CN113564118A - 一种cik细胞培养液及增强cik细胞cd3+cd56+的培养方法 - Google Patents

一种cik细胞培养液及增强cik细胞cd3+cd56+的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CIK细胞培养液及增强CIK细胞CD3+CD56+的培养方法；该方法包括步骤：将外周血单个核细胞加入IFN－2γ细胞因子的培养基中培养16天左右；培养期间，每隔2～3天需要多次添加含rHIL－22、rHIL－21和CD3细胞因子的培养基；培养结束后，经离心处理和生理盐水溶液清洗，得到CIK细胞。该培养方法，IFN－2γ先于rhIL－21加入细胞培养后能够提升细胞毒性，再加入rhIL－21细胞因子，以进一步增强细胞的毒力；后续培养液换液中加入CD3单抗，还可以促进CIK细胞快速增殖。

Description

一种CIK细胞培养液及增强CIK细胞CD3+CD56+的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞学领域，尤其涉及一种增强CIK细胞CD3+CD56+的培养方法。
背景技术
CIK细胞(Cytokine Induced Killer Cell)，是一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是介导细胞毒活性最强的免疫细胞，兼具有T淋巴细胞的高度杀瘤活性和NK细胞非主要组织相兼容复合物(MHC)的限制性杀瘤效应。CIK细胞其具有增殖速度快、杀瘤活性高等优点，具有TIL、LAK细胞无法比拟的优势。
现阶段而言，CIK细胞培养是将分离的外周血血单个核细胞(PBMC)用CD3单克隆抗体、白细胞介素－1(IL－1α)、白细胞介素－2(IL－2)以及γ－干扰素(IFN－γ)等因子进行活化，进一步静态培养或间歇换液的方式扩增，然而这种方式普遍存在激活效率低、细胞生长慢、最终获得的CIK细胞增殖效果差、细胞毒性低，难以满足临床需要。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题之一在于提供一种CIK细胞培养液。本发明所要解决的问题之二在于提供一种增强CIK细胞CD3+CD56+的培养方法。
本发明的技术方案一如下：
一种CIK细胞培养液，包括含浓度10％血清的RPMI－1640培养基，在所述培养基中包含终浓度为500～2000μg/ml的IFN－2γ、终浓度为50～1000μg/ml的rHIL－22、终浓度为10～300μg/ml的rHIL－21及终浓度为10～100ng/ml的CD3。
一较好实施例中，在所述培养基中，包含终浓度为1000μg/ml的IFN－2γ、终浓度为300μg/ml的rHIL－22、终浓度为100μg/ml的rHIL－21及终浓度为50ng/ml的CD3。
本发明所要解决达到问题之二如下：
一种增强CIK细胞CD3+CD56+的培养方法，包括以下步骤：
S1、从外周血中分离出单个核细胞；
S2、第1天，将细胞浓度为0.5×108个/ml的所述单个核细胞加入含终浓度为500～2000μg/ml的IFN－2γ细胞因子的培养基中，制备单个核细胞悬液，并控制细胞浓度为1×106～3×106个/ml进行静置培养；其中，所述培养基为含浓度10％血清的RPMI－1640培养基；
S3、静置培养第2天，添加含终浓度为50～1000μg/ml的rHIL－22、终浓度为10～300μg/ml的rHIL－21和终浓度为10～100ng/ml的CD3细胞因子的培养基；
S4、第4天至16天，每隔2至3天更换含rHIL－21和CD3细胞因子的所述培养基，并控制rHIL－21和CD3细胞因子的终浓度分别为10～300μg/ml的rHIL－21和10～100ng/ml，同时控制细胞浓度为1×106～3×106个/ml；
S5、第16天，细胞培养结束后，将将细胞收集到离心管中进行离心处理后，收集离心获得的细胞并用氯化钠溶液反复洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
较好地，所述培养方法的步骤S2中，所述培养基中，所述IFN－2γ的终浓度为1000μg/ml。
较好地，所述培养方法的所述步骤S3中，所述培养基中，所述rHIL－22的终浓度为300μg/ml、rHIL－21的终浓度为100μg/ml和CD3的终浓度为50ng/ml。
较好地，所述培养方法的所述步骤S4中，所述培养基中，控制所述rHIL－21的终浓度为100μg/ml及所述CD3的终浓度为50ng/ml。
较好地，所述培养方法的所述步骤S3和S4中，所述培养基为RPMI－1640培养基。
较好地，所述培养方法中，步骤S4之后还包括步骤S5：
S5、将获得的CIK细胞中加入体积百分比为10％的人血清白蛋白10ml，并用0.9wt％氯化钠溶液定容至200ml，备用。
本发明对CIK细胞培养时，采用分阶段添加不同的细胞因子，通过细胞因子刺激不同阶段的细胞，实现CIK细胞快速生长、提升其扩增倍数、增强细胞的杀毒性。如，细胞培养第1天，采用含IFN－2γ细胞因子以及培养基；细胞培养第2天，更换的培养液中含有rHIL－22、rHIL－21和CD3细胞因子；细胞培养第4至16天，更换的培养液中只含有rHIL－21和CD3细胞因子。通过实验检测数据可知，培养10天后，细胞会扩增到754倍左右，培养至16天，CIK细胞能够扩增的倍率达到1000倍以上。IFN－2γ先于rhIL－21加入细胞培养后能够提升细胞毒性，再加入rhIL－21细胞因子，以进一步增强细胞的毒力；第2天以后，培养液换液中加入CD3单抗，其可以促进细胞快速增殖；但是，如果IFN－2γ、rHIL－21和CD3等三种细胞因子同时加入后，细胞的毒力就会下降，因此在CIK细胞培养时必须控制好细胞因子加入的先后顺序；这种高倍增殖、高毒力的CIK细胞，可以实现临床应用。
附图说明
图1为本发明中实施例1、2、3、4及对比例1的CIK细胞生长曲线图；
图2为本发明中实施例1、2、3、4及对比例1的CIK细胞扩增倍率曲线图；
图3为本发明中实施例1、2、3、4及对比例1的CIK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；
图4a、4b、4c、4d、4e分别为实施例1、2、3、4及对比例1中CIK培养细胞16天后的CD3+CD56+表型检测图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
CIK细胞，即为细胞因子诱导杀伤细胞，主要表达CD3+CD56+表型，主要是将人体外周血单个核细胞在体外与多种细胞因子共同培养一段时间后获得的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的细胞毒性T淋巴细胞，对肿瘤细胞具有高效的溶解毒性，也是目前国内外最为广泛的免疫治疗技术。因此，对于CIK细胞的培养，也就成为当前热门研究。
CIK细胞培养研究，主要包括三部分：其一是CIK细胞培养液或培养基配方研究；其二是CIK细胞培养工艺研究；其三是CIK细胞冻存技术研究。
本发明中，采用健康人体外周血来培养CIK细胞，具体操作如下：
1、外周血单个核细胞的制备
1.1、抽取健康人外周血50～60ml，将其收集于肝素瓶中，37℃存放。
1.2、在超净台上使用两支50ml离心管(标记1#和2#)分别装入20ml的淋巴分离液。
1.3、按30ml/支外周血用毛玻璃吸管转移至装有淋巴细胞分离液的两支离心管中(注意：外周血需要放在淋巴细胞上层)。
1.4、两支离心管置于离心机中，于20℃、800g下离心15min。
1.5、离心结束后，使用负压器将两支离心管中的血浆尽可能多的吸除，将所得的淋巴细胞层细胞转移至另一只50ml离心管(标记为3#)中。
1.6、按照500ml生理盐水配8万单位庆大霉素的剂量，将160IU/ml的庆大霉素生理盐水溶液加入到50ml的3#离心管中，充分混合均匀后，20℃、1800～2000r/min、离心8分钟，离心结束后，对3#离心管中的细胞沉淀物用生理盐水洗涤2～3次，收集细胞沉淀物，并添加生理盐水补足到50ml刻度，再用10ml移液管吹打均匀后，滴2滴到EP管中，进行计数。
1.8、计数结束，从细胞液中取1×107数目单个核细胞装入到4#离心管中并重悬到50ml；随后将4#离心管进行离心处理，离心力为300g、离心时间为10min，且离心时升8档、降8档；离心结束后，弃去上清，沉淀物沉淀物即为所需的外周血单个核细胞(PBMC)，用多支冻存管收集沉淀物，置于液氮中存储，备用。
2、外周血CIK细胞的培养
2.1、将细胞浓度为细胞浓度为0.5×108个/ml的外周血单个核细胞转至T75培养瓶中，培养瓶中装有含终浓度为500～2000μg/ml的IFN－2γ细胞因子的培养基；此时的培养基质为含有10％自体血清；随后将培养瓶放入培养箱中静置培养1天。
该步骤，培养基质中，IFN－2γ细胞因子的终浓度可以为500～2000μg/ml。培养基质采用含10％自体血清的RPMI－1640培养基，自体血清中含天然促生长因子，可以促进细胞贴壁，利于细胞培养。
较好的，培养基质中，IFN－2γ细胞因子的终浓度可以为800～1500μg/ml，优选IFN－2γ细胞因子的终浓度可以为1000μg/ml
培养箱中静置培养的条件为：环境温度为37℃、体积百分比为含量为5％及相对饱和湿度为100％的CO2。
2.2、细胞静置培养的第2天，需要更换或添加培养基，此时添加的培养基中含终浓度为50～1000μg/ml的rHIL－22、终浓度为10～300μg/ml的rHIL－21和终浓度为10～100ng/ml的CD3细胞因子。
该步骤中，较好地，培养基质采用RPMI－1640培养基，且培养基质中含终浓度为200～400μg/ml的rHIL－22、终浓度为80～200μg/ml的rHIL－21和终浓度为20～80ng/ml的CD3细胞因子；优选，培养基质中含终浓度为300μg/ml的rHIL－22、终浓度为100μg/ml的rHIL－21和终浓度为50ng/ml的CD3细胞因子。
同时，细胞静置培养过程中，细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml范围内。
由于前一步骤中的自体血清已经促使细胞进行贴壁生长了，此步骤中，RPMI－1640培养基中无需再添加自体血清，是为了使促使细胞快速增殖。
2.3、从第4天开始，每隔2至3天更换含rHIL－21和CD3细胞因子的所述培养基，并控制rHIL－21和CD3细胞因子的终浓度分别为10～300μg/ml和10～100ng/ml，同时控制细胞浓度为1×105个/ml～3×105个/ml；培养至第15天后，转入培养袋中，继续细胞培养直至细胞培养结束。
该步骤中，从第4至第16天培养截止，每隔2至3天更换一次无血清RPMI－1640培养基。
较好地，培养基中，控制rHIL－21和CD3细胞因子含终浓度分别为80～200μg/ml和20～80ng/ml；优选，控制rHIL－21和CD3细胞因子终浓度分别为100μg/ml和50ng/ml。
2.4、地面16天，细胞培养结束后，将细胞收集到离心管中进行离心处理后，收集离心获得的细胞并用0.9％生理盐溶液反复洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
此步骤中，细胞培养第30天完成后，将培养袋中CIK细胞及培养液一同转至50ml离心杯中，室温、2500r/min、离心8分钟，离心结束后去除上层液，将细胞集中到2支50ml离心管中使用0.9％生理盐水平衡离心管继续2000r/min、8min离心，去除上清液，并采用0.9％生理盐水溶液对下层的沉淀物进行反复离心洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
2.5、往收集到的CIK细胞中加入10ml浓度为10％的人血清白蛋白，再用0.9％生理盐水定容至200ml，得到外周血CIK细胞；其中，人血清白蛋白可以防止细胞结团，保持细胞活率。
与常规的培养方法相比，本发明对CIK细胞培养时，采用分阶段添加不同的细胞因子，通过不同的细胞因子刺激不同阶段的细胞，实现CIK细胞快速生长、提升其扩增倍数、增强细胞的杀毒性。如，细胞培养第1天，采用含IFN－2γ细胞因子以及培养基；细胞培养第2天，更换的培养液中含有rHIL－22、rHIL－21和CD3细胞因子；细胞培养第5～30天，更换的培养液中只含有rHIL－21细胞因子。通过实验检测数据可知，培养10天后，细胞会扩增到754倍左右，观察培养至16天，CIK细胞能够扩增的峰值出现在第8～15天时，细胞能够扩增的倍率达到1000倍以上。用胸腺嘧啶对培养的CIK细胞进行检测发现，rHIL－22和CD3单抗是促进CIK细胞增殖的重要物质，有利于促进CIK细胞快速增殖，而IFN－2γ与rhIL－21对细胞的增殖基本不起作用；另外，通过毒力检测发现，IFN－2γ先于rhIL－21加入后能够提升细胞毒性，再加入rhIL－21细胞因子，细胞的毒力会进一步增强。但是如果IFN－2γ、rHIL－21和CD3等三种细胞因子同时加入后，细胞的毒力就会下降，因此在CIK细胞培养时必须控制好细胞因子加入的先后顺序。
一、下面通过几个实施例进一步详细描述本发明采用外周血实现CIK细胞扩增的培养
实施例1
从上述液氮中取出细胞浓度为0.5×108个/ml的外周血单核细胞(PBMC)，迅速置于37℃－42℃水浴中，快速摇动使其在1分钟内融化；酒精消毒冻存管外表面，移至生物安全柜中；在生物安全柜内将冻存管中细胞转移到50ml离心管中；1500rpm，离心10min，4℃，升速max，降速max；离心结束，吸去离心管中上清液，细胞沉淀用含10％自体血清的RPMI－1640培养基重悬，计数后调整细胞浓度为1×106个/ml范围内即可，然后接种到T175培养瓶中。
第1天，往培养瓶中添加含10％自体血清的RPMI－1640培养基的体积数为25ml，接着添加IFN－2γ细胞因子，并控制培养基中IFN－2γ细胞因子的终浓度为1000μg/ml；随后将培养瓶放入培养箱中静置培养24小时；该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2。
第2天，往细胞培养瓶中加入100ml RPMI－1640培养基，并添加细胞因子rHIL－22、rHIL－21及CD3单抗；此时控制培养基中铬细胞因子的浓度，使得rHIL－22、rHIL－21及CD3单抗细胞因子的含终浓度分别为300μg/ml、100μg/ml和50ng/ml；计数细胞，细胞浓度控制在2×106个/ml范围内。
第4天至第16天，每隔2至3天加入一次120ml含rHIL－21和CD3细胞因子的RPMI－1640培养基，控制rHIL－21和CD3细胞因子终浓度分别为100μg/ml和50ng/ml，同时控制细胞浓度为2×106个/ml；继续进行细胞培养；待培养至第15天后，转入培养袋中，继续细胞培养直至细胞培养结束。
第16天，细胞培养结束后，将培养袋中CIK细胞及培养液一同转至50ml离心杯中，室温、2500r/min、离心8分钟，离心结束后去除上层液，将细胞集中到2支50ml离心管中使用0.9％生理盐水平衡离心管继续2000r/min、8min离心，去除上清液，并采用氯化钠溶液对下层的沉淀物进行反复离心洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
实施例2
从上述液氮中取出细胞浓度为0.5×108个/ml的外周血单核细胞(PBMC)，迅速置于37℃－42℃水浴中，快速摇动使其在1分钟内融化；酒精消毒冻存管外表面，移至生物安全柜中；在生物安全柜内将一个冻存管中细胞转移到50ml离心管中；1500rpm，离心10min，4℃，升速max，降速max；离心结束，吸去离心管中上清液，细胞沉淀用含10％自体血清的RPMI－1640培养基重悬，计数后调整细胞浓度为1×106个/ml范围内即可，然后接种到T175培养瓶中。
将往培养瓶中添加IFN－2γ细胞因子，并控制培养基中IFN－2γ细胞因子的终浓度为500μg/ml，添含含10％自体血清的RPMI－1640培养基的体积数为25ml；随后将培养瓶放入培养箱中静置培养24小时；该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2。
第2天，往细胞培养瓶中加入50ml RPMI－1640培养基，此时培养基中含终浓度为100μg/ml的rHIL－22、终浓度为80μg/ml的rHIL－21和终浓度为20ng/ml的CD3细胞因子，计数细胞，细胞浓度控制在1×106个/ml范围内。
第4至第16天，每隔2至3天加入一次80ml含rHIL－21和CD3细胞因子的RPMI－1640培养基，控制rHIL－21和CD3细胞因子终浓度分别为80μg/ml和20ng/ml，同时控制细胞浓度为1×106个/ml；培养至第15天后，转入培养袋中，继续细胞培养直至细胞培养结束。
第16天，细胞培养结束后，将培养袋中CIK细胞及培养液一同转至50ml离心杯中，室温、2500r/min、离心8分钟，离心结束后去除上层液，将细胞集中到2支50ml离心管中使用0.9％生理盐水平衡离心管继续2000r/min、8min离心，去除上清液，并采用氯化钠溶液对下层的沉淀物进行反复离心洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
实施例3
从上述液氮中取出细胞浓度为0.5×108个/ml的外周血单核细胞(PBMC)，迅速置于37℃－42℃水浴中，快速摇动使其在1分钟内融化；酒精消毒冻存管外表面，移至生物安全柜中；在生物安全柜内将一个冻存管中细胞转移到50ml离心管中；1500rpm，离心10min，4℃，升速max，降速max；离心结束，吸去离心管中上清液，细胞沉淀用含10％自体血清的RPMI－1640培养基重悬，计数后调整细胞浓度为1×106个/ml范围内即可，然后接种到T175培养瓶中。
将往培养瓶中添加IFN－2γ细胞因子，并控制培养基中IFN－2γ细胞因子的终浓度为1500μg/ml，添加含10％自体血清的RPMI－1640培养基的体积数为25ml；随后将培养瓶放入培养箱中静置培养24小时；该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2。
第2天，往细胞培养瓶中加入150ml RPMI－1640培养基，此时培养基中含终浓度为500μg/ml的rHIL－22、终浓度为300μg/ml的rHIL－21和终浓度为100ng/ml的CD3细胞因子，计数细胞，细胞浓度控制在3×106个/ml范围内。
第4至第16天，每隔2至3天加入一次150ml含rHIL－21和CD3细胞因子的RPMI－1640培养基，控制rHIL－21和CD3细胞因子终浓度分别为300μg/ml和100ng/ml；同时控制细胞浓度为3×106个/ml；培养至第15天后，转入培养袋中，继续细胞培养直至细胞培养结束。
第16天，细胞培养结束后，将培养袋中CIK细胞及培养液一同转至50ml离心杯中，室温、2500r/min、离心8分钟，离心结束后去除上层液，将细胞集中到2支50ml离心管中使用0.9％生理盐水平衡离心管继续2000r/min、8min离心，去除上清液，并采用氯化钠溶液对下层的沉淀物进行反复离心洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
实施例4
从上述液氮中取出细胞浓度为0.5×108个/ml的外周血单核细胞(PBMC)，迅速置于37℃水浴中，快速摇动使其在1分钟内融化；酒精消毒冻存管外表面，移至生物安全柜中；在生物安全柜内将一个冻存管中细胞转移到50ml离心管中；1500rpm，离心10min，4℃，升速max，降速max；离心结束，吸去离心管中上清液，细胞沉淀用含10％自体血清的RPMI－1640培养基重悬，计数后调整细胞浓度为1×106个/ml范围内即可，然后接种到T175培养瓶中。
将往培养瓶中添加rHIL－21和CD3细胞因子，并控制培养基中rHIL－21的终浓度为100μg/ml以及CD3的终浓度为50ng/ml；添加含10％自体血清的RPMI－1640培养基的体积数为25ml；随后将培养瓶放入培养箱中静置培养24小时；该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2。
第2天，往细胞培养瓶中加入100ml RPMI－1640培养基，此时培养基中含终浓度为1000μg/ml的IFN－2γ、终浓度为300μg/ml的rHIL－22、终浓度为100μg/ml的rHIL－21和终浓度为50ng/ml的CD3细胞因子，计数细胞，细胞浓度控制在2×106个/ml范围内。
第4至第16天，每隔2至3天加入一次120ml含IFN－2γ、rHIL－21和CD3细胞因子的RPMI－1640培养基，控制IFN－2γ、rHIL－21和CD3细胞因子终浓度分别为1000μg/ml、100μg/ml和50ng/ml；同时控制细胞浓度为2×106个/ml；培养至第15天后，转入培养袋中，继续细胞培养直至细胞培养结束。
第16天，细胞培养结束后，将培养袋中CIK细胞及培养液一同转至50ml离心杯中，室温、2500r/min、离心8分钟，离心结束后去除上层液，将细胞集中到2支50ml离心管中使用0.9％生理盐水平衡离心管继续2000r/min、8min离心，去除上清液，并采用氯化钠溶液对下层的沉淀物进行反复离心洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
对比例1
从上述液氮中取出细胞浓度为0.5×108个/ml的外周血单核细胞(PBMC)，迅速置于37℃水浴中，快速摇动使其在1分钟内融化；酒精消毒冻存管外表面，移至生物安全柜中；在生物安全柜内将一个冻存管中细胞转移到50ml离心管中；1500rpm，离心10min，4℃，升速max，降速max；离心结束，吸去离心管中上清液，细胞沉淀用含10％自体血清的RPMI－1640培养基重悬，计数后调整细胞浓度为1×106个/ml范围内即可，然后接种到T175培养瓶中。
往培养瓶中加入含10％胎牛血清的RPMI－1640培养基50ml，添加终浓度为1200ng/mlIFN－γ和终浓度分别是1200ng/ml的IL－1β的细胞因子；将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2的培养箱中静置培养24小时。
第2天，往细胞培养瓶中加入IL－2、IL－12、CD3单抗等细胞因子，进行细胞培养；其中，IL－2、IL－12、CD3单抗体蛋白在培养基中的最终浓度分别是1200ng/ml、120ng/ml及200ug/ml。
第4至16天，每3天往细胞培养瓶中加入400ml含IL－2、IL－12、CD3单抗等细胞因子的RPMI－1640培养基，继续进行细胞培养；其中，其中，IL－2、IL－12、CD3单抗体蛋白在培养基中的最终浓度分别是2700ng/ml、1200ng/ml及200ug/ml。
第16天，停止培养，将培养好的外周血CIK细胞用离心管收集，离心处理，去除上层液，并用氯化钠溶液反复离心洗涤3次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并往沉淀物中加入10ml的10％的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml，得到CIK细胞产品。
二、实验测试结果表征
(一)、CIK细胞生长测定
图1表示CIK细胞培养生长曲线图；图1显示，CIK细胞经过16天的培养生长，在第8～16天，CIK细胞能够扩增非常明显，尤其是本发明中，rHIL－22和CD3的共同作用，刺激CIK细胞快速生长；第16天细胞培养结束后，实施例1中，CIK细胞数量达到近10.0×1010/ml，大于对比例1中CIK细胞的数量7.85×1010个/ml；如表1所示。表1中，分别表示实施例1、实施例2、实施例3、实施例4及对比例1中，外周血CIK细胞在第0、2、4、8、10、14、16天后测得的细胞生长数量。由图1和表1表明，rHIL－22和CD3单抗细胞因子是促进了CIK细胞快速生长主要因素。
表1 CIK细胞生长数量表(×108/ml)
Figure BDA0003237778610000121
(二)、外周血CIK细胞增殖数量的测定
分别取实施例1至4、对比例1培养的CIK细胞，用台盼蓝染色后再用细胞计数器进行计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的扩增倍数。用此方法可以动态观察细胞的增殖状况。如图2为外周血CIK细胞扩增倍率曲线。
由图2可知，细胞经过16天的培养增殖后，在CIK细胞生长、增殖过程中，CD3单抗可以CIK细胞的有效增殖倍数，尤其是本发明中，rHIL－22和CD3的共同作用，使CIK细胞扩增倍数达到1000倍，远大于对比例1中CIK细胞扩增倍数684倍，如表2所示。表2中，分别表示实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1中外周血CIK细胞在第1、2、6、8、10、12、16天后测得的扩增倍率值；其中，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4分别为对比例1的1.47倍、1.40倍、132倍和1.52倍。因此，rHIL－22和CD3单抗细胞因子是促进了CIK细胞快速生长主要因素。
表2外周血CIK细胞扩增倍率表
Figure BDA0003237778610000131
(三)、CIK细胞冻存前后的活率检测
将实施例1至4、对比例1的细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率，如表3。
表3细胞数和细胞活率表
Figure BDA0003237778610000132
Figure BDA0003237778610000141
从表3中可以看出，实施例1至4的细胞数量以及细胞活率，远高于对比例1，也就说明采用实施例1至4培养方法培养的CIK细胞扩增比例远高于对比例，尤其是实施例1。
(四)、外周血CIK细胞杀伤活性测试
取实施例1至4、对比例1分别培养16天后的外周血CIK细胞且细胞数量相同，转至4组离心管组(每组离心管组4支离心管，每组都对应有实施例1至4、对比例1中培养的CIK细胞)中；然后采用各自对应的RPMI－1640培养液，将4组离心管组分别调整浓度约为1.0×106/ml、2.0×106/ml、3.0×106/ml、4.0×106/ml的细胞悬液，作为4组效应细胞。
K562细胞作为靶细胞，按照效靶比1：1、5：1、10：1、20：1进行靶细胞K562和效应细胞CIK细胞进行铺孔，每组3个复孔。CIK细胞和K562靶细胞的每隔孔分别为500μl。
效应细胞CIK细胞自然释放组：1.0×106/ml、2.0×106/ml、3.0×106/ml、4.0×106/ml的CIK细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
K562靶细胞最大释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养40分钟。
K562靶细胞自然释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
培养液空白对照试验组：每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
铺板后，将培养板250g离心4分钟，置于于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。在培养结束后前45分钟，取出培养板，在靶细胞最大释放组加入解冻液，250g离心4分钟，继续培养45分钟取出，之后轻轻混匀细胞，再300g离心5min，收集上清液，用LDH(乳酸脱氢酶)测定492nm波长的吸光度值。
杀伤活性按照如下公式计算：
杀伤活性＝(A－B－C)/(D－C)×100％；
其中：
A－表示试验组吸光度值校正值；
B－表示效应细胞自然释放组；
C－表示靶细胞自然释放组；
D－表示靶细胞最大释放组；
测试结果见表4和图3。如图3所示，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1中对应外周血CIK细胞杀伤活性率曲线。
表4CIK细胞对K562靶细胞的杀伤活性检测
组别 20：1 10：1 5：1 1：1
实施例1 133.60％ 72.80％ 68.50％ 41.90％
实施例2 112.50％ 66.70％ 58.60％ 25.70％
实施例3 105.08％ 75.40％ 42.06％ 18.89％
实施例4 42.21％ 29.20％ 18.30％ 3.21％
对比例1 55.58％ 32.22％ 21.64％ 6.93％
由表4和图3可知，在杀伤K562细胞时，本发明方法实施例1至4诱导的CIK细胞比对比例1诱导的CIK细胞的杀伤效果更好，差异较明显，说明采用本发明实施例提供的培养方法培养CIK细胞，可以增强杀伤肿瘤的活性。尤其是，实施例1培养的CIK细胞杀伤活性最强，以及效靶比为20：1组，CIK细胞的杀伤性活性也是最好的。
另外，实施例4相对于实施例1至3而言，实施例4中细胞毒性表现则相对较差。这是因为，CIK细胞培养过程中，由于细胞因子rhIL－21先于IFN－2γ加入培养液且后续细胞培养过程的培养液中，IFN－2γ、rHIL－21和CD3等三种细胞因子又同时加入，会大大降低了CIK细胞的毒性。
(五)、外周血CIK细胞免疫表型检测
第16天后，分别取实施例1至4、对比例1培养的外周血CIK细胞，制成细胞悬液并调整细胞浓度为1×105个/ml，加入标记的CD3+CD56+单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，测试结果如图4a、4b、4c、4d、4e所示的外周血CIK细胞表型分析图。由图4a、4b、4c、4d、4e说明，实施例1至4培养的外周血CIK细胞，培养基中添加时，由于细胞因子IFN－2γ先于rhIL－21加入，可以提升CIK细胞的毒力，使得CD3+CD56+细胞含量高达70.63％(实施例1)；而实施例4中，由于细胞因子rhIL－21先于IFN－2γ加入且IFN－2γ、rHIL－21和CD3等三种细胞因子又同时加入，则大大降低了CIK细胞的毒力，使得CD3+CD56+细胞含量为23.38％，还不到实施例1中的一半，其CD3+CD56+细胞含量低于对比例1(42.86％)。因此，图中4a、4b、4c、4d说明，细胞因子IFN－2γ相对于rhIL－21优先加入培养基后，对CD3+CD56+细胞有较强的诱导作用，也就是说，CIK细胞的毒力会进一步增强。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种CIK细胞培养液，其特征在于，包括含浓度10％血清的RPMI－1640培养基，在所述培养基中包含终浓度为500～2000μg/ml的IFN－2γ、终浓度为50～1000μg/ml的rHIL－22、终浓度为10～300μg/ml的rHIL－21及终浓度为10～100ng/ml的CD3。
2.根据权利要求1所述的CIK细胞培养液，其特征在于，在所述培养基中，包含终浓度为1000μg/ml的IFN－2γ、终浓度为300μg/ml的rHIL－22、终浓度为100μg/ml的rHIL－21及终浓度为50ng/ml的CD3。
3.一种增强CIK细胞CD3+CD56+的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从外周血中分离出单个核细胞；
S2、第1天，将细胞浓度为0.5×108个/ml的所述单个核细胞加入含终浓度为500～2000μg/ml的IFN－2γ细胞因子的培养基中，制备单个核细胞悬液，并控制细胞浓度为1×106～3×106个/ml进行静置培养；其中，所述培养基为含浓度10％血清的RPMI－1640培养基；
S3、静置培养第2天，添加含终浓度为50～1000μg/ml的rHIL－22、终浓度为10～300μg/ml的rHIL－21和终浓度为10～100ng/ml的CD3细胞因子的培养基；
S4、第4天至16天，每隔2至3天更换含rHIL－21和CD3细胞因子的所述培养基，并控制rHIL－21和CD3细胞因子的终浓度分别为10～300μg/ml的rHIL－21和10～100ng/ml，同时控制细胞浓度为1×106～3×106个/ml；
S5、第16天，细胞培养结束后，将将细胞收集到离心管中进行离心处理后，收集离心获得的细胞并用氯化钠溶液反复洗涤2～3次，即得到CIK细胞。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述培养基中，所述IFN－2γ的终浓度为1000μg/ml。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述培养基中，所述rHIL－22的终浓度为300μg/ml、rHIL－21的终浓度为100μg/ml和CD3的终浓度为50ng/ml。
6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述培养基中，所述rHIL－21的终浓度为100μg/ml；所述CD3的终浓度为50ng/ml。
7.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S3和S4中，所述培养基为RPMI－1640培养基。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S5之后还包括步骤S6：
S6、将获得的CIK细胞中加入体积百分比为10％的人血清白蛋白10ml，并用0.9wt％氯化钠溶液定容至200ml，备用。
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