CN105821483A - 一种人干性记忆t细胞库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人干性记忆T细胞库的构建方法，包括以下步骤：(1)人外周血的采集；(2)外周血单个核细胞的分离；(3)初始T细胞的分选；(4)干性记忆T细胞的制备；(5)细胞冻存；(6)编码入库。本发明通过采用体外定向诱导的方法，可在短时间内获得足量的干性记忆T细胞(TSCM)并对其进行建库，该方法所需外周血体量小，具有成本低、实验室条件要求不高，操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人外周血免疫细胞库的构建方法，尤其涉及一种人干性记忆T细胞库的构建方法。
背景技术
人外周血中含有多种免疫细胞，其中淋巴细胞是人体主要的免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等，目前临床研究及应用上进行的免疫细胞治疗以T细胞为主，如TCR或CAR-T技术。自体来源的T细胞由于没有免疫原性可直接用于回输进行肿瘤等疾病治疗，同时其具有的记忆性特征在一定程度上还可以抑制疾病的复发。T细胞可从人外周血单个核细胞(PBMC)中分离获得，但由于外周血通常采自肿瘤或病毒感染的患者，体质虚弱，增加了采集的难度，同时其免疫细胞的增殖和抗疾病能力已经大大下降；而且已有研究表明，随着年龄的增长免疫细胞的生理功能也会逐渐下降，因此储存人体健康和年轻时期的免疫细胞，以便在出现疾病的时候进行治疗或年老时进行回输增强免疫力方面意义重大。
近期，在人体内发现一种T细胞亚群，命名为干性记忆T细胞(stemmemoryTcells，TSCM)，该细胞不仅具有很强的存活能力和抗肿瘤功能，而且具有干细胞的特性，能分化为中枢性记忆性T细胞(centralmemoryTcells，TCM)、效应性记忆性T细胞(effectormemoryTcells，TEM)和效应性T细胞(effectorTcells，TE)，保证机体具有持续不断的抗肿瘤和抗感染能力；同时又能进行自我更新，维持体内的TSCM数量。
在表型上，TSCM和初始T细胞具有共同的表型特征CD45RA+、CD45RO-、CCR7+和CD27+，区别是其能高表达CD95和CD122，而其他记忆T细胞亚群也高表达CD95和CD122。在功能上，和其他类型T细胞相比，TSCM过继性回输后在体内的存活更具持久性，可以产生更持续的免疫应答，显示更好的抗肿瘤响应。同时TSCM具有干细胞的特性，在治疗的制备和量的需求上相对于其他细胞会小很多，可以大大缩短制备的时间和体外扩增所需要的费用。因此，TSCM细胞库的建立在免疫治疗中具有巨大的应用前景。
由于TSCM在人循环外周血中所占的比例较低，约占T细胞的2-4％，而即使采用流式细胞术进行分离，大约每250个PBMC细胞才能分离1个CD4+TSCM细胞，而每500-1000个PBMC细胞才能分离1个CD8+TSCM细胞，对于规模化的细胞库构建来说，这种方法显然效率低下，对外周血的需求量大，制备费用昂贵。
因此，如何研发一种对外周血的需求量小、制作成本低并且操作简单的人干性记忆T细胞库的构建方法已成为目前研究的重点。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种人干性记忆T细胞库的构建方法，本发明通过体外定向分化的方法进行TSCM细胞库的构建，所需外周血体量小，具有成本低、实验室条件要求不高，操作简单，应用广等优点，从而推动TSCM细胞库的建设。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种人干性记忆T细胞库的构建方法，该方法包括以下步骤：
(1)人外周血的采集；
(2)外周血单个核细胞的分离；
(3)初始T细胞的分选：采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA和CD45RO的组合或CD45RA、CD45RO和CD95的组合；
(4)干性记忆T细胞的制备；
(5)细胞冻存；
(6)编码入库。
本发明在进行初始T细胞的分选时，采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，其抗体可以采用CD45RA和CD45RO的组合或CD45RA、CD45RO和CD95的组合形式，优选采用CD45RA、CD45RO和CD95的组合。本发明通过采用上述抗体组合形式，尤其是采用CD45RA、CD45RO和CD95的组合，其能够获得纯度更高的靶向细胞，对于细胞的质量控制非常关键。
根据本发明，步骤(1)所述人外周血的采集可以采用如下方法进行：采集外周血前，参与人应签署知情同意书，进行体格检查，需符合国家《血站基本标准》中有关血液采集的规定，利用人工或采血机进行外周血的采集，并将其存放于采血袋中。
根据本发明，步骤(2)所述外周血单个核细胞的分离方法是：将采集的外周血进行分装和离心，取上清液得到自体血浆；分离下层血细胞，将其离心后得到外周血单个核细胞。
优选地，所述外周血的离心是在室温下进行的；离心的转速优选为1500-2000rpm，例如1500rpm、1600rpm、1650rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、1950rpm或2000rpm，离心的时间优选为10-15min，例如10min、10.5min、11min、12min、12.5min、13min、14min或15min。
本发明中，将外周血离心后，取上清液得到自体血浆，通常是将其置于-20℃保存备用。
优选地，所述下层血细胞的分离是采用生理盐水对其进行稀释，将稀释后的血细胞加入淋巴细胞液液面上方进行分离；其中生理盐水与下层血细胞可以按1:1的比例进行配制；另外，还需将稀释后的下层血细胞加入到1-3倍体积的淋巴细胞分离液液面上方进行离心。
优选地，所述下层血细胞的离心是在室温下进行；离心的转速优选为1800-2000rpm，例如1800rpm、1820rpm、1850rpm、1870rpm、1900rpm、1920rpm、1950rpm或2000rpm，离心的时间优选为20-30min，例如20min、20.5min、21min、22min、22.5min、23min、24min、25min、28min、29min或30min。
本发明中，将下层血细胞进行离心后，需将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即是外周血单个核细胞。
示例性地，步骤(2)所述外周血单个核细胞的分离过程具体如下：
将采集的外周血分装到离心管中，1500-2000rpm室温离心10-15min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞加入到1-3倍体积的淋巴细胞分离液液面上方，1800-2000rpm室温离心20-30min，离心后将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即是外周血单个核细胞。
根据本发明，步骤(3)所述抗体CD45RA采用正分选法，CD45RO和CD95采用负分选法。
优选地，步骤(3)所述抗体选用CD45RA、CD45RO和CD95的组合形式，其中，抗体CD45RA采用正分选法，CD45RO和CD95采用负分选法。采用该组合形式的抗体能够最大程度地提高靶向细胞的纯度和质量。
根据本发明，步骤(4)所述干性记忆T细胞的制备方法是：先对初始T细胞进行诱导培养，收集、洗涤诱导培养后的细胞，再对其进行扩增培养。
本发明通过利用初始T细胞进行诱导后扩增，能够使初始T细胞在外周血单个核细胞(PBMC)的含量达到约50％，在较少血液量的条件下，能够诱导扩增出满足建库所需的细胞数量，而且成本相对较低，操作也较为简单。
优选地，所述诱导培养采用诱导培养液对初始T细胞进行悬浮，并调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7-12天。
优选地，所述扩增培养采用扩增培养液进行细胞悬浮，并调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱扩增。
优选地，所述扩增培养还包括当细胞浓度超过2.5-5×106个/mL时进行分流培养。
根据本发明，步骤(4)所述诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3-10μMTWS119、0-20ng/mL的重组人白介素2、20-30ng/mL重组人白介素7和20-30ng/mL重组人白介素15。
优选地，所述诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加10％的血清替代物、2.0mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素，2×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、7μMTWS119、5ng/mL的重组人白介素2、25ng/mL重组人白介素7和25ng/mL重组人白介素15。
本发明中所述诱导培养液对于CD4+和CD8+T细胞类型都能够较好地适用，满足对该类T细胞充分诱导培养的要求。
根据本发明，步骤(4)所述扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、0-15ng/mL的重组人白介素2、3-8ng/mL重组人白介素7和3-8ng/mL重组人白介素15。
优选地，所述扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加15％的血清替代物、2.0mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、5ng/mL重组人白介素7和5ng/mL重组人白介素15。
本发明中所述扩增培养液对于CD4+和CD8+T细胞类型也都能较好地适用，满足对该类T细胞充分扩增培养的要求，并使其在较少血液量的条件下，能够诱导扩增出满足建库所需的细胞数量，而且成本相对较低，操作也较为简单。
根据本发明，步骤(5)所述细胞冻存的方法包括：采用细胞冻存液在-196℃～-165℃的温度下进行冻存，例如在-196℃、-190℃、-185℃、-180℃、-175℃或-165℃的温度下进行冻存。
优选地，所述细胞冻存液由10％DMSO和90％自体血浆组成。
优选地，所述细胞冻存前还包括对细胞数量、细胞无菌性、细胞纯度和细胞身份进行检测和鉴定。
优选地，所述细胞无菌性采用全自动细菌/分枝杆菌培养监测系统进行。
优选地，所述细胞纯度采用鲎试剂法进行。
优选地，所述细胞身份采用流式细胞术进行。
本发明中，当扩增培养的干性记忆T细胞的细胞数量达到1-5×108时，达到冻存要求，此时需对其进行细胞数量与活率的检测，通常是采用全自动细菌/分枝杆菌培养监测系统进行细胞无菌性检测，采用PCR法进行支原体检测，采用鲎试剂法进行细胞纯度检测，采用流式细胞术进行细胞身份鉴定。当检测结果符合要求时，以1-5×107个/mL冻存细胞放置于细胞冻存液中，使细胞最终在-196℃～-165℃温度下长期储存，其中储存的装置可以采用液氮罐，或者采用本领域技术人员熟知的储存装置。
示例性地，步骤(5)所述细胞冻存的方法具体包括如下操作：
当扩增培养的干性记忆T细胞的细胞数量达到1-5×108时，达到冻存要求，进行细胞数量与活率检测，全自动细菌/分枝杆菌培养监测系统进行细胞无菌性检测，PCR法进行支原体检测，鲎试剂法进行细胞纯度检测，流式细胞术进行细胞身份鉴定，当检测结果符合要求时，以1-5×107个/mL冻存细胞，细胞冻存液由10％DMSO和90％自体血浆组成，细胞最终在-196℃～-165℃液氮罐中长期储存。
根据本发明，步骤(6)所述编码入库的方法是：对冻存的细胞进行编码，贴上二维码，并将个人信息、储存位置及编号录入信息系统中，用于检索和管理；
优选地，所述二维码包含区域代码、类型代码、年份、流水号和分管号。
本发明中所述人干性记忆T细胞库的构建方法，其具有所需外周血体量小及费用低等优点主要是针对从外周血中直接提取TSCM而言的，由于TSCM在人循环外周血中所占的比例较低，约占T细胞的2-4％，使用流式细胞术进行分离，大约每250个PBMC细胞才能分离1个CD4+TSCM细胞，而每500-1000个PBMC细胞才能分离1个CD8+TSCM细胞，采用磁珠法分离获得的数量就更低了，就本发明所进行的PBMC分离方法来看，最好的100mL血液能提取大约1×108个PBMC。
而对于细胞库的构建来说，其实针对个人所需要的细胞量是很大的，一般冻存浓度为107个/mL，每管冻存1mL，至少需要冻存10管，所需要的TSCM的数量至少为1×108个，这样的细胞量如果直接从外周血中分离即使CD4+TSCM细胞大约也需要25000mL血液的量，这是不切合实际的；或者人们会考虑首先从100ml提取TSCM后再在体外进行扩增，100mL最大理论来算含CD4+TSCM也只有4×105个，由于其本身在PBMC中含量就低，流式或磁珠法分离的效果并不理想，操作相对也繁琐，同时加大了后续的扩增工作量，所需耗材和人工成本增加，效率低下。而本发明利用初始T细胞进行诱导后扩增，初始细胞在PBMC达到约50％的含量，在较少血液量的条件下，能够诱导扩增出满足建库所需的细胞数量，成本相对较低，操作也较为简单。
示例性地，本发明所述人干性记忆T细胞库的构建方法，具体可以包括以下步骤：
(1)外周血的采集：供体应查体符合献血标准；
(2)外周血单个核细胞的分离：将采集的外周血分装到离心管中，1500-2000rpm室温离心10-15min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞加入到1-3倍体积的淋巴细胞分离液液面上方，1800-2000rpm室温离心20-30min，离心后将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即是外周血单个核细胞；
(3)初始T细胞的分选：采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA、CD45RO和CD95组合，其中CD45RA采用正分选法，CD45RO和CD95采用负分选法；
(4)干性记忆T细胞的制备：用生理盐水或PBS对所得初始T细胞进行洗涤，300-400g室温离心3-5min，并用诱导培养液对细胞进行悬浮，调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7-12天，对细胞进行诱导；收集、洗涤诱导后的细胞，300-400g室温离心3-5min，加入扩增培养液进行细胞悬浮、计数，调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱扩增，当细胞浓度超过2.5-5×106个/mL时进行分流培养；
所述诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3-10μMTWS119、0-20ng/mL的重组人白介素2、20-30ng/mL重组人白介素7和20-30ng/mL重组人白介素15；
所述扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、0-15ng/mL的重组人白介素2、3-8ng/mL重组人白介素7和3-8ng/mL重组人白介素15；
(5)细胞冻存：当扩增培养的干性记忆T细胞的细胞数量达到1-5×108时，达到冻存要求，进行细胞数量与活率检测，全自动细菌/分枝杆菌培养监测系统进行细胞无菌性检测，PCR法进行支原体检测，鲎试剂法进行细胞纯度检测，流式细胞术进行细胞身份鉴定，当检测结果符合要求时，以1-5×107个/mL冻存细胞，细胞冻存液由10％DMSO和90％自体血浆组成，细胞最终在-196℃～-165℃液氮罐中长期储存；
(6)编码入库：对冻存的细胞进行编码，贴上唯一的二维码，二维码包含区域代码、类型代码、年份、流水号和分管号，并将个人信息、储存位置及编号录入信息系统中，用于检索和管理。
与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明通过体外定向分化的方法进行TSCM细胞库的构建，所需外周血体量小，具有成本低、实验室条件要求不高，操作简单，应用广等优点，从而推动TSCM细胞库的建设；
(2)本发明通过采用抗体组合形式，尤其是采用CD45RA、CD45RO和CD95的组合，其能够获得纯度更高的靶向细胞，对于细胞的质量控制非常关键；
(3)本发明通过利用初始T细胞进行诱导后扩增，能够使初始T细胞在外周血单个核细胞(PBMC)的含量达到约50％，在较少血液量的条件下，能够诱导扩增出满足建库所需的细胞数量，而且成本相对较低，操作也较为简单；
(4)本发明中所述诱导培养液和扩增培养液对于CD4+和CD8+T细胞类型都能够较好地适用，满足对该类T细胞充分诱导培养的要求。
附图说明
图1是本发明所述人干性记忆T细胞库的构建方法流程图。
图2是细胞储存参与者健康信息采集表。
图3是入库细胞样本编码示意图。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
图1示出了本发明所述人干性记忆T细胞库的构建方法流程图，其具体流程如下：
(1)人外周血的采集；
(2)单个核细胞的分离；
(3)初始T细胞的分选；
(4)经定向诱导进行干性记忆T细胞的制备；
(5)细胞冻存；
(6)统一编码入库。
图2示出了细胞储存参与者健康信息采集表，其具体采集信息包括：参与者姓名、年龄/出生日期、血型、血常规情况等信息。
图3示出了入库细胞样本编码示意图，其包含区域代码、类型代码、年份、流水号和分管号等信息。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
一种人干性记忆T细胞库的构建方法，其包括以下步骤：
(1)人外周血的采集
细胞储存参与者签署知情同意书，体检结果显示其血常规和乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病、谷丙转氨酶的检测均符合国家《血站基本标准》中有关血液采集的规定；手动采集60mL外周血于含有抗凝剂的采血袋中，4℃保存，并尽快送到细胞制备室。
(2)分离和冻存血浆
在洁净台把采血袋中的血液转移到离心管，使用经灭菌消毒的剪刀剪断塑料管，小心把袋中的外周血倾倒入离心管，1800rpm室温离心12min，离心完毕后吸取上层血浆到新离心管，放置于-20℃保存备用。
(3)分离PBMC
将采集的外周血分装到离心管中，1500rpm室温离心10min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞悬液缓慢匀速地加入到Ficoll-PaqueTM淋巴细胞分离液上方，2000rpm室温离心25min，离心完毕后，离心管内出现分层，小心将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即可获得PBMC。
(4)初始T细胞的分选
采用免疫磁珠法对分离所得PBMC进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA和CD45RO组合，其采用先进行CD45RA正分选，然后对所得细胞再进行CD45RO负分选，所得细胞即为初始T细胞。
(5)TSCM的制备
用生理盐水对所得初始T细胞进行洗涤，400g室温离心4min，并用诱导培养液对细胞进行悬浮，调整细胞终浓度至1×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱培养10天，对细胞进行诱导；收集、洗涤诱导后的细胞，400g室温离心4min，加入扩增培养液进行细胞悬浮、计数，调整细胞终浓度至1×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱扩增，当细胞浓度超过2.5×106个/mL时进行分流培养；
诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加10％的血清替代物、2.0mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素和100μg的链霉素、2×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、7μMTWS119、5ng/mL的重组人白介素2(IL-2)、25ng/mL重组人白介素7(IL-7)和25ng/mL重组人白介素15(IL-15)。
扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加10％的血清替代物、2.0mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素和100μg的链霉素、1×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、0ng/mL的重组人白介素2(IL-2)、5ng/mL重组人白介素7(IL-7)和5ng/mL重组人白介素15(IL-15)。
(6)细胞冻存
当TSCM扩增达到足够数量时进行质量检测，具体操作按相关试剂盒说明书进行，其中细胞活率达到95％以上，无菌、支原体和内毒素检测结果均符合《中国药典》标准，细胞表面抗原流式检测结果为CCR7+、CD62L+、CD95+、CD45RO–，当细胞质量检测合格后，对细胞进行冷冻储存，细胞浓度为107个/mL，细胞冻存液的组成为10％DMSO+90％自体血浆，并最终把细胞转移到-176℃液氮罐中长期储存。
(7)细胞编码入库
冻存入库的细胞按照唯一性原则进行编码，贴上相应的二维码，并将个人信息、编码和保存位置等信息录入系统中进行管理。
实施例2
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(3)，具体操作如下，其它与实施例1相同。
(3)将采集的外周血分装到离心管中，1600rpm室温离心12min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞悬液缓慢匀速地加入到Ficoll-PaqueTM淋巴细胞分离液上方，1800rpm室温离心20min，离心完毕后，离心管内出现分层，小心将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即可获得PBMC。
实施例3
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(3)，具体操作如下，其它与实施例1相同。
(3)将采集的外周血分装到离心管中，1800rpm室温离心14min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞悬液缓慢匀速地加入到Ficoll-PaqueTM淋巴细胞分离液上方，1900rpm室温离心22min，离心完毕后，离心管内出现分层，小心将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即可获得PBMC。
实施例4
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(3)，具体操作如下，其它与实施例1相同。
(3)将采集的外周血分装到离心管中，2000rpm室温离心15min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞悬液缓慢匀速地加入到Ficoll-PaqueTM淋巴细胞分离液上方，2000rpm室温离心30min，离心完毕后，离心管内出现分层，小心将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即可获得PBMC。
实施例5
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(3)，具体操作如下，其它与实施例1相同。
(3)将采集的外周血分装到离心管中，1600rpm室温离心15min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞悬液缓慢匀速地加入到Ficoll-PaqueTM淋巴细胞分离液上方，1950rpm室温离心20min，离心完毕后，离心管内出现分层，小心将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即可获得PBMC。
实施例6
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(4)，具体操作如下，其它与实施例1相同。
(4)初始T细胞的分选：采用免疫磁珠法对分离所得PBMC进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA、CD45RO和CD95组合，其中CD45RA采用正分选法，CD45RO和CD95采用负分选法，所得细胞即为初始T细胞。
实施例7
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(5)，具体操作如下，其它与实施例1相同。
(5)TSCM的制备
用生理盐水对所得初始T细胞进行洗涤，300g室温离心5min，并用诱导培养液对细胞进行悬浮，调整细胞终浓度至1.2×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱培养8天，对细胞进行诱导；收集、洗涤诱导后的细胞，300g室温离心5min，加入扩增培养液进行细胞悬浮、计数，调整细胞终浓度至1.2×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱扩增，当细胞浓度超过3×106个/mL时进行分流培养；其中诱导培养液和扩增培养液组分及其含量同实施例1。
实施例8
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(5)，具体操作如下，其它与实施例1相同。
(5)TSCM的制备
用生理盐水对所得初始T细胞进行洗涤，350g室温离心3min，并用诱导培养液对细胞进行悬浮，调整细胞终浓度至1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7天，对细胞进行诱导；收集、洗涤诱导后的细胞，350g室温离心3min，加入扩增培养液进行细胞悬浮、计数，调整细胞终浓度至1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱扩增，当细胞浓度超过5×106个/mL时进行分流培养；其中诱导培养液和扩增培养液组分及其含量同实施例1。
实施例9
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(5)中用到的诱导培养液，其它与实施例1相同。
诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5％的血清替代物、1.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3μMTWS119、2ng/mL的重组人白介素2、20ng/mL重组人白介素7和30ng/mL重组人白介素15。
实施例10
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(5)中用到的诱导培养液，其它与实施例1相同。
诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加20％的血清替代物、2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、10μMTWS119、20ng/mL的重组人白介素2、25ng/mL重组人白介素7和25ng/mL重组人白介素15。
实施例11
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(5)中用到的扩增培养液，其它与实施例1相同。
扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5％的血清替代物、1.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、2×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、10ng/mL的重组人白介素2、3ng/mL重组人白介素7和3ng/mL重组人白介素15。
实施例12
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(5)中用到的扩增培养液，其它与实施例1相同。
扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加15％的血清替代物、2.2mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、2×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、11ng/mL的重组人白介素2、4ng/mL重组人白介素7和6ng/mL重组人白介素15。
实施例13
与实施例1相比，其区别仅在于步骤(5)中用到的扩增培养液，其它与实施例1相同。
扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加20％的血清替代物、2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、15ng/mL的重组人白介素2、8ng/mL重组人白介素7和8ng/mL重组人白介素15。
通过上述实施例1-13所构建的人干性记忆T细胞库，其能够提高靶细胞，尤其是CD4+和CD8+T细胞的纯度和细胞质量，通过利用初始T细胞进行诱导后扩增，能够使初始T细胞在外周血单个核细胞(PBMC)的含量达到约50％，在较少血液量的条件下，能够诱导扩增出满足建库所需的细胞数量，而且成本相对较低，操作也较为简单，满足了对CD4+和CD8+等类型的T细胞充分诱导培养的要求。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (9)
1.一种人干性记忆T细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人外周血的采集；
(2)外周血单个核细胞的分离；
(3)初始T细胞的分选：采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA和CD45RO的组合或CD45RA、CD45RO和CD95的组合；
(4)干性记忆T细胞的制备；
(5)细胞冻存；
(6)编码入库。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述外周血单个核细胞的分离方法是：将采集的外周血进行分装和离心，取上清液得到自体血浆；分离下层血细胞，将其离心后得到外周血单个核细胞；
优选地，所述外周血的离心是在室温下进行；离心的转速优选为1500-2000rpm，离心的时间优选为10-15min；
优选地，所述下层血细胞的分离是采用生理盐水对其进行稀释，将稀释后的血细胞加入淋巴细胞液液面上方进行分离；
优选地，所述下层血细胞的离心是在室温下进行；离心的转速优选为1800-2000rpm，离心的时间优选为20-30min。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述抗体CD45RA采用正分选法，CD45RO和CD95采用负分选法；
优选地，所述抗体选用CD45RA、CD45RO和CD95的组合。
4.如权利要求1-3之一所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)所述干性记忆T细胞的制备方法是：先对初始T细胞进行诱导培养，收集、洗涤诱导培养后的细胞，再对其进行扩增培养；
优选地，所述诱导培养采用诱导培养液对初始T细胞进行悬浮，调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7-12天；
优选地，所述扩增培养采用扩增培养液进行细胞悬浮，调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱扩增；
优选地，所述扩增培养还包括当细胞浓度超过2.5-5×106个/mL时进行分流培养。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3-10μMTWS119、0-20ng/mL的重组人白介素2、20-30ng/mL重组人白介素7和20-30ng/mL重组人白介素15；
优选地，所述诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加10％的血清替代物、2.0mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素，2×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、7μMTWS119、5ng/mL的重组人白介素2、25ng/mL重组人白介素7和25ng/mL重组人白介素15。
6.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、0-15ng/mL的重组人白介素2、3-8ng/mL重组人白介素7和3-8ng/mL重组人白介素15；
优选地，所述扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加15％的血清替代物、2.0mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、5ng/mL重组人白介素7和5ng/mL重组人白介素15。
7.如权利要求1-6之一所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述细胞冻存的方法包括：采用细胞冻存液在-196℃～-165℃的温度下进行冻存；
优选地，所述细胞冻存液由10％DMSO和90％自体血浆组成；
优选地，所述细胞冻存前还包括对细胞数量、细胞无菌性、细胞纯度和细胞身份进行检测和鉴定；
优选地，所述细胞无菌性采用全自动细菌/分枝杆菌培养监测系统进行；
优选地，所述细胞纯度采用鲎试剂法进行；
优选地，所述细胞身份采用流式细胞术进行。
8.如权利要求1-7之一所述的构建方法，其特征在于，步骤(6)所述编码入库的方法是：对冻存的细胞进行编码，贴上二维码，并将个人信息、储存位置及编号录入信息系统中，用于检索和管理；
优选地，所述二维码包含区域代码、类型代码、年份、流水号和分管号。
9.如权利要求1-8之一所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)外周血的采集：供体应查体符合献血标准；
(2)外周血单个核细胞的分离：将采集的外周血进行分装，1500-2000rpm室温离心10-15min，取上清液得到自体血浆，置于-20℃保存备用；分离自体血浆后，用生理盐水按1:1的比例稀释下层血细胞，将稀释的血细胞加入到1-3倍体积的淋巴细胞分离液液面上方，1800-2000rpm室温离心20-30min，离心后将白膜层转移至另一离心管，收集得到的成分即是外周血单个核细胞；
(3)初始T细胞的分选：采用免疫磁珠法对分离所得外周血单个核细胞进行初始T细胞的分选，抗体选用CD45RA、CD45RO和CD95的组合，其中CD45RA采用正分选法，CD45RO和CD95采用负分选法；
(4)干性记忆T细胞的制备：用生理盐水或PBS对所得初始T细胞进行洗涤，300-400g室温离心3-5min，并用诱导培养液对细胞进行悬浮，调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7-12天，对细胞进行诱导；收集、洗涤诱导后的细胞，300-400g室温离心3-5min，加入扩增培养液进行细胞悬浮、计数，调整细胞终浓度至0.5-1.5×106个/mL，放置于37℃、5％CO2培养箱扩增，当细胞浓度超过2.5-5×106个/mL时进行分流培养；
所述诱导培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3-10μMTWS119、0-20ng/mL的重组人白介素2、20-30ng/mL重组人白介素7和20-30ng/mL重组人白介素15；
所述扩增培养液的组成为：以RPMI1640液体培养基为基础，添加5-20％的血清替代物、1.5-2.5mML-谷氨酰胺、100单位的青霉素、100μg的链霉素、1-4×106个磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、0-15ng/mL的重组人白介素2、3-8ng/mL重组人白介素7和3-8ng/mL重组人白介素15；
(5)细胞冻存：当扩增培养的干性记忆T细胞的细胞数量达到1-5×108时，达到冻存要求，进行细胞数量与活率检测，全自动细菌/分枝杆菌培养监测系统进行细胞无菌性检测，PCR法进行支原体检测，鲎试剂法进行细胞纯度检测，流式细胞术进行细胞身份鉴定，当检测结果符合要求时，以1-5×107个/mL冻存细胞，细胞冻存液由10％DMSO和90％自体血浆组成，细胞最终在-196℃～-165℃液氮罐中长期储存；
(6)编码入库：对冻存的细胞进行编码，贴上唯一的二维码，二维码包含区域代码、类型代码、年份、流水号和分管号，并将个人信息、储存位置及编号录入信息系统中，用于检索和管理。
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