CN111394309A

CN111394309A - 一种nk细胞体外扩增培养的方法

Info

Publication number: CN111394309A
Application number: CN201911255520.6A
Authority: CN
Inventors: 谢海涛; 方晓; 薛卫巍; 刘元甲; 刘家飞; 翟秋梅; 陈坤
Original assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2020-07-10

Abstract

本发明涉及一种NK细胞体外扩增培养的方法，该NK细胞体外扩增培养的方法，属于细胞培养领域，用CD16包被的培养瓶，筛除大量的T细胞，使NK细胞成为优势细胞群，用IL‑2、IL‑12、IL‑15、IL‑18、SCM、IFN‑γ刺激诱导NK细胞，再用含有IL‑2的无血清完全培养基扩增，得到大量高纯度的NK细胞。本发明解决现有技术中无法扩增得到大量、高纯度NK细胞的问题，该方法利用CD16包被的培养瓶，筛除大部分T细胞，使NK细胞成为优势细胞，刺激诱导扩增NK细胞；操作简单，容易实现，扩增效率高，在培养过程中不添加任何饲养细胞和导体血清，不会带来医学伦理和GVHD风险问题，适用于NK细胞临床实验研究及大规模制备。

Description

一种NK细胞体外扩增培养的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及NK细胞体外扩增培养的方法。

背景技术

肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。目前国内外对癌症的治疗方法有手术切除、化学疗法及放射线疗法。针对肿瘤患者无法自主产生更有效的杀伤效应的细胞，科学家们发明了过继性免疫疗法。过继性免疫疗法是现今用于研究肿瘤治疗的热点，而且在临床得到广泛的应用。

NK细胞，又称自然杀伤细胞，NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键子集，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。

近年来，关于NK细胞及其抗肿瘤功能的研究已经成为免疫学和肿瘤学研究的热点内容之一。NK细胞抗肿瘤已经在美国和日本等国家进行了大量的临床试验，显示了良好的应用前景。据国内外相关报道，体外扩增NK细胞的技术主要有三种：一是采用免疫磁珠细胞分选，从外周血单个核细胞得到纯化的NK细胞，在体外加入因子扩增培养；二是利用滋养层细胞K562细胞扩增原代NK细胞；三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养NK细胞。前两种扩增NK细胞的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证，且K562细胞用为肿瘤细胞存在一定的风险，因此这两种方法多用于科研研究。第三种利用因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好，临床应用价值高，但扩增位数和纯度不高且不稳定。现在，国内外有科研人员发现先去除单个核细胞中的T细胞，更有利于NK细胞的扩增，这种方法可以直接使NK细胞成优势细胞群，更快地刺激诱导扩增NK细胞，这种方法用到磁珠，这就大大增大了NK细胞扩增的成本，不利于NK细胞大模式培养和临床研究。因此，寻找一种成本低、安全性好、扩增倍数高的NK细胞体外培养方法是很有必要的。

发明内容

本发明目的在于为了克服目前NK细胞体外培养的不稳定性、成本高等因素，利用培养瓶CD16包被的方法先去除T细胞，再对NK细胞诱导刺激扩增，提供了一种成本较低、扩增效率高的NK细胞培养体系，适用于NK细胞临床实验研究及大规模制备。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种NK细胞体外扩增培养的方法，其创新点在于：无需磁珠，利用CD16包被培养瓶，加入单个核细胞后NK细胞附壁，而T细胞悬浮，从而可以将T细胞去除，再用IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、SCM、IFN-γ多组合的方法刺激诱导NK细胞扩增，获得多数量、活性强的NK细胞；具体步骤如下：

（1）培养瓶包被处理：用含有CD16（浓度0.1μg/ml~20μg/ml）包被液铺满TC处理的培养瓶中，置于4℃冰箱，孵育过夜，或37℃孵育2h；包被完成后吸弃的包被液，并用PBS洗涤2次，备用；

（2）采集人体血液，梯度离心获得单个核细胞PBMC；志愿者检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性。抽取80ml血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞，血浆合并后放入56℃水浴中灭活20~30min，再放于-20℃环境上速冻10~30min，离心1100g~2000g，10~30min，得到清澈的血浆，保存于2℃~8℃环境；全血细胞用生理盐水1：1稀释后，最大按1：2的比例缓慢加入到装有淋巴分离液的离心管中，尽量保证分层清晰，650~800g，升1降0，离心20~30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，分出0.2 x10⁸~1x10⁸数量的细胞，备用；

（3）粗筛去除T细胞：将分出0.2 x10⁸~1x10⁸数量的细胞，用含有5%~20%（v/v）自体灭活血浆的培养基重悬，调整细胞密度1~4x10⁶个/ml，转入已包被处理的培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育0.5~12h；细胞中的NK细胞附壁，T细胞悬浮于培养液中形成细胞悬液；然后将细胞悬液吸弃，留下附壁的NK细胞，再用新的无血清完全培养基洗涤两遍，筛去除T细胞；

（4）刺激诱导NK细胞扩增：向上述去除T细胞后的培养瓶中加入含有刺激诱导因子的培养基，刺激诱导因子包括：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、SCM、IFN-γ和自体血浆中的一个或多个组合形成的刺激诱导因子，刺激诱导NK细胞，第3天，补加含有刺激诱导因子及自体血浆的培养基，继续诱导；第5天，再补加含有刺激诱导因子及自体血浆的培养基，持续诱导扩增；

（5）第7天至第14天扩增培养，每两天取样检测细胞含量，补加含有IL-2、IL-12、IL-15、IL-18的扩增培养基，使细胞浓度控制在1x10⁶个/ ml，至收获NK细胞。将细胞培养液转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水洗涤2遍，获得高纯度、高活性的NK细胞；

本发明的优势在于：

本发明提供的一种NK细胞体外扩增培养的方法安全性高、稳定性强、大大降低成本，具体创新：首先通过培养瓶包被CD16孵育，筛除去T细胞后，让NK细胞形成优势细胞群，经过刺激诱导后，扩增能力强，经过12~20天的培养，扩增位数可达100~300倍，经流式细胞仪检测，NK细胞所含的比例在80%~96%之间，并且本发明对不同的人体血液都有相同的结果，稳定性很好，方法简单、高效、有利于规模化生产。

附图说明

图1是人外周血采用实施例1方法扩增后的外周血NK细胞比例的流式细胞检测结果；

图2是脐血采用实施例2方法扩增后的脐血NK细胞比例的流式细胞检测结果；

图3是人外周血NK细胞与脐血NK细胞扩增数量的曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

本实施例的NK体外扩增培养的方法，采用志愿者外周血进行扩增实验，经过培养瓶包被、采血、分离单个核细胞及血浆灭活、初筛去除T细胞、刺激诱导、扩增培养、收获细胞和检测。该NK体外扩增培养的方法具体步骤如下：

（1）培养瓶包被处理：用10ml含有CD16浓度10μg/ml包被液铺满TC处理的培养瓶中，置于4℃冰箱，孵育过夜；包被完成后吸弃包被液，用10ml PBS洗涤2次，备用；

（2）采集志愿者外周血，梯度离心获得单个核细胞PBMC：检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性。抽取80ml血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞，血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境上速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血浆，保存于2~8℃环境；全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，备用；

（3）粗筛去除T细胞：收集得到的单个核细胞，分出1x10⁸数量的细胞，用40ml含有10%自体灭活血浆的无血清完全培养基重悬，转入已CD16包被处理的培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育2.0 h；孵育完成后，将细胞悬液吸弃，留下附壁的细胞，用无血清完全培养基洗涤2遍，使悬浮细胞完全洗出，将T细胞筛除；

（4）刺激诱导NK细胞：向上述去除T细胞后的培养瓶中加入40ml含有刺激诱导因子的培养基，刺激诱导因子包括：IL-2（2000IU/ml）、IL-12(20pg/ml)、IL-15(50pg/ml)、IL-18(20pg/ml)、SCM(1.0μg/ml)、IFN(20pg/ml)和10%自体血浆组合形成的刺激诱导因子，刺激诱导NK细胞，第3天，补加40ml含有刺激诱导因子及10%(v/v)自体血浆的培养基，继续诱导；第5天，再补加80 ml含有刺激诱导因子及10%(v/v)自体血浆的培养基，持续诱导扩增；

（5）扩增培养NK细胞：第7天至第14天扩增培养，每两天取样检测细胞含量，补加含有IL-2（1000IU/ml）、IL-12(10pg/ml)、IL-15(20pg/ml)、IL-18(10pg/ml)的扩增培养基，控制细胞浓度在1.0ⅹ10⁶个/ ml。第12天取样检测流式；第14天，将细胞培养液转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水洗涤2遍，获得高纯度、高活性的NK细胞；

（6）流式结果：如图1所示，该脐血NK细胞流式中CD3-CD16+CD56+到96.5%，其扩增曲线如图3生长曲线中的外周血NK细胞。

实施例２：

本实施例的NK体外扩增培养的方法，采集医院脐血（产妇知情），与外周血NK体外扩增培养的方法一致，由于脐血中NK的含量更低，因此在扩增培养的过程中刺激扩增培养因子的用量不一样。该NK体外扩增培养的方法具体步骤如下：

（1）培养瓶包被处理：用10ml含有CD16浓度２0μg/ml的包被液铺满TC处理的培养瓶中，置于4℃冰箱，孵育过夜；包被完成后吸弃包被液，用10ml PBS洗涤2次，备用；

（2）来自医院的脐血，梯度离心获得单个核细胞PBMC：检测乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体，人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒IgM抗体等项目均为阴性。抽取100ml脐血，置于无菌采血袋中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞，血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境上速冻15min，离心1500g，30min，得到清澈的血浆，保存于2~8℃环境；全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：1.5的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，分出2x10⁸数量的细胞，备用；

（3）粗筛去除T细胞：将分出2x10⁸数量的细胞，用40ml含有10%（v/v）自体灭活血浆的无血清完全培养基重悬，转入已CD16包被处理的培养瓶中，封口膜封口，置于4℃冰箱中孵育12 h；孵育完成后，将细胞悬液吸弃，留下附壁的细胞，用无血清完全培养基洗涤2遍，使悬浮细胞完全洗出，将T细胞筛除；

（4）刺激诱导NK细胞：向上述去除T细胞后的培养瓶中加入40ml含有刺激诱导因子的培养基，刺激诱导因子包括：IL-2（1000IU/ml）、IL-12(50pg/ml)、IL-15(100pg/ml)、IL-18(50pg/ml)、SCM(5.0μg/ml)、IFN(20pg/ml)和10%(v/v)自体血浆组合形成的刺激诱导因子，刺激诱导NK细胞，第3天，补加40ml含有刺激诱导因子及10%(v/v)自体血浆的培养基，继续诱导；第5天，再补加80 ml含有刺激诱导因子及10%(v/v)自体血浆的培养基，持续诱导扩增；

（5）扩增培养NK细胞：第7天至第14天扩增培养，每两天取样检测细胞含量，补加含有IL-2（1000IU/ml）、IL-12(10pg/ml)、IL-15(20pg/ml)、IL-18(10pg/ml)的扩增培养基，控制细胞浓度在1.0ⅹ106/ml。第14天取样检测流式；第16天，将细胞培养液转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水洗涤2遍，获得高纯度、高活性的NK细胞；

（6）流式结果：如图2所示，该脐血NK流式中CD3-CD16+CD56+到82.17%，其扩增曲线如图3生长曲线中的脐血NK。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）使用包被液对培养瓶进行包被处理；

2）采集人体血液，淋巴分离液梯度离心获得单个核细胞PBMC；

3）将单个核细胞PBMC用无血清完全培养基重悬后，转入步骤1）包被处理的培养瓶中孵育，细胞分成附壁细胞和悬浮的细胞悬液，其中，NK细胞附壁，T细胞在细胞悬液中；

4）将细胞悬液吸弃，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入含有刺激诱导因子的培养基刺激诱导NK细胞增殖；

5）对刺激诱导后的NK细胞进行扩增培养，获得NK细胞。

2.根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增的方法，其特征在于：所述步骤1）中包被液含有抗体，所述的包被液为PBS，抗体为CD16。

3.根据权利要求2所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：所述包被液中包含的单抗为CD16，浓度为0.1μg/ml~20μg/ml，用PBS溶解后，加入TC处理的培养瓶中，4℃包被过夜或37℃包被2~6h。

4.根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：所述步骤2）的具体操作为：用含有肝素钠抗凝剂的采血管或采血袋采集人体血液，转移至离心管，离心，获得上层血浆和下层全血细胞，上层血浆灭活后冰箱中贮存备用，全血细胞与生理盐水1：1稀释后，淋巴分离液梯度离心分离得到外周血单个核细胞，生理盐水重悬后洗涤，离心收集单个核细胞PBMC。

5.如权利要求4所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：人体血液包括人体外周血和脐血，分离液分离后，得到血浆和全血细胞，血浆合并后放入56℃水浴中灭活20~30min，再放于-20℃环境上速冻10~30min，离心1100g~2000g，10~30min，得到清澈的血浆，保存于2℃~8℃环境；全血细胞用生理盐水稀释后，最大按1：2的比例缓慢加入到含有淋巴分离液的离心管中，尽量保证分层清晰，650~800g，升1降0，离心20~30min，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，分出0.2 x10⁸~1x10⁸数量的细胞，备用。

6.根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：所述步骤3）的具体操作为：将所述步骤2）分出0.2x10⁸~1x10⁸数量的细胞，用20~40ml含有5%~20%（v/v）自体灭活血浆的培养基重悬，调整细胞密度1.0 x10⁶~4.0x10⁶个/ml，转入步骤1）包被处理的培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育0.5~12h后，细胞将被分成贴附的附壁细胞和悬浊在培养液中的细胞悬液，其中NK细胞附壁，T细胞在细胞悬液中。

7.根据权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：所述步骤4）中，步骤3）孵育后，将含有T细胞的细胞悬液吸弃，筛除T细胞，加入新的含有刺激诱导因子的培养基，刺激诱导NK细胞扩增，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育。

8.如权利要求7所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：NK细胞刺激诱导完成后，对NK细胞进行扩增培养，所述的刺激诱导因子包括：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、SCM、IFN-γ和自体血浆中的一个或多个的组合。

9.如权利要求1所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：所述步骤5）中，将刺激诱导后的NK细胞进行扩增培养，培养到第14天，可收获高纯度、高活性的NK细胞，通过离心分离收获细胞。

10.如权利要求9所述的一种NK细胞体外扩增培养的方法，其特征在于：NK细胞刺激诱导完成后，对NK细胞进行扩增培养；NK细胞扩增培养，所采用的培养基的制备方法为：加入浓度100IU/ml~3000IU/ml的IL-2和1%~3%（v/v）自体血浆的无血清完全培养基，每两天补加一次培养基，使细胞浓度控制在1x10⁶个/ml，NK细胞扩增培养至第13~18天，将扩增培养后的NK细胞液转至离心管中，500g、10min离心，得到目标NK细胞，合并后加入一定量的生理盐水洗涤若干次，得到NK细胞，计数。