CN114717187A - 一种cik细胞及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CIK细胞及其制备方法与应用。该CIK细胞的制备方法为：在培养未经冻存的单个核细胞的过程中，加入经冻存的单个核细胞共培养，显著促进CIK细胞扩增，并且具有协同增效作用；并且显著提高CD3+CD56+双阳性效应细胞的比例，从而提高CIK细胞的杀伤效果，并且具有协同增效作用，可用于制备治疗肿瘤的制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CIK细胞及其制备方法与应用。
背景技术
癌症是头号杀手疾病之一。为了治愈癌症，研究人员尝试了许多抗肿瘤策略，但癌症的复发率和死亡率仍然很高。过继免疫疗法作为辅助或替代疗法，在治疗各种恶性肿瘤方面具有很大的前景。CIK细胞(cytokine induced killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)是一种新型的免疫活性细胞，它是自体单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类CD3+和CD56+两种膜蛋白分子共同表达的杀伤细胞。CIK细胞具有抗肿瘤活性和非MHC杀瘤特性，是一种具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等特点的效应细胞，被认为是癌症免疫治疗的理想候选细胞类型。许多基础研究和临床研究证明了CIK疗法在治疗恶性肿瘤方面的安全性和可行性。CIK可对癌细胞进行直接杀伤，此外，它还可以通过分泌各种细胞因子来调节免疫功能。大量研究表明，经过肿瘤细胞刺激后，CIK细胞分泌的促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ和IL-2)的水平显著上调，这些细胞因子进一步增强全身抗肿瘤活性并诱导Th1免疫应答。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种CIK细胞的制备方法。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的制备方法得到的CIK细胞。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的制备方法和/或第二方面的CIK细胞在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)用免疫细胞培养基重悬未经冻存的单个核细胞，培养5～10天；
(2)加入经冻存的单个核细胞，培养，得到CIK细胞。
优选地，步骤(1)中所述免疫细胞培养基为含自体血浆、IL-2、IFN-γ、OTK-3的基础培养基。
优选地，步骤(1)中所述培养的时间为6～8天。
优选地，所述基础培养基为X-VIVO培养基、RPMI-1640培养基或CTS培养基。
优选地，所述基础培养基为无血清培养基。
优选地，所述自体血浆是经过56℃灭活过的自体血浆。
优选地，所述自体血浆的终浓度为1～10v/v％；进一步为2～10v/v％。
优选地，所述IL-2的终浓度为400～2500U/mL；进一步为500～2000U/mL；更进一步为1000～2000U/mL。
优选地，所述IFN-γ的终浓度为400～2500U/mL；进一步为500～2000U/mL；更进一步为1000～2000U/mL。
优选地，所述OTK-3的终浓度为400～2500U/mL；进一步为500～2000U/mL；更进一步为1000～2000U/mL。
优选地，步骤(1)、(2)中所述单个核细胞为外周血单个核细胞或脐带血单个核细胞。
优选地，步骤(1)、(2)中所述单个核细胞是从新鲜的外周血或脐带血中收集。
优选地，步骤(1)、(2)中所述单个核细胞通过密度梯度离心法从外周血或脐带血中分离得到，具体方法如下：外周血或脐带血心收集下层血细胞加生理盐水稀释，加入淋巴分离液后离心，收集淋巴细胞，加生理盐水洗涤，再次离心后去上清，获得单个核细胞。
优选地，步骤(1)中所述单个核细胞在所述免疫细胞培养基中的浓度为1～3×106/mL；进一步为1.5～3×106/mL。
优选地，步骤(1)、(2)中所述培养的条件为32～38℃、3～7v/v％CO2；进一步为35～37℃、4～6v/v％CO2。
优选地，步骤(2)中所述冻存的时间为5～10天；进一步为5～7天。
优选地，步骤(2)中所述经冻存的单个核细胞的制备方法为：取单个核细胞，用血清重悬，然后加入DMSO混合，置于-80℃。
优选地，所述血清与DMSO的体积比为1:(8～10)。
优选地，步骤(1)、(2)中所述培养的过程中，还包括如下步骤：定期补充含自体血浆、IL-2的基础培养基。
优选地，所述基础培养基为X-VIVO培养基、RPMI-1640培养基或CTS培养基。
优选地，所述培养基为无血清培养基。
优选地，所述自体血浆的终浓度为1～10v/v％；进一步为2～10v/v％。
优选地，所述IL-2的终浓度为400～2500U/mL；进一步为500～2000U/mL；更进一步为1000～2000U/mL。
优选地，所述定期补充含自体血浆、IL-2的基础培养基为每2～5天补充含自体血浆、IL-2的基础培养基；进一步为每3～4天补充含自体血浆、IL-2的基础培养基。
优选地，所述补充含自体血浆、IL-2的基础培养基为补充含自体血浆、IL-2的基础培养基至所述细胞浓度为1～3×106/mL；进一步为1.5～3×106/mL。
优选地，步骤(2)中所述培养的时间为9～23天；进一步为10～20天。
本发明的第二个方面，提供一种CIK细胞，通过本发明的第一个方面的制备方法得到。
优选地，所述CIK细胞的CD3+CD56+双阳性效应细胞的比例为69％～90％；进一步为69％～70.5％。
本发明的第三个方面，提供第一个方面的制备方法和/或第二方面的CIK细胞在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了一种CIK细胞的制备方法，在培养未经冻存的单个核细胞的过程中，加入经冻存的单个核细胞共培养，显著促进CIK细胞扩增，并且具有协同增效作用；并且显著提高CD3+CD56+双阳性效应细胞的比例，从而提高CIK细胞的杀伤效果，并且具有协同增效作用，可用于制备治疗肿瘤的制剂。
进一步地，本发明提供的制备方法中采用自体血浆，无需动物血清等试剂，避免引入动物源成分及污染源风险(如疯牛病毒、猪细小病毒等)。
本发明提供了一种CIK细胞，通过上述制备方法得到，该CIK细胞的CD3+CD56+双阳性效应细胞的比例为69％～90％，显著提高了CIK细胞的杀伤效果。
附图说明
图1是实施例1、2、3的CIK细胞的制备方法的流程图。
图2是对比例1的CIK细胞的制备方法的流程图。
图3是实施例2的CIK细胞的制备方法的流程图。
图4是实施例1、2、对比例1、2的放大100倍后的CIK细胞的状态图。
图5是实施例1、2、对比例1、2的CIK细胞扩增倍数对比图。
图6是实施例1、对比例1、2的CIK细胞的流式结果图：其中，A是实施例1的CIK细胞的流式结果图；B是对比例1的CIK细胞的流式结果图；C是对比例2的CIK细胞的流式结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种CIK细胞的制备方法
一种CIK细胞的制备方法，其流程图如图1所示，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离：
取70mL人来源的新鲜抗凝外周血加入离心管中，常温(20℃)1800rpm离心10min，离心后的离心管分为两层：血浆层和血细胞层：将血浆吸出，放置于另一支离心管中，将加入血浆的离心管经密封后，置于56℃水浴中30min灭活处理，灭活后的血浆置于4℃冰浴静置15min，析出沉淀，常温(20℃)1200g离心10min，用移液管将上层血浆采集至新的离心管，用封口胶密封并做好标记后，放置-20℃冰箱中保存，备用；同时，加入等体积的生理盐水稀释血细胞；取离心管，每支加入15mL人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)，制成分离液管，每支分离液管中加入15mL稀释后的血细胞，常温(20℃)800g离心20min，离心后的离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层，收集第二层(环状乳白色淋巴细胞层，即为PBMC)，分别缓慢加入到离心管中，每支离心管用生理盐水补至45mL，4℃1800rpm离心10min，弃去上清，先用10mL生理盐水稀释，取2mL稀释液，再用生理盐水稀释至10mL，从中取1mL计数，并计算细胞得率及活率，70mL人来源的新鲜抗凝外周血中的细胞数目为3.53×108，活率为94.8％。
(2)外周血单个核细胞(PBMC)的冻存：
取一部分步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，先用预冷的步骤(1)得到的自体血浆重悬，再缓慢加入DMSO，DMSO与血清的体积比为1:9，边加入边摇晃，得到浓度为1.5×107/mL的外周血单个核细胞(PBMC)冻存液，外周血单个核细胞(PBMC)冻存液按1mL/管分装在冻存管中，分装后的细胞放入梯度降温盒中，然后置于-80℃。
(3)外周血单个核细胞(PBMC)的培养：
取一部分步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，用含有2v/v％步骤(1)得到的自体血浆、IL-2(1000U/mL)、IFN-γ(1000U/mL)、OTK-3(CD3抗体，1000U/mL)的X-VIVO培养基重悬，得到浓度为1.5×106/mL的细胞悬液，取10mL细胞悬液(细胞总量为1.5×107)接种至T25瓶中，得到外周血单个核细胞(PBMC)培养体系(第0天)，体系于37℃、5v/v％二氧化碳的培养箱中进行分离培养，在细胞培养的第7天，复苏一管步骤(2)冻存的PBMC(细胞量为1.5×107/mL，1mL/管)，接种至上述外周血单个核细胞(PBMC)培养体系中；在培养过程中，每3天抽取细胞悬液进行计数，根据计数结果进行补液(使用含有2v/v％自体血清及1000U/mL IL-2的X-VIVO培养基将细胞量稀释至1.5×106/mL)；若培养体积超过30mL，则扩至T75瓶中，体积超过100mL，则扩至T175瓶中，体积超过300mL，则进行分瓶。
实施例2一种CIK细胞的制备方法
一种CIK细胞的制备方法，其流程图如图1所示，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离：
取70mL人来源的新鲜抗凝外周血加入离心管中，常温(20℃)1800rpm离心10min，离心后的离心管分为两层：血浆层和血细胞层：将血浆吸出，放置于另一支离心管中，将加入血浆的离心管经密封后，置于56℃水浴中30min灭活处理，灭活后的血浆置于4℃冰浴静置15min，析出沉淀，常温(20℃)1200g离心10min，用移液管将上层血浆采集至新的离心管，用封口胶密封并做好标记后，放置-20℃冰箱中保存，备用；同时，加入等体积的生理盐水稀释血细胞；取离心管，每支加入15mL人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)，制成分离液管，每支分离液管中加入15mL稀释后的血细胞，常温(20℃)800g离心20min，离心后的离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层，收集第二层(环状乳白色淋巴细胞层，即为PBMC)，分别缓慢加入到离心管中，每支离心管用生理盐水补至45mL，4℃1800rpm离心10min，弃去上清，先用10mL生理盐水稀释，取2mL稀释液，再用生理盐水稀释至10mL，从中取1mL计数，并计算细胞得率及活率，70mL人来源的新鲜抗凝外周血中的细胞数目为3.53×108，活率为94.8％；本实施例中的PBMC即为实施例1得到的PBMC。
(2)外周血单个核细胞(PBMC)的冻存：
取一部分步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，先用预冷的血清重悬，再缓慢加入DMSO，DMSO与血清的体积比为1:9，边加入边摇晃，得到浓度为1.5×107/mL的外周血单个核细胞(PBMC)冻存液，外周血单个核细胞(PBMC)冻存液按1mL/管分装在冻存管中，分装后的细胞放入梯度降温盒中，然后置于-80℃。
(3)外周血单个核细胞(PBMC)的培养：
取一部分步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，用含有2v/v％步骤(1)得到的自体血浆、IL-2(2000U/mL)、IFN-γ(2000U/mL)、OKT-3(2000U/mL)的X-VIVO培养基重悬，得到浓度为1.5×106/mL的细胞悬液，取10mL细胞悬液(细胞总量为1.5×107)接种至T25瓶中，得到外周血单个核细胞(PBMC)培养体系(第0天)，体系于37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行分离培养，在细胞培养的第7天，复苏一管步骤(2)冻存的PBMC(细胞量为1.5×107)，接种至上述外周血单个核细胞(PBMC)培养体系中；在培养过程中，每3天抽取细胞悬液进行计数，根据计数结果进行补液(使用含有2v/v％自体血清及2000U/mL IL-2的X-VIVO培养基将细胞量稀释至1.5×106/mL)；若培养体积超过30mL，则扩至T75瓶中，体积超过100mL，则扩至T175瓶中，体积超过300mL，则进行分瓶。
实施例3一种CIK细胞的制备方法
一种CIK细胞的制备方法，其流程图如图1所示，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离：
取70mL人来源的新鲜抗凝外周血加入离心管中，常温(20℃)1800rpm离心10min，离心后的离心管分为两层：血浆层和血细胞层：将血浆吸出，放置于另一支离心管中，将加入血浆的离心管经密封后，置于56℃水浴中30min灭活处理，灭活后的血浆置于4℃冰浴静置15min，析出沉淀，常温(20℃)1200g离心10min，用移液管将上层血浆采集至新的离心管，用封口胶密封并做好标记后，放置-20℃冰箱中保存，备用；同时，加入等体积的生理盐水稀释血细胞；取离心管，每支加入15mL人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)，制成分离液管，每支分离液管中加入15mL稀释后的血细胞，常温(20℃)800g离心20min，离心后的离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层，收集第二层(环状乳白色淋巴细胞层，即为PBMC)，分别缓慢加入到离心管中，每支离心管用生理盐水补至45mL，4℃1800rpm离心10min，弃去上清，先用10mL生理盐水稀释，取2mL稀释液，再用生理盐水稀释至10mL，从中取1mL计数，并计算细胞得率及活率，70mL人来源的新鲜抗凝外周血中的细胞数目为3.53×108，活率为94.8％；本实施例中的PBMC即为实施例1得到的PBMC。
(2)外周血单个核细胞(PBMC)的冻存：
取一部分步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，先用预冷的血清重悬，再缓慢加入DMSO，DMSO与血清的体积比为1:9，边加入边摇晃，得到浓度为1.5×107/mL的外周血单个核细胞(PBMC)冻存液，外周血单个核细胞(PBMC)冻存液按1mL/管分装在冻存管中，分装后的细胞放入梯度降温盒中，然后置于-80℃。
(3)外周血单个核细胞(PBMC)的培养：
取一部分步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，用含有2v/v％步骤(1)得到的自体血浆、IL-2(500U/mL)、IFN-γ(500U/mL)、OKT-3(500U/mL)的X-VIVO培养基重悬，得到浓度为1.5×106/mL的细胞悬液，取10mL细胞悬液(细胞总量为1.5×107)接种至T25瓶中，得到外周血单个核细胞(PBMC)培养体系(第0天)，体系于37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行分离培养，在细胞培养的第7天，复苏一管步骤(2)冻存的PBMC(细胞量为1.5×107)，接种至上述外周血单个核细胞(PBMC)培养体系中；在培养过程中，每3天抽取细胞悬液进行计数，根据计数结果进行补液(使用含有2v/v％自体血清及500U/mL IL-2的X-VIVO培养基将细胞量稀释至1.5×106/mL)；若培养体积超过30mL，则扩至T75瓶中，体积超过100mL，则扩至T175瓶中，体积超过300mL，则进行分瓶。
对比例1一种CIK细胞的制备方法
一种CIK细胞的制备方法，其流程图如图2所示，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离：
取70mL人来源的新鲜抗凝外周血加入离心管中，常温(20℃)1800rpm离心10min，离心后的离心管分为两层：血浆层和血细胞层：将血浆吸出，放置于另一支离心管中，将加入血浆的离心管经密封后，置于56℃水浴中30min灭活处理，灭活后的血浆置于4℃冰浴静置15min，析出沉淀，常温(20℃)1200g离心10min，用移液管将上层血浆采集至新的离心管，用封口胶密封并做好标记后，放置-20℃冰箱中保存，备用；同时，加入等体积的生理盐水稀释血细胞；取离心管，每支加入15mL人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)，制成分离液管，每支分离液管中加入15mL稀释后的血细胞，常温(20℃)800g离心20min，离心后的离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层，收集第二层(环状乳白色淋巴细胞层，即为PBMC)，分别缓慢加入到离心管中，每支离心管用生理盐水补至45mL，4℃1800rpm离心10min，弃去上清，先用10mL生理盐水稀释，取2mL稀释液，再用生理盐水稀释至10mL，从中取1mL计数，并计算细胞得率及活率，70mL人来源的新鲜抗凝外周血中的细胞数目为3.53×108，活率为94.8％；本对比例中的PBMC即为实施例1得到的PBMC。
(2)外周血单个核细胞(PBMC)的培养：
取步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，用含有2v/v％步骤(1)得到的自体血浆、IL-2(1000U/mL)、IFN-γ(1000U/mL)、OKT-3(1000U/mL)的X-VIVO培养基重悬，得到浓度为1.5×106/mL的细胞悬液，取10mL细胞悬液(细胞总量为1.5×107)细胞悬液接种至T25瓶中，得到外周血单个核细胞(PBMC)培养体系(第0天)，体系于37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行分离培养；在培养过程中，每3天抽取细胞悬液进行计数，根据计数结果进行补液(使用含有2v/v％自体血清及1000U/mL IL-2的X-VIVO培养基将细胞量稀释至1.5×106/mL)；若培养体积超过30mL，则扩至T75瓶中，体积超过100mL，则扩至T175瓶中，体积超过300mL，则进行分瓶。
对比例2一种CIK细胞的制备方法
一种CIK细胞的制备方法，其流程图如图3所示，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离：
取70mL人来源的新鲜抗凝外周血加入离心管中，常温(20℃)1800rpm离心10min，离心后的离心管分为两层：血浆层和血细胞层：将血浆吸出，放置于另一支离心管中，将加入血浆的离心管经密封后，置于56℃水浴中30min灭活处理，灭活后的血浆置于4℃冰浴静置15min，析出沉淀，常温(20℃)1200g离心10min，用移液管将上层血浆采集至新的离心管，用封口胶密封并做好标记后，放置-20℃冰箱中保存，备用；同时，加入等体积的生理盐水稀释血细胞；取离心管，每支加入15mL人淋巴细胞分离液(密度为1.077g/mL)，制成分离液管，每支分离液管中加入15mL稀释后的血细胞，常温(20℃)800g离心20min，离心后的离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层，收集第二层(环状乳白色淋巴细胞层，即为PBMC)，分别缓慢加入到离心管中，每支离心管用生理盐水补至45mL，4℃1800rpm离心10min，弃去上清，先用10mL生理盐水稀释，取2mL稀释液，再用生理盐水稀释至10mL，从中取1mL计数，并计算细胞得率及活率，70mL人来源的新鲜抗凝外周血中的细胞数目为3.53×108，活率为94.8％；本对比例中的PBMC即为实施例1得到的PBMC。
(2)外周血单个核细胞(PBMC)的冻存：
取一部分步骤(1)得到的外周血单个核细胞(PBMC)，先用预冷的血清重悬，再缓慢加入DMSO，DMSO与血清的体积比为1:9，边加入边摇晃，得到浓度为1.5×107/mL的外周血单个核细胞(PBMC)冻存液，外周血单个核细胞(PBMC)冻存液按1mL/管分装在冻存管中，分装后的细胞放入梯度降温盒中，然后置于-80℃。
(3)外周血单个核细胞(PBMC)的培养：
外周血单个核细胞(PBMC)冻存7天后，复苏一管步骤(2)冻存的PBMC(细胞量为1.5×107)，用含有2v/v％步骤(1)得到的自体血浆、IL-2(1000U/mL)、IFN-γ(1000U/mL)、OTK-3(1000U/mL)的X-VIVO培养基重悬，得到浓度为1.5×106/mL的细胞悬液，细胞悬液(细胞量为1.5×107)接种至T25瓶中，得到外周血单个核细胞(PBMC)培养体系(第0天)，体系于37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行复苏培养；在培养过程中，每3天抽取细胞悬液进行计数，根据计数结果进行补液(使用含有2v/v％自体血清及1000U/mL IL-2的X-VIVO培养基将细胞量稀释至1.5×106/mL)；若培养体积超过30mL，则扩至T75瓶中，体积超过100mL，则扩至T175瓶中，体积超过300mL，则进行分瓶。
效果实施例
1.分别于第1、4、8、12、16、18天，在倒置显微镜下观察实施例1、2、对比例1、2的细胞的状态，结果如图4所示：随着培养时间的推移，采用本申请提供的方法(分离+复苏培养方法，实施例1、2)的CIK细胞较采用分离培养方法(对比例1)和复苏培养方法(对比例2)分布更均匀、汇合度更高，表明本申请提供CIK细胞制备方法可以促进CIK细胞增殖，并且具有协同增效作用。
2.分别在不同时间(具体详见表1)对实施例1、2、对比例1、2的细胞计数，计算不同时间的扩增倍数(不同时间的细胞数/第0天的细胞数)，结果如图5及表1所示：采用分离+复苏培养方法(实施例1、2)的CIK扩增倍数显著高于采用分离培养方法(对比例1)和复苏培养方法(对比例2)，表明本申请提供CIK细胞制备方法可以促进CIK细胞扩增，并且具有协同增效作用。
表1不同处理对CIK细胞扩增效率的影响
3.分别在第18天通过流式细胞术对实施例1、对比例1、2的细胞的表型进行鉴定，结果如图6所示：采用分离+复苏培养方法(实施例1)的CD3+CD56+双阳性效应细胞的比例(70.5％)显著高于采用分离培养方法(对比例1，65.3％)和复苏培养方法(对比例2，51.7％)，表明本申请提供CIK细胞制备方法可以显著提高CD3+CD56+双阳性效应细胞的比例，从而提高CIK细胞的杀伤效果，并且具有协同增效作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)用免疫细胞培养基重悬未经冻存的单个核细胞，培养5～10天；
(2)加入经冻存的单个核细胞，培养，得到CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述免疫细胞培养基为含自体血浆、IL-2、IFN-γ、OTK-3的基础培养基。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述自体血浆的终浓度为1～10v/v％；
优选地，所述IL-2的终浓度为400～2500U/mL；
优选地，所述IFN-γ的终浓度为400～2500U/mL；
优选地，所述OTK-3的终浓度为400～2500U/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)、(2)中所述单个核细胞为外周血单个核细胞或脐带血单个核细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
所述单个核细胞通过密度梯度离心法从外周血或脐带血中分离得到。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述单个核细胞在所述免疫细胞培养基中的浓度为1～3×106/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)、(2)中所述培养的条件为32～38℃、3～7v/v％CO2。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)、(2)中所述培养的过程中，还包括如下步骤：定期补充含自体血浆、IL-2的基础培养基；
优选地，所述补充含自体血浆、IL-2的基础培养基为补充含自体血浆、IL-2的基础培养基至所述细胞浓度为1～3×106/mL。
9.一种CIK细胞，通过权利要求1～8中任一项所述的制备方法得到；
所述CIK细胞的CD3+CD56+双阳性效应细胞的比例为69％～90％。
10.权利要求1～8中任一项所述的制备方法和/或权利要求9所述的CIK细胞在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
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