CN112410297B - 一种γδT样αβT细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种γδT样αβT细胞及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明利用肿瘤组织提取抗原诱导γδT细胞，抗原诱导后的γδT细胞充当抗原提呈细胞激活αβT细胞，得到所述γδT样αβT细胞。本发明所述γδT样αβT细胞中CD3和HLA‑DR双阳性的γδT样αβT细胞数量占总T细胞数量的70％以上；且当所述γδT样αβT细胞与肿瘤细胞效靶比1：1时，γδT样αβT细胞杀伤活性为73.85～78.21％。

Description

一种γδT样αβT细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种γδT样αβT细胞及其制备方法和应用。
背景技术
人的T淋巴细胞按照其表面T细胞抗原受体的不同，可以分为αβT细胞和γδT细胞两大类。虽然γδT细胞仅占T细胞的1～10％，但他发挥作用不依赖MHC识别，从而可以抵抗肿瘤的逃逸；低表达CTLA4和PD-1分子从而抵抗肿瘤抑制；具有广谱杀伤功能从而抵抗肿瘤编辑；对低糖低氧的肿瘤微环境更加耐受从而更加有效发挥其对肿瘤的杀伤功能。由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度及细胞量不高。扩增出的γδT细胞很难满足临床需求，即使通过优化各种诱导条件及扩增方法扩增出的单一γδT细胞在相应的免疫性疾病和肿瘤疾病上有所应用，但是应用后并未达到人们理想中的效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种γδT样αβT细胞及其制备方法和应用，所述γδT样αβT细胞比传统的αβT细胞，具有高抗肿瘤活性，并且能够长期有效的控制肿瘤生长，可特异性识别和消除肿瘤细胞，同时保留正常的健康细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种γδT样αβT细胞的制备方法，包括以下步骤：利用肿瘤组织抗原诱导γδT细胞，以所述γδT细胞为抗原提呈细胞激活αβT细胞，得肿瘤组织抗原诱导的双特异性γδT细胞刺激活化的γδT样αβT细胞。
优选的，所述肿瘤组织抗原的制备方法，包括：(1)将用PBS冲洗后的肿瘤组织块与复合酶液混合消化；所述复合酶液的体积为所述肿瘤组织块体积的2倍；所述复合酶液中包括胰蛋白酶、胶原酶I和胶原酶IV；
(2)将消化液的上层液体用70μm孔径的细胞筛网过滤后，与等体积的完全培养基混合终止消化；
(3)利用PBS重悬终止消化后的细胞至1×107cells/ml，反复冻融3次后离心，取上清，过0.2μm的无菌滤器过滤除菌，得所述肿瘤组织抗原。
优选的，所述γδT细胞的诱导方法，包括：(a)将肝素抗凝的人外周血700g第一离心20min，取上层液体，56℃灭活后，4℃静置15min，2000g第二离心20min，收集上层液体，得自体灭活血浆；
(b)利用DPBS重悬第一离心后的沉淀，与淋巴细胞分离液以5:4的体积比混合，800g离心15min，收集环状乳白色PBMC；
(c)利用生理盐水溶解所述环状乳白色PBMC，600g离心10min，弃上清液；再用生理盐水溶解后，500g离心10min，收集底层细胞；
(d)用无血清免疫细胞培养液重悬所述底层细胞，转移至预处理的T75培养瓶中，与肿瘤组织抗原、唑来膦酸、IL-2和所述自体灭活血浆混合后培养；所述预处理包括在T75培养瓶中，利用DPBS包被抗γδ单抗和CD277特异性抗体，弃去溶液。
优选的，所述αβT细胞的激活方法，包括：①将肝素抗凝的人外周血700g第一离心20min，取上层液体，56℃灭活后，4℃静置15min，2000g第二离心20min，收集上层液体，得自体灭活血浆；
②利用DPBS重悬第一离心后的沉淀，与淋巴细胞分离液以5:4的体积比混合，800g离心15min，收集环状乳白色PBMC；
③利用生理盐水溶解所述环状乳白色PBMC，600g离心10min，弃上清液；再用生理盐水溶解后，500g离心10min，收集底层细胞；
④用无血清免疫细胞培养液重悬所述底层细胞，转移至预处理的T175培养瓶中，与IFN-γ、IL-7、IL-2和所述自体灭活血浆混合后培养7d，得αβT细胞；所述预处理包括在T175培养瓶中，利用DPBS包被抗αβ单抗与重组人纤维连接蛋白，弃去溶液；
⑤将所述αβT细胞与γδT细胞、IL-2、IL-7和所述自体灭活血浆混合后培养5d，收集细胞悬液分离，生理盐水洗涤分离的沉淀，用含人血白蛋白的生理盐水重悬细胞，得γδT样αβT细胞。
优选的，步骤(d)或步骤④所述培养为在恒温培养箱中培养，所述培养的条件包括：37℃，5.0％CO2和饱和湿度。
优选的，步骤⑤所述αβT细胞与γδT细胞的混合比例为1～20：1。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的γδT样αβT细胞，所述γδT样αβT细胞中CD3和HLA-DR双阳性的细胞数量占总T细胞数量的70％以上。
本发明还提供了上述γδT样αβT细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
优选的，所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌、直肠癌和胃癌。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，所述药物的有效成分包括上述γδT样αβT细胞。
本发明提供了一种γδT样αβT细胞的制备方法，利用肿瘤组织提取抗原诱导γδT细胞，抗原诱导后的γδT细胞充当抗原提呈细胞激活αβT细胞，得到的所述γδT样αβT细胞比传统的αβT细胞，可以特异性识别和消除肿瘤细胞，同时保留正常的健康细胞；显示出具有高抗肿瘤活性，并且能够长期有效的控制肿瘤生长。
利用本发明所述制备方法，将所述γδT样αβT细胞培养12天后，细胞数量可达百亿以上，细胞中CD3和HLA-DR双阳性的γδT样αβT细胞数量占总T细胞数量的70％以上；且当所述γδT样αβT细胞与肿瘤细胞效靶比1：1时，γδT样αβT细胞杀伤活性为73.85～78.21％。
附图说明
图1为γδT样的αβT细胞培养12天后，收集前通过显微镜观察到的细胞示意图；
图2为γδT样的αβT细胞生长曲线图；
图3为γδT样的αβT细胞免疫表型的表达示意图；
图4为γδT样的αβT细胞对肺癌细胞的杀伤示意图；
图5为γδT样的αβT细胞对乳腺癌细胞的杀伤示意图；
图6为γδT样的αβT细胞对肝癌细胞的杀伤示意图；
图7为γδT样的αβT细胞对直肠癌细胞的杀伤示意图；
图8为γδT样的αβT细胞对胃癌细胞的杀伤示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种γδT样αβT细胞的制备方法，包括以下步骤：利用肿瘤组织抗原诱导γδT细胞，以所述γδT细胞为抗原提呈细胞激活αβT细胞，得肿瘤组织抗原诱导的双特异性γδT细胞刺激活化的γδT样αβT细胞。
本发明对所述肿瘤组织抗原的种类并没有特殊限定，优选包括肺癌、乳腺癌、肝癌、直肠癌和胃癌，且不同种类的肿瘤组织抗原的制备方法相同。本发明所述肿瘤组织抗原的制备方法，优选包括：(1)将用PBS冲洗后的肿瘤组织块与复合酶液混合消化；所述复合酶液的体积为所述肿瘤组织块体积的2倍；所述复合酶液中包括胰蛋白酶、胶原酶I和胶原酶IV；
(2)将消化液的上层液体用70μm孔径的细胞筛网过滤后，与等体积的完全培养基混合终止消化；
(3)利用PBS重悬终止消化的细胞达1×107cells/ml，反复冻融3次后离心，取上清，过0.2μm的无菌滤器过滤除菌，得所述肿瘤组织抗原。
本发明步骤(1)中所述肿瘤组织块在剪取前，优选还包括将新鲜肿瘤组织置于培养皿中，加入适量PBS，去除其他组织保留肿瘤细胞丰富的区域，并用PBS清洗；然后再将肿瘤组织放入新的培养皿中，加入PBS，使用眼科剪将组织剪成约1～2mm3大小的碎块进行后续的冲洗和消化。本发明所述消化时使用的复合酶液中包括胰蛋白酶、胶原酶I和胶原酶IV。本发明对所述胰蛋白酶、胶原酶I和胶原酶IV的来源并没有特殊限定，优选为常规市售产品即可，在本发明实施例中，所述酶优选为0.25％胰蛋白酶(酶液中酶的质量浓度)、2％胶原酶I(酶液中酶的质量浓度)和2％胶原酶IV(酶液中酶的质量浓度)，且所述0.25％胰蛋白酶、2％胶原酶I和2％胶原酶IV的体积比为1：1：1。本发明所述复合酶与肿瘤组织块的体积比优选为2：1。本发明所述消化优选包括在37℃水浴恒温摇床上振荡消化30～60min。
本发明对步骤(2)中所述完全培养基的组成和来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可，在本发明实施例中，购自Takara Bio，货号为GT-T551。
本发明步骤(3)中所述反复冻融优选包括将将装有重悬后细胞的离心管置于液氮中5min，取出置于37℃水浴中融化。本发明在经过3次所述反复冻融后进行离心，所述离心优选在4℃的温度下离心30min，所述离心的转速优选为3000rpm。本发明优选将得到的所述肿瘤组织抗原分装在冻存管内，置于-80℃保存备用。
本发明所述γδT细胞的诱导方法，优选包括：(a)将肝素抗凝的人外周血700g第一离心20min，取上层液体，56℃灭活后，4℃静置15min，2000g第二离心20min，收集上层液体，得自体灭活血浆；
(b)利用DPBS重悬第一离心后的沉淀，与淋巴细胞分离液以5:4的体积比混合，800g离心15min，收集环状乳白色PBMC；
(c)利用生理盐水溶解所述环状乳白色PBMC，600g离心10min，弃上清液；再用生理盐水溶解后，500g离心10min，收集底层细胞；
(d)用无血清免疫细胞培养液重悬所述底层细胞，转移至预处理的T75培养瓶中，与肿瘤组织抗原、唑来膦酸、IL-2和所述自体灭活血浆混合后培养；所述预处理包括在T75培养瓶中，利用DPBS包被抗γδ单抗和CD277特异性抗体，弃去溶液。
在本发明中，步骤(a)中优选将40ml新鲜的肝素抗凝的人外周血倒入50ml离心管内，700g/min第一离心20min(降速最慢)，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g第二离心20min后吸取上层液体，即自体灭活血浆。本发明步骤(b)中优选将上述外周血第一离心后的下层加入DPBS混匀，定容50ml，再各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面(共40ml，每管20ml)上，并保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层，其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层，收集第二层的PBMC。本发明所述淋巴细胞分离液优选在使用前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。本发明步骤(c)中优选收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。本发明在步骤(d)中取出预处理的T75培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将底层细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，重悬后细胞数量优选为2×107～4×107cells/ml，更优选为3×107cells/ml。本发明将所述重悬后的细胞转移至T75培养瓶中，同时加入1ml上述肿瘤组织抗原，1μg/ml唑来膦酸，1000IU/ml IL-2和所述无血清免疫细胞培养液体积5％的所述自体灭活血浆，然后进行培养。本发明所述培养优选在恒温培养箱中培养，设置温度37℃、5.0％CO2浓度和饱和湿度。本发明所述预处理优选包括用5ml的DPBS将1μg/ml抗γδ单抗与0.5μg/ml CD277特异性抗体混匀，加入T75瓶内，4℃避光包被24h。
本发明优选在所述培养后的第2天开始视生长情况，适量补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml唑来膦酸和5％的所述自体灭活血浆继续培养。本发明对所述无血清免疫细胞培养液的来源并没有特殊限定，优选购自TakaraBio，货号GT-T551。
本发明所述αβT细胞的激活方法，优选包括：①将肝素抗凝的人外周血700g第一离心20min，取上层液体，56℃灭活后，4℃静置15min，2000g第二离心20min，收集上层液体，得自体灭活血浆；
②利用DPBS重悬第一离心后的沉淀，与淋巴细胞分离液以5:4的体积比混合，800g离心15min，收集环状乳白色PBMC；
③利用生理盐水溶解所述环状乳白色PBMC，600g离心10min，弃上清液；再用生理盐水溶解后，500g离心10min，收集底层细胞；
④用无血清免疫细胞培养液重悬所述底层细胞，转移至预处理的T175培养瓶中，与IFN-γ、IL-7、IL-2和所述自体灭活血浆混合后培养7d，得αβT细胞；所述预处理包括在T175培养瓶中，利用DPBS包被抗αβ单抗与重组人纤维连接蛋白，弃去溶液；
⑤将所述αβT细胞与γδT细胞、IL-2、IL-7和所述自体灭活血浆混合后培养5d，收集细胞悬液分离，生理盐水洗涤分离的沉淀，用含人血白蛋白的生理盐水重悬细胞，得γδT样αβT细胞。
本发明所述步骤①、②和③优选与上述步骤(a)、(b)和(c)相同，在此不再赘述。
本发明所述步骤④中优选取出预处理的T175培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将所述底层细胞用40ml无血清免疫细胞培养液重悬，转移至T175培养瓶中，同时加入1000IU/mlIFN-γ，1μg/ml IL-7，1000IU/ml IL-2和5％的所述自体灭活血浆，培养。本发明所述培养优选在恒温培养箱中培养，设置温度37℃、5.0％CO2浓度和饱和湿度。本发明所述预处理优选包括用10ml的DPBS将1μg/ml抗αβ单抗与100μg/ml重组人纤维连接蛋白混匀，加入T175瓶内，4℃避光包被24h。
本发明在所述培养过程中，在培养后的第2天，补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml IL-7和5％的所述自体灭活血浆进行培养；培养后的第4天，补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml IL-7和5％的所述自体灭活血浆进行培养。本发明在所述培养的第7d，将所述γδT细胞和所述αβT细胞混合培养，并补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml IL-7和5％的所述自体灭活血浆进行培养，且在培养过程中，视生长情况，适量的补充新鲜的含IL-7和IL-2的无血清培养液进行培养。本发明所述γδT细胞和所述αβT细胞的数量比优选为1～20:1，更优选为10:1。
本发明在所述培养5d后，收集γδT样αβT细胞悬液，优选经2000rpm离心10min后用负压吸引器弃去上清液，生理盐水洗涤(2000rpm×8min)2次后，用含有5ml浓度为20％的人血白蛋白的200ml生理盐水重悬细胞，封装好，同时留样封存。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的γδT样αβT细胞，所述γδT样αβT细胞中CD3和HLA-DR双阳性的αβT细胞数量占总T细胞数量的70％以上。
本发明还提供了上述γδT样αβT细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明所述γδT样αβT细胞对肿瘤细胞有特异性杀伤作用，当所述γδT样αβT细胞与肿瘤细胞效靶比1：1时，对肺癌细胞的杀伤活性为78.21％，对乳腺癌的杀伤活性为74.87％，对肝癌的杀伤活性为75.45％，对直肠癌的杀伤活性为73.85％，对胃癌的杀伤活性为77.39％。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，所述药物的有效成分包括上述γδT样αβT细胞。
本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，利用本领域的常规剂型即可。
下面结合实施例对本发明提供的γδT样αβT细胞及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、肺癌、乳腺癌、肝癌、直肠癌和胃癌肿瘤组织抗原的制备
1.1将新鲜肿瘤组织置于培养皿中，加入适量PBS，去除其他组织保留肿瘤细胞丰富的区域，并用PBS清洗。
1.2将肿瘤组织放入新的培养皿中，加入PBS，使用眼科剪将组织剪成约1～2mm3大小的碎块。转入50ml离心管中，用PBS冲洗，组织块自动下沉后，除去PBS。
1.3加入两倍体积0.25％胰蛋白酶：2％胶原酶I：2％胶原酶IV混合液，37℃水浴恒温摇床振荡消化30～60min。
1.4当组织块消化完成后吸出上层液体，用70μm孔径的细胞筛网过滤后，移入含等体积完全培养基的离心管中终止消化。
1.5细胞用PBS重悬(1×107/ml)后，浸入液氮中速冻，5min后取出，放入37℃融化；反复冻融3次后，4℃，3000rpm离心30min，收取上清。
1.6肿瘤细胞冻融上清经0.2μm的一次性无菌滤器过滤除菌，1×107的细胞上清分装在1支冻存管内，分装后置于-80℃保存备用。
二、γδT细胞的制备
2.1用5ml的DPBS将1μg/ml抗γδ单抗与0.5μg/ml CD277特异性抗体混匀，加入T75瓶内，4℃避光包被24h。
2.2提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。
2.3将40ml新鲜的肝素抗凝的人外周血倒入50ml离心管内，配平，700g/min离心20min(降速最慢)，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用(自体灭活血浆)。
2.4上述外周血离心后的下层加入DPBS混匀，定容50ml。各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
2.5收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
2.6取出预处理的T75培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将步骤2.5得到的细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，转移至T75培养瓶中，同时加入1ml步骤1.8得到的肿瘤组织抗原，1μg/ml唑来膦酸，1000IU/ml IL-2和5％的自体灭活血浆，置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养。
2.7培养后的第2天开始视生长情况，适量补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml唑来膦酸和5％的自体灭活血浆进行培养。
三、αβT细胞的制备
3.1用10ml的DPBS将1μg/ml抗αβ单抗与100μg/ml重组人纤维连接蛋白混匀，加入T175瓶内，4℃避光包被24h。
3.2提前30min将淋巴细胞分离液从4℃冰箱中取出置于室温，待温度升至室温后使用。
3.3将40ml新鲜的肝素抗凝的人外周血倒入50ml离心管内，配平，700g/min离心20min(降速最慢)，收集上层液体，56℃灭活30min，然后4℃放置15min，最后2000g离心20min后吸取上层液体备用(自体灭活血浆)。
3.4上述外周血离心后的下层加入DPBS混匀，定容50ml。各取25ml沿管壁缓慢加至两管淋巴细胞分离液面上，并保持清楚的界面，以800g离心15min(缓升缓降)后，离心管中由上至下分为四层。
其中，第一层为DPBS层，第二层为环状乳白色PBMC，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
3.5收集两管中的第二层环状乳白色PBMC加入到一个50ml离心管中，补加生理盐水至50ml，600g离心10min，弃上清液，再用50ml生理盐水重悬细胞，500g离心10min，弃上清液。
3.6取出预处理的T175培养瓶，弃去瓶中预处理试剂，将步骤3.5得到的细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，转移至T175培养瓶中，同时加入，1000IU/ml IFN-γ，1μg/mlIL-7，1000IU/ml IL-2和5％的自体灭活血浆，置于恒温培养箱(37℃、5.0％CO2、饱和湿度)中培养。
3.7培养后的第2d，补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml IL-7和5％的自体灭活血浆进行培养。
3.8培养后的第4天，补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml IL-7和5％的自体灭活血浆进行培养。
3.9培养后的第7天，将步骤2.7得到的γδT细胞和步骤3.8得到的αβT细胞混合培养，并补加新鲜的无血清免疫细胞培养液并加入1000IU/ml IL-2、1μg/ml IL-7和5％的自体灭活血浆进行培养。
3.10视生长情况，适量的补充新鲜的含IL-7和IL-2的无血清培养液进行培养。
3.11细胞收集：培养5天后，收集γδT样αβT细胞悬液，2000rpm×10min离心后用负压吸引器弃去上清液，生理盐水洗涤(2000rpm×8min)2次后，用含有5ml浓度为20％的人血白蛋白的200ml生理盐水重悬细胞，封装好，同时留样封存。
如图1～3所示，本发明培养12天后细胞数量可达百亿以上，细胞中CD3和HLA-DR双阳性的γδT样αβT细胞数量占总T细胞数量的70％以上，且针对提取的肿瘤抗原不同，可得到针对不同抗原的γδT样αβT细胞。
实施例2
提取肺癌抗原，负载γδT细胞，与αβT细胞共培养后，得到的γδT样αβT细胞与肺癌细胞特异性杀伤作用。
1、计数肺癌细胞，并加入CFSE，使CFSE终浓度达到2μM，37℃处理30min。
2、拿出后，1000rpm离心5min，可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次。
3、与γδT样αβT细胞混培，37℃，5％CO2，饱和湿度，孵育24h。
4、加入1μg/ml PI工作液，避光30min后上流式。
5、CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的肺癌细胞，除以肺癌细胞总数，即为杀伤率。
按照上述方法进行测试，结果如图4所示，γδT样αβT细胞与肺癌细胞效靶比1：1时，γδT样αβT细胞杀伤活性为78.21％。
实施例3
提取乳腺癌抗原，负载γδT细胞，与αβT细胞共培养后，得到的γδT样αβT细胞与乳腺癌细胞特异性杀伤作用
1、计数乳腺癌细胞，并加入CFSE，使CFSE终浓度达到2μM，37℃处理30min。
2、拿出后，1000rpm离心5min，可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次。
3、与γδT样αβT细胞混培，37℃，5％CO2，饱和湿度，孵育24h。
4、加入1μg/ml PI工作液，避光30min后上流式。
5、CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的乳腺癌细胞，除以乳腺癌细胞总数，即为杀伤率。
按照上述方法进行测试，结果如图5所示，γδT样αβT细胞与乳腺癌细胞效靶比1：1时，αβT细胞杀伤活性为74.87％。
实施例4
提取肝癌抗原，负载γδT细胞，与αβT细胞共培养后，得到的γδT样αβT细胞与肝癌细胞特异性杀伤作用
1、计数肝癌细胞，并加入CFSE，使CFSE终浓度达到2μM，37℃处理30min。
2、拿出后，1000rpm离心5min，可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次。
3、与γδT样αβT细胞混培，37℃，5％CO2，饱和湿度，孵育24h。
4、加入1μg/ml PI工作液，避光30min后上流式。
5、CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的肝癌细胞，除以肝癌细胞总数，即为杀伤率。
按照上述方法进行测试，结果如图6所示，γδT样αβT细胞与肝癌细胞效靶比1：1时，αβT细胞杀伤活性为75.45％。
实施例5
提取直肠癌抗原，负载γδT细胞，与αβT细胞共培养后，得到的γδT样αβT细胞与直肠癌细胞特异性杀伤作用的检测。
1、计数直肠癌细胞，并加入CFSE，使CFSE终浓度达到2μM，37℃处理30min。
2、拿出后，1000rpm离心5min，可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次。
3、与γδT样αβT细胞混培，37℃，5％CO2，饱和湿度，孵育24h。
4、加入1μg/ml PI工作液，避光30min后上流式。
5、CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的肝癌细胞，除以肝癌细胞总数，即为杀伤率。
按照上述方法进行测试，结果如图7所示，γδT样αβT细胞与直肠癌细胞效靶比1：1时，αβT细胞杀伤活性为73.85％。
实施例6
提取胃癌抗原，负载γδT细胞，与αβT细胞共培养后，得到的γδT样αβT细胞与胃癌细胞特异性杀伤作用
1计数胃癌细胞，并加入CFSE，使CFSE终浓度达到2μM，37℃处理30min。
2、拿出后，1000rpm离心5min，可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次。
3、与γδT样αβT细胞混培，37℃，5％CO2，饱和湿度，孵育24h。
4、加入1μg/ml PI工作液，避光30min后上流式。
5、CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的肝癌细胞，除以肝癌细胞总数，即为杀伤率。
按照上述方法进行测试，结果如图8所示，γδT样αβT细胞与胃癌细胞效靶比1：1时，αβT细胞杀伤活性为77.39％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种γδT样αβT细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：利用肿瘤组织抗原诱导γδT细胞，以所述γδT细胞为抗原提呈细胞激活αβT细胞，得肿瘤组织抗原诱导的双特异性γδT细胞刺激活化的γδT样αβT细胞；
所述肿瘤组织抗原的制备方法，包括：(1)将用PBS冲洗后的肿瘤组织块与复合酶液混合消化；所述复合酶液的体积为所述肿瘤组织块体积的2倍；所述复合酶液中包括胰蛋白酶、胶原酶I和胶原酶IV；
(2)将消化液的上层液体用70μm孔径的细胞筛网过滤后，与等体积的完全培养基混合终止消化；
(3)利用PBS重悬终止消化后的细胞至1×107cells/ml，反复冻融3次后离心，取上清，过0.2μm的无菌滤器过滤除菌，得所述肿瘤组织抗原；
所述γδT细胞的诱导方法，包括：(a)将肝素抗凝的人外周血700g第一离心20min，取上层液体，56℃灭活后，4℃静置15min，2000g第二离心20min，收集上层液体，得自体灭活血浆；
(b)利用DPBS重悬第一离心后的沉淀，与淋巴细胞分离液以5:4的体积比混合，800g离心15min，收集环状乳白色PBMC；
(c)利用生理盐水溶解所述环状乳白色PBMC，600g离心10min，弃上清液；再用生理盐水溶解后，500g离心10min，收集底层细胞；
(d)用无血清免疫细胞培养液重悬所述底层细胞，转移至预处理的T75培养瓶中，与肿瘤组织抗原、唑来膦酸、IL-2和所述自体灭活血浆混合后培养；所述预处理包括在T75培养瓶中，利用DPBS包被抗γδ单抗和CD277特异性抗体，弃去溶液；
所述αβT细胞的激活方法，包括：①将肝素抗凝的人外周血700g第一离心20min，取上层液体，56℃灭活后，4℃静置15min，2000g第二离心20min，收集上层液体，得自体灭活血浆；
②利用DPBS重悬第一离心后的沉淀，与淋巴细胞分离液以5:4的体积比混合，800g离心15min，收集环状乳白色PBMC；
③利用生理盐水溶解所述环状乳白色PBMC，600g离心10min，弃上清液；再用生理盐水溶解后，500g离心10min，收集底层细胞；
④用无血清免疫细胞培养液重悬所述底层细胞，转移至预处理的T175培养瓶中，与IFN-γ、IL-7、IL-2和自体灭活血浆混合后培养7d，得αβT细胞；所述预处理包括在T175培养瓶中，利用DPBS包被抗αβ单抗与重组人纤维连接蛋白，弃去溶液；
⑤将所述αβT细胞与γδT细胞、IL-2、IL-7和所述自体灭活血浆混合后培养5d，收集细胞悬液分离，生理盐水洗涤分离的沉淀，用含人血白蛋白的生理盐水重悬细胞，得γδT样αβT细胞；
步骤(d)或步骤④所述培养为在恒温培养箱中培养，所述培养的条件包括：37℃，5.0％CO2和饱和湿度；
步骤⑤所述αβT细胞与γδT细胞的数量比为1～20：1。
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