖類ポリマーのヒドロゲルを開発して、相互貫入ヒドロゲルを形成した。低濃度のコラーゲンの存在により、細胞の長期生存が著しく改善された。更に、本発明者らはまた、クロレラ成長因子などの藻類成長因子が、ジェランガムヒドロゲル中に封入された細胞の細胞生存率を改善することを示した。

したがって、本発明は、創傷治療においてそれを必要とする対象に使用するための、多糖類ポリマーネットワークとコラーゲンとを含むヒドロゲル、好ましくは、架橋多糖類ポリマーとコラーゲンとを含む相互貫入ポリマーネットワークを有するヒドロゲルに関する。好ましい実施形態において、ヒドロゲルは、０．２％（ｗ／ｖ）未満のコラーゲンを含む。別の好ましい実施形態では、多糖類ポリマーはジェランガムである。本発明で使用するヒドロゲルは、好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）のジェランガムを含む。別の好ましい実施形態では、ヒドロゲルのジェランガムは、Ｍｇ２＋によって架橋されている。本発明で使用するヒドロゲルはまた、藻類成長因子、好ましくはクロレラ成長因子、より好ましくは０．１～１％（ｗ／ｖ）のクロレラ成長因子を更に含むことができる。

本発明はまた、本発明のヒドロゲルと、好ましくは藻類成長因子、より好ましくはクロレラ成長因子とを含む創傷被覆材にも関する。創傷被覆材は、薬学的に許容される担体を更に含んでもよい。本発明はまた、創傷治療においてそれを必要とする対象に使用するための創傷被覆材にも関する。

別の態様では、本発明は、多糖類ポリマーネットワークとコラーゲン及び藻類成長因子、好ましくはクロレラ成長因子とを含むヒドロゲルに関する。

最後に、本発明は、上記のヒドロゲルと、藻類成長因子を含む細胞培養培地とを含む細胞培養系に関し、好ましくは、細胞培養培地は血清又はアルブミンを含まない。

図１は、０．４％のジェランガム及び０．０２％又は０．０３％のＭｇＣｌ２で形成されたジェランガムヒドロゲル中に封入されたＨＤＦの細胞生存率を示す。平均（ｎ＝３）及びＳＤを示す。 図２は、ジェランガム－コラーゲンの相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）ヒドロゲルの物理的特性を示す。ＩＰＮヒドロゲルの断面のＡ）１００ｘ、Ｂ）１５０ｘ、及びＣ）２００ｘ拡大（スケールバー：１００）でのＳＥＭ。Ｄ）円筒形状に合わせたＩＰＮヒドロゲルの画像（スケールバー：１ｃｍ）。Ｅ）（左から右へ）０．４％ジェランガム、０．４％ジェランガムと１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンの混合物、３７℃で３０分加熱した０．４％ジェランガムと１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンの混合物、３７℃で３０分加熱した後、０．０２％のＭｇＣｌ_２で架橋した０．４％ジェランガムと１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンの混合物。Ｆ）２８日間にわたるＩＰＮヒドロゲルの分解（重量損失）。平均（ｎ＝３）及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。全ての試料をそれぞれの溶液に浸漬し、６０ｒｐｍで穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。 図３Ａは、ＩＰＮヒドロゲルの細胞付着性３Ｄ微小環境の有効性を示す。ＩＰＮヒドロゲル中に封入されたＡＤＳＣの挙動をＣＬＳＭで検討した。細胞のＦ－アクチン（細胞骨格）をＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ４８８試薬で染色し、封入されたＡＤＳＣのｚ－スタック画像を取得して、ＩＰＮヒドロゲルの３Ｄネットワークの完全性を分析した。ＡＤＳＣをヒドロゲル全体に均一に分布させた。１日目からフィロポディアが観察され、インキュベーションした２１日間にわたってＡＤＳＣは増殖し続けて広がる。４－ウェルのチャンバガラススライド中に、細胞を担持したＩＰＮヒドロゲルを作製した。全ての試料を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートし、培地を２～３日毎に変えた（月曜日、水曜日、金曜日）。スケールバー：１００μｍ。 図３Ｂは、純粋なジェランガムヒドロゲルの細胞付着性３Ｄ微小環境の有効性を示す。封入されたｈＭＳＣの挙動を観察した。細胞のＦ－アクチン（細胞骨格）をＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ４８８試薬で染色し、ｚ－スタック画像をＣＬＳＭで取得して、細胞を担持した純粋なジェランガムヒドロゲルの完全性を分析した。播種の直後にはヒドロゲル全体に細胞が均一に分布していることが見られた。１日目からフィロポディアが観察され、インキュベーションの全体の期間にわたって細胞は増殖し続けて広がる。全ての試料を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートし、培地を２～３日毎に変えた（月曜日、水曜日、金曜日）。スケールバー：１００μｍ。 図４は、ＣＧＦを添加した又は添加していない細胞培養培地と接触させた純粋なジェランガム又はＩＰＮヒドロゲル中に封入されたＨＤＦの細胞生存率を示す。細胞を、１×１０^６個の細胞／ｍＬヒドロゲルの密度で９６ウェルプレートに播種した。細胞生存率は、０日目に対する百分率で表した。平均（ｎ＝３）及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。全ての試料を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートし、培地を２～３日毎に変えた（月曜日、水曜日、金曜日）。 図５は、純粋なジェランガムヒドロゲルの細胞の環境を示す。封入されたＡ）ｈＭＳＣ、及びＢ）ＡＤＳＣの細胞生存率（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊ｐ＜０．０００５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。平均（ｎ＝３）及びＳＤを示す。 図６は、様々な濃度のＦＢＳ及びＣＧＦを補充した培養培地中でインキュベートしたジェランガム－コラーゲンＩＰＮヒドロゲル中に封入されたＡＤＳＣの細胞生存率を示す。細胞を、１×１０^６個の細胞／ｍＬヒドロゲルの密度で４８ウェルプレートに播種した。ＡＤＳＣの生存率を、０、１、３、７、１４及び２１日目にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）を用いて測定した。細胞の増殖は、１、３、７、１４及び２１日目の０日目に対する生存率で表して決定した。平均（ｎ＝３）及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。全ての試料を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートし、培地を２～３日毎に変えた（月曜日、水曜日、金曜日）。 図７Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクラッチアッセイによるＡＤＳＣ担持ＩＰＮヒドロゲルの創傷治癒能力の評価。０．９ｍｍの細胞のない間隔を形成する機械的挿入物の存在によって形成された創傷領域中へのＨＤＦの移行の４８時間にわたる代表的な画像。ＨＤＦを、通常培地、ＡＤＳＣ平衡化培地、ゲル平衡化培地、又は無血清培地のいずれかに曝露した。ＡＤＳＣ平衡化培地はＡＤＳＣ担持ヒドロゲルと無血清培地を７２時間培養した後に回収し、一方、ゲル平衡化培地は無細胞ヒドロゲルと無血清培地を７２時間培養した後に回収した。ＦＢＳを含む非平衡化培養培地を陽性対照（通常）として使用し、ＦＢＳを含まない非平衡化培養培地を陰性対照（無血清）として使用した。全ての培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを含有する。 図７Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクラッチアッセイによるＡＤＳＣ担持ＩＰＮヒドロゲルの創傷治癒能力の評価を示す。ＡＤＳＣ平衡化培地に曝露したＨＤＦの移行は、通常培地に曝露したＨＤＦの移行と統計的に有意に異なるものではなかった（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊ｐ＜０．０００５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。しかしながら、ＡＤＳＣ平衡化培地に曝露したＨＤＦの移行は、ゲル平衡化培地に曝露したＨＤＦとは統計的に有意に異なっていた。平均（ｎ＝３）及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。全ての試料を、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。 図８は、ヒトＴＳＧ－６のＥＬＩＳＡアッセイ。Ａ）ヒトＴＳＧ－６のＥＬＩＳＡの検量線を示す。Ｌｏｇ_１０（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）＝０．５１０４＊Ｌｏｇ_１０［ヒトＴＳＧ－６］ｎｇ／ｍＬ－０．８５７８。未知のヒトＴＳＧ－６濃度は、以下の式から計算することができる：［ＴＳＧ－６］ｎｇ／ｍＬ＝１０＾（［Ｌｏｇ（ａｂｓ_４５０）＋０．８５７８］／０．５１０４）。Ｂ）通常培地、ＡＤＳＣ条件培地、ゲル条件培地及び無血清培地中で検出されたヒトＴＳＧ－６の濃度。較正曲線から値を計算した。ＡＤＳＣ平衡化培地は、他の形態の培養培地よりも統計的に有意に多量のヒトＴＳＧ－６を含有することが認められた（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００５、^＊＊＊ｐ＜０．０００５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。平均（ｎ＝５）及びＳＤを示す。 図９は、ｉｎ ｖｉｖｏでの完全な厚さの熱傷創傷の形成手順を示す。

本発明者らは、細胞の長期生存を可能にする多糖類ポリマーネットワークとコラーゲンとを含む新しいヒドロゲルを開発した。したがって、本発明は、多糖類ポリマーネットワークとコラーゲンとを含むヒドロゲルに関する。

本明細書で使用する場合、用語「ヒドロゲル」とは、ヒドロゲルに高い含有量で水を吸収及び保持し、粘弾性特性を獲得し、酸素、栄養素、及び廃棄物の輸送を促進する能力を付与する可溶性ポリマーの化学的又は物理的架橋によって生成される親水性高分子ネットワークを指す。

本発明において、ヒドロゲルは多糖類ポリマーネットワークを含む。本明細書で使用する場合、用語「多糖類」とは、多糖類及びそれらの誘導体を指す。

多糖類とは、グルコシド結合によって一緒に結合された繰り返し単位で形成された高分子炭水化物構造を指す。これらの構造は、直鎖であってもよく、様々な分枝を含んでもよい。用語「多糖類」とは、単一の多糖類又は２つ以上の多糖類の混合物を指す。好ましい実施形態では、多糖類は単一の多糖類である。本発明において、多糖類は、好ましくは、動物由来の多糖類、植物由来の多糖類、藻類由来の多糖類、細菌由来の多糖類、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択され、好ましくは植物由来の多糖類からなる群から選択される。より好ましくは、多糖類は、キサンタンガム、ジェランガム、λ－カラギーナン及びκ－カラギーナン、ι－カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、寒天、アラビアガム、ヒアルロン酸、デキストラン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択され、好ましくはジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、グアーガム及びデキストランからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、多糖類はジェランガムである。ジェランガムは、スフィンゴモナス・パウシモビリスによって分泌され、それはＭｏｏｒｈｏｕｓｅ．Ｒらによって最初に１９８１，ＡＣＳ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ．Ｎｏ．１５０，ｐ．１１１に記載された。それは、β－Ｄ－グルコース、β－Ｄ－グルクロン酸、及びα（Ｌ－ラムノース）モノマーを２：１：１のモル比で含む四糖類の繰り返し単位からなる。それは、一般に２つの構成で存在し、一つは細菌によって分泌された生成物である高アシル含有量を有するものであり、他方はよく知られた処理された低アシル含有量を有するものである。ジェランガムとしては、限定されるものではないが、低アシルジェランガム、高アシルジェランガム、化学修飾ジェランガム、又はそれらのジェランガムポリマーの任意の混合物が挙げられる。好ましくは、ジェランガムは、低アシルジェランガムである。

多糖類ヒドロゲルは、多糖類を架橋剤と混合することによって得ることができる。好ましい実施形態において、多糖類がジェランガムである場合、イオン性架橋剤はカチオンであり、より好ましくは二価カチオンである。二価カチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｒａ２＋、Ｂｅ２＋からなる群から選択され、好ましくはＭｇ２＋である。二価カチオン、好ましくはＭｇ２＋の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．０３％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）である。

より良好な結果のための一実施形態では、本発明のヒドロゲル中の多糖類、好ましくはジェランガムの濃度は、０．１％～１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％～５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．２％～２．５％（ｗ／ｖ）、又は０．２％～１％（ｗ／ｖ）である。更により好ましくは、ヒドロゲル中のジェランガムの濃度は、０．４％（ｗ／ｖ）である。

特に、ジェランガム又はカラギーナンなどの多糖類は、安定したヒドロゲルを形成するためにイオンの存在を必要とする。多糖類は、その鎖の線形化を促進する温度で溶媒中に均一に分散させることができ、温度を低下させることにより、またイオンの存在下でヒドロゲルを形成させることができる。本発明において、好適な溶媒は水性溶液であり、好ましくは、水、細胞培養培地、水性食塩水溶媒、又はそれらの混合物である。本発明において使用する水は、精製水又は滅菌水である。

温度によって触媒されるゲル化に加えて、水溶液のｐＨを変化させることによって多糖類ヒドロゲルを形成させることもできる。

本発明者らは、ジェランガムとコラーゲンによって形成された完全な相互貫入ネットワークを有するヒドロゲルによって、細胞の長期生存が改善されることを示した。したがって、本発明のヒドロゲルはコラーゲンを含む。好ましい実施形態において、ヒドロゲルは、架橋多糖類ポリマーと架橋コラーゲンとを含む完全な相互貫入ポリマーネットワークを有する。コラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型天然コラーゲンなどの天然コラーゲン、アテロペプチドコラーゲン及び再生コラーゲンから選択される。好ましい実施形態において、コラーゲンはＩ型コラーゲンである。好ましい実施形態において、ヒドロゲルは、０．２％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは０．２～０．１％（ｗ／ｖ）のコラーゲンを含み、より好ましくは０．１％のコラーゲンを含む。好ましくは、ヒドロゲルは０．２０％未満、より好ましくは０．２～０．１％のＩ型コラーゲン、より好ましくは０．１％のＩ型コラーゲンを含む。

ヒドロゲルは、１つ以上の活性治療薬又は抗菌剤を更に含んでもよい。好適な治療薬としては、成長因子、鎮痛剤、局所麻酔剤、及びステロイドが挙げられる。好適な抗菌剤としては、銀化合物（例えば、スルファジアジン銀）及びクロルヘキシジンなどの消毒薬、及び抗生物質などが挙げられる。

本発明者らは、藻類成長因子を含む本発明のヒドロゲルが細胞生存率を特に改善することを示した。したがって、特定の実施形態では、藻類成長因子が本発明のヒドロゲルに組み込まれる。これは、ヒドロゲルを藻類成長因子溶液で処理することによって、又は多糖類をゲル化の前に藻類成長因子を含む溶媒と混合することによって行うことができる。

藻類抽出物は、細胞の増殖の促進を示し、本明細書では藻類成長因子と称される。本発明において、藻類成長因子とは、藻類細胞由来の任意の画分、抽出物、又は単離された又は精製された分子を意味する。一実施形態において、成分は、タンパク質又は核酸である。別の実施形態では、成分はファイトケミカルである。別の実施形態では、成分は藻類の画分である。抽出物は、例えば、アルカリ溶解又は有機溶媒抽出、高圧均質化、米国特許第５，３３０，９１３号に記載のビーズミリングなどの当該技術分野において既知の好適な技術に従って調製することができる。藻類、特にクロレラの抽出に使用される好ましい方法は、国際公開第２０１６／００９１４５号に記載されている。

「藻類」とは、クロレラや珪藻などの単細胞微細藻類属から多細胞の形態までの範囲の生物を含む光合成真核生物を意味する。本発明において、藻類は、好ましくは緑藻類であり、より好ましくは緑藻植物門のものである。好ましい実施形態では、藻類は、単細胞緑藻類の属を指すクロレラである。クロレラ種としては、これらに限定されるものではないが、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ａｎｔａｒｔｉｃａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｃｏｌｏｎｉａｌｉｓ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｅ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆａｇｉｎｅａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｇｌｏｒｉｏｓａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｈｅｌｉｏｚｏａｅ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｉｎｆｕｓｉｏｎｕｍ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｗｉｎｉｉ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｍｉｎｉａｔａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｎｏｃｔｕｒｎａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｎｏｒｄｓｔｅｄｔｉ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、及びｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａが挙げられ、好ましくは、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ又はｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓである。既知の多くのクロレラ種は、データベースＡｌｇａｅＢａｓｅ（Ｇｕｉｒｙ，Ｍ．Ｄ．及びＧｕｉｒｙ，Ｇ．Ｍ．，２０１９，ＡｌｇａｅＢａｓｅ．Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｇａｌｗａｙ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｇａｅｂａｓｅ．ｏｒｇ）に見ることができる。

好ましい実施形態において、クロレラ成長因子は、クロレラ、好ましくはｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ又はｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、より好ましくはｃｈｌｏｒｅｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓに由来する画分又は抽出物である。

好ましい実施形態において、本発明のヒドロゲルは、０．０５～１０％、又は０．０５～５％、好ましくは０．１～２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．３３～１％（ｗ／ｖ）のクロレラ成長因子を含む。

本発明のヒドロゲルは、特に弾性特性及び貯蔵エネルギーの観点から良好な機械的特性を示す。特に、２５℃、１Ｈｚで測定されたヒドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は、１００～５０００Ｐａ、好ましくは５００～５０００Ｐａ、１０００～３０００Ｐａ、又は２０００～３０００Ｐａであり、より好ましくは２０００～２５００Ｐａである。本発明の貯蔵弾性率（Ｇ’）は、実施例に記載するように、プレート－プレート形状（直径＝８ｍｍ、作業間隙＝１ｍｍ）を使用して、振動レオメーター（ＭＣＲ３０２、Ａｎｔｏｒ Ｐａａｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）で測定される。

ヒドロゲルの調製方法
本発明のヒドロゲルの調製は、コラーゲンを含む溶媒中への多糖類の溶解と、網状化するための架橋メカニズムの使用とを含む。

特定の実施形態では、多糖類ヒドロゲルは、ジェランガムヒドロゲルであり、熱及び／又はイオン架橋によって調製される。好ましい実施形態では、本発明のジェランガムヒドロゲルは、ポリマーの臨界ゲル化温度を超える温度、一般的には９０℃でジェランガムを溶媒に溶解させ、ポリマーの臨界ゲル化温度より低い温度に下げることによって、及び／又はジェランガム溶液をイオン性架橋剤と混合することによって調製される。

好ましい実施形態では、ヒドロゲルは、コラーゲンと多糖類ポリマーとを含む完全な相互貫入ポリマーネットワークであり、多糖類ポリマーは、既に架橋されたコラーゲンの存在下で架橋されている。したがって、コラーゲンは、ポリマーの臨界ゲル化温度より低い温度に下げた後、かつジェランガム溶液をイオン性架橋剤と混合して相互貫入ネットワークを形成させる前に添加することができる。

好ましい実施形態では、ジェランガムを９０℃で加熱してランダム鎖を伸ばした後、３７℃に冷却して二重螺旋を形成させ、氷冷して中和されたコラーゲンを添加して、ジェランガム溶液に混合した後に、ＭｇＣｌ_２で架橋する。

特に、本発明のヒドロゲル中の多糖類、好ましくはジェランガムの濃度は、０．１％～１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％～５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．２％～２．５％（ｗ／ｖ）又は０．２％～１％（ｗ／ｖ）である。更により好ましくは、ヒドロゲル中のジェランガムの濃度は、０．４％（ｗ／ｖ）である。

好ましい実施形態において、ヒドロゲルは、０．２％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは０．２～０．１％（ｗ／ｖ）のコラーゲンを含み、より好ましくは０．１％のコラーゲンを含む。好ましくは、ヒドロゲルは、０．２％未満のＩ型コラーゲン、より好ましくは０．２～０．１％のＩ型コラーゲン、より好ましくは０．１％のＩ型コラーゲンを含む。

好ましい実施形態では、ヒドロゲルの調製に使用する溶媒は、水系溶媒、例えば、脱イオン水、リン酸緩衝溶液などである。

特定の実施形態において、溶媒は藻類成長因子を含み、ヒドロゲルに対するクロレラ成長因子の最終濃度は、０．０５～１０％（ｗ／ｖ）又は０．０５～５％のクロレラ成長因子であり、好ましくは０．１～２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．３３～１％（ｗ／ｖ）である。

好ましい実施形態では、イオン性架橋剤は、カチオン、好ましくは二価カチオンであり、より好ましくは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｒａ２＋、Ｂｅ２＋からなる群から選択され、好ましくはＭｇ２＋である。

創傷被覆材
別の態様では、本発明は、本発明のヒドロゲルを含む創傷被覆材に関する。創傷被覆材によって、本発明のヒドロゲルを創傷と接触させて配置することができる。特定の実施形態では、創傷被覆材は、吸収性材料としての本発明のヒドロゲル及びバッキング層を含む。バッキング層は、創傷被覆材を通る微生物の通過に対するバリアを提供する。バッキング層は、液体不透過性であっても半透過性であってもよい。好ましくは、バッキング層は、酸素及び水蒸気に対しては透過性であるが、液体の水又は創傷滲出物に対しては透過性ではない。バッキング層はまた、微生物不透過性である。創傷被覆材はまた、吸収層に面するバッキング層上に接着剤層を含んでもよい。好ましくは、接着剤層は、吸収層から外向きに拡がり、バッキング層上に接着剤でコーティングされた縁部を形成する。接着剤層及び／又はバッキング層は、吸収パッドを創傷上に保持し、創傷の周囲の無菌環境の維持に役立つ。一般に、接着剤及びバッキング層は薄くて可撓性である。

特定の実施形態において、本発明のヒドロゲルを含む創傷被覆材は、１つ以上の活性治療薬又は抗菌剤を含んでもよい。特定の実施形態では、活性剤又は抗菌剤は、ヒドロゲル中に添加されてもよく、又は創傷被覆材に別に添加されてもよい。好ましい実施形態では、創傷被覆材は、上記のような藻類成長因子を更に含む。したがって、藻類成長因子は、ヒドロゲル中に含まれてもよく、又は創傷被覆材に別に添加されてもよい。

別の特定の実施形態では、本発明の創傷被覆材は、許容される局所用担体を含んでもよい。用語「許容される局所用担体」とは、薬学的に許容される担体及び化粧品的に許容される担体の両方を包含し、活性成分を皮膚に送達するために好適な実質的に非刺激性の適合性成分を包含する。本明細書で使用する場合、用語「適合性」とは、創傷の治療に使用している間のヒドロゲルの有効性を実質的に低下させるような相互作用のない様式で、担体の成分がヒドロゲルと混合できなければならないことを意味する。これらの担体は、当然のことながら、ヒト又は下等動物の皮膚への長期の局所投与にそれらを適したものにするために、純度が十分に高く、毒性が十分に低くなければならない。

治療における使用
本発明のヒドロゲル又は創傷被覆材は、創傷治療においてそれを必要とする対象に使用することができる。

本明細書で使用する場合、用語「対象」又は「患者」とは、哺乳類を指す。本開示の治療方法から利益を得ることができる哺乳類種としては、これらに限定するものではないが、ヒト、例えば、類人猿、チンパンジー、サル、及びオランウータンなどの非ヒト霊長類、イヌ及びネコ、並びにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヤギなどの家畜を含む飼い慣らされた動物、又は、限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳類種が挙げられる。

用語「創傷」とは、皮膚及び粘膜の損傷を広く指すために使用される。具体的には、「創傷」という用語は、皮膚又は肉の切断、穴、及び熱傷などの身体の損傷領域を指す。創傷は、慢性又は急性の創傷であってもよい。急性創傷は、事故又は外科的な損傷に起因して突然生じる皮膚、粘膜の損傷である。慢性創傷は、型どおりに、かつ適時には治癒しない創傷である。慢性創傷としては、静脈及び動脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡、放射線障害、感染、又は虚血が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療する」、又は「処置する」とは、患者の状態を改善することを意図する全ての行為を指す。特定の実施形態において、このような用語は、創傷治癒の改善を指す。本明細書で使用する場合、用語「創傷治癒」とは、皮膚又は粘膜が損傷後にそれ自体を修復する複雑なプロセスを指す。

関連する態様では、本発明は、創傷の治療に使用するための薬剤の調製における本発明のヒドロゲル又は創傷被覆材の使用に関する。

更なる態様では、本発明は、創傷治療を、それを必要とする対象において行う方法に関し、方法は、治療有効量の本発明のヒドロゲル又は創傷被覆材を対象の創傷の表面に局所投与することを含む。局所投与は、皮膚及び粘膜への適用を含む。

この局所投与は、単回投与量であっても、複数回の所定の間隔で投与される反復投与量であってもよい。当業者には、好ましい投与レジメンは、治療する損傷の種類及び重症度によって変わることが容易に理解される。

「治療有効量」とは、創傷治癒の促進などの所望の治療結果を得るために必要な用量及び期間において有効な量を指す。ヒドロゲル又はそれを含む創傷被覆材の治療有効量は、創傷の種類（機械的又は熱的、完全な又は部分的な厚さなど）、創傷の大きさ、創傷の深さ（完全な厚さの場合）、感染の有無、損傷による影響からの経過時間、及び年齢、身体的状態、他の疾患状態の存在、及び患者の栄養状態などの要因によって変化する。

投与レジメンは、最適な治療応答が得られるように調節することができる。治療有効量はまた、一般的に、治療上の有益な効果が製品又は医薬組成物の全ての毒性又は有害な影響を上回る量である。

細胞培養系
本発明のヒドロゲルは、細胞の培養及び支持に好適である。したがって、本発明はまた、本発明のヒドロゲルと、藻類成長因子を含む培養培地とを含む細胞培養系にも関する。具体的には、細胞培養系は、多糖類ポリマーネットワーク及びコラーゲンを含むヒドロゲルと、藻類成長因子を含む培養培地とを含む。

特に、培養細胞系は、２Ｄ又は３Ｄ培養の細胞系であってもよい。２Ｄ培養細胞系では、細胞は、細胞培養培地中で、本発明のヒドロゲル上で培養される。３Ｄ培養系では、細胞は、細胞培養培地中の本発明のヒドロゲルの中に埋め込まれる。

培養細胞培地は、細胞の培養及び支持を可能にする少なくとも１つ以上の成分を含む基本培地を含んでもよい。多くの基本培地が市販されており、当業者には公知である。この培地は、特に、ミネラル塩、アミノ酸、ビタミン、及び細胞に必須の炭素源、並びにｐＨを調節するための緩衝系を含む最少培地であってもよい。本発明の方法で使用することができる基本培地としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、及びＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。使用する培地に応じて、グルタミン、ビタミンＣ、ストレプトマイシン、ペニシリン、及び／又はファンギゾン（アンホテリシンＢ）のような抗真菌剤などの１つ以上の抗生物質の添加が必要であるか、又は望ましい場合がある。

好ましい実施形態によると、培地は上記の藻類成長因子を含む。

より好ましい実施形態では、培地は、動物由来の血清又は血清アルブミンを含まない。血清は、ヒト患者又はプールされたヒト血清、ウシ胎児血清又はウシ血清である。アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンである。

本発明の細胞培養培地を使用して培養することができる細胞としては、幹細胞、誘導多能性幹細胞、前駆細胞、及び分化細胞が挙げられる。

本発明のヒドロゲルを使用することができる細胞培養を含む応用例としては、これらに限定されるものではないが、ｉｎ ｖｉｖｏで見られる環境により密接に近い環境におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞及び組織の増殖（例えば、研究ツールとして）、そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養物又は組織における医薬化合物のスクリーニング及び毒物学的アッセイ、細胞療法、細胞送達、薬物送達、生化学的置換、生物学的活性分子の生産、組織工学（例えば、エクスビボ器官モデル、組織外植片、ｉｎ ｖｉｖｏの組織再生）、生体材料、及び臨床試験が挙げられる。

本発明の以下の実施例は、本出願に記載される実施形態に限定されるものではなく、当業者は、特許請求の範囲に記載されている主要な概念から逸脱することなく、多くの可能な変更を予測することができる。

１． 材料
低アシルジェランガム（Ｇｅｌｚａｎ（商標）ＣＭ、Ｇ１９１０）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２、２０８３３７）、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｓ８２８２）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、Ｓ８０４５）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３、Ｓ５７６１）、塩化カリウム（ＫＣｌ、Ｐ９５４１）、低グルコース（Ｄ５５２３）及び高グルコース（Ｄ１１５２）ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）溶液（Ａ６９６４）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ４３３３）、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｐ６１４８）、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）は、シグマ・アルドリッチ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Ｓ３４９００）は、ユニケム社（インドマハーラーシュトラ州ムンバイ）から入手し、全ての塩は無水の形態で受領した。ラット尾由来１型コラーゲン（ＳＣ－１３６１５７）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（米国テキサス州ダラス）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（米国ユタ州サウスローガン）から入手した。脱イオン水は、Ａｄｒｏｎａ Ｃｒｙｓｔａｌのｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｗａｔｅｒ ｐｉｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ラトビア、リガ）製の濾液であった。超高純度グレードのリン酸緩衝生理食塩水（１０ｘ ＰＢＳ）は、Ｖｉｖａｎｔｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｄｎ Ｂｈｄ（マレーシアセランゴール州スバン・ジャヤ）から購入した。０．２２μｍのフィルターユニットは、ザルトリウス社（ドイツ、ゲッティンゲン）から入手した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）は、プロメガ（米国ウィスコンシン州マディソン）から購入した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘは、バイオ・ラッド ラボラトリーズ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）から入手した。Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ ４８８試薬（ａｂ１７６７５３）は、アブカム（英国ケンブリッジ）から入手した。４－ウェルチャンバスライド及びそれらのそれぞれのチャンバガラスカバーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。ＴＳＧ－６ ＥＬＩＳＡキットは、レイバイオテック（米国ジョージア州ピーチツリー・コーナーズ）から入手した。

ヒト胚線維芽細胞（ＨＤＦ）、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰＴ－２５０１）及び脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ、ＰＴ－５００６）は、ロンザ社バイオサイエンス事業部（シンガポール）から購入した。全ての幹細胞ドナーは、マイコプラズマ、細菌、酵母、及び真菌、またＨＩＶ－１、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎に対して試験で陰性であった。ｈＭＳＣは、５継代にわたって、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ１６６を発現し、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、及びＣＤ４５を発現しないことが保証された。ＡＤＳＣは、５継代にわたって、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ１６６を発現し、ＣＤ１４、ＣＤ３１、及びＣＤ４５を発現しないことが保証された。

２． ジェランガムヒドロゲルの調製
ジェランガム溶液を、乾燥ジェランガム（Ｇｅｌｚａｎ（商標）ＣＭ、Ｇ１９１０、シグマ・アルドリッチ）を０．７６２％（ｗ／ｖ）の濃度で水に溶解させて調製する。３１５μＬのジェランガム溶液を、乾式熱浴上、９０℃で３０分間インキュベートする。次いで、ジェランガム溶液を、乾式熱浴上、３７℃で少なくとも１５分間インキュベートする。

中和した３．３３ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲン（ｓｃ－１３６１５７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を新たに調製する。１８０μＬのコラーゲン溶液を３１５μＬのジェランガム溶液に移す。

ジェランガムをコラーゲンの前に架橋させる場合（完全に同時のＩＰＮ（最初にジェランガムの架橋））、イオン性架橋剤ＭｇＣｌ_２を室温で混合物に添加し、最後に、混合物をコラーゲンの原線維形成のために３７℃で３０分間加熱する。

コラーゲンをジェランガムの前に架橋させる場合（完全に同時のＩＰＮ（最初にコラーゲンの架橋））、混合物を３７℃で２０～３０分間インキュベートする。イオン性架橋剤溶液を０．１１４％（ｗ／ｖ）のＭｇＣｌ_２で調製して、ジェランガム－コラーゲン溶液中に移し、溶液を室温で５分間静置する。

ジェランガム、ＭｇＣｌ_２及びコラーゲンの最終濃度は、それぞれ０．４％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、及び１ｍｇ／ｍｌである。

３． ジェランガムヒドロゲルのゲル化
３．１ 流動測定法
ヒドロゲルのレオロジー特性評価は、プレート－プレート形状（直径＝８ｍｍ、作業間隙＝１ｍｍ）を使用した振動式レオメーター（ＭＣＲ３０２、オーストリア、アントンパール）を用いて行った。各試験の前に、１００μＬの新たに調製したヒドロゲルをレオメーターのベースプレート上に迅速に移した。ヒドロゲル組成物当たり３つの異なる試料を使用して試験を行った。上部コーンプレートをベースプレートと１ｍｍの間隔に下げた後、ヒドロゲル試料を１分間安定化させた。全ての測定は２５℃で行った。

常に振幅掃引を最初に行って、線形粘弾性領域（ＬＶＲ）の限界を決定した。限界は、試料を変形させることなく、振動数掃引を行うことができるパーセント剪断ひずみである。１Ｈｚの一定の振動数で、０．１～１００％の剪断ひずみの範囲の間で貯蔵（Ｇ’）及び損失（Ｇ”）弾性率を得た。プロットしたグラフ上で定規を使用して、線形の限界を決定した。

ヒドロゲルの剪断依存性の挙動及び内部構造を、振動数掃引によって検討した。Ｇ’及びＧ”の弾性測定を、０．１～１００ｒａｄ／ｓの最小から最大の振動数で行った。各測定の開始前に、剪断ひずみを先に決定したＬＶＲより低く一定に設定した。

ＩＰＮヒドロゲルの温度依存性及び時間依存性のゲル化挙動を理解するために、一定の動的粘弾性測定を行った。温度掃引及び時間掃引の両方を、１％の一定の剪断ひずみ及び１Ｈｚの一定の振動数で行った。温度掃引では、－２℃^－１で５０～１０℃で測定を行った。一方、時間掃引では、ヒドロゲル試料には平衡化のための時間をかけずに、５秒毎に最大２分までＧ’／Ｇ”の測定を行った。

レオロジー掃引の結果は、両方の軸を対数スケールとして、Ｇ’とＧ”をｙ軸上にプロットし、それぞれのパラメータをｘ軸上にプロットして図に示した。

３．２ ゲル収率の方法
ゲル収率については、６００μＬのヒドロゲル（ｎ＝３）を拭き取り乾燥して、凍結乾燥の前に秤量した（Ｗ_ｉ）。凍結乾燥したヒドロゲルを、３７℃の脱イオン水６００μＬに６０ｒｐｍで一定に撹拌しながら３日間浸漬した。次に、再構成された湿潤ヒドロゲルを、拭き取り乾燥して、再秤量した（Ｗ_ｒ）。ゲル収率の百分率を、以下の等式に従って決定した。

３．３ 結果
細胞の挙動は、ヒドロゲルスキャフォールドの剛性に大きく影響される（Ｂｉｓｃｈｏｆｓ，Ｉ．Ｂ．及びＵ．Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｚ．ＰＮＡＳ，２００３，１００（１６）：９２７４～９２７９；Ｆｒａｔｚｌ，Ｐ．及びＦ．Ｇ．Ｂａｒｔｈ．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６２（７２７２）：ｐ．４４２；Ａｈｅａｍｅ，Ｍ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｆｏｃｕｓ，２０１４，４（２）：ｐ．２０１３００３８）。Ｇ’（貯蔵弾性率）が高くなるほど、材料は硬い。Ｅｎｇｅｒらは、３，０００Ｐａ未満の貯蔵弾性率を有するより軟らかい材料では、自発的な分化が誘導されないことを示唆している（Ｅｎｇｌｅｒ，Ａ．Ｊ．ら．Ｃｅｌｌ，２００６．１２６（４）：ｐ．６７７～６８９）。一方、より軟らかいゲルは、細胞の付着を促進する細胞のコンテクストを確立しない場合があり（Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．ら．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５．３１０（５７５１）：１１３９～１１４３）、２，０００～３，０００Ｐａを超える貯蔵弾性率を有するヒドロゲルのみが、細胞の付着及び拡散を促進した（Ｙｅｕｎｇ，Ｔ．ら．Ｃｅｌｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｔｏｎ，２００５．６０（１）：２４～３４）。また、以前の研究では、既存のヒドロゲルネットワークへのゼラチン（コラーゲンの化学誘導体）の組み込みによって、その貯蔵弾性率が２．４～３．４倍増大することが示されている（Ｍｉａｏ，Ｔｅｔら．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ ２０１５，３（４８），９２４２～９２４９）。したがって、得られる相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）ヒドロゲルの貯蔵弾性率が、細胞の拡散及び非自発的な分化に最適な範囲の中にあることを確実にするために、０．４％（ｗ／ｖ）のジェランガムと０．０２％（ｗ／ｖ）のＭｇＣｌ_２の濃度を選択した（表１）。

０．４％（ｗ／ｖ）のジェランガムと０．０３％（ｗ／ｖ）のＭｇＣｌ_２の組合せは、潜在的な細胞毒性の問題のために選択しなかった（図１）。

ＩＰＮの形成に最も一般的に使用された技術は、同時の、しかし直交する架橋を行う前にポリマーを溶液中で混合するというｉｎ－ｓｉｔｕでの調製である。しかしながら、コラーゲンガムとジェランガムとの混合によって、イオン架橋するためのジェランガム上のカルボキシレート基同士の接近が少なくなる。２ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含む半ＩＰＮは形成されなかった（表２）。この問題を克服するために、本発明者らはコラーゲン濃度の低減を考えた。コラーゲン濃度を１ｍｇ／ｍｌに低下させた場合に、弱いヒドロゲルが形成された。

次に、本発明者らは、ジェランガムヒドロゲルネットワークからのコラーゲンの急速な漏出を低減するために、完全なＩＰＮヒドロゲルの形成を探索した。ジェランガムをコラーゲンの前に架橋した場合、試みは成功しなかった。順序を逆にした場合、２３５３．９±１１０．２Ｐａの平均貯蔵弾性率を有する完全に同時のＩＰＮヒドロゲルが成功裏に作製された。その後、このＩＰＮヒドロゲルを以下の実験で使用した。

平均貯蔵弾性率が２３５３．９±１１０．２Ｐａのジェランガム－コラーゲンのＩＰＮヒドロゲルのレオロジー特性を下の表３に示す。

したがって、２３５３．９±１１０．２Ｐａの貯蔵弾性率は、間葉系幹細胞に良好に適する。

ゲル化温度及びゲル化時間の両方について得られた結果から、後続の臨床使用に関する重要な情報が得られる。皮膚の表面の温度は、３４℃である。ジェランガムが低温でのゲル化メカニズムを示すことから、架橋剤の添加によって、ＩＰＮヒドロゲルを皮膚上で直接形成することができる。急速なゲル化時間は、注入可能な系におけるＩＰＮヒドロゲルの使用に有用である。

ゲル収率は、ヒドロゲルネットワークの堅牢性を反映している。より高いゲル収率は、ヒドロゲルが、その含水量の吸収及び蒸発に応答して膨張及び収縮できることを示している。コラーゲンの組み込みによって、ジェランガムヒドロゲルのゲル収率は８５．９±５．２％から９５．８±１．５２％に増加する（表４）。

３．４ 走査電子顕微鏡
３．４．１ 方法
凍結乾燥したヒドロゲル試料を、まず液体窒素中で凍結させた後、それらの横断面で分割した。次いで、切開したヒドロゲルを、それらの断面が電子放射源に面した状態で、ピンスタブ上に迅速に載せた。その後、試料を金でスパッタコーティングして、ＪＥＯＬ ＪＳＭ ６５１０走査電子顕微鏡（日本電子株式会社、日本東京都昭島）で検査した。最大の孔径を、内蔵スケールバーを参照して計算した。各標本の断面の少なくとも３つの異なる位置を撮像した。このプロセスを、３つの異なる光学ズームで繰り返した。

３．４．２ 結果
ＩＰＮヒドロゲルの多孔質構造は、封入された細胞と細胞外の培地との間の栄養素、代謝産物、及びその他の重要な調節分子の輸送を可能にする（図２Ａ～Ｃ）。

３．５ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒドロゲルの分解の検討
３．５．１ 方法
０．３５ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．６８ｇのＮａＣｌ、２．５ｇのＮａＨＣＯ_３及び０．２２ｇのＫＣｌを１００ｍＬの脱イオン水（ｐＨ＝８．００±０．０５）に溶解させて、疑似傷口液（ＳＦＷ）を調製した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分解の検討では、６００μＬのヒドロゲルを２ｍＬのエッペンドルフチューブ中で形成した後、拭き取り乾燥して、１５ｍＬのファルコンチューブ（ｎ＝３）に移した。各ファルコンチューブを移す前と後に計量して、ヒドロゲルの初期重量（Ｗｉ）を決定した。ヒドロゲルを２ｍＬの１ｘＰＢＳ、培養培地、又はＳＷＦに浸漬して、３７℃、６０ｒｐｍの一定の撹拌下で、合計２８日間にわたってインキュベートした。１、３、７、１０、１４及び２８日目にファルコンチューブを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄みをデカントし、残ったヒドロゲルを拭き取り乾燥して、秤量した（Ｗ_ｄ）。各タイムポイントの０日目に対する湿潤ヒドロゲルの質量の差を、以下の等式（式（１））によって計算した。２ｍＬの新鮮な１ｘＰＢＳ、培養培地、又はＳＷＦを、２８日目のインキュベーションまで各タイムポイントの後に補充した。
質量変化％＝（Ｗ_ｄ／Ｗ_ｉ）×１００ （１）
Ｗ_ｉ－初期の湿潤ヒドロゲルの重量
Ｗ_ｄ－各タイムポイントにおける湿潤ヒドロゲルの重量

３．５．２ 結果
定性的な反転試験から、ジェランガム及びジェランガム－コラーゲンが透明な自由流動性溶液であることが示された。ジェランガム－コラーゲン混合物を３７℃で３０分間加熱した場合、その重さを保持することができる固体の塊が形成された。後続のＭｇＣｌ_２による架橋によって同じ固体の質量が保持された。エッペンドルフチューブを反転させた時に透明な内容物が流れなかった場合に、ＩＰＮヒドロゲルのゲル化が定性的に示された（図２Ｄ～Ｅ）。

経時的な重量損失をヒドロゲルの分解の尺度として使用した。物理的に架橋したヒドロゲルでは、イオン交換メカニズムによる架橋の緩やかな崩壊によって分解が観察される。次いで、遊離ポリマー物質が溶媒中に拡散してゲルの質量が減少する。ＳＷＦとインキュベーションした１２日後では、８０％超のＩＰＮヒドロゲルが残った（図２Ｆ）。したがって、それらは創傷床上で少なくとも１週間、構造的完全性を保持できると期待される。

４． ｉｎ ｖｉｔｒｏでの特性評価：封入された細胞の細胞付着。
４．１ 封入された細胞の細胞付着の評価方法
形態学的検討のために、１０００細胞／μＬを含有する２００μＬのヒドロゲルを、８チャンバ（ＨＤＦ）及び４チャンバ（幹細胞）のガラススライド（ｎ＝２）の各ウェルに加えた。４００μＬの培地を各ＨＤＦ担持ヒドロゲルに添加し、一方、８００μＬの培地を各幹細胞担持ヒドロゲルに添加した。細胞を染色し、同じ日（０日目）に画像化した。様々な継続時間でインキュベートした細胞を可視化するために、それらをカウントダウン様式で播種した。

製造業者のプロトコルに従って細胞を染色した。簡潔に述べると、細胞培養培地を慎重に吸引して、全てのヒドロゲルを除去されないようにした。各ヒドロゲルを１ｘＰＢＳで１回すすいでフェノールレッドを除去した。封入された細胞を固定するために、細胞担持ヒドロゲルを、ＰＢＳ中４％のホルムアルデヒド２００μＬ（ＨＤＦ）又は５００μＬ（幹細胞）と共に３０分間インキュベートした。その後、細胞を同じ体積の０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００と共に５分間インキュベートして、細胞透過性を増加させた。次いで、透過性を亢進させた細胞を、１ｘファロイジンコンジュゲート作用溶液中、暗所で９０分間インキュベートした。続いて、全ての染色した細胞を、１ｘＰＢＳで３回、完全に洗浄して過剰なファロイジンコンジュゲートを除去し、これは、ヒドロゲルネットワーク中に捕捉された残留物が残ることを避けるための重要な工程である。

共焦点ｚ－スタック画像を、２０ｘ／１．４５の油浸対物レンズのオリンパスＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０００（オリンパス、日本）共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）で、励起源として５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いて撮像した。画像は、４×３フレームのタイルスキャンモードでステッチした。画像をＩｍａｒｉｓ９．１．３（英国ベルファスト）によりデジタル積層して、ヒドロゲル中に封入された細胞の３Ｄ画像を生成した。

４．２ 結果
コラーゲンを含まないジェランガムヒドロゲル上で培養された高密度線維芽細胞（ＨＤＦ）（下パネル）は、０日目から７日目まで顕著には広がらず、増殖しない。対照的に、コラーゲンを含むジェランガムヒドロゲル上で培養されたＨＤＦは、広がって増殖することができる（細胞密度の増加によって示される）。

３Ｄ共焦点画像により、ヒドロゲル中に封入された細胞がどのように広がるかを観察することができる。間葉系幹細胞は、ＩＰＮヒドロゲルマトリックス中に広がり始めて細胞突出部を形成し始めた（図３Ａ）。一方、純粋なジェランガムヒドロゲル中に封入された細胞は、インキュベーションの継続時間にわたって、それらの丸い形態のまま残った（図３Ｂ）。このことから、コラーゲンネットワークの存在によって、ＭＳＣなどの付着性細胞が付着して広がったことが証明された。マトリックスへの細胞の付着は、付着性細胞の細胞恒常性にとって重要である。それらでは、付着基質が存在しない場合、アノイキスと呼ばれるプログラムされた細胞死が始まる。

５． ｉｎ ｖｉｔｒｏでの特性評価：封入された細胞の細胞増殖
５．１ 封入された細胞の細胞増殖の評価方法
ヒドロゲル中に封入された哺乳類細胞株の細胞生存率を決定するために、ＭＴＳ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５（３－カルボキシメトキシフェニル）－２（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）アッセイを行った。生存した、したがって代謝活性な細胞は、それらのミトコンドリアの脱水素酵素によって、ＭＴＳを褐色のホルマザン生成物に変換することができる。

簡潔に述べると、細胞の封入の後の様々な時点で、１００μＬの培養培地毎に１０μＬのＭＴＳを加えた（ｎ＝３）。ＨＤＦ及び脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）では、ＭＴＳを０日目（封入の６時間後）、１、３又は７日目に加え、ＭＳＣでは、ＭＴＳを０、１、３、７、１４又は２１日目に加えた。細胞を更に、空気中５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後に、各ウェルの上澄み１００μＬを、透明で円形の平底９６ウェルプレートの新しいウェルに移した。

生存細胞数に直線比例する総代謝活性の測定は、マルチウェルマイクロプレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ、フィンランド、トゥルク）でＯＤ_４９０で行った。同じ方法で処理した無細胞ヒドロゲルを「ブランク」として使用した。細胞増殖は、０日目に対する１、３及び７日目のブランク補正したＯＤ_４９０の値で表して決定した。幹細胞（ｈＭＳＣ及びＡＤＳＣ）では、０、１、３、７、１４及び２１日目の時点で実験全体を繰り返した（ｎ＝３）。

５．２ 結果
図４に示すように、ＨＤＦを純粋なジェランガムヒドロゲル（全血清）中に封入した場合、細胞の成長は阻害されたが、細胞死は観察されなかった。ＣＧＦは、細胞の生存率を改善したが、それを有意には改善しなかった。

無血清培地を、純粋なジェランガムヒドロゲルに封入されたＨＤＦ、ＡＤＳＣ、又はＭＳＣに加えた場合、細胞死が観察された（図４及び５）。ＣＧＦは、死滅する速度を遅くした。ＩＰＮヒドロゲル中に封入されたＨＤＦに無血清培地を加えた場合もまた、細胞死が観察された。しかしながら、ＣＧＦの存在は、細胞を再活性化し、全体を通して増殖を維持した。コラーゲンを含み、相互貫入ネットワークを形成したジェランガムヒドロゲルで、ＣＧＦを血清の代わりに用いてＨＤＦを培養した場合、細胞の成長は７日間にわたって維持される。

血清の存在によって、封入されたＡＤＳＣに対するＣＧＦの増殖効果は隠された。ＡＤＳＣの細胞生存率は、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳの存在下では有意には増加しなかった（図６）。また、血清の非存在下では、封入された幹細胞は急速に衰え、細胞生存率は３週間の培養後に１０％未満まで減少し続けた。１ｇ／ＬのＣＧＦの存在は、死滅する速度を遅らせたが、挙動の過程は逆転させなかった。

培養培地中の血清の半分を除去すると、封入されたＡＤＳＣは急速に衰え、細胞生存率は、培養２１日後に３０．４±４．６８％である。顕著なこととして、１ｇ／ＬのＣＧＦは、このような条件下の封入されたＡＤＳＣの生存性を維持した。血清を減少させた培地に１ｇ／ＬのＣＧＦを補充した場合、細胞生存率は、細胞増殖を示す１２４．０±７．５７％に達した。

６． スクラッチアッセイ
６．１ スクラッチアッセイの方法
ＩＰＮヒドロゲル中に封入されたＡＤＳＣが、ＴＮＦ－αのような炎症性サイトカインに曝露された際にパラクリン創傷治癒因子を分泌できるかどうかを評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで２Ｄスクラッチアッセイを行った。まず、６×１０^５個の封入されたＡＤＳＣを含有するＩＰＮヒドロゲル６００μＬを、２ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で７２時間インキュベートして、ＡＤＳＣ平衡化培地を調製した。合計１０ｍＬのＡＤＳＣ平衡化培地を、透明で円形の平底６ウェルプレートの５つの別個のウェルから回収した。ゲル平衡化培地を、無細胞ＩＰＮヒドロゲルを使用して同じ方法で調製した。培地を回収した後、それらを１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄みを次に使用するまで－８０℃で保存した。ＦＢＳを補充した非平衡化培養培地を、陽性対照（通常培地）として使用し、ＦＢＳを含まない非平衡化培養培地を陰性対照（無血清培地）として使用した。全ての培養培地は、ＴＳＧ－６の分泌を誘導するために１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを含有する。

スクラッチアッセイは、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）２４ウェル創傷治癒アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンジエゴ））を使用して、製造元のプロトコルに従って行った。簡潔に述べると、５×１０^５細胞／ｍＬの通常培地での５００μＬのＨＤＦ懸濁液を２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。各ウェルにプラスチック製挿入物を入れて、画定された０．９ｍｍの間隙の一貫した創傷場（「創傷」領域）を形成した。細胞を、単層が形成されるまで、空気中５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。

その後、プラスチック製挿入物を慎重に取り出し、細胞を滅菌１ｘＰＢＳで３回すすいだ。すすいだ直後に、５００μＬのＡＤＳＣ平衡化した、ゲル平衡化した通常又は無血清培地を指定されたウェルに加えた（ｎ＝３）。創傷が閉じる差速を、光学顕微鏡（オリンパスＣＫＸ４１、日本、東京新宿）でモニターした。創傷の間隙の画像を、０（Ｌ_ｉ）、６、１２、２４及び４８時間の異なる時点で撮像した。移行速度は、以下の等式によって決定した：
％創傷閉鎖＝（Ｌ_ｉ－Ｌ_ｃ）／Ｌ_ｉ×１００；
Ｌ_ｉは、創傷の間隙の初期の長さを表し、
Ｌ_ｃは、各時点における創傷の間隙の長さを表す。

６．２ 結果
血清中に見られる生化学的前駆体に応答して、ＨＤＦはインキュベーションの４８時間後に「創傷領域」の８２．４±２．５７％まで移行して被覆した。一方、血清の補充がない場合、ＨＤＦの移行は有意に阻害され、１８．９±３．９３％のみの創傷閉鎖率であった。対照的に、ＡＤＳＣ平衡化無血清培地は、ＨＤＦに対して走化性の刺激を与えるように思われ、実験の継続時間にわたって７１．５±２．０８％まで「創傷閉鎖」を促進した（図７Ａ～Ｂ）。無細胞ＩＰＮヒドロゲルは、細胞増殖又は移行を促進することができる何の基質も提供しなかった。４８時間のインキュベーションの後、ゲル平衡化培地に曝露されたＨＤＦの創傷閉鎖率（％）は２２．１±６．２１％のみであった。これらの結果は、ＩＰＮヒドロゲル中に封入されたＡＤＳＣが、有意にＨＤＦの成長及び移行を誘導する生理活性因子を分泌したことを示唆した。このことは、生理学的な創傷治癒プロセスにおける創傷の閉鎖速度の向上と相関する可能性がある。

７． ヒトＴＳＧ－６のＥＬＩＳＡアッセイ
７．１ 方法
ＴＮＦ－αで刺激したＡＤＳＣ担持ＩＰＮヒドロゲル（ｎ＝５）から放出された抗炎症ＴＳＧ－６タンパク質の定量を、製造元のプロトコルを使用して、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（米国ジョージア州ピーチツリー・コーナーズ）のＥＬＩＳＡ試験キットで試験した。

６×１０^５個の封入されたＡＤＳＣを含有する６００μＬのＩＰＮヒドロゲルを、２ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で７２時間インキュベートして、ＡＤＳＣ条件培地を調製した。合計１０ｍＬのＡＤＳＣ条件培地を、透明で円形の平底６ウェルプレートの５つの別個のウェルから回収した。ゲル条件培地を、無細胞ＩＰＮヒドロゲルを使用して同じ方法で調製した。培地を回収した後、それらを１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄みを次に使用するまで－８０℃で保存した。ＦＢＳを補充した非条件化培養培地を陽性対照（通常培地）として使用し、ＦＢＳを含まない非条件化培養培地を陰性対照（無血清培地）として使用した。全ての培養培地は、封入されたＡＤＳＣからのＴＳＧ－６の分泌を誘導するために、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを含有する。

７．２ 結果
ＴＳＧ－６は、ＡＤＳＣによって分泌される強力な抗炎症性パラクリンである。ＩＰＮヒドロゲル中に封入されたヒトＡＤＳＣからのヒトＴＳＧ－６の検出は、全体的な生物学的創傷被覆材構築物が、適用されて熱傷上で創傷サイトカイン、ＴＮＦ－αに曝露されると、抗炎症性パラクリンを放出し、潜在的な抗炎症性パラクリン活性を示すことを示唆している。

８． ｉｎ ｖｉｖｏでの完全な厚さの熱傷の形成手順（図９）
５％イソフルラン（Ａｔｔａｎｅ（商標）、ＪＤ Ｍｅｄｉｃａｌ、米国）で吸入誘導麻酔を行い、１．５％のイソフルランを維持した。Ｖｅｅｔ（商標）の除毛クリーム（Ｒｅｃｋｉｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ Ｇｒｏｕｐ、英国）を使用して、マウスの右下後背部領域の毛髪をきれいに除去した。完全な厚さの熱傷を形成した。術前に、皮下（ＳＣ）でブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ＫｇＢＷ）を、熱傷創傷形成の３０分前に投与した。次に、ステンレス鋼製バー（９６．２ｇ）を１００℃の水浴中で１５分間熱した後、６ｍｍ×５ｍｍのテンプレート熱表面を各マウスの剃毛した後背部に３０秒間置いた。術後に、ＳＣでブプレノルフィンを、８時間毎に４８時間投与した。その後、痂皮を除去して熱傷を切除し、次いで創傷を６０μＬのヒドロゲルで処置した。コントロールを含む全ての創傷を、その上から続発性のテガダームの創傷被覆材で被覆した。鎮痛用のＳＣのブプレノルフィンを、獣医による次の評価まで１２時間毎に投与した。実験を通して、マウスは環境エンリッチメントなケージに別々に収容した。参照された時点で、それらをＣＯ_２吸入させ、頚椎脱臼を行って安楽死させた。

Claims (16)

1. 創傷治療においてそれを必要とする対象に使用するための、多糖類ポリマーネットワークとコラーゲンとを含むヒドロゲル。
2. 架橋コラーゲンと多糖類ポリマーとを含む完全な相互貫入ポリマーネットワークを含み、好ましくは、前記コラーゲンが前記多糖類ポリマーの架橋の前に架橋されている、請求項１に記載のヒドロゲル。
3. ０．２％（ｗ／ｖ）未満のコラーゲンを含む、請求項１又は２に記載の使用のためのヒドロゲル。
4. 前記多糖類ポリマーがジェランガムである、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのヒドロゲル。
5. ０．１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）のジェランガムを含む、請求項４に記載の使用のためのヒドロゲル。
6. 前記ジェランガムヒドロゲルがＭｇ２＋によって架橋されている、請求項４又は５に記載の使用のためのヒドロゲル。
7. 前記ヒドロゲルが藻類成長因子を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのヒドロゲル。
8. 前記藻類成長因子がクロレラ成長因子である、請求項７に記載の使用のためのヒドロゲル。
9. ０．１～１％のクロレラ成長因子を含む、請求項８に記載の使用のためのヒドロゲル。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載のヒドロゲルを含む、創傷被覆材。
11. 請求項１～６のいずれか一項に記載のヒドロゲルと、藻類成長因子、好ましくはクロレラ成長因子と、を含む創傷被覆材。
12. 薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１０又は１１に記載の創傷被覆材。
13. 創傷治療においてそれを必要とする対象に使用するための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の創傷被覆材。
14. 多糖類ポリマーネットワークと、コラーゲン及び藻類成長因子、好ましくはクロレラ成長因子と、を含むヒドロゲル。
15. 請求項１～９のいずれか一項に記載のヒドロゲルと、藻類成長因子を含む細胞培養培地と、を含む細胞培養系。
16. 前記細胞培養培地が血清又はアルブミンを含まない、請求項１５に記載の細胞培養系。
    
    

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