CN103484429A - 一种nk细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种NK细胞的高效制备方法,即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用,提高NK细胞的增殖速度和纯度。本发明的主要特点是:NCR3LG1和m IL-15同时转染到K562细胞,m IL-15可以调节NK细胞的活化和增殖,而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体,可以有效的刺激NK细胞活化,且两者有协同作用。再加上游离添加的IL-2和IL-21等因子的刺激,可以在21天的培养时间内,使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖,CD3-CD56+NK细胞的比例超过70%。到目前为止,仍未见有将NCR3LG1和m IL-15同时转染到饲养细胞同时联合游离细胞因子共同刺激活化NK细胞的研究报道,本发明首次提供出一种联合饲养细胞和游离因子共同培养制备NK细胞的方法。

Description

一种NK细胞的制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域,具体涉及一种自然杀伤细胞(Natural Killer,NK)的培养,即利用转基因饲养细胞和细胞因子联合刺激外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),获得大量高纯度的NK细胞。
背景技术
NK细胞是一群较大的颗粒化的淋巴细胞,其细胞表面表达CD56且缺少CD3的表达,所以,通常用表面标志CD3CD56+来界定NK细胞。NK细胞大约可以占到外周血淋巴细胞的5‐15%,同时分布在人体肝脏、比脏、骨髓和淋巴结等部位。
NK细胞是固有免疫系统重要的组成部分,可以通过多种方式对肿瘤细胞或受感染细胞造成杀伤:1、与靶细胞接触后,释放穿孔素和颗粒酶;2、通过自身表达的配体,刺激并活化靶细胞表面的死亡受体;3、通过抗体依赖的细胞毒作用对靶细胞造成杀伤。
由于NK细胞对肿瘤细胞或受感染细胞可以做出快速的免疫反应,所以在机体的免疫监视中发挥重要的作用。有研究表明,NK细胞不足的患者更容易受到严重的系统性病毒感染。外周血中NK细胞活性高的男性患肿瘤的几率要低10%,而在女性中这一数值是4%。并且,NK细胞在肿瘤组织中的侵润提示较好的预后。
由于NK细胞不需要特异性的抗原刺激,即可对肿瘤细胞造成杀伤的特性,使其在临床上获得了广泛的应用,并取得了一定的疗效。但是,无法在体外培养获得足够数量的高纯度NK细胞,成为了进一步提高临床治疗效果的瓶颈。
最初,NK细胞的活化刺激主要依靠高浓度的IL‐2,经两周的培养,仅能获得10倍左右的增殖。随后,研究人员尝试了使用多种因子组合比如IL‐12、IL‐15、IL‐21、CD2抗体等刺激NK细胞,但是获得的NK细胞的数量和纯度都有限。饲养细胞的使用,使NK细胞的培养效率获得很大的提高。比如,用转染CD137L和mIL‐15的K562细胞作为饲养细胞,可以刺激NK细胞获得超过200倍的增殖。寻找更加理想的刺激NK细胞增殖的方法,已成为科研人员的重要目标。
发明内容
本发明的目的是提供一种NK细胞的高效制备方法,即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用,提高NK细胞的增殖速度和纯度。
申请人在长期的研究中发现,将NCR3LG1基因转染到饲养细胞中后,可以刺激活化NK细胞,使其快速增殖,而且它与膜表达的mIL‐15对NK细胞的刺激有协同作用。申请人将NCR3LG1和IL‐15同时转染到K562细胞中,作为饲养细胞刺激活化NK细胞,同时添加IL‐2和IL‐21细胞因子,极大的提高了培养NK细胞的效率,从而促成了本发明。
上述NK细胞的高效制备方法,包括如下步骤:
1)使用慢病毒转染系统将NCR3LG1基因核苷酸片段和包含有mIL‐15基因的核苷酸片段同时转染到K562细胞,作为制备NK细胞的饲养细胞;
其中NCR3LG1基因核苷酸片段的序列为:SEQ ID NO:1,包含有mIL‐15基因的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2;
2)将从外周血分离得到的PBMC用培养液重悬后,接种培养瓶中,同时接种灭活的K562饲养细胞和IL‐2和IL‐21因子进行培养;
3)培养4天后,将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养;
4)持续扩大培养至第7天,再次添加灭活的K562细胞进行二次刺激;
5)持续扩大培养至第21天,收获细胞,完成NK细胞的制备。
本发明步骤2)所述的培养液,其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。
其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。
维生素的配比如下:2份D‐生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D‐泛酸酯。
微量元素的配比如下:85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。
为了获得更好的培养效果,在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor,CGF)。
本发明所制备出的NK细胞具有增殖速度快、细胞数量大、纯度高等特点。本发明的主要特点是:NCR3LG1和m IL‐15同时转染到K562细胞,m IL‐15可以调节NK细胞的活化和增殖,而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体,可以有效的刺激NK细胞活化,且两者有协同作用。再加上游离添加的IL‐2和IL‐21等因子的刺激,可以在21天的培养时间内,使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖,CD3CD56+NK细胞的比例超过70%。到目前为止,仍未见有将NCR3LG1和m IL‐15同时转染到饲养细胞同时联合游离细胞因子共同刺激活化NK细胞的研究报道,本发明首次提供出一种联合饲养细胞和游离因子共同培养制备NK细胞的方法。
具体实施方式
首先对于本发明方法所使用的材料进行描述,其中慢病毒载体pEF1alpha‐IRES Vector,购自CLONTECH公司;K562细胞:人慢性髓细胞性白血病细胞系,购于中科院细胞库。
本发明NK细胞的高效制备方法,包括如下的步骤:
1)饲养细胞的构建:选取状态良好的K562细胞,将NCR3LG1和m IL‐15基因核苷酸片段分别插入到慢病毒载体pEF1alpha‐IRES Vector的两个多克隆位点,构建目的基因载体;提前24小时将5×106个Lenti‐X293T包装细胞接种到10厘米的培养皿中;将目的基因载体与36微升Lenti‐X HTXPackaging Mix,7.5微升Xfect Polymer,1150微升Xfect Reaction Buffer混合后,室温静置10分钟,然后加入到培养皿中;将培养皿至于37℃二氧化碳培养箱中过夜;更换新的培养基;48小时后,收集上清液,过0.45微米的无菌滤膜,过滤液即为含有目的基因的病毒悬液;检测病毒滴度为5.2×107单位/毫升。病毒悬液加入到含K562细胞的24孔培养板中,500微升/孔。经传代和抗性筛选后,作为饲养细胞,持续培养,待用;
2)细胞接种:采集50毫升的静脉外周血,使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC,生理盐水洗涤2次,用60毫升的培养基重悬,取样计数后,接种到细胞培养瓶中,加入同样数量的灭活的步骤1)制备的饲养细胞,同时添加360000单位的IL‐2,600ng的IL‐21因子。
其中培养液的配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。另外,为了获得更好的培养效果,在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor,CGF)。
上述的培养基是经过长期优化获得的,在同样的培养时间内,本发明的培养液对细胞的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液,细胞增殖速度可以提高约12%,伽马干扰素的分泌量提高7.8%。
3)转移培养:接种后的细胞在培养4天后,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加培养基至300毫升,添加15000单位的IL‐2,3000ng的IL‐21。
4)二次刺激:扩大培养至第7天时,取样计数,添加相同数量的灭活的饲养细胞进行二次刺激,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10ng/毫升的浓度添加IL‐21。
5)扩大培养:每隔2天,根据细胞浓度补充无血清培养基,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21,在培养到第21天时,取样进行细胞计数和流式细胞仪分析。收获细胞。
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
实验例1
1)细胞接种:采集50毫升的静脉外周血,使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC,生理盐水洗涤2次,用60毫升的无血清培养基重悬,取样计数,细胞数为4.6×107。将细胞接种到培养瓶中,加入同样数量的灭活的饲养细胞,添加360000单位的IL‐2,600纳克的IL‐21。
2)转移培养:接种后的细胞在培养4天后,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加无血清培养基至300毫升,添加15000单位的IL‐2,3000纳克的IL‐21。
3)二次刺激:扩大培养至第7天时,取样计数,添加相同数量的灭活的饲养细胞进行二次刺激,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。
4)扩大培养:每隔2天,根据细胞浓度补充无血清培养基,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。
5)收获细胞:在培养到第21天时,取样进行细胞计数和流式细胞仪分析。计算细胞数为2.47×1010,增殖537倍;CD3CD56+NK细胞的比例78.2%。
按照上述步骤,重复试验7次,高效NK细胞培养方法所得细胞的增殖倍数平均值为525倍,CD3‐CD56+NK细胞的比例73.6%.
实验例2
1)细胞接种:采集50毫升的静脉外周血,使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC,生理盐水洗涤2次,用70毫升的无血清培养基重悬。取样计数,细胞数为5.1×107。将细胞接种到培养瓶中,加入同样数量的灭活的饲养细胞,添加420000单位的IL‐2,700纳克的IL‐21。
2)转移培养:接种后的细胞在培养4天后,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加无血清培养基至400毫升,添加20000单位的IL‐2,4000纳克的IL‐21。
3)二次刺激:扩大培养至第7天时,取样计数,添加相同数量的灭活的饲养细胞进行二次刺激,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。
4)扩大培养:每隔2天,根据细胞浓度补充无血清培养基,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。
5)收获细胞:在培养到第21天时,取样进行细胞计数和流式细胞仪分析。计算细胞数为2.82×1010,增殖552倍;CD3CD56+NK细胞的比例84.9%。
实验例3
1)细胞接种:采集50毫升的静脉外周血,使用淋巴细胞分离液离心分离得到PBMC,生理盐水洗涤2次,用50毫升的无血清培养基重悬,取样计数,细胞数为3.9×107。将细胞接种到培养瓶中,加入同样数量的灭活的饲养细胞,添加300000单位的IL‐2,500纳克的IL‐21。
2)转移培养:接种后的细胞在培养4天后,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加无血清培养基至300毫升,添加15000单位的IL‐2,3000纳克的IL‐21。
3)二次刺激:扩大培养至第7天时,取样计数,添加相同数量的灭活的饲养细胞进行二次刺激,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。
4)扩大培养:每隔2天,根据细胞浓度补充无血清培养基,并按500单位/毫升的浓度添加IL‐2,按10纳克/毫升的浓度添加IL‐21。
5)收获细胞:在培养到第21天时,取样进行细胞计数和流式细胞仪分析,结果表明细胞数为2.1×1010,增殖539倍;CD3CD56+NK细胞的比例71.4%,表明本发明的方法制备NK细胞非常有效率。
Figure IDA0000389465490000011
Figure IDA0000389465490000021

Claims (7)

1.一种NK细胞的高效制备方法,包括如下步骤:
1)使用慢病毒转染系统将NCR3LG1基因和mIL-15基因同时转染到K562细胞,作为制备NK细胞的饲养细胞;
2)将从外周血分离得到的PBMC,用培养液重悬后,接种培养瓶中,同时接种灭活的K562饲养细胞和IL-2和IL-21因子进行培养;
3)培养4天后,将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养;
4)持续扩大培养至第7天,再次添加灭活的K562细胞进行二次刺激;
5)持续扩大培养至第21天,收获细胞,完成NK细胞的制备。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的步骤1)中NCR3LG1基因的核苷酸序列为:SEQ ID NO:1,mIL-15基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于所述的步骤2)中的培养液,其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。
4.如权利要求3所述的培养方法,其特征在于所述的氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。
5.如权利要求3所述的培养方法,其特征在于所述的维生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。
6.如权利要求3所述的培养方法,其特征在于所述的微量元素的配比如下:85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。
7.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于所述的步骤2)中的培养液添加有25mg/L的小球藻生长因子。
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