JP2013006793A - Nk細胞を増幅するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、タクロリムス、その誘導体及び塩と、ダルテパリン、その誘導体及び塩とからなる群から選択される1種類又は2種類以上の化合物を含む、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)を増幅するための組成物を提供する。本発明は、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)を調製するステップと、タクロリムス、その誘導体及び塩と、ダルテパリン、その誘導体及び塩とからなる群から選択される1種類又は2種類以上の化合物の存在下で、前記NK細胞をインキュベーションするステップとを含む、NK細胞を増幅する方法を提供する。
【選択図】なし
Description
1.材料及び方法
(1)細胞の出所
臍帯血単核球細胞は、文書による説明と文書による同意とが得られた被験者の臍帯血から調製され、北海道臍帯血バンク内の液体窒素システムで凍結保存された。本実験は、北海道臍帯血バンク倫理委員会の承認(承認番号第005番、初回承認日:2005年1月20日)を得て実施された。
前記臍帯血単核球細胞の培養条件の検討には、GMPグレードの幹細胞培養用培地(CellGro SCGM、セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社)に、10ng/mLのIL−15(Peprotech、東洋紡績株式会社、ED50 <0.5 ng/mL、比活性> 2x106 U/mg)と、5ng/mLのIL−2(R&Dシステムズ、コスモ・バイオ株式会社、ED50は0.075−0.375 ng/mL)と、5%のヒトAB型血清(NOVA Biologics, Inc、コスモ・バイオ株式会社)とが添加された培地(以下、「2+15培地」と表される。)が基本培地として用いられた。前記2+15培地に、10ng/mLないし1mg/mLの抗CD3モノクローナル抗体(OKT3、Centocor Ortho Biotech Inc、ヤンセンファーマ株式会社)が添加された培地(以下、「2+3+15培地」と表される。)が調製された。タクロリムス及びダルテパリンの効果を検討する場合には、前記2+15培地(培養開始時のみ前記2+3+15培地)に、0.02−0.1ng/mLのタクロリムス(FK506、アステラス製薬株式会社)、及び/又は、5−10U/mLのダルテパリン(フラグミン(登録商標)、ファイザー株式会社)が添加された培地が用いられた。以下では、2+15培地にタクロニムスのみが添加された培地は、「+FK培地」と表され、2+15培地にダルテパリンのみが添加された培地は、「+F培地」と表され、2+15培地にタクロニムス及びダルテパリンが添加された培地は、「+FK+F培地」と表される。臍帯血単核球細胞は常法に従って解凍され、培地1mLあたり1×106個の濃度に調製され、フィーダー細胞なしで、市販の24穴培養プレート(ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)又はT−25フラスコ(ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)に播種され、37°C、5%CO2及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。前記細胞は、3−4日間毎に、新鮮な培地で2分の1ないし4分の1に希釈され、21日後に、以下のとおり細胞数及び細胞表面マーカーの解析に供せられた。
前記臍帯血単核球細胞の培養21日後の細胞数は、トリパンブルーで染色され、改良ノイバウエル血球計算盤を用いて計測された。前記臍帯血単核球細胞の培養開始時及び培養21日後における、T細胞(CD3+CD56−)、NK細胞(CD3−CD56+)及びNKT細胞(CD3+CD56+)を識別する細胞表面マーカーCD3及びCD56と、NK細胞及びNKT細胞の細胞傷害能に関与するグランザイムAと、NK細胞及びNKT細胞の細胞傷害性誘導シグナルレセプターNKG2D(CD314)とは、それぞれ、抗CD3抗体(Pharmingen、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)、抗CD56抗体(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)、抗グランザイムA抗体(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)及び抗NKG2D抗体(Immunotech、ベックマン・コールター株式会社)とを用いて、フロー・サイトメトリー法で解析された。有意性の検定はスチューデントt検定で行われた。
表1−1及び表1−2は前記臍帯血からのNK細胞(CD3−CD56+)の21日培養下での増幅に対する0.02ng/mL、0.05ng/mL又は0.1ng/mLのタクロリムス(以下、「+FK0.02」、「+FK0.05」又は「+FK0.1」と表す。)、及び/又は、5U/mLのダルテパリン(以下、「+F」と表す。)の効果を調べた実験結果を示す。各実験条件の標準偏差は、同一条件で5回繰り返された実験結果から算出された。表の「NK細胞の構成比率」では、フロー・サイトメトリー法により計測された、各実験群の全培養細胞中のNK細胞の割合が百分率で表される。表の「全細胞数」では、各実験群の21日後の全細胞数が1×106個の単位で表される。表の「NK細胞の増幅倍率」では、各実験群の21日培養後のNK細胞の数を培養開始時の臍帯血単核球細胞中に存在したNK細胞の数で除算した結果が表される。
1.材料及び方法
(1)細胞
タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地(+F+FK培地)で臍帯血単核球細胞が21日培養されて得られた細胞(以下、「本発明の方法で増幅された臍帯血由来NK細胞」という。)が、エフェクター細胞として用いられた。慢性骨髄性白血病細胞由来のK562株(以下、「K562」という。)と、未分化型の急性骨髄性白血病(AML(M0))細胞(以下、「AML」という。)と、第三者の同種PHA幼若化細胞(以下、「AlloPHA」という。)と、慢性期の慢性骨髄性白血病細胞(以下、「CML」という。)とが、標的細胞として用いられた。
本発明の方法で増幅された臍帯血由来NK細胞の細胞傷害活性(%)は、当業者に周知の方法で評価された。簡潔には、51Crで標識された標的細胞と、エフェクター細胞とが4時間混合培養された。その後、培養上清に遊離した51Crの放射線量が測定され、傷害された標的細胞の比率が、NK細胞の細胞傷害活性(%)として決定された(4時間51Cr遊離アッセイ)。エフェクター細胞と標的細胞との比(E:T)は、1対1、3対1、及び、10対1であった。
抗NKG2Dモノクローナル抗体(1D11、AbD(Serotec)、R&Dシステムズ、フナコシ株式会社)が、エフェクター細胞及び標的細胞をインキュベーションするときに最終濃度50μg/mLで添加された。
図2Aは、本発明の方法で増幅された臍帯血由来NK細胞のK562に対する細胞傷害活性を調べた実験結果を示すグラフである。縦軸は細胞傷害活性(単位:%)である。各実験条件の誤差棒は、同一条件で3回繰り返された実験結果の標準偏差を示す。E:Tが1:1のとき、細胞傷害活性は約55%であった。E:Tの比が、3対1と10対1とのとき、前記細胞傷害活性はともに80%を上回り、最大域に達した。
1.材料及び方法
(1)細胞の出所
末梢血単核球細胞は、文書による説明と文書による同意とが得られた被験者の末梢血から調製され、定法に従って凍結保存された。保存検体を使用する本実験は、北海道大学医学研究科医の倫理委員会によって平成13年2月23日に初回承認、平成20年11月6日に追加変更承認を得て実施された。
末梢血単核球細胞は、健常者と、同種幹細胞移植を施された白血病患者とから、常法に従って調製された。前記末梢血単核球細胞は、実施例1で説明された手順に従って、タクロリムス及びダルテパリンが添加された培地(+F+FK培地)で21日培養された。
前記末梢血単核球細胞の培養21日後の細胞数は、自動細胞計数装置により計測された。前記臍帯血単核球細胞の培養開始時及び培養21日後における、T細胞(CD3+CD56−)、NK細胞(CD3−CD56+)及びNKT細胞(CD3+CD56+)を識別する細胞表面マーカーCD3及びCD56は、実施例1と同様にフロー・サイトメトリー法で解析された。
表2は、0.02ng/mLのタクロリムス及び5U/mLのダルテパリンが添加された培地(+F+FK培地)で健常者の末梢血からNK細胞(CD3−CD56+)が21日培養された実験の結果を示す。標準偏差は、同一条件で6回繰り返された実験結果から算出された。表の「培養前」と「培養後」とは、それぞれ、培養開始時と、+F+FK培地での培養21日後とを表す。表の「NK細胞数」は、培養開始時(培養前)及び培養21日後(培養後)のNK細胞数が1×106個の単位で表される。表の「NK細胞の構成比率」では、フロー・サイトメトリー法により計測された、全培養細胞中のNK細胞の割合が百分率で表される。表の「NK細胞増幅倍率」では、+F+FK培地での21日培養後のNK細胞の数を培養開始時の末梢血単核球細胞中に存在したNK細胞の数で除算した結果が表される。
Claims (10)
- タクロリムス又はその誘導体又は塩と、ダルテパリン又はその誘導体又は塩とを含むことを特徴とする、NK細胞を増幅するための組成物。
- 感染症及び/又はがんを治療するために用いられることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記タクロリムス又はその誘導体又は塩はタクロリムスの濃度に換算して0.02ng/mLないし0.1ng/mLの濃度であり、前記ダルテパリン又はその誘導体又は塩はダルテパリンの濃度に換算して5U/mLないし10U/mLの濃度であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
- IL−2及びIL−15をさらに含むことを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- 前記IL−2は0.075ng/mLないし25ng/mLの濃度であり、前記IL−15は0.5ng/mLないし50ng/mLの濃度であることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- 抗CD3抗体をさらに含むことを特徴とする、請求項4又は5に記載の組成物。
- 前記抗CD3抗体は、OKT3の濃度に換算して10ng/mLないし1mg/mLの濃度であることを特徴とする、請求項6に記載の組成物。
- 自家血清、ヒトAB型血清、及び/又は、ヒト血清アルブミンをさらに含むことを特徴とする、請求項4ないし7のいずれか1つに記載の組成物。
- NK細胞を含む単核球細胞を調製するステップと、
請求項1ないし8のいずれか1つに記載の組成物の存在下で、前記NK細胞を培養するステップとを含むことを特徴とする、NK細胞を増幅する方法。 - 前記NK細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹(iPS)細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞と、臍帯血単核球細胞と、末梢血単核球細胞とからなる群から選択される細胞から調製されることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
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