CN113151168A - 一种人nk细胞培养体系及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人脐血NK细胞培养体系及制备方法，属于免疫细胞治疗技术领域。本发明的人脐血NK细胞培养体系包括人乙肝免疫球蛋白、人血白蛋白、无血清培养基、活化因子和自体血浆，通过培养瓶包被、脐带血梯度离心制备脐带血单个核细胞和自体血浆、接种、换液、入袋、细胞收获等步骤得到人脐血NK细胞。本发明创造性地使用人乙肝免疫球蛋白和人血白蛋白结合用于包被培养瓶，采用纯因子IL2、IL15联合使用，降低了临床使用风险，且本发明所述的制备方法培养周期为12天，降低了成本，制备得到的NK细胞扩增效率好，纯度高，数量多，可满足临床需要。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种人NK细胞培养体系及制备方法。
背景技术
手术、化疗和放疗作为肿瘤三大标准治疗方法，在提高肿瘤病人生存率、延长生存时间方面发挥着重要作用。但是，根治肿瘤之路依然任重道远，迫切需要开发新的治疗方法。近年来，免疫治疗作为肿瘤第四治疗方法，正在快速发展并受到极大关注。免疫治疗不同于传统标准治疗直接杀伤癌细胞，而是通过激活机体免疫系统来驱除和消灭癌细胞。
自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)是来源于造血细胞的一种大粒状淋巴细胞，是机体固有免疫系统的重要组成部分之一，与T细胞和B细胞不同，NK细胞不需要特异性的抗原致敏刺激就可识别并杀伤靶细胞(如病毒感染的宿主细胞和肿瘤细胞)。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，因此称为“自然杀伤细胞”，其在早期抗感染和抗肿瘤免疫过程中起重要作用。
NK细胞具有广谱的肿瘤杀伤效果，杀伤机制包括：(1)直接杀伤：释放穿孔素/颗粒酶裂解肿瘤细胞；(2)细胞调亡途径：活化NK细胞表达Fas(CD95)配体和TRAIL(TNF-relatedapoptosis inducing ligand)分子，诱导CD95+靶细胞和TRAIL受体阳性的靶细胞通过内源酶的级联反应发生凋亡；(3)ADCC：借助表面CD16与肿瘤特异性IgG发生的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；(4)释放细胞因子：如分泌IFN-γ、TNF。
流行病学研究表明，NK细胞功能下降与癌症发病率有关。2000年，日本研究人员Imai等对3625名日本居民随访11年发现，NK细胞活性低的人群比中或高人群患癌风险明显增高，表明NK细胞的细胞毒性是肿瘤细胞免疫监测的至关重要的组成部分。然而，NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5-10％，且目前NK细胞扩增的方法不管是细胞因子刺激扩增法还是滋养层细胞扩增法，其扩增效率及纯度较低，同时存在重复性差的缺点。如专利CN108300693A公开了一种NK细胞体外扩增的方法，通过构建的新型人工抗原递呈细胞CD86-4-1BBL-aAPC作为饲养细胞扩增NK细胞，其引入外源性的细胞，增加了临床应用的风险。专利CN109628397A也公开了一种NK细胞体外扩增的方法，但其培养周期为14-18天，耗时较长。
因此，亟需开发一种临床使用安全，增殖效率高，纯度高，杀伤肿瘤细胞活性高的大规模离体培养NK细胞的方法。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种人脐血NK细胞培养体系及制备方法。本发明创造性地使用人乙肝免疫球蛋白和人血白蛋白结合用于包被培养瓶，采用纯因子IL2、IL15联合使用，降低了临床使用风险，且本发明所述的制备方法培养周期为12天，降低了成本，制备得到的NK细胞扩增效率好，纯度高。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种人脐血NK细胞培养体系，所述的培养体系包括人乙肝免疫球蛋白、人血白蛋白、无血清培养基、活化因子和自体血浆。
具体地，所述的人乙肝免疫球蛋白浓度为10-100μg/mL，优选为50μg/mL。
具体地，所述的人血白蛋白浓度为50-500μg/mL，优选为200μg/mL。
具体地，所述的无血清培养基为AIM-V、SCGM或X-VIVO 15，优选为SCGM。
具体地，所述的活化因子包括白介素2IL-2、白介素15IL-15和低分子量肝素。
进一步具体地，所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为100-800IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL。
进一步具体地，接种步骤，所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为100-800IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL；换液步骤，所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为500IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL；入袋步骤，所述IL-2的终浓度为100-500IU/mL。
具体地，所述的自体血浆的含量为1-10％。
进一步具体地，接种步骤，自体血浆的含量为10％；换液步骤，自体血浆的含量为1％；入袋步骤，自体血浆的含量为1％。
另一方面，本发明提供了一种人脐血NK细胞的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
1)培养瓶包被：接种前24-48h，取人乙肝免疫球蛋白和人血白蛋白混合液加入培养瓶中，混合均匀，室温静置0.5-2h，置于4℃冰箱备用，使用前，将包被好的培养瓶中的上清液弃去，用PBS清洗一遍；
2)脐带血梯度离心制备脐带血单个核细胞和自体血浆；
3)接种：按照接种密度0.5-2×106，将步骤2)制备的脐带血单个核细胞加入步骤1)包被好的培养瓶中，加入无血清培养基、活化因子和自体血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天。
4)换液：培养第4天，在原培养瓶换液，加入自体血浆和活化因子。
5)入袋：培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入无血清培养基、活化因子和自体血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
6)细胞收获：培养第12天，收获细胞。
具体地，步骤1)中所述的人乙肝免疫球蛋白浓度为10-100μg/mL，优选为50μg/mL；所述的人血白蛋白浓度为50-500μg/mL，优选为200μg/mL；所述的混合液中人乙肝免疫球蛋白和人血白蛋白体积比为1:1；所述混合液体积为5-15mL，优选为10mL；所述培养瓶为75cm2培养瓶；所述室温静置时间为1h。
具体地，步骤2)所述的脐带血单个核细胞和自体血浆制备方法包括以下步骤：
S1.采血：脐带血取自足月健康新生儿的脐带，加入枸橼酸钠抗凝，采集后24h内进行分离；
S2.分离：按脐带血:PBS＝1:1体积比稀释脐带血，缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液中，800g离心20min；
S3.取白膜层：收集单个核细胞白膜层至新的离心管中，加入PBS洗涤2遍，600g离心10min，弃上清，获得脐带血单个核细胞沉淀；
S4.取自体血浆：取血浆于新的离心管中，将血浆在56℃下灭活30min，800g离心10min，取上清液至新的离心管中4℃保存备用。
具体地，步骤3)中所述的接种密度为2×106；所述的无血清培养基为AIM-V、SCGM或X-VIVO 15，优选为SCGM；所述的活化因子包括IL-2、IL-15和低分子量肝素；所述的自体血浆的含量为10％。
进一步具体地，所述的无血清培养基的含量(或加入量)为10-50mL，优选为50mL；所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为100-800IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL。
具体地，步骤4)中所述的自体血浆的含量为1％；所述的活化因子包括IL-2、IL-15和低分子量肝素。
进一步具体地，所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为500IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL。
具体地，步骤5)中所述的无血清培养基为AIM-V、SCGM或X-VIVO 15，优选为SCGM；所述的活化因子包括IL-2；所述的自体血浆的含量为1％。
进一步具体地，所述的无血清培养基的含量(或加入量)为300-600mL，优选为500mL；所述IL-2的终浓度为100-500IU/mL。
具体地，步骤6)中所述的细胞收获包括以下步骤：
S1.将培养12天的培养液转移至离心管，500g离心10min；
S2.弃上清，加入50mL PBS重悬细胞沉淀，500g离心10min；
S3.弃上清，得NK细胞。
具体地，细胞培养第0天和12天取样进行细胞计数。
又一方面，本发明提供了上述培养体系或制备方法制备得到的人脐血NK细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌和白血病。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
1.本发明提供了一种人脐血NK细胞的培养体系及制备方法，创新性地将人乙肝免疫球蛋白(50μg/mL)和人血白蛋白(200μg/mL)结合用于包被培养瓶，刺激活化人脐血NK细胞的效果优良。
2.本发明联合使用IL-2和IL-15，可特异性地激活NK细胞，作用3-7天后，NK细胞优势活化，而对IL-2反应的T淋巴细胞群受到抑制，在随后的培养体系中加入IL-2，NK细胞快速增殖，细胞纯度大大提高。
3.本发明利用低分子肝素的粘附特性和促进祖细胞增殖的优点，进一步提高NK细胞的扩增效率。
4.本发明采用脐带血分离制备脐带血单个核细胞，脐带血中含有多种外周血中没有的可以分化为NK细胞的祖细胞，可以提供即用型商品化的NK细胞。
5.本发明所述人脐血NK细胞的制备方法换液次数少，降低了污染的概率；细胞培养周期仅12天，降低培养成本。
6.本发明所述人脐血NK细胞的制备方法NK细胞扩增效率高，纯度高，数量多，可满足临床需要。
附图说明
图1为流式检测结果图，其中A为实施例1的检测结果，B为实施例2的检测结果，C为对比例1的检测结果，D为对比例2的检测结果，E为对比例3的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学用语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
实施例1人脐血NK细胞的体外扩增
1.包被培养瓶：接种前24-48h，将人乙肝免疫球蛋白(50μg/mL)和人血白蛋白(200μg/mL)按照1:1的比例混合均匀后，取10mL加入75cm2培养瓶中，混合均匀，室温静置1h，然后置于4℃冰箱备用。
使用前，将包被好的培养瓶中的上清液弃去，再用PBS清洗一遍。
2.将脐带血梯度离心，分离获得脐带血单核细胞和血浆：
(1)采血：脐血取自足月健康新生儿的脐带，加入枸橼酸钠抗凝，采集后24h内进行分离。
(2)分离：按脐血:PBS＝1:1比例稀释脐血，缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液中，800g离心20min。
(3)取白膜层：收集单个核细胞白膜层至新的离心管中，加入PBS洗涤2遍，600g离心10min。弃上清，获得脐血单个核细胞沉淀。
(4)取血浆：取血浆于新的50mL离心管中，将血浆在56℃下灭活30min，800g离心10min，除去血小板等。取上清液至新的离心管中4℃保存备用。
3.接种：按照细胞接种密度2×106个/mL，将细胞加入事先包被好的培养瓶中，加入无血清培养基、活化因子、10％的血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
其中，细胞接种体积为10mL，无血清培养基为SCGM，加入量为50mL。活化因子包括IL-2，IL-15和低分子量肝素，IL-2的终浓度为1000IU/mL，IL-15的终浓度为500IU/mL，低分子量肝素的浓度为300IU/mL。
4.换液：培养第4天，在原培养瓶换液，加入1％的血浆和活化因子。
其中，活化因子中IL-2的终浓度为800IU/mL，IL-15的终浓度为500IU/mL，低分子量肝素的浓度为300IU/mL。
5.入袋：培养第6天，转移细胞至培养袋中培养，加入无血清培养基、IL-2和1％的血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
其中，无血清培养基为SCGM，加入量为500mL。IL-2的终浓度为500IU/mL。
6.细胞收获：
(1)将培养12天的培养液转移至离心管，500g离心10min；
(2)弃上清，加入50mL PBS重悬细胞沉淀，500g离心10min；
(3)弃上清，得NK细胞。
7.细胞计数：于细胞培养的第0天和12天分别取样计数。
实施例2人脐血NK细胞的体外扩增
1.包被培养瓶：接种前24-48h，将人乙肝免疫球蛋白(100μg/mL)和人血白蛋白(500μg/mL)按照1:1的比例混合均匀后，取10mL加入75cm2培养瓶中，混合均匀，室温静置1h，然后置于4℃冰箱备用。
使用前，将包被好的培养瓶中的上清液弃去，再用PBS清洗一遍。
2.将脐带血梯度离心，分离获得脐带血单核细胞和血浆：
(1)采血：脐血取自足月健康新生儿的脐带，加入枸橼酸钠抗凝，采集后24h内进行分离。
(2)分离：按脐血:PBS＝1:1比例稀释脐血，缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液中，800g离心20min。
(3)取白膜层：收集单个核细胞白膜层至新的离心管中，加入PBS洗涤2遍，600g离心10min。弃上清，获得脐血单个核细胞沉淀。
(4)取血浆：取血浆于新的50mL离心管中，将血浆在56℃下灭活30min，800g离心10min，除去血小板等。取上清液至新的离心管中4℃保存备用。
3.接种：按照细胞接种密度2×106个/mL，将细胞加入事先包被好的培养瓶中，加入无血清培养基、活化因子、10％的血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
其中，细胞接种体积为10mL，无血清培养基为SCGM，加入量为50mL。活化因子包括IL-2，IL-15和低分子量肝素，IL-2的终浓度为800IU/mL，IL-15的终浓度为800IU/mL，低分子量肝素的浓度为600IU/mL。
4.换液：培养第4天，在原培养瓶换液，加入1％的血浆和活化因子。
其中，活化因子中IL-2的终浓度为1000IU/mL，IL-15的终浓度为500IU/mL，低分子量肝素的浓度为600IU/mL。
5.入袋：培养第6天，转移细胞至培养袋中培养，加入无血清培养基、IL-2和1％的血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
其中，无血清培养基为SCGM，加入量为500mL。IL-2的终浓度为500IU/mL。
6.细胞收获：
(1)将培养12天的培养液转移至离心管，500g离心10min；
(2)弃上清，加入50mL PBS重悬细胞沉淀，500g离心10min；
(3)弃上清，得NK细胞。
7.细胞计数：于细胞培养的第0天和12天分别取样计数。
对比例1
步骤1采用人乙肝免疫球蛋白(1μg/mL)和人血白蛋白(10μg/mL)混合液包被培养瓶，其他与实施例1相同。
对比例2
步骤1采用人乙肝免疫球蛋白(200μg/mL)和人血白蛋白(600μg/mL)混合液包被培养瓶，其他与实施例1相同。
对比例3
步骤1采用人乙肝免疫球蛋白(1μg/mL)和人血白蛋白(10μg/mL)混合液包被培养瓶，步骤3中IL-2的终浓度为1000IU/mL，IL-15的终浓度为1000IU/mL，低分子量肝素的浓度为1000IU/mL，步骤4中IL-2的终浓度为1000IU/mL，IL-15的终浓度为1000IU/mL，低分子量肝素的浓度为1000IU/mL，步骤5中IL-2的终浓度为1000IU/mL。其他与实施例1相同。
实验例1细胞计数
细胞培养的第0天和12天分别取样计数，检测结果如下表1。
表1细胞总数计数结果
| 细胞数目 | 第0天(个) | 第12天(个) |
| 实施例1 | 2×10<sup>7</sup> | 3.6×10<sup>9</sup> |
| 实施例2 | 2×10<sup>7</sup> | 3.2×10<sup>9</sup> |
| 对比例1 | 2×10<sup>7</sup> | 1.5×10<sup>9</sup> |
| 对比例2 | 2×10<sup>7</sup> | 1.9×10<sup>9</sup> |
| 对比例3 | 2×10<sup>7</sup> | 1.7×10<sup>9</sup> |
实验例2NK细胞表型检测
取第12天的细胞悬液，离心重悬，调整细胞浓度为1.0×106个/mL，每管100μL。分别加入抗体CD3-FITC、CD56-APC各5μL，于暗处孵育30min。洗涤后进行流式细胞表型检测，检测结果如下表2所示，流式检测结果如图1所示。表3为NK细胞的扩增倍率计算结果。
表2流式细胞表型检测结果
| 细胞类型 | CD3-CD56+细胞(％) |
| 起始细胞 | 20.1 |
| 实施例1 | 94.2 |
| 实施例2 | 94.0 |
| 对比例1 | 54.4 |
| 对比例2 | 58.7 |
| 对比例3 | 62.9 |
表3NK细胞扩增倍率计算
实验例3细胞杀伤毒性
使用CCK-8kit进行细胞杀伤活性的检测。
取培养第12天的细胞悬液，离心后PBS洗涤2遍，调整细胞密度为1.0×106个/mL，作为效应细胞。取对数生长期的人慢性髓系白血病细胞K562，调整细胞密度为5.0×104个/mL，作为靶细胞。按照效靶比分别为1:1、5:1、10:1、20:1的比例混合细胞，培养于96孔板内，每孔总体积200μL。同时，设置效应细胞孔、靶细胞孔、空白对照孔，每组设3个复孔。置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养24h后，加CCK-8试剂20μL，置入培养箱继续孵育4h后于450nm测定吸光度(A)值。
按如下公式计算细胞杀伤活性：
杀伤率＝[1-(实验孔A值-效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值]×100％。
杀伤率检测效果如下表4所示。
表4杀伤率检测效果
| 效靶比 | 1:1 | 5:1 | 10:1 | 20:1 |
| 实施例1 | 6.3 | 26.9 | 81.5 | 96.7 |
| 实施例2 | 6.2 | 25.4 | 79.2 | 96.0 |
| 对比例1 | 3.1 | 6.8 | 16.3 | 53.2 |
| 对比例2 | 3.3 | 8.5 | 30.2 | 69.8 |
| 对比例3 | 5.5 | 10.2 | 40.4 | 74.4 |
实验例4实体瘤杀伤能力
检测本发明所述NK细胞对实体瘤细胞非小细胞肺癌NCI-H292和人肝癌细胞系HepG2的杀伤效果。结果如下表5所示。
表5
由表4可知，本发明制备得到的NK细胞具有较好的实体瘤杀伤效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种人脐血NK细胞培养体系，其特征在于，所述的培养体系包括人乙肝免疫球蛋白、人血白蛋白、无血清培养基、活化因子和自体血浆。
2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，
所述的人乙肝免疫球蛋白浓度为10-100μg/mL；
所述的人血白蛋白浓度为50-500μg/mL；
所述的无血清培养基为AIM-V、SCGM或X-VIVO 15；
所述的活化因子包括白介素2IL-2、白介素15IL-15和低分子量肝素；
所述的自体血浆的含量为1-10％。
3.根据权利要求2所述的培养体系，其特征在于，
所述的人乙肝免疫球蛋白浓度为50μg/mL；
所述的人血白蛋白浓度为200μg/mL；
所述的无血清培养基为SCGM；
所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为100-800IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL。
4.根据权利要求3所述的培养体系，其特征在于，
接种步骤，所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为100-800IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL；换液步骤，所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为500IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL；入袋步骤，所述IL-2的终浓度为100-500IU/mL；
接种步骤，自体血浆的含量为10％；换液步骤，自体血浆的含量为1％；入袋步骤，自体血浆的含量为1％。
5.一种人脐血NK细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
1)培养瓶包被：接种前24-48h，取人乙肝免疫球蛋白和人血白蛋白混合液加入培养瓶中，混合均匀，室温静置0.5-2h，置于4℃冰箱备用，使用前，将包被好的培养瓶中的上清液弃去，用PBS清洗1遍；
2)脐带血梯度离心制备脐带血单个核细胞和自体血浆；
3)接种：按照接种密度0.5-2×106，将步骤2)制备的脐带血单个核细胞加入步骤1)包被好的培养瓶中，加入无血清培养基、活化因子和自体血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天；
4)换液：培养第4天，在原培养瓶换液，加入自体血浆和活化因子；
5)入袋：培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入无血清培养基、活化因子和自体血浆，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
6)细胞收获：培养第12天，收获细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的人乙肝免疫球蛋白浓度为10-100μg/mL，优选为50μg/mL；所述的人血白蛋白浓度为50-500μg/mL，优选为200μg/mL；所述的混合液中人乙肝免疫球蛋白和人血白蛋白体积比为1:1；所述混合液体积为5-15mL，优选为10mL；所述培养瓶为75cm2培养瓶；所述室温静置时间为1h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的脐带血单个核细胞和自体血浆制备方法包括以下步骤：
S1.采血：脐带血取自足月健康新生儿的脐带，加入枸橼酸钠抗凝，采集后24h内进行分离；
S2.分离：按脐带血:PBS＝1:1体积比稀释脐带血，缓慢加入等体积人淋巴细胞分离液中，800g离心20min；
S3.取白膜层：收集单个核细胞白膜层至新的离心管中，加入PBS洗涤2遍，600g离心10min，弃上清，获得脐带血单个核细胞沉淀；
S4.取自体血浆：取血浆于新的离心管中，将血浆在56℃下灭活30min，800g离心10min，取上清液至新的离心管中4℃保存备用。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
步骤3)中所述的接种密度为2×106；所述的无血清培养基为AIM-V、SCGM或X-VIVO 15，优选为SCGM；所述的活化因子包括IL-2、IL-15和低分子量肝素；所述的自体血浆的含量为10％；
所述的无血清培养基的加入量为10-50mL，优选为50mL；所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为100-800IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL；
步骤4)中所述的自体血浆的含量为1％；所述的活化因子包括IL-2、IL-15和低分子量肝素；
所述IL-2的终浓度为100-1000IU/mL，所述IL-15的终浓度为500IU/mL，所述低分子量肝素的浓度为200-600IU/mL；
步骤5)中所述的无血清培养基为AIM-V、SCGM或X-VIVO 15，优选为SCGM；所述的活化因子包括IL-2；所述的自体血浆的含量为1％；
所述的无血清培养基的加入量为300-600mL，优选为500mL；所述IL-2的终浓度为100-500IU/mL。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中所述的细胞收获包括以下步骤：
S1.将培养12天的培养液转移至离心管，500g离心10min；
S2.弃上清，加入50mL PBS重悬细胞沉淀，500g离心10min；
S3.弃上清，得NK细胞。
10.如权利要求1所述的培养体系制备得到的人脐血NK细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
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