CN106929472A - 人cd3+cd56+cik细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，采用步骤：（1）采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞；（2）将上述PBMCs重悬于含自体灭活血浆的商品化无血清培养基中，调整细胞密度1-2×106/ml，并加入IFN-γ至终浓度600-1000IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养；（3）培养12-24小时后加入抗CD3单抗、抗CD28单、IL-2、IL-15，连续培养14~21天，其中每2~3天补加含有IL-2和IL-15的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在1~2×106/ml。本发明利用抗CD3单抗作为刺激剂，激活CIK细胞，并联合细胞因子rh rh IL-15和rh IL-2共同刺激。从而为临床过继性免疫细胞治疗提供新的可选方案。

Description

人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法及其应用。
背景技术
细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell, CIK）是Schmidt 等于1986年报的从外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中诱导出的一群异质性细胞。其主要效应细胞因同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，因此又被称为NK细胞样T淋巴细胞（NKT细胞）。体内外的实验研究表明，CIK细胞具有杀瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及杀瘤效应不受癌细胞多重耐药的影响等优势。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种实用高效的体外扩增人CIK细胞的方法。
本发明采用的技术方案是：一种制备人CD3+CD56+细胞的方法，包括如下步骤：采集并分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），用抗CD3单抗刺激，同时加入细胞因子rh IL-15和rh IL-2，置于37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半两更换培养并补加等量的rh Il-2，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加等量含有rh IL-2和rh IL -15的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2）×106个/mL。10～15天即可获得CD3+CD56+CIK细胞。
根据本发明，所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离手机，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得。所述rh IL-15终浓度为1-50ng/mL、rh IL-2终浓度为50-1500IU、抗CD3单抗终浓度为1-50ng/mL。根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10-15天。
本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
本发明的有益效果：利用抗CD3单抗作为刺激剂，激活CIK细胞，并联合细胞因子rhrh IL-15和rh IL-2共同刺激。从而为临床过继性免疫细胞治疗提供新的可选方案。
附图说明
图1为实施例集落和不规则的单个核细胞示意图；
图2为实施例细胞增殖倍数示意图；
图3为实施例FlowJo分析结果示意图；
图4为实施例Flowjo分析结果示意图；
图5为实施例Flowjo分析结果示意图。
具体实施方式
下面用实例说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
实施例1
本实例1是用抗CD3单抗刺激PBMCs，以获得CD3+CD56+CIK细胞。具体操作包括以下步骤：
1. 无菌条件下用血细胞分离机或50mL注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按照1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，放置时间较长的血液离心30分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤两次，转速分别为1500转/分，1200转/分，均离心8分钟，即可获得外周血单个核细胞。
2. 将上述分离的PBMCs置于含有刺激剂和细胞因子为25ng/mL rh IL-15、300IUrh IL-2、30ng/mL 抗CD3单抗、100ng/mL 抗CD28单抗和1-10%自体血浆的RPMI 1640、OpTmizer、AIM-V、SCGM或GT-T551等培养基内，调整细胞密度为（1～2）×106个/mL，转入细胞培养班板、培养瓶或者培养袋内，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半两更换培养液并加等量的rh IL-2，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加含有等量rh IL-2的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2）×106个/mL。10～15天即可获得TSCM细胞。在细胞培养的第14天，培养增殖的人TSCM细胞绝对扩增细胞倍数平均为
实施例2
本实施例2将对上述培养的CIK细胞形态学、增殖能力及活率进行检测。具体操作包括以下步骤：
1.形态学观察细胞培养24小时即可见CIK细胞沉于培养皿底部，仍呈单细胞状态，48小时趋于集落话，培养3天后可以看到大的集落和不规则的单个核细胞见图1。
2.在第0、3、5、7、9、12、14天分别用细胞计数仪和细胞计数板，将当前细胞总数除以开始培养的细胞总数，所得数值即为细胞增殖数，依次进行动态观察细胞增殖情况作为细胞补加新鲜培养基时的参考，细胞增殖倍数图见图2。
3.在第0、3、5、7、9、12、14天分别对细胞活率进行检测，取培养至相应天数的细胞，用含有0.1%叠氮钠的PBS洗涤2次，调整细胞密度0.5×106/mL，加入100ng/mL PI染料，室温避光孵育15分钟，用上述PBS洗涤2次，并重悬在上述的PBS中，用流式细胞仪检测细胞活率。
实施例3
本实施例3是对CD3+CD56+CIK细胞进行免疫表型检测。步骤如下：
取第0天和第14天的细胞，用含5%的新生牛血清和0.1%叠氮钠的PBS洗涤2次，调整密度为1×106/mL，重悬在100μL的上述PBS中，加入荧光抗体（CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PerCP、CD56-APC）染色，4℃孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1%的多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据用FlowJo分析，见图3。
实施例4
本实施例4是对CD3+CD56+CIK细胞及不同亚型的细胞进行细胞毒活性的检测。包括以下步骤：
1.取培养13天的CIK细胞，检测对人白血病K562肿瘤细胞株的杀伤活性；
2.取K562细胞，调整浓度为5×106/mL，加入0.05μMCalcein-AM37℃染色30分钟；
3.用PBS洗涤2次，1500转/分离心5分钟；
4.调整K562的细胞密度为5×105/孔，24孔板，每孔500μL，分别按照1:10、1:20、1:40的比例分别于CIK细胞混合，同时设置单独靶细胞（肿瘤细胞）对照、PI单染靶细胞对照、Calcein-AM单染靶细胞对照、PI和Calcein-AM双染靶细胞对照、效应细胞对照。于37℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养4小时；
5.将细胞从24孔板中转移至1.5mL Ep管中，1500转/分离心5分钟，收集细胞；
6.用100μL的PBS重悬细胞，加入100ng/mL PI，避光孵育15分钟；
7.用100μL的PBS洗涤两次，1500转/分离心5分钟；
8.用流式仪进行检测，数据用Flowjo分析，见图4。
实施例5
本实施例5是对CIK细胞及不同亚型的细胞进行胞内因子IFN-γ的检测。包括以下步骤：
1.配置5%的新生牛血清和0.1%叠氮钠的PBS；
2.取CIK细胞1500 rpm离心5分钟，重选于含10%新生牛血清的RPMI 1640中，进行计数，调整密度至2×106/mL；
3.分别设置阴性对照组，刺激对照组，阻断对照组、阳性组，24孔板，向每孔中加入500μL的CIK细胞，阴性对照组加入500μL的无血清RPMI 1640培养基，刺激对照组加入500μL含有1μg/mL Ionomycin、10ng/mL PMA的RPMI 1640，阻断对照组加入10μg/mL BFA，阳性组加入500μL含有1μg/mL Ionomycin、10ng/mL PMA、10μg/mL BFA的RPMI 1640。37℃、5%CO2及饱和湿度下孵育4小时；
4.将细胞移至1.5mL Ep管中，400×g离心5分钟；
5.弃上清，收集细胞沉淀，重悬在上述PBS中，加入胞外荧光染料（CD3-FITC、CD56-APC），4℃避光孵育30分钟；
6.400×g离心5分钟，洗涤两次；
7.向每支Ep管中加入500μL破膜固定剂，4℃避光孵育20分钟；
8.向每支Ep管中加入500μL固定洗液，400×g离心5分钟；
9.向每支Ep管中加入500μL固定洗液，400×g离心5分钟，洗涤两遍；
10.用100μL上述PBS重悬，加入胞内细胞染料IFN-γ，4℃避光孵育30分钟；
11.用上述PBS洗涤2次，400×g离心5分钟；
12.重悬于100μL的上述PBS中，用流式细胞仪检测，用FlowJo分析，见图5。

Claims (7)

1.人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，其特征在于采用如下步骤：
采集患者外周静脉血，经经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞；
将上述PBMCs重悬于含自体灭活血浆的商品化无血清培养基中，调整细胞密度1-2×106/ml，并加入IFN-γ至终浓度600-1000IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养；
培养12-24小时后加入抗CD3单抗、抗CD28单、IL-2、IL-15，连续培养14 ~21天，其中每2~3天补加含有IL-2和IL-15的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在1 ~2×106/ml。
2.根据权利要求1所述人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述12-24小时后使用的CD3单抗浓度为10-500ng/mL、50-500ng/mL anti-CD 28 mAb、1-50ng/mL rh IL-15、50-1500IU rh IL-2和1-10%自体血浆的RPMI 1640、OpTmizer、AIM-V、SCGM或GT-T551培养基内，调整细胞密度为（1～2）×106个/mL，转入细胞培养板、培养瓶或者培养袋内，于培养箱内培养。
3.根据权利要求2所述人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述抗CD3单抗浓度为30ng/mL。
4.根据权利要求2所述人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述抗CD28单抗浓度为100ng/mL。
5.根据权利要求2所述人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述IL-2浓度为500IU/mL。
6.根据权利要求2所述人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述IL-15浓度为25ng/mL。
7.根据权利要求1-6所述人CD3+CD56+CIK细胞的制备方法，其特征在于，所制备的人CD3+CD56+CIK细胞用于癌症治疗的药物或者生物制品。
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