CN113564119A - 一种nk细胞培养基及nk细胞培养方法 - Google Patents

一种nk细胞培养基及nk细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞培养基及NK细胞培养方法，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份为：浓度为70～90％的无血清培养基、浓度为5～20％的血浆、浓度为1.2～1.5％的人血白蛋白、浓度为1.5～2.0％的番茄汁、浓度为0.5％～5％的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml～10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml～100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml～30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml～200μg/ml的IL‑2、余量为蒸馏水。该NK细胞培养基培养的NK细胞，扩增倍数高达4000～6500多倍，且细胞成活率高达95％、对肿瘤细胞的杀伤活率也较高。

Description

一种NK细胞培养基及NK细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种NK细胞培养基及NK细胞培养方法。
背景技术
肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。
肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗费；其中，自体免疫细胞治疗技术，比如，NK细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗，且副作用小，不损伤正常组织。
NK细胞，又称自然杀伤细胞(natural killer cell)，NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键子集，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。
据国内外相关报道，体外扩增NK细胞的技术主要有三种：一是采用免疫磁珠细胞分选，从外周血单个核细胞得到纯化的NK细胞，在体外加入因子扩增培养；二是利用滋养层细胞K562细胞扩增原代NK细胞；三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养NK细胞。但是，前两种扩增NK细胞的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证，且K562细胞用为肿瘤细胞存在一定的风险，因此这两种方法多用于科研研究。第三种，也是目前NK细胞扩增的主要方法，其利用因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好，临床应用价值高，但扩增位数和纯度不高且不稳定。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题之一在于提供一种NK细胞培养基。本发明所要解决的问题之二在于提供一种NK细胞培养方法。
本发明的技术方案一如下：
一种NK细胞培养基，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：
浓度为70～90％的无血清培养基、浓度为5～20％的血浆、浓度为1.2～1.5％的人血白蛋白、浓度为1.5～2.0％的番茄汁、浓度为0.5％～5％的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml～10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml～100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml～30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml～200μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
一实施例中，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：
浓度为80％的无血清培养基、浓度为10％的血浆、浓度为1.4％的人血白蛋白、浓度为1.7％的番茄汁、浓度为1％的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
较好地，所述NK细胞培养基中，还包括浓度为50μg/ml～100μg/ml的环己六醇；优选浓度为70μg/ml的环己六醇。
本发明所要解决技术方案二如下：
一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：
采血管采用自体外周血并离心分离，获得单个核细胞；
取经包被处理的培养瓶并加入NK细胞培养基，随后将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，此时细胞密度调整为1×106/ml；其中，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：浓度为70～90％的无血清培养基、浓度为5～20％的血浆、浓度为1.2～1.5％的人血白蛋白、浓度为1.5～2.0％的番茄汁、浓度为0.5％～5％的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml～10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml～100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml～30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml～200μg/ml的IL-2，余量为蒸馏水；
往培养瓶中加入含量为50～200g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时；
第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；
第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养；
第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养；
第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
较好地，上述培养方法中，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：浓度为80％的无血清培养基、浓度为10％的血浆、浓度为1.4％的人血白蛋白、浓度为1.7％的番茄汁、浓度为1％的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2，余量为蒸馏水。
较好地，所述培养方法中，所述NK培养基中还包括浓度为50μg/ml～100μg/ml的环己六醇。
较好地，所述培养方法中，所述活性炭放入含量为100g/L；
较好地，所述培养方法中，所述NK细胞培养是在37℃、5％CO2环境下的培养箱中进行的。
本发明提供的NK培养基，除了保护细胞培养所需要的的基础培养组份，如，浓无血清培养基、血浆、单抗CD3、IL-2及蒸馏水，该培养基还包括细胞生长所需的营养物质，如番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素；其中，番茄汁中的番茄红素可以在细胞培养过程中防止保护细胞被氧化，增强细胞壁的韧性，以提升细胞生长，且番茄汁中的维生素E是细胞生长的生物活性物质，在细胞生长代谢过程中起到调节及控制作用；酵母提取物可以促进细胞增殖与分化，对细胞快速生长起到促进作用；Na+离子在细胞生长过程中，维持细胞内外渗透压的平衡，可以起到防止细胞壁破裂；玉米素可以促进细胞快速增殖分裂，以利于细胞快速生长；相对于其他培养基和培养方法，采用本发明培养基和培养方法，可以缩短NK细胞培养时间至少5～6天，实现NK细胞体外快速扩增，NK细胞扩增倍数可以达到400～621倍；NK细胞的活率高达95％以上，且NK细胞中，有效性细胞比率达到90以上；经体外肿瘤细胞杀伤实验验证表面，效靶比为20:1的条件下，该NK细胞对肿瘤细胞的最低杀伤率范围75.23％～94.35％，已经远远超过临床应用标准(≥40％)(《深圳市细胞治疗技术协会团体标准》，SZTT/SSCT004-2019)。
附图说明
图1为实施例6至10、对比例1培养的NK细胞生长曲线图；
图2为实施例6至10、对比例1培养的NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；
图3a、3b、3c、3d、3e、3f分别为实施例6至10、对比例1的NK细胞培养12天后的CD3-CD56+表型检测图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供的一种NK细胞培养基，按照每100ml的NK细胞培养基中，其包括组份：浓度为70～90％(体积百分比，下同)的无血清培养基、浓度为5～20％的血浆、浓度为1.2～1.5％的人血白蛋白、浓度为1.5～2.0％的番茄汁、浓度为0.5％～5％的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml～10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml～100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml～30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml～200μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
在另一实施例中，按照每100ml的NK细胞培养基中，其包括组份：浓度为75～85％的无血清培养基、浓度为10～15％的血浆、浓度为1.2～1.4％的人血白蛋白、浓度为1.7～1.9％的番茄汁、浓度为1％～3％的酵母提取物、浓度为1μg/ml～5μg/ml的Na+、浓度为60μg/ml～90μg/ml的玉米素、浓度为1μg/ml～20μg/ml的单抗CD3、浓度20μg/ml～100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
本发明中，上述NK培养基组份的无血清培养基选用RPMI 1640培养基；血浆选用人自体血液，即外周血800g下离心10分钟，获得上层液，对上层液再次2000g下离心5分钟，过滤，得到血浆。
上述NK培养基组份中，除了保护细胞培养所需要的的基础培养组份(如，浓无血清培养基、血浆、单抗CD3、IL-2及蒸馏水)外，该培养基中还包括细胞生长所需的营养物质及保护物质，如，番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素；其中：
番茄汁中的番茄红素可以在细胞培养过程中防止保护细胞被氧化，增强细胞壁的韧性，以提升细胞生长，且番茄汁中的维生素E是细胞生长的生物活性物质，在细胞生长代谢过程中起到调节及控制作用；其中，番茄汁是采用常用萃取方式获得；
酵母提取物可以促进细胞增殖与分化，对细胞快速生长起到促进作用；
Na+离子在细胞生长过程中，维持细胞内外渗透压的平衡，可以起到防止细胞壁破裂；
玉米素可以促进细胞快速增殖分裂、减慢细胞呼吸、保持细胞活力，以利于细胞快速生长。
上述营养组份中，在一实施例中，番茄汁也可以采用其他果蔬汁液，如，苦瓜汁、黄瓜汁、香蕉汁、苹果汁等；这些果蔬汁液，可以采用相应的果实或枝叶经萃取获得。细胞生长过程中，用以维持细胞核内外渗透压平衡的无机盐，除了Na+盐外，在其他实施例中，还可以是K+、Ca2+、Mg2+等无机离子盐；这些无机离子盐在细胞生长过程中参与细胞代谢活动。
上述营养组份中，酵母提取物是酵母通过质壁分离后，利用自身水解酶系完全自溶后，去除细胞壁和不溶性分子后获得。用作较慢提取物的原料主要是高蛋白质、高淀粉、高氨基酸的物质，如，豆类、麦类、红薯或马铃薯等经微生物发酵、提出处理获得。
在一实施例中，上述NK细胞培养基，按照每100ml的NK细胞培养基中，其包括组份：浓度为80％的无血清培养基、浓度为10％的血浆、浓度为1.4％的人血白蛋白、浓度为1.7％的番茄汁、浓度为1％的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
较好地，上述NK细胞培养基中，还包括浓度为50μg/ml～100μg/ml的环己六醇；优选浓度为70μg/ml的环己六醇。环己六醇，又称肌醇，其本身不能直接促进细胞生长，但可以激发无机盐Na+、酵母提取物、番茄汁中的维生素E和番茄素等物质的发挥，参与细胞代谢、促进离子平衡，从而促进细胞生长。
依托本发明上述NK细胞培养基，本发明提供了一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、采血管采用自体外周血并离心分离，获得单个核细胞；其中：
此处，采集志愿者外周血，抽取80ml血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞。血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境上速冻15min，离心1500g，30分钟，得到清澈的血浆，保存于2～8℃环境；全血细胞与生理盐水1:1稀释后，按1:2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30分钟，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，备用；
S2、取经包被处理的培养瓶并加入NK细胞培养基，随后将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，此时细胞密度调整为1×106/ml；其中，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：浓度为70～90％的无血清培养基、浓度为5～20％的血浆、浓度为1.2～1.5％的人血白蛋白、浓度为1.5～2.0％的番茄汁、浓度为0.5％～5％的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml～10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml～100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml～30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml～200μg/ml的IL-2及余量为蒸馏水。
其中，该步骤中，对培养瓶的包被处理如下：
往培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
应该注意是：在吸出培养瓶中的包被液时，不要触碰底面，且只有在细胞确实需要接种前才可吸出包被液，避免包培养瓶壁上的包被液干掉，影响细胞爬壁生长。
S3、往培养瓶中加入含量为50～200g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时。
S4、第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；其中，这个步骤中，还可以单独加入细胞刺激因子IL-2，浓度控制在20～50μg/ml左右，诱导NK细胞进一步增殖、扩增。
S5、第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养。
S6、第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
S7、第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
较好地，在一实施例中，上述培养方法中，按照每100ml的NK细胞培养基，包括组份：浓度为80％的无血清培养基、浓度为10％的血浆、浓度为1.4％的人血白蛋白、浓度为1.7％的番茄汁、浓度为1％的酵母提取物、浓度为50μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
在又一实施例中，活性炭的放入含量为100g/L；NK培养基中环己六醇的浓度为70μg/ml。
在NK细胞培养过程中，加入活性炭，其目的主要是利用其吸附能力，吸除培养基质中细胞增殖产生的代谢物质，起到净化培养基质的作用，促进细胞生长。
较好地，对于NK细胞的培养，在37℃、5％CO2环境下的培养箱中进行的。
因此，相对于其他培养基和培养方法，采用本发明得我NK细胞培养基和培养方法，可以缩短NK细胞培养时间至少5天，也就是说，本发明中，NK细胞培养时间只需要12天，就可以实现NK细胞体外快速扩增，NK细胞扩增倍数可以达到400～600倍；NK细胞的活率高达95％以上，且NK细胞中，有效性细胞比率达到90以上；经体外肿瘤细胞杀伤实验验证表面，该NK细胞对肿瘤细胞的伤率高达87％以上。
下面通过一些具体实施例来进一步说明
一、NK细胞培养基的配置
下述各实施例中，NK培养基组份的无血清培养基选用RPMI 1640培养基；血浆选用人自体血液，即外周血800g下离心10分钟，获得上层液，对上层液再次2000g下离心5分钟，过滤，得到血浆。
实施例1
按照每100ml的NK细胞培养基中，其组份包括：
浓度为80％的无血清培养基、浓度为10％的血浆、浓度为1.4％的人血白蛋白、浓度为1.7％的番茄汁、浓度为1％的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水；混匀后备用。
实施例2
按照每100ml的NK细胞培养基中，其组份包括：
浓度为70％的无血清培养基、浓度为20％的血浆、浓度为1.2％的人血白蛋白、浓度为1.5％的番茄汁、浓度为5％的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml的玉米素、浓度为30μg/ml的单抗CD3、浓度为200μg/ml的IL-2、浓度为70μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水；混匀后备用。
实施例3
按照每100ml的NK细胞培养基中，其组份包括：
浓度为90％的无血清培养基、浓度为5％的血浆、浓度为1.5％的人血白蛋白、浓度为2.0％的番茄汁、浓度为0.5％的酵母提取物、浓度为10μg/ml的Na+、浓度为100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml的单抗CD3、浓度为2μg/ml的IL-2、浓度为100μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水；混匀后备用。
实施例4
按照每100ml的NK细胞培养基中，其组份包括：
浓度为75％的无血清培养基、浓度为15％的血浆、浓度为1.3％的人血白蛋白、浓度为1.8％的番茄汁、浓度为2％的酵母提取物、浓度为3μg/ml的Na+、浓度为70μg/ml的玉米素、浓度为10μg/ml的单抗CD3、浓度为50μg/ml的IL-2、浓度为50μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水；混匀后备用。
实施例5
按照每100ml的NK细胞培养基中，其组份包括：
浓度为80％的无血清培养基、浓度为10％的血浆、浓度为1.25％的人血白蛋白、浓度为1.7％的番茄汁、浓度为1％的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、浓度为70μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水；混匀后备用。
二、NK细胞培养
下述各实施例中，NK细胞均采用体外扩增培养，采用志愿者外周血进行扩增实验，经过培养瓶包被、采血、分离单个核细胞及血浆灭活、初筛去除T细胞、刺激诱导、扩增培养、收获NK细胞。
本发明中，采集志愿者外周血。抽取80ml血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞。血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境上速冻15min，离心1500g，30分钟，得到清澈的血浆，保存于2～8℃环境；全血细胞与生理盐水1：1稀释后，按1：2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30分钟，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，备用。
实施例6
NK细胞的培养工艺，包括如下步骤：
1、第0日，往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例1制备的NK细胞培养基，随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，孵育完成后，将细胞悬液吸弃，留下附壁的细胞，用无血清完全培养基洗涤2遍，使悬浮细胞完全洗出，将T细胞筛除。
3、第2日，往培养瓶中加入含量为150g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；其中，这个步骤中，还可以单独加入细胞刺激因子IL-2，浓度控制在20～50μg/ml左右，诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例7
NK细胞的培养工艺，包括如下步骤：
1、第0日，往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例2制备的NK细胞培养基，随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，孵育完成后，将细胞悬液吸弃，留下附壁的细胞，用无血清完全培养基洗涤2遍，使悬浮细胞完全洗出，将T细胞筛除。
3、第2日，往培养瓶中加入含量为50g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；其中，这个步骤中，还可以单独加入细胞刺激因子IL-2，浓度控制在20～50μg/ml左右，诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例8
NK细胞的培养工艺，包括如下步骤：
1、第0日，往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例3制备的NK细胞培养基，随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，孵育完成后，将细胞悬液吸弃，留下附壁的细胞，用无血清完全培养基洗涤2遍，使悬浮细胞完全洗出，将T细胞筛除。
3、第2日，往培养瓶中加入含量为200g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；其中，这个步骤中，还可以单独加入细胞刺激因子IL-2，浓度控制在20～50μg/ml左右，诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例9
NK细胞的培养工艺，包括如下步骤：
1、第0日，往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例4制备的NK细胞培养基，随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，孵育完成后，将细胞悬液吸弃，留下附壁的细胞，用无血清完全培养基洗涤2遍，使悬浮细胞完全洗出，将T细胞筛除。
3、第2日，往培养瓶中加入含量为100g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；其中，这个步骤中，还可以单独加入细胞刺激因子IL-2，浓度控制在20～50μg/ml左右，诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例10
NK细胞的培养工艺，包括如下步骤：
1、第0日，往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例5制备的NK细胞培养基，随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时，孵育完成后，将细胞悬液吸弃，留下附壁的细胞，用无血清完全培养基洗涤2遍，使悬浮细胞完全洗出，将T细胞筛除。
3、第2日，往培养瓶中加入含量为120g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；其中，这个步骤中，还可以单独加入细胞刺激因子IL-2，浓度控制在20～50μg/ml左右，诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，500g，离心8分钟，再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
对比例1
NK细胞的培养工艺，包括如下步骤：
1、第0天，往培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
2、将含细胞因子的浓度为无血清的RPMI 1640培养基加入到TC175细胞培养瓶中，且培养基的体积为25ml；随后将1×106个/ml的上述制得的外周血单个核细胞转移到培养瓶中，放入培养箱中静置培养3天，该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2；其中，细胞因子中包括：浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度为10ng/ml的IL-15。
3、第3天，往细胞培养瓶中加入50ml含细胞因子的RPMI 1640培养基，进行细胞培养；其中，细胞因子包括含有浓度10ng/ml的IL-15及浓度1000IU/ml的IL-2。
4、第6天，再次往细胞培养瓶中加入120ml含细胞因子的RPMI 1640培养基，继续进行细胞培养；其中，细胞因子包括浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度10ng/ml的IL-15。
5、第8天，将细胞连同培养基质转至两个2000ml规格的细胞培养袋中，同时往细胞培养袋中添加包含浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度10ng/ml的IL-15的RPMI 1640培养基400ml；继续在培养箱中进行细胞培养。
6、第10天，再次往细胞培养袋中添加含浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度10ng/ml的IL-15的RPMI 1640培养基600ml；
7、第12天，停止培养，将培养好的外周血NK细胞用离心管收集，离心处理，去除上层液，并用氯化钠溶液反复离心洗涤3次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并往沉淀物中加入10ml的10％的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml，得到外周血NK细胞产品。
三、NK细胞检测
1、NK细胞培养生长曲线图
图1表示外周血NK细胞培养生长曲线图。如图1所示，细胞经过12天的培养增殖后，本发明培养基质能有效提高NK细胞的增殖倍数，培养12天后，使NK细胞数量达到近6.21×109/ml，远大于对比例1中培养NK细胞的数量3.45×109个/ml；如表1所示。
表1 NK细胞扩增数量表(×107cells/ml)
Figure BDA0003245496060000151
表1中，分别表示实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10及对比例1中，外周血NK细胞在第0、2、3、6、8、10、12天后测得的细胞生长数量；其中，实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10培养的NK细胞数量扩增达到4000～6000倍，对比例1培养的NK细胞扩增数量为250倍左右。相对应而言，在缩短NK细胞培养时间约为5～6天后(正常状态，NK细胞需要培养17～18天)，即同期培养12天后，实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10培养的NK细胞数量分别是对比例1培养细胞数量的1.63、1.75、1.87、2.0、2.46倍。这是因为番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素共同刺激NK细胞生长的结果。番茄汁中的番茄红素可以在细胞培养过程中防止保护细胞被氧化，增强细胞壁的韧性，以提升细胞生长，且番茄汁中的维生素E是细胞生长的生物活性物质，在细胞生长代谢过程中起到调节及控制作用；酵母提取物可以促进细胞增殖与分化，对细胞快速生长起到促进作用；Na+离子在细胞生长过程中，维持细胞内外渗透压的平衡，可以起到防止细胞壁破裂；玉米素可以促进细胞快速增殖分裂，以利于细胞快速生长。
2、NK细胞活率检测
将实施例6至10、对比例1的NK细胞进行台盼蓝染色，放入18～25℃下保存4小时后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率，如表2。
表2细胞数和细胞活率表
Figure BDA0003245496060000161
从表2中可以看出，实施例6至10的NK细胞数量以及细胞活率，远高于对比例1，也就说明采用本发明NK培养基质及培养方法培养的NK细胞扩增比例远高于对比例，尤其是实施例10(其对应的培养基质为实施例5)，其细胞活率达到97.9％，已经超出临床应用标准规定的细胞活率(≥90％)。
3、NK细胞杀伤活性测试
取实施例6至10、对比例1培养12天后的NK细胞且细胞数量相同。转至3组离心管组(每组离心管组6支离心管，每组都对应有实施例6至10、对比例1中培养的NK细胞)中，然后采用各自对应的培养液，将3组离心管组分别调整浓度约为1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的细胞悬液，作为3组效应细胞。
K562细胞作为靶细胞，按照效靶比1:1、5:1、10:1、20:1进行靶细胞K562和效应细胞NK细胞进行铺孔，每组3个复孔。NK细胞和K562靶细胞的每个孔分别为500μl。每孔加入500μl实施例6至10、对比例1中各自对应的培养基。
效应细胞NK细胞自然释放组：1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的NK细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
K562靶细胞最大释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养40分钟。
K562靶细胞自然释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
培养液空白对照试验组：每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
铺板后，将培养板250g离心4分钟，置于于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。在培养结束后前45分钟，取出培养板，在靶细胞最大释放组加入解冻液，250g离心4分钟，继续培养45分钟取出，之后轻轻混匀细胞，再300g离心5min，收集上清液，用LDH(乳酸脱氢酶)测定492nm波长的吸光度值。
杀伤活性按照如下公式计算：
杀伤活性＝(A-B-C)/(D-C)×100％；
其中：
A-表示试验组吸光度值校正值；
B-表示效应细胞自然释放组；
C-表示靶细胞自然释放组；
D-表示靶细胞最大释放组；
测试结果见表3和图2
表3 NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性检测
组别 20:1 10:1 5:1 1:1
实施例6 75.23％ 55.23％ 41.23％ 11.19％
实施例7 77.50％ 59.36％ 35.60％ 18.70％
实施例8 74.91％ 61.12％ 42.06％ 26.38％
实施例9 85.34％ 65.89％ 56.75％ 32.25％
实施例10 94.35％ 85.34％ 72.56％ 41.45％
对比例1 63.21％ 42.13％ 31.86％ 8.92％
由表3和图2可知，在杀伤K562细胞时，本发明方法诱导培养的NK细胞比对比例1诱导培养的NK细胞的杀伤效果更好，差异较明显，说明采用本发明培养基质和培养方法培养NK细胞，可以增强杀伤肿瘤的活性。尤其是，实施例10(对应实施例5的NK培养基质)培养的NK细胞杀伤活性最强(达到94.35％)，在效靶比为20:1条件下，NK细胞的杀伤性活性也是最好的。实施例6至10中NK细胞培养12天后，在杀伤K562细胞时，以效靶比为20:1条件下，其细胞杀伤率介于75.23％～94.35％，远高于临床应用标准大于等于40％。
4、NK细胞免疫表型检测
图3a、3b、3c、3d、3e、3f分别对应实施例6至10、对比例1的NK细胞培养12天后的CD3-CD56+表型检测图。
第12天后，分别取实施例6至10、对比例1培养的NK细胞，制成细胞悬液并调整细胞浓度为1×106个/ml，加入标记的CD3-CD56+单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，测试结果如图3a、3b、3c、3d、3e、3f所示的NK细胞表型分析图。由图3a、3b、3c、3d、3e说明，实施例6至10培养的NK细胞，培养基中添加的番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素组合使得CD3-CD56+细胞含量高达92.42％，比对比例1的NK细胞在CD3-CD56+的含量(24.42％)高出68％；尤其是为采用实施例5的NK细胞培养基培养的NK细胞使得CD3-CD56+细胞含量最高，即使是采用实施例1的NK细胞培养基培养的NK细胞使得CD3-CD56+细胞含量也达到53.08％，比对比例1的NK细胞在CD3-CD56+的含量(24.42％)高出28.66％。
图中3a、3b、3c、3d、3e还说明，实施例6至10中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例，相对对比例1中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例明显增加，且实施例7至10中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例，分别是63.08％、71.21％、82.87％、92.42％，均已超过临床应用标准(≥60％)。
因此，实施例6至10培养的NK细胞扩增明显，培养基质中的番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素组分对CD3-CD56+细胞有较强的诱导作用。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种NK细胞培养基，其特征在于，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：
浓度为70～90％的无血清培养基；
浓度为5～20％的血浆；
浓度为1.2～1.5％的人血白蛋白；
浓度为1.5～2.0％的番茄汁；
浓度为0.5％～5％的酵母提取物；
浓度为0.1μg/ml～10μg/ml的Na+；
浓度为50μg/ml～100μg/ml的玉米素；
浓度为0.6μg/ml～30μg/ml的单抗CD3；
浓度2μg/ml～200μg/ml的IL-2；及
余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：
浓度为80％的无血清培养基；
浓度为10％的血浆；
浓度为1.4％的人血白蛋白
浓度为1.7％的番茄汁；
浓度为1％的酵母提取物；
浓度为5μg/ml的Na+；
浓度为80μg/ml的玉米素；
浓度为20μg/ml的单抗CD3；
浓度100μg/ml的IL-2；及
余量为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的NK细胞培养基，其特征在于，还包括浓度为50μg/ml～100μg/ml的环己六醇。
4.根据权利要求2所述的NK细胞培养基，其特征在于，所述环己六醇的浓度为70μg/ml。
5.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
采血管采用自体外周血并离心分离，获得单个核细胞；
取经包被处理的培养瓶并加入NK细胞培养基，随后将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，此时细胞密度调整为1×106/ml；其中，每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：浓度为70～90％的无血清培养基、浓度为5～20％的血浆、浓度为1.2～1.5％的人血白蛋白、浓度为1.5～2.0％的番茄汁、浓度为0.5％～5％的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml～10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml～100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml～30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml～200μg/ml的IL-2，余量为蒸馏水；
往培养瓶中加入含量为50～200g/L的活性炭，对单个核细胞进行包被处理24小时；
第3日，对细胞进行离心换液：吸弃细胞悬液，筛除T细胞，剩下附壁细胞，再加入NK培养基，刺激诱导NK细胞增殖；
第6日，计数细胞数量，并更换NK培养基质继续培养；
第7日～11日，将细胞及培养基转移至培养袋中，每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养；
第12日，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述NK细胞培养基包括：
每100ml的NK细胞培养基中，包括组份：浓度为80％的无血清培养基、浓度为10％的血浆、浓度为1.4％的人血白蛋白、浓度为1.7％的番茄汁、浓度为1％的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2，余量为蒸馏水。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述NK培养基中还包括浓度为50μg/ml～100μg/ml的环己六醇。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述NK培养基中还包括浓度为70μg/ml的环己六醇。
9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述活性炭放入含量为100g/L。
10.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述NK细胞培养是在37℃、5％CO2环境下的培养箱中进行的。
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