JP7039623B2 - 形質転換されたｔ細胞を用いてナチュラルキラー細胞を培養する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、形質転換されたＴ細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法に関する。
がん患者の処置およびがんの再発の予防のための治療方法として、患者の免疫機能を用いた免疫療法が開発されている。特に、大量生産および凍結が可能なナチュラルキラー細胞を用いた免疫療法が研究されている。ナチュラルキラー細胞は、末梢血リンパ球の約１５％を占めるリンパ系細胞であり、自然免疫応答において重要な役割を果たしている。
具体的には、ナチュラルキラー細胞は樹状細胞を活性化し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導して腫瘍に特異的に応答し、それにより腫瘍細胞を排除する。
ナチュラルキラー細胞は悪性腫瘍（肉腫、骨髄腫、がん腫、リンパ腫および白血病など）を直接死滅させる。しかし、正常な対象の体内に存在するほとんどのナチュラルキラー細胞は不活性な状態で存在し、腫瘍を排除するためには活性化されたナチュラルキラー細胞が必要となる。さらに、がん患者の体内に存在するナチュラルキラー細胞の場合、ナチュラルキラー細胞はがん細胞の免疫回避機構のために機能的な欠陥を有する。
したがって、ナチュラルキラー細胞を治療物質として使用するためには、ナチュラルキラー細胞を活性化することが非常に重要である。さらに、体内に存在するナチュラルキラー細胞の数は限られているため、正常な対象または患者の血液中のナチュラルキラー細胞を大量に増殖させ、凍結させる技術を開発することが重要である。
ナチュラルキラー細胞を大量に増殖させる方法として、エクスビボ(ex vivo)での拡大培養法が使用される。ナチュラルキラー細胞のエクスビボでの拡大培養のために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＣＤ３－細胞、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞およびＣＤ５６＋細胞などが種細胞(seed cell)として使用され、サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１など）、ＬＰＳ（Goodier et al., J. Immunol. 165(1):139-147, 2000）、ＣＤ３を刺激するＯＫＴ－３抗体（Condiotti et al., Experimental Hematol. 29(1):104-113, 2001）がナチュラルキラー細胞の増殖因子として使用される。上記の増殖因子のみを用いて、ナチュラルキラー細胞を約３～１０倍増殖できる。しかし、上記の増殖率ではナチュラルキラー細胞を治療物質として商業化することは困難である。
最近、様々な種類のフィーダー細胞を用いてナチュラルキラー細胞を増殖させる方法が研究されている。フィーダー細胞として使用される代表的な細胞株には、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ－ＬＣＬおよびＫ５６２細胞株が含まれる。Ｋ５６２細胞株はＨＬＡを持たない血液がん由来の細胞株であり、ナチュラルキラー細胞が容易に攻撃できる代表的な標的細胞株である。Ｋ５６２に基づくフィーダー細胞を用いたＮＫ細胞の培養方法は以下の通りである；４－１ＢＢＬおよび膜結合型ＩＬ－１５を発現するＫ５６２細胞株を用いてＮＫ細胞を培養する方法（Fujisaki et al., Cancer Res. 69(9):4010-4017, 2009）、ＭＩＣＡ、４－１ＢＢＬおよびＩＬ－１５を発現するＫ５６２細胞株を用いてＮＫ細胞を培養する方法（Gong et al., Tissue Antigens, 76(6):467-475, 2010）、ならびに４－１ＢＢＬおよび膜結合型ＩＬ－２１を発現するＫ５６２細胞を用いてＮＫ細胞を培養する方法（Cecele JD et al, PloSONE, 7(1):e30264, 2012）。
したがって、ナチュラルキラー細胞を活性化および増殖させるために、本発明者らは、ナチュラルキラー細胞の増殖を増強できる共刺激分子および増殖因子をＣＤ４＋Ｔ細胞に発現させることを含む、ナチュラルキラー細胞をエクスビボで効果的に増殖させる方法を開発した。
具体的には、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞をフィーダー細胞として用いたナチュラルキラー細胞の培養方法の効率を向上させるために、本発明者らは形質転換または遺伝子改変されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞を確立した。本発明者らは、遺伝子改変されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞を末梢血単核細胞と共培養した場合に、そのような共培養がナチュラルキラー細胞の増殖および異常な殺細胞活性を増加させることを特定し、本発明を完成させた。したがって、遺伝子改変されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞を用いて効率的かつ安定した様式でナチュラルキラー細胞を増殖させる培養方法を提供する。
本発明のある態様において、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する、遺伝子改変または形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。
さらに、本発明の別の態様において、遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞と種細胞を共培養する工程を含む、ナチュラルキラー細胞の培養方法を提供する。
さらに、本発明のさらなる別の態様において、遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を活性成分として含む、ナチュラルキラー細胞を培養するための組成物を提供する。
さらに、本発明のさらに別の態様において、該培養方法によって産生したナチュラルキラー細胞を提供する。
本発明の遺伝子改変されたＴ細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法は、ナチュラルキラー細胞を少数の種細胞から効果的に増殖および産生させることを可能にする。さらに、該培養方法はナチュラルキラー細胞の異常な殺細胞活性を改善する。したがって、本発明の遺伝子改変されたＴ細胞を用いたナチュラルキラー細胞の培養方法は、細胞治療物質への商業化に有効に使用され得る。さらに、本発明の培養方法によって産生したナチュラルキラー細胞は、細胞治療物質として有効に使用され得る。
以下において、本発明を詳細に説明する。
本発明のある態様において、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する形質転換されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を提供する。
具体的には、１つの遺伝子が形質導入されている場合、該遺伝子は４－１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ－２１、ＯＸ４０ＬまたはｍＴＮＦ－αであり得る。さらに、２つの遺伝子が形質導入されている場合、遺伝子の組合せは、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ、４－１ＢＢＬ／ＯＸ４０Ｌ、ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ、ｍｂＩＬ－２１／ｍＴＮＦ－α、またはｍＴＮＦ－α／ＯＸ４０Ｌであり得る。本発明のある実施態様において、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ、ｍＴＮＦ－α／ＯＸ４０Ｌ、ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ、およびｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌの遺伝子の組合せがＴ細胞に形質導入された。
さらに、３つの遺伝子が形質導入されている場合、遺伝子の組合せは、４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ、ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ／ｍＴＮＦ－α、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ、または４－１ＢＢＬ／ＯＸ４０Ｌ／ｍＴＮＦ－αであり得る。本発明のある実施態様において、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬの遺伝子の組合せがＴ細胞に形質導入された。
さらに、４つの遺伝子が形質導入されている場合、遺伝子の組合せは、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ／４－１ＢＢＬであり得る。本発明のある実施態様において、ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ／４－１ＢＢＬの遺伝子の組合せがＴ細胞に形質導入された。
本明細書における用語「４－１ＢＢＬ」は、ＣＤ１３７Ｌと呼ばれるＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の１つを指し、三量体を形成し、受容体として４－１ＢＢに結合するリガンドを意味する。４－１ＢＢＬ遺伝子はヒト由来であってもよい。
具体的には、４－１ＢＢＬ遺伝子はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３８１１であり得るが、これに限定されない。４－１ＢＢＬ遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列であり得る。
本明細書における用語「ｍｂＩＬ－２１」は、細胞膜に結合するように設計されたＩＬ－２１であり得る。ここで、ｍｂＩＬ－２１は、ＩＬ－２１と膜貫通タンパク質との結合によって形成される融合タンパク質であり得る。膜貫通タンパク質はＣＤ８αであり得る。具体的には、膜貫通タンパク質はＣＤ８αの膜貫通ドメインであり得る。
具体的には、ＩＬ－２１遺伝子はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２１８０３．３であり得るが、これに限定されない。さらに、ＣＤ８α遺伝子はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１７６８であり得るが、これに限定されない。ｍｂＩＬ－２１は、細胞膜に結合するＩＬ－２１の形態で発現する。さらに、ｍｂＩＬ－２１遺伝子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり得る。
本明細書における用語「ＯＸ４０Ｌ」は、ＡＣＴ－４受容体、ＴＮＦ４－ヒト、ＧＰ３４またはＣＤ１３４Ｌとも呼ばれ、ＯＸ４０に結合するリガンドを意味する。具体的には、ＯＸ４０Ｌ遺伝子はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３３２６であり得るが、これに限定されない。ＯＸ４０Ｌ遺伝子は、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列であり得る。
本明細書における用語「ｍＴＮＦ－α」は、腫瘍壊死因子アルファのアミノ酸配列において腫瘍壊死因子アルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）によって認識される部位であるアラニン－バリンをプロリン－バリンに変化させるように、腫瘍壊死因子アルファのＤＮＡ上に点変異を引き起こすことによって得られる遺伝子を意味する。アラニンのプロリンへの変異はランダムに選択される。
具体的には、ｍＴＮＦ－α遺伝子は、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に示されるヌクレオチド配列であり得る。
４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子またはｍＴＮＦ－α遺伝子は、組換えレンチウイルスにより形質導入され得る。しかし、形質導入はこれに限定されない。
細胞に遺伝子を導入する方法として、生化学的方法、物理的方法またはウイルス媒介性の遺伝子導入法が使用され得る。さらに、生化学的方法として、ＦｕＧｅｎｅ６（Roche, USA）、リポフェクタミン（リポフェクタミン（商標）２０００、Invitrogen, USA）、またはＥｘＧｅｎ ５００（MBI Fermentas International Inc., CANADA）が使用され得る。さらに、リポフェクタミンを用いた脂質媒介性の方法が使用され得る。
本明細書における用語「ベクター」は、目的の遺伝子をベクターが形質導入された細胞に発現させることができる発現ベクターであり、ベクターに形質導入された遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された基本的な調節エレメントを含む遺伝子コンストラクトを指す。
さらに、遺伝子を含む発現ベクターとして、ＣＤ４＋ Ｔ細胞株に遺伝子を発現させることができるあらゆる発現ベクターが使用され得、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（ＳＢＩ、ＣＤ５１０Ｂ－１）またはｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｎｅｏ（ＳＢＩ、ＣＤ５１４Ｂ－１）レンチウイルスベクターが本発明の特定の実施態様において使用された。
レンチウイルスとは、レトロウイルスファミリーに属し、長い潜伏期間を特徴とするウイルスを意味する。レンチウイルスは、遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達できる。レンチウイルスの使用は、非分裂細胞中で複製できる遺伝子送達ベクターの使用の最も効果的な方法の１つである。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、エクスビボで単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、エクスビボで拡大培養されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞株（Ｔリンパ腫細胞株）であり得る。さらに、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は補助Ｔ細胞(auxiliary T cell)であり得、ＣＤ４＋ Ｔ細胞をがん細胞と融合させることによって得られるハイブリドーマであり得る。具体的には、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｈｕｔ７８、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｌｏｕｃｙ、Ｍｏｌｔ－３、Ｍｏｌｔ－１３、ＰＥＥＲ、ＲＰＭＩ８４０２およびＴＡＬＬ－０１細胞からなる群から選択されるいずれか１つであり得る。Ｈｕｔ７８、Ｈ９またはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞が好ましい場合がある。
本発明の別の態様において、形質転換されたＣＤ４＋ Ｔ細胞と種細胞を共培養する工程を含む、ナチュラルキラー細胞の培養方法を提供する。
本明細書における用語「フィーダー細胞」は培養のための補助細胞とも呼ばれ、増殖しないが、様々な代謝物を産生し、したがって標的細胞の増殖を助けるような代謝活性を有する細胞を意味する。フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する形質転換されたＣＤ４＋ Ｔ細胞であり得る。
フィーダー細胞として使用されるＴ細胞は、分裂／増殖が抑制された不活化細胞であってもよく、または不活化されていない細胞であってもよい。好ましくは、Ｔ細胞は安全性を保証するために不活性化されてい得る。不活化の方法としては、当分野で公知の従来の方法が使用され得る。例えば、ガンマ線照射法を使用してもよい。不活性化されていないＴ細胞を用いる場合、それらのほとんどは腫瘍細胞であり、したがって培養中に活性化ナチュラルキラー細胞によって死滅し得る。
本明細書における用語「種細胞」は、適切な培養によりナチュラルキラー細胞に増殖できる細胞を意味する。具体的には、種細胞は、末梢血、末梢血白血球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、濃縮されたナチュラルキラー細胞および単離されたナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるいずれか１つであり得る。種細胞は、好ましくはＣＤ３（＋）細胞が除去されたＣＤ３（－）細胞であり得るが、これに限定されない。
ナチュラルキラー細胞の培養方法では、フィーダー細胞および種細胞を０．１以上の比率で混合することによって培養が実施され得る。具体的には、フィーダー細胞と種細胞は、０．１：１～５０：１の比率であり得る。より具体的には、比率は０．５：１～４０：１であり得る。さらにより具体的には、比率は１：１～３０：１であり得る。最も具体的には、比率は２：１～２０：１であり得る。ある実施態様において、フィーダー細胞と種細胞は５：１の比率であり得るが、特にこれに限定されない。「比率」は、細胞数に基づく比率を意味する。
ナチュラルキラー細胞の培養方法では、種細胞をフィーダー細胞と１回混合して培養を５日～６０日間行ってもよく、または種細胞をフィーダー細胞と２回以上混合して培養を６０日以上行ってもよい。好ましくは、種細胞をフィーダー細胞と１回混合してもよく、培養を１４日～２１日間行った。しかし、培養方法はこれに限定されない。
ナチュラルキラー細胞の培養方法では、ナチュラルキラー細胞およびＴリンパ腫細胞株を、従来の動物細胞培地（ＡＩＭ－Ｖ培地、ＲＰＭＩ１６４０、ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ、Ｘ－ＶＩＶＯ２０、ＩＭＤＭおよびＤＭＥＭなど）中で共培養する。共培養において、培養は、Ｔ細胞に対する親和性が低く、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンを添加して実施され得る。しかし、培養方法はこれに限定されない。
本明細書における用語「Ｔ細胞に対する親和性が低く、Ｔ細胞を刺激する抗体」は、ＣＤ３抗原に特異的に応答するタンパク質を意味し、ＣＤ３抗原はそれぞれがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合し、抗原認識複合体を形成する分子の群である。ＴＣＲと比較して、ＣＤ３分子はより長い細胞内領域を有し、抗原認識シグナルを細胞に送達する役割を担っている。
本発明において使用され得るＴ細胞に対する親和性が低く、Ｔ細胞を刺激する抗体は、好ましくは抗ＣＤ３抗体であり得る。具体的には、抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ－３、ＵＣＨＴ１またはＨＩＴ３ａであり得る。
本明細書における用語「インターロイキン（ＩＬ）」は、サイトカインに属する群を指し、免疫担当細胞（リンパ球、単球およびマクロファージなど）によって産生されるタンパク質性の生物活性物質を意味する。インターロイキンは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１であり得る。
本発明のある実施態様において、ＯＫＴ－３抗体およびＩＬ－２を添加して培養を行った。添加するＯＫＴ－３抗体の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり得る。好ましくは、ＯＫＴ－３抗体の濃度は１０ｎｇ／μｌであり得る。ＩＬ－２の濃度は１０Ｕ／ｍｌ～２，０００Ｕ／ｍｌであり得る。好ましくは、ＩＬ－２の濃度は５００Ｕ／ｍｌであり得る。さらに、血清または血漿、およびリンパ球の増殖を支持するさらなる増殖因子を添加して培養が実施され得る。培地に添加される血清または血漿の種類は特に限定されず、様々な市販の動物由来の血清または血漿が使用され得る。好ましくは、ヒト由来の血清または血漿、特に自己由来の血清または血漿が使用され得る。
本明細書における用語「培養」は、人工的に適切に調節された環境条件下で細胞を増殖させる方法を意味する。遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を培養する方法は、当分野で周知の方法を用いて実施され得る。具体的には、培養は、バッチまたはフェドバッチプロセスで実施され得、または反復フェドバッチプロセスで連続的に実施され得る。
さらに、培地に適した前駆物質が使用され得る。上述の原料は、培養プロセス中に適切な方法によってバッチ、フェドバッチ、または連続的な様式で培養物に添加され得る。しかし、本発明はこれに特に限定されない。培養物のｐＨは、塩基性化合物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびアンモニアなど）または酸性化合物（リン酸または硫酸など）を適切な様式で使用することにより調節され得る。
Ｔ細胞をフィーダー細胞として用いる培養方法は、ナチュラルキラー細胞を種細胞（ＰＢＭＣなど）から選択的に培養することを可能にし、ＰＢＭＣフィーダー細胞をドナーに応じて使用する場合と比較してナチュラルキラー細胞の増殖に差がないという事実により、安定な培養を可能にする。したがって、大量のナチュラルキラー細胞の治療物質が効率的かつ安定に取得され得る。
さらに、本発明のさらに別の態様において、遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性成分として含む、ナチュラルキラー細胞を培養するための組成物を提供する。
さらに、本発明のさらに別の態様において、ナチュラルキラー細胞の培養方法により産生されたナチュラルキラー細胞を提供する。
ナチュラルキラー細胞の培養方法に従って培養されたナチュラルキラー細胞は凍結され得、再度解凍した場合においても細胞機能の低下を示さない。さらに、活性化受容体（ＮＫｐ４６など）の高い発現のために、ナチュラルキラー細胞は腫瘍細胞株に対する死滅活性の増加およびサイトカイン分泌の増加を示し、したがって優れた抗がん効果が想定され得る。したがって、臨床的に適用可能な大量の活性化ナチュラルキラー細胞を用いて腫瘍処置に効果的な細胞治療物質を調製できる。
さらに、ナチュラルキラー細胞の培養方法により産生されたナチュラルキラー細胞を活性成分として含む感染症の予防または処置のための組成物において、ナチュラルキラー細胞は組成物の総重量に対して１０重量％～９５重量％含まれ得る。さらに、本発明の感染症の予防または処置のための組成物は、活性成分に加えて、同一または類似の機能を示す１以上の活性成分をさらに含み得る。
感染症の予防または処置のための組成物は、上述の活性成分に加えて１以上の薬学的に許容され得る担体をさらに含むことにより、投与のための医薬組成物に製剤化され得る。
感染症の予防または処置のための医薬組成物の用量は、様々な要素（疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれる活性成分および他の成分の種類および量、製剤の種類、ならびに患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌速度、処置期間、ならびに同時に使用される薬物を含む）に依存して調節され得る。しかし、所望の効果のために、本発明におけるナチュラルキラー細胞の用量は、０．０１×１０７細胞／ｋｇ～１．０×１０９細胞／ｋｇであり得、０．５×１０７細胞／ｋｇ～１．０×１０８細胞／ｋｇであり得る。ここで、用量は１日１回投与してもよく、または１日数回に分けてもよい。
さらに、感染症の予防または処置のための医薬組成物は、当分野で公知の様々な方法によって個体に投与され得る。投与経路は、投与方法、体液量および粘度などを考慮して当業者によって適切に選択され得る。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する、遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［２］
４－１ＢＢＬ遺伝子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［３］
配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列である、前記［２］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［４］
ｍｂＩＬ－２１遺伝子が、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［５］
配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列である、前記［４］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［６］
ＯＸ４０Ｌ遺伝子が、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［７］
配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列である、前記［６］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［８］
ｍＴＮＦ－α遺伝子が、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［９］
配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列である、前記［８］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１０］
遺伝子が組換えレンチウイルスにより形質導入されている、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１１］
４－１ＢＢＬ遺伝子またはｍｂＩＬ－２１遺伝子を発現する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１２］
４－１ＢＢＬ遺伝子およびｍｂＩＬ－２１遺伝子を発現する、前記［１１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１３］
４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子を発現する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１４］
４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子を発現する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１５］
Ｈｕｔ７８、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｌｏｕｃｙ、Ｍｏｌｔ－３、Ｍｏｌｔ－１３、ＰＥＥＲ、ＲＰＭＩ８４０２、およびＴＡＬＬ－０１細胞からなる群から選択されるいずれか１つである、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１６］
前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および種細胞を共培養することを含む、ナチュラルキラー細胞の培養方法。
［１７］
種細胞が、末梢血、末梢血単核細胞、末梢血白血球、濃縮されたナチュラルキラー細胞および単離されたナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるいずれか１つである、前記［１６］記載の培養方法。
［１８］
種細胞が、ＣＤ３（＋）細胞が除去された細胞である、前記［１６］記載の培養方法。
［１９］
遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞と種細胞を０．１：１～５０：１の比率で混合して培養を行う、前記［１６］記載の培養方法。
［２０］
種細胞をフィーダー細胞と１回混合して培養を５日～６０日間行うか、または種細胞をフィーダー細胞と２回以上混合して培養を６０日以上行う、前記［１６］記載の培養方法。
［２１］
抗ＣＤ３抗体およびインターロイキンタンパク質を含む培地中で培養を行う、前記［１６］記載の培養方法。
［２２］
抗ＣＤ３抗体が、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａからなる群から選択されるいずれか１つを含む、前記［２１］記載の培養方法。
［２３］
インターロイキンタンパク質が、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１からなる群から選択されるいずれか１つを含む、前記［２１］記載の培養方法。
［２４］
前記［１］～[１５]のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性成分として含む、ナチュラルキラー細胞を培養するための組成物。
［２５］
前記［１６］～[２３]のいずれかに記載のナチュラルキラー細胞の培養方法によって調製されるナチュラルキラー細胞。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する、遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［２］
４－１ＢＢＬ遺伝子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［３］
配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列である、前記［２］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［４］
ｍｂＩＬ－２１遺伝子が、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［５］
配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列である、前記［４］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［６］
ＯＸ４０Ｌ遺伝子が、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［７］
配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列である、前記［６］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［８］
ｍＴＮＦ－α遺伝子が、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［９］
配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列である、前記［８］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１０］
遺伝子が組換えレンチウイルスにより形質導入されている、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１１］
４－１ＢＢＬ遺伝子またはｍｂＩＬ－２１遺伝子を発現する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１２］
４－１ＢＢＬ遺伝子およびｍｂＩＬ－２１遺伝子を発現する、前記［１１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１３］
４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子を発現する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１４］
４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子を発現する、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１５］
Ｈｕｔ７８、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｌｏｕｃｙ、Ｍｏｌｔ－３、Ｍｏｌｔ－１３、ＰＥＥＲ、ＲＰＭＩ８４０２、およびＴＡＬＬ－０１細胞からなる群から選択されるいずれか１つである、前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
［１６］
前記［１］記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および種細胞を共培養することを含む、ナチュラルキラー細胞の培養方法。
［１７］
種細胞が、末梢血、末梢血単核細胞、末梢血白血球、濃縮されたナチュラルキラー細胞および単離されたナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるいずれか１つである、前記［１６］記載の培養方法。
［１８］
種細胞が、ＣＤ３（＋）細胞が除去された細胞である、前記［１６］記載の培養方法。
［１９］
遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞と種細胞を０．１：１～５０：１の比率で混合して培養を行う、前記［１６］記載の培養方法。
［２０］
種細胞をフィーダー細胞と１回混合して培養を５日～６０日間行うか、または種細胞をフィーダー細胞と２回以上混合して培養を６０日以上行う、前記［１６］記載の培養方法。
［２１］
抗ＣＤ３抗体およびインターロイキンタンパク質を含む培地中で培養を行う、前記［１６］記載の培養方法。
［２２］
抗ＣＤ３抗体が、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａからなる群から選択されるいずれか１つを含む、前記［２１］記載の培養方法。
［２３］
インターロイキンタンパク質が、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１からなる群から選択されるいずれか１つを含む、前記［２１］記載の培養方法。
［２４］
前記［１］～[１５]のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性成分として含む、ナチュラルキラー細胞を培養するための組成物。
［２５］
前記［１６］～[２３]のいずれかに記載のナチュラルキラー細胞の培養方法によって調製されるナチュラルキラー細胞。
以下では、本発明を実施例によって詳細に説明する。しかし、以下の実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明は以下の実施例に限定されない。
実施例１．組換えレンチウイルスの作成
実施例１．１．組換えレンチウイルスベクターの作成
レンチウイルスベクターとして、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（ＳＢＩ、ＣＤ５１０Ｂ－１）またはｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｎｅｏ（ＳＢＩ、ＣＤ５１４Ｂ－１）を用いた。形質導入のための遺伝子として、４－１ＢＢＬ（ＴＮＦスーパーファミリーメンバー９、ＴＮＦＳＦ９）、ｍｂＩＬ－２１（膜結合ＩＬ－２１）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦスーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＳＦ４）転写変異体１）およびｍＴＮＦ－α（膜結合ＴＮＦアルファ）遺伝子を用いた。
実施例１．１．組換えレンチウイルスベクターの作成
レンチウイルスベクターとして、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（ＳＢＩ、ＣＤ５１０Ｂ－１）またはｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－Ｎｅｏ（ＳＢＩ、ＣＤ５１４Ｂ－１）を用いた。形質導入のための遺伝子として、４－１ＢＢＬ（ＴＮＦスーパーファミリーメンバー９、ＴＮＦＳＦ９）、ｍｂＩＬ－２１（膜結合ＩＬ－２１）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦスーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＳＦ４）転写変異体１）およびｍＴＮＦ－α（膜結合ＴＮＦアルファ）遺伝子を用いた。
具体的には、４－１ＢＢＬ遺伝子（配列番号２）について、４－１ＢＢＬ遺伝子発現ベクター（OriGene, RC211160）を用いた。ｍｂＩＬ－２１遺伝子（配列番号４）について、コドン最適化されたｍｂＩＬ－２１遺伝子配列が挿入されているｐｃＤＮＡ３．１ベクター（GenScript, US）を用いた。ＯＸ４０Ｌ遺伝子（配列番号６）について、その合成の依頼をBIONEER CORPORATIONに行った。
ｍＴＮＦ－α遺伝子（配列番号９）について、ＲＮＡを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出し、次いでＲＮＡから逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲによってＣＤＳを得た。ＴＮＦ－αを分泌させるために、ＴＮＦ－αを腫瘍壊死因子アルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）によって切断した；ただし、ＴＮＦ－αのアミノ酸配列中のＴＡＣＥによって認識される部位であるアラニン－バリン（Ａ－Ｖ）がプロリン－バリン（Ｐ－Ｖ）となり、それによりＴＮＦ－αが細胞膜に結合したままとなるように、ＴＮＦ－αのＤＮＡ上に点変異を生じさせた。配列番号７に示されるヒトｍＴＮＦ－α遺伝子において、２２６番目の塩基であるグアニンをシトシンに置換し、２２８番目の塩基であるアデニンをグアニンに置換することによって点変異を行った。
形質導入のための各遺伝子に適したプライマーを用いて、導入遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）をＰＣＲによって増幅した（表１）。
表１は本実験で使用したプライマーを示す。
導入遺伝子およびレンチウイルスベクターを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で処理した。その後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Clontech, 639649）を用いて連結を行った。連結したレンチウイルスベクターをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、培養を行った。形質転換されたＤＨ５αコンピテント細胞からプラスミドミニプレップキット（MACHEREY-NAGEL/740422.50）を用いてプラスミドＤＮＡを得た。すべてのプラスミドＤＮＡについて、その配列決定の依頼を外部企業に行い、そのＤＮＡ配列が正確であることを確認した。
実施例１．２．濃縮したレンチウイルスの作成
組換えレンチウイルスの産生のために、２９３Ｔ細胞株を遺伝子導入の２日前に１．５×１０６～２×１０６細胞で７５Ｔフラスコ（Nunc, 156499）に播種し、５％ＣＯ２および３７℃の条件のインキュベーター中でインキュベートした。２９３Ｔ細胞の細胞培養密度が約８０％～９０％に達したら、培地を６ｍｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Gibco, 31985-088）に交換し、３７℃の温度において５％ＣＯ２条件下で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ混合溶液およびリポフェクタミン（リポフェクタミン２０００、Life technologies, 11668500）混合溶液を調製した（表２）。
表２は、ＤＮＡ混合溶液およびリポフェクタミン（リポフェクタミン２０００、Life technologies, 11668500）混合溶液を示す。
組換えレンチウイルスの産生のために、２９３Ｔ細胞株を遺伝子導入の２日前に１．５×１０６～２×１０６細胞で７５Ｔフラスコ（Nunc, 156499）に播種し、５％ＣＯ２および３７℃の条件のインキュベーター中でインキュベートした。２９３Ｔ細胞の細胞培養密度が約８０％～９０％に達したら、培地を６ｍｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Gibco, 31985-088）に交換し、３７℃の温度において５％ＣＯ２条件下で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ混合溶液およびリポフェクタミン（リポフェクタミン２０００、Life technologies, 11668500）混合溶液を調製した（表２）。
それぞれの混合溶液の成分をボルテキサーを用いてよく混合し、室温で３分間静置した。次に、２つの混合溶液を混合し、室温で２０分以上静置した。培地交換を行った２９３Ｔ細胞を、ＤＮＡおよびリポフェクタミンの混合溶液２ｍｌで処理した。４時間後、培地を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Gibco, 11995073）培地に交換し、３７℃の温度において５％ＣＯ２の条件下で４８時間インキュベートした。
４８時間インキュベートして得られた２９３Ｔ細胞の培養液８ｍｌを回収し、０．４５μｍフィルター（Millipore, SLHP033RS）でろ過した。ろ過した培養液を、ウルトラセル－１００メンブレンを備えたアミコンウルトラ－１５遠心式フィルターユニット（Merckmillipore, UFC910096）を用いて２５０μｌ以下に濃縮した。濃縮したウイルスを適切な量に分注し、－８０℃の温度で保存した。
実施例２．形質導入遺伝子を有するＴ細胞の作成
実施例２．１．レンチウイルスの感染
培養中の０．５×１０６細胞のＴ細胞株、１ｍｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ、５０μｌのレンチウイルス解凍物、１０μｇ／ｍｌのポリブレン（Santa Cruz, C2013）を混合した。混合物を６ウェルプレート（Nunc, 140675）に配置し、スピノキュレーション(spinoculation)を１８００ｇおよび３２℃の温度で９０分間行った。次に、５％ＣＯ２および３７℃の条件のインキュベーター中で２時間インキュベートした。その後、培地を同じ培地に交換し、４８時間インキュベートした。
実施例２．１．レンチウイルスの感染
培養中の０．５×１０６細胞のＴ細胞株、１ｍｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ、５０μｌのレンチウイルス解凍物、１０μｇ／ｍｌのポリブレン（Santa Cruz, C2013）を混合した。混合物を６ウェルプレート（Nunc, 140675）に配置し、スピノキュレーション(spinoculation)を１８００ｇおよび３２℃の温度で９０分間行った。次に、５％ＣＯ２および３７℃の条件のインキュベーター中で２時間インキュベートした。その後、培地を同じ培地に交換し、４８時間インキュベートした。
Ｈｕｔ７８細胞株（ATCC, TIB-161（商標））を、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＩＭＤＭ（ATCC, 30-2005）培地で培養した。継代培養において、細胞の濃度を１．５×１０５細胞／ｍｌ～２．０×１０５細胞／ｍｌに維持した。Ｈ９細胞株（ATCC, HTB-176（商標））およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（ATCC, TIB-152（商標））を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０（ATCC, 30-2001）培地で培養した。継代培養において、細胞の濃度をそれぞれ１．０×１０５細胞／ｍｌ～１．５×１０５細胞／ｍｌおよび０．５×１０５細胞／ｍｌ～１．０×１０５細胞／ｍｌに維持した。すべての細胞株の継代培養を、２日～３日間隔で行った。培養容器として７５Ｔフラスコを使用し、培地の容量を１５ｍｌ～２０ｍｌに維持した。
組換えレンチウイルス感染細胞株を、抗生物質を用いて選択した（表３）。
表３は、形質導入遺伝子を有する細胞株のために使用した抗生物質を示す。
実施例２．２．形質導入遺伝子の発現の同定
実施例２．１．で継代培養したＴ細胞株を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、培養物を吸引により除去した。ＦＡＣＳ緩衝液を、ＰＢＳに２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加することによって作成した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈を行い、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度を与えるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加えた。抗ヒトＴＮＦ－α（膜）－ＰＥ（R&D Systems, FAB210P）、抗ヒトＯＸ４０Ｌ－ＰＥ（BD, 558184）、抗ヒト４－１ＢＢＬ－ＰＥ（BD, 559446）、抗ヒトＩＬ－２１－ＰＥ（eBioscience, 12-7219-42）、７－ＡＡＤ（Beckman Coulter, Inc., IM3630c）、ＰＥマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555749）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD, 550795）抗体を用いて染色を行い、次に各遺伝子の発現率をＦＡＣＳ装置を用いて分析した（図１ａ～３ｂ）。
実施例２．１．で継代培養したＴ細胞株を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、培養物を吸引により除去した。ＦＡＣＳ緩衝液を、ＰＢＳに２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加することによって作成した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈を行い、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度を与えるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加えた。抗ヒトＴＮＦ－α（膜）－ＰＥ（R&D Systems, FAB210P）、抗ヒトＯＸ４０Ｌ－ＰＥ（BD, 558184）、抗ヒト４－１ＢＢＬ－ＰＥ（BD, 559446）、抗ヒトＩＬ－２１－ＰＥ（eBioscience, 12-7219-42）、７－ＡＡＤ（Beckman Coulter, Inc., IM3630c）、ＰＥマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555749）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD, 550795）抗体を用いて染色を行い、次に各遺伝子の発現率をＦＡＣＳ装置を用いて分析した（図１ａ～３ｂ）。
実施例３．ＣＤ３（－）ＰＢＭＣおよび形質導入遺伝子を有するＴ細胞の共培養
実施例３．１．ＣＤ３（－）ＰＢＭＣ種細胞の調製
健常なドナーから回収したＰＢＭＣにリン酸緩衝生理食塩水（PBS, LONZA, 17-516Q）を１：１の比率で添加し、遠心分離を１，５００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間行った。２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡをＰＢＳに添加し、ＭＡＣＳランニング緩衝液を作成した。ＰＢＭＣのペレットを１０ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液に懸濁し、Ａｄａｍセルカウンターシステムを用いて細胞数を測定した。
実施例３．１．ＣＤ３（－）ＰＢＭＣ種細胞の調製
健常なドナーから回収したＰＢＭＣにリン酸緩衝生理食塩水（PBS, LONZA, 17-516Q）を１：１の比率で添加し、遠心分離を１，５００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間行った。２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡをＰＢＳに添加し、ＭＡＣＳランニング緩衝液を作成した。ＰＢＭＣのペレットを１０ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液に懸濁し、Ａｄａｍセルカウンターシステムを用いて細胞数を測定した。
ＣＤ３（＋）細胞を除去した種細胞を取得するために、５×１０７個のＰＢＭＣを新しい５０ｍｌチューブに移し、１，２００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間遠心分離した。４００μｌのＭＡＣＳランニング緩衝液および１００μｌのＣＤ３磁気ビーズ（Miltenyi Biotech, 130050101）を５×１０７個のＰＢＭＣ細胞ペレットに添加し、４℃の温度で２０分間反応させた。１０ｍｌ～２０ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液を添加し、洗浄を行った。次に、遠心分離を１，２００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間行い、結果物を２ｍｌのＭＡＣＳランニング緩衝液に再懸濁した。
細胞を、ＣＳカラム（Miltenyi Biotech, 130-041-305）を備えたＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Miltenyi Biotech）を用いて単離した。２０ｍｌの最終容量に達するまでカラムを洗浄することによって細胞を回収した。Ａｄａｍセルカウンターシステムを用いて細胞数を測定した。１×１０７個の細胞を新たな５０ｍｌチューブに配置し、１，２００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを凍結培地に懸濁し、バイアルあたり１×１０７細胞を達成するように液体窒素で凍結を行った。
凍結した１つのＣＤ３（－）ＰＢＭＣバイアルを解凍し、５０ｍｌチューブに移した。ＣＤ３（－）ＰＢＭＣを、０．６％（ｖ／ｖ）ＡＣＤ（クエン酸－デキストロース溶液、Sigma-Aldrich, C3821）、０．２％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁し、１，２００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間遠心分離した。ＣＤ３（－）ＰＢＭＣペレットを１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地（Cellgenix, 20802-0500）に懸濁し、Ａｄａｍセルカウンターシステムを用いて細胞数を測定した。ＣＤ３（－）ＰＢＭＣ種細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した。
実施例３．２．ＣＤ３（－）ＰＢＭＣ種細胞および形質導入遺伝子を有するＴフィーダー細胞の共培養
形質導入遺伝子を有するＴ細胞を培養フラスコから回収し、１，２００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間遠心分離した。次に、細胞を１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁し、Ａｄａｍセルカウンターシステムを用いて細胞数を測定した。形質導入遺伝子を有するＴフィーダー細胞を、１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に５×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、ガンマ線照射装置において２０，０００ｃＧｙを照射して不活性化することによって調製した。
形質導入遺伝子を有するＴ細胞を培養フラスコから回収し、１，２００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間遠心分離した。次に、細胞を１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁し、Ａｄａｍセルカウンターシステムを用いて細胞数を測定した。形質導入遺伝子を有するＴフィーダー細胞を、１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に５×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、ガンマ線照射装置において２０，０００ｃＧｙを照射して不活性化することによって調製した。
ナチュラルキラー細胞の培養において、５００ＩＵのＩＬ－２（Proleukin Inj., Novartis Korea）および１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３（eBioscience, 16-0037-85）を培養プラスチックプレートに添加した。培養の０日目に、ＣＤ３（－）ＰＢＭＣ種細胞および形質導入遺伝子を有するＴフィーダー細胞を、それぞれ０．５ｍｌ～１ｍｌの体積で１：５または１：２．５の比率で添加し、１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を０．２５ｍｌ～０．５ｍｌの体積で添加した。培地を添加しながら、結果物を３７℃の温度条件のインキュベーターで４～７日間静置培養した。
培養４～５日目に、細胞数を測定し、細胞の濃度を約０．５×１０６～１×１０６細胞／ｍｌとした。その後、細胞を５００ＩＵのＩＬ－２および１％（ｖ／ｖ）の自己血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、適切な培養容器に配置した。細胞を再度静置培養した。
その後、細胞数を２日～３日間隔で測定し、細胞の濃度を０．５×１０５～１×１０６細胞／ｍｌとした。その後、細胞を、５００ＩＵのＩＬ－２および１％（ｖ／ｖ）自己血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈しながら２１日目まで懸濁培養した。懸濁培養の２１日目に、ナチュラルキラー細胞を得た。
培養したナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、１以上の遺伝子（ｍＴＮＦ－α、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬまたはｍｂＩＬ－２１）を形質導入した細胞株を伴う培養が、形質導入遺伝子を持たない細胞株と比較して、全有核細胞（ＴＮＣ）に基づく増殖率に関してナチュラルキラー細胞の増殖の増加（Ｈ９において７６倍、Ｈｕｔ７８において３８２倍、Ｊｕｒｋａｔにおいて２６倍）をもたらすことが確認できた。特に、４－１ＢＢＬ遺伝子またはｍｂＩＬ－２１遺伝子の単一の形質導入と比較して、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子を形質導入した細胞株の場合、ナチュラルキラー細胞の著しく高い増殖率（Ｈｕｔ７８－ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬにおいて４，１６９倍、Ｈ９－ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬにおいて３，７５８倍、Ｊｕｒｋａｔ－ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬにおいて２５８倍）がＴ細胞の種類に関係なく誘導された（表４、図４ａ～４ｃ）。すなわち、ｍｂＩＬ－２１遺伝子と４－１ＢＢＬ遺伝子を形質導入した場合に相乗効果が観察されたことが確認された。
表４は、単一遺伝子または二重遺伝子の形質導入を受けたＴ細胞株とともに培養したナチュラルキラー細胞の増殖率を示す。
２以上の遺伝子の組合せを形質導入した場合に得られる相乗効果を確認するために、三重遺伝子（ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ）または四重遺伝子（ｍＴＮＦ－α／ｍｂＩＬ－２１／ＯＸ４０Ｌ／４－１ＢＢＬ）の形質導入を受けたＨｕｔ７８ Ｔ細胞株とともに培養したナチュラルキラー細胞の増殖効果を、以前に実験を行った遺伝子の組合せと比較した。二重遺伝子の形質導入を受けた細胞株のうち、ナチュラルキラー細胞の最も高い増殖を誘導した細胞株は、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子を形質導入した細胞株（９９８倍）であった。しかし、三重遺伝子の形質導入を受けた細胞株（１，６０７倍）または四重遺伝子の形質導入を受けた細胞株（１，６４０倍）とともに培養した場合、ｍｂＩＬ－２１／４－１ＢＢＬ遺伝子を形質導入した細胞株（９９８倍）よりも高い相乗効果が観察されたことが確認された（表５および図４ｄ）。
表５は、複数の遺伝子の形質導入を受けたＴ細胞株とともに培養したナチュラルキラー細胞の増殖率を示す。
ナチュラルキラー細胞の培養が、遺伝子導入のためのＴ細胞株による再刺激を繰り返しながら継続的に維持され得るか否かを確認するために実験を行った。
三重遺伝子の形質導入を受けたＨｕｔ７８細胞を培養フラスコから回収し、１，２００ｒｐｍおよび４℃の温度で１０分間遠心分離した。その後、細胞を１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁し、Ａｄａｍセルカウンターシステムを用いて細胞数を測定した。三重遺伝子の形質導入を受けたＨｕｔ７８フィーダー細胞を、１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、ガンマ線照射装置において２０，０００ｃＧｙを照射して不活性化することによって調製した。
ナチュラルキラー細胞の培養において、５００ＩＵのＩＬ－２（Proleukin Inj., Novartis Korea）および１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３（eBioscience, 16-0037-85）を培養プラスチックプレートに添加した。
培養の０日目に、ＣＤ３（－）ＰＢＭＣ種細胞および三重遺伝子の形質導入を受けたＨｕｔ７８フィーダー細胞をそれぞれ０．５ｍｌ～１ｍｌの体積で１：２．５の比率で添加し、１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を０．５ｍｌ～１ｍｌの体積で添加した。細胞を３７℃の温度条件のインキュベーターで４～７日間静置培養した。培養の２日目または３日目に、培地の半分を除去し、１％（ｖ／ｖ）のヒト血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を除去した量だけ添加した。培養の４日目または５日目に、細胞数を測定し、細胞の濃度を約０．５×１０６細胞／ｍｌ～１×１０６細胞／ｍｌとした。
培養の７日目または１１日目に細胞数を測定し、細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した。再刺激のために、三重遺伝子の形質導入を受けたＨｕｔ７８フィーダー細胞をそれぞれ０．５ｍｌ～１ｍｌの体積で１：２．５の比率で添加し、５００ＩＵのＩＬ－２（Proleukin Inj., Novartis Korea）、１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ－３（eBioscience, 16-0037-85）および１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を０．５ｍｌ～１ｍｌの体積で添加した。細胞を３７℃の温度条件のインキュベーターで３～４日間静置培養した。その後、細胞数を２日または３日間隔で測定し、細胞の濃度を０．５×１０５細胞／ｍｌ～１×１０６細胞／ｍｌとした。
７日間隔で合計４回の再刺激（Ｄ７ＲＳ５）および１１日間隔で合計３回の再刺激（Ｄ１１ＲＳ４）を与えるように、再刺激プロセスを７日間隔または１１日間隔で繰り返した。
培養したナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、１以上の再刺激を伴う培養が、再刺激を与えなかった場合に得られた増殖と比較して、全有核細胞（ＴＮＣ）に基づく増殖に関してナチュラルキラー細胞の増殖の増加をもたらしたことが確認できた（図５ａ～５ｄ）。培養の０日目にＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１細胞株で１回刺激した場合、培養は最大で２５日目まで継続され、２，１２４倍の増殖が達成された。７日間隔でＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１細胞株で５回刺激した場合、培養は最大で３５日目まで継続され、４３６，０３２倍の増殖が達成された。１１日間隔でＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１細胞株で４回刺激した場合、培養は最大で４２日目まで継続され、２，６２８，１５３倍の増殖が達成された。したがって、７日または１１日間隔におけるＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１ Ｔ細胞株での繰り返しの刺激は、ナチュラルキラー細胞の増殖の継続的な増加をもたらしたことが確認できた。
実験例１．形質導入遺伝子に依存したナチュラルキラー細胞の細胞生存率の同定
インビトロでの細胞生存率を比較および評価するために、細胞内の核に結合できるＰＩ染色溶液を用いるセルカウンターの１つであるＡｄａｍセルカウンターシステムを用いた。測定された細胞の総数から死細胞の数を引くことによって生細胞の数を計算した後、以下の式Ｉを用いて細胞生存率を計算した。
［式Ｉ］
細胞生存率（％）＝（生細胞の数／全細胞の数）×１００
インビトロでの細胞生存率を比較および評価するために、細胞内の核に結合できるＰＩ染色溶液を用いるセルカウンターの１つであるＡｄａｍセルカウンターシステムを用いた。測定された細胞の総数から死細胞の数を引くことによって生細胞の数を計算した後、以下の式Ｉを用いて細胞生存率を計算した。
［式Ｉ］
細胞生存率（％）＝（生細胞の数／全細胞の数）×１００
２１日間の培養後にナチュラルキラー細胞の生存率を測定した結果、約８０％以上の高い細胞生存率がすべての条件下で観察された（図６ａ～６ｄ）。
実験例２．形質導入遺伝子に依存したナチュラルキラー細胞の細胞表現型解析
２１日間培養したナチュラルキラー細胞または繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養物を吸引によって除去した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度となるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加え、以下の抗体を用いて表現型解析を行った。
２１日間培養したナチュラルキラー細胞または繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養物を吸引によって除去した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度となるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加え、以下の抗体を用いて表現型解析を行った。
チューブ１：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ（BD Pharmingen, 555332）、抗ヒトＣＤ１６－ＰＥ（BD Pharmingen, 555407）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５（BD Pharmingen, 555517）または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ Ｃｙ７（BD Pharmingen, 557747）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１（BD Pharmingen, 562751）
チューブ２：抗ヒトＣＤ１４－ＦＩＴＣ（BD Pharmingen, 555397）、抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ（BD Pharmingen, 555413）、抗ヒトＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ５（BD Pharmingen, 555341）または抗ヒトＣＤ３－ＰＥ Ｃｙ７（eBioscience, 25-0038-42）、抗ヒトＣＤ３－ＢＶ４２１（BD Pharmingen, 562438）
チューブ３：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫＧ２Ｄ－ＰＥ（R&D Systems, FAB139P）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ４：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫｐ３０－ＰＥ（BD Pharmingen, 558407）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ５：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫｐ４４－ＰＥ（BD Pharmingen, 558563）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ６：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫｐ４６－ＰＥ（BD Pharmingen, 557991）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ７：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＤＮＡＭ－１－ＰＥ（BD Pharmingen, 559789）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ８：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＸＣＲ３－ＰＥ（BD Pharmingen, 557185）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ９：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＰＥマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555749）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ１０：ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555748）、ＰＥマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照、ＰＥ－Ｃｙ５マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555750）またはＰＥ－Ｃｙ７マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 557872）、ＢＶ４２１マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 562438）
チューブ１１：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫＧ２Ａ－ＰＥ（R&D Systems, FAB1059P）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ１２：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＮＫＧ２Ｃ－ＰＥ（R&D Systems, FAB138P）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ１３：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ６２Ｌ－ＰＥ（eBioscience, 12-0629-42）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ１４：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ６９－ＰＥ（R&D Systems, FAB23591P）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ１５：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ５７－ＰＥ（BD Pharmingen, 560844）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ１において、抗ヒトＣＤ５６での染色を３つの蛍光のうち１つを選択することによって行ったため、チューブ２のＣＤ３、チューブ３～９および１１～１５のＣＤ５６、ならびにチューブ１０のアイソタイプ対照について同じ蛍光を選択した。
上記のチューブ内の細胞を、冷蔵温度で３０分間染色した。その後、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を染色細胞に添加し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を再度添加した。遠心分離を１，５００ｒｐｍで５分間行った。上清を再度除去し、２００μｌの固定緩衝液（BD, 554655）中に配置して懸濁した。次に、ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（BD）を用いて、細胞の同定ならびにその純度および表現型の試験を行った。
２１日間培養したナチュラルキラー細胞に対して同定および純度の分析を行った。その結果、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）の含有量がすべての条件下で９５％以上であり、ナチュラルキラー細胞の活性化を評価するためのＣＤ５６＋ＣＤ１６＋マーカーの発現レベルが二重遺伝子の形質導入を受けたＴフィーダー細胞を用いて高度に維持されたことが確認された（図７ａ～７ｈ）。
さらに、ナチュラルキラー細胞における代表的な受容体の発現を分析した。すべてのナチュラルキラー細胞は、二重遺伝子の形質導入を受けたフィーダー細胞の条件下において、遺伝子を形質導入していない条件または単一遺伝子の形質導入を受けたフィーダー細胞の条件と比較して、ドナー間で変動することなく、ＣＤ１６を高いレベルで発現し、活性化マーカーＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６およびＤＮＡＭ－１を高レベルで発現したことが確認された。特に、二重遺伝子の形質導入を受けたフィーダー細胞の条件下において、ＣＸＣＲ３の量が大幅に増加したことが確認できた。したがって、二重遺伝子の形質導入を受けたフィーダー細胞は、ＮＫ細胞の活性化および腫瘍ターゲティングを向上できる有用なフィーダー細胞であることが確認された（図８ａ～１１ｌ）。
遺伝子導入のためのＴ細胞株による再刺激を繰り返しながら培養したナチュラルキラー細胞の受容体および活性化マーカーを同定した結果、再刺激を行わなかった条件および再刺激を繰り返し行った条件の両方において、活性化マーカー（ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１）は、再刺激の間隔または培養期間を増加させても大きな差を生じることなく発現したことが確認された（図１２ａ～１２ｃ）。
実験例３．Ｔ細胞の形質導入遺伝子に依存したナチュラルキラー細胞の異常な殺細胞活性の同定
１×１０６細胞のＫ５６２がん細胞株を１５ｍｌチューブに配置し、遠心分離を行った。細胞ペレットを、１ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。その後、３０μｌの１ｍＭ カルセインＡＭ（Molecular probe, C34852）を添加した。次に、銀箔を用いて光を遮断し、３７℃の温度条件のインキュベーターで１時間染色を行った。
１×１０６細胞のＫ５６２がん細胞株を１５ｍｌチューブに配置し、遠心分離を行った。細胞ペレットを、１ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。その後、３０μｌの１ｍＭ カルセインＡＭ（Molecular probe, C34852）を添加した。次に、銀箔を用いて光を遮断し、３７℃の温度条件のインキュベーターで１時間染色を行った。
カルセインＡＭで染色した腫瘍細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌ～１５ｍｌを加えて洗浄し、遠心分離を行った。次に、細胞の濃度が１×１０５細胞／ｍｌとなるように、ペレットを１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌに懸濁した。ナチュラルキラー細胞を１×１０６細胞で１５ｍｌチューブに配置し、遠心分離を行った。ペレットを、Ｋ５６２がん細胞株に対して所望の比率（１：１）で１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。調製したＫ５６２がん細胞株およびナチュラルキラー細胞株をそれぞれ１００μｌ用いて混合し、９６ウェルＵ底プレート（Nunc, 163320）に分注した。各ウェルを３通り調製し、その平均値を得た。
自然放出のために、染色したＫ５６２がん細胞株１００μｌおよび１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌをウェルに添加した。最大放出のために、染色したＫ５６２がん細胞株１００μｌおよび２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００を添加した三回蒸留水１００μｌをウェルに添加した。
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地および２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に存在する自己蛍光を補正するために、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌを添加して、中央値を調製した；２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００を添加したＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌを、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌに添加し、２つの溶液の混合溶液の値を調製した。自己蛍光を、中央値から混合溶液の値を引いて得られた差（Ａ）を最大放出の値に加えることによって補正した。
光を遮断して３７℃の温度条件のインキュベーターで４時間反応させ、次いでプレートを２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を９６ウェルブラックプレート（Nunc, 237108）にそれぞれ１００μｌ分注した。蛍光値（ＯＤ４８０／５３５ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Perkin Elmer, VICTOR X3）を用いて測定し、ナチュラルキラー細胞の腫瘍細胞死滅能を以下の式ＩＩを用いて計算した。
[式ＩＩ]
死滅の％＝（試料ウェルの蛍光の平均値－Ｓｐｏｎウェルの蛍光の平均値）／｛（Ｍａｘウェルの蛍光の平均値＋Ａ）－Ｓｐｏｎウェルの蛍光の平均値｝×１００
[式ＩＩ]
死滅の％＝（試料ウェルの蛍光の平均値－Ｓｐｏｎウェルの蛍光の平均値）／｛（Ｍａｘウェルの蛍光の平均値＋Ａ）－Ｓｐｏｎウェルの蛍光の平均値｝×１００
様々なフィーダー細胞とともに培養したナチュラルキラー細胞をＫ５６２がん細胞株と反応させ、直接的な殺細胞活性を測定した。他の条件と比較して、Ｋ５６２がん細胞株に対する死滅活性は、二重遺伝子の形質導入を受けたフィーダー細胞の条件下で平均して増加した（図１３ａ～１４ｄ）。
遺伝子導入のためのＴ細胞株による再刺激を伴って培養したナチュラルキラー細胞を、Ｋ５６２がん細胞株と反応させ、直接的な殺細胞活性を測定した。再刺激を行わなかった条件および再刺激を繰り返し行った条件の両方において、Ｋ５６２に対する死滅活性は、培養期間を延長し、増殖倍率が増加した場合でさえ、よく維持されていたことが確認された（図１５ａ～１５ｃ）。
実験例４．Ｔ細胞の形質導入遺伝子に依存したナチュラルキラー細胞の増殖マーカー（Ｋｉ－６７）の分析
２１日間培養したナチュラルキラー細胞または繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養物を吸引によって除去した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度となるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加え、以下の抗体を用いて増殖マーカー分析を行った。
２１日間培養したナチュラルキラー細胞または繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養物を吸引によって除去した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度となるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加え、以下の抗体を用いて増殖マーカー分析を行った。
チューブ１：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ（BD Pharmingen, 555332）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７（BD Pharmingen, 557747）、７－ＡＡＤ（Beckman Coulter, Inc., A07704）
チューブ２：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ（BD Pharmingen, 555332）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７（BD Pharmingen, 557747）、７－ＡＡＤ（Beckman Coulter, Inc., A07704）
チューブ３：ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555748）、ＰＥ－Ｃｙ７マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 557872）
上記のチューブ内の細胞を、冷蔵温度で３０分間染色した。その後、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を染色細胞に添加し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を再度添加した。遠心分離を１，５００ｒｐｍで５分間行った。上清を再度除去し、２００μｌの固定／透過処理緩衝液（eBioscience, 00-5521-00）に配置して懸濁した。次に、冷蔵温度で３０分以上反応させた。２ｍｌの１×Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液を添加し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を再度添加した。遠心分離を１，５００ｒｐｍで５分間行った。抗ヒトＫｉ－６７－Ｖ４５０（BD Pharmingen, 561281）をチューブ１に添加し、Ｖ４５０マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 561504）をチューブ２および３に添加した。室温で３０分間染色した。
その後、２ｍｌの１×Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液を染色細胞に添加し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、２ｍｌの１×Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液を再度添加した。遠心分離を１，５００ｒｐｍで５分間行った。上清を再度除去し、２００μｌの固定緩衝液（BD, 554655）に配置して懸濁した。次に、ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（BD）を用いて、細胞内の増殖マーカーを調べた。
１以上の遺伝子を形質導入したＨｕＴ ７８細胞株とともに培養したナチュラルキラー細胞におけるＫｉ－６７の発現は、Ｈｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／ＯＸ４０Ｌを除いて、遺伝子導入しなかったＨｕＴ ７８細胞株と比較して相対的に高いレベルで維持されていたことが確認された（図１６ａ～１６ｄ）。
Ｈｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１フィーダー細胞によって再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞の増殖マーカーについて分析を行った。その結果、減少していたＫｉ－６７の発現が７日または１１日間隔のフィーダー細胞による刺激によって増加したことが確認された。さらに、Ｋｉ－６７の発現は、再刺激を繰り返すことにより持続できることが確認された（図１７ａ～１７ｄ）。
実験例５．Ｔ細胞の形質導入遺伝子に依存したナチュラルキラー細胞の共刺激分子の分析
２１日間培養したナチュラルキラー細胞または繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養物を吸引によって除去した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度となるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加え、以下の抗体を用いて表現型解析を行った。
２１日間培養したナチュラルキラー細胞または繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞を回収し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養物を吸引によって除去した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、細胞数を測定した。５×１０６細胞／ｍｌの濃度となるようにＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。希釈した細胞溶液１００μｌを５ｍｌ ＦＡＣＳチューブ（Falcon, 352052）にそれぞれ加え、以下の抗体を用いて表現型解析を行った。
チューブ１：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ（BD Pharmingen, 555332）、抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ（BD Pharmingen, 555432）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５（BD Pharmingen, 555517）または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ Ｃｙ７（BD Pharmingen, 557747）、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１（BD Pharmingen, 562751）
チューブ２：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒトＴＮＦＲＩＩ－ＰＥ（R&D Systems, FAB226P）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ３：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ヒト４－１ＢＢ－ＰＥ（BD Pharmingen, 559446）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ４：抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＰＥマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555749）、抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ５または抗ヒトＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７、抗ヒトＣＤ５６－ＢＶ４２１
チューブ５：ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555748）、ＰＥマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照、ＰＥ－Ｃｙ５マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555750）またはＰＥ－Ｃｙ７マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 557872）、ＢＶ４２１マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 562438）
チューブ１において、抗ヒトＣＤ５６での染色を３つの蛍光のうち１つを選択することによって行ったため、チューブ２～４のＣＤ５６およびチューブ５のアイソタイプ対照について同じ蛍光を選択した。
上記のチューブ内の細胞を、冷蔵温度で３０分間染色した。その後、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を染色細胞に添加し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を再度添加した。遠心分離を１，５００ｒｐｍで５分間行った。上清を再度除去し、２００μｌの固定緩衝液（BD, 554655）中に配置して懸濁した。次に、ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（BD）を用いて、細胞の同定および共刺激分子の試験を行った。
様々な遺伝子の組合せを有するＨｕｔ７８細胞株を用いて２１日間培養したナチュラルキラー細胞の共刺激分子について分析を行った。その結果、１以上の遺伝子を形質導入したＨｕｔ７８細胞株とともに培養したナチュラルキラー細胞における共刺激分子の発現は、遺伝子導入していないＨｕｔ７８細胞株と比較して相対的に高いレベルで維持されることが確認された。特に、単一の遺伝子またはｍｂＩＬ－２１遺伝子を含む複数の遺伝子の組合せを形質導入した細胞株は、他の細胞株よりも共刺激分子のより高い発現を示したことが確認された（図１８ａ～１８ｆ）。
培養の０日目におけるＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１細胞株による１回の刺激の後に培養したナチュラルキラー細胞、または７日もしくは１１日間隔でＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１細胞株によって繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞における共刺激分子について分析を行った。その結果、共刺激分子の発現は増加し、その後、最初の刺激後に追加の再刺激を行わない限り、減少した状態のままであった。一方、フィーダー細胞による繰り返しの刺激により、共刺激分子の発現は刺激の時点で増加し、一定時間経過後に減少したことを繰り返し示しながら、共刺激分子の発現は培養期間中継続された（図１９ａ～１９ｆ）。
実験例６．Ｔ細胞の形質導入遺伝子に依存したナチュラルキラー細胞のサイトカイン分泌の同定
２．５×１０６細胞のＫ５６２がん細胞株を１５ｍｌチューブに配置して遠心分離した。細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌに懸濁した。
２．５×１０６細胞のＫ５６２がん細胞株を１５ｍｌチューブに配置して遠心分離した。細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌに懸濁した。
ナチュラルキラー細胞を２．５×１０６細胞で１５ｍｌチューブに配置して遠心分離した。細胞ペレットを１ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。細胞外に分泌される細胞内のサイトカインを同定するために、タンパク質輸送阻害剤Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ（BD, 555029）およびＧｏｌｇｉｓｔｏｐ（BD, 554724）を添加した。
調製した細胞を９６ウェルＵ底プレート（Nunc, 163320）に分注し、ここでナチュラルキラー細胞および培地をウェル１に各１００μｌ添加し、Ｋ５６２がん細胞株およびナチュラルキラー細胞株を各１００μｌ用いて混合し、ウェル２および３に添加した。
ウェル１、２：抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ（BD Pharmingen, 560664）
ウェル３：ＡＰＣマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555751）
光を遮断して３７℃の温度条件のインキュベーターで４時間反応させ、次いでプレートを２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、以下の抗体を用いてサイトカイン分泌能の分析を行った。
ウェル１、２、３：抗ヒトＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（eBioscience, 45-0036-42）、抗ヒトＣＤ５６－ＡＰＣ－Ｃｙ７（eBioscience, 47-0567-42）、７－ＡＡＤ（Beckman Coulter, Inc., A07704）
プレートを冷蔵温度で３０分間染色した。その後、染色細胞に１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を再度添加した。遠心分離を２，０００ｒｐｍで３分間行った。上清を再度除去し、２００μｌの固定／透過処理緩衝液（BD Pharmingen, 554714）に配置して懸濁した。次に、冷蔵温度で３０分以上反応させた。
２００μｌの１×Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液を添加し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を再度添加した。遠心分離を２，０００ｒｐｍで３分間行った。抗ヒトＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣ（BD Pharmingen, 554700）、抗ヒトＴＮＦα－ＰＥ－Ｃｙ７（eBioscience, 25-7349-82）をウェル１および２に添加し、ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 555748）、ＰＥ－Ｃｙ７マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（BD Pharmingen, 557872）をウェル３に添加した。冷蔵温度で３０分間染色した。
その後、１００μｌの１×Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液を染色細胞に添加し、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、１００μｌの１×Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液を再度添加した。遠心分離を２，０００ｒｐｍで３分間行った。上清を再度除去し、２００μｌの固定緩衝液（BD, 554655）に配置して懸濁した。次に、ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（BD）を用いて、細胞のサイトカイン分泌能を調べた。
様々な遺伝子の組合せを有するＨｕｔ７８細胞株を用いて２１日間培養したナチュラルキラー細胞のＫ５６２がん細胞株に対するサイトカイン分泌能について測定を行った。その結果、１以上の遺伝子を形質導入した細胞株とともに培養した場合、遺伝子導入していない細胞株と比較して、増殖倍率の大きな差異にもかかわらず類似のレベルのサイトカイン分泌能が観察されたことが確認された（図２０ａ～２０ｃ）。
培養の０日目におけるＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１細胞株による１回の刺激の後に培養したナチュラルキラー細胞、または７日もしくは１１日間隔のＨｕｔ７８－ｍＴＮＦ－α／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ－２１細胞株による再刺激を繰り返しながら培養したナチュラルキラー細胞のサイトカイン分泌を、Ｋ５６２がん細胞株との反応によって測定した。１回の刺激を伴って培養したナチュラルキラー細胞と比較して、Ｋ５６２に対するサイトカイン分泌能は、繰り返し再刺激しながら培養したナチュラルキラー細胞において長い培養期間および高い増殖倍率にもかかわらず大きな差異が生じることなく維持されていたことが確認された（図２１ａ～２１ｃ）。
Claims (22)
- ４－１ＢＢＬ遺伝子およびｍｂＩＬ－２１遺伝子を発現する、遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ４－１ＢＢＬ遺伝子が、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列である、請求項２記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ｍｂＩＬ－２１遺伝子が、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１～３のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに発現する、請求項１～４のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ＯＸ４０Ｌ遺伝子が、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項５記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- 配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列である、請求項６記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ｍＴＮＦ－α遺伝子が、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項５～７のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- 配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列である、請求項８記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- 遺伝子が組換えレンチウイルスにより形質導入されている、請求項１～９のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子を発現する、請求項５～１０のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ４－１ＢＢＬ遺伝子、ｍｂＩＬ－２１遺伝子、ＯＸ４０Ｌ遺伝子およびｍＴＮＦ－α遺伝子を発現する、請求項５～１０のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- Ｈｕｔ７８、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｌｏｕｃｙ、Ｍｏｌｔ－３、Ｍｏｌｔ－１３、ＰＥＥＲ、ＲＰＭＩ８４０２、およびＴＡＬＬ－０１細胞からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１～１２のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞。
- ４－１ＢＢＬ遺伝子を発現する遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および種細胞を共培養することを含む、ナチュラルキラー細胞の培養方法。
- 種細胞が、末梢血、末梢血単核細胞、末梢血白血球、濃縮されたナチュラルキラー細胞および単離されたナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１４記載の培養方法。
- 種細胞が、ＣＤ３（＋）細胞が除去された細胞である、請求項１４または１５に記載の培養方法。
- 遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞と種細胞を０．１：１～５０：１の比率で混合して培養を行う、請求項１４～１６のいずれかに記載の培養方法。
- 種細胞をフィーダー細胞と１回混合して培養を５日～６０日間行うか、または種細胞をフィーダー細胞と２回以上混合して培養を６０日以上行う、請求項１４～１７のいずれかに記載の培養方法。
- 抗ＣＤ３抗体およびインターロイキンタンパク質を含む培地中で培養を行う、請求項１４～１８のいずれかに記載の培養方法。
- 抗ＣＤ３抗体が、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａからなる群から選択されるいずれか１つを含む、請求項１９記載の培養方法。
- インターロイキンタンパク質が、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１からなる群から選択されるいずれか１つを含む、請求項１９または２０に記載の培養方法。
- 請求項１～１３のいずれかに記載の遺伝子改変されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性成分として含む、ナチュラルキラー細胞を培養するための組成物。
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