JP2022513055A - 形質転換されたｔ細胞を用いた臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、形質転換されたＴ細胞を用いた臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の培養方法に関する。本発明の形質転換されたＴ細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法は、少量の種細胞からナチュラルキラー細胞を効果的に増殖させて製造することができる。また、ナチュラルキラー細胞の細胞殺害能も向上させる。したがって、本発明の形質転換されたＴ細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法は、細胞治療剤の商品化に有用である。さらに、本発明の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞は、細胞治療剤として有用である。【選択図】 図２Ｅ

Description

本発明は、形質転換されたＴ細胞を用いた臍帯血由来のナチュラルキラー細胞（自然殺害細胞）の培養方法に関する。

癌患者の治療及び再発防止のための治療法として、患者の免疫機能を用いた免疫治療法が開発されている。特に、大量生産及び凍結が可能なナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）を用いた免疫治療法が研究されている。ナチュラルキラー細胞は、末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の約１５％程度を占めるリンパ球系細胞であり、自然免疫反応において重要な役割を担う。

具体的に、ナチュラルキラー細胞は、樹状細胞を活性化させ、細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）を腫瘍に特異的に反応するように誘導して腫瘍細胞を除去する。ナチュラルキラー細胞は、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）及び白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）のような悪性腫瘍を直接に死滅させる。しかしながら、健康な人の体内に存在する大部分のナチュラルキラー細胞は、不活性化状態で存在し、腫瘍を除去するためには活性化したナチュラルキラー細胞が必要である。また、癌患者の体内に存在するナチュラルキラー細胞の場合、癌細胞の免疫回避機構によってナチュラルキラー細胞の機能的欠陥につながる。

したがって、ナチュラルキラー細胞を治療剤として用いるためには、ナチュラルキラー細胞を活性化させることが非常に重要である。また、体内のナチュラルキラー細胞の細胞数は限られているため、健康な人の血液又は患者の血液のナチュラルキラー細胞を大量に増殖させ凍結する技術の開発が必須である。

ナチュラルキラー細胞を大量に増殖させるための方法としては、体外増殖法を用い、末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＰＢＭＣ）、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ，ＣＢ）又はヒト誘導万能幹細胞（ｈｕｍａｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を原料としたナチュラルキラー細胞の大量培養法が研究されている。

特に、臍帯血は、骨髄とは違い、分娩後に廃棄される臍帯血から簡単な施術によって得ることができる。また、臍帯血の保管産業が活性化しており、ドナー（供与者）の獲得も容易であることから、臍帯血を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法に関する研究が活発に行われている。

具体的に、臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の体外増殖培養方法は、単核細胞（ＭＮＣ）を種細胞として用いて増殖する方法、及び造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ，ＣＤ３４＋細胞）を種細胞にして増殖する方法がある。単核細胞を種細胞として用いる方式は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、ＦＬＴ－３Ｌなどを単独で或いは混合使用してナチュラルキラー細胞の増殖を促進させるが、増殖率及び純度が低いという問題がある（Ｂｉｏｓｓｅｌ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４，１０３１－１０３８，２００８）。一方、造血前駆細胞を種細胞として増殖する方式は、増殖率が良く、純度が高いが、培養期間が長く、様々なサイトカインと成長因子を混合して使用しなければならないため、コスト面で商品化が困難である（Ｆｉａｓ Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３６（１）：６１－６８，２００８）。

ナチュラルキラー細胞の体外増殖培養には、ＰＢＭＣ、ＣＤ３－細胞、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６＋細胞などが種細胞として用いられ、ナチュラルキラー細胞増殖因子として、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などのサイトカインとＬＰＳ（Ｇｏｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１）：１３９－１４７，２０００）、ＣＤ３を刺激するＯＫＴ－３抗体（Ｃｏｎｄｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．２９（１）：１０４－１１３，２００１）が用いられる。上記の増殖因子だけでナチュラルキラー細胞を３倍～１０倍程度増殖させることができる。しかし、この程度の増殖率ではナチュラルキラー細胞を治療剤として商品化するには不十分である。

近年、様々なタイプのフィーダー（支持）細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）を用いてナチュラルキラー細胞を大量増殖させる方法が研究されている。フィーダー細胞として用いられている細胞株の代表には、末梢血単核細胞、ＥＢＶ－ＬＣＬ、Ｋ５６２細胞株がある。Ｋ５６２細胞株は、ＨＬＡが欠如した白血病由来の細胞株であり、ナチュラルキラー細胞が攻撃し易い代表的なターゲット細胞株である。ナチュラルキラー細胞を培養する多くのフィーダー細胞は、例えばＫ５６２細胞株に、４－１ＢＢＬと膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ）ＩＬ－１５を発現させて増殖させる方法（Ｆｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（９）：４０１０－４０１７，２００９）、ＭＩＣＡ、４－１ＢＢＬ、及びＩＬ－１５を発現させて増殖させる方法（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４６７－４７５，２０１０）、及び４－１ＢＢＬと膜結合ＩＬ－２１を発現させて増殖させる方法（Ｃｅｃｅｌｅ ＪＤ ｅｔ ａｌ，ＰｌｏＳＯＮＥ，７（１）：ｅ３０２６４，２０１２）などの既知の方法によって増殖される。

このような状況下で、本発明者は、臍帯血からナチュラルキラー細胞を効率的に増殖させるために、ナチュラルキラー細胞の増殖を高めることができる共刺激因子及び成長因子を発現させたＣＤ４＋Ｔ細胞と臍帯血由来のナチュラルキラー細胞を共培養して体外増殖させる方法を開発した。

具体的には、本発明者は、前記ＣＤ４（＋）Ｔ細胞をフィーダー細胞として用いたナチュラルキラー細胞培養の効率を増加させるために、形質転換されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞を製造した。前記形質転換されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞と臍帯血由来の単核細胞を共培養し、このような共培養によってナチュラルキラー細胞の増殖率及び細胞殺害能が増加することを確認し、本発明が完成された。

本発明の一態様は、形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞と種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌｓ）を共培養する段階を含むナチュラルキラー細胞の培養方法を提供する。

本発明の他の態様は、前記培養方法によって製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。

本発明の形質転換されたＴ細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法は、少量の臍帯血由来の種細胞からナチュラルキラー細胞を効果的に増殖させて製造することができる。また、このように製造されたナチュラルキラー細胞は、細胞殺害能が向上する。したがって、本発明の形質転換されたＴ細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法は、細胞治療剤の商品化に有用である。さらに、本発明の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞は、細胞治療剤として有用である。

Ｈｕｔ７８細胞株への遺伝子発現をＦＡＣＳによって確認した図である。 Ｈｕｔ７８細胞株に形質導入された単一遺伝子の発現をＦＡＣＳによって確認した図である。 Ｈｕｔ７８細胞株に形質導入されたｍＴＮＦ－α／ＯＸ４０Ｌ及びｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ二重遺伝子の発現をＦＡＣＳによって確認した図である。 Ｈｕｔ７８細胞株に形質導入されたｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ及びｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ二重遺伝子の発現をＦＡＣＳによって確認した図である。 Ｈｕｔ７８細胞株に形質導入された三重遺伝子の発現をＦＡＣＳによって確認した図である。 Ｈｕｔ７８細胞株に形質導入された四重遺伝子の発現をＦＡＣＳによって確認した図である。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の増殖率を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の増殖率を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の増殖率を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＰｅｅｒ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の増殖率を示す。 三重遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養中に、１４日或いは１６日の間隔で再刺激して製造したナチュラルキラー細胞の増殖率を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の生存率を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の生存率を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の生存率を示す。 遺伝子が形質導入されたＰｅｅｒ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の生存率を導入遺伝子別に示す。 三重遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養中に、１４日或いは１６日の間隔で再刺激して製造したナチュラルキラー細胞の生存率を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の純度（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の純度（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の純度（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＰｅｅｒ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の純度（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を示す。 三重遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養中に、１４日或いは１６日の間隔で再刺激して製造したナチュラルキラー細胞の純度（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の活性（ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋）を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫＧ２Ｄの発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫｐ３０の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫｐ４４の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫｐ４６の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＤＮＡＭ－１の発現レベルを導入遺伝子別に示す図である。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＣＸＣＲ３の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の活性（ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋）を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫＧ２Ｄの発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫｐ３０の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫｐ４４の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫｐ４６の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＤＮＡＭ－１の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＣＸＣＲ３の発現レベルを示す。 三重遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養するとき、１４日或いは１６日間隔で再刺激して製造したナチュラルキラー細胞の活性（ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋）及び表現型マーカーとしてのＮＫＧ２Ｄの発現レベルを示す。 三重遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養中に、１４日或いは１６日の間隔で再刺激して製造したナチュラルキラー細胞の表現型マーカーとしてのＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、およびＣＸＣＲ３の発現レベルを示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の細胞殺害能を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＨ９細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の細胞殺害能を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の細胞殺害能を示す。 異なる遺伝子が形質導入されたＰｅｅｒ細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養して製造したナチュラルキラー細胞の細胞殺害能を示す。 三重遺伝子が形質導入されたＨｕｔ７８細胞株と臍帯血由来のＣＤ３（－）単核細胞を共培養中に、１４日或いは１６日の間隔で再刺激して製造したナチュラルキラー細胞の細胞殺害能を示す。 Ｒａｊｉマウス動物モデルを用いたナチュラルキラー細胞の効能の評価のための投与スケジュールを示す。 Ｒａｊｉ動物モデルにおいてＮＫ細胞、ＲＴＸ及び併用投与の効能を確認するために生存率を測定した結果を示す。 Ｒａｍｏｓマウス動物モデルを用いたナチュラルキラー細胞の効能の評価のための投与スケジュールを示す。 Ｒａｍｏｓ動物モデルにおいてＮＫ細胞、ＲＴＸ及び併用投与の効能を確認するために生存率を測定した結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の一態様は、形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞と種細胞を共培養する段階を含むナチュラルキラー細胞の培養方法を提供する。

前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子、及びｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子が発現するものでよい。

具体的には、前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞は１つの遺伝子を発現してもよい。この場合、前記遺伝子は、４－１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ－２１、ＯＸ４０Ｌ又はｍＴＮＦ－αでよい。また、前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞は２つの遺伝子を発現してもよい。この場合、前記遺伝子の組合せは、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ、４－１ＢＢＬ／ＯＸ４０Ｌ、ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ、ｍｂＩＬ－２１／ｍＴＮＦ－α又はｍＴＮＦ－α／ＯＸ４０Ｌでよい。本発明の一実施例では、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ、ｍＴＮＦ－α／ＯＸ４０Ｌ、ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌの遺伝子の組合せをＴ細胞に導入した。

あるいは、前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞は３つの遺伝子を発現してもよい。この場合、前記遺伝子の組合せは、４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ、ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ／ｍＴＮＦ－α、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ又は４－１ＢＢＬ／ＯＸ４０Ｌ／ｍＴＮＦ－αでよい。本発明の一実施例では、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬの遺伝子の組合せをＴ細胞に導入した。

また、前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞は４つの遺伝子を発現してもよい。この場合、前記遺伝子の組合せは、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ／４－１ＢＢＬでよい。本発明の一実施例では、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ／４－１ＢＢＬの遺伝子の組合せをＴ細胞に導入した。

本発明で使われる用語‘４－１ＢＢＬ’とは、三重合体（ｔｒｉｍｅｒ）を形成して受容体である４－１ＢＢと結合するリガンドを指す。ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属し、ＣＤ１３７Ｌとも呼ばれる。前記４－１ＢＢＬ遺伝子は、ヒト由来のものでよい。

具体的には、前記４－１ＢＢＬ遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３８１１でよいが、これに限定するものではない。前記４－１ＢＢＬ遺伝子は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列でよい。前記配列番号１で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号２で表示される塩基配列でよい。

本発明で使われる用語‘ｍｂＩＬ－２１’とは、細胞膜に結合可能に設計されたＩＬ－２１でよい。このとき、ｍｂＩＬ－２１は、ＩＬ－２１と膜通過タンパク質が結合した融合タンパク質でよい。前記膜通過タンパク質は、ＣＤ８αでよい。具体的には、ＣＤ８αの膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）でよい。

具体的に、前記ＩＬ－２１遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０２１８０３．３でよいが、これに限定するものではない。また、前記ＣＤ８α遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１７６８でよいが、これに限定するものではない。前記ｍｂＩＬ－２１は、細胞膜に結合したＩＬ－２１形態で発現する。また、前記ｍｂＩＬ－２１遺伝子は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列でよい。前記配列番号３で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号４で表示される塩基配列でよい。

本発明で使われる用語‘ＯＸ４０Ｌ’は、ＴＮＦＳＦ４、ｇｐ３４、ＴＸＧＰ１、ＣＤ２５２及びＣＤ１３４Ｌとも呼ばれ、ＯＸ４０に結合するリガンドを指す。具体的には、前記ＯＸ４０Ｌ遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００３３２６でよいが、これに限定されるものではない。前記ＯＸ４０Ｌ遺伝子は、配列番号５で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列でよい。前記配列番号５で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号６で表示される塩基配列でよい。

本発明で使われる用語‘ｍＴＮＦ－α’は、腫瘍壊死因子－アルファ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ）のアミノ酸配列においてＴＡＣＥ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）認識部位であるアラニン－バリン（Ａｌａｎｉｎｅ－Ｖａｌｉｎｅ）をプロリン－バリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ－Ｖａｌｉｎｅ）となるようにＤＮＡ上で点変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）させた遺伝子を指す。アラニンをプロリンに変異させたものは、ランダムに選択される。

具体的に、前記ｍＴＮＦ－α遺伝子は、配列番号８で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列でよい。前記配列番号８で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号９で表示される塩基配列でよい。

前記４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子又はｍＴＮＦ－α遺伝子は、組換えレンチウイルスを介して導入されてもよいが、遺伝子導入ベクターは組換えレンチウイルスに限定されない。

前記遺伝子を細胞内に形質導入させる方法は、生化学的方法、物理的方法又はウイルスを媒介とする形質導入方法が用いられてもよい。また、生化学的方法として、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）又はＥｘＧｅｎ ５００（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，ＣＡＮＡＤＡ）を用いることができる。また、リポフェクタミンを用いた脂質媒介トランスフェクションを用いることができる。

本発明で使われる用語“ベクター”とは、ベクター内に導入された遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物（遺伝子構成物）を指す。前記ベクターは、導入された細胞で標的遺伝子を発現させることができる発現ベクターであり得る。

また、前記遺伝子含有発現ベクターは、ＣＤ４＋細胞株で発現させることができるいずれの発現ベクターも用いることができ、本発明の具体的な実施例では、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（ＳＢＩ，ＣＤ５１０Ｂ－１）又はｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｎｅｏ（ＳＢＩ，ＣＤ５１４Ｂ－１）レンチウイルスベクターを使用した。

前記レンチウイルスは、長期間の潜伏期を特徴とするレトロウイルス科のウイルスを指す。レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡ内に遺伝情報を伝達することができる。レンチウイルスを使用することは、非分裂細胞において複製可能な遺伝子伝達ベクターの最も効果的な使用方法の一つである。

前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞、体外拡張培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋細胞株（Ｔリンパ腫細胞株）でよい。また、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は補助Ｔ細胞であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞と癌細胞を融合して得たハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）でよい。具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｈｕｔ７８、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｌｏｕｃｙ、Ｍｏｌｔ－３、Ｍｏｌｔ－１３、Ｐｅｅｒ、ＲＰＭＩ８４０２及びＴＡＬＬ－０１細胞からなる群から選択されるいずれか一つでよい。好ましくは、Ｈｕｔ７８、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ又はＰｅｅｒ細胞でよい。

本発明で使われる用語‘フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）’とは、培養補助細胞とも呼ばれ、増殖することはできないが、代謝活性があるので、様々な代謝物質を生産して標的細胞の増殖を助ける細胞を指す。前記フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子及びｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子が発現する形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞でよい。

前記フィーダー細胞として用いられるＴ細胞は、分裂／増殖が抑制された不活性化細胞又は非活性化細胞でよく、好ましくは、安全性を確保するために不活性化させる。不活性化させるには、当業界に既知の適切な方法を用いればよく、例えば、ガンマ線（ｇａｍｍａ－ｒａｙ）を照射する方法を用いることができる。不活性化させていないＴ細胞を用いる場合、大部分が腫瘍細胞であるから、活性化したナチュラルキラー細胞によって培養中に死滅し得る。

本発明で使われる用語“種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）”とは、適切な培養によってナチュラルキラー細胞に増殖できる細胞を指す。具体的には、前記種細胞は、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）由来の単核細胞又は臍帯血由来のナチュラルキラー細胞でよいが、これに限定されない。好ましくは、前記種細胞は、ＣＤ３（＋）細胞を除去したＣＤ３（－）細胞であってもよい。

前記ナチュラルキラー細胞の培養方法は、フィーダー細胞と種細胞の比率を０．１以上：１の比率で混合して培養すればよい。具体的には、フィーダー細胞と原料細胞の比は０．１：１～５０：１でよい。より具体的には０．５：１～４０：１でよい。より具体的には１：１～３０：１でよい。最も具体的には２：１～２０：１でよい。一具体例において、フィーダー細胞と種細胞の比は２．５：１でよいが、特にこれに限定されない。前記“比率”は、フィーダー細胞と種細胞の細胞数を基づいている。

前記ナチュラルキラー細胞の培養方法において、種細胞はフィーダー細胞と１回混合して５日～６０日培養、或いはフィーダー細胞と２回以上混合して６０日以上培養することができる。好ましくは、種細胞は、フィーダー細胞と１回混合して１４日～２１日培養されるが、これに限定されない。

本発明のナチュラルキラー細胞培養方法によれば、ＡＩＭ－Ｖ ｍｅｄｉａ、ＲＰＭＩ１６４０、ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ、Ｘ－ＶＩＶＯ２０、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭのような通常の動物細胞培養培地にナチュラルキラー細胞及びＴリンパ腫細胞株を共培養する。共培養時に、Ｔ細胞に低い親和性を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体及びインターロイキンを添加して培養してもよいが、これに限定されない。

本発明で使われる用語‘Ｔ細胞に低い親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体’とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合して抗原認識複合体を形成する分子群であるＣＤ３抗原に特異的に反応するタンパク質を指す。前記ＣＤ３分子は、ＴＣＲと比較して細胞内領域が長く、抗原認識シグナルを細胞内に伝達する役割を担う。

Ｔ細胞に低い親和性を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体は、好ましくは、抗ＣＤ３抗体でよい。具体的には、抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ－３、ＵＣＨＴ１又はＨＩＴ３ａでよい。

本発明で使われる用語‘インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）’とは、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）内の一つの群であり、リンパ球や単核細胞及びマクロファージなどの免疫担当細胞が生産するタンパク質性生物活性物質を指す。前記インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８又はＩＬ－２１でよい。

本発明の一実施例では、ＯＫＴ－３抗体とＩＬ－２を添加して培養した。添加するＯＫＴ－３抗体の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ～１，０００ｎｇ／ｍｌでよい。好ましくは、ＯＫＴ－３抗体の濃度は、１０ｎｇ／μｌでよい。ＩＬ－２の濃度は、１０Ｕ／ｍｌ～２，０００Ｕ／ｍｌでよい。好ましくは、ＩＬ－２の濃度は、１，０００Ｕ／ｍｌでよい。また、血清又は血漿とリンパ球の増殖を支持する追加の増殖因子を添加して培養することができる。培地に添加する血清又は血漿の種類は特に限定されず、市販されている各種動物由来の血清又は血漿を用いることができる。好ましくは、ヒト由来の血清又は血漿を用いることができる。

本発明の用語“培養”とは、人工的に適切に調節した環境条件で細胞を増殖させることを指す。前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞の培養は、当業界に広く知られている適切な方法を用いて行うことができる。具体的には、前記培養は、バッチ工程又は注入バッチ（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ）工程により、又は反復注入バッチ工程（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）により連続して行うことができる。

また、培養培地に適切な前駆細胞を用いてもよい。上記の原料は、培養過程で培養物に適切な方式によってバッチ式、注入バッチ式又は連続式で添加すればよいが、特にこれに限定されない。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物あるいはリン酸又は硫酸のような酸化合物を適切な態様で用いて培養物のｐＨを調節することができる。

前記Ｔ細胞をフィーダー細胞として用いる培養方法は、種細胞から選択的にナチュラルキラー細胞の培養を誘導し、ドナーのＰＢＭＣフィーダー細胞を使用する場合に比べて、ナチュラルキラー細胞の増殖時にドナーによるバラツキがないため、安定して培養できる。また、ドナーのＭＮＣをフィーダー細胞として用いる場合、臍帯血種細胞は体外培養が難しい。したがって、Ｔ細胞をフィーダー細胞として用いる培養により、多量の治療用ナチュラルキラー細胞治療剤を効率的に且つ安定的に確保することができる。

本発明のさらなる態様は、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法によって製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。

前記ナチュラルキラー細胞の培養方法によって培養されたナチュラルキラー細胞は、凍結が可能であり、再び解凍する場合にも細胞の機能を失うことはない。また、ＮＫｐ４６のような活性化受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が高いため、腫瘍細胞株に対する殺害能及びサイトカイン分泌が増加し、優れた抗癌効果が期待できる。したがって、臨床適用が可能な多量の活性化したナチュラルキラー細胞を用いて、腫瘍治療に有効な細胞治療剤を製造することができる。

また、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法によって製造されたナチュラルキラー細胞は、感染性疾患の予防又は治療用組成物の有効成分として用いることができる。この場合、全重量に対して１０～９５重量％の量で存在していてもよい。また、感染性疾患の予防又は治療用の組成物は、前記有効成分の他に、同一又は類似の機能を示す１つまたは複数の有効成分をさらに含むことができる。

前記感染性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物は、投与のために、上記の有効成分の他、薬学的に許容可能な１つまたは複数担体を共に処方することができる。

前記感染性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた有効成分及び他の成分の種類及び含有量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節されてよい。ただし、所望の効果のために、本発明に係るナチュラルキラー細胞の投与量は、０．０１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ～１．０×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｋｇでよく、０．５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ～１．０×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｋｇでよい。このとき、投与は、１日に１回で投与してもよく、分割して投与してもよい。

また、前記感染性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物は、当業界に公知の様々な方法で個体に投与することができる。前記投与経路は、投与方法、体液の量、粘性度などを考慮して当業者が適切に選択することができる。

本発明のさらに他の態様は、形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞を有効成分として含むナチュラルキラー細胞の培養用組成物を提供する。本発明で用いられるＣＤ４＋Ｔ細胞及び該細胞に導入される遺伝子については既に詳述したので、過度な重複を避けるためにその記載を省略する。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明を限定するためのものではない。

実施例１．組換えレンチウイルス作製

実施例１．１．組換えレンチウイルスベクター作製

レンチウイルスベクターとして、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（ＳＢＩ，ＣＤ５１０Ｂ－１）又はｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｎｅｏ（ＳＢＩ、ＣＤ５１４Ｂ－１）を使用した。４－１ＢＢＬ（ＴＮＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ９、ＴＮＦＳＦ９）、ｍｂＩＬ－２１（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ ＩＬ－２１）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ４（ＴＮＦＳＦ４）ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １）及びｍＴＮＦ－α（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ ＴＮＦ ａｌｐｈａ）を導入遺伝子として使用した。

具体的には、４－１ＢＢＬ遺伝子（配列番号２）は、４－１ＢＢＬ遺伝子発現ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ＲＣ２１１１６０）を使用した。ｍｂＩＬ－２１遺伝子（配列番号４）は、コドン最適化（ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｍｂＩＬ－２１遺伝子配列が挿入されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＵＳ）を使用した。ＯＸ４０Ｌ遺伝子（配列番号６）の合成は、バイオニア社（Ｂｉｏｎｅｅｒ）に依頼した。

ｍＴＮＦ－α遺伝子（配列番号９）は、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）からＲＮＡを抽出した後、ＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）－ＰＣＲでＣＤＳを得た。ＴＮＦ－αは、分泌されるためにＴＡＣＥ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）によって切断された。この切断のため、ＴＮＦ－αアミノ酸配列においてＴＡＣＥ認識部位であるＡ－Ｖ（Ａｌａｎｉｎｅ－Ｖａｌｉｎｅ）をＰ－Ｖ（Ｐｒｏｌｉｎｅ－Ｖａｌｉｎｅ）となるようにＤＮＡ上で点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こして細胞膜に付着された状態に維持させた。前記点突然変異は、配列番号７で表示されるヒトｍＴＮＦ－α遺伝子において２２６番目の塩基であるグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）をシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）に置換し、２２８番目の塩基であるアデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）をグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）に置換して行った。

それぞれの導入遺伝子に適合するプライマーを用いて導入遺伝子のＣＤＳ（Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をＰＣＲで増幅させた（表１）。

前記表１は、実験に使用されたプライマーを示すものである。導入遺伝子とレンチウイルスベクターを制限酵素としてＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理した。その後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３９６４９）を用いてライゲーションさせた。ライゲーションさせたレンチウイルスベクターをＤＨ５α水溶性細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換させて培養した。形質転換させたＤＨ５α水溶性細胞からプラスミドミニ調製キット（ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐ ｋｉｔ）（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ／７４０４２２．５０）を用いてプラスミドＤＮＡを得た。全プラスミドＤＮＡは、外部会社にシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を依頼し、ＤＮＡ配列が一致することを確認した。また、外部製作会社に外注して、ｃＬＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（ピューロマイシン）又はｃＬＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏ（ネオマイシン）、ｃＬＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－Ｂｓｄ（ブラストサイジン）に、所望の導入遺伝子を上記と同じ方法で挿入した。

実施例１．２．濃縮されたレンチウイルス作製

組換えレンチウイルス生産のために、２９３Ｔ細胞株を形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）２日前に１．５×１０^６～２×１０^６ｃｅｌｌｓで７５Ｔフラスコ（Ｎｕｎｃ，１５６４９９）に接種し、５％ ＣＯ_２、３７℃条件のインキュベーターで培養した。２９３Ｔ細胞の細胞飽和度が８０％～９０％程度になった時、６ｍｌ ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，３１９８５－０８８）に培地を入れ換え、３７℃で５％ ＣＯ_２条件で３０分間培養した。ＤＮＡ混合液とリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１６６８５００）混合液を調製した（表２）。

前記それぞれの混合液成分をボルテキサー（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）を用いてよく混ぜて常温で３分間放置した。その後、両混合液を混ぜて常温で２０分以上放置した。ＤＮＡとリポフェクタミンが混合された溶液２ｍｌを、培地を６ｍｌ ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地で培養中である２９３Ｔ細胞で処理した。４時間後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，１１９９５０７３）培地に入れ換え、４８時間３７℃で５％ ＣＯ_２条件で培養した。４８時間培養した２９３Ｔ細胞の培養液８ｍｌを回収して０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＨＰ０３３ＲＳ）で濾過した。濾過した培養液をＵｌｔｒａｃｅｌ－１００メンブレイン付きＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ ｗｉｔｈ Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１００ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｍｅｒｃｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ９１００９６）を用いて２５０μｌ以下に濃縮した。濃縮されたウイルスは適切量で分注し、－８０℃で保管した。

実施例２．遺伝子導入Ｔ細胞作製

実施例２．１．レンチウイルス感染

培養中の０．５×１０^６個の細胞株と１ｍｌ ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地、５０μｌレンチウイルス解凍液、１０μｇ／ｍｌポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃ２０１３）を混合して６－ウェルプレート（６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，１４０６７５）に入れて１８００×ｇ、３２℃で９０分間回転接種（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を行った。その後、２時間５％ ＣＯ_２、３７℃条件のインキュベーターで培養した後、既存の培養培地に入れ換えて４８時間培養した。

Ｈｕｔ７８細胞株（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ－１６１（商標））は、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＩＭＤＭ（ＡＴＣＣ，３０－２００５）培地で培養した。継代培養時、細胞濃度は１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ～２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに維持した。Ｈ９細胞株（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－１７６（商標））とＪｕｒｋａｔ細胞株（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ－１５２（商標））は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ，３０－２００１）培地で培養した。継代培養時、細胞濃度はそれぞれ１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ～１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌと０．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ～１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに維持した。Ｐｅｅｒ細胞株は、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。継代培養時、細胞濃度は３．０×１０^５～５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに維持した。全細胞株の継代培養は２日～３日間隔で行った。培養容器は７５Ｔフラスコを使用し、培地量は１５ｍｌ～２０ｍｌに維持した。

組換えレンチウイルスに感染した細胞株は、抗生剤を用いてスクリーニングした（表３）。

前記表３は、遺伝子が導入された細胞株に使用された抗生剤を示すものである。

実施例２．２．導入遺伝子の発現確認

前記実施例ではフローサイトメトリーによって導入遺伝子の発現を確認した。実施例２．１．で継代培養された細胞株を回収して１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、培養液を吸入（ｓｕｃｔｉｏｎ）して除去した。ＰＢＳに２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加してＦＡＣＳバッファーを作った。１ｍｌのＦＡＣＳバッファーで希釈して細胞数をカウントし、５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度になるようにＦＡＣＳバッファーで希釈した。５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Ｆａｌｃｏｎ，３５２０５２）に希釈した細胞溶液を１００μｌずつ入れた。抗ヒトＴＮＦ－ａ（ｍｅｍｂｒａｎｅ）－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＡＢ２１０Ｐ）、抗ヒトＯＸ４０Ｌ－ＰＥ（ＢＤ，５５８１８４）、抗ヒト４－１ＢＢＬ－ＰＥ（ＢＤ，５５９４４６）、抗ヒトＩＬ－２１－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－７２１９－４２）、７－ＡＡＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ，ＩＭ３６３０ｃ）、ＰＥマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５７４９）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール（ＢＤ，５５０７９５）抗体で染色した後、ＦＡＣＳによって各遺伝子の発現率を分析した（図１Ａ～図１Ｆ）。

また、ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ）を用いて形質導入された遺伝子の発現を確認した。実施例２．１．で継代培養した細胞株を回収して１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、培養液を吸入（ｓｕｃｔｉｏｎ）して除去した。ＰＢＳで希釈して細胞数をカウントし、１×１０^６の細胞からＲＮＡ調製キットを用いてＲＮＡを抽出して定量した。また、ｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを用いてＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ＲＴ－ｑＰＣＲに使用されたプライマーは、下記表４の通りである。

細胞株における形質導入遺伝子の発現量を、下記表５に示す。

前記表５から、細胞株に形質導入すると、させた遺伝子の発現量の増加が誘導されることを確認した。

実施例３．ＣＤ３（－）ＰＢＭＣと遺伝子導入Ｔ細胞との共培養

実施例３．１．臍帯血由来のＣＤ３（－）ＰＢＭＣ種細胞の準備

研究用の臍帯血を５０ｍｌチューブに入れて１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上層の血漿を除去し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＬＯＮＺＡ，１７－５１６Ｑ）を１：１の比率で追加した。その後、フィコール密度勾配遠心分離（ｆｉｃｏｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－１４４０－０３）を用いて臍帯血単核細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＭＮＣ）を分離した後、ＡＤＡＭ細胞カウンターシステム（ＡＤＡＭ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｎａｎｏ Ｅｎｔｅｘ）を用いて細胞数をカウントした。

ＣＤ３（＋）細胞を除去した種細胞を得るために、まず、５×１０^７個の臍帯血単核細胞を新しい５０ｍｌチューブに移した後、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。ＰＢＳに２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと２ｍＭ濃度のＥＤＴＡが含まれたＭＡＣＳランニングバッファーを製造した。遠心分離を終えた後、ペレットに４００μｌのＭＡＣＳランニングバッファーと１００μｌのＣＤ３自己ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０５０－１０１）を入れて４℃で２０分間反応させた。１０ｍｌ ＭＡＣＳランニングバッファーで培養物を洗浄した後、１３，５００ｒｐｍ、４℃で８分間遠心分離し、０．５ｍｌのＭＡＣＳランニングバッファーに懸濁した。

ＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にＣＳカラム（ｃｏｌｕｍｎ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０４１－３０５）を装着して細胞を分離した。最終体積が２０ｍｌになるまでカラムを洗浄して細胞を回収した。回収した細胞を新しい５０ｍｌチューブに入れて１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、凍結培地に懸濁した。ＡＤＡＭ細胞計数器システムを用いて細胞数をカウントし、１バイアル（ｖｉａｌ）当たり５×１０^６個の細胞を液体窒素で凍結した。

各バイアル内の凍結されたＣＤ３（－）臍帯血単核細胞を、３７℃の恒温水槽（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で解凍して５０ｍｌチューブに移し、０．６％（ｖ／ｖ）ＡＣＤ（Ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃ３８２１）、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｓｅｒｕｍ ｂｏｖｉｎｅ）と２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳで懸濁し、１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。ＣＤ３（－）臍帯血単核細胞をＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ，２０８０２－０５００）に懸濁し、ＡＤＡＭ細胞カウンターシステムを用いて細胞数をカウントした。ＣＤ３（－）臍帯血単核細胞を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した。

実施例３．２．ＣＤ３（－）臍帯血単核細胞と遺伝子導入Ｔ細胞との共培養

実施例２で製造した形質導入された（トランスジェニック）Ｔ細胞を培養フラスコから回収し、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。その後、ＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁し、ＡＤＡＭ細胞カウンターシステムを用いて細胞数をカウントした。トランスジェニックＴ細胞を２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射機を用いて２０，０００ｃＧｙで照射して不活性化させて準備した。

ナチュラルキラー細胞培養は以下の手順で行った。１，０００ＩＵのＩＬ－２（プロロイキン注射、韓国ノバルティス）と１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１６－００３７－８５）を培養プラスチックプレートに入れた。培養０日目にＣＤ３（－）臍帯血単核細胞とトランスジェニックＴ細胞を１：２．５の比率でそれぞれ０．２５ｍｌ入れ、２％（ｖ／ｖ）ヒト血漿が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を０．２５ｍｌ入れて、３７℃のインキュベーターで４日間静置培養した。

培養４日目に、１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿、１，０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を同量入れた後、再び静置培養した。その後、２日～３日の間隔で細胞数をカウントし、濃度が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿、１，０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を追加しつつ２１日目まで浮遊培養した。２１日目まで浮遊培養して増殖されたナチュラルキラー細胞を得た。この時、Ｊｕｒｋａｔ細胞株又はＰｅｅｒ細胞株をフィーダー細胞として使用した場合、１１日目まで浮遊培養した。Ｈ９及びＨｕｔ７８細胞株に遺伝子を導入してフィーダー細胞として使用した場合、２１日目まで浮遊培養した。

培養されたナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、総有核細胞数（Ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ，ＴＮＣ）に基づくと、遺伝子が導入されていないＨｕｔ７８細胞株と共培養すると、９３倍に増殖した。一つ以上の遺伝子（ｍＴＮＦ－α、ｍｂＩＬ－２１、４－１ＢＢＬ）が導入されたＨｕｔ７８細胞株と共培養すると、著しくナチュラルキラー細胞の増殖率が上がることを確認した。特に、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬの遺伝子が導入されたＨｕｔ７８細胞株と共培養すると、９５７倍に増殖した。また、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬが導入されたＨｕｔ７８細胞株と共培養したとき、１，１３８倍増殖した（表６、図２Ａ）。

また、遺伝子が導入されていないＨ９細胞株と共培養すると、１３倍に増殖したが、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ又はｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬが導入されたＨ９細胞株と共培養すると、それぞれ３６７倍、９７９倍に増殖した（表７及び図２ｂ）。

他の細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞株又はＰｅｅｒ細胞株と共培養すると、培養１１日目まで培養が可能であった。ｍｂＩＬ－２１／４．１ＢＢＬ遺伝子が導入された細胞株または、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入された細胞株において相対的に高い増殖率を示した。（表８及び表９、図２Ｃ及び図２Ｂ）

上記の結果は、臍帯血単核細胞から分離されたＣＤ３（－）細胞を、遺伝子が導入されたフィーダー細胞に２１日間培養して、ナチュラルキラー細胞を培養することが可能であることを示し、非トランスジェニックフィーダー細胞に比べて高い増殖率を示した。

実施例３．３．ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入されたＨｕＴ７８細胞を用いたナチュラルキラー細胞培養の再刺激

実施例２で準備したトランスジェニックＴ細胞を培養フラスコから回収し、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。その後、ＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁し、ＡＤＡＭ細胞計数器システムを用いて細胞数をカウントした。トランスジェニックＴ細胞を濃度が２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射機を用いて２０，０００ｃＧｙで照射して不活性化させた。

ナチュラルキラー細胞を以下のように培養した。まず、１，０００ＩＵのＩＬ－２と１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３を培養プラスチックプレートに入れた。培養０日目にＣＤ３（－）臍帯血単核細胞とトランスジェニックＴ細胞を１：２．５の比率でそれぞれ０．２５ｍｌ～１ｍｌ入れ、２％（ｖ／ｖ）ヒト血漿が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を０．２５ｍｌ～１ｍｌ入れ、３７℃のインキュベーターで４日間静置培養した。

培養４日目に１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿、１，０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を同量で入れた後、再び静置培養した。その後、２日～３日間隔で細胞数をカウントし、濃度が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿、１，０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して培養した。

再刺激のために、培養０日目にｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入されたＨｕＴ７８細胞を同じ比率で使用した。培養１６日目に最初の再刺激を与えた。まず、ＡＤＡＭ細胞カウンターシステムを用いて培養中のナチュラルキラー細胞の数をカウントし、１．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈して０．２５ｍｌを培養プラスチックプレートに準備した。ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が形質導入されたＨｕＴ７８細胞は、２．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射によって１０，０００ｃＧｙで照射して不活性化させた。

不活性化させたｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入されたＨｕＴ７８細胞を培養プラスチックプレートに０．２５ｍｌ入れた。１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２と１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３、１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿を培養プラスチックプレートに入れ、３７℃のインキュベーターで３日間静置培養した。その後、２日～３日間隔で細胞数をカウントし、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿と１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を追加して培養した。最初の再刺激後１４日間隔で同じ方法でそれぞれ培養３２日目、４６日目、６０日目にフィーダー細胞を用いた再刺激を行い、７０日目まで培養を行った。

その結果、最初の再刺激後の培養３２日目にナチュラルキラー細胞の増殖率は６．９×１０^４倍、二回目の再刺激後には３．７×１０^６倍であり、三回目の再刺激後の培養６０日目には２．３×１０^８倍、四回目の再刺激を与えた後の培養７０日目には５．９×１０^９倍となり、持続的に増殖が維持され、高い増殖率を示した（表１０、図２Ｅ）。

表１０の結果は、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が形質導入されたＨｕＴ７８細胞株に周期的な再刺激を与えた場合、増殖倍数が継続的に増加し、優れたフィーダー細胞として使用できることを示している。

実験例１．導入遺伝子によるナチュラルキラー細胞の細胞生存率確認

イン－ビトロ（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ）細胞生存率を比較、評価するために、細胞内の核と結合可能なＰＩ染色液を使用する細胞カウンター（Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ）の一つであるＡＤＡＭ細胞カウンターシステムを用いた。カウントされた総細胞数から死滅細胞数を引いて生存細胞数を求めた後、下記式Ｉを用いて細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を算出した。

［式Ｉ］
細胞生存率（％）＝（生存細胞数／総細胞数）×１００

遺伝子が導入されたＨｕＴ７８細胞株と共培養したナチュラルキラー細胞の場合、遺伝子導入の有無に関係なく、９０％前後の生存率を示した（表１１、図３Ａ）。

Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ又はＰｅｅｒ細胞株の場合、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入された細胞株、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入された細胞株で培養されたナチュラルキラー細胞の生存率は、培養２１日目（Ｈ９）、および培養１１日目（Ｊｕｒｋａｔ、Ｐｅｅｒ）に９０％以上の生存率を示した（表１２～表１４、図３Ｂ～図３Ｄ）。

また、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入されたＨｕＴ７８細胞株で再刺激回数を増やしながら培養した結果、ナチュラルキラー細胞の生存率は、再刺激回数が増加したにもかかわらず約９０％以上の高い生存率を示した（表１５、図３Ｅ）。

このことから、長期間の継続培養でもナチュラルキラー細胞は高い生存レベルを維持するので、ナチュラルキラー細胞の長期間の増殖培養が可能であることを確認した。

実験例２．ナチュラルキラー細胞の純度確認

２１日間培養されたナチュラルキラー細胞又は反復的な再刺激で培養されたナチュラルキラー細胞を回収して１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養液を吸入して除去した。１ｍｌのＦＡＣＳバッファーで希釈した後に細胞数をカウントし、５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＦＡＣＳバッファーで希釈した。５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Ｆａｌｃｏｎ，３５２０５２）に希釈した細胞溶液を１００μｌずつ入れ、下記の抗体で表現型を分析した：

チューブ１：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５３３２）、抗ヒトＣＤ１６－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５４０７）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５６２７５１）

チューブ２：抗ヒトＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５３９７）、抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５４１３）、抗ヒトＣＤ３－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５６２４３８）

チューブ３：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫＧ２Ｄ－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＦＡＢ１３９Ｐ）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１

チューブ４：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫｐ３０－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５８４０７）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１

チューブ５：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫｐ４４－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５８５６３）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１

チューブ６：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫｐ４６－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５７９９１）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１

チューブ７：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＤＮＡＭ－１－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５９７８９）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１

チューブ８：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＸＣＲ３－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５７１８５）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１

チューブ９：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＰＥマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５７４９）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１

チューブ１０：ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５７４８）、ＰＥマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール、ＢＶ４２１マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５６２４３８）

各チューブの細胞は、３つの蛍光抗体のうち１つの抗体で染色された。具体的には、チューブ１は抗ヒト（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ）ＣＤ５６抗体で、チューブ２は抗ヒトＣＤ３抗体で、チューブ３から９までは抗ヒトＣＤ５６抗体で、チューブ１０はアイソタイプコントロール抗体でそれぞれ染色された。

前記各チューブの細胞を３０分間冷蔵温度として染色した。その後、染色した細胞に２ｍｌ ＦＡＣＳバッファーを加え、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液を除去し、再び２ｍｌ ＦＡＣＳバッファーを加えて２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。再び上澄み液を除去し、２００μｌのｃｙｔｏｆｉｘバッファー（ｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ，ＢＤ，５５４６５５）を加えて懸濁した後、ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞の確認及び純度と表現型を調べた。

臍帯血単核細胞から分離されたＣＤ３（－）細胞を、遺伝子を導入したＨｕＴ７８細胞株と２１日間共培養した後に、ナチュラルキラー細胞の同定及び純度を分析した結果、遺伝子導入の有無に関係なく、全ての条件でナチュラルキラー細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）含有量が９０％以上と高いことを確認した（表１６、図４Ａ）。

Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ又はＰｅｅｒ細胞株の場合も、遺伝子が非導入の場合に比べて、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子又はｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子を導入した細胞株と共培養したナチュラルキラー細胞の純度がより高く維持されることを確認した（表１７～表１９、図４Ｂ～図４Ｄ）。

また、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬの３つの遺伝子が導入された細胞株で再刺激回数を増やしながら培養されたナチュラルキラー細胞は、培養６０日目までナチュラルキラー細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）含有量が９０％以上と高いことを確認した（表２０、図４Ｅ）。

実験例３．ナチュラルキラー細胞の活性マーカー分析
また、臍帯血単核細胞から分離されたＣＤ３（－）細胞を、遺伝子が導入されたフィーダー細胞と２１日間共培養した後、代表的なナチュラルキラー細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現を分析した。

ＨｕＴ７８細胞株と共培養した場合、ＣＤ１６はいずれも高レベルで発現し、活性マーカーであるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１が、遺伝子非導入や単一遺伝子導入のフィーダー細胞に比べて、二重遺伝子導入のフィーダー細胞においてドナー間のバラツキ（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）無くいずれも高レベルで発現した（図５Ａ～図５Ｇ）。

また、Ｈ９細胞株と共培養した場合、遺伝子を非導入した場合に比べてｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子とｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬの３つの遺伝子が導入されたフィーダー細胞と共培養した場合に、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ－１、ＣＸＣＲ３の発現レベルがより高くなることを確認した。他の活性マーカーであるＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６の発現は、ドナー間のバラツキ無く高く発現した。したがって、二重及び三重遺伝子導入のフィーダー細胞は、ＮＫ細胞の活性及び腫瘍ターゲッティング能力を高めることができる有用なフィーダー細胞であることを確認した（図６Ａ～図６Ｇ）。

また、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬの３つの遺伝子が導入されたＨｕｔ７８細胞株を用いて再刺激して共培養したナチュラルキラー細胞の表現型を確認した結果、再刺激を１回行った条件に比べて４回行った条件で培養した場合に、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、ＣＸＣＲ３などの活性マーカーの発現が減少する傾向を示した。このことから、再刺激回数が増えるほど培養期間が増加しながら一部の活性マーカーの発現レベルに影響を与え得ることを確認した（図７Ａ及び図７Ｂ）。

実験例４．Ｔ細胞の導入遺伝子及び共培養によるナチュラルキラー細胞の細胞殺害能の確認

１×１０^６個のＫ５６２癌細胞株を１５ｍｌチューブに入れて遠心分離した。細胞ペレットを、１ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁した。その後、１ｍＭのカルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ，Ｃ３４８５２）を３０μｌ入れた後、アルミホイルで光を遮断し、３７℃のインキュベーターで１時間染色した。

カルセイン－ＡＭ染色が終わった腫瘍細胞株は、１０ｍｌ～１５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を入れて洗浄し遠心分離した後、ペレットを、１０ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度にした。ナチュラルキラー細胞は、１×１０^６ｃｅｌｌｓを１５ｍｌチューブに入れて遠心分離し、ペレットをＫ５６２癌細胞株に対して所望の比率（１：１）で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。Ｋ５６２癌細胞株とナチュラルキラー細胞株を丸底９６－ウェルプレート（９６－ｗｅｌｌ Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，１６３３２０）に１００μｌずつ混ぜて分注し、各ウェルを３回（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）測定して平均値を得た。

Ｓｐｏｎ（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）ウェルには染色したＫ５６２癌細胞株を１００μｌずつ入れ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を１００μｌずつ入れた。Ｍａｘ（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）ウェルには染色したＫ５６２癌細胞株を１００μｌずつ入れ、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００が添加された３次蒸留水を１００μｌずつ入れた。

１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地及び２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に存在する自家蛍光値（ａｕｔｏ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を補正するために、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌを入れて培地値を補正し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌに、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌを入れて、両溶液の混合液の値を補正した。培地値から混合液の値を引いた差（Ａ）をＭａｘ（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）値に足して自家蛍光値を補正した。

暗所で３７℃のインキュベーターで４時間反応させた後、プレートを２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上層液を９６－ウェルブラックプレート（９６ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ，Ｎｕｎｃ，２３７１０８）に１００μｌずつ分注した。蛍光プレート読み取り器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＶＩＣＴＯＲ Ｘ３）を用いて蛍光値（ＯＤ_{４８０／５３５}ｎｍ）を測定し、ナチュラルキラー細胞の腫瘍細胞殺害能は、下記式ＩＩを用いて算出した。

［式ＩＩ］
％ ｏｆ ｋｉｌｌｉｎｇ＝（Ｓａｍｐｌｅウェル平均蛍光値－Ｓｐｏｎウェル平均蛍光値）／｛（Ｍａｘウェル平均蛍光値＋Ａ）－Ｓｐｏｎウェル平均蛍光値｝×１００

様々なタイプのフィーダー細胞を用いて培養されたナチュラルキラー細胞をＫ５６２癌細胞株と反応させ、直接的な細胞殺害能（細胞毒性）を測定した。その結果、いずれのフィーダー細胞においても、遺伝子を非導入した条件に比べてｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子とｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子を導入した条件で培養されたナチュラルキラー細胞の細胞殺害能が増加した（図８Ａ～図８Ｄ）。

ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入されたＨｕＴ７８細胞株の再刺激回数によるナチュラルキラー細胞の細胞殺害能は、有意差無く培養６０日目まで高く維持された（図８Ｅ）。

このことから、遺伝子非導入フィーダー細胞に比べてｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子又はｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子が導入されたフィーダー細胞は、高い活性とともに優れた細胞殺害能を有する高純度ナチュラルキラー細胞の体外での増殖培養に有用であることを確認した。

実施例４．動物実験

実施例４．１．遺伝子導入Ｔフィーダー細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養

ナチュラルキラー細胞培養時に、５００或いは１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（プロロイキン注射、韓国ノバルティス）と１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１６－００３７－８５）を培養プラスチックプレートに入れ、培養０日目にＣＤ３（－）臍帯血単核細胞或いは末梢血液単核細胞と遺伝子導入Ｔフィーダー細胞を１：２．５の比率で入れ、２ｖ／ｖ％ヒト血漿が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を入れて、３７℃のインキュベーターで４日間静置培養した。ＩＬ－２は、臍帯血単核細胞の場合に１０００ＩＵ／ｍＬ、末梢血液単核細胞の場合に５００ＩＵ／ｍｌを使用した。

臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の培養は、以下の手順で行った：培養４日目に１ｖ／ｖ％ヒト血漿、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を同量で入れた後、再び静置培養した。その後、２～３日間隔で細胞数をカウントし、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１Ｖ／Ｖ％ヒト血漿と１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を追加して１４日目まで培養した。培養１４日目に遺伝子導入Ｔフィーダー細胞を１：２．５の比率で再刺激し、１Ｖ／Ｖ％ヒト血漿とＯＫＴ３、ＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地に培養した。その後、２～３日間隔で細胞数をカウントし、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１Ｖ／Ｖ％ヒト血漿と１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を追加して１４日間追加培養し、合計２８日間細胞を培養した。

末梢血液由来のナチュラルキラー細胞の培養は、次の通りである：培養４日目に１Ｖ／Ｖ％ヒト血漿、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を同量で入れた後、再び静置培養した。その後、２～３日間隔で細胞数をカウントし、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１Ｖ／Ｖ％ヒト血漿と５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を追加して１１日目まで培養した。培養１１日目に遺伝子導入Ｔフィーダー細胞を１：２．５の比率で再刺激し、１Ｖ／Ｖ％ヒト血漿とＯＫＴ３、ＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地に培養した。その後、２～３日の間隔で細胞数をカウントし、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１Ｖ／Ｖ％ヒト血漿と１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を追加して８～１０日間追加培養し、合計１９～２１日間細胞を培養した。

培養細胞を、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように凍結培地に懸濁し、温度制御細胞凍結器を用いて凍結後に液体窒素に保管した。

培養ナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、臍帯血由来のナチュラルキラー細胞（ＣＢ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ）は、約８０，０００倍、末梢血由来のナチュラルキラー細胞（ＰＢＭＣ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ）は５５，０００倍増殖し、ＣＢ－ｅｎＦｅｅｄｅｒとＰＢＭＣ－ｅｎＦｅｅｄｅｒとの間の増殖率に有意な差はなかった（表２１）。

実施例４．２．Ｒａｊｉ動物モデル効能評価

Ｒａｊｉ－ｌｕｃｉ細胞株は、培養最終日に癌細胞を回収し、ＰＢＳを用いて細胞濃度を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬにした後、マウス当たり０．２ｍＬ（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）ずつ尾静脈に注射した。ナチュラルキラー細胞は、２×１０^７ｃｅｌｌｓ／２００μＬで尾静脈に注射し、リツキサン（以下、ＲＴＸ、マブセラ注射、韓国ロシュ社）は、ＰＢＳを用いて０．０１μｇ／１００μＬ濃度に希釈して、マウスの肩甲骨と胸壁との間における弱化部位の皮下に１００μＬ注射した。ＮＫ細胞は、癌細胞移植の翌日に固定器を用いて尾静脈に合計６回投与し、ＲＴＸは皮下に１回投与した（表２２、図９Ａ）。

全ての動物の観察は、１日２回、一般症状及び死亡動物を観察し、死亡の有無を観察した後、凍結培地対照群及びナチュラルキラー細胞及びＲＴＸ処理群の生存期間の中央値（Ｍｅｄｉａｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ）を計算して生存率の延長効果を評価した。Ｒａｊｉ－ｌｕｃｉ細胞株移植後、２種のナチュラルキラー細胞及びＲＴＸ単独及び併用投与群では、２６～１２２日にわたって死亡動物が観察されたが、最終日（１２２日目）まで生存期間の中央値は、凍結培地対照群の３０日と比較して、ＲＴＸ、ＰＢＭＣ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ、ＣＢ－ｅｎＦｅｅｄｅｒの単独投与群では４８．５日、４３日及び４７日であった。ＰＢＭＣ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ＋ＲＴＸ、ＣＢ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ＋ＲＴＸの併用投与群での生存期間の中央値は、５５日及び７５．５日であった（表２３、図９Ｂ）。

実施例４．３．Ｒａｍｏｓ動物モデル効能評価

Ｒａｍｏｓ細胞株は、培養最終日に癌細胞を回収し、ＰＢＳを用いて細胞濃度を５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した後、マウス当たり０．２ｍＬ（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）尾静脈に注射した。ナチュラルキラー細胞は、２×１０^７ｃｅｌｌｓ／２００μＬで尾静脈に注射し、ＲＴＸはＰＢＳを用いて０．３μｇ／１００μＬの濃度に希釈してマウス肩甲骨と胸壁との間における弱化部位皮下に１００μＬ注射した。ナチュラルキラー細胞は、癌細胞移植４日目から固定器を用いて尾静脈に合計６回投与し、ＲＴＸは、癌細胞移植３日目から尾静脈に６回投与した（表２４、図１０Ａ）。

全ての動物の観察は、１日２回に一般症状及び死亡動物を観察し、死亡の有無を観察した後、凍結培地対照群及びナチュラルキラー細胞及びＲＴＸ処理群の生存期間の中央値を計算して生存率の延長効果を評価した。Ｒａｍｏｓ細胞株移植後、２種のナチュラルキラー細胞及びＲＴＸ単独及び併用投与群では、３４～１１０日にわたって死亡動物が観察されたが、最終日（１２４日目）まで生存期間の中央値は、凍結培地対照群の３１日と比較して、ＲＴＸ、ＰＢＭＣ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ、ＣＢ－ｅｎＦｅｅｄｅｒの単独投与群では４９．５日、４２日及び４２．５日であった。ＰＢＭＣ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ＋ＲＴＸ、ＣＢ－ｅｎＦｅｅｄｅｒ＋ＲＴＸの併用投与群での生存期間の中央値は、６３．５日及び８７．５日であった（表２５、図１０Ｂ）。

以上、本発明の詳細を詳細に記載したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記載は単に好ましい実施形態であって、本発明の範囲を限定することを意図するものでないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とその均等物によって定義される。

Claims (26)

1. 形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞と種細胞を共培養することを含むナチュラルキラー細胞の培養方法。
2. 前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子及びｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子が発現するものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記４－１ＢＢＬ遺伝子は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列である、請求項２に記載の方法。
4. 前記配列番号１で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号２で表示される塩基配列である、請求項３に記載の方法。
5. 前記ｍｂＩＬ－２１遺伝子は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列である、請求項２に記載の方法。
6. 前記配列番号３で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号４で表示される塩基配列である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＯＸ４０Ｌ遺伝子は、配列番号５で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列である、請求項２に記載の方法。
8. 前記配列番号５で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号６で表示される塩基配列である、請求項７に記載の方法。
9. 前記ｍＴＮＦ－α遺伝子は、配列番号８で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列である、請求項２に記載の方法。
10. 前記配列番号８で表示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号９で表示される塩基配列である、請求項９に記載の方法。
11. 前記遺伝子は、組換えレンチウイルスを介して導入されたものである、請求項２に記載の方法。
12. 前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子又はｍｂＩＬ－２１遺伝子が発現するものである、請求項１に記載の方法。
13. 前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子及びｍｂＩＬ－２１遺伝子が発現するものである、請求項１に記載の方法。
14. 前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子及びｍＴＮＦ－α遺伝子が発現するものである、請求項１に記載の方法。
15. 前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子及びｍＴＮＦ－α遺伝子が発現するものである、請求項１に記載の方法。
16. 前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｈｕｔ７８、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｌｏｕｃｙ、Ｍｏｌｔ－３、Ｍｏｌｔ－１３、Ｐｅｅｒ、ＲＰＭＩ８４０２及びＴＡＬＬ－０１細胞からなる群から選ばれるいずれか一つである、請求項１に記載の方法。
17. 前記種細胞は、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）由来の単核細胞である、請求項１に記載の方法。
18. 前記種細胞は、ＣＤ３（＋）細胞が除去された細胞である、請求項１に記載の方法。
19. 前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞と前記種細胞の比率を０．１：１～５０：１に混合して培養する、請求項１に記載の方法。
20. 前記種細胞は、フィーダー細胞と１回混合して５日～６０日間培養するか、或いはフィーダー細胞と２回以上混合して６０日以上培養する、請求項１に記載の方法。
21. 抗ＣＤ３抗体及びインターロイキンタンパク質が含まれている培地で培養する、請求項１に記載の方法。
22. 前記抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１及びＨＩＴ３ａからなる群から選ばれるいずれか一つを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記インターロイキンタンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１からなる群から選ばれるいずれか一つを含む、請求項２１に記載の方法。
24. 請求項１のナチュラルキラー細胞の培養方法によって製造されたナチュラルキラー細胞。
25. 形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞を有効成分として含むナチュラルキラー細胞の培養用組成物。
26. 前記形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子及びｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子が発現するものである、請求項２５に記載の組成物。
    

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