CN107475192B - 一种以记忆干t细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法，其是将健康人的外周血单个核细胞转入anti‑CD3mAb，anti‑CD28McAb，Novonectin预先包被的培养瓶，加入含IL‑1α和IFN‑γ的无血清培养基，再加入多因子组合:VC、NAC、RAPA、IL‑7、IL‑15和IL‑21，之后补充无血清培养基及上述多因子组合；培养12～16天后，即可获得所述以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群。本发明方法细胞因子的联合应用可以对淋巴细胞的扩增产生协同作用，扩增倍数提高了，体外杀伤性和存活时间都明显提高，该方法具有安全性高、成本低廉等优点。

Description

一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效 扩增方法

技术领域

本发明属于细胞生物工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法。

背景技术

记忆干T细胞是一种新发现细胞亚群，这类细胞具有干细胞的特性，即有多向分化潜能，在分化的时候又能维持自我更新，它既有初始T细胞((naive T)的标记，但是在做细胞功能研究时又表现出记忆T细胞的特征。

现有技术为了得到高含量的记忆T细胞常用流式细胞仪分选，这种方法对仪器、实验环境要求都很高，操作复杂，容易产生污染，分选过程对细胞有一定损伤和浪费。

关根晖彬等人的专利将外周血淋巴细胞加入到抗CD3抗体固相化烧瓶中，于含有IL-2的培养液中进行活化培养，以培养中的淋巴细胞群的细胞密度大于一定的阈值为指标、检测到淋巴细胞群中的记忆T细胞的占有率达到了期望的值，收获所述细胞群，进行冷冻保存；对所述冷冻保存细胞进行解冻、培养，加入IL2使其增殖，得到以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群。该方法需要对细胞群进行冷冻保存，然后再进行解冻培养，在冻存细胞和解冻细胞过程中会造成一定的细胞损失，冻存剂会对细胞有一定的伤害，冻存和解冻的这一过程也耗费时间。在对细胞进行解冻培养时需要大量使用IL2这一种单因子进行增殖，很多实验已经证明大剂量单因子应用会产生毒副作用。IL2因子扩增体系培养的T细胞绝大部分分化为终末分化的效应细胞，存活时间短。传统的T细胞扩增培养体系却使得T细胞一部分重要生理功能丢失，如长期植入能力以及免疫系统重建能力。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法，该扩增方法可以提高以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的纯度和杀伤活性，使以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群更适用于临床。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，包括以下步骤：

(1)、用终浓度为1-10μg/ml的anti-CD3mAb，100-500ng/ml的anti-CD28McAb，2-10μg/ml的Novonectin预先包被培养瓶；

(2)、通过梯度离心法，采用淋巴细胞分离液分离健康人的外周血单个核细胞；

(3)、将单个核细胞吸出，使用PBS缓冲液洗涤细胞两至三次，使用台盼蓝进行染色，检测细胞活性并计数；

(4)、将单个核细胞转入步骤(1)包被的培养瓶中，加入含有200-1000IU/ml的IL-1α和200-1000IU/ml的IFN-γ的无血清培养基，使细胞密度达到2×10⁶个/ml，放入培养箱中培养；

(5)、第二天加入维生素C(VC)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、雷帕霉素Rapamycin(RAPA)、StemRegenin-1(SR1)、IL-7(IL-7)、IL-15(IL-15)和IL21(IL-21)，使其终浓度分别为10-100mg/L、1-10mM、50-200nM、0.5-1.0μM、10-100μg/L、10-100μg/L和500-1500μg/L，置于培养箱内继续培养；

(6)、第5天，用无血清培养基将细胞重悬，细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21，使其终浓度分别为10-100mg/L、1-10mM、50-200nM、0.5-1.0μM、10-100μg/L、10-100μg/L和500-1500μg/L，置于培养箱内继续培养；

(7)、第7天或第8天，补加无血清培养基，使得细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21，使其终浓度分别为10-100mg/L、1-10mM、50-200nM、0.5-1.0μM、10-100μg/L、10-100μg/L和500-1500μg/L，置于培养箱内继续培养；

(8)、第11天或第12天，补加无血清培养基，使得细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21，使其终浓度分别为10-100mg/L、1-10mM、50-200nM、0.5-1.0μM、10-100μg/L、10-100μg/L和500-1500μg/L；置于培养箱内继续培养；

(9)、自转入步骤(1)包被的培养瓶中起12～16天后，即可获得所述以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群。

在其中一些实施例中，步骤(5)～(8)中所述维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21的终浓度分别为25～85mg/L、2.5～7.5mM、53～63nM、0.4～0.75μM、25～40μg/L、25～50μg/L和700～1000μg/L。

在其中一些实施例中，步骤(5)～(8)中所述维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21的终浓度分别为85mg/L、0.75mM、63nM、0.75μM、40μg/L、50μg/L和1000μg/L。

在其中一些实施例中，步骤(4)中所述无血清培养基含有1000IU/ml的IL-1α和1000IU/ml的IFN-γ。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述anti-CD3mAb的终浓度为5μg/ml，anti-CD28McAb的终浓度为500ng/ml，Novonectin的终浓度为5μg/ml。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述细胞活性应达到97％以上。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述细胞的个数应在3.2-8×10⁶个/ml。

在其中一些实施例中，步骤(4)～步骤(8)中所述培养箱的条件为：饱和湿度、37℃、5.0％CO₂。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述外周血单个核细胞的分离方法为：将80ml健康人的外周血于400g离心10min，吸取上层血浆，加PBS还原至原体积80ml，混匀；再将该稀释外周血缓慢加在外周血淋巴分离液上，400g室温水平离心25min，在分离液界面出现一层乳白色，即为单个核细胞层。

本发明还提供了上述体外高效扩增方法得到的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群。

本发明的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法主要使用多种因子联合的培养方式，形成鸡尾酒培养体系，其中各因子的作用分别如下：

维生素C(VC)作为一种小分子药物，最早在临床上用于坏血病的治疗，其抗氧化作用被广泛应用。近年来的研究发现，VC在抑制肿瘤生长上发挥了一定的作用，并且可高效地维持干细胞的存活和自我更新。

N-乙酰半胱氨酸(NAC)是细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的前体，它可以直接清除自由基，增加机体抗氧化应激能力，并可减少炎性细胞因子、趋化因子和黏附分子产生。此外，NAC能够调节机体免疫状态和细胞凋亡程序，延长T细胞的存活时间。许多文献和实验结果均显示NAC作为一种含活性巯基抗氧化剂，无毒副作用，具备较高的生物安全性，除医疗用途之外，也广泛应用于细胞系的培养，可有效地维持细胞系的存活。

雷帕霉素Rapamycin(RAPA)是一种mTOR蛋白特异性抑制剂，主要抑制的是蛋白复合体mTORC1，研究显示，mTORC1在成熟细胞毒T细胞分裂生成的两个子细胞中呈不对称分布。其中，mTORC1表达量高的子细胞后来发育成为了效应T细胞，而表达量低的子细胞则将成为记忆T细胞。使用Rapamycin一方面是降低细胞代谢水平，另一方面提高培养体系中记忆T细胞水平。

StemRegenin-1(SR1)SR1是一种嘧啶类衍生物，通过拮抗AHR信号通路调人造血干细胞大量扩增和自我更新。SR1还可以非常高效的促使造血干细胞/祖细胞的体外(exvivo)扩增。而一旦去除了SR1后，细胞则迅速发生分化。可保持多系细胞长期重建能力。

白介素7(IL-7)通过与白介2共用γc受体亚单位，刺激T细胞的存活增殖和维持。可以为

T细胞和中央型记忆T细胞提供持续的刺激信号，并且能够上调抗凋亡蛋白Bcl2的表达。

白细胞介素15(IL-15)通过与白介2共用γc受体亚单位，刺激T细胞的活化与增殖，白介素15的在免疫细胞治疗中的优势在于不会引起活化的T细胞凋亡。IL15在免疫治疗中的另一个特性是维持记忆性T细胞，从而对长期抗肿瘤活性中起到重要作用。

白细胞介素21(IL-21)：通过一个特异性受体亚单位及IL2受体γc亚单位复合受体发挥其生物学功能。IL21的多种生物学效应包括：促进CD⁴⁺和CD⁸⁺T细胞的增殖，增强CD⁸⁺T细胞和NK细胞的细胞毒性而不引起活化产生的细胞凋亡。IL21在于优先扩增CD²⁷⁺CD²⁸⁺的CD⁸⁺T细胞。通常认为这一细胞类群是“年轻”的中心性记忆T细胞，具有更强的细胞毒作用。同时IL21不会引起Treg的扩增。由于IL21体外刺激抗原特异性T细胞产生和提高对抗原亲和力的卓越效果，在免疫细胞治疗中得到越来越广泛的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明基于对记忆干细胞特性的认识，对记忆干T细胞进行体外活化富集培养扩增工序，制造记忆干T细胞占有率高的淋巴细胞群，并且找出了其促进体外扩增的各种因子联合使用的最适浓度，细胞因子的联合应用可以对淋巴细胞的扩增产生协同作用，比使用单一细胞因子诱导细胞的扩增倍数提高了，并且减少了单因子的用量，也减少了因大剂量单因子应用所产生的毒副作用；减少了对细胞冻存，解冻这一环节；

2、采用本发明的方法得到的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群体外杀伤性和存活时间都明显高于现有CIK技术，该方法具有安全性高、成本低廉等优点；

3、本发明获得的淋巴细胞群中的记忆干T细胞具有多向分化潜能，可分化为中央型记忆T细胞和效应型记忆T细胞；中央型记忆T细胞具有归巢至淋巴结、迎击侵入体内的异物和抗原的功能，效应型记忆T细胞具有处于本应所在的部位、捕捉异物和抗原的作用，此外它还具有初始T细胞的特性，因此，本发明所述的以记忆干T细胞群为主要成分的淋巴细胞群可以作为过继免疫治疗，能够期待其比以往被用于过继性免疫疗法等的、中央型记忆T细胞占有率低的淋巴细胞群具有高得多的治疗效果。

附图说明

图1为试验例2中试验组和与常规组的细胞扩增倍数的比较图；

图2为试验例3中试验组和与常规组的淋巴细胞群的纯度比较图；

图3为试验例4中试验组和与常规组的淋巴细胞群的体外杀伤活性比较图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

实施例1一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法

本实施例的一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法包括以下步骤：

(1)、用终浓度为5μg/ml的anti-CD3mAb(PEPROTECH，USA)，浓度为500ng/ml的anti-CD28McAb(PEPROTECH，USA)，5μg/ml的Novonectin(PEPROTECH，USA)预先包被75mm培养瓶；

(2)、采集80ml健康人的外周血，将采集的血样转至离心管；400g，10min离心分离，吸取上层血浆培养时备用；用PBS还原至80ml，混匀；稀释血缓慢加在外周血淋巴分离液上，400g，室温水平离心25min；

(3)、将单个核细胞吸出，使用PBS缓冲液洗涤细胞两次，使用台盼蓝进行染色，检测细胞活性(细胞活性应达到97％以上)并计数(细胞个数应在3.2-8×10⁶个/ml)；

(4)、将单个核细胞转入步骤(1)包被的培养瓶中，加入含有1000IU/ml的IL-1α(PEPROTECH，USA)和1000IU/ml的IFN-γ(PEPROTECH，USA)的无血清培养基，使细胞密度达到2×10⁶个/ml，放入置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱培养；

(5)、第二天加入VC(东北制药集团股份有限公司，中国)、NAC(意大利赞邦集团，意大利)、RAPA(Gene Operation，USA)、SR1(Cayman Chemical，USA)、IL-7(PEPROTECH，USA)、IL-15(PEPROTECH，USA)和IL-21(PEPROTECH，USA)，其终浓度分别为10mg/L、1mM、50nM、0.5μM、10μg/L、10μg/L、500μg/L；

(6)、第5天，仔细观察细胞生长状态，并用无血清培养基将细胞重悬到300ml，由一个75cm²培养扩瓶到2个175cm²培养瓶，150ml/瓶。细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充VC、NAC、RAPA、SR1、IL-7、IL-15和IL-21，其终浓度分别为10mg/L、1mM、50nM、0.5μM、10μg/L、10μg/L、500μg/L；置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱内继续培养；

(7)、第7天或第8天，仔细观察细胞生长状态，根据细胞生长情况，用无血清培养基由2瓶175cm²培养瓶分别转入到2个640cm²培养袋中，1150ml/袋。细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充VC、NAC、RAPA、SR1、IL-7、IL-15和IL-21，其终浓度分别为10mg/L、1mM、50nM、0.5μM、10μg/L、10μg/L、500μg/L；置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱内继续培养；

(8)、第11天或第12天，仔细观察细胞生长状态，补加无血清培养基到2个640cm²培养袋中，最终为1900ml/袋。细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充VC、NAC、RAPA、SR1、IL-7、IL-15和IL-21，其终浓度分别为10mg/L、1mM、50nM、0.5μM、10μg/L、10μg/L、500μg/L；置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱内继续培养；

(9)、自转入步骤(1)包被的培养瓶中起12～16天后，即可获得所述以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群。

实施例2一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法

本实施例的一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法除了步骤(5)～(8)中VC、NAC、RAPA、SR1、IL-7、IL-15和IL-21的终浓度分别为50mg/L、5mM、150nM、0.8μM、50μg/L、50μg/L、1000μg/L外，其他步骤都与实施例1相同。

实施例3一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法

本实施例的一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法除了步骤(5)～(8)中VC、NAC、RAPA、SR1、IL-7、IL-15和IL-21的终浓度分别为100mg/L、10mM、200nM、1μM、25μg/L、25μg/L、700μg/L外，其他步骤都与实施例1相同。

实施例4一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法

本实施例的一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法除了步骤(5)～(8)中VC、NAC、RAPA、SR1、IL-7、IL-15和IL-21的终浓度分别为25mg/L、2.5mM、53nM、0.4μM、25μg/L、25μg/L、700μg/L外，其他步骤都与实施例1相同。

实施例5一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法

本实施例的一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法除了步骤(5)～(8)中VC、NAC、RAPA、SR1、IL-7、IL-15和IL-21的终浓度分别为85mg/L、7.5mM、63nM、0.75μM、40μg/L、40μg/L、1000μg/L外，其他步骤都与实施例1相同。

试验例1对实施例1～5培养的细胞存活性和TSCM细胞比例的检测

细胞存活率的检测

使用台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。吸取培养14天左右的实施例1～5的细胞悬液100μl重悬到0.5ml离心管内，加入100μl台盼蓝染色液(2×)轻轻混匀(碧云天C0011台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒)，吸取少量经过染色的细胞，用血细胞计数板计数，从染色到上机三分钟内完成。判断标准死细胞染成淡蓝色，活细胞拒染，细胞活性检测结果见表1。

表1培养细胞存活率的检测

实施例	存活率
		1	96％
2	94％
		3	93％
4	96％
		5	95％

表1结果表明，实施例1～5的培养方案存活率均达90％以上。

TSCM细胞比例的检测

收集培养14天的实施例1～5的细胞，每管细胞调整约10⁶个，将待检细胞悬液离心2000rpm，3min钟后弃去上清，细胞重悬在100μl PBSbuffer中，加入相应荧光标记抗体(CD3-FITC，CD8-ECD，CD62L-CY5,CD45RO-CY7，CCR7-PE)进行荧光染色，另设同型对照；避光孵育30min；加入1ml PBS buffer,2000rpm离心3min，洗涤3遍；用200μl PBS buffer将细胞重悬，将细胞悬液转移到流式管中，上机分析，CD3+CD8+CD62L+CD45RO+CCR7+的细胞为记忆干T细胞，结果如表2所示。

表2 TSMC细胞比例

实施例	TSCM
		1	26％
2	42％
		3	35％
4	50％
		5	62％

表2结果表明，实施例1的TSCM比例约为26％，实施例2约为42％，实施例3约为49％，实施例4和5的TSCM的比例明显提升到50％以上，其中实施例5都达到了62％。

试验例2本发明的培养方法与常规培养方法的细胞扩增倍数的比较

试验组(本发明培养方法)：实施例5的方法，补充VC,NAC,RAPA,SR1，IL-7，IL-15和IL21等多因子

常规组(常规培养方法)：仅补充IL-2因子

分别在第0、4、8、12、14及16天从两组取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较两组细胞的扩增情况，结果如表3和图1所示

表3增长倍数

从图1和表3结果可知，在培养的第4、8、12、14和16天，两组的淋巴细胞群均在扩增，但是每个时间点试验组的扩增情况均高于常规组，第14天时两组达到扩增最高点，随后试验组细胞仍然呈扩增趋势，但是常规组扩增速度明显速度变缓，第16天呈下降趋势。

试验例3本发明的培养方法与常规培养方法的淋巴细胞群纯度比较

试验组(本发明培养方法)：实施例5的方法，补充VC,NAC,RAPA,SR1，IL-7，IL-15和IL21等多因子

常规组(常规培养方法)：仅补充IL-2因子

收集培养0、4、8、12、14和16天的细胞，每管细胞调整约10⁶个，将待检细胞悬液离心2000rpm，3min钟后弃去上清，细胞重悬在100μl PBS buffer中，加入相应荧光标记抗体(CD3-FITC，CD8-ECD，CD62L-CY5,CD45RO-CY7，CCR7-PE)进行荧光染色，另设同型对照；避光孵育30min；加入1ml PBS buffer,2000rpm离心3min，洗涤3遍；用200μl PBS buffer将细胞重悬，将细胞悬液转移到流式管中，上机分析，CD3+CD8+CD62L+CD45RO+CCR7+的细胞为记忆干T细胞，结果如图2所示。

结果表明：在培养开始时，两组PBMC的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群纯度相似，其后每个时间点试验组的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的纯度均高于对应的常规组(P<0.01)。

试验例4本发明的培养方法与常规培养方法的淋巴细胞群体外杀伤活性比较

试验组(本发明培养方法)：实施例5的方法，补充VC,NAC,RAPA,SR1，IL-7，IL-15和IL21等多因子

常规组(常规培养方法)：仅补充IL-2因子

以处于对数生长期的K562细胞作为靶细胞，将其调整为1×10⁵个/ml,将两种方法培养14天的淋巴细胞群作为效应细胞，按1:1，2:1，5:1，10:1，20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积为200μl，37℃、5％CO₂培养箱中孵育，30h后每孔加入20μl cck-8溶液，在培养箱中继续孵育4小时，用酶标仪检测450nm时的OD值，按以下公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[1-(实验孔OD值-效应孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100％，结果如表4和图3所示。

表4杀伤活性比较

效靶比	1:1	5:1	10:1	20:1
					常规组	10.39±0.20	23.62±0.91	33.28±0.64	48.22±0.61
试验组	23.02±0.73	50.66±1.09	61.98±1.44	89.57±2.23

从结果可知，试验组对肿瘤细胞的杀伤率均高于常规组，差异有统计学意义(*P<0.05)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1).用终浓度为1-10μg/ml的anti-CD3mAb，100-500ng/ml的anti-CD28McAb，2-10μg/ml的Novonectin预先包被培养瓶；

(2).通过梯度离心法，采用淋巴细胞分离液分离健康人的外周血单个核细胞；

(3).将单个核细胞吸出，使用PBS缓冲液洗涤细胞两至三次，使用台盼蓝进行染色，检测细胞活性并计数；

(4).将单个核细胞转入步骤(1)包被的培养瓶中，加入含有200-1000IU/ml的IL-1α和200-1000IU/ml的IFN-γ的无血清培养基，使细胞密度达到2×10⁶个/ml，放入培养箱中培养；

(5).第二天加入维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21，使其终浓度分别为85mg/L、7.5mM、63nM、0.75μM、40μg/L、40μg/L和1000μg/L，置于培养箱内继续培养；

(6).第5天，用无血清培养基将细胞重悬，细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21，使其终浓度分别为85mg/L、7.5mM、63nM、0.75μM、40μg/L、40μg/L和1000μg/L，置于培养箱内继续培养；

(7).第7天或第8天，补加无血清培养基，使得细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21，使其终浓度分别为85mg/L、7.5mM、63nM、0.75μM、40μg/L、40μg/L和1000μg/L，置于培养箱内继续培养；

(8).第11天或第12天，补加无血清培养基，使得细胞密度控制在1.5～2×10⁶/ml，同时补充维生素C、N-乙酰半胱氨酸、雷帕霉素Rapamycin、StemRegenin-1、IL-7、IL-15和IL21，使其终浓度分别为85mg/L、7.5mM、63nM、0.75μM、40μg/L、40μg/L和1000μg/L，置于培养箱内继续培养；

(9).自转入步骤(1)包被的培养瓶中起12～16天后，即可获得所述以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群。

2.根据权利要求1所述的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，其特征在于，步骤(4)中所述无血清培养基含有1000IU/ml的IL-1α和1000IU/ml的IFN-γ。

3.根据权利要求1所述的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，其特征在于，步骤(1)中所述anti-CD3mAb的终浓度为5μg/ml，anti-CD28McAb的终浓度为500ng/ml，Novonectin的终浓度为5μg/ml。

4.根据权利要求1所述的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞活性为97％以上。

5.根据权利要求1所述的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞的个数为3.2-8×10⁶个/ml。

6.根据权利要求1所述的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，其特征在于，步骤(4)～步骤(8)中所述培养箱的条件为：饱和湿度、37℃、5.0％CO₂。

7.根据权利要求1所述的以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，其特征在于，步骤(2)中所述外周血单个核细胞的分离方法为：将80ml健康人的外周血于400g离心10min，吸取上层血浆，加PBS还原至原体积80ml，混匀；再将该稀释外周血缓慢加在外周血淋巴分离液上，400g室温水平离心25min，在分离液界面出现一层乳白色，即为单个核细胞层。

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