CN116891827A - 一种nk细胞活性激活体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种NK细胞活性激活体系，属于NK细胞活性培养技术领域，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基，NK细胞激活因子为IL‑2、IL‑12、IL‑15中的一种或几种，本发明的细胞激活因子用量少，成分简单、易得，性能稳定，且激活因子可直接使用，省去了融合处理步骤，简化了工艺步骤，可用于后续NK细胞活性物质检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种NK细胞活性检测前的活性激活体系，具体涉及一种NK细胞活性激活体系，属于NK细胞活性培养技术领域。
背景技术
NK细胞是大颗粒淋巴细胞，其来源于骨髓，可分布在淋巴结、脾脏和外周血液之中。NK细胞不需要抗原事先刺激和抗体存在，就能发挥细胞毒活性，且不受主要组织相容性复合体（MHC）约束。其主要功能为抗肿瘤，抗感染，对T、B淋巴细胞、骨髓干细胞具有调控作用，还能发挥自身正反馈调节。
NK细胞活性预示着机体先天免疫细胞抵御致病性细胞的免疫能力。其变化可作为考察某些疾病疗效和预后的指标之一。许多疾病的发生、发展及转归与NK活性密切相关。当NK活性减弱，其杀伤循环血液中的肿瘤细胞能力受到影响，将不能有效地发挥其监视功能。肿瘤病人的NK活性明显低于正常人，并随病情而变化。病情严重时，NK活性下降更为明显，病情好转时，NK活性回升。血浆中细胞因子的含量可直接反映NK细胞的活力，以此进一步评估个体的免疫情况，特别是可能的状况或疾病对NK细胞活力的影响而导致身体免疫力的变化。
NK细胞活性检测作为一种评估机体固有免疫状态改变的有效工具，可以帮助临床医师评估机体免疫系统通过先天免疫细胞抵御受感染细胞及肿瘤细胞的能力。
目前市售的NK细胞活性培养基包含细胞激活因子、肝素钠、牛血清白蛋白及其它组成，其培养基中细胞激活因子含量较高，成本较贵，而且细胞激活因子需进行融合处理，工艺较复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK细胞活性激活体系，降低了细胞激活因子的用量，且激活因子可直接使用，省去了融合处理步骤，简化了工艺步骤。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基，NK细胞激活因子为IL-2、IL-12、IL-15中的一种或几种，NK细胞激活因子的浓度为0.5ng/mL-5ng/mL，NK细胞激活培养基包括：0.01-0.1mol/L的PB或柠檬酸或Tris体系、0.1-1%的海藻糖、0.1-1%的牛血清白蛋白、0.1-0.5%的PEG6000、0.1-1%的水解乳蛋白、0.1-0.5%的甘氨酸。
所述NK细胞激活培养基的pH值为6.0-8.0。
作为一种优化方案，
所述NK细胞激活因子为IL-2。
所述NK细胞激活因子的浓度为1ng/mL。
所述NK细胞激活培养基包括：0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸。
所述NK细胞激活培养基的pH值为7.4。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：本发明的细胞激活因子用量少，成分简单、易得，性能稳定，且激活因子可直接使用，省去了融合处理步骤，简化了工艺步骤，可用于后续NK细胞活性物质检测。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下所有实施例和对比例中的百分数均为质量百分数。
实施例1
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-2。
NK细胞激活因子的浓度为0.5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.01mol/L的PB、0.1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、0.1%的水解乳蛋白、0.1%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为6.0。
实施例2
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-12。
NK细胞激活因子的浓度为3.5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.05mol/L的PB、0.5%的海藻糖、0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的PEG6000、0.05%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为7.0。
实施例3
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-15。
NK细胞激活因子的浓度为5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.1mol/L的PB、1%的海藻糖、1%的牛血清白蛋白、0.5%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.5%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为8.0。
实施例4
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-2、IL-12的混合物。
NK细胞激活因子的浓度为0.5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.01mol/L的柠檬酸、0.2%的海藻糖、0.2%的牛血清白蛋白、0.2%的PEG6000、0.2%的水解乳蛋白、0.2%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为6.0。
实施例5
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-2、IL-15的混合物。
NK细胞激活因子的浓度为2.5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.05mol/L的柠檬酸、0.6%的海藻糖、0.6%的牛血清白蛋白、0.3%的PEG6000、0.6%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为7.4。
实施例6
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-12、IL-15的混合物。
NK细胞激活因子的浓度为3ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.1mol/L的柠檬酸、1%的海藻糖、1%的牛血清白蛋白、0.5%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.5%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为6.5。
实施例7
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-2、IL-12、IL-15的混合物。
NK细胞激活因子的浓度为5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.01mol/L的Tris体系、0.1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、0.1%的水解乳蛋白、0.1%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为8.0。
实施例8
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-2、IL-12、IL-15的混合物。
NK细胞激活因子的浓度为4.5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.05mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、1%的牛血清白蛋白、0.5%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.4%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为6.3。
实施例9
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-2。
NK细胞激活因子的浓度为1ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为7.4。
实施例10
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基。
NK细胞激活因子为IL-2、IL-12、IL-15的混合物。
NK细胞激活因子的浓度为5ng/mL。
NK细胞激活培养基包括：0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、1%的牛血清白蛋白、0.5%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.5%的甘氨酸。
NK细胞激活培养基的pH值为8.0。
对比例1
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基，NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-2，NK细胞激活培养基分别取以下6种：
1：NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸，pH7.4。
2：NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.5%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸，pH7.4。
3：NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸，pH7.4。
4：NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.5%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白，pH7.4。
5：NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.5%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、0.3%的甘氨酸，pH7.4。
6：NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.5%的牛血清白蛋白、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸，pH7.4。
将NK细胞激活因子分别与以上6种NK细胞激活培养基混合得6种NK细胞活性激活体系，分别标记NK细胞活性激活体系1-6，分别向6种NK细胞活性激活体系中加入正常人的血液样本，对样本中的NK细胞活性物质进行刺激培养，培养20小时后，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测，评价其信号值的差异性。
另取同一正常人的血液样本直接离心得到血浆，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测作为对照值，以此评价NK细胞活性激活体系对NK细胞活性物的刺激效果，结果如下表1。
表1：
从表1数据可知，6种NK细胞激活培养基均对样本中NK细胞活性物质的刺激有积极的作用，同时可以看出，NK细胞激活培养基1、2的效果优于其它几种。因NK细胞激活培养基1中各组分浓度更低，故优选NK细胞激活培养基1。
需要说明的是：PB或柠檬酸与Tris体系配制的NK细胞激活培养基性能相近，本对比例选用Tris体系进行其他组分的对比实验。
对比例2
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基，NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸，pH7.4，NK细胞激活因子分别取以下7种：
1：NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-2、IL-12的混合物；
2：NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-2、IL-15的混合物；
3：NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-2、IL-12、IL-15的混合物；
4：NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-12、IL-15的混合物；
5：NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-2；
6：NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-12；
7：NK细胞激活因子为5ng/mL的IL-15。
将NK细胞激活培养基分别与以上7种NK细胞激活因子混合得7种NK细胞活性激活体系，分别标记NK细胞活性激活体系1-7，分别向7种NK细胞活性激活体系中加入正常人的血液样本，对样本中的NK细胞活性物质进行刺激培养，培养20小时后，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测，评价其信号值的差异性。
另取同一正常人的血液样本直接离心得到血浆，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测作为对照值，以此评价NK细胞活性激活体系对NK细胞活性物的刺激效果，结果如下表2。
表2：
由表2可知，在正常人的血液样品中未能检测到NK细胞活性物质，而当经过NK细胞活性激活体系培养后的血液样品中NK细胞分泌的活性物质增多，且不同NK细胞激活因子的刺激效果不同。
经表2数据分析可知，组合NK细胞活性激活体系1、2、3、5对NK细胞活性物质的刺激效果优于NK细胞活性激活体系4、6、7，其中NK细胞活性激活体系5的成分单一，且刺激效果与其他相比差异不大，故优选IL-2作为NK细胞激活因子。
对比例3
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基，NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸，pH7.4，NK细胞激活因子为IL2，NK细胞激活因子的浓度分别取以下8种：0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；
将不同浓度的NK细胞激活因子溶解到NK细胞激活培养基中得7种NK细胞活性激活体系，每种浓度配制10份，分别向7种NK细胞活性激活体系中加入正常人的血液样本，对样本中的NK细胞活性物质进行刺激培养，培养20小时后，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测，每种NK细胞活性激活体系取10份结果的平均值作为最终结果，评价信号值的差异性以及不同NK细胞活性激活体系的精密性。
另取同一正常人的血液样本直接离心得到血浆，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测作为对照值，评价7种NK细胞活性激活体系对NK细胞活性物的刺激效果，结果如下表3。
表3：
由表3可得，在正常人的血液样品中未能检测到NK细胞活性物质，而经过NK细胞活性激活体系培养后的血液样品中NK细胞分泌的活性物质增多，且含有不同浓度NK细胞激活因子的NK细胞活性激活体系的刺激效果不同。
刺激物的用量上，含有浓度为1-10ng/mL的NK细胞激活因子的NK细胞活性激活体系刺激效果均满足要求，其中含有浓度为1ng/mL、2ng/mL的NK细胞激活因子的NK细胞活性激活体系的刺激信号值最高，刺激效果最明显，且其精密度合格。在综合考虑刺激效果与成本的情况下，优选浓度为1 ng/mL的NK细胞激活因子，此浓度远低于同类产品的10ng/mL浓度，有利于后期大规模生产的成本控制。
实验
一种NK细胞活性激活体系，包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基，NK细胞激活培养基包括0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、0.1%的牛血清白蛋白、0.1%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.3%的甘氨酸，pH7.4，NK细胞激活因子为IL2，NK细胞激活因子的浓度为1ng/mL；
1、取10个正常人的血液样本作为检测样本，每个正常人的血液样本为两份，其中一份分别加入到上述NK细胞活性激活体系中，对血液样本中的NK细胞活性物质进行刺激培养，培养20小时后，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测，评价其信号值；
另外一份血液样本分别离心得到血浆，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测作为对比，评价NK细胞活性激活体系对10个正常人的血液样本的NK细胞活性物的刺激效果，结果如下表4。
表4：
从表4可以看出，同一标本采集的血液刺激前后检测信号值差异较大，证明本培养管对NK细胞活性物质的增殖有积极的作用。
2、分别取血液样本1mL加入到5个上述NK细胞活性激活体系中进行平行培养，样本数量为3例，37℃培养20小时，离心分离得到上清血浆，使用NK细胞活性检测试剂盒进行检测，检测结果如下表5。
表5：
由表5数据可知，本发明基培养得到的NK细胞活性物质稳定、可靠，瓶间可控。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种NK细胞活性激活体系，其特征在于：包括NK细胞激活因子和NK细胞激活培养基，NK细胞激活因子为IL-2、IL-12、IL-15中的一种或几种，NK细胞激活因子的浓度为0.5ng/mL-5ng/mL，NK细胞激活培养基包括：0.01-0.1mol/L的PB或柠檬酸或Tris体系、0.1-1%的海藻糖、0.1-1%的牛血清白蛋白、0.1-0.5%的PEG6000、0.1-1%的水解乳蛋白、0.1-0.5%的甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性激活体系，其特征在于：所述NK细胞激活培养基的pH值为6.0-8.0。
3.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性激活体系，其特征在于：所述NK细胞激活因子为IL-2。
4.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性激活体系，其特征在于：所述NK细胞激活因子的浓度为1ng/mL。
5.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性激活体系，其特征在于：所述NK细胞激活培养基包括：0.1mol/L的Tris体系、1%的海藻糖、1%的牛血清白蛋白、0.5%的PEG6000、1%的水解乳蛋白、0.5%的甘氨酸。
6.根据权利要求5所述的一种NK细胞活性激活体系，其特征在于：所述NK细胞激活培养基的pH值为7.4。
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