CN103436492A - 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法 - Google Patents

通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103436492A
CN103436492A CN2013103346666A CN201310334666A CN103436492A CN 103436492 A CN103436492 A CN 103436492A CN 2013103346666 A CN2013103346666 A CN 2013103346666A CN 201310334666 A CN201310334666 A CN 201310334666A CN 103436492 A CN103436492 A CN 103436492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
serum
lymphocyte
free medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013103346666A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103436492B (zh
Inventor
邵谊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING YONGTAI IMMUNITY APPLICATION TECHNOLOGY CO., LTD.
Original Assignee
IMMUNOTECH BEIJING Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IMMUNOTECH BEIJING Ltd filed Critical IMMUNOTECH BEIJING Ltd
Priority to CN201310334666.6A priority Critical patent/CN103436492B/zh
Publication of CN103436492A publication Critical patent/CN103436492A/zh
Priority to HK14105496.2A priority patent/HK1192282A1/zh
Priority to PCT/CN2014/083368 priority patent/WO2015014291A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103436492B publication Critical patent/CN103436492B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括：a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。

Description

通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法。
背景技术
过继性细胞免疫治疗是经体外刺激培养淋巴细胞后回输给肿瘤病人，进行肿瘤治疗的方法。自20世纪80年代，细胞因子IL-2对肿瘤的治疗作用被发现，细胞免疫治疗在临床上的应用迅速扩展，人们先后培养出淋巴因子激活的杀伤性细胞（LAK），肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），细胞因子激活的杀伤性细胞（CIK）。2000年，Yamazaki T等人在柳叶刀杂志（The Lancet）报道了体外扩增活化自体淋巴细胞预防肝癌术后肿瘤复发的随机对照临床实验研究。结果表明这种非特异性免疫治疗极大延长了肝癌患者术后无复发生存时间，而且回输细胞量和杀伤性能与疗效有一定相关性，是一种很有前景的肿瘤治疗方法。
在淋巴细胞体外扩增培养中，不同的扩增步骤、不同的培养基以及是否添加血清对于扩增效果具有不同影响，而是否添加血清对提高淋巴细胞的扩增能力和排除临床使用的潜在安全风险至关重要。
本领域需要一种安全、高效、产品稳定性好、适宜于大规模生产的通过无血清培养来扩增活化淋巴细胞的方法。
发明内容
本发明提供一种通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括：
(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；
(b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
(c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
(d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；
(e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和
(f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
在一些实施方案中，本发明的方法中使用的淋巴细胞活化剂是抗CD3抗体。
在一些实施方案中，本发明的方法中步骤(a)-(e)使用相同的无血清培养基。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的无血清培养基含有细胞因子。所述细胞因子可以包括IL-2、IL-7以及INF-γ。本发明的方法使用的培养基中，IL-2的浓度可以是750-1500U/ml，例如1000U/ml；IL-7的浓度可以是1-30U/ml，例如20U/ml；INF-γ的浓度可以是750-1500U/ml，例如1000U/ml。优选地，本发明的方法中使用的无血清培养基是X-VIVO15、TexMACS或IMSF100培养基。更优选地，所使用的无血清培养基为IMSF100培养基。
使用本发明的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增100至1000倍。优选地，其中扩增后的细胞主要为CD8+T细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，CD8+T细胞可>50%。优选地，所扩增的活化淋巴细胞的活力可保持12小时。
附图说明
图1示出扩增活化淋巴细胞的方法流程图。
图2示出扩增的活化淋巴细胞活力时间变化曲线图。
图3示出五种培养基扩增性能比较和统计学分析。
图4示出不同培养基扩增后的细胞表型百分比和统计学分析。
具体实施方式
本发明提供了一种高效扩增活化淋巴细胞的方法，其使用无血清培养基进行培养，安全、高效、产品稳定性好且适宜于大规模生产。
优化的培养/扩增步骤
本发明提供了一种扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；
(b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
(c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
(d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；
(e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和
(f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
上述扩增活化淋巴细胞的方法中，培养基添加的次数和体积以及各步骤的培养时间均进行了优化。本发明的方法使得可以使用基本上一致的条件和步骤对不同患者来源的样品进行扩增。对于大量样品而言，扩增可以同步进行，从而实现规模化生产。
此外，用于扩增的起始细胞原材料一般来自患者外周血，不同性别、年龄和疾病状态的患者会造成培养前细胞差别较大。通过本发明的方法进行扩增后，可获得数量和质量相对一致的细胞，符合统一的质量标准，有利于商业上的应用。
如实施例1所述，对143例患者的淋巴细胞使用本发明的方法扩增，全部获得了高效扩增，扩增倍数为约100-约1000倍，且培养后细胞数量、细胞表型较培养前的变异系数均有明显降低，降低幅度达62～85%(表5)，也即是说使用本发明的方法可获得质量较一致的细胞制品。
淋巴细胞
能够使用本发明的方法进行培养和扩增的淋巴细胞可来自外周血淋巴细胞。待扩增的淋巴细胞也可以是其他生物学样品中存在的淋巴细胞，例如上皮淋巴细胞、肿瘤内浸润淋巴细胞、癌性腹水或胸水中的浸润淋巴细胞等。由于外周血中的淋巴细胞分离简便、分离后淋巴细胞生存率高等原因，因此优选地使用分离自新鲜外周血的淋巴细胞。优选地，本发明的方法中所述“含有淋巴细胞的生物学样品”是指分离的外周血单个核细胞(PBMC)。从外周血分离PBMC的方法为本领域技术人员所熟知。本发明的方法中所使用的初始外周血单个核细胞的量可低至1×107～4×107个细胞，相当于正常人仅约20ml外周血，扩增后却可以获得1×109～12×109以杀伤性T细胞为主的淋巴细胞。较低的初始细胞量避免了对患者的大量采血。
活化淋巴细胞
术语“活化淋巴细胞”是指经特异性抗原或非特异性淋巴细胞刺激剂/分子刺激的淋巴细胞，所述活化淋巴细胞能合成大分子物质(RNA、蛋白质、DNA)及细胞因子。淋巴细胞经活化后进行细胞增殖，并分化为不同功能的子代效应细胞和记忆细胞。
术语“淋巴细胞活化剂”是指能够刺激淋巴细胞活化的试剂/分子。例如，可以使用抗CD3抗体作为淋巴细胞活化剂，该试剂刺激T细胞表面的CD3分子，通过T细胞受体有效活化T淋巴细胞。淋巴细胞有丝分裂原是另一类有效的淋巴细胞活化剂。这类分子快速活化淋巴细胞，其作用不通过T淋巴细胞受体。
合适的淋巴细胞活化剂的实例是抗CD3抗体。在本发明的淋巴细胞扩增方法的一个具体实施方式中，所述淋巴细胞活化剂是包被(固定化)于培养容器表面的抗CD3抗体。使用固定化的抗CD3抗体是优选的，因为其主要活化具有细胞杀伤功能的CD8+T细胞，这特别有利于提高所扩增的淋巴细胞的抗肿瘤活性。固定化抗CD3抗体的方法是已知的，例如固定化可以如下所述进行。
将抗CD3抗体固定化于培养容器时，可将抗CD3抗体以灭菌的磷酸氯化钠缓冲液(PBS)稀释成1-50μg/ml的浓度使用。不足1μg/ml的浓度时，T细胞的增殖倾向于不充分，超过50μg/ml时，T细胞的增殖虽然充分，但没有固定于不溶性载体的、自由的抗CD3抗体倾向于增多。另外，作为稀释液，只要是灭菌的磷酸氯化钠缓冲液等生理溶液即可，不作特别限定，作为保护剂，可加入白蛋白、琼脂糖等。
将稀释的抗CD3抗体无菌地平铺于培养瓶的底面。固定时的反应温度为4-40℃，更优选为4-25℃，最优选为4-10℃。不足4℃时，抗CD3抗体的固定化效率倾向于降低，超过40℃时，抗CD3抗体的活性倾向于降低。固定化时的反应时间为30分钟-24小时，优选1小时至24小时。不足30分钟时，抗CD3抗体的固定化量倾向于降低，超过24小时时，固定时间过长，生产效率倾向于降低。
紧接着上述抗CD3抗体的固定化，除去没被固定的残余的抗CD3抗体稀释液。通过使用磷酸氯化钠缓冲液(PBS)等适当的清洗液清洗没有被固定的抗CD3抗体，使其干燥。干燥方法可以在去除清洗液以后利用4-10℃冷库中的自然干燥、10-40℃的加温干燥、冻干等方法。考虑到抗CD3抗体的活性和稳定性，优选冻干，最优选4-10℃冷库中的自然干燥。如上所述，抗CD3抗体被固定化于培养容器。
本领域技术人员可以了解，在淋巴细胞活化后的扩增步骤中无需再使用淋巴细胞活化剂。例如，任选地，可以在培养步骤(a)、(b)、(c)或(d)之后将培养物转移至不含有淋巴细胞活化剂的培养容器中进行后续培养步骤。
优化的细胞因子
在细胞扩增培养过程中，通常需要在培养基中加入细胞因子以促进细胞的增殖。本发明的方法中对扩增淋巴细胞时使用的细胞因子进行了优化。
在本发明中，细胞因子使用IL-2、IL-7和INF-γ的组合。其中IL-2可以高效率、高专一性地扩增CD8+T细胞，而CD8+T细胞是免疫系统发挥抗肿瘤作用的最重要的细胞成分。而IL-7和INF-γ则额外地促进淋巴细胞增殖，例如，维持记忆细胞的生存能力并减少细胞活化后的死亡，从而达到最好的细胞扩增效果和细胞活性的保持。在本发明的方法使用的培养基中，IL-2的浓度可以是250-3000U/ml，500-2000U/ml，750-1500U/ml，例如1000U/ml；IL-7的浓度可以是1-100U/ml，5-50U/ml，10-30U/ml，例如20U/ml；INF-γ的浓度可以是250-3000U/ml，500-2000U/ml，750-1500U/ml，例如1000U/ml。优选地，使用本发明的方法扩增后的细胞主要为CD8+T细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，CD8+T细胞的比例可>50%。
优化的无血清培养基
本领域常用的细胞培养基如RPMI-1640或DMEM等在培养细胞时必须添加胎牛血清或者人血清。然而添加血清将带来一些问题，例如引入血清来源病源体污染，不同批次血清间可能存在的差异，免疫排斥风险等等。
本领域已开发了一些无血清细胞培养系统。然而，这些无血清培养系统在淋巴细胞培养过程中不能实现高效扩增，不能满足临床对治疗用细胞数量和活性的要求，并且所获得的细胞在短期内就失去活性。
本发明针对已有的无血清细胞培养方法进行了改进，筛选出适于扩增淋巴细胞的无血清培养基，并且结合上面描述的优化的细胞因子组合以及优化的培养步骤，避免了上述问题。适于在本发明的方法中使用的无血清培养基包括X-VIVO15(Lonza)、TexMACS（Miltenyi Biotech）或IMSF100（LYMMUNOTECH）培养基。最优选的无血清培养基为IMSF100培养基。
本发明的方法的一个优点是淋巴细胞培养过程中可以使用相同的培养基(包含相同的优化细胞因子组合)，无需在培养中进行变化，这简化了培养步骤，便于大规模操作，有利于商业上应用。
与本领域其它无血清培养方法相比，本发明的方法具有稳定的细胞培养效率，可以达到或超过添加动物血清的培养体系的扩增效力，获得的细胞活性稳定，具有较长的有效期。使用本发明的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增至少10倍，优选至少100倍，更优选至少1000倍。使用本发明的方法所扩增的活化淋巴细胞的活力可保持至少4小时，优选至少8小时，更优选至少12小时。
免疫治疗方法和药物组合物
本发明还提供了一种免疫治疗方法，包括给个体施用通过本发明方法而获得的活化淋巴细胞。
在本发明的免疫治疗方法的一个实施方式中，通过上述扩增方法所获得的淋巴细胞是自体淋巴细胞，且所述免疫治疗方法包括以下步骤：
(i)从个体获得含有淋巴细胞的生物学样品；
(ii)采用本发明的方法扩增所述淋巴细胞，由此获得扩增的活化淋巴细胞；和
(iii)将所述扩增的活化淋巴细胞回输给所述个体。
在本发明的免疫治疗方法中，使用的淋巴细胞来源于病人自身的少量外周血。这些淋巴细胞在短时间内可以活化扩增达100-1000倍，再回输于病人体内。
本发明的方法获得的活化细胞大部分是CD8+T淋巴细胞(>50%)。CD8+T淋巴细胞在杀伤病毒感染的细胞和癌症细胞中发挥重要的功能。人体内T淋巴细胞包括许多针对不同抗原的特异性细胞。这些细胞经过培养后，会针对不同的肿瘤抗原/病毒抗原具有广泛的识别和杀伤效果。本发明的免疫治疗方法可用于治疗患有例如肿瘤、感染性疾病、先天性或后天性免疫缺陷症、以及器官移植后感染性疾病及感染诱发的肿瘤的个体。
可使用本发明的免疫治疗方法进行治疗的肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、贲门癌、结肠癌、乳腺癌、髓母细胞瘤、胃癌、肾癌、和恶性黑色素瘤，且患有肿瘤的个体可以是正在接受放疗和/或化疗的个体。
本发明还提供一种免疫治疗的药物组合物，其包括通过本发明方法而获得的活化淋巴细胞。
本发明的各种优势
总而言之，本发明所提供的扩增活化淋巴细胞的方法相对于现有技术具有以下优势：
1.使用无血清培养基进行培养
本发明的方法可以使用无血清培养基进行，无血清培养避免了使用血清可能导致的病源微生物污染及其它对细胞生长的不利因素，也避免了可能带来的安全性因素。
2.细胞扩增效率高，不需要使用血细胞单采机
通过本发明的方法在体外高效活化和扩增患者自身的T淋巴细胞，从1×107～4×107外周血单个核细胞开始，可以获得1×109～12×109活化扩增的以杀伤性T细胞为主的淋巴细胞，这种约100～约1000倍以上高效扩增，避免了传统免疫细胞治疗需要使用单采机采取大量起始外周血单个核细胞对患者整体免疫细胞系统的破坏作用。
3.细胞产品活性高、稳定性好
传统非特异性细胞培养后，细胞活性一般保持在2小时左右。而本发明的方法产生的细胞活性和稳定性好，细胞可保存12个小时而不影响其治疗效果。
4.可以实现规范化、系统化生产
本发明的方法操作简单、步骤统一、出错风险小，特别适宜于大规模系统生产。
5.细胞产品可符合统一质量标准
经过本发明的方法进行扩增后可获得数量和质量相对一致的淋巴细胞，符合统一的质量标准，有利于商业应用。
实施例
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
实施例1：143例患者的活化淋巴细胞扩增
⑴采集了共计143例患者的外周血，不同性别、年龄和肿瘤类型均有分布。患者基本信息见下表1、2和3。
表1：患者性别
性别 男
男 75
女 68
合计 143
表2：患者年龄
年龄 人数
2～10 16
11～20 11
21～40 11
41～60 55
61～82 50
合计 143
表3：患者肿瘤类型
肿瘤类型 人数
血液肿瘤 35
消化道肿瘤 39
肉瘤 3
肝胆肿瘤 21
呼吸系统肿瘤 22
妇科肿瘤 12
乳腺癌 4
泌尿系统肿瘤 2
其他 5
合计 143
⑵分离外周血单个核细胞(PBMC)并接种培养：
将所收集的外周血(18-100ml，取决于不同患者)放入一新250mL离心管，加入与血样等体积的注射用生理盐水，混匀后缓慢加到已分装好每管15ml Ficoll(美国GE公司，货号17-5442-03)的50mL离心管中,931×g离心20min。吸取界面间细胞层到一新50mL离心管，1:1加入注射用生理盐水，混匀，600×g离心10min。倾去上清，用50mL注射用生理盐水重悬，335×g离心10min。倾去上清，加5mL注射用生理盐水重悬，混匀后取10μL细胞悬液进行细胞计数。然后补充注射用生理盐水至50mL，223×g离心10min。倾去上清，用50mL无血清细胞培养基IMSF100重悬细胞后接种到已包被抗人CD3抗体的T225培养瓶中，并将其放入细胞培养箱开始培养。
⑶第一次添加无血清细胞培养基：
接种后培养3天，从培养箱取出细胞培养瓶，量取无血清细胞培养基IMSF100(含IL-21000U/ml，IL-720U/ml，INF-γ1000U/ml)50mL倾入细胞培养瓶，将其放回细胞培养箱进行培养。该第一次添加步骤可后延不超过三天进行，例如最迟在接种培养后第6天进行。
⑷第二次添加无血清细胞培养基：
第一次添加后再培养1天，从培养箱取出细胞培养瓶，量取无血清细胞培养基IMSF100(含IL-21000U/ml，IL-720U/ml，INF-γ1000U/ml)140mL倾入细胞培养瓶，将其放回细胞培养箱进行培养。该第二次添加步骤可后延不超过两天进行，例如最迟在第一次添加后第3天进行。
⑸第三次添加无血清细胞培养基并转入细胞培养袋：
第二次添加后再培养1天，从培养箱取出细胞培养瓶，拍打瓶壁使细胞完全从瓶底脱落，取样进行细胞计数。对细胞密度不低于1×106/mL（含）的样品进行以下操作：通过60mL注射器套筒将培养瓶中细胞悬液和750mL无血清细胞培养基IMSF100(含IL-21000U/ml，IL-720U/ml，INF-γ1000U/ml)全部倒入一新细胞培养袋中，封闭管口，抽取样品进行无菌检查。将细胞培养袋放回培养箱中进行培养。该第三次添加步骤可后延不超过两天进行，例如最迟在第二次添加后第3天进行。
⑹第四次添加无血清细胞培养基并均分为两袋：
第三次添加后再培养4天，取一新细胞培养袋至生物安全柜，通过60mL注射器套筒倒入1000mL或1250mL无血清细胞培养基IMSF100(含IL-21000U/ml，IL-720U/ml，INF-γ1000U/ml)（袋A），封闭管口。从培养箱取出含有培养中细胞的细胞培养袋（袋B），通过无菌接合机将两袋连通，首先使袋A中液体全部流入袋B中，混匀后再返回1000mL至袋A，两袋中液体量均为1000mL。封死管口，抽取样品进行无菌检查。将两袋细胞放回培养箱中进行培养。该第四次添加步骤可后延不超过两天进行，例如最迟在第三次添加后第6天进行。
⑺纯化浓缩收集细胞：
第四次添加后再培养4天，从培养箱中取出一袋细胞至生物安全柜，将细胞悬液均分到4个250mL离心管中，931×g离心5分钟。倾去上清，并振开沉淀。再从培养箱中取出同一批次另一袋细胞，将细胞悬液均分到同样的4个250mL离心管中，931×g离心5分钟。倾去上清并振开沉淀。将四管细胞合并至两管，再分别补充注射用生理盐水至250mL，931×g离心5分钟。倾去上清并振开沉淀，然后用200mL注射用生理盐水将两个管中细胞分三次冲洗，合并到一个管中，混匀后取样进行细胞计数。931×g离心5分钟，倾去上清后用含有1%人血白蛋白的注射用生理盐水重悬细胞。再将细胞悬液转入一次性塑料转输袋制成细胞制品。该收获步骤可后延不超过两天进行，例如最迟在第四次添加后第6天进行。
扩增结果列于下表4中并总结于表5。
Figure BDA00003612791100121
Figure BDA00003612791100131
Figure BDA00003612791100141
Figure BDA00003612791100151
表5：培养前后细胞差异比较
Figure BDA00003612791100161
从上述结果可以看出，全部143例患者的淋巴细胞使用本发明的方法都获得了高效扩增。且培养后细胞数量、细胞表型较培养前的变异系数均有明显降低，降低幅度达62～85%，也即使用本发明的方法可获得质量较一致的细胞产品。
实施例2：扩增的活化淋巴细胞的稳定性分析
将三个批次按本发明的方法扩增的活化淋巴细胞产品均分为两个平行组，一组保存于2-8℃，一组保存于室温（15-25℃），每4小时检测细胞活性(台盼蓝染色并在显微镜下活细胞计数)，绘制细胞活性时间变化曲线。结果示于下表6和图2。
由上可见，根据本发明的方法扩增的活化淋巴细胞保存于两种温度条件下，细胞活性变化没有显著性差异（p＞0.05），12h内均可保持在85%以上，符合回输人体的要求。
表6
Figure BDA00003612791100162
A组样品保存于2-8℃，B组样品保存于室温。“A-1、2、3”分别表示三个批次细胞产品。
实施例3：无血清培养基的优化
体外比较研究国内市场五种常用品牌培养基X-VIVO15(Lonza)、AIM-V（GIBCO）、TexMACS（Miltenyi Biotech）和IMSF100（LYMMUNOTECH），以及文献（Hoyle,C.,et al.,Blood,1998.92(9):p.3318-27.）报导使用的常用细胞培养基RPMI-1640（GIBCO）在本发明培养方法中的性能参数。
收集了3个正常人的外周血并分离单个核细胞。分成五组（RPMI-1640含10%胎牛血清、X-VIVO15、TexMACS、AIM-V和IMSF100），接种相同数量细胞，采用本发明中的培养步骤进行培养。
1.外周血单个核细胞的分离
采集3个正常人外周血（120ml/人），无菌条件下，使用密度梯度离心法（Ficoll法），获取外周血单个核细胞(PBMC)。将每个人的细胞均分为5等分，分别用50ml的五种培养基（均含细胞因子IL-21000U/ml，IL-720U/ml，INF-γ1000U/ml，见下表7）重悬后接种到已包被CD3+抗体的LC-AC T225细胞培养瓶中，接种细胞数量范围为≥1.2×107/瓶，各组起始接种细胞数相同。
表7
Figure BDA00003612791100171
2.扩增活化淋巴细胞
将15个细胞培养瓶放入细胞培养箱内培养（37℃，7.5%CO2）。
培养72h后取出培养瓶，镜下观察细胞生长情况，给每个细胞培养瓶中补充50ml相应组分培养基。
培养96h后取出培养瓶，镜下观察细胞生长情况，给每个细胞培养瓶中补充140ml相应组分培养基。
培养6天后取出培养瓶，镜下观察细胞生长情况。如细胞密度符合要求（0.9×106-1.4×106/ml）进行装袋培养。
培养10天后，观察培基颜色和细胞状态，进行分袋培养。
培养14天后，观察袋中培基颜色和细胞状态。分别收获每组样品每个人的细胞，并取出适量细胞样品进行细胞计数和活性检测以及细胞表型检测。
3.扩增的活化淋巴细胞的生物学行为观察
使用细胞计数板对细胞进行计数以测定扩增比例。通过台盼蓝染色以及细胞计数获得扩增的细胞活率。扩增的细胞的表型检测使用FITC标记的CD3抗体、PerCP-Cy5.5标记的CD4抗体、APC标记的CD8抗体通过流式细胞术测定。
4.统计学方法
五组间数据比较采用t检验，两组曲线间数据比较采用two way ANOVA进行分析。
结果：
细胞计数检测结果见下表8。其中使用无血清培养基AIM-V组在培养5～6天后细胞逐渐死亡。由此可见，AIM-V培养基无法用于本发明的细胞培养体系。
表8：细胞计数检测结果
Figure BDA00003612791100181
细胞扩增情况分析结果见于图3。由图3可以看出，培养14天后，无血清细胞培养基IMSF100组细胞扩增能力明显优于其它各组，p<0.001或p<0.05，均具有统计学意义。
下表9示出细胞活率检测结果。培养14天后，细胞活率无显著性差异。
表9：细胞活率检测结果
Figure BDA00003612791100191
培养前后细胞表型的比较结果见于表10。培养前，不同培养基使用相同细胞，表型百分比相同。培养后不同培养基的细胞表型百分比见图4，其中表格显示不同培养基之间显著性差异的P值。IMSF100培养的细胞，其CD3+细胞百分比与RPMI1640和TexMACS相比均有显著性差异。
表10：培养前后细胞表型的比较
Figure BDA00003612791100192
结论：
从以上试验结果可以看出，在四种无血清培养基中无血清细胞培养基AIM-V无法用于扩增活化淋巴细胞培养，IMSF100对扩增活化淋巴细胞培养的作用最佳。

Claims (12)

1.一种通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括：
a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；
b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；
d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；
e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和
f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述淋巴细胞活化剂是抗CD3抗体。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)-(e)中使用相同的无血清培养基。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述无血清培养基还含有细胞因子。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞因子包括IL-2、IL-7以及INF-γ。
6.权利要求5的方法，其中所述无血清培养基中IL-2的浓度是750-1500U/ml，优选1000U/ml。
7.权利要求5的方法，其中所述无血清培养基中IL-7的浓度是10-30U/ml，优选20U/ml。
8.权利要求5的方法，其中所述无血清培养基中INF-γ的浓度是750-1500U/ml，优选1000U/ml。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述无血清培养基选自X-VIVO15、TexMACS和IMSF100培养基。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述淋巴细胞被扩增100-1000倍。
11.权利要求1-9任一项的方法，其中被扩增后的淋巴细胞主要是CD8+T细胞。
12.权利要求1-9任一项的方法，其中所获得的扩增的活化淋巴细胞的活力可以保持至少12小时。
CN201310334666.6A 2013-08-02 2013-08-02 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法 Active CN103436492B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310334666.6A CN103436492B (zh) 2013-08-02 2013-08-02 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法
HK14105496.2A HK1192282A1 (zh) 2013-08-02 2014-06-11 通過無血清培養擴增活化淋巴細胞的方法
PCT/CN2014/083368 WO2015014291A1 (zh) 2013-08-02 2014-07-31 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310334666.6A CN103436492B (zh) 2013-08-02 2013-08-02 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103436492A true CN103436492A (zh) 2013-12-11
CN103436492B CN103436492B (zh) 2016-03-02

Family

ID=49690210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310334666.6A Active CN103436492B (zh) 2013-08-02 2013-08-02 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN103436492B (zh)
HK (1) HK1192282A1 (zh)
WO (1) WO2015014291A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107208061A (zh) * 2014-12-05 2017-09-26 伦敦国王学院 γδ T细胞扩增方法
CN112662625A (zh) * 2021-01-18 2021-04-16 杭州原生生物科技有限公司 一种t细胞培养基及其用于t细胞的扩增培养方法
CN114984048A (zh) * 2022-06-16 2022-09-02 浙江百越生物技术有限公司 一种预防与治疗老年人行动迟缓的细胞疗法
CN116355846A (zh) * 2021-12-28 2023-06-30 北京永泰生物制品有限公司 一种质量稳定可控的扩增活化淋巴细胞的方法及其用于防治神经科疾病中的用途
CN116355845A (zh) * 2021-12-28 2023-06-30 北京永泰生物制品有限公司 一种质量稳定可控的扩增活化淋巴细胞的方法及其用于抗肿瘤用途
CN117965445A (zh) * 2024-04-02 2024-05-03 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 一种用于细胞培养的组合物

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112251407A (zh) * 2020-11-03 2021-01-22 广州康琪莱精准医疗科技有限公司 一种脐带血cik细胞的扩增培养方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1990044A (zh) * 2005-12-30 2007-07-04 上海中科英达生物技术有限公司 人体免疫活性细胞dccik抗肿瘤细胞制剂的制备方法及应用
CN101063108A (zh) * 2007-04-25 2007-10-31 哈尔滨医科大学 一种高增殖力、高细胞毒活性cik细胞的制备方法
WO2011103882A1 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 Ingo Schmidt-Wolf Method for the generation of a cik cell and nk cell population
CN102352342A (zh) * 2011-09-30 2012-02-15 上海柯莱逊生物技术有限公司 一种用于扩增cik的方法及一种cik细胞制剂
CN102517213A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 辽宁迈迪生物科技有限公司 用于t淋巴细胞的体外培养试剂盒
CN103013914A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 吉林省拓华生物科技有限公司 体外培养杀伤性t细胞的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2553133T3 (es) * 2004-06-04 2015-12-04 Cel-Sci Corporation Método de modificación de la proporción de CD4/CD8 y del infiltrado celular mononuclear en un tumor
US8211425B2 (en) * 2005-12-21 2012-07-03 Sentoclone International Ab Method for treating disseminated cancer
CN101418283A (zh) * 2007-10-23 2009-04-29 范云峰 一种简单高效地制备cik细胞的方法
CN101386840A (zh) * 2008-10-31 2009-03-18 江苏省人民医院 Cd3-cd56+nk细胞高效扩增培养系统的构建方法
CN102174469B (zh) * 2011-01-26 2012-11-21 宋鑫 一种有效培养肿瘤浸润淋巴细胞的方法
CN102827808B (zh) * 2012-09-27 2014-06-18 高岱清 一种制备cik细胞的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1990044A (zh) * 2005-12-30 2007-07-04 上海中科英达生物技术有限公司 人体免疫活性细胞dccik抗肿瘤细胞制剂的制备方法及应用
CN101063108A (zh) * 2007-04-25 2007-10-31 哈尔滨医科大学 一种高增殖力、高细胞毒活性cik细胞的制备方法
WO2011103882A1 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 Ingo Schmidt-Wolf Method for the generation of a cik cell and nk cell population
CN102352342A (zh) * 2011-09-30 2012-02-15 上海柯莱逊生物技术有限公司 一种用于扩增cik的方法及一种cik细胞制剂
CN102517213A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 辽宁迈迪生物科技有限公司 用于t淋巴细胞的体外培养试剂盒
CN103013914A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 吉林省拓华生物科技有限公司 体外培养杀伤性t细胞的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
罗海华等: "人类CD8+记忆T细胞体外体外扩增方法的研究", 《中国病理生理杂志》, 15 July 2013 (2013-07-15) *
许云云等: "IL-7对胸腺T细胞及树突状细胞体外分化发育的影响", 《中国免疫性杂志》, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 108 - 112 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107208061A (zh) * 2014-12-05 2017-09-26 伦敦国王学院 γδ T细胞扩增方法
CN112662625A (zh) * 2021-01-18 2021-04-16 杭州原生生物科技有限公司 一种t细胞培养基及其用于t细胞的扩增培养方法
CN116355846A (zh) * 2021-12-28 2023-06-30 北京永泰生物制品有限公司 一种质量稳定可控的扩增活化淋巴细胞的方法及其用于防治神经科疾病中的用途
CN116355845A (zh) * 2021-12-28 2023-06-30 北京永泰生物制品有限公司 一种质量稳定可控的扩增活化淋巴细胞的方法及其用于抗肿瘤用途
WO2023125704A1 (zh) * 2021-12-28 2023-07-06 北京永泰生物制品有限公司 一种质量稳定可控的扩增活化淋巴细胞的方法及其用于防治神经科疾病中的用途
WO2023125696A3 (zh) * 2021-12-28 2023-08-24 北京永泰生物制品有限公司 一种质量稳定可控的扩增活化淋巴细胞的方法及其用于抗肿瘤用途
CN116355845B (zh) * 2021-12-28 2024-03-26 北京永泰生物制品有限公司 一种质量稳定可控的扩增活化淋巴细胞的方法及其用于抗肿瘤用途
CN114984048A (zh) * 2022-06-16 2022-09-02 浙江百越生物技术有限公司 一种预防与治疗老年人行动迟缓的细胞疗法
CN117965445A (zh) * 2024-04-02 2024-05-03 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 一种用于细胞培养的组合物

Also Published As

Publication number Publication date
HK1192282A1 (zh) 2014-08-15
CN103436492B (zh) 2016-03-02
WO2015014291A1 (zh) 2015-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103436492B (zh) 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法
CN107326008B (zh) 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法
CN101302491B (zh) 高效扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统
CN104357390B (zh) 同时扩增cd3+cd56+cik细胞和cd3‑cd56+nk细胞的方法
CN103849599B (zh) 一种高效扩增自体nk细胞的培养基及培养方法
CN102618498B (zh) Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法
CN102676454B (zh) 一种脐带血来源的cik细胞的制备方法
CN106434554A (zh) Nk细胞的制备方法
CN104938477A (zh) 一种cik细胞冻存液及冻存方法
CN106591231B (zh) 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用
CN106148282A (zh) 一种自然杀伤细胞的培养方法
CN103301449A (zh) 一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法及其应用
CN104039333B (zh) 移植物抗宿主疾病的治疗或预防方法
CN106754704B (zh) 免疫细胞体外诱导扩增的方法
CN1990044A (zh) 人体免疫活性细胞dccik抗肿瘤细胞制剂的制备方法及应用
CN105296421B (zh) 一种双特异性抗体活化的t细胞及制备方法与应用
CN102719400B (zh) Hla-a0201限制性抗cea抗原特异性ctl的制备方法
CN105505871A (zh) 一种有效扩增cik且提高其特异性杀瘤能力的方法
CN103981144A (zh) 自体血清抗原致敏dc-cik细胞的制备方法
CN105969731B (zh) 一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法
CN105106237A (zh) 一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂
CN104762261A (zh) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法
CN109957543A (zh) 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法
CN108148805B (zh) 一种人Tscm细胞及其制备方法和应用
CN106479973B (zh) 一种体外iak免疫细胞培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1192282

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1192282

Country of ref document: HK

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190725

Address after: 100176 No. 1, Kangding Street, Daxing Economic and Technological Development Zone, Beijing, 4 buildings and 2 floors

Patentee after: BEIJING YONGTAI IMMUNITY APPLICATION TECHNOLOGY CO., LTD.

Address before: 100071 Beijing Fengtai District Fengtai Road 139 Xifulou 226

Patentee before: ImmunoTech Beijing Limited

TR01 Transfer of patent right