CN103484429A

CN103484429A - 一种nk细胞的制备方法

Info

Publication number: CN103484429A
Application number: CN201310452975.3A
Authority: CN
Inventors: 徐矫健; 孙威
Original assignee: QINGDAO MAIDI SAISI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: QINGDAO MAIDI SAISI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-28
Filing date: 2013-09-28
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明的目的是提供一种NK细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。本发明的主要特点是：NCR3LG1和m IL-15同时转染到K562细胞，m IL-15可以调节NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的IL-2和IL-21等因子的刺激，可以在21天的培养时间内，使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖，CD3^-CD56⁺NK细胞的比例超过70%。到目前为止，仍未见有将NCR3LG1和m IL-15同时转染到饲养细胞同时联合游离细胞因子共同刺激活化NK细胞的研究报道，本发明首次提供出一种联合饲养细胞和游离因子共同培养制备NK细胞的方法。

Description

一种NK细胞的制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种自然杀伤细胞（Natural Killer,NK）的培养，即利用转基因饲养细胞和细胞因子联合刺激外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC），获得大量高纯度的NK细胞。

背景技术

NK细胞是一群较大的颗粒化的淋巴细胞，其细胞表面表达CD56且缺少CD3的表达，所以，通常用表面标志CD3^‐CD56⁺来界定NK细胞。NK细胞大约可以占到外周血淋巴细胞的5‐15%，同时分布在人体肝脏、比脏、骨髓和淋巴结等部位。

NK细胞是固有免疫系统重要的组成部分，可以通过多种方式对肿瘤细胞或受感染细胞造成杀伤：1、与靶细胞接触后，释放穿孔素和颗粒酶；2、通过自身表达的配体，刺激并活化靶细胞表面的死亡受体；3、通过抗体依赖的细胞毒作用对靶细胞造成杀伤。

由于NK细胞对肿瘤细胞或受感染细胞可以做出快速的免疫反应，所以在机体的免疫监视中发挥重要的作用。有研究表明，NK细胞不足的患者更容易受到严重的系统性病毒感染。外周血中NK细胞活性高的男性患肿瘤的几率要低10%，而在女性中这一数值是4%。并且，NK细胞在肿瘤组织中的侵润提示较好的预后。

由于NK细胞不需要特异性的抗原刺激，即可对肿瘤细胞造成杀伤的特性，使其在临床上获得了广泛的应用，并取得了一定的疗效。但是，无法在体外培养获得足够数量的高纯度NK细胞，成为了进一步提高临床治疗效果的瓶颈。

最初，NK细胞的活化刺激主要依靠高浓度的IL‐2，经两周的培养，仅能获得10倍左右的增殖。随后，研究人员尝试了使用多种因子组合比如IL‐12、IL‐15、IL‐21、CD2抗体等刺激NK细胞，但是获得的NK细胞的数量和纯度都有限。饲养细胞的使用，使NK细胞的培养效率获得很大的提高。比如，用转染CD137L和mIL‐15的K562细胞作为饲养细胞，可以刺激NK细胞获得超过200倍的增殖。寻找更加理想的刺激NK细胞增殖的方法，已成为科研人员的重要目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种NK细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。

申请人在长期的研究中发现，将NCR3LG1基因转染到饲养细胞中后，可以刺激活化NK细胞，使其快速增殖，而且它与膜表达的mIL‐15对NK细胞的刺激有协同作用。申请人将NCR3LG1和IL‐15同时转染到K562细胞中，作为饲养细胞刺激活化NK细胞，同时添加IL‐2和IL‐21细胞因子，极大的提高了培养NK细胞的效率，从而促成了本发明。

上述NK细胞的高效制备方法，包括如下步骤：

1)使用慢病毒转染系统将NCR3LG1基因核苷酸片段和包含有mIL‐15基因的核苷酸片段同时转染到K562细胞，作为制备NK细胞的饲养细胞；

其中NCR3LG1基因核苷酸片段的序列为：SEQ ID NO:1，包含有mIL‐15基因的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2；

2）将从外周血分离得到的PBMC用培养液重悬后，接种培养瓶中，同时接种灭活的K562饲养细胞和IL‐2和IL‐21因子进行培养；

3）培养4天后，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养；

4）持续扩大培养至第7天，再次添加灭活的K562细胞进行二次刺激；

5）持续扩大培养至第21天，收获细胞，完成NK细胞的制备。

本发明步骤2）所述的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。

其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。

维生素的配比如下：2份D‐生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D‐泛酸酯。

微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。

为了获得更好的培养效果，在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子（Chlorella Growth Factor，CGF）。

本发明所制备出的NK细胞具有增殖速度快、细胞数量大、纯度高等特点。本发明的主要特点是：NCR3LG1和m IL‐15同时转染到K562细胞，m IL‐15可以调节NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的IL‐2和IL‐21等因子的刺激，可以在21天的培养时间内，使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖，CD3^‐CD56⁺NK细胞的比例超过70%。到目前为止，仍未见有将NCR3LG1和m IL‐15同时转染到饲养细胞同时联合游离细胞因子共同刺激活化NK细胞的研究报道，本发明首次提供出一种联合饲养细胞和游离因子共同培养制备NK细胞的方法。

具体实施方式

首先对于本发明方法所使用的材料进行描述，其中慢病毒载体pEF1alpha‐IRES Vector,购自CLONTECH公司；K562细胞：人慢性髓细胞性白血病细胞系，购于中科院细胞库。

本发明NK细胞的高效制备方法，包括如下的步骤：

1）饲养细胞的构建：选取状态良好的K562细胞，将NCR3LG1和m IL‐15基因核苷酸片段分别插入到慢病毒载体pEF1alpha‐IRES Vector的两个多克隆位点，构建目的基因载体；提前24小时将5×10⁶个Lenti‐X293T包装细胞接种到10厘米的培养皿中；将目的基因载体与36微升Lenti‐X HTXPackaging Mix，7.5微升Xfect Polymer，1150微升Xfect Reaction Buffer混合后，室温静置10分钟，然后加入到培养皿中；将培养皿至于37℃二氧化碳培养箱中过夜；更换新的培养基；48小时后，收集上清液，过0.45微米的无菌滤膜，过滤液即为含有目的基因的病毒悬液；检测病毒滴度为5.2×10⁷单位/毫升。病毒悬液加入到含K562细胞的24孔培养板中，500微升/孔。经传代和抗性筛选后，作为饲养细胞，持续培养，待用；

2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC，生理盐水洗涤2次，用60毫升的培养基重悬，取样计数后，接种到细胞培养瓶中，加入同样数量的灭活的步骤1）制备的饲养细胞，同时添加360000单位的IL‐2，600ng的IL‐21因子。

其中培养液的配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。另外，为了获得更好的培养效果，在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子（Chlorella Growth Factor，CGF）。

上述的培养基是经过长期优化获得的，在同样的培养时间内，本发明的培养液对细胞的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液，细胞增殖速度可以提高约12%，伽马干扰素的分泌量提高7.8%。

3）转移培养：接种后的细胞在培养4天后，转入透气的细胞培养袋中继续培养，添加培养基至300毫升，添加15000单位的IL‐2,3000ng的IL‐21。

4）二次刺激：扩大培养至第7天时，取样计数，添加相同数量的灭活的饲养细胞进行二次刺激，并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2，按10ng/毫升的浓度添加IL‐21。

5）扩大培养：每隔2天，根据细胞浓度补充无血清培养基，并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2，按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21，在培养到第21天时，取样进行细胞计数和流式细胞仪分析。收获细胞。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

实验例1

1）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数，细胞数为4.6×10⁷。将细胞接种到培养瓶中，加入同样数量的灭活的饲养细胞，添加360000单位的IL‐2，600纳克的IL‐21。

2）转移培养：接种后的细胞在培养4天后，转入透气的细胞培养袋中继续培养，添加无血清培养基至300毫升，添加15000单位的IL‐2,3000纳克的IL‐21。

3）二次刺激：扩大培养至第7天时，取样计数，添加相同数量的灭活的饲养细胞进行二次刺激，并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2，按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。

4）扩大培养：每隔2天，根据细胞浓度补充无血清培养基，并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2，按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。

5）收获细胞：在培养到第21天时，取样进行细胞计数和流式细胞仪分析。计算细胞数为2.47×10¹⁰，增殖537倍；CD3^‐CD56⁺NK细胞的比例78.2%。

按照上述步骤，重复试验7次，高效NK细胞培养方法所得细胞的增殖倍数平均值为525倍，CD3‐CD56+NK细胞的比例73.6%.

实验例2

1）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC，生理盐水洗涤2次，用70毫升的无血清培养基重悬。取样计数，细胞数为5.1×10⁷。将细胞接种到培养瓶中，加入同样数量的灭活的饲养细胞，添加420000单位的IL‐2，700纳克的IL‐21。

2）转移培养：接种后的细胞在培养4天后，转入透气的细胞培养袋中继续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加20000单位的IL‐2,4000纳克的IL‐21。

5）收获细胞：在培养到第21天时，取样进行细胞计数和流式细胞仪分析。计算细胞数为2.82×10¹⁰，增殖552倍；CD3^‐CD56⁺NK细胞的比例84.9%。

实验例3

1）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC，生理盐水洗涤2次，用50毫升的无血清培养基重悬，取样计数，细胞数为3.9×10⁷。将细胞接种到培养瓶中，加入同样数量的灭活的饲养细胞，添加300000单位的IL‐2，500纳克的IL‐21。

5）收获细胞：在培养到第21天时，取样进行细胞计数和流式细胞仪分析，结果表明细胞数为2.1×10¹⁰，增殖539倍；CD3^‐CD56⁺NK细胞的比例71.4%，表明本发明的方法制备NK细胞非常有效率。

Claims

1.一种NK细胞的高效制备方法，包括如下步骤：

1)使用慢病毒转染系统将NCR3LG1基因和mIL-15基因同时转染到K562细胞，作为制备NK细胞的饲养细胞；

2）将从外周血分离得到的PBMC，用培养液重悬后，接种培养瓶中，同时接种灭活的K562饲养细胞和IL-2和IL-21因子进行培养；

5）持续扩大培养至第21天，收获细胞，完成NK细胞的制备。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中NCR3LG1基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO:1，mIL-15基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的步骤2）中的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。

4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述的氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。

5.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述的维生素的配比如下：2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。

6.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述的微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。

7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的步骤2）中的培养液添加有25mg/L的小球藻生长因子。