KR20200001595A - 형질전환된 t세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법 - Google Patents

형질전환된 t세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환된 T세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환된 T세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법은 소량의 원료세포로부터 자연살해세포를 효과적으로 증식시켜 제조할 수 있다. 또한, 자연살해세포의 세포살해능도 향상시킨다. 따라서, 본 발명의 형질전환된 T세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법은 세포치료제 상용화에 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 배양방법으로 제조된 자연살해세포는 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

형질전환된 T세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
본 발명은 형질전환된 T세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법에 관한 것이다.
암환자들의 치료 및 재발 방지를 위한 치료법으로 환자의 면역기능을 이용한 면역치료법이 개발되고 있다. 특히, 대량 생산 및 동결이 가능한 자연살해세포를 이용한 면역치료법이 연구되고 있다. 자연살해세포는 말초혈 림프구(peripheral blood lymphocyte)의 약 15% 정도를 차지하는 림프구계 세포로서, 선천성 면역반응에 중요한 역할을 한다.
구체적으로, 자연살해세포는 수지상세포를 활성화시키고 세포독성 T 임파구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 종양에 특이적으로 반응하도록 유도하여 종양세포를 제거한다. 자연살해세포는 육종(sarcoma), 골수종(myeloma), 암종(carcinoma), 림프종(lymphomas) 및 백혈병(leukemia)과 같은 악성 종양을 직접적으로 사멸시킨다. 하지만, 정상인의 체내에 존재하는 대부분의 자연살해세포는 비활성화 상태로 존재하며, 종양을 제거하기 위해서는 활성화된 자연살해세포가 필요하다. 또한, 암환자의 체내에 존재하는 자연살해세포의 경우 암세포의 면역회피 기전에 의해 자연살해세포의 기능적 결함이 존재한다.
따라서, 자연살해세포를 치료제로서 이용하기 위해서는 자연살해세포를 활성화 시키는 것이 매우 중요하다. 또한, 체내에 존재하는 자연살해세포의 세포수는 한정되어 있으므로, 정상인의 혈액 또는 환자의 혈액의 자연살해세포를 대량으로 증식시키고 동결하는 기술의 개발이 필수적이다.
자연살해세포를 대량으로 증식시키기 위한 방법으로는 체외 확장 배양방법을 이용한다. 자연살해세포의 체외 확장 배양에는 PBMC, CD3- 세포, CD3-CD56+ 세포, CD56+ 세포 등이 원료세포로 사용되며, 자연살해세포 증식 인자로 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 등의 사이토카인들과 LPS (Goodier et al., J. Immunol. 165(1):139-147, 2000), CD3을 자극하는 OKT-3 항체(Condiotti et al., Experimental Hematol. 29(1):104-113, 2001)를 이용하고 있다. 상기 언급된 증식인자만으로 자연살해세포를 3배 내지 10배 정도 증식시킬 수 있다. 하지만, 상기 증식율 정도로는 자연살해세포를 치료제로 상업화시키기 어렵다.
최근 여러가지 형태의 지지세포(feeder cell)를 이용하여 자연살해세포를 증폭시키는 방법에 대해 연구되고 있다. 지지세포로 이용되고 있는 세포주로는 말초혈 단핵구, EBV-LCL, K562 세포주가 대표적이다. K562 세포주는 HLA가 결여된 혈액암 유래 세포주로 자연살해세포가 쉽게 공격할 수 있는 대표적인 타겟 세포주이다. 자연살해세포를 배양하는 대부분의 지지세포는 K562 세포주에 4-1BBL과 막 고정된(membrane-bound) IL-15를 발현시켜 증식시키는 방법(Fujisaki et al., Cancer Res. 69(9):4010-4017, 2009), MICA, 4-1BBL, 및 IL-15를 발현시켜 증식시키는 방법(Gong et al., Tissue Antigens, 76(6):467-475, 2010), 및 4-1BBL과 막에 고정된 IL-21을 발현시켜 증식시키는 방법(Cecele JD et al, PloSONE, 7(1):e30264, 2012)등이 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 자연살해세포를 활성 및 증식시키기 위해, CD4+ T세포에 자연살해세포의 증식을 높일 수 있는 보조자극인자 및 성장인자를 발현시켜 효과적으로 자연살해세포를 체외 증식시키는 방법을 개발하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 상기 CD4(+) T세포를 지지세포로 이용한 자연살해세포 배양방법의 효율을 증가시키기 위해, 형질전환된 CD4(+) T세포를 제작하였다. 상기 형질전환된 CD4(+) T세포와 말초혈 단핵구 세포와 공동배양 하였고, 이러한 공동배양을 통해 자연살해세포의 증식율 및 세포살해능이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 상기 형질전환된 CD4(+) T세포를 이용하여, 자연살해세포를 효율적이고 안정적으로 증식시키는 배양방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면은, 4-1BBL 유전자, mbIL-21 유전자, OX40L 유전자 및 mTNF-α 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 발현되는 형질전환된 CD4+ T세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 상기 형질전환된 CD4+ T세포와 원료세포를 공동배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포 배양방법을 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환된 CD4+ T세포를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 배양방법에 의해 제조된 자연살해세포를 제공한다.
본 발명의 형질전환된 T세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법은 소량의 원료세포로부터 자연살해세포를 효과적으로 증식시켜 제조할 수 있다. 또한, 자연살해세포의 세포살해능도 향상시킨다. 따라서, 본 발명의 형질전환된 T세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법은 세포치료제 상용화에 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명의 배양방법으로 제조된 자연살해세포는 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 Hut78 세포주에 도입한 단일 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 1b는 Hut78 세포주에 도입한 이중 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 1c는 Hut78 세포주의 유전자 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 1d는 Hut78 세포주에 도입한 단일 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 1e는 Hut78 세포주에 도입한 mTNF-α/OX40L 및 mTNF-α/4-1BBL 이중 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 1f는 Hut78 세포주에 도입한 mbIL-21/OX40L 및 mbIL-21/4-1BBL 이중 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 1g는 Hut78 세포주에 도입한 삼중 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 1h는 Hut78 세포주에 도입한 사중 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 2a는 H9 세포주에 도입한 단일 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 2b는 H9 세포주에 도입한 이중 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 3a는 Jurkat T세포주에 도입한 단일 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 3b는 Jurkat T세포주에 도입한 이중 유전자의 발현 여부를 FACS를 통해 확인한 도면이다.
도 4a는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 증식률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 4b는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 증식률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 4c는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 증식률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 4d는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 증식률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 5a는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D7R)의 증식률을 나타낸 도면이다.
도 5b는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D7R)의 증식률을 로그(Log)값으로 환산하여 나타낸 도면이다.
도 5c는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D11R)의 증식률을 나타낸 도면이다.
도 5d는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D11R)의 증식률을 로그(Log)값으로 환산하여 나타낸 도면이다.
도 6a는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 생존률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 6b는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 생존률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 6c는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 생존률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 6d는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 생존률을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7a는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 순도(CD3-CD56+)를 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7b는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 활성(CD16+CD56+)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7c는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 순도(CD3-CD56+)를 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7d는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 활성(CD16+CD56+)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7e는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 순도(CD3-CD56+)를 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7f는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 활성(CD16+CD56+)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7g는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 순도(CD3-CD56+)를 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 7h는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 활성(CD16+CD65+)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 8a는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD16 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 8b는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKG2D 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 8c는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp30 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 8d는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp44 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 8e는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp46 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 8f는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 DNAM-1 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 8g는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CXCR3 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 9a는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD16 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 9b는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKG2D 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 9c는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp30 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 9d는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp44 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 9e는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp46 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 9f는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 DNAM-1 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 9g는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CXCR3 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 10a는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD16 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 10b는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKG2D 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 10c는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp30 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 10d는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp44 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 10e는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp46 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 10f는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 DNAM-1 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 10g는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CXCR3 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11a는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD16 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11b는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKG2A 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11c는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKG2C 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11d는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKG2D 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11e는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp30 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11f는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp44 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11g는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp46 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11h는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 DNAM-1 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11i는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CXCR3 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11j는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD62L 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11k는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD57 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 11l는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD69 표현형 마커의 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 12a는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD16, NKG2A, NKG2C 및 NKG2D 표현형 마커의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 12b는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 NKp30, NKp44, NKp46 및 DNAM-1 표현형 마커의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 12c는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD62L, CD69, CXCR3 및 CD57 표현형 마커의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 13a는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 종양세포 살해능을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 13b는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 H9 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 종양세포 살해능을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 13c는 단일 또는 이중 유전자가 도입된 Jurkat T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 종양세포 살해능을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 14a는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 종양세포 살해능(E:T=10:1)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 14b는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 종양세포 살해능(E:T=3:1)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 14c는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 종양세포 살해능(E:T=1:1)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 14d는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 종양세포 살해능(E:T=0.3:1)을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 15a는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(NoS1)의 종양세포 살해능을 세포 비율에 따라 나타낸 도면이다.
도 15b는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D7RS5)의 종양세포 살해능을 세포 비율에 따라 나타낸 도면이다.
도 15c는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D11RS4)의 종양세포 살해능을 세포 비율에 따라 나타낸 도면이다.
도 16a는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 도입 유전자별 Ki-67 증식마커의 발현량을 조직화학적 염색을 통해 나타낸 도면이다.
도 16b는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 16일째의 Ki-67 증식마커 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 16c는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 도입 유전자별 Ki-67 증식마커의 발현량을 평균형광강도(Mean Fluorescence Index, MFI) 비율 값으로 나타낸 도면이다.
도 16d는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 도입 유전자별 Ki-67 증식마커의 발현량을 평균형광강도 비율 값으로 나타낸 도면이다.
도 17a는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 7일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D7R)의 Ki-67 증식마커 발현량을 나타낸 도면이다.
도 17b는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 11일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D11R)의 Ki-67 증식마커 발현량을 나타낸 도면이다.
도 17c는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 7일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D7R)의 Ki-67 증식마커 발현량을 평균형광강도 비율 값으로 나타낸 도면이다.
도 17d는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 11일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D11R)의 Ki-67 증식마커 발현량을 나타낸 평균형광강도 비율 값으로 도면이다.
도 18a는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD25 보조자극인자(co-stimulatory molecule) 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 18b는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 11일째의 자연살해세포의 CD25 보조자극인자 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 18c는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 TNFRII 보조자극인자 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 18d는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 16일째의 자연살해세포의 TNFRII 보조자극인자 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 18e는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 41BB 보조자극인자 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 18f는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 7일째의 자연살해세포의 41BB 보조자극인자 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 19a는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 7일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D7R)의 CD25 보조자극인자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 19b는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 7일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D7R)의 TNFRII 보조자극인자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 19c는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 7일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D7R)의 41BB 보조자극인자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 19d는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 11일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D11R)의 CD25 보조자극인자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 19e는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 11일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D11R)의 TNFRII 보조자극인자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 19f는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양할 때, 11일 간격으로 재자극하여 제조한 자연살해세포(D11R)의 41BB 보조자극인자 발현량을 나타낸 도면이다.
도 20a는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 CD107a 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 20b는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 IFN-γ 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 20c는 단일 내지 사중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포의 TNF-α 발현량을 도입 유전자별로 나타낸 도면이다.
도 21a는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(NoS1)의 CD107a, IFN-γ 및 TNF-α 발현량을 나타낸 도면이다.
도 21b는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D7RS5)의 CD107a, IFN-γ 및 TNF-α 발현량을 나타낸 도면이다.
도 21c는 삼중 유전자가 도입된 Hut78 T세포주와 말초혈 단핵구 세포를 공동배양하여 제조한 자연살해세포(D11RS4)의 CD107a, IFN-γ 및 TNF-α 발현량을 나타낸 도면이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 4-1BBL 유전자, mbIL-21 유전자, OX40L 유전자 및 mTNF-α 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 발현되는 형질전환된 CD4+ T세포를 제공한다.
구체적으로, 하나의 유전자가 도입된 경우, 상기 유전자는 4-1BBL, mbIL-21, OX40L 또는 mTNF-α일 수 있다. 또한, 두 개의 유전자가 도입된 경우, 상기 유전자 조합은 mbIL-21/4-1BBL, 4-1BBL/OX40L, mTNF-α/4-1BBL, mbIL-21/OX40L, mbIL-21/mTNF-α 또는 mTNF-α/OX40L일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 mbIL-21/4-1BBL, mTNF-α/OX40L, mTNF-α/4-1BBL 및 mbIL-21/OX40L 조합의 유전자를 T세포에 도입하였다.
또한, 세 개의 유전자가 도입된 경우, 상기 유전자 조합은 4-1BBL/mbIL-21/OX40L, mbIL-21/OX40L/mTNF-α, mTNF-α/ mbIL-21 /4-1BBL 또는 4-1BBL/OX40L/mTNF-α일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, mTNF-α/ mbIL-21 /4-1BBL 조합의 유전자를 T세포에 도입하였다.
또한, 네 개의 유전자가 도입된 경우, 상기 유전자 조합은 mTNF-α/mbIL-21/OX40L/4-1BBL 일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 mTNF-α/mbIL-21/OX40L/4-1BBL 조합의 유전자를 T세포에 도입하였다.
본 발명에서 사용하는 용어 '4-1BBL'이란, CD137L로 불리는 TNFSF(TNF superfamily) 중 하나로, 삼중합체(trimer)를 형성하여 수용체인 4-1BB와 결합하는 리간드를 의미한다. 상기 4-1BBL 유전자는 인간으로부터 유래된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 4-1BBL 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_003811일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 상기 4-1BBL 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 'mbIL-21'은 세포막에 결합될 수 있도록 고안된 IL-21일 수 있다. 이때, mbIL-21은 IL-21과 막통과단백질이 결합된 융합 단백질일 수 있다. 상기 막통과단백질은 CD8α일 수 있다. 구체적으로는, CD8α의 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-21 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_021803.3일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 또한, 상기 CD8α 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_001768일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 상기 mbIL-21은 세포막에 결합된 IL-21 형태로 발현한다. 또한, 상기 mbIL-21 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 'OX40L'은 ACT-4 수용체, TNF4-인간, GP34 및 CD134L로도 불리며, OX40에 결합하는 리간드를 의미한다. 구체적으로, 상기 OX40L 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_003326일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 OX40L 유전자는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6로 표시되는 염기서열일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 'mTNF-α'는 종양 괴사 인자-알파(tumor necrosis factor-alpha)의 아미노산 서열에서 TACE(tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme) 인식부위인 알라닌-발린(Alanine-Valine)을 프롤린-발린(Proline-Valine)이 되도록 DNA 상에서 점 돌연변이(point mutation) 시킨 유전자를 의미한다. 알라닌을 프롤린으로 돌연변이시킨 것은 랜덤하게 선택한 것이다.
구체적으로, 상기 mTNF-α 유전자는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 9로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 4-1BBL 유전자, mbIL-21 유전자, OX40L 유전자 또는 mTNF-α 유전자는 재조합 렌티 바이러스를 통해 도입될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유전자를 세포 내로 형질도입 시키는 방법은 생화학적 방법, 물리적 방법 또는 바이러스를 매개로 하는 형질도입 방법이 사용될 수 있다. 또한, 생화학적 방법으로 FuGene6 (Roche, USA), 리포펙타민(LipofectamineTM 2000, Invitrogen, USA) 또는 ExGen 500 (MBI Fermentas International Inc. CANADA)를 이용할 수 있다. 또한, 리포펙타민을 이용한 지질 매개법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "벡터"란, 상기 벡터가 도입된 세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현벡터로서, 벡터 내에 도입된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
또한, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터는 CD4+ T세포주에서 발현시킬 수 있는 모든 발현벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(SBI, CD510B-1) 또는 pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo(SBI, CD514B-1) 렌티 바이러스 벡터를 사용하였다.
상기 렌티 바이러스는 장기간의 잠복기를 특징으로 하는 레트로 바이러스과의 바이러스를 의미한다. 렌티 바이러스는 숙주세포의 DNA 내에 유전정보를 전달할 수 있다. 비분열 세포에서 복제할 수 있는 유전자 전달 벡터의 가장 효과적인 방법 중 하나이다.
상기 CD4+ T세포는 체외로 분리된 CD4+ T세포, 체외 확장 배양된 CD4+ T세포 또는 CD4+ T세포주(T 림포마 세포주)일 수 있다. 또한, 상기 CD4+ T세포는 보조 T세포일 수 있으며, CD4+ T세포와 암세포를 융합하여 얻은 하이브리도마(hybridoma)일 수 있다. 구체적으로, CD4+ T세포는 Hut78, H9, Jurkat, Loucy, Molt-3, Molt-13, PEER, RPMI8402 및 TALL-01 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 Hut78, H9 또는 Jurkat T세포일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 형질전환된 CD4+ T세포와 원료세포를 공동배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포 배양방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 '지지세포(feeder cell)'란, 배양보조세포로도 불리며, 증식하지는 못하지만 대사활성이 있어 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적세포의 증식을 도와주는 세포를 의미한다. 상기 지지세포는 4-1BBL 유전자, mbIL-21 유전자, OX40L 유전자 및 mTNF-α 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 발현되는 형질전환된 CD4+ T세포일 수 있다.
상기 지지세포로 이용되는 T세포는 분열증식이 억제된 불활성화 세포 또는 불활성화시키지 않은 것일 수 있으며, 바람직하게는 불활성화시킴으로써 안전성을 확보할 수 있다. 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법을 사용할 수 있다. 불활성화를 시키는 않은 T세포를 사용할 경우 대부분 종양세포들이므로 활성화된 자연살해세포에 의해 배양 중 사멸될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "원료세포(seed cell)"란, 적절한 배양을 통해 자연살해세포로 증식될 수 있는 세포를 의미한다. 구체적으로, 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 농축된(enriched) 자연살해세포 및 분리된 자연살해세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 CD3(+) 세포를 제거시킨 CD3(-) 세포일 수 있다.
상기 자연살해세포의 배양방법은 지지세포와 원료세포의 비율을 0.1 이상으로 혼합하여 배양할 수 있다. 구체적으로, 지지세포와 원료세포의 비율은 0.1:1 내지 50:1일 수 있다. 보다 구체적으로 0.5:1 내지 40:1 일 수 있다. 보다 더 구체적으로는 1:1 내지 30:1 일 수 있다. 가장 구체적으로는 2:1 내지 20:1일 수 있다. 일구체예로, 지지세포와 원료세포의 비율은 5:1의 비율일 수 있으며, 특별히 이에 제한하지 않는다. 상기 "비율"은 세포수를 기준으로 한 비율을 의미한다.
상기 자연살해세포의 배양방법에서 원료세포는 지지세포와 1회 혼합하여 5일 내지 60일간 배양하거나, 지지세포와 2회 이상 혼합하여 60일 이상 배양할 수 있다. 바람직하게, 원료세포는 지지세포와 1회 혼합하여 14일 내지 21일간 배양할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자연살해세포 배양방법은 AIM-V media, RPMI1640, CellGro SCGM, X-VIVO20, IMDM, DMEM과 같은 통상의 동물세포배양용 배지에 자연살해세포 및 T 림포마 세포주를 공동배양한다. 공동배양 시 T세포에 저친화성을 가지며 T세포를 자극하는 항체 및 인터루킨을 첨가하여 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 'T세포에 저친화성(low affinity)을 가지며 T세포를 자극하는 항체'란, T세포 수용체(TCR)와 회합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 반응하는 단백질을 의미한다. 상기 CD3 분자는 TCR과 비교하여 세포 내 영역이 길고 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당하고 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 T세포에 저친화성(low affinity)을 가지며 T세포를 자극하는 항체는, 바람직하게는 항-CD3 항체일 수 있다. 구체적으로, 항-CD3 항체는 OKT-3, UCHT1 또는 HIT3a일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 '인터루킨(Interleukin, IL)'이란, 사이토카인(cytokine) 내 하나의 군으로, 림프구나 단핵구 및 대식세포 등 면역담당세포가 생산하는 단백질성 생물 활성물질을 의미한다. 상기 인터루킨은 IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 또는 IL-21일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 OKT-3 항체와 IL-2를 첨가하여 배양하였다. 첨가하는 OKT-3 항체의 농도는 0.1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖일 수 있다. 바람직하게, OKT-3 항체의 농도는 10 ng/㎕일 수 있다. IL-2의 농도는 10 U/㎖ 내지 2,000 U/㎖일 수 있다. 바람직하게, IL-2의 농도는 500 U/ml일 수 있다. 또한, 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양할 수 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 시판되는 각종 동물 유래의 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래로서 본인 유래의 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 상기 형질전환된 CD4+ T세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치(fed batch) 또는 반복 주입 배치 공정(repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
상기 T세포를 지지세포로 사용하는 배양방법은 PBMC 등의 원료세포에서 선택적으로 자연살해세포의 배양을 유도하고, 공여자에 따른 PBMC 지지세포를 사용하는 경우보다 자연살해세포의 증식 차이가 없이 안정적으로 배양할 수 있다. 따라서, 많은 양의 치료용 자연살해세포 치료제를 효율적이고 안정적으로 확보할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환된 CD4+ T세포를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포 배양방법에 의해 제조된 자연살해세포를 제공한다.
상기 자연살해세포 배양방법에 따라 배양된 자연살해세포는 동결이 가능하고 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않는다. 또한, NKp46과 같은 활성화 수용체(activating receptor)의 발현이 높아 종양 세포주에 대한 살해능 및 사이토카인 분비가 증가하므로, 탁월한 항암 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 임상 적용이 가능한 다량의 활성화된 자연살해세포를 이용하여 종양치료에 유효한 세포치료제를 제조할 수 있다.
또한, 상기 자연살해세포 배양방법에 의해 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 총 중량에 대하여 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
상기 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.
상기 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 자연살해세포의 투여량은 0.01x107 cells/㎏ 내지 1.0x109 cells/㎏일 수 있고, 0.5x107 cells/㎏ 내지 1.0x108 cells/㎏일 수 있다. 이때 투여는 하루에 한 번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 상기 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 렌티 바이러스 제작
실시예 1.1. 재조합 렌티 바이러스 벡터 제작
렌티 바이러스 벡터는 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(SBI, CD510B-1) 또는 pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo(SBI, CD514B-1)를 사용하였다. 유전자는 4-1BBL(TNF superfamily member 9, TNFSF9), mbIL-21(membrane bound IL-21), OX40L(TNF superfamily member 4(TNFSF4) transcript variant 1) 및 mTNF-α(membrane bound TNF alpha)를 도입 유전자로 사용하였다.
구체적으로, 4-1BBL 유전자(서열번호 2)는 4-1BBL 유전자 발현벡터(Origene, RC211160)를 사용하였다. mbIL-21 유전자(서열번호 4)는 코돈-최적화(codon-optimization)된 mbIL-21 유전자 서열이 삽입된 pcDNA3.1 벡터(Genscript, US)를 사용하였다. OX40L 유전자(서열번호 6)는 바이오니아(Bioneer)에 합성을 의뢰하였다.
mTNF-α 유전자(서열번호 9)는 말초혈 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 RNA를 추출한 후, RT(Reverse transcriptase)-PCR로 CDS를 얻었다. TNF-α가 분비되기 위해서 TACE(tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme)에 의해 잘리게 되는데, TNF-α 아미노산 서열에서 TACE 인식 부위인 A-V(Alanine-Valine)을 P-V(Proline-Valine)가 되도록 DNA 상에서 점 돌연변이(point mutation)를 일으켜서 세포막에 부착된 상태를 유지하게 하였다. 상기 점 돌연변이는 서열번호 7로 표시되는 인간 mTNF-α 유전자에서 226번째 염기인 구아닌(guanine)을 시토신(cytosine)으로 치환하고, 228번째 염기인 아데닌(adenine)을 구아닌(guanine)으로 치환하여 수행하였다.
각각의 도입 유전자에 맞는 프라이머를 사용하여 도입 유전자의 CDS(Coding Sequence)를 PCR을 통해 증폭시켰다(표 1).
프라이머 서열정보 (5'->3') 서열번호
4-1BBL 4-1BBL Forward TCTAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGGAATACGCCTCTGACGCTT 서열번호 10
4-1BBL Reverse TTCGCGGCCGCGGATCCTTATTCCGACCTCGGTGAAGG 서열번호 11
mbIL-21 mbIL-21 Forward TAGAGCTAGCGAATTCGCCACCGCCACCATGGCTCTGCCC 서열번호 12
mbIL-21 Reverse TCGCGGCCGCGGATCCTCAATACAGGGTGATGACC 서열번호 13
OX40L OX40L Forward TAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGGAACGGGTGCAAC 서열번호 14
OX40L Reverse TCGCGGCCGCGGATCCTCACAAGACACAGAACTCCCC 서열번호 15
mTNF-α mTNF-α Forward TAGAGCTAGCGAATTCGCCACCGCCACCATGGCTCTGCCC 서열번호 16
mTNF-α Reverse TCGCGGCCGCGGATCCTCACAGGGCAATGATCCC 서열번호 17
상기 표 1은 실험에 사용된 프라이머들을 나타낸 것이다.
도입 유전자와 렌티 바이러스 벡터에 EcoRI과 BamHI 제한효소를 처리하였다. 그 후, In-Fusion HD cloning kit(Clontech, 639649)를 이용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션시킨 렌티 바이러스 벡터를 DH5α 수용성 세포(competent cell)에 형질전환시켜 배양하였다. 형질전환시킨 DH5α 수용성 세포로부터 plasmid mini-prep kit(MACHEREY-NAGEL / 740422.50)을 이용하여 플라스미드 DNA를 수득하였다. 모든 플라스미드 DNA는 외부 업체에 시퀀싱(sequencing)을 의뢰하여 DNA 서열이 일치하는 것을 확인하였다.
실시예 1.2. 농축된 렌티 바이러스 제작
재조합 렌티 바이러스 생산을 위해 293T세포주를 형질도입(transfection) 2일 전에 1.5x106 내지 2x106 cells로 75T 플라스크(Nunc, 156499)에 접종하여 5% CO2, 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 293T세포의 세포 포화도가 80% 내지 90% 정도가 되었을 때, 6 ㎖ OPTI-MEM(Gibco, 31985-088)으로 배지를 교체하여 37℃ 온도에서 5% CO2 조건으로 30분 동안 배양하였다. DNA 혼합액과 리포펙타민(lipofectamine 2000, Life technologies, 11668500) 혼합액을 준비하였다(표 2).
구 분 성 분
DNA 혼합액 6 ㎍ 타겟 DNA, 6 ㎍ Gag, 6 ㎍ REV, 3 ㎍ VSVG, 1 ㎖ OPTI-MEM
리포펙타민 혼합액 36 ㎕ lipofectamine 2000, 1 ㎖ OPTI-MEM
상기 표 2는 DNA 혼합액과 리포펙타민(lipofectamine 2000, Life technologies, 11668500) 혼합액을 나타낸 것이다.
상기 각각의 혼합액 성분을 볼텍서(vortexer)를 이용해 잘 섞고 상온에서 3분간 방치하였다. 그 후, 두 혼합액을 섞어 상온에서 20분 이상 방치하였다. DNA와 리포펙타민이 혼합된 용액 2 ㎖를 배지를 교체해준 293T세포에서 처리하였다. 4시간 후, 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM(Gibco, 11995073) 배지로 교체하고 48시간 동안 37℃ 온도에서 5% CO2 조건으로 배양하였다.
48시간 동안 배양한 293T세포의 배양액 8 ㎖를 수거하여 0.45 ㎛ 필터(Millipore, SLHP033RS)로 걸러주었다. 걸러진 배양액을 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane(Merckmillipore, UFC910096)을 이용하여 250 ㎕ 이하로 농축하였다. 농축된 바이러스는 적당량으로 분주하여 -80℃ 온도에 보관하였다.
실시예 2. 유전자 도입 T세포 제작
실시예 2.1. 렌티 바이러스 감염
배양중인 0.5x106 개의 T세포주와 1 ㎖ OPTI-MEM, 50 ㎕ 렌티 바이러스 해동액, 10 ㎍/㎖ 폴리브렌(polybrene, Santa Cruz, C2013)을 혼합하여 6-웰 플레이트(6-well plate, Nunc, 140675)에 넣고 1800 g, 32℃ 온도에서 90분간 회전접종(spinoculation)을 진행하였다. 그 후, 2시간 동안 5% CO2, 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 배양한 후, 기존 배양배지로 교체해주고 48시간 동안 배양하였다.
Hut78 세포주(ATCC, TIB-161™)는 20%(v/v) FBS를 포함하는 IMDM(ATCC, 30-2005)배지에서 배양하였다. 계대배양시 세포 농도는 1.5x105 cells/㎖ 내지 2.0x105 cells/㎖로 유지하였다. H9 세포주(ATCC, HTB-176™)와 Jurkat T세포주(ATCC, TIB-152™)는 10%(v/v) FBS를 포함하는 RPMI1640(ATCC, 30-2001) 배지에서 배양하였다. 계대 배양 시 세포 농도는 각각 1.0x105 cells/㎖ 내지 1.5x105 cells/㎖과 0.5x105 cells/㎖ 내지 1.0x105 cells/㎖로 유지하였다. 모든 세포주의 계대배양은 2일 내지 3일 간격으로 진행하였다. 배양용기는 75T 플라스크를 사용하였고, 배지량은 15 ㎖ 내지 20 ㎖을 유지하였다.
재조합 렌티 바이러스에 감염된 세포주는 항생제를 이용하여 선별하였다(표 3).
도입 유전자 조합 세포주 항생제 사용 농도
mTNF-αmbIL-21 Hut78 1 ㎍/㎖ puromycin(Life technologies, A1113802)또는 6 ㎍/㎖ blasticidin (Gibo, R210-01)
H9
Jurkat
OX40L4-1BBL Hut78 1 ㎍/㎖ puromycin또는 50 ㎍/㎖ G418 (Sigma Aldrich, G8168)
H9
Jurkat 1 ㎎/㎖ G418
mTNF-α/OX40LmbIL-21/OX40LmbIL-21/4-1BBL Hut78 1 ㎍/㎖ puromycin 또는 6 ㎍/㎖ blasticidin50 ㎍/㎖ G418
H9
Jurkat 0.5 ㎍/㎖ puromycin1 ㎎/㎖ G418
mTNF-α/mbIL-21/4-1BBLmTNF-α/mbIL-21/OX40L/4-1BBL Hut78 1 ㎍/㎖ puromycin6 ㎍/㎖ blasticidin50 ㎍/㎖ G418
상기 표 3은 유전자가 도입된 세포주에 사용된 항생제를 나타낸 것이다.
실시예 2.2. 도입 유전자 발현 확인
상기 실시예 2.1.에서 계대배양한 T세포주를 수거하여 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 그 후, 배양액을 흡입(suction)하여 제거하였다. PBS에 2%(v/v) FBS를 첨가하여 FACS 버퍼를 만들었다. 1 ㎖의 FACS 버퍼로 희석하여 세포수를 측정하고, 5x106 cells/㎖ 농도가 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 ㎖ FACS 튜브 (Falcon, 352052)에 희석한 세포용액을 100 ㎕씩 넣었다. 항-인간 TNF-α(membrane)-PE(R&D systems, FAB210P), 항-인간 OX40L-PE(BD, 558184), 항-인간 4-1BBL-PE(BD, 559446), 항-인간 IL-21-PE(eBioscience, 12-7219-42), 7-AAD(Beckman coulter, IM3630c), PE 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 555749), PerCP-Cy5.5 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD, 550795) 항체로 염색한 후 FACS 장비를 이용하여 각 유전자의 발현율을 분석하였다(도 1a 내지 도 3b).
실시예 3. CD3(-) PBMC 및 유전자 도입 T세포 공동배양
실시예 3.1. CD3(-) PBMC 원료세포의 준비
건강한 공여자로부터 채취한 PBMC에 PBS(phosphate buffered saline, LONZA, 17-516Q)를 1:1 비율로 추가하여 1,500 rpm, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리 하였다. PBS에 2%(v/v) FBS와 2 mM EDTA를 첨가하여 MACS 러닝버퍼를 만들었다. PBMC 펠렛을 10 ㎖ MACS 러닝 버퍼에 현탁하고, Adam cell counter system을 사용하여 세포수를 측정하였다.
CD3(+) 세포를 제거시킨 원료세포를 수득하기 위해, 5x107 개의 PBMC를 새로운 50 ㎖ 튜브로 옮긴 후 1,200 rpm, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리 하였다. 5x107개의 PBMC 세포 펠렛에 400 ㎕의 MACS 러닝버퍼와 100 ㎕의 CD3 자기비드(Miltenyi biotech, 130050101)를 넣고 4℃ 온도에서 20분간 반응시켰다. 10 ㎖ 내지 20 ㎖의 MACS 러닝버퍼를 넣어 세척한 뒤 1,200 rpm, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리하고 다시 2 ㎖의 MACS 러닝버퍼에 현탁하였다.
VarioMACS(Miltenyi Biotech)에 CS 컬럼(column, Miltenyi Biotech, 130-041-305)을 장착하여 세포를 분리하였다. 최종 20 ㎖이 될 때까지 컬럼을 세척하여 세포를 회수하였다. Adam cell counter system을 사용하여 세포수를 측정하여 1x107개의 세포를 새로운 50 ㎖ 튜브에 담아 1,200 rpm, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 동결배지에 현탁하여 1 바이알(vial)당 1x107 개의 세포를 액체 질소에 동결하였다.
얼려둔 하나의 CD3(-) PBMC 바이알을 녹여 50 ㎖ 튜브로 옮기고, 0.6%(v/v) ACD(Citrate-dextrose solution, Sigma-Aldrich, C3821), 0.2%(v/v) FBS(Fetal serum bovine)와 2 mM EDTA를 포함하는 PBS로 현탁하여 1,200 rpm, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리하였다. CD3(-) PBMC 펠렛을 1%(v/v) CellGro 배지(Cellgenix, 20802-0500)에 현탁하고, Adam cell counter system을 사용하여 세포수를 측정하였다. CD3(-) PBMC 원료세포를 1x106 cells/㎖ 농도에 맞춰 1%(v/v) CellGro 배지에 현탁하였다.
실시예 3.2. CD3(-) PBMC 원료세포와 유전자 도입 T 지지세포 공동배양
유전자 도입 T세포는 배양 플라스크에서 회수하여 1,200 rpm, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리하였다. 그 후, 1%(v/v) CellGro 배지에 현탁하고, Adam cell counter system을 사용하여 세포수를 측정하였다. 유전자 도입 T 지지세포를 5x106 cells/㎖ 농도에 맞춰 1%(v/v) CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 20,000 cGy로 조사하여 불활성화시켜 준비하였다.
자연살해세포 배양시 500 IU의 IL-2(프로류킨 주, 한국노바티스)와 10 ng/㎖의 OKT-3(eBioscience, 16-0037-85)를 배양 플라스틱 플레이트에 넣어주었다. 배양 0일째 CD3(-) PBMC 원료세포와 유전자 도입 T 지지세포를 1:5 또는 1:2.5의 비율로 각각 0.5 ㎖ 내지 1 ㎖로 넣고 1%(v/v) 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 0.25 ㎖ 내지 0.5 ㎖ 넣어 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 4일 내지 7일 동안 배지를 추가해주며 정치 배양하였다.
배양 4일 내지 5일째에 세포수를 측정하여 약 0.5x106 내지 1x106 cells/㎖ 농도가 되도록 하였다. 그 후, 500 IU의 IL-2와 1%(v/v) 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하여 적절한 배양용기에 넣어 다시 정치 배양하였다.
이후 2일 내지 3일 간격으로 세포수를 측정하고 0.5x105 내지 1x106 cells/㎖ 농도가 되도록 하였다. 그 후, 500 IU의 IL-2와 1%(v/v) 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하며 21일까지 부유배양하였다. 부유배양 21일째 자연살해세포를 수득하였다.
배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포수(Total nucleated cells, TNC) 기준 증식률은 유전자가 도입되지 않은 세포주(H9 76배, Hut78 382배, Jurkat 26배) 대비 하나 이상의 유전자(mTNF-α, OX40L, 4-1BBL, 또는 mbIL-21)를 도입한 세포주로 배양하는 것이 자연살해세포의 증식을 높이는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 4-1BBL 유전자 또는 mbIL-21 유전자를 단일로 도입하였을 경우에 비해 mbIL-21/4-1BBL 유전자가 도입된 세포주의 경우 Hut78-mbIL-21/4-1BBL 4,169배, H9-mbIL-21/4-1BBL 3,758배, Jurkat-mbIL-21/4-1BBL 258배로 T세포 종류에 상관없이 월등히 높은 자연살해세포 증식률을 유도하였다(표 4, 도 4a 내지 4c). 즉, mbIL-21 유전자 및 4-1BBL 유전자를 도입할 경우 시너지 효과를 내는 것을 확인하였다.
도입된 유전자 Hut78 feeder cellFold increase(D21) H9 feeder cellFold increase(D21) Jurkat feeder cellFold increase(D14)
parental 382.0±379.78 79.3±38.60 26.1±15.45
mTNF-α 532.5±315.48 147.7±101.04 19.1±8.84
OX40L 541.4±353.22 - -
4-1BBL 992.3±423.75 689.8±541.60 121.7±30.46
mbIL-21 979.2±745.36 277.8±71.00 1.4±1.05
mTNF-α/OX40L 916.0±204.52 - -
mTNF-α/4-1BBL 1871.7±701.68 985.3±705.35 60.7±20.09
mbIL-21/4-1BBL 4169.5±2795.10 3758.5±3232.39 258.5±121.36
상기 표 4는 단일 또는 이중 유전자를 도입한 T세포주로 배양한 자연살해세포의 증식율을 나타낸 것이다.
두 개 이상의 유전자 조합을 도입했을 때 나타나는 시너지 효과를 확인하기 위해 앞서 실험한 유전자 조합과 함께 삼중(mTNF-α/mbIL-21/4-1BBL) 또는 사중(mTNF-α/mbIL-21/OX40L/4-1BBL) 유전자를 Hut78 T세포주에 도입하여 배양된 자연살해세포의 증식 효과를 비교하였다. 이중 유전자가 도입된 세포주 중에서 가장 높은 자연살해세포 증식을 유도하는 세포주는 mbIL-21/4-1BBL 유전자가 도입된 세포주(998배)이다. 그러나, 삼중 유전자 도입 세포주(1,607배) 또는 사중 유전자 도입 세포주(1,640배)로 배양했을 때 mbIL-21/4-1BBL 유전자가 도입된 세포주(998배)에 비해, 더 높은 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였다(표 5 및 도 4d).
도입된 유전자 Hut78 feeder cellFold increase(D21)
parental 72.1 ±71.5
mTNF-α 121.9 ±103.0
OX40L 212.4 ±297.2
4-1BBL 235.1 ±195.1
mbIL-21 737.2 ±393.6
mTNF-α/OX40L 77.8 ±67.3
mTNF-α/4-1BBL 385.4 ±293.3
mbIL-21/4-1BBL 998.3 ±911.2
mbIL-21/OX40L 743.0 ±411.7
mTNF-α/mbIL-21/4-1BBL 1607.3 ±845.0
mTNF-α/mbIL-21/OX40L/4-1BBL 1640.6 ±1191.6
원료세포 단일배양 0.8
상기 표 5는 다중 유전자를 도입한 T세포주로 배양한 자연살해세포의 증식율을 나타낸 것이다.
유전자 도입에 따른 T세포주의 반복적인 재자극으로 자연살해세포의 배양을 지속적으로 유지시킬 수 있는지 확인하기 위해 실험을 진행하였다.
삼중 유전자가 도입된 Hut78 세포는 배양 플라스크에서 회수하여 1,200 rpm, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리하였다. 그 후, 1%(v/v) CellGro 배지에 현탁하고, Adam cell counter system을 사용하여 세포수를 측정하였다. 삼중 유전자가 도입된 Hut78 지지세포를 2.5x106 cells/㎖ 농도에 맞춰 1%(v/v) CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 20,000 cGy로 조사하여 불활성화시켜 준비하였다.
자연살해세포 배양시 500 IU의 IL-2(프로류킨 주, 한국노바티스)와 10 ng/㎖의 OKT-3(eBioscience, 16-0037-85)를 배양 플라스틱 플레이트에 넣어주었다.
배양 0일째 CD3(-) PBMC 원료세포와 삼중 유전자가 도입된 Hut78 지지세포를 1:2.5의 비율로 각각 0.5 ㎖ 내지 1 ㎖로 넣고 1%(v/v) 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 0.5 ㎖ 내지 1 ㎖ 넣어 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 4일 내지 5일 동안 정치 배양하였다. 배양 2일 또는 3일째에 배지의 반을 덜어내고 1%(v/v) 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 덜어낸 만큼 넣어 주었다. 배양 4일 또는 5일째에 세포수를 측정하여 약 0.5x106 cells/㎖ 내지 1x106 cells/㎖ 농도가 되도록 하였다.
배양 7일 또는 11일째에 세포수를 측정하여 1x106 cells/㎖ 농도에 맞춰 1%(v/v) CellGro 배지에 현탁하였다. 재자극을 위해 삼중 유전자가 도입된 Hut78 지지세포를 1:2.5의 비율로 각각 0.5 ㎖ 내지 1 ㎖로 넣고 500 IU의 IL-2(프로류킨 주, 한국노바티스)와 10 ng/㎖의 OKT-3(eBioscience, 16-0037-85)와 1%(v/v) 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 0.5 ㎖ 내지 1 ㎖로 넣어 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 3일 내지 4일 동안 정치 배양하였다. 이후 2일 또는 3일 간격으로 세포수를 측정하고 0.5x105 cells/㎖ 내지 1x106 cells/㎖ 농도가 되도록 하였다.
7일 또는 11일 간격으로 재자극 과정을 반복하여 7일 간격으로 총 4번(D7RS5), 11일 간격으로 총 3번(D11RS4)의 재자극을 주었다.
배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포수(Total nucleated cells, TNC) 기준 증식률은 재자극을 주지 않은 증식률 대비 한번 이상의 재자극을 주어 배양하는 것이 자연살해세포의 증식을 높이는 것을 확인할 수 있었다(도 5a 내지 5d). 배양 0일째 1회 Hut78-mTNF-α /4-1BBL/mbIL-21 세포주로 자극시 25일까지 배양이 지속되었고 2,124배 증식하였다. 7일 간격으로 5회 Hut78-mTNF-α/4-1BBL/mbIL-21 세포주로 자극시 35일까지 배양이 지속되었으며 436,032배 증식하였다. 11일 간격으로 4회 Hut78-mTNF-α/4-1BBL/mbIL-21 세포주로 자극시 42일까지 배양이 지속되었으며 2,628,153배 증식하였다. 따라서, Hut78-mTNF-α/4-1BBL/mbIL-21 T세포주를 7일 또는 11일 간격으로 반복하여 자극시 자연살해세포 증식이 지속적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 1. 도입 유전자에 따른 자연살해세포의 세포생존율 확인
인-비트로(in-vitro) 세포생존율을 비교, 평가하기 위하여 세포내 핵과 결합할 수 있는 PI 염색액을 사용하는 세포계수기(Cell counter) 중에 하나인 Adam cell counter system 사용하였다. 측정된 총 세포수에서 사멸 세포수를 감하여 생존 세포수를 계산한 후, 하기 수학식 I을 이용하여 세포생존율(Cell viability)을 계산하였다.
[수학식 I]
세포생존율 (%) = (생존 세포수/총 세포수) x 100
21일 배양 후 자연살해세포의 생존율을 측정한 결과, 모든 조건에서 약 80% 이상의 높은 세포생존율을 보여주었다(도 6a 내지 도 6d).
실험예 2. 도입 유전자에 따른 자연살해세포의 세포표현형 분석
21일 배양된 자연살해세포 또는 반복적인 재자극으로 배양된 자연살해세포를 수거하여 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하고, 배양액을 흡입하여 제거하였다. 1 ㎖의 FACS 버퍼로 희석하여 세포 수를 측정하고, 5x106 cells/㎖ 농도가 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 ㎖ FACS 튜브 (Falcon, 352052)에 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 넣고, 하기 항체로 표현형을 분석하였다.
튜브 1: 항-인간 CD3-FITC(BD Pharmingen, 555332), 항-인간 CD16-PE(BD Pharmingen, 555407), 항-인간 CD56-PE-Cy5(BD Pharmingen, 555517) 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7(BD Pharmingen, 557747), 항-인간 CD56-BV421(BD Pharmingen, 562751)
튜브 2: 항-인간 CD14-FITC(BD Pharmingen, 555397), 항-인간 CD19-PE(BD Pharmingen, 555413), 항-인간 CD3-PE-Cy5(BD Pharmingen, 555341) 또는 항-인간 CD3-PE-Cy7(eBioscience, 25-0038-42), 항-인간 CD3-BV421(BD Pharmingen, 562438)
튜브 3: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKG2D-PE (R&D system, FAB139P), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 4: 항-인간 CD3-FITC, anti-human NKp30-PE (BD Pharmingen, 558407), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 5: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKp44-PE (BD Pharmingen, 558563), 항-인간CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 6: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKp46-PE (BD Pharmingen, 557991), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 7: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 DNAM-1-PE (BD Pharmingen, 559789), 항-인간CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 8: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 CXCR3-PE (BD Pharmingen, 557185), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 9: 항-인간 CD3-FITC, PE 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤 (BD Pharmingen, 555749), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 10: FITC 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 555748), PE 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤, PE-Cy5 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 555750) 또는 PE-Cy7 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 557872), BV421 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 562438)
튜브 11: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKG2A-PE (R&D system, FAB1059P), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 12: 항-인간 CD3-FITC, anti-human NKG2C-PE (R&D system, FAB138P), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 13: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 CD62L-PE (ebioscience, 12-0629-42), 항-인간CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 14: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 CD69-PE (R&D system, FAB23591P), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 15: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 CD57-PE (BD Pharmingen, 560844), 항-인간CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
상기 튜브 1에서 항-인간(anti-human) CD56은 세 가지 형광 중에 한 가지를 선택하여 진행하였고, 그에 따라 튜브2의 CD3와 튜브 3 부터 9, 11 부터 15까지의 CD56, 튜브 10의 아이소타입 컨트롤의 형광을 같은 것으로 선택하였다.
상기 튜브들을 30분간 냉장 온도에서 염색하였다. 그 후, 염색이 끝난 세포에 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 200 ㎕ 고정버퍼(fixation buffer, BD, 554655)를 넣어 현탁한 후 FACS LSRII Fortessa(BD)를 이용하여 세포의 확인 및 순도와 표현형을 조사하였다.
21일 배양된 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, NK 세포(CD3-CD56+) 함량은 모든 조건에서 95% 이상이었고, 자연살해세포의 활성을 평가하기 위한 CD56+CD16+ 마커는 이중 유전자가 도입된 T 지지세포에서 발현이 높게 유지되는 것을 확인하였다(도 7a 내지 도 7h).
또한, 대표적인 자연살해세포의 수용체(receptor) 발현을 분석하였다. CD16은 모두 높게 발현하고 있었고 활성마커인 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1이 유전자를 도입하지 않은 조건이나 단일 유전자 도입 지지세포 조건에 비해 이중 유전자 도입 지지세포 조건에서 공여자 간 편차(variation)없이 모두 높게 발현하는 것을 확인하였다. 특히 CXCR3는 이중 유전자 도입 지지세포 조건에서 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이중 유전자 도입 지지세포가 NK 세포의 활성 및 종양 타겟팅을 높일 수 있는 유용한 지지세포임을 확인하였다(도 8a 내지 도 11l).
유전자 도입에 따른 T세포주의 반복적인 재자극으로 배양된 자연살해세포의 수용체 및 활성마커를 확인한 결과 활성마커(CD16, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1)의 경우 재자극하지 않은 조건이나 반복적인 재자극 조건 모두 재자극 간격이나 배양 기간이 늘어남에도 큰 차이없이 발현하는 것을 확인하였다(도 12a 내지 12c).
실험예 3. T세포의 도입 유전자 및 공동배양에 따른 자연살해세포의 세포살해능 확인
1x106 개의 K562 암세포주를 15 ㎖ 튜브에 담아 원심분리하였다. 세포 펠렛을 1 ㎖의 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지로 현탁하였다. 그 후, 1 mM의 Calcein-AM(Molecular probe, C34852)을 30 ㎕ 넣은 다음 은박지로 빛을 차단하여 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 한 시간 동안 염색했다.
Calcein-AM 염색이 끝난 종양 세포주는 10 ㎖ 내지 15 ㎖의 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지를 넣어 세척하고 원심 분리한 뒤 펠렛을 10 ㎖의 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지로 현탁하여 1x105 cells/㎖의 농도가 되도록 하였다. 자연살해세포는 1x106 cells를 15 ㎖ 튜브에 담아 원심분리하고, 펠렛을 K562 암세포주에 대비하여 원하는 비율(1:1)로 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에 현탁하였다. 준비된 K562 암세포주와 자연살해 세포주를 둥근 바닥 96-웰 플레이트(96-well U-bottom plate, Nunc, 163320)에 100 ㎕씩 섞어서 분주하고, 각 웰을 3 개씩(triplicate) 준비하여 평균값을 얻었다.
스판(Spontaneous release) 웰에는 염색된 K562 암세포주를 100 ㎕씩 넣고 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지를 100 ㎕씩 넣어주었다. 맥스(Maximum release) 웰에는 염색된 K562 암세포주를 100 ㎕씩 넣고 2%(v/v) Triton-X 100이 첨가된 3차 증류수를 100 ㎕씩 넣어주었다.
10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지 및 2%(v/v) Triton-X 100이 첨가된 RPMI1640 배지에 존재하는 자가 형광값(auto-fluorescence)을 보정하기 위해 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지 200 ㎕를 넣어 배지값을 준비하고, 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지 100 ㎕에 2%(v/v) Triton-X 100이 첨가된 RPMI1640 배지 100 ㎕를 넣어 두 용액의 혼합액의 값을 준비한다. 배지값에서 혼합액의 값을 뺀 차(A)를 맥스(Maximum release)값에 더하여 자가 형광값을 보정하였다.
빛을 차단하여 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상층액을 96-웰 블랙 플레이트(96 well black plate, Nunc, 237108)에 100 ㎕씩 분주하였다. 형광 플레이트 리더기(Perkin Elmer, VICTOR X3)를 이용하여 형광값(OD480/535 nm)을 측정하고, 자연살해세포의 종양 세포살해능은 하기 수학식 II를 이용하여 계산하였다.
[수학식 II]
% of killing = (Sample well 평균 형광값 - Spon well 평균 형광값)/{(Max well 평균 형광값 + A) - Spon well 평균형광값} x 100
다양한 지지세포로 배양된 자연살해세포들을 K562 암세포주와 반응시켜 직접적인 세포살해능을 측정하였다. 다른 조건들보다 이중 유전자가 도입된 지지세포 조건에서 K562 암세포주에 대한 세포살해능이 평균적으로 증가하였다(도 13a 내지 도 14d).
유전자 도입에 따른 T세포주의 반복적인 재자극으로 배양된 자연살해세포들을 K562 암세포주와 반응시켜 직접적인 세포살해능을 측정하였다. 재자극하지 않은 조건이나 반복적인 재자극 조건 모두 배양기간이 길어지고 증식배수가 높아져도 K562에 대한 세포살해능이 잘 유지되는 것을 확인하였다(도 15a 내지 15c).
실험예 4. T세포의 도입 유전자 및 공동배양에 따른 자연살해세포의 증식 마커(Ki-67) 분석
21일 배양된 자연살해세포 또는 반복적인 재자극으로 배양된 자연살해세포를 수거하여 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하고, 배양액을 흡입(suction)하여 제거하였다. 1 ㎖의 FACS 버퍼로 희석하여 세포 수를 측정하고, 5x106 cells/㎖ 농도가 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 ㎖ FACS 튜브(Falcon, 352052)에 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 넣고, 하기 항체로 증식 마커를 분석하였다.
튜브 1: 항-인간 CD3-FITC(BD Pharmingen, 555332), 항-인간 CD56-PE-Cy7(BD Pharmingen, 557747), 7-AAD(Beckman coulter, A07704)
튜브 2: 항-인간 CD3-FITC(BD Pharmingen, 555332), 항-인간 CD56-PE-Cy7(BD Pharmingen, 557747), 7-AAD(Beckman coulter, A07704)
튜브 3: FITC 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 555748), PE-Cy7 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 557872)
상기 튜브들을 30분간 냉장 온도에서 염색하였다. 그 후, 염색이 끝난 세포에 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 200 ㎕ 고정/투과화 버퍼(fixation/permiabilization buffer, ebioscience, 00-5521-00)를 넣어 현탁한 후 30분 이상 냉장 온도에서 반응하였다. 2 ㎖ 1xPerm/wash 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 튜브 1에는 항-인간 Ki-67-V450(BD Pharmingen, 561281), 튜브 2와 3에는 V450 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 561504)를 넣고 30분간 상온에서 염색하였다.
그 후, 염색이 끝난 세포에 2 ㎖ 1xPerm/wash 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 ㎖ 1xPerm/wash 버퍼를 넣고 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 200 ㎕ 고정버퍼(fixation buffer, BD, 554655)를 넣어 현탁한 후 FACS LSRII Fortessa(BD)를 이용하여 세포의 증식 마커를 조사하였다.
유전자가 도입되지 않은 세포주 대비 하나 이상의 유전자가 도입된 세포주로 배양한 자연살해세포의 Ki-67 발현이 Hut78-mTNF-α/OX40L를 제외하고 비교적 높게 유지되는 것을 확인하였다(도 16a 내지 16d).
Hut78-mTNF-α/4-1BBL/mbIL-21 지지세포로 재자극을 통해 배양된 자연살해세포의 증식 마커를 분석한 결과, 7일 또는 11일 간격 지지세포의 자극으로 감소하던 Ki-67의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 반복적인 재자극을 통해 Ki-67의 발현이 지속될 수 있음을 확인하였다(도 17a 내지 17d).
실험예 5. T세포의 도입 유전자 및 공동배양에 따른 자연살해세포의 보조자극(co-stimulatory) 인자 분석
21일 배양된 자연살해세포 또는 반복적인 재자극으로 배양된 자연살해세포를 수거하여 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하고, 배양액을 흡입(suction)하여 제거하였다. 1 ㎖의 FACS 버퍼로 희석하여 세포 수를 측정하고, 5x106 cells/㎖ 농도가 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 ㎖ FACS 튜브 (Falcon, 352052)에 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 넣고, 하기 항체로 표현형을 분석하였다.
튜브 1: 항-인간 CD3-FITC(BD Pharmingen, 555332), 항-인간 CD25-PE(BD Pharmingen, 555432), 항-인간 CD56-PE-Cy5(BD Pharmingen, 555517) 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7(BD Pharmingen, 557747), 항-인간 CD56-BV421(BD Pharmingen, 562751)
튜브 2: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 TNFRII-PE (R&D system, FAB226P), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 3: 항-인간 CD3-FITC, anti-human 4-1BB-PE (BD Pharmingen, 559446), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 4: 항-인간 CD3-FITC, PE 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤 (BD Pharmingen, 555749), 항-인간 CD56-PE-Cy5 또는 항-인간 CD56-PE-Cy7, 항-인간 CD56-BV421
튜브 5: FITC 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 555748), PE 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤, PE-Cy5 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 555750) 또는 PE-Cy7 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 557872), BV421 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 562438)
상기 튜브 1에서 항-인간(anti-human) CD56은 세 가지 형광 중에 한 가지를 선택하여 진행하였고, 그에 따라 튜브 2부터 4까지의 CD56, 튜브 5의 아이소타입 컨트롤의 형광을 같은 것으로 선택하였다.
상기 튜브들을 30분간 냉장 온도에서 염색하였다. 그 후, 염색이 끝난 세포에 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고 1500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 200 ㎕ 고정버퍼(fixation buffer, BD, 554655)를 넣어 현탁한 후 FACS LSRII Fortessa (BD)를 이용하여 세포의 확인 및 보조자극인자를 조사하였다.
다양한 유전자 조합의 Hut78 세포주를 이용해 21일 배양된 자연살해세포의 보조자극인자를 분석한 결과, 유전자를 도입하지 않은 Hut78 세포주 대비 하나 이상의 유전자를 도입한 Hut78 세포주로 배양한 경우 보조자극인자의 발현이 비교적 높게 유지되는 것을 확인하였다. 특히, mbIL-21 유전자를 포함하는 단일 또는 다중 유전자 조합으로 도입된 세포주의 경우 다른 세포주 대비 높은 보조자극인자의 발현을 보이는 것을 확인하였다(도 18a 내지 18f).
Hut78-mTNF-α/4-1BBL/mbIL-21 세포주로 배양 0일째, 1회자극 후 배양된 자연살해세포 또는 7일이나 11일 반복적인 재자극을 통해 배양된 자연살해세포의 보조자극인자를 분석한 결과, 1회 자극 후 추가적인 재자극을 하지 않으면 보조자극인자의 발현이 증가한 후 감소한 상태를 유지하였다. 반면, 지지세포의 반복적인 자극시 자극시점에 보조자극인자의 발현이 증가하였다가 일정 시간 이후 감소되는 것이 반복되면서 배양 기간 동안 보조자극인자의 발현이 지속되었다(도 19a 내지 19f).
실험예 6. T세포의 도입 유전자 및 공동배양에 따른 자연살해세포의 싸이토카인 분비능 확인
K562 암세포주 2.5x106 cells를 15 ㎖ 튜브에 담아 원심분리하였다. 세포 펠렛을 1 ㎖의 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지로 현탁하였다.
자연살해세포는 2.5x106 cells를 15 ㎖ 튜브에 담아 원심분리하였다. 세포 펠렛을 1 ㎖의 10%(v/v) FBS가 첨가된 RPMI1640 배지로 현탁하였다. 세포 밖으로 분비하는 싸이토카인을 세포 내에서 확인하고자 단백질 수송 저해제(protein transport inhibitor)인 Golgiplug(BD, 555029)와 Golgistop(BD, 554724)를 넣어주었다.
준비된 세포는 둥근 바닥 96-웰 플레이트(96-well U-bottom plate, Nunc, 163320)에 웰 1에는 자연살해세포와 배지를 각각 100 ㎕씩, 웰 2와 3에는 K562 암세포주와 자연살해 세포주를 100 ㎕씩 섞어서 분주하였다.
웰 1,2: 항-인간 CD107a-APC(BD Pharmingen, 560664)
웰 3: APC 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤 (BD Pharmingen, 555751)
빛을 차단하여 37℃ 온도 조건의 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 하기 항체로 싸이토카인 분비능를 분석하였다.
웰 1,2,3: 항-인간 CD3-PerCP-Cy5.5(ebioscience, 45-0036-42), 항-인간 CD56-APC-Cy7(ebioscience, 47-0567-42), 7-AAD(Beckman coulter, A07704)
상기 플레이트를 30분간 냉장 온도에서 염색하였다. 그 후, 염색이 끝난 세포에 100 ㎕ FACS 버퍼를 넣고, 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 200 ㎕ FACS 버퍼를 넣고, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 200 ㎕ 고정/투과화 버퍼(fixation/permiabilization buffer, BD Pharmingen, 554714)를 넣어 현탁한 후 30분 이상 냉장 온도에서 반응하였다.
200 ㎕ 1xPerm/wash 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 ㎖ FACS 버퍼를 넣고 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 웰 1,2에는 항-인간 IFN-γ-FITC(BD Pharmingen, 554700), 항-인간 TNFα-PE-Cy7(ebioscience, 25-7349-82), 웰 3에는 FITC 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 555748), PE-Cy7 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤(BD Pharmingen, 557872)를 넣고 30분간 냉장 온도에서 염색하였다.
그 후, 염색이 끝난 세포에 100 ㎕ 1xPerm/wash 버퍼를 넣고, 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 100 ㎕ 1xPerm/wash 버퍼를 넣고 2000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 200 ㎕ 고정버퍼(fixation buffer, BD, 554655)를 넣어 현탁한 후 FACS LSRII Fortessa (BD)를 이용하여 세포의 싸이토카인 분비능을 조사하였다.
다양한 유전자 조합의 Hut78 세포주를 이용해 21일 배양된 자연살해세포의 K562 암세포주에 대한 싸이토카인 분비능을 측정하였다. 그 결과, 유전자가 도입되지 않은 세포주 대비 하나 이상의 유전자가 도입된 세포주로 배양한 경우 높은 증식 배수 차이에도 불구하고 싸이토카인 분비능이 비슷한 수준임을 확인하였다(도 20a 내지 20c).
Hut78-mTNF-α/4-1BBL/mbIL-21 세포주로 배양 0일째, 1회자극 후 배양된 자연살해세포 또는 7일이나 11일 반복적인 재자극을 통해 배양된 자연살해세포의 싸이토카인 분비능을 K562 암세포주와 반응시켜 측정하였다. 반복적인 재자극으로 배양된 자연살해세포는 1회 자극으로 배양된 자연살해세포에 비해 배양기간이 길고 증식배수가 높았음에도 불구하고 K562에 대한 싸이토카인 분비능이 큰 차이없이 유지되는 것을 확인하였다(도 21a 내지 21c).
<110> Green Cross Lab Cell Corporation <120> METHOD FOR CULTURING NATURAL KILLER CELLS WITH GENETICALLY ENGINEERED T CELLS <130> PCB804043GCL <150> KR 10-2017-0065180 <151> 2017-05-26 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for 4-1BBL <400> 1 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 2 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4-1BBL <400> 2 atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60 gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120 ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180 tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240 cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300 ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360 acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420 tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480 gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540 ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600 ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660 agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720 acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765 <210> 3 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for membrane bound IL-21 (mbIL-21) <400> 3 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu 20 25 30 Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro 35 40 45 Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser 50 55 60 Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly 65 70 75 80 Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys 85 90 95 Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys 100 105 110 Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu 115 120 125 Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser 130 135 140 Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala 145 150 155 160 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 165 170 175 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 180 185 190 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 195 200 205 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 210 215 220 <210> 4 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of membrane bound IL-21 (mbIL-21) <400> 4 atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgcaaga 60 ccacaggacc gccacatgat tcggatgagg cagctgatcg acattgtgga tcagctgaag 120 aactacgtga atgacctggt ccccgagttc ctgcccgctc ctgaggatgt cgaaacaaac 180 tgcgaatggt ctgcattcag ttgttttcag aaggctcagc tgaaatctgc aaacactgga 240 aacaatgagc gaatcattaa tgtgagcatc aagaaactga agcggaaacc cccttccact 300 aatgcaggcc ggagacagaa gcaccgactg acctgcccct catgtgacag ctatgaaaag 360 aaaccaccca aagagttcct ggagcggttc aagagcctgc tccagaaaat gatccaccag 420 cacctgagca gccggaccca cggcagcgag gattctgcca agcctaccac aactccagct 480 ccccgccctc caacccctgc accaacaatt gccagtcagc ccctgtcact gaggcctgaa 540 gcatgccgcc cagccgctgg cggagcagtc cacacacgag gcctggactt tgcttgtgat 600 atctacattt gggcacctct ggctggaact tgcggcgtcc tgctgctgtc cctggtcatc 660 accctgtatt ga 672 <210> 5 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for OX40L <400> 5 Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg 1 5 10 15 Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln 20 25 30 Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val 50 55 60 Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln 65 70 75 80 Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn 85 90 95 Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu 100 105 110 Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln 115 120 125 Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr 130 135 140 Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu 145 150 155 160 Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn 165 170 175 Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 180 <210> 6 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of OX40L <400> 6 atggaacggg tgcaacctct ggaggagaat gtgggcaatg cagcccggcc aagatttgag 60 aggaacaagc tactgctggt ggcctctgtg atacagggac tggggctcct cctgtgcttc 120 acctacatct gcctgcactt cagcgctctt caggtgtcac accggtatcc ccgcatacaa 180 agtatcaagg tccagtttac cgagtataag aaagagaagg gtttcatcct cactagtcag 240 aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac aactcagtta ttattaactg tgacggcttt 300 tatctgatca gcctgaaggg ctacttctcc caggaagtaa acatcagcct gcattaccag 360 aaggatgagg agcccctgtt tcagctgaag aaggtccggt ccgtgaactc ccttatggtc 420 gcctctctga cgtacaagga caaggtgtac ctcaatgtga ccacagacaa tacatccctg 480 gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg attctgattc accagaaccc tggggagttc 540 tgtgtcttgt ga 552 <210> 7 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60 acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120 gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180 gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240 tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300 cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360 gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420 aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480 gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540 accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600 cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660 gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt gagga 705 <210> 8 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid seqeunce for mutated TNF alpha (mTNF-a) <400> 8 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Pro Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230 <210> 9 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mutated TNF alpha (mTNF-a) <400> 9 atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60 acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120 gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180 gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccagccggt cagatcatct 240 tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300 cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360 gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420 aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480 gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540 accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600 cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660 gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga 702 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 4-1BBL <400> 10 tctagagcta gcgaattcgc caccatggaa tacgcctctg acgctt 46 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 4-1BBL <400> 11 ttcgcggccg cggatcctta ttccgacctc ggtgaagg 38 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mbIL-21 <400> 12 tagagctagc gaattcgcca ccgccaccat ggctctgccc 40 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mbIL-21 <400> 13 tcgcggccgc ggatcctcaa tacagggtga tgacc 35 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for OX40L <400> 14 tagagctagc gaattcgcca ccatggaacg ggtgcaac 38 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for OX40L <400> 15 tcgcggccgc ggatcctcac aagacacaga actcccc 37 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mTNF-a <400> 16 tagagctagc gaattcgcca ccgccaccat ggctctgccc 40 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mTNF-a <400> 17 tcgcggccgc ggatcctcac agggcaatga tccc 34

Claims (25)

  1. 4-1BBL 유전자, mbIL-21 유전자, OX40L 유전자 및 mTNF-α 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 발현되는 형질전환된 CD4+ T세포.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 4-1BBL 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 mbIL-21 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 OX40L 유전자는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 mTNF-α 유전자는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 9로 표시되는 염기서열인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자는 재조합 렌티 바이러스를 통해 도입된 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 CD4+ T세포는 4-1BBL 유전자 또는 mbIL-21 유전자가 발현되는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 CD4+ T세포는 4-1BBL 유전자 및 mbIL-21 유전자가 발현되는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 CD4+ T세포는 4-1BBL 유전자, mbIL-21 유전자 및 mTNF-α 유전자가 발현되는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 CD4+ T세포는 4-1BBL 유전자, mbIL-21 유전자, OX40L 유전자 및 mTNF-α 유전자가 발현되는 것인, 형질전환된 CD4+ T세포.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 CD4+ T세포가 Hut78, H9, Jurkat, Loucy, Molt-3, Molt-13, PEER, RPMI8402 및 TALL-01 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 형질전환된 CD4+ T세포.
  16. 제1항의 형질전환된 CD4+ T세포와 원료세포를 공동배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포 배양방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 원료세포는 말초혈액, 말초혈 단핵구 세포, 말초혈 백혈구 세포, 농축된 자연살해세포 및 분리된 자연살해세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 원료세포는 CD3(+) 세포가 제거된 세포인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양방법.
  19. 제 16항에 있어서,
    형질전환된 CD4+ T세포와 원료세포의 비율을 0.1:1 내지 50:1로 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양방법.
  20. 제 16항에 있어서,
    상기 원료세포는 지지세포와 1회 혼합하여 5일 내지 60일간 배양하거나, 지지세포와 2회 이상 혼합하여 60일 이상 배양하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 배양방법.
  21. 제 16항에 있어서,
    항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 항-CD3 항체는 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양방법.
  23. 제 21항에 있어서,
    상기 인터루킨 단백질은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포 배양방법.
  24. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 형질전환된 CD4+ T세포를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물.
  25. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항의 자연살해세포 배양방법에 의해 제조된 자연살해세포.
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