CN117511869A - 一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用 - Google Patents
一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117511869A CN117511869A CN202410003886.9A CN202410003886A CN117511869A CN 117511869 A CN117511869 A CN 117511869A CN 202410003886 A CN202410003886 A CN 202410003886A CN 117511869 A CN117511869 A CN 117511869A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- immune cells
- cells
- bioreactor
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 title description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 claims description 62
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 46
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 17
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 16
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 16
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 15
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 15
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 claims description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 14
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 14
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 13
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 11
- BQRXMLXVGQMIBO-UHFFFAOYSA-N 1,1-bis(sulfanyl)ethanol Chemical compound CC(O)(S)S BQRXMLXVGQMIBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 10
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 10
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 10
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 10
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 8
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 7
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 6
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 15
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 3
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002233 benzalkonium bromide Drugs 0.000 description 1
- KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M benzododecinium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
- C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药技术领域，本发明具体公开了一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用，包括以下步骤：（1）将单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基在生物反应器中进行培养1天；（2）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（1）的单个核细胞在生物反应器中继续培养13~15天，得到免疫细胞；本发明在培养过程中采用了第二培养基，制备得到了NK细胞占比高的免疫细胞，所述的第二培养基能有效的扩增免疫细胞，并能提高细胞活率。（2）本发明所述的制备方法，制备得到的NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
背景技术
免疫细胞治疗是将病人本身的免疫细胞在体外增殖和活化后， 再回输至体内的一种治疗方式。目前免疫细胞治疗已逐渐被应用于癌症治疗上， 成功的关键在于了解各类免疫细胞的特性和功能， 并根据癌症患者的状况及基因特性来选择最合适的免疫细胞类型，例如自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞等。
NK细胞(Naturalkillercell)是机体除T细胞之外的另一抗肿瘤利器,本身具有广谱的肿瘤杀伤能力。NK细胞数量减少或者功能受损与各种类型癌症的进展相关。在应用NK细胞作为过继性免疫治疗的细胞时，NK细胞的主要来源是外周血，但外周血单个核细胞中NK细胞的数量仅占10%~15%，因此NK细胞的体外扩增培养十分重要。
CN 106754704A公开了一种免疫细胞体外诱导扩增的方法。该方法包括：利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行免疫细胞激活培养基，以便得到激活的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到扩增的免疫细胞；以及利用免疫细胞规模化扩增培养基将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得规模化扩增的功能激活免疫细胞。利用该方法对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要，其在培养过程中，在不同的培养阶段，采用了不同的培养基，方法复杂，不利于产业化生产。
鉴于此，提出本申请。
发明内容
本发明提供一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用，本发明所述的制备方法，制备得到的免疫细胞中NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案：
一种免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）将单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基在生物反应器中进行培养1天；
（2）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（1）的单个核细胞在生物反应器中继续培养13~15天，得到免疫细胞；
所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、小球藻提取物0.8~2mg/mL、IFN-γ800~1200 IU/mL、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、二巯基乙醇0.02~0.08μL/mL、L-精氨酸100~300μg/mL、葡萄糖20~50μg/mL、亚硒酸钠20~100μg/mL。
本发明创造性的在培养过程中采用了上述特定的第二培养基，制备得到了NK细胞占比高的免疫细胞，所述的第二培养基能有效的扩增免疫细胞，并能提高细胞活率，且在培养过程中，只需使用第二培养基培养即可，无需使用其他的培养基搭配使用。
其中，本发明所述的制备方法，制备得到的免疫细胞中NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。
本发明创造性的在第二培养基中加入小球藻提取物，所述的小球藻提取物能够有效的活化免疫细胞，刺激免疫细胞，使其产生较长的时间记忆，提高免疫细胞的兴奋度，可有效抑制细胞进入休眠，提高免疫细胞的活性，进而促进免疫细胞的扩增，含有所述的小球藻提取物的第二培养基能够调节培养过程中能够的渗透压，对细胞膜起保护作用，提高细胞的保水能力。
作为本发明的优选实施方案，所述培养在37℃、2~7％CO2、8~10％O2以及无菌条件下进行。
作为本发明的优选实施方案，所述第一培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、0.005~0.02KE/ml沙培林。
作为本发明的优选实施方案，所述单个核细胞来源于外周血。
作为本发明的优选实施方案，所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、10%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
作为本发明的优选实施方案，所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTMCTSTM无血清培养基或SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
作为本发明的优选实施方案，所述小球藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将小球藻粉、复合酶加入到水中，在45~55℃下酶解4~10h，得到酶解液；
（2）将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
（3）将截留液以0.5~2BV/h上大孔吸附树脂，洗脱速度为1~2BV/h，先用去离子水洗0.5~2 BV，再用体积浓度为50~80%乙醇溶液洗1~2 BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
本发明所述的小球藻提取物能够显著提高NK细胞的占比，并提高扩增倍数，且不同的制备方法制备得到的小球藻提取物对于效果的提高是不同的，采用本发明的方法相比于其他的方法能够更加显著的提高NK细胞的比例和扩增倍数。
作为本发明的优选实施方案，所述复合酶为纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的混合物；
所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：（0.4~0.8）：（0.2~0.6）。
作为本发明的优选实施方案，所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：（0.01~0.05）：（2~10）。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的免疫细胞在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
本发明的有益效果：（1）本发明在培养过程中采用了第二培养基，制备得到了NK细胞占比高的免疫细胞，所述的第二培养基能有效的扩增免疫细胞，并能提高细胞活率。（2）本发明所述的制备方法，制备得到的NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。（3）本发明在第二培养基中加入小球藻提取物，所述的小球藻提取物能够有效的活化免疫细胞，刺激免疫细胞，使其产生较长的时间记忆，提高免疫细胞的兴奋度，可有效抑制细胞进入休眠，提高免疫细胞的活性，进而促进免疫细胞的扩增，含有所述的小球藻提取物的第二培养基能够调节培养过程中能够的渗透压，对细胞膜起保护作用，提高细胞的保水能力。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本发明中，具体的分散、搅拌处理方式没有特别限制。
本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理，具体如下：
1.准备抗人CD16包被的ZellWerk生物反应器
1.1在生物反应器中加入经医用生理盐水溶解的2.5μg/mL抗人CD16单克隆抗体15mL，轻轻晃动培养瓶使抗体铺满培养面，4℃避光过夜。
1.2使用前回收抗体包被液，用15mL生理盐水洗涤生物反应器一次，再用15mL的T细胞扩增培养基(OpTmizerTMCTSTM T-cellexpansion SFM)洗涤一次。
2.采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞
2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约200ml，预留1ml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入GMP实验室，若快检不合格，血样废弃处理。
2.2在GMP实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中(≤40ml/管)，2500rpm离心15min。
2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心15min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。
2.4将血浆放到56℃水浴锅中水浴30-50min灭活补体，3500rpm离心15min去除补体，10ml每支分装到15ml无菌离心管中，-20℃冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物，其中病毒由第三方检测为准。
2.5将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。
2.6待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬。
2.7取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。
2.8轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。
2.91ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。实验结束的带血污物均经过配比过得新洁尔灭浸泡过夜才能丢弃。
2.10预留4×106个细胞进行流式抗体标记检测NK细胞的比例。
（2）将2.10剩余的单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基（50mL）在生物反应器中进行培养1天；培养在37℃、5％CO2、9％O2以及无菌条件下进行；
所述第一培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、白细胞介素-2 1000 IU/mL、0.01KE/ml沙培林。
（3）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（2）的单个核细胞在生物反应器中继续培养（培养在37℃、5％CO2、9％O2以及无菌条件下进行）14天（每天更换一次培养基），进行细胞回收，得到免疫细胞，留取10ml培养基上清进行Elisa分泌因子检测；
所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL；
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.6：0.4。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.04：5。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
（4）将免疫用200ml生理盐水重悬，并加入10ml人血清白蛋白，混匀；并从中取10ml细胞悬液待检，剩余的细胞注入回输袋中准备回输。从回输袋中抽取10ml细胞悬液进行检测：支原体、内毒素、微生物和病毒五项。
（5）流式细胞仪检测细胞中淋巴细胞谱系
取10ml免疫细胞，1800rpm离心回收细胞，进行流式抗体标记。设置同型对照、单标样品和染色管，每管样品细胞数约5× 105个，然后加入对应抗体染色。4℃，30min放置，用生理盐水洗涤，然后上机检测分析淋巴细胞群中的NK细胞比例。
（6）取10ml免疫细胞用台盼蓝染色检测细胞存活率；
（7）将剩余10ml细胞悬液上清，进行分装，用以检测病毒五项、内毒素、支原体、微生物。
实施例2
实施例2与实施例1不同之处在于，第二培养基的组成比例不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、8%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ800IU/mL、白细胞介素-2 1200 IU/mL、二巯基乙醇0.02μL/mL、L-精氨酸300μg/mL、葡萄糖20μg/mL、亚硒酸钠100μg/mL。
实施例3
实施例3与实施例1不同之处在于，第二培养基的组成比例不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、12%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ800~1200 IU/mL、白细胞介素-2 800IU/mL、二巯基乙醇0.08μL/mL、L-精氨酸100μg/mL、葡萄糖50μg/mL、亚硒酸钠20μg/mL。
实施例4
实施例4与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的用量不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、小球藻提取物0.8mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
实施例5
实施例5与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的用量不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、小球藻提取物2mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
实施例6
实施例6与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的制备参数不同，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.8：0.2。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.03：6。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
实施例7
实施例7与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的制备参数不同，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.5：0.5。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.05：10。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
实施例8
实施例8与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的制备参数不同，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.4：0.6。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.02：4。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处在于，对比例1的第二培养基不含有小球藻提取物，其他都相同。
本对比例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
对比例2
对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2的小球藻提取物的制备方法不同于实施例1，其他都相同。
本对比例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.6：0.4。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.04：5。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到小球藻提取物。
对比例3
对比例3与实施例1不同之处在于，对比例3的小球藻提取物的制备方法不同于实施例1，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶，所述纤维素酶、果胶酶的质量比为1：1。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.04：5。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
测试例
实施例和对比例的NK细胞比例、细胞活率、扩增倍数如表1所示。
表1
从表1中可看出，本发明所制备得到的免疫细胞NK细胞所占比例高，达到96%以上，且扩增倍数和活率均明显优于现有技术，采用本发明的方法，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%。
对比实施例1~8可看出，实施例1为本发明的最佳实施方式，其NK细胞比例高，扩增倍数高，且细胞活率也高。
对比实施例1与对比例1~3可看出，本发明所述的小球藻提取物能够显著提高NK细胞的占比，并提高扩增倍数，且不同的制备方法制备得到的小球藻提取物对于效果的提高是不同的，采用本发明的方法相比于其他的方法能够更加显著的提高NK细胞的比例和扩增倍数。
经过详细的分析实施例1与对比例2可知，若小球藻提取物不经过大孔吸附树脂纯化处理，其含有的杂质成分过多，且小球藻提取物中能够提高NK细胞的比例和扩增倍数的成分含量相对不高，因此，在本发明中，必须使用经过大孔吸附树脂纯化的小球藻提取物。
对比实施例1与对比例3可知，若小球藻提取物的制备过程中，采用其他的酶替换本发明的复合酶，将导致效果显著下降。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (10)
1.一种免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基在生物反应器中进行培养1天；
（2）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（1）的单个核细胞在生物反应器中继续培养13~15天，得到免疫细胞；
所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、小球藻提取物0.8~2mg/mL、IFN-γ800~1200 IU/mL、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、二巯基乙醇0.02~0.08μL/mL、L-精氨酸100~300μg/mL、葡萄糖20~50μg/mL、亚硒酸钠20~100μg/mL。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述培养在37℃、2~7％CO2、8~10％O2以及无菌条件下进行。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、0.005~0.02KE/ml沙培林。
4.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞来源于外周血。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、10%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
6.根据权利要求1~5任一所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTM CTSTM无血清培养基或SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
7.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述小球藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将小球藻粉、复合酶加入到水中，在45~55℃下酶解4~10h，得到酶解液；
（2）将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
（3）将截留液以0.5~2BV/h上大孔吸附树脂，洗脱速度为1~2BV/h，先用去离子水洗0.5~2 BV，再用体积浓度为50~80%乙醇溶液洗1~2 BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
8.根据权利要求7所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述复合酶为纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的混合物；
所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：（0.4~0.8）：（0.2~0.6）。
9.根据权利要求7所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：（0.01~0.05）：（2~10）。
10.权利要求1~9任一所述的制备方法制备得到的免疫细胞在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410003886.9A CN117511869B (zh) | 2024-01-03 | 2024-01-03 | 一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410003886.9A CN117511869B (zh) | 2024-01-03 | 2024-01-03 | 一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117511869A true CN117511869A (zh) | 2024-02-06 |
| CN117511869B CN117511869B (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=89753435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410003886.9A Active CN117511869B (zh) | 2024-01-03 | 2024-01-03 | 一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117511869B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103484429A (zh) * | 2013-09-28 | 2014-01-01 | 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 | 一种nk细胞的制备方法 |
| CN105176925A (zh) * | 2015-09-26 | 2015-12-23 | 友康恒业生物科技（北京）有限公司 | 一种免疫细胞无血清培养基及其制备和用途 |
| CN106591233A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-04-26 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 |
| CN108192868A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-22 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 免疫细胞的诱导扩增方法 |
| CN114874985A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-08-09 | 杭州中赢生物医疗科技有限公司 | 一种nk细胞的高纯度高效率扩增方法 |
| CN115920005A (zh) * | 2022-12-05 | 2023-04-07 | 南京植创生物技术研究院有限公司 | 一种小球藻蛋白多肽肠溶缓释微囊的制备方法 |
-
2024
- 2024-01-03 CN CN202410003886.9A patent/CN117511869B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103484429A (zh) * | 2013-09-28 | 2014-01-01 | 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 | 一种nk细胞的制备方法 |
| CN105176925A (zh) * | 2015-09-26 | 2015-12-23 | 友康恒业生物科技（北京）有限公司 | 一种免疫细胞无血清培养基及其制备和用途 |
| CN106591233A (zh) * | 2016-12-28 | 2017-04-26 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 |
| CN108192868A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-22 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 免疫细胞的诱导扩增方法 |
| CN114874985A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-08-09 | 杭州中赢生物医疗科技有限公司 | 一种nk细胞的高纯度高效率扩增方法 |
| CN115920005A (zh) * | 2022-12-05 | 2023-04-07 | 南京植创生物技术研究院有限公司 | 一种小球藻蛋白多肽肠溶缓释微囊的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JUNG HYUN KWAK ET AL: "Beneficial immunostimulatory effect of short-term Chlorella supplementation: enhancement of Natural Killer cell activity and early inflammatory response (Randomized, double-blinded, placebo-controlled trial", NUTRITION JOURNAL, vol. 11, no. 53, 13 July 2012 (2012-07-13), pages 2 * |
| 朱江;赖达雄;欧阳邦进;: "破壁绿藻粉的加工及细胞生长因子的提取研究", 江西食品工业, no. 02, 30 June 2006 (2006-06-30), pages 2 - 3 * |
| 郭瑞雪;杨友;张诗雯;QURESHI SHAHIDMOIN;顾嘉琦;武彩霞;刘进军;兰金苹;: "小球藻高价值活性物质研究现状及展望", 河北北方学院学报(自然科学版), no. 03, 28 March 2020 (2020-03-28), pages 54 - 60 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117511869B (zh) | 2024-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU720285B2 (en) | Process for preparing macrophages, and kits and compositions therefore | |
| Faradji et al. | Large scale isolation of human blood monocytes by continuous flow centrifugation leukapheresis and counterflow centrifugation elutriation for adoptive cellular immunotherapy in cancer patients | |
| CN106701681B (zh) | 一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法 | |
| CN111454903B (zh) | 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 | |
| CN108251365B (zh) | 免疫细胞培养基体系 | |
| Kikugawa et al. | Filter columns for preparation of leukocyte-poor blood for transfusion | |
| CN112608896A (zh) | 一种nk细胞的培养方法及其应用 | |
| CN114507640B (zh) | 一种高增殖能力和高细胞毒性cik细胞的培养方法及其应用 | |
| CN114075546A (zh) | 一种nk细胞扩增组合物及体外扩增培养方法 | |
| CN106754704B (zh) | 免疫细胞体外诱导扩增的方法 | |
| CN111548994B (zh) | 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法 | |
| CN117511869B (zh) | 一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用 | |
| CN110857435B (zh) | 用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基及其培养方法 | |
| CN112300992B (zh) | 一种nk细胞培养液及多级激活nk细胞的培养方法 | |
| CN108192868B (zh) | 免疫细胞的诱导扩增方法 | |
| CN111690607B (zh) | 一种高效杀伤细胞体外培养试剂盒及培养方法 | |
| CN107090434A (zh) | 一种提高cik细胞培养效果的血液抗凝和保存方法 | |
| CN113881633B (zh) | 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法 | |
| Yannelli et al. | Clinical/technical challenges in adoptive cellular immunotherapy: in vitro culture techniques | |
| CN106635986B (zh) | 促进cik细胞增殖分化的人参多糖、培养基、培养方法和应用 | |
| CN111154721A (zh) | Nk细胞扩增方法 | |
| CN117187181B (zh) | 包被组合物的方法及其应用 | |
| CN114686432B (zh) | 一种中性粒细胞的高效扩增培养体系及其应用 | |
| CN112410297B (zh) | 一种γδT样αβT细胞及其制备方法和应用 | |
| Svensson et al. | Monocyte enriched apheresis for preparation of dendritic cells (DC) to be used in cellular therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |