CN113564119A - 一种nk细胞培养基及nk细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NK细胞培养基及NK细胞培养方法,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份为:浓度为70~90%的无血清培养基、浓度为5~20%的血浆、浓度为1.2~1.5%的人血白蛋白、浓度为1.5~2.0%的番茄汁、浓度为0.5%~5%的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml~10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml~100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml~30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml~200μg/ml的IL‑2、余量为蒸馏水。该NK细胞培养基培养的NK细胞,扩增倍数高达4000~6500多倍,且细胞成活率高达95%、对肿瘤细胞的杀伤活率也较高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域,特别是涉及一种NK细胞培养基及NK细胞培养方法。
背景技术
肿瘤是困扰人类健康的重大疾病,但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性,一直找不到一种更加深入治疗方法,随着医学的进步,癌症的治愈率、生存率都有显著的改善,但现在仍然是难治性的疾病。
肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗费;其中,自体免疫细胞治疗技术,比如,NK细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法,适用于多种恶性肿瘤的临床治疗,且副作用小,不损伤正常组织。
NK细胞,又称自然杀伤细胞(natural killer cell),NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞,具有独特功能的细胞亚群,是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞,是先天免疫细胞的关键子集,被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一,也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。
据国内外相关报道,体外扩增NK细胞的技术主要有三种:一是采用免疫磁珠细胞分选,从外周血单个核细胞得到纯化的NK细胞,在体外加入因子扩增培养;二是利用滋养层细胞K562细胞扩增原代NK细胞;三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养NK细胞。但是,前两种扩增NK细胞的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证,且K562细胞用为肿瘤细胞存在一定的风险,因此这两种方法多用于科研研究。第三种,也是目前NK细胞扩增的主要方法,其利用因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好,临床应用价值高,但扩增位数和纯度不高且不稳定。
发明内容
基于上述问题,本发明所要解决的问题之一在于提供一种NK细胞培养基。本发明所要解决的问题之二在于提供一种NK细胞培养方法。
本发明的技术方案一如下:
一种NK细胞培养基,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:
浓度为70~90%的无血清培养基、浓度为5~20%的血浆、浓度为1.2~1.5%的人血白蛋白、浓度为1.5~2.0%的番茄汁、浓度为0.5%~5%的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml~10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml~100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml~30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml~200μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
一实施例中,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:
浓度为80%的无血清培养基、浓度为10%的血浆、浓度为1.4%的人血白蛋白、浓度为1.7%的番茄汁、浓度为1%的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
较好地,所述NK细胞培养基中,还包括浓度为50μg/ml~100μg/ml的环己六醇;优选浓度为70μg/ml的环己六醇。
本发明所要解决技术方案二如下:
一种NK细胞的培养方法,包括如下步骤:
采血管采用自体外周血并离心分离,获得单个核细胞;
取经包被处理的培养瓶并加入NK细胞培养基,随后将所述单个核细胞加入所述培养瓶中,此时细胞密度调整为1×106/ml;其中,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:浓度为70~90%的无血清培养基、浓度为5~20%的血浆、浓度为1.2~1.5%的人血白蛋白、浓度为1.5~2.0%的番茄汁、浓度为0.5%~5%的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml~10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml~100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml~30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml~200μg/ml的IL-2,余量为蒸馏水;
往培养瓶中加入含量为50~200g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时;
第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;
第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养;
第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养;
第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
较好地,上述培养方法中,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:浓度为80%的无血清培养基、浓度为10%的血浆、浓度为1.4%的人血白蛋白、浓度为1.7%的番茄汁、浓度为1%的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2,余量为蒸馏水。
较好地,所述培养方法中,所述NK培养基中还包括浓度为50μg/ml~100μg/ml的环己六醇。
较好地,所述培养方法中,所述活性炭放入含量为100g/L;
较好地,所述培养方法中,所述NK细胞培养是在37℃、5%CO2环境下的培养箱中进行的。
本发明提供的NK培养基,除了保护细胞培养所需要的的基础培养组份,如,浓无血清培养基、血浆、单抗CD3、IL-2及蒸馏水,该培养基还包括细胞生长所需的营养物质,如番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素;其中,番茄汁中的番茄红素可以在细胞培养过程中防止保护细胞被氧化,增强细胞壁的韧性,以提升细胞生长,且番茄汁中的维生素E是细胞生长的生物活性物质,在细胞生长代谢过程中起到调节及控制作用;酵母提取物可以促进细胞增殖与分化,对细胞快速生长起到促进作用;Na+离子在细胞生长过程中,维持细胞内外渗透压的平衡,可以起到防止细胞壁破裂;玉米素可以促进细胞快速增殖分裂,以利于细胞快速生长;相对于其他培养基和培养方法,采用本发明培养基和培养方法,可以缩短NK细胞培养时间至少5~6天,实现NK细胞体外快速扩增,NK细胞扩增倍数可以达到400~621倍;NK细胞的活率高达95%以上,且NK细胞中,有效性细胞比率达到90以上;经体外肿瘤细胞杀伤实验验证表面,效靶比为20:1的条件下,该NK细胞对肿瘤细胞的最低杀伤率范围75.23%~94.35%,已经远远超过临床应用标准(≥40%)(《深圳市细胞治疗技术协会团体标准》,SZTT/SSCT004-2019)。
附图说明
图1为实施例6至10、对比例1培养的NK细胞生长曲线图;
图2为实施例6至10、对比例1培养的NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图;
图3a、3b、3c、3d、3e、3f分别为实施例6至10、对比例1的NK细胞培养12天后的CD3-CD56+表型检测图。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供的一种NK细胞培养基,按照每100ml的NK细胞培养基中,其包括组份:浓度为70~90%(体积百分比,下同)的无血清培养基、浓度为5~20%的血浆、浓度为1.2~1.5%的人血白蛋白、浓度为1.5~2.0%的番茄汁、浓度为0.5%~5%的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml~10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml~100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml~30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml~200μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
在另一实施例中,按照每100ml的NK细胞培养基中,其包括组份:浓度为75~85%的无血清培养基、浓度为10~15%的血浆、浓度为1.2~1.4%的人血白蛋白、浓度为1.7~1.9%的番茄汁、浓度为1%~3%的酵母提取物、浓度为1μg/ml~5μg/ml的Na+、浓度为60μg/ml~90μg/ml的玉米素、浓度为1μg/ml~20μg/ml的单抗CD3、浓度20μg/ml~100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
本发明中,上述NK培养基组份的无血清培养基选用RPMI 1640培养基;血浆选用人自体血液,即外周血800g下离心10分钟,获得上层液,对上层液再次2000g下离心5分钟,过滤,得到血浆。
上述NK培养基组份中,除了保护细胞培养所需要的的基础培养组份(如,浓无血清培养基、血浆、单抗CD3、IL-2及蒸馏水)外,该培养基中还包括细胞生长所需的营养物质及保护物质,如,番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素;其中:
番茄汁中的番茄红素可以在细胞培养过程中防止保护细胞被氧化,增强细胞壁的韧性,以提升细胞生长,且番茄汁中的维生素E是细胞生长的生物活性物质,在细胞生长代谢过程中起到调节及控制作用;其中,番茄汁是采用常用萃取方式获得;
酵母提取物可以促进细胞增殖与分化,对细胞快速生长起到促进作用;
Na+离子在细胞生长过程中,维持细胞内外渗透压的平衡,可以起到防止细胞壁破裂;
玉米素可以促进细胞快速增殖分裂、减慢细胞呼吸、保持细胞活力,以利于细胞快速生长。
上述营养组份中,在一实施例中,番茄汁也可以采用其他果蔬汁液,如,苦瓜汁、黄瓜汁、香蕉汁、苹果汁等;这些果蔬汁液,可以采用相应的果实或枝叶经萃取获得。细胞生长过程中,用以维持细胞核内外渗透压平衡的无机盐,除了Na+盐外,在其他实施例中,还可以是K+、Ca2+、Mg2+等无机离子盐;这些无机离子盐在细胞生长过程中参与细胞代谢活动。
上述营养组份中,酵母提取物是酵母通过质壁分离后,利用自身水解酶系完全自溶后,去除细胞壁和不溶性分子后获得。用作较慢提取物的原料主要是高蛋白质、高淀粉、高氨基酸的物质,如,豆类、麦类、红薯或马铃薯等经微生物发酵、提出处理获得。
在一实施例中,上述NK细胞培养基,按照每100ml的NK细胞培养基中,其包括组份:浓度为80%的无血清培养基、浓度为10%的血浆、浓度为1.4%的人血白蛋白、浓度为1.7%的番茄汁、浓度为1%的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
较好地,上述NK细胞培养基中,还包括浓度为50μg/ml~100μg/ml的环己六醇;优选浓度为70μg/ml的环己六醇。环己六醇,又称肌醇,其本身不能直接促进细胞生长,但可以激发无机盐Na+、酵母提取物、番茄汁中的维生素E和番茄素等物质的发挥,参与细胞代谢、促进离子平衡,从而促进细胞生长。
依托本发明上述NK细胞培养基,本发明提供了一种NK细胞的培养方法,包括如下步骤:
S1、采血管采用自体外周血并离心分离,获得单个核细胞;其中:
此处,采集志愿者外周血,抽取80ml血液,置于无菌肝素钠采血管中,血液转入50ml的离心管中,离心后,得到血浆和全血细胞。血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min,再放于-20℃环境上速冻15min,离心1500g,30分钟,得到清澈的血浆,保存于2~8℃环境;全血细胞与生理盐水1:1稀释后,按1:2的比例缓慢加入到淋巴分离液中,尽量保证分层清晰,650g,升1降0,离心30分钟,吸取白膜层,再用生理盐水重悬洗涤2次,收集单个核细胞PBMC,备用;
S2、取经包被处理的培养瓶并加入NK细胞培养基,随后将所述单个核细胞加入所述培养瓶中,此时细胞密度调整为1×106/ml;其中,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:浓度为70~90%的无血清培养基、浓度为5~20%的血浆、浓度为1.2~1.5%的人血白蛋白、浓度为1.5~2.0%的番茄汁、浓度为0.5%~5%的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml~10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml~100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml~30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml~200μg/ml的IL-2及余量为蒸馏水。
其中,该步骤中,对培养瓶的包被处理如下:
往培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液,常温包被所述培养瓶内壁2h,包被结束吸出包被液待用。
应该注意是:在吸出培养瓶中的包被液时,不要触碰底面,且只有在细胞确实需要接种前才可吸出包被液,避免包培养瓶壁上的包被液干掉,影响细胞爬壁生长。
S3、往培养瓶中加入含量为50~200g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时。
S4、第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;其中,这个步骤中,还可以单独加入细胞刺激因子IL-2,浓度控制在20~50μg/ml左右,诱导NK细胞进一步增殖、扩增。
S5、第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养。
S6、第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
S7、第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,500g,离心8分钟,再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
较好地,在一实施例中,上述培养方法中,按照每100ml的NK细胞培养基,包括组份:浓度为80%的无血清培养基、浓度为10%的血浆、浓度为1.4%的人血白蛋白、浓度为1.7%的番茄汁、浓度为1%的酵母提取物、浓度为50μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水。
在又一实施例中,活性炭的放入含量为100g/L;NK培养基中环己六醇的浓度为70μg/ml。
在NK细胞培养过程中,加入活性炭,其目的主要是利用其吸附能力,吸除培养基质中细胞增殖产生的代谢物质,起到净化培养基质的作用,促进细胞生长。
较好地,对于NK细胞的培养,在37℃、5%CO2环境下的培养箱中进行的。
因此,相对于其他培养基和培养方法,采用本发明得我NK细胞培养基和培养方法,可以缩短NK细胞培养时间至少5天,也就是说,本发明中,NK细胞培养时间只需要12天,就可以实现NK细胞体外快速扩增,NK细胞扩增倍数可以达到400~600倍;NK细胞的活率高达95%以上,且NK细胞中,有效性细胞比率达到90以上;经体外肿瘤细胞杀伤实验验证表面,该NK细胞对肿瘤细胞的伤率高达87%以上。
下面通过一些具体实施例来进一步说明
一、NK细胞培养基的配置
下述各实施例中,NK培养基组份的无血清培养基选用RPMI 1640培养基;血浆选用人自体血液,即外周血800g下离心10分钟,获得上层液,对上层液再次2000g下离心5分钟,过滤,得到血浆。
实施例1
按照每100ml的NK细胞培养基中,其组份包括:
浓度为80%的无血清培养基、浓度为10%的血浆、浓度为1.4%的人血白蛋白、浓度为1.7%的番茄汁、浓度为1%的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、余量为蒸馏水;混匀后备用。
实施例2
按照每100ml的NK细胞培养基中,其组份包括:
浓度为70%的无血清培养基、浓度为20%的血浆、浓度为1.2%的人血白蛋白、浓度为1.5%的番茄汁、浓度为5%的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml的玉米素、浓度为30μg/ml的单抗CD3、浓度为200μg/ml的IL-2、浓度为70μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水;混匀后备用。
实施例3
按照每100ml的NK细胞培养基中,其组份包括:
浓度为90%的无血清培养基、浓度为5%的血浆、浓度为1.5%的人血白蛋白、浓度为2.0%的番茄汁、浓度为0.5%的酵母提取物、浓度为10μg/ml的Na+、浓度为100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml的单抗CD3、浓度为2μg/ml的IL-2、浓度为100μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水;混匀后备用。
实施例4
按照每100ml的NK细胞培养基中,其组份包括:
浓度为75%的无血清培养基、浓度为15%的血浆、浓度为1.3%的人血白蛋白、浓度为1.8%的番茄汁、浓度为2%的酵母提取物、浓度为3μg/ml的Na+、浓度为70μg/ml的玉米素、浓度为10μg/ml的单抗CD3、浓度为50μg/ml的IL-2、浓度为50μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水;混匀后备用。
实施例5
按照每100ml的NK细胞培养基中,其组份包括:
浓度为80%的无血清培养基、浓度为10%的血浆、浓度为1.25%的人血白蛋白、浓度为1.7%的番茄汁、浓度为1%的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2、浓度为70μg/ml的环己六醇、余量为蒸馏水;混匀后备用。
二、NK细胞培养
下述各实施例中,NK细胞均采用体外扩增培养,采用志愿者外周血进行扩增实验,经过培养瓶包被、采血、分离单个核细胞及血浆灭活、初筛去除T细胞、刺激诱导、扩增培养、收获NK细胞。
本发明中,采集志愿者外周血。抽取80ml血液,置于无菌肝素钠采血管中,血液转入50ml的离心管中,离心后,得到血浆和全血细胞。血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min,再放于-20℃环境上速冻15min,离心1500g,30分钟,得到清澈的血浆,保存于2~8℃环境;全血细胞与生理盐水1:1稀释后,按1:2的比例缓慢加入到淋巴分离液中,尽量保证分层清晰,650g,升1降0,离心30分钟,吸取白膜层,再用生理盐水重悬洗涤2次,收集单个核细胞PBMC,备用。
实施例6
NK细胞的培养工艺,包括如下步骤:
1、第0日,往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液,常温包被所述培养瓶内壁2h,包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例1制备的NK细胞培养基,随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2小时,孵育完成后,将细胞悬液吸弃,留下附壁的细胞,用无血清完全培养基洗涤2遍,使悬浮细胞完全洗出,将T细胞筛除。
3、第2日,往培养瓶中加入含量为150g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;其中,这个步骤中,还可以单独加入细胞刺激因子IL-2,浓度控制在20~50μg/ml左右,诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,500g,离心8分钟,再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例7
NK细胞的培养工艺,包括如下步骤:
1、第0日,往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液,常温包被所述培养瓶内壁2h,包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例2制备的NK细胞培养基,随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2小时,孵育完成后,将细胞悬液吸弃,留下附壁的细胞,用无血清完全培养基洗涤2遍,使悬浮细胞完全洗出,将T细胞筛除。
3、第2日,往培养瓶中加入含量为50g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;其中,这个步骤中,还可以单独加入细胞刺激因子IL-2,浓度控制在20~50μg/ml左右,诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,500g,离心8分钟,再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例8
NK细胞的培养工艺,包括如下步骤:
1、第0日,往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液,常温包被所述培养瓶内壁2h,包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例3制备的NK细胞培养基,随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2小时,孵育完成后,将细胞悬液吸弃,留下附壁的细胞,用无血清完全培养基洗涤2遍,使悬浮细胞完全洗出,将T细胞筛除。
3、第2日,往培养瓶中加入含量为200g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;其中,这个步骤中,还可以单独加入细胞刺激因子IL-2,浓度控制在20~50μg/ml左右,诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,500g,离心8分钟,再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例9
NK细胞的培养工艺,包括如下步骤:
1、第0日,往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液,常温包被所述培养瓶内壁2h,包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例4制备的NK细胞培养基,随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2小时,孵育完成后,将细胞悬液吸弃,留下附壁的细胞,用无血清完全培养基洗涤2遍,使悬浮细胞完全洗出,将T细胞筛除。
3、第2日,往培养瓶中加入含量为100g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;其中,这个步骤中,还可以单独加入细胞刺激因子IL-2,浓度控制在20~50μg/ml左右,诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,500g,离心8分钟,再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
实施例10
NK细胞的培养工艺,包括如下步骤:
1、第0日,往TC175培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液,常温包被所述培养瓶内壁2h,包被结束吸出包被液待用。
2、取TC175培养瓶并加入实施例5制备的NK细胞培养基,随后将1×106/ml单个核细胞加入TC175培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2小时,孵育完成后,将细胞悬液吸弃,留下附壁的细胞,用无血清完全培养基洗涤2遍,使悬浮细胞完全洗出,将T细胞筛除。
3、第2日,往培养瓶中加入含量为120g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时。
4、第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;其中,这个步骤中,还可以单独加入细胞刺激因子IL-2,浓度控制在20~50μg/ml左右,诱导NK细胞增殖、扩增。
5、第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养。
6、第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养。
7、第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,500g,离心8分钟,再用生理盐水反复洗涤离心管下层沉淀物多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
对比例1
NK细胞的培养工艺,包括如下步骤:
1、第0天,往培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10ml PBS溶液,常温包被所述培养瓶内壁2h,包被结束吸出包被液待用。
2、将含细胞因子的浓度为无血清的RPMI 1640培养基加入到TC175细胞培养瓶中,且培养基的体积为25ml;随后将1×106个/ml的上述制得的外周血单个核细胞转移到培养瓶中,放入培养箱中静置培养3天,该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5%的CO2及相对饱和湿度为100%的CO2;其中,细胞因子中包括:浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度为10ng/ml的IL-15。
3、第3天,往细胞培养瓶中加入50ml含细胞因子的RPMI 1640培养基,进行细胞培养;其中,细胞因子包括含有浓度10ng/ml的IL-15及浓度1000IU/ml的IL-2。
4、第6天,再次往细胞培养瓶中加入120ml含细胞因子的RPMI 1640培养基,继续进行细胞培养;其中,细胞因子包括浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度10ng/ml的IL-15。
5、第8天,将细胞连同培养基质转至两个2000ml规格的细胞培养袋中,同时往细胞培养袋中添加包含浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度10ng/ml的IL-15的RPMI 1640培养基400ml;继续在培养箱中进行细胞培养。
6、第10天,再次往细胞培养袋中添加含浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度10ng/ml的IL-15的RPMI 1640培养基600ml;
7、第12天,停止培养,将培养好的外周血NK细胞用离心管收集,离心处理,去除上层液,并用氯化钠溶液反复离心洗涤3次;最后用定容器收集离心管下层的沉淀物,并往沉淀物中加入10ml的10%的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml,得到外周血NK细胞产品。
三、NK细胞检测
1、NK细胞培养生长曲线图
图1表示外周血NK细胞培养生长曲线图。如图1所示,细胞经过12天的培养增殖后,本发明培养基质能有效提高NK细胞的增殖倍数,培养12天后,使NK细胞数量达到近6.21×109/ml,远大于对比例1中培养NK细胞的数量3.45×109个/ml;如表1所示。
表1 NK细胞扩增数量表(×107cells/ml)
表1中,分别表示实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10及对比例1中,外周血NK细胞在第0、2、3、6、8、10、12天后测得的细胞生长数量;其中,实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10培养的NK细胞数量扩增达到4000~6000倍,对比例1培养的NK细胞扩增数量为250倍左右。相对应而言,在缩短NK细胞培养时间约为5~6天后(正常状态,NK细胞需要培养17~18天),即同期培养12天后,实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10培养的NK细胞数量分别是对比例1培养细胞数量的1.63、1.75、1.87、2.0、2.46倍。这是因为番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素共同刺激NK细胞生长的结果。番茄汁中的番茄红素可以在细胞培养过程中防止保护细胞被氧化,增强细胞壁的韧性,以提升细胞生长,且番茄汁中的维生素E是细胞生长的生物活性物质,在细胞生长代谢过程中起到调节及控制作用;酵母提取物可以促进细胞增殖与分化,对细胞快速生长起到促进作用;Na+离子在细胞生长过程中,维持细胞内外渗透压的平衡,可以起到防止细胞壁破裂;玉米素可以促进细胞快速增殖分裂,以利于细胞快速生长。
2、NK细胞活率检测
将实施例6至10、对比例1的NK细胞进行台盼蓝染色,放入18~25℃下保存4小时后,用细胞计数板进行细胞计数,计算出细胞数和细胞活率,如表2。
表2细胞数和细胞活率表
从表2中可以看出,实施例6至10的NK细胞数量以及细胞活率,远高于对比例1,也就说明采用本发明NK培养基质及培养方法培养的NK细胞扩增比例远高于对比例,尤其是实施例10(其对应的培养基质为实施例5),其细胞活率达到97.9%,已经超出临床应用标准规定的细胞活率(≥90%)。
3、NK细胞杀伤活性测试
取实施例6至10、对比例1培养12天后的NK细胞且细胞数量相同。转至3组离心管组(每组离心管组6支离心管,每组都对应有实施例6至10、对比例1中培养的NK细胞)中,然后采用各自对应的培养液,将3组离心管组分别调整浓度约为1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的细胞悬液,作为3组效应细胞。
K562细胞作为靶细胞,按照效靶比1:1、5:1、10:1、20:1进行靶细胞K562和效应细胞NK细胞进行铺孔,每组3个复孔。NK细胞和K562靶细胞的每个孔分别为500μl。每孔加入500μl实施例6至10、对比例1中各自对应的培养基。
效应细胞NK细胞自然释放组:1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的NK细胞,每孔500μl,每组3个复孔,每孔加入500μl。
K562靶细胞最大释放组:1.0×105/ml的靶细胞,每孔500μl,每组3个复孔,每孔加入500μl培养基,于37℃、5%CO2培养箱中培养40分钟。
K562靶细胞自然释放组:1.0×105/ml的靶细胞,每孔500μl,每组3个复孔,每孔加入500μl。
培养液空白对照试验组:每孔500μl,每组3个复孔,每孔加入500μl。
铺板后,将培养板250g离心4分钟,置于于37℃、5%CO2培养箱中培养4小时。在培养结束后前45分钟,取出培养板,在靶细胞最大释放组加入解冻液,250g离心4分钟,继续培养45分钟取出,之后轻轻混匀细胞,再300g离心5min,收集上清液,用LDH(乳酸脱氢酶)测定492nm波长的吸光度值。
杀伤活性按照如下公式计算:
杀伤活性=(A-B-C)/(D-C)×100%;
其中:
A-表示试验组吸光度值校正值;
B-表示效应细胞自然释放组;
C-表示靶细胞自然释放组;
D-表示靶细胞最大释放组;
测试结果见表3和图2
表3 NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性检测
组别 | 20:1 | 10:1 | 5:1 | 1:1 |
实施例6 | 75.23% | 55.23% | 41.23% | 11.19% |
实施例7 | 77.50% | 59.36% | 35.60% | 18.70% |
实施例8 | 74.91% | 61.12% | 42.06% | 26.38% |
实施例9 | 85.34% | 65.89% | 56.75% | 32.25% |
实施例10 | 94.35% | 85.34% | 72.56% | 41.45% |
对比例1 | 63.21% | 42.13% | 31.86% | 8.92% |
由表3和图2可知,在杀伤K562细胞时,本发明方法诱导培养的NK细胞比对比例1诱导培养的NK细胞的杀伤效果更好,差异较明显,说明采用本发明培养基质和培养方法培养NK细胞,可以增强杀伤肿瘤的活性。尤其是,实施例10(对应实施例5的NK培养基质)培养的NK细胞杀伤活性最强(达到94.35%),在效靶比为20:1条件下,NK细胞的杀伤性活性也是最好的。实施例6至10中NK细胞培养12天后,在杀伤K562细胞时,以效靶比为20:1条件下,其细胞杀伤率介于75.23%~94.35%,远高于临床应用标准大于等于40%。
4、NK细胞免疫表型检测
图3a、3b、3c、3d、3e、3f分别对应实施例6至10、对比例1的NK细胞培养12天后的CD3-CD56+表型检测图。
第12天后,分别取实施例6至10、对比例1培养的NK细胞,制成细胞悬液并调整细胞浓度为1×106个/ml,加入标记的CD3-CD56+单克隆抗体,于室温暗处孵育15分钟,洗去多余抗体,用上流式细胞仪检测,测试结果如图3a、3b、3c、3d、3e、3f所示的NK细胞表型分析图。由图3a、3b、3c、3d、3e说明,实施例6至10培养的NK细胞,培养基中添加的番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素组合使得CD3-CD56+细胞含量高达92.42%,比对比例1的NK细胞在CD3-CD56+的含量(24.42%)高出68%;尤其是为采用实施例5的NK细胞培养基培养的NK细胞使得CD3-CD56+细胞含量最高,即使是采用实施例1的NK细胞培养基培养的NK细胞使得CD3-CD56+细胞含量也达到53.08%,比对比例1的NK细胞在CD3-CD56+的含量(24.42%)高出28.66%。
图中3a、3b、3c、3d、3e还说明,实施例6至10中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例,相对对比例1中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例明显增加,且实施例7至10中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例,分别是63.08%、71.21%、82.87%、92.42%,均已超过临床应用标准(≥60%)。
因此,实施例6至10培养的NK细胞扩增明显,培养基质中的番茄汁、酵母提取物、Na+及玉米素组分对CD3-CD56+细胞有较强的诱导作用。
应当理解的是,上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细,并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制,本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种NK细胞培养基,其特征在于,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:
浓度为70~90%的无血清培养基;
浓度为5~20%的血浆;
浓度为1.2~1.5%的人血白蛋白;
浓度为1.5~2.0%的番茄汁;
浓度为0.5%~5%的酵母提取物;
浓度为0.1μg/ml~10μg/ml的Na+;
浓度为50μg/ml~100μg/ml的玉米素;
浓度为0.6μg/ml~30μg/ml的单抗CD3;
浓度2μg/ml~200μg/ml的IL-2;及
余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的NK细胞培养基,其特征在于,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:
浓度为80%的无血清培养基;
浓度为10%的血浆;
浓度为1.4%的人血白蛋白
浓度为1.7%的番茄汁;
浓度为1%的酵母提取物;
浓度为5μg/ml的Na+;
浓度为80μg/ml的玉米素;
浓度为20μg/ml的单抗CD3;
浓度100μg/ml的IL-2;及
余量为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的NK细胞培养基,其特征在于,还包括浓度为50μg/ml~100μg/ml的环己六醇。
4.根据权利要求2所述的NK细胞培养基,其特征在于,所述环己六醇的浓度为70μg/ml。
5.一种NK细胞的培养方法,其特征在于,包括如下步骤:
采血管采用自体外周血并离心分离,获得单个核细胞;
取经包被处理的培养瓶并加入NK细胞培养基,随后将所述单个核细胞加入所述培养瓶中,此时细胞密度调整为1×106/ml;其中,每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:浓度为70~90%的无血清培养基、浓度为5~20%的血浆、浓度为1.2~1.5%的人血白蛋白、浓度为1.5~2.0%的番茄汁、浓度为0.5%~5%的酵母提取物、浓度为0.1μg/ml~10μg/ml的Na+、浓度为50μg/ml~100μg/ml的玉米素、浓度为0.6μg/ml~30μg/ml的单抗CD3、浓度2μg/ml~200μg/ml的IL-2,余量为蒸馏水;
往培养瓶中加入含量为50~200g/L的活性炭,对单个核细胞进行包被处理24小时;
第3日,对细胞进行离心换液:吸弃细胞悬液,筛除T细胞,剩下附壁细胞,再加入NK培养基,刺激诱导NK细胞增殖;
第6日,计数细胞数量,并更换NK培养基质继续培养;
第7日~11日,将细胞及培养基转移至培养袋中,每隔一天更换NK细胞培养基质后继续细胞培养;
第12日,收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中,离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次,获得高纯度、高活性的NK细胞。
6.根据权利要求5所述的培养方法,其特征在于,所述NK细胞培养基包括:
每100ml的NK细胞培养基中,包括组份:浓度为80%的无血清培养基、浓度为10%的血浆、浓度为1.4%的人血白蛋白、浓度为1.7%的番茄汁、浓度为1%的酵母提取物、浓度为5μg/ml的Na+、浓度为80μg/ml的玉米素、浓度为20μg/ml的单抗CD3、浓度100μg/ml的IL-2,余量为蒸馏水。
7.根据权利要求6所述的培养方法,其特征在于,所述NK培养基中还包括浓度为50μg/ml~100μg/ml的环己六醇。
8.根据权利要求7所述的培养方法,其特征在于,所述NK培养基中还包括浓度为70μg/ml的环己六醇。
9.根据权利要求5所述的培养方法,其特征在于,所述活性炭放入含量为100g/L。
10.根据权利要求5所述的培养方法,其特征在于,所述NK细胞培养是在37℃、5%CO2环境下的培养箱中进行的。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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