CN112261950A - 用于治疗cd30+肿瘤的car-cd30 t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗CD30+肿瘤如淋巴恶性肿瘤、白血病、实体瘤的第三代CAR‑CD30 T细胞。

Description

用于治疗CD30+肿瘤的CAR-CD30 T细胞
技术领域
本发明涉及用于治疗CD30+肿瘤的CAR-CD30 T细胞。特别地，本发明涉及用于治疗CD30+肿瘤(如淋巴恶性肿瘤、白血病、实体瘤)的第三代CAR-CD30 T细胞。
背景技术
众所周知，大多数化疗难以治愈的或多次复发的非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金淋巴瘤(HL)患者的预后仍然很差(1)。尽管同种异体HSCT(allo-HSCT)提供了治愈各种淋巴瘤亚型患者的潜力，但移植相关死亡率仍然很高，并且包括慢性移植物抗宿主病(GVHD)在内的长期后遗症会对生活质量产生实质性的负面影响(2)。
PD-1阻断对allo-HSCT后复发的淋巴瘤似乎非常有效，但经常伴有严重和难治性GVHD的快速发作(3)。CAR-T细胞正在成为这些患者的一种新型治疗方法。
CD30(Ki-1)是一种来源于肿瘤坏死因子受体超家族8(TNFRSF8)的细胞膜蛋白，其正常表达限于活化的T细胞和B细胞。在肿瘤细胞中，CD30的表达最常见于淋巴恶性肿瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、T细胞(4)或B细胞谱系 (5)的CD30+急性淋巴细胞白血病(ALL))。据报道，CD30在大多数成人非淋巴恶性肿瘤中也有表达。根据已发表的数据，24.5％的实体瘤也是CD30+，最显著的是生殖细胞肿瘤(肌纤维母细胞肉瘤(93％)、胚胎癌(77％)、间皮瘤(77％)、混合生殖细胞瘤(GCT)(65％)、头颈部癌(24％)、卵黄囊瘤(18％)、血管肉瘤(14％)、垂体腺瘤(11％)和精原细胞瘤(6％)，增加了针对其他肿瘤的CD30靶向治疗的可能性(6)。
虽然90％的早期HL患者可以通过常规治疗治愈，但只有70％的晚期患者可以通过标准治疗方法治愈。对于复发的HL患者，只有一半的患者被标准的补救疗法治愈(7)。
用单克隆抗体靶向CD30治疗霍奇金淋巴瘤(HL)和间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL)在临床上取得了巨大成功。然而，主要由嵌合抗体的毒素成分介导的不良事件导致许多患者停止治疗。用表达CD30特异性嵌合抗原受体(CAR)的T细胞靶向CD30可减少副作用并增强抗肿瘤活性。
通过CAR靶向CD30的免疫治疗方法已经在临床前模型中证明了价值(8, 9)，并且在两个不同的独立临床试验中得到证实(10,11)，虽然临床受益不是最佳的。
第一代抗CD30 CAR T细胞是在20世纪90年代开发的，临床前研究证明了这些细胞能够在体外裂解表达CD30的HL细胞系(12,13)的能力。事实上，用抗CD30 CAR转导的Epstein–Barr病毒特异性细胞毒性T细胞在体外和体内小鼠异种移植模型中显示出抗CD30+癌细胞系的活性，改善了T细胞在体内的持久性(8)。
值得注意的是，在清除CD30+淋巴瘤细胞的同时，可溶性CD30的存在并没有减弱细胞裂解，这表明CD30从HL细胞脱落到血液中不会抑制体内抗CD30 CAR T细胞的功效(14)。
在第一次试验中，观察到淋巴瘤的反应不一致，大多数患者在多次输注CAR T细胞后疾病表现稳定，或者根本没有反应。总的来说，淋巴结比结外病变表现出更好的反应，肺部病变的反应似乎相对较差，并且输注的CAR T在输注后没有存留超过60天。值得注意的是，几项临床数据(15,16)清楚地表明，在体内存留的CAR-T细胞与接受治疗的患者的更好结果相关。如表1中所总结的，在所描述的第一次临床试验中，作者考虑了携带第二代CAR的慢病毒平台，其特征在于来源于AJ878606.1杂交瘤的特异性针对CD30抗原的单链可变区片段(scFv) 序列、来源于人CD137的共刺激结构域与CD3ζ信号转导结构域(10)在同一阅读框。
抗CD30 CAR T细胞的第一个开放标记I期临床试验涉及18名复发或顽固的霍奇金淋巴瘤患者，该试验用慢病毒载体进行基因修饰以表达CD137共刺激域。所述18例患者包括1例原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和17例3 种不同亚型的霍奇金淋巴瘤，其中大多数为结节性硬化症。13名患者接受了1 个周期的CAR T细胞输注，5名患者接受了2个周期。
这项研究的初步结果表明，7例获得部分缓解，6例病情稳定。客观反应率为39％(10)。
在第二次试验中，大多数患者接受了CD30.CAR T细胞的多次输注，获得暂时缓解，并且输注后6周，不能再检测到CD30.CAR T细胞。如表1中所总结的，在该临床试验中，作者考虑了携带第二代CAR的逆转录病毒平台，其特征在于来源于HRS3杂交瘤的特异性针对CD30抗原的单链可变区片段(scFv)序列、来源于人CD28的共刺激域与CD3ζ信号转导结构域在同一阅读框。
表1
Figure BDA0002680373170000031
特别地，在第二次临床试验中，9名复发/顽固的HL或ALCL患者被输注自体T细胞，所述自体T细胞用逆转录病毒载体进行基因修饰以表达CD30特异性CAR(CD30.CAR-T)，并编码CD28共刺激胞内域。值得注意的是，这些患者中有7人患有本妥昔单抗顽固性疾病。这项研究的初步结果显示，9名患者中有3名患者完全缓解，3名患者病情暂时稳定。在这项研究中，CAR-T细胞存留<8周，但肿瘤活检显示，其能有效地将T细胞转运到淋巴瘤部位(11)。
两项临床试验都表明多次CD30.CAR-T细胞输注耐受性良好。CAR-T输注前的宿主淋巴结清除术将有利于进一步改善CAR T细胞的扩增及其抗肿瘤活性。更重要的是，所述CAR-T细胞的存留与临床反应相关。
所有这些数据表明，CD30.CAR-T细胞是安全的，并可导致HL患者的临床反应，尽管有必要进一步优化该疗法以实现更长的体内存留和更高的抗肿瘤控制，尤其是在淋巴瘤复发时。
特别地，该方法的优化应考虑到经典霍奇金淋巴瘤(cHL)和间变性大T细胞淋巴瘤的特征在于仅少数恶性Reed-Sternberg及霍奇金细胞(HRS)和大量炎性细胞。这些非恶性细胞产生参与肿瘤免疫逃避的可溶性或膜结合分子。此外，HL 肿瘤产生的趋化因子环境会显著影响何种T细胞亚型在肿瘤中迁移和积聚(17)。事实上，HRS细胞产生趋化因子TARC和MDC，它们吸引辅助性T细胞(Th2) 和调节性T细胞(Tregs)，后者表达这些趋化因子的受体CCR4。在包括HL在内的肿瘤中的Tregs(和Th2细胞)的大量存在，通过削弱少数能够到达肿瘤部位的细胞毒性效应T淋巴细胞的抗肿瘤活性，产生了一种不利的免疫微环境。CCR4 在CD30特异性嵌合抗原受体(CAR-CD30)上的强制表达改善了CAR-CD30 T-重定向的效应T淋巴细胞向HL产生的TARC梯度的迁移(9)。HRS细胞通常表达高水平的PDL1，并产生免疫抑制性IL-10、TGF-β、半乳糖凝集素1和前列腺素E2，它们通过诱导CD95配体来抑制T细胞效应细胞功能并诱导活化的Th1 和CD8+T细胞凋亡。最近也有研究表明，在T-regs存在的情况下，IL-15选择性地支持Epstein–Barr病毒(EBV)-CTL的存活、增殖和效应细胞功能(18)。此外，最近有研究表明，生长在IL-7/IL-15中的CAR-CD30 T细胞表达较高水平的CXCR4和CXCR3，CXCR4和CXCR3是已知的促进T细胞向外周组织迁移的趋化因子受体(11)。
此外，临床前研究表明，与携带CD28信号转导结构域的第二代CAR-T细胞相比，结合CD28和4-1BB共受体的第三代CAR-T细胞可能具有更好的体外激活和增殖能力，并且这两种细胞在体内清除CD19+B细胞方面表现出相当的功效(19)，尽管从未对CAR.CD30证明。已知其他CAR-CD30 T细胞，例如在 WO2017066122、WO2016134284和CN107759699中描述的那些。例如， WO2017066122比较了在IL2条件下5F11-28Z、AC10-28Z和XmAb-28Z细胞的产生。
据报道，所有使用的CAR都具有高水平的转导效率，然而与AC10和XmAb 相比，使用5F11获得了更高的转导效率(表A)，即当细胞在IL2生长7天时，相对于AC10(61.90％)或XmAb(64.70％)，5F11获得了更高的CD8+CAR的转导百分比(80.7％)。另外，还描述了有关通过将CAR-T细胞与CD30+肿瘤： SUDHL-1、HH和BV173共同培养而产生IFNγ的功能性实验。当与BV173共培养时，5F11-28Z(在IL2生长)显示出比AC10-28Z更高的IFNγ产量，即表D-1 显示5F11-28Z产生3781pg/ml的IFNγ，而AC10-28Z产生538pg/ml的IFNγ。此外，5F11-28Z与HDML-2细胞系共培养时产生3534pg/ml的IFNγ。
鉴于上述，因此，显然需要提供更多的CAR CD30 T细胞，其能够克服已知的CARCD30 T细胞的缺点。
发明内容
根据本发明，现在提供了两种新的第三代CD30特异性嵌合抗原受体 (CAR-CD30)。特别地，提供了以下两种临床级第三代CAR CD30 SFG逆转录病毒载体:
-SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4-1BB.ζ(28.4-1BB. ζ)
-SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ(28.OX40.ζ) 其包含：
-来自AC10杂交瘤的单链可变区片段(scFv)，所述scFv之前从未用于CAR 治疗；
-仅16个氨基酸(aa)的可追踪标记CD34衍生表位(ΔCD34)(作为可追踪标记)，用于通过FACS(荧光激活细胞分选)系统快速鉴定和/或通过Cell Sorter 系统选择基因修饰的T细胞；
-由CD8区域代表的铰链，以避免免疫原性CH2-CH3鼠序列应用于绝大多数相似的CAR(20)；
-来自CD8跨膜区的跨膜区，用于提高分子稳定性；
-两个共刺激域被添加到CAR-CD30载体中:CD28(21,22)和OX40(23,24)、或 CD28和4-1BB(25)，两者分别与CD3-ζ链融合。因此，两个SFG载体可以通过单一共刺激域来区分(第一个载体为4-1BB，第二个载体为OX40)。
在所有CAR-CD30中，所述区域、所述可追踪标记、所述共刺激域和所述 CD3-ζ链都经过密码子优化以提高蛋白质的有效表达。
表2显示了根据本发明的CAR-CD30与已知CAR-CD30的差异。
表2
Figure BDA0002680373170000061
与已知的CAR-CD30相比，根据本发明的CAR-CD30的上述序列整体上提供了意想不到的优点，例如通过使用逆转录病毒平台和CD8 TM结构域获得的在T细胞中更有效稳定的CAR-CD30表达，与已知的依赖于共刺激结构域的 CAR-CD30 T细胞相比更长的体内存留，即使在免疫调节存在和单个CAR-CD30 T细胞施用下的高抗肿瘤活性得益于单链抗体与抗原的亲和力和生产方法的选择(例如使用IL7/IL15代替IL2)。
本文所述的体外和体内结果表明，根据本发明的经修饰的多克隆CD30CAR T细胞能够在长期共培养中非常有效地清除CD30+肿瘤。根据本发明的生物产品在异种移植体内模型中显示出清除霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，并建立长期免疫记忆。
更详细地说，由两种SFG逆转录病毒载体获得的上清液能够有效地转导活化的T细胞，具有非常高的转导水平。在两种构建体中引入CD34衍生表位作为可追踪标记，使得在体外和体内异种移植小鼠模型中容易追踪基因修饰的T 细胞(CD3+CD34+)。如长期体外培养所显示的，IL2换为IL7/IL15组合提高了 CAR-CD30 T细胞表达的稳定性，特别是对28.OX40.ζCAR T细胞。在实验环境中，IL7/IL15的组合改善了增殖的T细胞的动力学，特别是在体外扩增的+20 天后更加明显。
相对于生长在IL2中的T细胞，在IL7/IL15中体外培养15天的CAR-CD30 T细胞可诱导效应记忆(EfM)T细胞区分优先扩增。评估第+15天，CAR-CD30 T细胞(IL2)的衰竭情况，发现PD1和TIM3的显著的基础表达，特别是在28.OX40. ζT细胞中。在体内异种移植实验模型中，首次证明了能够第二次清除再次激发的肿瘤的长期免疫记忆。
IL2换为IL7/IL15显著降低了PD1的表达，但仅适度增加了两种CAR T细胞中的TIM3。
正如不同的作者所报道的，4.1BB的存在本身就降低了CAR T细胞中的衰竭情况(26)。培养条件(IL7/IL15)进一步提高了PD1表达的减少，特别是在 28.OX40.ζT细胞中。为了评估基础PD1表达对CAR修饰的T细胞抗PDL1+ 肿瘤效价的作用，CAR修饰的T细胞与用PDL1永久转导的L428-PDL1淋巴瘤细胞系共培养，显示相对于野生型(WT)L428细胞系没有发现显著差异，甚至效应细胞/靶细胞比更低。值得注意的是，在受压性长期共培养中，出乎意料的是，相对于，28.OX40.ζT细胞较28.4-1BB.ζT细胞对Karpas 299(和HDML-2) 表现出明显的更优裂解活性，效应细胞/靶细胞比率更低(比率E:T为1:8和 1:16)。
根据本发明的结果清楚地显示在IL2中生长的(AC10)28.4-1BB.ζT细胞或28.OX40.ζ，当与HDML-2(效应细胞:目标比例为1:1)一起培养时，分别产生约 10303±3321.63pg/ml和29872.17±8572.18pg/ml的IFNγ(图9B)，即 WO2017066122中描述的5F11-28Z产生的IFNγ的三倍以上，WO2017066122 中5F11-28Z与HDML-2共培养时产生3534pg/ml的IFNγ。
此外，在IL7/IL15中生长的28.4-1BB.ζT细胞显示甚至更高的IFNγ产量:21270.17±11621.21pg/ml(图9E)。此外，当与HDML-2培养时，根据本发明的 28.OX40.ζT细胞显示出甚至更高的IFNγ产量:29872.17±8572.18pg/ml(当它们与IL2一起生长时，图9B)和34444.67±18872.62pg/ml(当它们与IL7/IL15 一起生长时，图9E)。
还观察到，与在包含IL2的条件下制备的CAR-T细胞相比，当在包含IL7 和IL15的条件下制备根据本发明的CAR-T细胞时，获得了CAR在T细胞上表达的更高的长期稳定性(图1D)，特别是28.OX40.ζ。本发明的可检测CAR的稳定性提供了CAR在T细胞膜中的稳定表达(图1D)。特别地，评估了在第5、15 和30天时CD8/CD4的转导比率。虽然CD8的水平在+5天相对于CD4较低，但是CD8 CAR+的水平从+5天到+15天随着时间的推移而增加，有利于CD8(图1E-F)。此外，如图1L和1M所示，与包含IL2的条件相比，培养条件中IL7/IL15 的存在显著改善了CAR-T细胞的倍数扩增。
图2也显示，在培养条件下IL7/IL15的存在对于减少CAR-T细胞的衰竭情况是重要的。
还观察到注入的28.OX40.ζT细胞的长达240天的长期存留(图11)。
此外，根据本发明发现，在连续添加CD30+淋巴瘤多至4次过程中(“受压性”共培养)，相对于具有4.1BB共刺激域的CAR.CD30 T细胞，具有CD28.OX40 共刺激域的CAR.CD30T细胞能够更有效地控制Karpass 299(图13A-13B)。
有趣的是，在第一次肿瘤激发后，CAR+阳性细胞的百分比增加，在28.4-1BB. ζT细胞和28.OX40.ζT细胞中，分别从61.7％±18.4％和74.0％±11.3％(第 0天)增加到93.4％±3.4％和93.5％±3.1％(第5天)(p＝0.049和p＝0.026) (图13C)。此外，随着随后的肿瘤再次激发，基因修饰的T细胞的百分比和中值荧光强度(MFI)仅在28.OX40.ζT细胞中随时间保持稳定(图13C-D)。
此外，与Karpa299肿瘤细胞系共培养时，相对于28.4-1BB.ζ，具有 CD28.OX40共刺激域的CAR.CD30 T细胞产生的IFN-γ(图13E)、IL-2(图 13F)和TNF-α(图13G)明显更高。
此外，两种CAR-CD30 T细胞也显示出对实体CD30+肿瘤的细胞毒性作用，如桥小脑角区髓母细胞瘤DAOY(图5D和图7G)、横纹肌肉瘤RD肿瘤细胞系(图7I-J)和胚胎癌。总的来说，所有这些结果使得根据本发明的构建体可用于有效治疗CD30+肿瘤患者变得非常合理。
因此，本发明的一个目的是一种CD30嵌合抗原受体分子，其从N末端到C 末端包含或由以下物质组成:
a)信号肽，例如一种信号肽，其包含MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)(核苷酸ID NO:AB776838.1和蛋白质ID NO:BAN63131.1)或由其组成，该信号肽通过第一接头连接到:
b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKV LIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGG GTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGW IYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNY WFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头连接，或由其组成；
c)可追踪标记，选自由如下组成的组：ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)(核苷酸ID NO AB238231.1和蛋白质ID NO:BAE46748.1；Δ CD19:PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGL PGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGE LFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPP CLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKS LLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEIT ARPVLWHWLLRTGGWK(SEQ ID.NO:5)(核苷酸ID NO:M21097.1和蛋白质ID NO:AAA35533.1)；
NGFR:KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSD VVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACR VCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLR ECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(SEQ ID NO:6)(核苷酸ID NO:AK313654.1和蛋白质ID NO:BAG36408.1)；优选地为ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)(核苷酸ID NO:AB238231.1和蛋白质ID NO:BAE46748.1)；
d)铰链，选自由如下组成的组：铰链CD8α: PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAV HTRGLDFA(SEQ ID NO:7)(核苷酸ID NO:M12828.1和蛋白质ID NO:AAB04637.1)；铰链CD28:IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:8)(核苷酸ID NO:AJ517504.1和蛋白质ID NO:CAD57003.1)；铰链CH2-CH3 (UNIPROTKB:P01861):
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:9)；铰链CH3 (UNIPROTKB:P01861):ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10),优选地，铰链CD8 α:PAPRPPTPAPTIASQP LSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7) (核苷酸ID NO:M12828.1和蛋白质ID NO:AAB04637.1)；
e)跨膜结构域，选自由如下组成的组：CD28TM: FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:13)(核苷酸ID NO: BC112085.1和蛋白质ID NO:AAI12086.1)；CD8aTM(SEQ IDNO:14),优选地， CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)(核苷酸ID NO NM_001768.6和蛋白质ID NO:NP_001759.3)；和
f)共刺激信号结构域，其选自由如下组成的组：通过连接CD28胞质序列： RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21) (核苷酸ID NO:AF222341.1和蛋白质ID NO:AAF33792.1)、CD137(4-1BB)序列: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22) (核苷酸ID NO:U03397.1和蛋白质NO:AAA53133.1)和CD3-Zeta链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT YDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)(核苷酸ID NO:J04132.1和蛋白质ID: AAA60394.1)获得的序列，或通过连接CD28胞质序列 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21) (核苷酸ID NO:AF222341.1和蛋白质ID NO:AAF33792.1)、OX40序列 RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:24)(核苷酸 ID NO:NM_003327.3和蛋白质NO:NP_003318.1)和CD3Zeta 链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT YDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)(核苷酸ID NO:J04132.1和蛋白质ID NO:AAA60394.1)获得的序列。
上面提到的铰链CD8α包括序列PAPRPPTPAPT(SEQ ID NO:11)(间隔子) 和IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:12)(核苷酸ID NO NM_001768.6和蛋白质IDNO:NP_001759.3)。
第一接头可以是两个或三个氨基酸的接头，例如SR。
连接AC10 VL和VH序列的第二接头可以选自由如下组成的组：富含脯氨酸的刚性接头，如小鼠igG3上铰链(mIgG3UH):PKPSTPPGSS(SEQ ID NO:15), (mIgG3UH)2:PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS(SEQ ID NO:16)，或富含甘氨酸的柔性接头，如(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17),(G4S)4接头: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18),G4SG2接头GGGGSGG(SEQ ID NO:19)或G3SG4接头:GGGSGGGG(SEQ ID NO:20)，优选GGGSGGGG (SEQID NO:20)。
此外，可以在AC10 VH序列和所述可追踪标记之间使用第三接头，例如短序列GS。
跨膜结构域和共刺激信号结构域之间可以存在一个或多个接头(第四接头)，例如CD8a胞质(细胞)：LYCNHRN(SEQ ID NO：25)(核苷酸ID NO: NM_001768.6和蛋白质ID NO:NP_001759.3)和EF。
根据本发明的一个实施方案，CD30嵌合抗原受体分子包含或由以下组成:
a)信号肽，其包含MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)或由其组成，该信号肽通过第一接头连接至:
b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKV LIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGG GTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGW IYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNY WFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17)连接，或由其组成；
c)包含ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)或由其组成的可追踪标记；
d)铰链CD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA (SEQ ID NO:7)；
e)跨膜结构域CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，其通过一个或多个接头连接，所述接头包含接头CD8a胞质(细胞)：LYCNHRN (SEQ ID NO：25)或由其组成，
f)共刺激信号结构域，其包含通过连接CD28胞质序列 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、OX40 sequence RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:24)和CD3Zeta 链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT YDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列。
或者，根据本发明的CD30嵌合抗原受体分子包括或由以下组成:
a)信号肽，其包含MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)或由其组成，该信号肽通过第一接头连接至:
b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKV LIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGG GTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGW IYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNY WFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17)连接，或由其组成；
c)包含ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)或由其组成的可追踪标记；
d)铰链CD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA (SEQ ID NO:7)；
e)跨膜结构域CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，其通过一个或多个接头连接，所述接头包含CD8a胞质(细胞)：LYCNHRN(SEQ ID NO：25)或由其组成，
f)共刺激信号结构域，其包含通过连接CD28胞质序列 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、CD137(4-1BB)序列 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22) 和CD3Zeta 链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列。
根据本发明的一个优选的实施方案，CD30嵌合抗原受体分子是： MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDG DSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEED AATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASV KISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATL TVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELP TQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC DIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGP TRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:26)。
即，该序列在本文也称为SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4-1BB.ζ，其包括以下序列:
信号肽
MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)(核苷酸ID NO:AB776838.1和蛋白质ID NO:BAN63131.1)
接头
SR(连接序列)
VL(AC10)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIY AASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGT KLEIK(SEQ ID NO:2)
柔性区
GGGSGGGG(G3SG4接头)(SEQ ID NO:20)
VH(AC10)
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIY PGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWF AYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)
接头
GS(连接序列)
ΔCD34
ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)(核苷酸ID NO:AB238231.1和蛋白质ID NO:BAE46748.1)
细胞外铰链(间隔子)
PAPRPPTPAPT(间隔子)(SEQ ID NO:11)
细胞外铰链(CD8a)
IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:12)(核苷酸ID NO:NM_001768.6和蛋白质ID NO:NP_001759.3)
CD8a(TM)跨膜区
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)(核苷酸ID NO:NM_001768.6 和蛋白质ID NO:NP_001759.3)
CD8a胞质(细胞)连接接头
LYCNHRN(SEQ ID NO:25)(核苷酸ID NO:NM_001768.6和蛋白质ID NO: NP_001759.3)
连接接头
EF(连接序列)
CD28细胞
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21) (核苷酸ID NO:AF222341.1和蛋白质ID NO:AAF33792.1)
4.1BB
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22) (核苷酸IDNO:U03397.1和蛋白质IDNO:AAA53133.1)
CD3 Zeta链
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)(核苷酸ID NO:J04132.1和蛋白质ID NO:AAA60394.1)
根据本发明的进一步优选的实施方案，CD30嵌合抗原受体是 MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDG DSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEED AATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASV KISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATL TVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELP TQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGP TRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLA KIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT YDALHMQALPPR*(SEQID NO:27).
即，该序列在本文也称为SFG.CAR.CD30(AC10)Δ CD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ，其包括以下序列:
信号肽
MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)(核苷酸ID NO:AB776838.1和蛋白质ID NO:BAN63131.1)
接头
SR(连接序列)
VL(AC10)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIY AASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGT KLEIK(SEQ ID NO:2)
柔性区
GGGSGGGG(G3SG4接头)(SEQ ID NO:20)
VH(AC10)
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIY PGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWF AYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)
接头
GS(连接序列)
ΔCD34
ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)(核苷酸ID NO:AB238231.1and Protein IDNO:BAE46748.1)
细胞外铰链(间隔子)
PAPRPPTPAPT(间隔子)(SEQ ID NO:11)
细胞外铰链(CD8a)
IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:12)(核苷酸ID NO:NM_001768.6and Protein ID NO:NP_001759.3)
CD8a(TM)跨膜区
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)(核苷酸ID NO:NM_001768.6 andProtein ID NO:NP_001759.3)
CD8a胞质(细胞)连接
LYCNHRN(SEQ ID NO:25)(核苷酸ID NO:NM_001768.6and Protein ID NO: NP_001759.3)
连接接头
EF(连接序列)
CD28细胞
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21) (核苷酸ID NO:AF222341.1和蛋白质ID NO:AAF33792.1)
OX40
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:24)(核苷酸 ID No:NM_003327.3和蛋白质NO:NP_003318.1)
CD3 Zeta链
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)(核苷酸ID NO:J04132.1和蛋白质ID NO:AAA60394.1)
本发明还涉及编码上述CD30嵌合抗原受体的核苷酸序列。
根据本发明的一个实施方案，所述核苷酸序列是 ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTC CAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGAT TTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCC CCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCG CGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCC AGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGG ATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGT TCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGG TCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACAT TTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTG AATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAA AAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGC ATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTG TGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGT GACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGT TAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCA TTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCC GGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATC TGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATC ACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTT CTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGG AAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCT AAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGG CCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGA GGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTGAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCG GATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAA TCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGG ATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACT GTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTG GCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCA GGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGG CACTCCCCCCCAGGTGA(SEQ ID NO:28)。
即，该核苷酸序列编码也称为SFG.CAR.CD30(AC10)Δ CD34.CD8aTM.CD28cyto.4-1BB.ζ的序列，其包含以下序列：
信号肽
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTC CAGTGTTCACGA(SEQID NO:29)(核苷酸ID NO:AB776838.1)
VL(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAG AGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTG ATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGC AGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGA GGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTT TGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(SEQ ID NO:30)
柔性区
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG(G3SG4接头)(SEQ ID NO:31)
VH(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAG AGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTG ATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGC AGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGA GGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTT TGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(SEQ ID NO:32)
接头(BamH1限制性位点)
GGATCC(BamH1限制性位点和连接序列)(SEQ ID NO:33)
ΔCD34
GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT(SE Q ID NO:34)(核苷酸ID NO:AB238231.1)
细胞外铰链(CD8a)
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTG AGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATAC AAGAGGACTCGATTTCGCT(SEQ ID NO:35)(NM_001768.6)
CD8a(TM)跨膜区
TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACC(SEQ ID NO:36)(NM_001768.6)
CD8a胞质(细胞)连接接头
CTTTATTGCAACCATCGAAAC(SEQ ID NO:37)(NM_001768.6)
接头(EcoR1限制性位点和连接序列)
GAATTC(SEQ ID NO:38)
CD28细胞
AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCA AGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAG AGACTTCGCAGCATACCGCTCT(SEQ ID NO:39)(AF222341.1)
4.1BB
AAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGG CCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGA GGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTG(SEQ ID NO:40)(U03397.1)
CD3 Zeta链
AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCA GAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACG TCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGA AGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGA TGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGT AAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACA CTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(SEQ ID NO:41) (J04132.1)
根据本发明的进一步的实施方案，所述核苷酸序列是ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTC CAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTC TCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGAT TTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCC CCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCG CGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCC AGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGG ATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGT TCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGG TCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACAT TTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTG AATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAA AAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGC ATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTG TGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGT GACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGT TAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCA TTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCC GGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATC TGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATC ACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTT CTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGG AAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCT CGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAG CTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGG CCAAAATTAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGC AGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGA AGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAA GGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACG AAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA (SEQ ID NO:42)
即，该核苷酸序列编码也称为SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ的序列，其包含以下序列：
信号肽
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTC CAGTGTTCACGA(SEQID NO:29)(AB776838.1)
VL(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAG AGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTG ATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGC AGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGA GGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTT TGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(SEQ ID NO:30)
柔性区
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG(G3SG4接头)(SEQ ID NO:31)
VH(AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAG AGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTG ATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGC AGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGA GGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTT TGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG(SEQ ID NO:32)
接头(BamH1限制性位点和连接序列)
GGATCC(SEQ ID NO:33)
ΔCD34
GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT(SE Q ID NO:SEQ IDNO:34)(AB238231.1)
细胞外铰链(CD8a)
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTG AGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATAC AAGAGGACTCGATTTCGCT(SEQ ID NO:35)(NM_001768.6)
CD8a(TM)跨膜区
TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACC(SEQ ID NO:36)(NM_001768.6)
CD8a胞质(细胞)连接接头
CTTTATTGCAACCATCGAAAC(SEQ ID NO:37)(NM_001768.6)
接头(EcoR1限制性位点和连接序列)
GAATTC(SEQ ID NO:38)
CD28细胞
AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCA AGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAG AGACTTCGCAGCATACCGCTCT(SEQ ID NO:39)(AF222341.1)
OX40
CGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAG CTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGG CCAAAATT(SEQ ID NO:43)(NM_003327.3)
CD3 Zeta链
AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCA GAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACG TCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGA AGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGA TGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGT AAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACA CTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(SEQ ID NO:41) (J04132.1)
本发明还涉及包含上述核苷酸序列的载体，其中所述载体是DNA载体、 RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
另外，本发明涉及包含上述载体或质粒的细胞，例如T细胞，例如α/β和γ/δT细胞、NK细胞、NK-T细胞。
根据本发明的一个实施方案，上述细胞是在重组人IL-2、或在重组IL-7和 IL15的组合存在下获得的。例如，所述白细胞介素可以存在于细胞制备过程的至少一个或所有步骤中，例如活化、转导和扩增。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含核苷酸序列、或载体、或细胞，或所有上述物质，连同一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。
本发明的另一个目的是CD30嵌合抗原受体分子、核苷酸序列、载体、细胞、药物组合物，所有上面提到的这些，用于医疗用途。
本发明的另一个目的是将所述CD30嵌合抗原受体分子、所述核苷酸序列、所述载体，所述细胞，所述药物组合物，所有上面提到的这些，用于CD30+癌症的治疗，例如在诊断或顽固/复发的疾病，例如淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；实体瘤，例如肌成纤维细胞肉瘤、横纹肌瘤、组织细胞肉瘤、胚胎癌、腺癌、间皮瘤、混合生殖细胞瘤(GCT)、非精原细胞瘤GCT、头颈部癌、卵黄囊瘤、血管肉瘤、垂体腺瘤、无性细胞瘤、畸胎瘤或精原细胞瘤。此外，本发明也可用于治疗CD30+PDL1+肿瘤(L428-PDL1)，如图7D中的效价测定所示。
此外，本发明还涉及一种制备如上定义的细胞的方法，其中，所述细胞(例如T淋巴细胞)的活化(例如用固定的OKT3和抗CD28抗体)、转导和扩增的至少一个或所有步骤在重组人IL-2、或组合的重组IL-7和IL15的存在下进行。
附图说明
根据本发明的优选实施方案，特别参考附图，以说明性而非限制性的方式描述了本发明，其中:
图1.在初始抗原刺激后，具有CD28.OX40或CD28.4-1BB共刺激的 CAR-CD30 T细胞表现出相似的转导水平、CD4+/CD8+分布和体外增殖。
(A)图中显示两个CAR-CD30的表达盒。CD30的scFv与CD8aTM、CD28 胞质部分和由4-1BB(上图)或OX40(下图)代表的第二共刺激结构域以及信号结构域CD3-ζ链(ζ)克隆在同一阅读框中。添加ΔCD34作为可追踪标记。(B)流式细胞分析显示了在示例性供体(在IL2中生长)中通过CD34表达分析的T 细胞(上图)，未转导的(NT)T细胞(作为阴性对照)(左图)或具有CAR.CD30. ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ)的基因修饰的T细胞(中图)和具有CAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ(28.OX40.ζ)的基因修饰的T细胞(右图) 的转导水平。(C)通过生物素化蛋白L也证实了T细胞的转导水平；能够有效结合scFv。(D-F)这三幅图显示了在三次体外培养中，通过FACS检测的阳性CAR+ T细胞的百分比的平均值。第一组显示CAR+CD3+表达(D)；第二组(E)显示 CAR+CD4+亚群；最后一组(F)是CAR+CD8+T细胞。对于在IL2：NT(白条)、 28.4.1BB.ζ(带水平线的白色条)和28.OX40.ζ(黑色条)；或在IL7/IL15：NT(带垂直线的白色条)、28.4.1BB.ζ(网格条)和28.OX40.ζ(棋盘条)中生长的T细胞。数据以六名健康供体的体外培养的第5、15和30天的平均值±标准偏差(SD)表示。(G-H)图显示通过台盼蓝计数测定法评估的NT T细胞和CAR-CD30 T细胞在IL2(连续线(G))或IL7/IL15(虚线(H))中的倍数扩增。数据代表6 个HD的结果。(I-M)细胞因子使用对NT T细胞(I)、28.4.1BB.ζT细胞(L) 和28.OX40.ζT细胞(M)的体外长期倍数扩增的影响。显著性用星号报告，而体外培养过程中转导水平变化的显著性用包围的星号表示。*p值＝<0.05，**p 值＝<0.01。
图2.基因修饰的CAR-CD30 T细胞的衰竭情况。
代表4个HD的CD3 T细胞的基础衰竭曲线，在IL2(左侧)的存在下扩增15 天：NT(白色条)、28.4-1BB.ζ(带水平线白色条)、或28.OX40ζ(黑色条)；或者在IL7/IL15中，(带垂直线的白色条表示NT；带正方形的白色条表示 CARGD2.28-41BBζT细胞和棋盘条表示CARCD30.28-OX40ζT细胞)。星号周围的圆圈表示在IL7/IL15或IL2存在下培养的相同T细胞群体之间进行比较的p值。来自四个HD的数据表示为平均值±SD。*p值＝<0.05，**p值＝<0.01。
图3.NT或者CAR-CD30 T细胞的基础和/或诱导增殖。
为了评估逆转录病毒修饰或培养条件对经修饰的T细胞的安全性的影响，对于NT(A)或CAR-CD30 T细胞(B-C)，评估了基础增殖或细胞因子或/和抗原特异性增殖。在第0天用荧光细胞染色CFSE标记T细胞，并在有/无细胞因子的情况下接种5天，或在存在肿瘤细胞系CD30阳性(Karpas299)或肿瘤细胞系CD30阴性(BV173)的情况下共培养。CD3+(左侧)、CD8+(右侧)和CD4+T 细胞(左侧)的基础或诱导增殖(通过CFSE染料稀释法测定)已通过FACS分析进行评估。
图4.实体和血液肿瘤细胞系中的CD30和/或PDL1表达。(A-D)CD30+和/ 或PDL1在三种淋巴瘤细胞系:L428、HDML2和Karpas 299(A)、五种肉瘤细胞系:RD、A673、SK-ES-1、CW9019和CT-10(B)、两种髓母细胞瘤细胞系:DAOY 和D283(C)、和两种白血病细胞系:CEM-T2和BV-173(D)中组成型表达的代表性FACS分析。最后一张图片显示了用含有盒PDL1的逆转录病毒载体SFG基因修饰的淋巴瘤细胞系L428的FACS分析，以获得L428-PDL1淋巴瘤细胞系 (E)。
图5.CAR-CD30 T细胞在含IL2的完整CTL培养基中生长，并用28.4-1BB 或28.OX40共刺激结构域转导，在体外实验中显示出相若的短期细胞毒性作用。体外51Cr释放试验评估NT T细胞(带白色圆圈的线)、28.4-1BBζT细胞(带白色方形的线)或28.OX40.ζT细胞(带黑色方形的线)，在CD30+淋巴瘤(Karpas 299 细胞系(A)、HDML-2细胞系(B)和L428细胞系(C))、在CD30+髓母细胞瘤 DAOY(D)、和在CD30阴性(如髓母细胞瘤D283(E)和淋巴瘤BV173(F))中的裂解活性。测定在IL2的存在下，在初始激活和扩增后15天进行。来自6个健康供体(HD)的数据表示为平均值±SD。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001，和****≤0.0001。
图6.CAR-CD30 T细胞在含IL7/IL15的完整CTL培养基中生长，并用 28.4-1BB或28.OX40共刺激结构域转导，在体外实验中显示出相若的短期细胞毒性作用。体外51Cr释放试验评估NT T细胞(带白色圆形的虚线)、28.4-1BBζ T细胞(带白色方形的虚线)或28.OX40.ζT细胞(带黑色方形的虚线)，在CD30+ 淋巴瘤(Karpas 299细胞系(A)、HDML-2细胞系(B)和L428细胞系(C))、在CD30+ 髓母细胞瘤DAOY(D)、和在CD30阴性(如髓母细胞瘤D283(E)和淋巴瘤 BV173(F))中的裂解活性。测定在IL7/IL15的存在下，在初始激活和扩增后15 天进行。来自6个健康供体(HD)的数据表示为平均值±SD。*p值≤0.05； **p值≤0.01；***p值≤0.001，和****≤0.0001。
图7.抗CD30+肿瘤细胞系的两种CAR-CD30 T细胞的长期共培养证实了它们相同的特异性细胞毒性效价，与所使用的细胞因子无关。(A-J)以E/T 1:1的比例与效应NT细胞(上图)、CD30-CAR T细胞:28.4-1BBζT细胞(中图)和 28-OX40ζT细胞(下图)共培养7天后,残留肿瘤细胞的代表性FACS分析(鉴定为GFP+细胞)(或CD45-CD3-代表D283细胞)。
(K-L)7天后剩余肿瘤细胞的平均代表-以E/T 1:1的比例共培养，在IL2(K) 中与NT(白条)、CARGD2.28-41BBζT细胞(带水平线的白色条)、和 CARCD30.28-OX40ζT细胞(黑色条)，或在IL7/IL15(L)中(带垂直线的白色条代表NT；方形白色条代表CARGD2.28-41BBζT细胞和棋盘条代表 CARCD30.28-OX40ζT细胞)。来自6个健康供体(HD)的数据表示为平均值±SD。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001，和****≤0.0001。
图8.受压性长期共培养，以评估和量化CAR-CD30 T细胞的功能活性。 (A-F)在低E/T比下，共培养7天后评估淋巴瘤肿瘤细胞的肿瘤控制效率：在 IL2(A-C)中与CARGD2.28-41BBζT细胞(带水平线的条形图)、或CARCD30.28-OX40ζT细胞(黑色条)；或在IL7/IL15(D-F)中，(方形条代表 CARGD2.28-41BBζT细胞或棋盘条代表CARCD30.28-OX40ζT细胞)。单独的肿瘤由白条表示，来自六个健康供体(HD)的数据表示为平均值±SD。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001，和****≤0.0001。
图9.与CD30+肿瘤细胞共培养的CAR-CD30 T细胞的IFN-γ谱。(A-F)效应细胞：靶细胞共培养24小时后产生的特异性IFN-γ。该图显示了经肿瘤淋巴瘤细胞系刺激后，在IL2(A-C)中或在IL7/IL15(D-F)中生长的CAR.CD30 T 细胞的IFN-γ产量。相对于CARCD 2.28-41bbζT细胞，CARCD30.28-OX40ζ T细胞与Karpas 299(A和D)或HDML-2(B和E)共培养24小时产生显著更高水平的IFN-γ，特别是更低比例的效应细胞:靶细胞。当CAR-CD30 T细胞与肿瘤细胞系L428共培养时，在两个CAR(C和F)之间没有观察到差异。除了与L428 肿瘤细胞系(F)共培养外，当与CD30+肿瘤细胞(D-E)共培养时，在IL7/IL15中生长的CARCD30.28-OX40ζT细胞也产生更高水平的IFN-γ。
图10.在IL2存在下，针对NHL Karpas 299产生并扩增的CAR.CD30 T细胞的体内活性。(A-C)NSG小鼠的体内生物发光显像，该小鼠携带系统性Karpas 299-FF-Luc.GFP细胞并以在IL2存在的情况下产生和扩增的NT、 CARCD30.28.4-1BBζ或CARCD30.28.OX40ζT细胞处理。(A)体内实验的示意模型。老鼠接受静脉注射。Karpas 299-FF-Luc.GFP细胞。在肿瘤的生物发光变得稳定的三天后，将它们分为三个组，并用NT或两个CAR-CD30 T细胞之一处理。每周通过IVIS评估对肿瘤生长进行评估，持续140天。(B)在三组小鼠中每周测量肿瘤生长的生物发光成像；(C)用NT(IL2)(带白色圆圈的线；8 只小鼠)、28.4-1BBζ(IL2)(带白色正方形的线；10只小鼠)和28.OX40ζ(IL2) T细胞(带黑色正方形的线；10只小鼠)处理的每只小鼠的生物发光的表示。 (4)用NT(IL2)(带白色圆圈的线；8只小鼠)、28.4-1BBζ(IL2)(带白色正方形的线； 10只小鼠)和28.OX40ζ(IL2)(带黑色正方形的线；10只小鼠)T细胞治疗的荷瘤小鼠的Kaplan-Meier总生存率(OS)分析。*P值＝<0.05；**P值＝<0.001；***P值＝<0.0001。对数等级(Mantel-Cox)。
图11。再激发模型：在NHL小鼠模型中建立长期免疫记忆。(A-C)在+140 天静脉注射0.2x106 Karpas 299-FF-Luc.GFP细胞再次激发了治愈的NSG小鼠的体内生物发光成像，然后再进行100天。(A)体内实验的示意模型。小鼠接受静脉注射Karpas 299-FF-Luc.GFP细胞两次:在第0天和第140天。当肿瘤的生物发光变得稳定的第三天，将它们分为三个组，并用NT或两个CAR-CD30 T细胞之一处理。每周通过IVIS评估对肿瘤生长进行评估，持续240天。在第140天，静脉注射Karpas 299-FF-Luc.GFP细胞对治愈的小鼠和一组新的小鼠(作为肿瘤移植的阳性对照(CTR小鼠)加入实验中)进行再激发。
(B)从第140天到第240天每周测量肿瘤生长的生物发光成像。(C)用NT(带白色圆圈的线；8只小鼠)、CARCD30.28.4-1BBζ(带白色正方形的线；10只小鼠) 和CARCD30.28.OX40ζT细胞(带黑色正方形的线；10只小鼠)处理的每只小鼠、和在第140天作为肿瘤二次移植的阳性对照加入实验的CTR小鼠(虚线；6 只老鼠)的生物发光表现。(D)在第3天用NT(带白色圆圈的线；8只小鼠)、 CARCD30.28.4-1BBζ(带白色正方形的线；10只小鼠)和CARCD30.28.OX40ζ T细胞(带黑色正方形的线；10只小鼠)仅处理一次的荷瘤小鼠，和在第140天用肿瘤二次再激发的小鼠的Kaplan-Meier总生存率(OS)分析。加入CTR小鼠的存活天数(带白色三角形的虚线；6只小鼠)，将第140天视为零。*P值＝<0.05；**P 值＝<0.01；***P值＝<0.001；****P值＝<0.0001。对数等级(Mantel-Cox)。(E)在第一次肿瘤激发后(第6天)和第二次肿瘤再次激发之前和之后(分别为第132 天和第180天)，显示了在指定天的循环人T细胞的代表性图片。NT(第一行)、 CARD 30.28-41BBζT细胞(第二行)和CARD30.28-OX40ζ(第三行)。
图12.评估在IL2或IL7/IL15存在下针对HL L428产生和扩增的CAR.CD30 T细胞的体内活性。(A-C)NSG小鼠的体内生物发光显像，该小鼠携带系统性 L428-FF-Luc.GFP细胞，在第6天用在L2或IL7/IL15存在的情况下体外产生和扩增的NT、28.OX40ζ或28.4-1BBζT细胞处理。每周通过IVIS评估对肿瘤生长进行评估，持续165天。(A)体内实验的示意模型。老鼠接受了静脉注射2x106 L428-FF-Luc.GFP细胞，并在6天后，当生物发光变得稳定时，将它们分为6组，并用NT或CAR-CD30 T细胞处理。每周通过IVIS评估对肿瘤生长进行评估，持续165天。(B)从第6天到第165天每周测量肿瘤生长的生物发光成像。(C) 用NT(IL2)T细胞(带白色圆圈的线；5只小鼠)、28.4-1BBζ(IL2)T细胞(带白色正方形的线；5只小鼠)、28.OX40ζ(IL2)T细胞(带黑色正方形的线条；5只小鼠)、 NT(IL7/IL15)T细胞(带白色圆圈的虚线；5只小鼠)、28.4-1BBζ(IL7/IL15)T细胞(带白色正方形的虚线；5只小鼠)和28.OX40ζ(IL7/IL15)T细胞(带黑色正方形的虚线；5只小鼠)处理的每只异种移植小鼠的生物发光。(D)用NT(IL2)(带白色圆圈的线)、28.4-1BBζ(IL2)(带白色正方形的线)、和CARCD30.28-OX40ζ(IL2)(带黑色正方形的线条)、NT(IL7/IL15)(带白色圆圈的虚线)、 CARCD30.28.4-1BBζ(IL7/IL15)(带白色正方形的虚线)和CARCD30.28.OX40 ζ(IL7/Il15)(带黑色正方形的虚线)处理的荷瘤小鼠的Kaplan-Meier总生存率 (OS)分析；*P值＝<0.05；**P值＝<0.001；***P值＝<0.0001。对数等级(Mantel-Cox)。(E)该表报告了用在IL2或IL7/IL15中生长的NT或CAR-CD30 T细胞处理的 L428异种移植小鼠的OS的重要性。
*P值＝<0.05和**P值＝<0.01。(F-G)在携带系统性L428-FF-Luc.GFP肿瘤细胞的、并在第6天用人NT或CAR.CD30 T细胞处理的NSG小鼠中的人循环T 细胞的平均值，在第15、30、56、80、100、130和160天评估CD45+CD3+细胞百分比(F)和CAR-CD30 T细胞(CD3+CD34+)(G)。
图13.受压性长期共培养。(A)图中展示了“受压性共培养”的实验设计。在转导后第15天，将T细胞与Karpas 299肿瘤细胞系以1∶1的E/T比接触共培养(在24孔板中，T细胞为0.5E+06，而Karpas 299为0.5E+06)。每五天施加肿瘤细胞，直到共培养的第20天(第I、II、III和IV次施用)。在每个时间点，在第24小时收集上清液，并分析细胞因子IFNγ、TNFα、IL-2和IL-10的存在。每次施加5天后，收集细胞并用FACS分析。(B)显示每次肿瘤施用5天后培养物中残留肿瘤百分比的条形图。两种CAR.CD30 T细胞都能有效控制肿瘤生长。然而，28-OX40ζT细胞在第20天时显示出增加的肿瘤控制。(C)显示在每个时间点，共培养物中的CD3阳性T细胞总数中的CAR阳性T细胞的百分比的条形图。第一次共培养后，即第5天，两种CAR.CD30分子中的百分比都显著增加。肿瘤的再次激发仅对28.4-1BB.ζT细胞的转导水平产生负面影响，而在 28.OX40.ζT细胞中该百分比保持稳定。(D)该图强调了，相对于28.4-1BB.ζT 细胞(白色条)，在28.OX40.ζT细胞(黑色条)中的MFI值显著更高。(E-H) 从ELLA分析获得的细胞因子谱，对肿瘤刺激24小时后收集的上清液进行的分析。来自7个健康供体(HD)的数据表示为平均值±SD。*p值≤0.05；**p 值≤0.01；***p值≤0.001，和****≤0.0001。(I):在CAR.CD30 T细胞中记忆和衰竭情况的肿瘤调节。在IL2或IL7/IL15细胞因子存在下扩增的CD3+T细胞 (NT(白色条)、28.4.1BB.ζ(带水平线的条)或28.OX40.ζ(黑色条))体外培养第15 天时，
Figure BDA0002680373170000321
CM、EM和EMRA亚群的比例的流式细胞分析。(J)长期“受压性”共培养在28.4-1BB.ζ和28.OX40.ζT细胞中诱导了EM和CM区分的选择，但不在NT T细胞中。(K)CD3+T细胞的衰竭情况，NT(白色条)、28.4.1BB. ζ(水平线条)、或28.OX40.ζ(黑色条)在IL2或IL7/15细胞因子中扩增15天。在相同的培养条件下，NT T细胞或CAR-CD30 T细胞生长之间的显著性用黑色表示，而带圆圈的星号表示在IL2或IL7/IL15存在下培养的相同T细胞群体之间进行比较的p值。(L)长期“受压性”共培养在两种CAR.CD30 T细胞类型中诱导了衰竭标志物(尤其是PD1和TIM3)的上调，尽管这些分子的上调并不影响其裂解活性。来自四个HD的数据表示为平均值±SD。*p值＝<0.05；**p值＝<0.001。
具体实施方式
实施例1：根据本发明的CAR-CD30的体外和体内设计和研究
材料和方法
CAR-CD30质粒(构建体)的设计
已经设计了两个临床级“第三”代逆转录病毒载体SFG，它们携带来源于 IgG(AC10)类鼠源抗体的抗CD30单链可变片段(scFv)、通过密码子优化的人CD8铰链-跨膜结构域连接到所述两个共刺激域CD28、4-1BB(CD137)或 OX40和CD3-ζ的密码子优化的信号结构域的表达盒(图1A)。所述CD30特异性单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白轻链(VL)可变区的111个氨基酸(aa)的融合蛋白，由8个氨基酸的柔性区(27)(短接头肽)连接至免疫球蛋白重链(VH)的117 个aa。特别地，所述scFv AC10与密码子优化的CD34衍生的16aa表位(作为可追踪标记)克隆在同一阅读框中，通过40aa的铰链(作为间隔区的11aa加上 29aa的密码子优化的CD8胞外结构域)连接至结合30aa的密码子优化的人CD8 跨膜区结构域(CD8aTM)。通过对于
SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4.1BB.ζ逆转录病毒载体(28.4-1BB.ζ)的两种共刺激分子CD28胞内域(41aa)和4-1BB胞内域(42aa)，所述信号从CD30 scFvAC10的胞外部分传递到CD3-ζ链(113aa)的胞内部分。
共刺激分子4.1BB换为OX40(36aa)可获得
SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ逆转录病毒载体(28.OX40.ζ)。
eGFP-萤火虫-荧光素酶细胞系的产生。
在选定的实验中，使用编码eGFP-萤火虫-荧光素酶(eGFP-FFLuc)的逆转录病毒载体标记CD30+肿瘤细胞：
-非霍奇金淋巴瘤(NHL)Karpas 299，
-霍奇金淋巴瘤(HL)HDML-2和L428；
-横纹肌肉瘤RD，
-增生性小脑髓母细胞瘤DAOY。
在选定的实验中，使用编码eGFP-萤火虫-荧光素酶(eGFP-FFLuc)的逆转录病毒载体来标记CD30阴性对照：
-B细胞前体白血病BV173，
-慢性粒细胞白血病K562，
如前所述(9)，这些细胞系用于体外和体内研究。
细胞系
非霍奇金淋巴瘤(NHL)Karpas 299是从Sigma-Aldrich获得的。霍奇金淋巴瘤(HL)HDML-2和L428以及B细胞前体白血病Ph+BV173获自DSMZ。横纹肌肉瘤RD、增生性小脑髓母细胞瘤DAOY、慢性粒细胞白血病K562、髓母细胞瘤D283和胚胎肾293T细胞系得自LGCStandards-ATCC。
Karpas 299、HDML-2、L428、BV173和le K562细胞系在RPMI 1640培养基(Gibco；USA)中培养。所述RD、DAOY肿瘤细胞系和293T细胞用DMEM 培养基(Gibco,InvitrogenTM,Carlsbad,CA)培养，所述D283在IMDM(Life Technologies Corporation,USA)中培养；细胞系补充有10％胎牛血清(FBS, Hyclone,Thermo Scientific,Pittsburgh,PA)和2mMGlutaMax(Invitrogen, California,USA)。将细胞保持在37℃的含5％CO2的潮湿气氛中。常规检测所有细胞系的支原体和靶抗原的表面表达。所有细胞系都已在认证实验室“BMRGenomics s.r.l”通过STR分析进行了鉴定。
逆转录病毒上清液
瞬时转染的逆转录病毒上清液通过用MoMLV gag/pol表达质粒Peqp m3(-env)、RD114 env表达质粒RDF和SFG载体分别以2∶3∶3的比例(总DNA 为10μg)共转染293T产生。GeneJuice试剂(Calbiochem)辅助转染。转染后2 天和3天收集上清液，过滤(使用0.45mm过滤器)，速冻，并在-80℃下以5ml 等分试样储存(28)。
效应细胞的分离、产生和转导。
根据OPBG(Approval of Ethical Committee N°969/2015prot.N°669LB) 的Institutional Review Board(IRB)制定的规则，在获得签署人的知情同意书后，使用淋巴细胞分离培养基(Eurobio；法国)，从获自健康供体(OPBG医院，Rome，意大利)的外周血(PB)或白细胞层中分离外周血单核细胞(PBMC)。在存在重组人白介素-2(IL-2,100U/ml；R&D；USA)(28)，或重组人白细胞介素7(IL7, 10ng/ml；R&D；USA)(29)和重组人白细胞介素15(IL15,5ng/ml；R&D)(18,30) 的组合的情况下，用固定的OKT3(1μg/ml,e-BioscienceInc.；San Diego,CA, USA)和抗CD28(1μg/ml,BD Biosciences，Europe)抗体激活T淋巴细胞。在第3天在预先包被有重组人RetroNectin(Takara-Bio.Inc；日本)的24孔板中使用特定的逆转录病毒上清液和特定的上述细胞因子转导活化的T细胞。转导后第5 天，将所述T细胞在含有45％RPMI1640和45％Click培养基(Sigma-Aldrich,Co.；美国)的“CTL完全培养基”中扩增，该培养基补充了10％FBS和2mM Glutamax，并每周补加两次上述特定的细胞因子。
表型分析。使用标准方法通过流式细胞术测定细胞表面分子的表达。使用以下单克隆抗体(mAb)：CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、 CD45RO、CD56、CD57、CD62L、CD62E、CD62P、CD95、CD106、CD127、 CD137、CD197、CD223(Lag3)、CD274(PDL1)、CD279(PD1)和TIM3。使用特异性抗CD34+(QBENd10V克隆)或能够有效结合scFv的Pierce RecombinantBiotinylated Protein L检测CAR-CD30在T细胞上的表达。使用一组24种不同 TCRVβ特异性的mAb(IO TEST Beta Mark TCR-Vβ谱试剂盒,BC)与CD3特异性mAb(BD Biosciences)和同种型对照mAb(BD Biosciences)(31)结合使用，在第15天和第30天评估NT T细胞和CAR-T细胞上的T细胞受体(TCR) -Vβ谱。样品用BD LSRFortessa X-20进行分析。流式细胞仪分析使用FACSDiva 软件(BD Biosciences)。对于每个样本，分析了至少20,000个事件。
TCR V beta(β)谱
为了评估第15天时NT和CAR修饰的T细胞之间的相对TCR Vβ谱分布，使用了
Figure BDA0002680373170000351
Beta Mark Kit(Beckman Coulter)。该方法使用为通过流式细胞术定量测定人T淋巴细胞的TCR Vβ谱设计的多参数分析工具。
CFSE稀释法测定
为了评估CAR-CD30 T细胞是否仅在存在特定抗原或细胞因子的情况下增殖，用荧光细胞染色染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记T细胞，使用 CellTraceTM CFSE CellProliferation Kit进行流式细胞术(Invitrogen)。
铬释放分析。如前所述(9)，使用6小时的铬释放测定法评估转导的效应细胞的细胞毒性活性。靶细胞(Karpas 299、HDML-2、L428和BV173)用放射性铬(51Cr,PerkinElmer,cat no NEZ030S)标记，然后洗涤，然后与CAR T细胞以不同比例共培养4小时。共培养上清液在Microbeta2 2450Microplate Counter (Pekin Elmer)上分析。三个孔的特异性裂解的平均百分比如下计算:[(实验释放- 自发释放)/(最大释放-自发释放)]x100。
共培养试验。在共培养实验中，对照非转导的(NT)和CAR-CD30 T淋巴细胞以1x106细胞/孔以指定的效应细胞:靶细胞(E:T)比率铺在24孔板中。在37℃孵育7天后，收集肿瘤细胞和T细胞，并通过基于CD3表达(效应T细胞)和GFP 或CD30+(肿瘤细胞系)的荧光激活细胞分选(FACS)分析来评估残留的肿瘤细胞和T细胞。
酶联免疫吸附试验和流式细胞珠阵列
使用可商购的试剂盒(R&D Systems，Pepro-Tech，Rocky Hill，NJ)通过特异性ELISA定量IFNγ的产生。从共培养测定中收集ELISA测试的上清液。
体内实验
所有体内实验均符合国际、EU和国家伦理要求，并获得了意大利Health Minster(N°88/2016-PR)的批准。
体内NHL小鼠模型(Karpas 299)
6周龄的NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ株；来自Charles River)小鼠通过静脉(i.v.)注射植入0.2x106 CD30+Karpas299-F-Luc.GFP。三天后，当肿瘤的光发射持续可测量时，小鼠接受静脉注射10×106对照(非转导的，NT)淋巴细胞或用CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ)或CAR.CD30.Δ CD34.CD28.OX40.ζ(28.OX40.ζ)基因修饰的T细胞(在IL2或在IL7/IL15的混合物中生长12-15天)。使用IVIS成像系统(异种)评估肿瘤生长。肿瘤的信号强度测量为总光子/sec/cm2/sr(p/s/cm2/sr)。低于5x105p/sec/cm2/sr(对没有肿瘤的小鼠进行测量)的生物发光信号被认为是阴性的。体内实验进行140天。定期评估小鼠外周血中循环的T细胞。
再激发模型：在NHL小鼠模型中建立长期免疫记忆。
移植了NHL CD30+Karpas299-F-Luc.GFP肿瘤细胞系并用一个剂量的 CAR.CD30 T细胞处理的小鼠被监测了140天，观察到肿瘤完全根除(低于5x105 p/sec/cm2/sr.的生物发光信号)至少70天后认为它们已经治愈。为了评估长期免疫记忆的建立，在第140天用0.2x106 CD30+Karpas299-F-Luc.GFP肿瘤细胞系再次激发治愈的小鼠。这些老鼠再进行至少110天。将一组新的对照小鼠(CTR 小鼠)加入实验，作为肿瘤植入的阳性对照。在再次激发CD30+肿瘤之前和之后，评估小鼠外周血中的循环T细胞。小鼠在第250天被安乐死。
体内HL小鼠模型(L428)
通过静脉内(i.v.)注射将2x106 CD30+L428-FF-Luc.GFP移植入6周龄的 NSG小鼠。6天后，当肿瘤的光发射持续可测量时，小鼠接受静脉(iv)注射10 ×106对照(非转导的，NT)淋巴细胞或用CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ)或CAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ(28.OX40.ζ)基因修饰的T细胞(在IL2或在IL7/IL15的混合物中生长12-15天)。使用IVIS成像系统(异种) 评估肿瘤生长。
统计分析
使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行统计评估，产生P值<0.05的组之间的差异被认为是显著的。
当需要进行多重比较分析时，通过重复测量ANOVA，然后进行多重比较的对数等级(Mantel-Cox)检验评估统计学显著性。使用Kaplan-Meier存活曲线分析小鼠存活数据，并使用Fisher精确检验来测量统计学上的显著差异。没有有价值的样本被排除在分析之外。仅在肿瘤植入后但输注T细胞之前死亡的情况才将动物排除。在体内研究中既没有进行随机化也没有进行盲法。然而，在输注对照或基因修饰的T细胞之前，根据对照和治疗组的肿瘤信号对小鼠进行匹配。为了比较肿瘤随时间的生长，以盲法收集生物发光信号强度。对生物发光信号强度进行对数转换，然后使用双样本t检验进行比较。病理学家旨在量化肿瘤体积的分析是以盲法进行的。
结果
CAR-CD30 T细胞的产生、鉴定
已经产生了两个有效的第三代CAR-CD30(CAR-CD30)T细胞，其包含来源于IgG(AC10)的鼠抗体单链可变片段(scFv)，所述scFv与CD28、和由4-1BB或 OX40代表的第二共刺激结构域、以及信号结构域CD3-ζ链(ζ)在同一阅读框。作为选择性标记，添加了源自磷酸糖蛋白CD34(ΔCD34)的小分子，图1A。从6 名健康供体中建立活化的T细胞(ATCs)，在含IL2或IL7/IL15混合物的CTL完全培养基中生长，并分别用编码CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ) 或CAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ(28.Ox40.ζ)28.OX40.ζ)SFG载体的逆转录病毒上清液转导。平行培养非转导(NT)ATC作为阴性对照。通过流式细胞术有效地使用CD34抗体(克隆QBEnd10)(如代表性的图1B所示)，或替代的蛋白L试剂(32)(图1C)检测转导的T细胞。如图1D所示，转导有28.OX40.ζ或 28.4.1BB.ζ构建体的T细胞高水平表达CAR-CD30。但是，在第5天，在IL.2 中转导的T细胞中，编码28.OX40.ζ(IL2)的载体相对于编码28.4.1BB.ζ(IL2) 的载体的转导水平显著更高(分别为87.3％±5.1％vs.76.1％±9.8％，p<0.05；(除非另有说明，否则此处和整篇文章均报告了平均值±标准差(SD))。在IL7/IL15中转导的T细胞也获得了类似的结果。在第5天，与28.4.1BB.ζ(IL7/IL15)T 细胞(78.6％±3.9％)相比，28.OX40.ζ(IL7/IL15)T细胞(84.1％±2.2％)的转导水平同样更高，p＜0.05。在IL2中生长的两种CD3+CAR.CD30 T细胞均值得注意，转导水平在第15天时显著下降(分别地，28.OX40.ζ(IL2)为65.1％±10.9％， 28.4.1BB.ζ(IL2)为49.2％±13.3％，p<0.05，蓝色星号)，再保持稳定至少两个星期至第30天(28.OX40.ζ(IL2)和28.4.1BB.ζ(IL2)分别为73.0％±6.4％vs.55.9％±18.1％)。换为IL7/IL15，不论使用哪种构建体，都显著提高CD4+和/或CD8+ T细胞的稳定性和转导水平。
在CAR T细胞中，CD4+/CD8+比率每周减少一次(图1E(CAR+CD4+))，结果有利于CAR+CD8+(图1F)。在第15天发现CD8+在两种CAR.CD30 T细胞中都占优势。NT T细胞观察到同样的趋势。当在IL2(图1G)或IL7/IL15(图1H) 中培养时，经修饰的T细胞的扩增速率与NT T细胞相比没有显著变化。然而，在长期体外培养中，IL7/IL15混合物显著提高了NT(图1I)和转导的T细胞(图 1L和1M)的倍数扩增。
基因修饰的CAR-CD30 T细胞的记忆和衰竭情况
为了评估特定的共刺激结构域和细胞因子对CAR.CD30 T细胞区分的影响，对CD3+CAR-T细胞记忆标记的表达进行了表征。在培养的第15天，在 CD3/CD28刺激和用IL2培养后产生的大多数扩增的T细胞具有效应记忆(EfM) 表型，在NT和两种CAR.CD30 T细胞之间没有显著差异。但是，换为IL7/IL15 显著降低了CAR.CD30 T细胞中的中央记忆(CM)区分，有利于EfM和效应末端(EfT)区分。经过30天的体外培养，只观察到
Figure BDA0002680373170000391
CAR.CD30 T的显著(只有在IL2中培养的T细胞)减少。
还评估了CAR+T细胞同时表达的抑制性受体(PD-1、LAG3和TIM3)的模式，以确定它们的衰竭状态(图2)。观察到，相对于NT或CARCD30.28.4-1BB. ζT细胞，当用(28.OX40.ζ)在IL2中转导T细胞时，在体外培养的第15天，观察到PD1和TIM3的显著上调(图2)。值得注意的是，IL2换为IL7/IL15显著降低了CARCD30.28.OX40.ζT细胞中PD1的表达(分别地，IL2为15.33％± 4.75％和IL7/IL15为7.95％±4.93％，p＝0.006)，但上调了TIM3的表达(分别地， IL2为2.45％±0.41％和IL7/IL15为7.28％±1.26％，p＝0.009)。体外培养+30天， NT和CARCD30修饰的T细胞的衰竭情况通常由PD1和TIM3表达决定。
CAR-CD30 T细胞的安全性
为了评估逆转录病毒修饰或培养条件对经修饰的T细胞的安全性的影响，对于NT或CAR-CD30 T细胞，评估基础增殖或细胞因子或/和抗原特异性增殖。在第0天用荧光细胞染色CFSE标记T细胞，并在有/无细胞因子的情况下接种 5天，或在存在肿瘤细胞系CD30阳性(Karpas299)或肿瘤细胞系CD30阴性 (BV173)的情况下共培养。评估了CD3+细胞的基础性增殖，也评估了CD8+ 细胞和CD4+细胞的基础性增殖。
NT T细胞仅在与IL2(50U/ml)(图3A-II)或IL7(10ng/ml)/IL15(5ng/ml)组合 (图3A-III)培养时增殖，如图CFSE染料稀释所示。增殖由于CD8+细胞(中间组)而优先。当它们在Karpas299细胞系(图3B-IV和图3C-IV)的存在下共培养，但不在BV173肿瘤细胞系(图3B-V和图3C-V)的存在下共培养时，或者当没有细胞因子(B-I和C-I)时，也观察到特定的CFSE染料稀释，CAR-CD30 T细胞形成对比。此外，为了评价培养的T细胞的多克隆扩增，在体外培养的第15天和第30天，确定在IL2或IL7/IL15中生长的NT和CAR-CD30 T细胞之间是否存在TCR Vβ谱分布的一致性。没有观察到特定克隆的细胞因子或CAR依赖性的显著优先扩增，即使细胞培养达30天(数据未显示)。
CAR-CD30 T细胞在体外能有效裂解CD30+淋巴瘤，但也能裂解实体瘤(如髓母细胞瘤和肉瘤细胞系)
然后评估了CAR-CD30 T细胞杀伤CD30+人肿瘤细胞系的能力。
众所周知，细胞膜蛋白CD30在2种霍奇金淋巴瘤细胞系(图4A(HDML-2， L428))和1种NHL细胞系(Karpas 299)中表达。有趣的是，CD30+也表达在 5个肉瘤细胞系中的1个(CD30阳性:RD，CD30阴性:SK-ES-1、A673、CW9019 和CT-10)图4B；在检测的2个髓母细胞瘤细胞系中的1个(CD30阳性:DAOY， CD30阴性:D283)图4C；和1个T淋巴细胞系T2(CEM.T2，但不在一个B细胞白血病细胞系BV173)(图4D)。
此外，下列CD30+肿瘤细胞系也表达高水平的PDL 1(KAPAS 299和HDML-2)。为了评估PDL1对将被CARCD30 T细胞杀死的CD30+肿瘤细胞系内在抗性的相对影响，HL L428(PDL1阴性)被转导以稳定表达PDL1(图4E)。
在51Cr释放试验中，两种CARCD30 T细胞都能够特异性且高效地裂解 CD30+淋巴瘤，如Karpas 299(图5A)、HDML-2(图5B)、L428(图5C)，但不包括CD30-白血病细胞系BV173(图5F)。值得注意的是，两种CAR-CD30 T细胞都显示出也能杀死桥小脑角区髓母细胞瘤DAOY(图5D)。作为实体瘤的CD30 阴性对照，检测了髓母细胞瘤D283(图5E)和白血病细胞系BV173(图5F)。从IL2切换到IL7/IL15的混合物并不能提高CAR-CD30 T细胞的效价(图6A-F)。
如代表性供体所显示的，在7天的长期共培养中，使用效应细胞和靶细胞的比率1比1(R1:1)，观察到在GFP+淋巴瘤细胞系上两种CAR-CD30 T细胞的特异性和相当的效价(图7A-D)。值得注意的是，相对于L428野生型(图7C)， PDL1在L428肿瘤细胞系上的表达(图7D)没有明显影响L428肿瘤细胞系对两种CAR-CD30 T细胞的敏感性。此外，在其他CD30+肿瘤细胞系中也观察到有明显的肿瘤控制，如在CD30+GFP+白血病细胞系中(图7E)，但在CD30阴性BV173中没有观察到(图7F)；在CD30+GFP肿瘤DAOY髓母细胞瘤细胞系中(图 7G)和在CD30+RD肉瘤细胞系(图7I)中，但在CD30阴性CD45阴性D283髓母细胞瘤细胞系(图7H)中没有。值得注意的是，对于实体瘤而言，28.OX40.ζ的杀伤力明显优于28.4.1BB.ζ(图7G和7I)，但在CD30阴性的SK-ES-1(图7J) 中则没有。这些结果在IL2(图7K)或IL7/IL15(图7L)中的6个不同供体中得到证实。
在本研究中，当在标准铬细胞毒性测定法(图5-6)或长期共培养(图7) 测试时，细胞因子培养条件不影响CAR-CD30 T细胞对CD30+细胞的体外特异性细胞裂解活性。为了评估两个CAR-CD30 T细胞之间裂解效价的实际效力，体外长期共培养能力试验被强化，将靶肿瘤细胞从R1:1增加到R1:32。值得注意的是，在低效应细胞/靶标细胞比率下，对Karpas299(以R1:8和R1:16)和 HDML-2细胞系(以R1:8、R1:16和R1:32)，CAR.CD30 T细胞的活性显示出 28.OX40.ζ(IL2)T细胞的体外肿瘤控制的显著改善(分别为图8A-B)，但是对于L428，在28.OX40.ζ(IL2)和28.4.1BB.ζ(IL2)之间没有观察到细胞裂解活性的显著差异。
对于CAR-CD30 T细胞(IL7/IL15)，28.OX40.ζ优越的裂解活性已被证实，特别是在Karpas 299和HDML-2细胞系的较低效应细胞/靶细胞比率下，尽管相对于28.4-1BB.ζ，其不能达到显著性(分别见图8D和8F)，
总体而言，这些数据证实了28.OX40.ζ(IL7/IL15)的优越的CD30+特异性激活，当与Karpas 299和HDML-2共培养时，就特定的IFN-γ产生而言，对共培养效价测定24小时收集的上清液进行评估(图9A-B和9D-E)。当与CD30+肿瘤细胞系L428共培养时，两种CAR-CD30T细胞都产生特异性和同等水平的IFN- γ(图9C和9F)。
在NHL小鼠模型中建立长期免疫记忆。
使用免疫缺陷NSG小鼠，在异种移植模型中，将CAR-CD30 T细胞的体内效力和持久性与NHL Karpas299-FF-Luc.GFP肿瘤细胞系(图10A)进行比较。
在用NT(IL2)T细胞治疗的组中，肿瘤的生物发光逐渐增加(图10B-C)，而在用10x106 CAR-CD30 T细胞(IL2)治疗的小鼠中，通过测量生物发光信号的减少或控制，观察到显著的肿瘤控制。用NT细胞(IL2)处理的小鼠的中位生存期仅达到45.5天，30％的用28.4.1BB.ζ(IL2)处理的小鼠和60％的用28.OX40.ζ (IL2)处理的小鼠分别经历了长期肿瘤控制(图10D)。具体来说，用28.4.1BB.ζ (IL2)处理的小鼠的中位生存期为58天(p＝0.05)，而用28.OX40.ζ(IL2)处理的小鼠的中位生存期未确定(图10D)。
经过140天的治疗，治愈的小鼠(在第0天用28.4.1BB.ζ(IL2)治疗的3只小鼠和用28.OX40.ζ(IL2)治疗的6只小鼠)被再次激发，静脉注射相同的肿瘤 (0.2x106)，并对小鼠进行另外100天的追踪。在这一组实验中，添加了6只新小鼠作为阳性对照小鼠(CTR小鼠)，它们通过静脉注射(i.v.)接受 CD30+Karpas299-F-Luc.GFP(图11A)。通过评估在+140天再次注射的 Karpas299-F-Luc.GFP的生物发光，注意到在CTR小鼠(带白色圆圈的线)和28.4-1BB.ζ(IL2)处理的小鼠(带白色正方形的线)中的肿瘤的快速进展(图 11B-11C)。相比之下在28.OX40.ζ(IL2)治疗的小鼠(带黑色正方形的线)中，在肿瘤最初扩张40天后，66.67％(6只中的4只)的小鼠第二次根除了再次激发激发的肿瘤，具有显著的存活益处(图10D)。为了证实长期免疫记忆的建立，在第一次肿瘤输注(第6、56、103和132天)和第二次肿瘤输注(第180、221和254 天)后，在接受治疗的小鼠中取样并分析血液。特别是，相较于用28.4-1BB.ζ(IL2)(0.275％±0.109％)或NT(IL2)(0.347％±0.071％)治疗的小鼠，对于用28.OX40.ζ(IL2)治疗的小鼠，观察到与淋巴瘤输注(2.49％±1.03％，p <0.005)相关的循环T细胞的显著扩增(图11E)。有趣的是，在第一次肿瘤根除后，当在+132天时，评估了用CAR-CD30 T细胞治疗的小鼠群组中的循环T 细胞，对于28.OX40.ζ(IL2)和28.4.1BB.ζ(IL2)，分别仅有0.022％±0.027％和0.090％±0.1355％的T细胞被定量。肿瘤再次激发后的40天(第180天)，相对于28.4.1BB.ζ(IL2)(0.093％±0.129％)，发现循环28.OX40.ζ(IL2) T细胞(7.216％±11,259％)缓慢但令人印象深刻的扩增。第二次肿瘤完全根除后，循环28.OX40.ζ(IL2)T细胞同时减少至不可测的百分比(在第254天测量 (0.001％±0.0018％))。
在NHL小鼠模型中评估CAR-CD30 T细胞的效力和持久性。
接下来评估了细胞因子的使用对在IL2或IL7/IL15中生长15天的 CAR-CD30 T细胞的体内对抗更具激发性的HL L428的功效的影响。小鼠在第6 天接受静脉注射2x106L428-FF-Luc.GFP细胞系，并且当肿瘤的光发射持续可测量时，所述小鼠被静脉注射NT或基因修饰的T细胞。为了评估人循环T细胞的持久性，在+15、+30、+56、+80、+100、+130、+160天对处理过的小鼠进行血液取样(图12A)。在用NT T细胞处理的HL荷瘤小鼠中，L428细胞系的生物发光在不到50天的时间内迅速增加到5log(图12B和图12C)，并且小鼠死亡或因发病而被处死。对处死小鼠器官的宏观分析显示，肝脏上优先出现大的肿瘤块。用28.4-1BBζ(IL2)处理的HL荷瘤鼠(79±10天)比用NT(IL2)、NT(IL7/IL15) 处理的荷瘤鼠(分别为52±9天和58±1天)存活的中位时间略长(图12B-E)。 IL7/IL15的转换没有提高28.4-1BBζ(IL7/IL15)的细胞毒性活性(图12B-D)。相对于用NT(IL2)或28.4-1BB.ζ(IL2)处理的小鼠，用28.OX40.ζ(IL2)治疗的 HL荷瘤小鼠的存活中位时间显著改善至133±4天。虽然当用28.OX40.ζ (IL7/IL15)治疗的HL荷瘤小鼠的存活中位时间不确定，但是在用两种28.OX40.ζCAR T细胞治疗的小鼠之间的总体存活率没有显著不同(p＝0.0876，图12E)。为了评估输注的T细胞的持久性，在整个实验期间，对荷L428肿瘤的NSG小鼠的血液循环T细胞进行定期监测，并用NT或基因修饰的T细胞进行治疗(图 12F)。尽管用NT T细胞治疗的小鼠也显示了人循环CD45+CD3+细胞的显著增加，并且在第56天的评估中出现峰值(NT(IL2)和NT(IL7/IL15)分别为26.69％± 7.02％和5.97％±9.63％)，但是没有观察到肿瘤控制。
在第80天，在用28.4-1BB.ζ(IL2)处理的仅存活的一只小鼠中，检测到非常高数量的循环人T细胞(CD45+CD3+＝20.56％)，但转导水平低 (CD3+CD34+＝4,57％)。相比之下，用28.OX40.ζ(IL2)处理的全部四只小鼠中，循环T细胞(CD45+CD3+)在第80天平均为9.79％±5.24％(范围为 3.08％-15.37％)，转导稳定水平为34.23％±5.87％。有趣的是，用28.OX40.ζ (IL7/IL15)治疗的小鼠中，检测到显著降低的循环T细胞水平(0.92％±0.56％, p＝0.0065)，和更高的转导T细胞百分比(41.89％±2.25％,p＝0.0300)。用28.OX40. ζCAR T细胞治疗的小鼠中彻底根除注入的肿瘤，随后循环T细胞减少。在最初的100天内，循环CAR-CD30 T细胞的百分比保持稳定。在第165天，在治疗的四只小鼠中，只在两只中发现循环T细胞(0.06％±0.02％)。所有四只老鼠都在这个时候痊愈了。在这两只小鼠中，CAR-CD30 T细胞显示出在CD4+和 CD8+之间均匀分布，作为中央记忆(CM)，定义为CD45RA-CD62L+，和效应记忆(EM)，定义为CD45RA-CD62L-(图12G)。
实施例2：根据本发明的CAR.CD30 T细胞(28.OX40.ζT细胞和28.4-1BB. ζT细胞)中的记忆和衰竭情况的肿瘤调节
材料和方法
受压性共培养试验
在受压性共培养实验中，将非转导的(NT)对照和CAR-CD30 T淋巴细胞 (28.OX40.ζT细胞和28.4-1BB.ζT细胞)以1x106细胞/孔以指定的效应细胞：靶细胞(E:T)比率1：1铺在24孔板中。为了评估当不止一次地添加肿瘤时，CAR.T 细胞多长时间能够消灭肿瘤，在第0、5、10和15天将肿瘤细胞添加到孔中。然后根据CD3表达(效应T细胞)和GFP或CD30+(肿瘤细胞系)通过FACS分析评估残余肿瘤细胞和T细胞的持久性，直至共培养20天。
酶联凝集素试验
在24小时收集E：T共培养物的上清液，使用ELLA方法(R和D系统)，以评估干扰素γ(IFNγ)、白介素2(IL-2)、白介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。
结果
为了在更复杂的对比中评估CAR.CD30 T细胞的裂解效力，通过每五天(在共培养的第0、5、10和15天)就再次激发肿瘤(Karpas 299)来“强化”共培养条件(图13A)。在每个时间点(在共培养的第1、6、11和16天)，通过评估单链表达和相对平均荧光强度(MFI)、记忆和衰竭情况、以及相对特异性细胞因子的产生(例如IFNγ、TNFα、IL-2和IL-10)来评估残余肿瘤的百分比和CAR.CD30 T细胞的行为。即使多次暴露于Karpas 299，两种CAR.CD30 T 细胞也都显示出高的肿瘤控制能力。尽管在第+5天和第+10天没有观察到它们之间的裂解活性的显著差异，28.OX40.ζT细胞在第20天表现出强大的肿瘤控制(28.OX40.ζT细胞为8.6％±5.3％，28.4-1BBζT细胞为27.9％±29.5％)(图 13B)。有趣的是，第一次共培养后，两种CAR.CD30分子的百分比均显著增加， 28.4-1BB.ζT细胞从66.9％±15.23％(第5天)增至93.8％±11.3％(第10天)， p＝0.022，28.OX40.ζT细胞从74.9％±11.3％(第5天)增至93.2％±11.3％(第 10天)，p＝0.007。事实上，下一次肿瘤再激发仅对28.4-1BB.ζT细胞的转导水平产生负面影响(从93.8％±3,06％(第10天)到67.9％±32.33％(第20天))，而在28.OX40.ζT细胞中，所述百分比保持稳定(从93.22％±2,75％(第10天)到 92.53％±3,45％(第20天))(图13C)。
此外，在每个时间点28.OX40.ζT细胞的MFI均显著高于28.4-1BB.ζT细胞(在第0天为11294.83±580453vs 24004±11365.6,p＝0.006；在第5天为16883 ±6703.47vs40671.2±12162.2,p＝0.004；在第10天为7382.75±4042.01vs 25329.75±14746.76,p＝0.037；在第15天为11729.83±11158.66vs 29552.83± 234643.32,p＝0.035；在第20天为8344.5vs 23834.83±11272.55,p＝0.001)(图 13D)。
此外，细胞因子谱证实了28.OX40.ζT细胞的活化较快，从而在受压性共培养的第20天也导致了明显的IFNγ产生(4768.86pg/ml±3708.34pg/ml)，相比于28.4-1BB.ζT细胞(2699.54pg/ml±2517.10pg/ml，p＝0.012)(图13E)，和TNFα产生(8439.32pg/ml±6187.27pg/ml)，相比于28.4-1BB.ζT细胞 (2983.40pg/ml±2497.48ng/ml,p＝0.013)(图13F)。
此外，在IL-2产生中，CAR.CD30 T细胞之间的差异在第+10天之前是显著不同的，这对应于肿瘤激发编号II)(28.OX40.ζT细胞为8480.82pg/ml±5065.76 Pg/ml)相较于28.4-1BB.ζT细胞(2778.64pg/ml±3852.82pg/ml，p＝0.006)(图 13G)。评价肿瘤控制的另一种方法是检测细胞因子IL-10(由Karpas 299细胞系产生)。如图13H所示，从第10天开始，在NT T细胞培养基(白色条)中检测到的IL-10的水平与在单独肿瘤(水平线条)中检测到的量相似，而高水平的IL-10 仅在与CAR CD30 T细胞第一次共培养(激发编号I)24小时后检测到(图13H)。
结果显示，在CD30+淋巴瘤连续添加达4次的过程中(“受压性”共培养)，具有CD28.OX40共刺激域的CAR.CD30 T细胞相对于4.1BB共刺激域能够更有效地控制肿瘤，当与Karpa299肿瘤细胞系共培养时，可产生显著更高含量的IFN- γ、TNF-α和IL-2。
参考文献
1.Brudno JN,and Kochenderfer JN.Chimeric antigen receptor T-celltherapies for lymphoma.Nature reviews Clinical oncology.2017.
2.Rezvani AR,Storer B,Maris M,Sorror ML,Agura E,Maziarz RT,Wade JC,Chauncey T,Forman SJ,Lange T,et al.Nonmyeloablative allogeneic hematopoieticcell transplantation in relapsed,refractory,and transformed indolent non-Hodgkin's lymphoma.Journal of clinical oncology:official journal of theAmerican Society of Clinical Oncology.2008；26(2):211-7.
3.Haverkos BM,Abbott D,Hamadani M,Armand P,Flowers ME,Merryman R,Kamdar M,Kanate AS,Saad A,Mehta A,et al.PD-1 blockade for relapsed lymphomapost-allogeneic hematopoietic cell transplant:high response rate but frequentGVHD.Blood.2017；130(2):221-8.
4.Wong RWJ,Ngoc PCT,Leong WZ,Yam AWY,Zhang T,Asamitsu K,Iida S,Okamoto T,Ueda R,Gray NS,et al.Enhancer profiling identifies critical cancergenes and characterizes cell identity in adult T-cell leukemia.Blood. 2017；130(21):2326-38.
5.Zheng W,Medeiros LJ,Young KH,Goswami M,Powers L,Kantarjian HH,Thomas DA,Cortes JE,and Wang SA.CD30 expression in acute lymphoblasticleukemia as assessed by flow cytometry analysis.Leukemia&lymphoma. 2014；55(3):624-7.
6.Berger GK,Gee K,Votruba C,McBride A,and Anwer F.Potentialapplication and prevalence of the CD30(Ki-1)antigen among solid tumors:Afocus review of the literature.Critical reviews in oncology/hematology.2017；113(8-17.
7.Evens AM,Hutchings M,and Diehl V.Treatment of Hodgkin lymphoma:thepast,present,and future.Nature clinical practice Oncology.2008；5(9):543-56.
8.Savoldo B,Rooney CM,Di Stasi A,Abken H,Hombach A,Foster AE,Zhang L,Heslop HE,Brenner MK,and Dotti G.Epstein Barr virus specific cytotoxic Tlymphocytes expressing the anti-CD30zeta artificial chimeric T-cell receptorfor immunotherapy of Hodgkin disease.Blood.2007；110(7):2620-30.
9.Di Stasi A,De Angelis B,Rooney CM,Zhang L,Mahendravada A,Foster AE,Heslop HE,Brenner MK,Dotti G,and Savoldo B.T lymphocytes coexpressing CCR4and a chimeric antigen receptor targeting CD30 have improved homing andantitumor activity in a Hodgkin tumor model.Blood.2009；113(25):6392-402.
10.Wang CM,Wu ZQ,Wang Y,Guo YL,Dai HR,Wang XH,Li X,Zhang YJ, ZhangWY,Chen MX,et al.Autologous T Cells Expressing CD30 Chimeric AntigenReceptors for Relapsed or Refractory Hodgkin Lymphoma:An Open-Label Phase ITrial.Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research.2017；23(5):1156-66.
11.Ramos CA,Ballard B,Zhang H,Dakhova O,Gee AP,Mei Z,Bilgi M,Wu MF,Liu H,Grilley B,et al.Clinical and immunological responses after CD30-specific chimeric antigen receptor-redirected lymphocytes.The Journal ofclinical investigation.2017；127(9):3462-71.
12.Hombach A,Heuser C,Sircar R,Tillmann T,Diehl V,Pohl C,and AbkenH.An anti-CD30 chimeric receptor that mediates CD3-zeta-independent T-cellactivation against Hodgkin's lymphoma cells in the presence of soluble CD30.Cancer research.1998；58(6):1116-9.
13.Hombach A,Heuser C,Sircar R,Tillmann T,Diehl V,Pohl C,and AbkenH.Characterization of a chimeric T-cell receptor with specificity for theHodgkin's lymphoma-associated CD30 antigen.Journal of immunotherapy.1999；22(6):473-80.
14.Hombach AA,Gorgens A,Chmielewski M,Murke F,Kimpel J,Giebel B, andAbken H.Superior Therapeutic Index in Lymphoma Therapy:CD30(+)CD34(+)Hematopoietic Stem Cells Resist a Chimeric Antigen Receptor T-cell Attack.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy. 2016；24(8):1423-34.
15.Louis CU,Savoldo B,Dotti G,Pule M,Yvon E,Myers GD,Rossig C,Russell HV,Diouf O,Liu E,et al.Antitumor activity and long-term fate ofchimeric antigen receptor-positive T cells in patients withneuroblastoma.Blood. 2011；118(23):6050-6.
16.Heczey A,Louis CU,Savoldo B,Dakhova O,Durett A,Grilley B,Liu H, WuMF,Mei Z,Gee A,et al.CAR T Cells Administered in Combination withLymphodepletion and PD-1 Inhibition to Patients with Neuroblastoma.Moleculartherapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.2017；25(9):2214-24.
17.Wein F,and Kuppers R.The role of T cells in the microenvironmentof Hodgkin lymphoma.Journal of leukocyte biology.2016；99(1):45-50.
18.Perna SK,De Angelis B,Pagliara D,Hasan ST,Zhang L,Mahendravada A,Heslop HE,Brenner MK,Rooney CM,Dotti G,et al.Interleukin 15 provides reliefto CTLs from regulatory T cell-mediated inhibition:implications for adoptiveT cell-based therapies for lymphoma.Clinical cancer research:an officialjournal of the American Association for Cancer Research.2013；19(1):106-17.
19.Karlsson H,Svensson E,Gigg C,Jarvius M,Olsson-Stromberg U, SavoldoB,Dotti G,and Loskog A.Evaluation of Intracellular Signaling DownstreamChimeric Antigen Receptors.PloS one.2015；10(12):e0144787.
20.Hudecek M,Sommermeyer D,Kosasih PL,Silva-Benedict A,Liu L, RaderC,Jensen MC,and Riddell SR.The nonsignaling extracellular spacer domain ofchimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity.Cancerimmunology research.2015；3(2):125-35.
21.Maher J,Brentjens RJ,Gunset G,Riviere I,and Sadelain M.Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimericTCRzeta /CD28 receptor.Nature biotechnology.2002；20(1):70-5.
22.Condomines M,Arnason J,Benjamin R,Gunset G,Plotkin J,and SadelainM.Tumor-Targeted Human T Cells Expressing CD28-Based Chimeric AntigenReceptors Circumvent CTLA-4 Inhibition.PloS one.2015；10(6):e0130518.
23.Hombach AA,Heiders J,Foppe M,Chmielewski M,and Abken H.OX40costimulation by a chimeric antigen receptor abrogates CD28 and IL-2 inducedIL-10 secretion by redirected CD4(+)T cells.Oncoimmunology.2012；1(4):458-66.
24.Hombach AA,Rappl G,and Abken H.Arming cytokine-induced killercells with chimeric antigen receptors:CD28 outperforms combined CD28-OX40 "super-stimulation".Molecular therapy:the journal of the American Society ofGene Therapy.2013；21(12):2268-77.
25.Zhong XS,Matsushita M,Plotkin J,Riviere I,and Sadelain M.Chimericantigen receptors combining 4-1BB and CD28 signaling domains augmentPI3kinase/AKT/Bcl-XL activation and CD8+T cell-mediated tumor eradication.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy. 2010；18(2):413-20.
26.Long AH,Haso WM,Shern JF,Wanhainen KM,Murgai M,Ingaramo M, SmithJP,Walker AJ,Kohler ME,Venkateshwara VR,et al.4-1BB costimulation amelioratesT cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigenreceptors.Nature medicine.2015；21(6):581-90.
27.Klement M,Liu C,Loo BL,Choo AB,Ow DS,and Lee DY.Effect of linkerflexibility and length on the functionality of a cytotoxic engineeredantibody fragment.Journal of biotechnology.2015；199(90-7.
28.Pule MA,Straathof KC,Dotti G,Heslop HE,Rooney CM,and Brenner MK.Achimeric T cell antigen receptor that augments cytokine release and supportsclonal expansion of primary human T cells.Molecular therapy:the journal ofthe American Society of Gene Therapy.2005；12(5):933-41.
29.Perna SK,Pagliara D,Mahendravada A,Liu H,Brenner MK,Savoldo B, andDotti G.Interleukin-7 mediates selective expansion of tumor-redirectedcytotoxic T lymphocytes(CTLs)without enhancement of regulatory T-cellinhibition.Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research.2014；20(1):131-9.
30.Cieri N,Camisa B,Cocchiarella F,Forcato M,Oliveira G,Provasi E,Bondanza A,Bordignon C,Peccatori J,Ciceri F,et al.IL-7 and IL-15 instruct thegeneration of human memory stem T cells from naive precursors.Blood. 2013；121(4):573-84.
31.Singh H,Figliola MJ,Dawson MJ,Olivares S,Zhang L,Yang G,Maiti S,Manuri P,Senyukov V,Jena B,et al.Manufacture of clinical-grade CD19-specificT cells stably expressing chimeric antigen receptor using Sleeping Beautysystem and artificial antigen presenting cells.PloS one.2013；8(5):e64138.
32.Zheng Z,Chinnasamy N,and Morgan RA.Protein L:a novel reagent forthe detection of chimeric antigen receptor(CAR)expression by flow cytometry.Journal of translational medicine.2012；10(29.
序列表
<110> 耶稣圣婴儿童医院
<120> 用于治疗CD30+肿瘤的CAR-CD30 T细胞
<130> PCT41700
<150> IT102018000003464
<151> 2018-03-13
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 1
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AC10 VL 序列
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
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Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<220>
<223> AC10 VH 序列
<400> 3
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<211> 16
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<213> 人工序列
<220>
<223> trackable marker DeltaCD34
<400> 4
Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可追踪标记DeltaCD19
<400> 5
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
20 25 30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
210 215 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
260 265 270
<210> 6
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可追踪标记NGFR
<400> 6
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn
210 215 220
<210> 7
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链CD8alpha
<400> 7
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
1 5 10 15
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
20 25 30
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链CD28
<400> 8
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 9
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链CH2CH3
<400> 9
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链CH3
<400> 10
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子
<400> 11
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链CD8alpha
<400> 12
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
20 25
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 跨膜结构域CD28TM
<400> 13
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 跨膜结构域CD8aTM
<400> 14
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠igG3上铰链(mIgG3UH)
<400> 15
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠igG3上铰链(mIgG3UH)2
<400> 16
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Ser Thr Pro
1 5 10 15
Pro Gly Ser Ser
20
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2接头
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)4接头
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4SG2接头
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G3SG4接头
<400> 20
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 21
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28胞质序列
<400> 21
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 22
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD137 (4-1BB) 序列
<400> 22
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-Zeta链
<400> 23
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 24
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40 序列
<400> 24
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Lys Ile
35
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8a胞质
<400> 25
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
1 5
<210> 26
<211> 542
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD30嵌合抗原受体分子
<400> 26
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu
65 70 75 80
Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Ile Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Thr Trp
165 170 175
Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr
180 185 190
Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Asn Tyr Gly
225 230 235 240
Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
245 250 255
Ala Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr
260 265 270
Asn Val Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
325 330 335
Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Glu Phe Arg Ser Lys Arg Ser
340 345 350
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
355 360 365
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
370 375 380
Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
385 390 395 400
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
405 410 415
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
420 425 430
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
435 440 445
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
450 455 460
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
465 470 475 480
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
485 490 495
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
500 505 510
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
515 520 525
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535 540
<210> 27
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD30嵌合抗原受体分子
<400> 27
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu
65 70 75 80
Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Ile Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Thr Trp
165 170 175
Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr
180 185 190
Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Asn Tyr Gly
225 230 235 240
Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
245 250 255
Ala Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr
260 265 270
Asn Val Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
325 330 335
Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Glu Phe Arg Ser Lys Arg Ser
340 345 350
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
355 360 365
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
370 375 380
Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro
385 390 395 400
Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp
405 410 415
Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
420 425 430
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
435 440 445
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
450 455 460
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
465 470 475 480
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
485 490 495
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
500 505 510
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
515 520 525
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535
<210> 28
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列
<400> 28
atggagtttg ggctctcctg gctcttcctg gtcgcgattc tgaagggggt ccagtgttca 60
cgagatatcg tcctgactca gagtcctgcc agcctggcag tctccctggg acagagagct 120
accataagtt gtaaagcatc acagtctgtt gatttcgatg gcgacagcta tatgaattgg 180
taccagcaaa aacccggcca gcccccgaaa gttttgatct atgcagcctc taacttggaa 240
agcggcattc ctgcgcgatt cagtggcagc gggagtggta cagatttcac cctgaacata 300
cacccagtcg aagaggagga cgcagccaca tattactgcc aacaatctaa cgaggatcca 360
tggacttttg ggggcggcac taaactcgaa atcaagggcg gaggttcagg cggaggaggg 420
cagattcaac tgcagcaatc aggacccgag gtggtcaaac caggtgccag tgtcaagata 480
tcttgcaagg catccggata tacatttacc gactattaca ttacctgggt caagcagaaa 540
cccgggcaag gacttgaatg gattggatgg atctaccctg gtagcggcaa caccaaatac 600
aacgaaaagt ttaaagggaa ggcaaccctg actgtagaca cctccagctc cacagcattc 660
atgcagctct cctcactgac ctccgaggac acagcagtgt atttctgtgc taattacggt 720
aattactggt tcgcctattg gggccaggga acccaagtga ccgtttcagc tggatccgaa 780
cttcctactc aggggacttt ctcaaacgtt agcacaaacg taagtcccgc cccaagaccc 840
cccacacctg cgccgaccat tgcttctcaa cccctgagtt tgagacccga ggcctgccgg 900
ccagctgccg gcggggccgt gcatacaaga ggactcgatt tcgcttgcga catctacatc 960
tgggctcccc tcgctggcac ctgtggggtg ctgctgctgt cactcgtgat caccctttat 1020
tgcaaccatc gaaacgaatt cagaagtaaa cggtcaaggc ttctgcacag cgattatatg 1080
aatatgacac caagaagacc tggtccaacc cggaaacact atcagcccta cgcgccccct 1140
agagacttcg cagcataccg ctctaagaga gggagaaaaa aattgctcta tatttttaaa 1200
caaccattta tgaggcccgt acagacaact caggaagagg atggctgtag ttgccgcttc 1260
ccagaggagg aggaaggagg ctgcgagttg agagttaaat tcagtagaag tgcggatgcg 1320
cctgcttacc agcagggcca gaaccaactg tacaatgaac tgaatctcgg gcgccgagaa 1380
gagtatgacg tcctcgataa gcggaggggt agggatcctg aaatgggtgg gaagccaaga 1440
agaaaaaacc cccaggaagg actgtataac gaacttcaga aggacaagat ggcagaggcc 1500
tactctgaga ttggcatgaa aggcgaacga cggcgcggta aaggtcatga cgggctgtac 1560
cagggcctgt ccacagcgac gaaggacact tacgacgccc tgcacatgca ggcactcccc 1620
cccaggtga 1629
<210> 29
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列
<400> 29
atggagtttg ggctctcctg gctcttcctg gtcgcgattc tgaagggggt ccagtgttca 60
cga 63
<210> 30
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 2的核苷酸序列
<400> 30
gatatcgtcc tgactcagag tcctgccagc ctggcagtct ccctgggaca gagagctacc 60
ataagttgta aagcatcaca gtctgttgat ttcgatggcg acagctatat gaattggtac 120
cagcaaaaac ccggccagcc cccgaaagtt ttgatctatg cagcctctaa cttggaaagc 180
ggcattcctg cgcgattcag tggcagcggg agtggtacag atttcaccct gaacatacac 240
ccagtcgaag aggaggacgc agccacatat tactgccaac aatctaacga ggatccatgg 300
acttttgggg gcggcactaa actcgaaatc aag 333
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列
<400> 31
ggcggaggtt caggcggagg aggg 24
<210> 32
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列
<400> 32
gatatcgtcc tgactcagag tcctgccagc ctggcagtct ccctgggaca gagagctacc 60
ataagttgta aagcatcaca gtctgttgat ttcgatggcg acagctatat gaattggtac 120
cagcaaaaac ccggccagcc cccgaaagtt ttgatctatg cagcctctaa cttggaaagc 180
ggcattcctg cgcgattcag tggcagcggg agtggtacag atttcaccct gaacatacac 240
ccagtcgaag aggaggacgc agccacatat tactgccaac aatctaacga ggatccatgg 300
acttttgggg gcggcactaa actcgaaatc aag 333
<210> 33
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BamH1限制性酶切位点
<400> 33
ggatcc 6
<210> 34
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列
<400> 34
gaacttccta ctcaggggac tttctcaaac gttagcacaa acgtaagt 48
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列
<400> 35
cccgccccaa gaccccccac acctgcgccg accattgctt ctcaacccct gagtttgaga 60
cccgaggcct gccggccagc tgccggcggg gccgtgcata caagaggact cgatttcgct 120
<210> 36
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:14的核苷酸序列
<400> 36
tgcgacatct acatctgggc tcccctcgct ggcacctgtg gggtgctgct gctgtcactc 60
gtgatcacc 69
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列
<400> 37
ctttattgca accatcgaaa c 21
<210> 38
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EcoR1限制性酶切位点和连接序列
<400> 38
gaattc 6
<210> 39
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:21的核苷酸序列
<400> 39
agaagtaaac ggtcaaggct tctgcacagc gattatatga atatgacacc aagaagacct 60
ggtccaaccc ggaaacacta tcagccctac gcgcccccta gagacttcgc agcataccgc 120
tct 123
<210> 40
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列
<400> 40
aagagaggga gaaaaaaatt gctctatatt tttaaacaac catttatgag gcccgtacag 60
acaactcagg aagaggatgg ctgtagttgc cgcttcccag aggaggagga aggaggctgc 120
gagttg 126
<210> 41
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:23的核苷酸序列
<400> 41
agagttaaat tcagtagaag tgcggatgcg cctgcttacc agcagggcca gaaccaactg 60
tacaatgaac tgaatctcgg gcgccgagaa gagtatgacg tcctcgataa gcggaggggt 120
agggatcctg aaatgggtgg gaagccaaga agaaaaaacc cccaggaagg actgtataac 180
gaacttcaga aggacaagat ggcagaggcc tactctgaga ttggcatgaa aggcgaacga 240
cggcgcggta aaggtcatga cgggctgtac cagggcctgt ccacagcgac gaaggacact 300
tacgacgccc tgcacatgca ggcactcccc cccaggtga 339
<210> 42
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:27的核苷酸序列
<400> 42
atggagtttg ggctctcctg gctcttcctg gtcgcgattc tgaagggggt ccagtgttca 60
cgagatatcg tcctgactca gagtcctgcc agcctggcag tctccctggg acagagagct 120
accataagtt gtaaagcatc acagtctgtt gatttcgatg gcgacagcta tatgaattgg 180
taccagcaaa aacccggcca gcccccgaaa gttttgatct atgcagcctc taacttggaa 240
agcggcattc ctgcgcgatt cagtggcagc gggagtggta cagatttcac cctgaacata 300
cacccagtcg aagaggagga cgcagccaca tattactgcc aacaatctaa cgaggatcca 360
tggacttttg ggggcggcac taaactcgaa atcaagggcg gaggttcagg cggaggaggg 420
cagattcaac tgcagcaatc aggacccgag gtggtcaaac caggtgccag tgtcaagata 480
tcttgcaagg catccggata tacatttacc gactattaca ttacctgggt caagcagaaa 540
cccgggcaag gacttgaatg gattggatgg atctaccctg gtagcggcaa caccaaatac 600
aacgaaaagt ttaaagggaa ggcaaccctg actgtagaca cctccagctc cacagcattc 660
atgcagctct cctcactgac ctccgaggac acagcagtgt atttctgtgc taattacggt 720
aattactggt tcgcctattg gggccaggga acccaagtga ccgtttcagc tggatccgaa 780
cttcctactc aggggacttt ctcaaacgtt agcacaaacg taagtcccgc cccaagaccc 840
cccacacctg cgccgaccat tgcttctcaa cccctgagtt tgagacccga ggcctgccgg 900
ccagctgccg gcggggccgt gcatacaaga ggactcgatt tcgcttgcga catctacatc 960
tgggctcccc tcgctggcac ctgtggggtg ctgctgctgt cactcgtgat caccctttat 1020
tgcaaccatc gaaacgaatt cagaagtaaa cggtcaaggc ttctgcacag cgattatatg 1080
aatatgacac caagaagacc tggtccaacc cggaaacact atcagcccta cgcgccccct 1140
agagacttcg cagcataccg ctctcgcgat caaagactcc cgcccgatgc ccacaaaccc 1200
cctggcgggg gcagctttag gacacccatt caagaagagc aggcagacgc ccacagcacc 1260
ttggccaaaa ttagagttaa attcagtaga agtgcggatg cgcctgctta ccagcagggc 1320
cagaaccaac tgtacaatga actgaatctc gggcgccgag aagagtatga cgtcctcgat 1380
aagcggaggg gtagggatcc tgaaatgggt gggaagccaa gaagaaaaaa cccccaggaa 1440
ggactgtata acgaacttca gaaggacaag atggcagagg cctactctga gattggcatg 1500
aaaggcgaac gacggcgcgg taaaggtcat gacgggctgt accagggcct gtccacagcg 1560
acgaaggaca cttacgacgc cctgcacatg caggcactcc cccccaggtg a 1611
<210> 43
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列
<400> 43
cgcgatcaaa gactcccgcc cgatgcccac aaaccccctg gcgggggcag ctttaggaca 60
cccattcaag aagagcaggc agacgcccac agcaccttgg ccaaaatt 108
agctttag gacacccatt caagaagagc aggcagacgc ccacagcacc 1260
ttggccaaaa ttagagttaa attcagtaga agtgcggatg cgcctgctta ccagcagggc 1320
cagaaccaac tgtacaatga actgaatctc gggcgccgag aagagtatga cgtcctcgat 1380
aagcggaggg gtagggatcc tgaaatgggt gggaagccaa gaagaaaaaa cccccaggaa 1440
ggactgtata acgaacttca gaaggacaag atggcagagg cctactctga gattggcatg 1500
aaaggcgaac gacggcgcgg taaaggtcat gacgggctgt accagggcct gtccacagcg 1560
acgaaggaca cttacgacgc cctgcacatg caggcactcc cccccaggtg a 1611
<210> 43
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列
<400> 43
cgcgatcaaa gactcccgcc cgatgcccac aaaccccctg gcgggggcag ctttaggaca 60
cccattcaag aagagcaggc agacgcccac agcaccttgg ccaaaatt 108

Claims (17)

1.CD30嵌合抗原受体，其从N末端到C末端包含或由以下物质组成:
a)信号肽，例如包含或由MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)组成的信号肽，其通过第一接头连接到；
b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，其包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头连接，或由其组成；
c)可追踪标记，其选自由如下组成的组：ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)、ΔCD19:PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK(SEQ ID NO:5)、NGFR:KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN(SEQ ID NO:6)，优选地为ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)；
d)铰链，其选自由如下组成的组：铰链CD8 α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)、铰链CD28:IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ IDNO:8)、铰链CH2-CH3:ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:9)、铰链CH3:ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10)，优选地为铰链CD8α:PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)；
e)跨膜结构域，其选自由如下组成的组：CD28TM:FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQID NO:13)、CD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，优选地为CD8aTMCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)；和
f)共刺激信号结构域，其选自由如下组成的组：通过连接CD28胞质序列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、CD137(4-1BB)序列:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22)、和CD3-Zeta链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列，或通过连接CD28胞质序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、OX40序列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:24)和CD3Zeta 链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列。
2.根据权利要求1所述的CD30嵌合抗原受体，其中连接AC10 VL和VH序列的第二接头选自由如下组成的组：富含脯氨酸的刚性接头，如小鼠igG3上铰链(mIgG3UH):PKPSTPPGSS(SEQ ID NO:15),(mIgG3UH)2:PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS(SEQ ID NO:16)；或者富含甘氨酸的柔性接头，如(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17),(G4S)4接头:GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18),G4SG2接头GGGGSGG(SEQ ID NO:19)或G3SG4接头:GGGSGGGG(SEQ ID NO:20)，优选GGGSGGGG(SEQ ID NO:20)。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中所述AC10VH序列和所述可追踪标记序列通过序列GS的第三接头连接。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域序列和共刺激信号结构域序列通过一个或多个接头连接，所述接头包含CD8a胞质(细胞):LYCNHRN(SEQ ID NO:25)或EF或由CD8a胞质(细胞):LYCNHRN(SEQ ID NO:25)或EF组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中:
a)信号肽，其包含MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)或由其组成，该信号肽通过第一接头连接至:
b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17)连接，或由其组成；
c)包含ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)或由其组成的可追踪标记；
d)铰链CD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)；
e)跨膜结构域CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，其通过一个或多个包含接头CD8a胞质(细胞)：LYCNHRN(SEQ ID NO：25)或由其组成的接头连接至：
f)共刺激信号结构域，其由通过连接CD28胞质序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、OX40序列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQID NO:24)和CD3Zeta链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:23)获得的序列组成。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中:
a)信号肽，其包含MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:1)或由其组成，该信号肽通过第一接头连接至:
b)来自AC10杂交瘤的抗CD30单链抗体结构域，包含AC10 VL序列:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)和AC10 VH序列:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA(SEQ ID NO:3)，所述AC10 VL和VH序列通过第二接头(G4S)2接头:GGGGSGGGG(SEQ ID NO:17)连接，或由其组成；
c)可追踪标记，其包含ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4)或由其组成；
d)铰链CD8αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:7)；
e)跨膜结构域CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14)，其通过一个或多个包含CD8a胞质(细胞)：LYCNHRN(SEQ ID NO：25)或由其组成的接头连接至：
f)共刺激信号结构域，其由通过连接CD28胞质序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21)、CD137(4-1BB)序列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22)和CD3Zeta链:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQID NO:23)获得的序列组成。
7.根据权利要求1-4、6中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中所述CD30嵌合抗原受体是:MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:26)。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的CD30嵌合抗原受体，其中所述CD30嵌合抗原受体是
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:27)。
9.编码根据权利要求1-8中任一项所述的CD30嵌合抗原受体的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的核苷酸序列，其是
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAAAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGC ATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCTAAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGGCCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTGAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(SEQ ID NO:28)。
11.根据权利要求9所述的核苷酸序列，其是ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGT TCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAAAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCTCGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGCCAAAATTAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA(SEQ ID NO:42)。
12.包含权利要求9-11中任一项所述的核苷酸序列的载体，其中所述载体是DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
13.一种细胞，例如T细胞，例如α/β和
Figure FDA0002680373160000081
T细胞、NK细胞、NK-T 细胞，其包含根据权利要求12所述的载体或质粒。
14.根据权利要求13所述的细胞，其在其中存在IL-7和IL-15两者的培养条件下获得，例如在制备所述细胞的方法的活化步骤、转导步骤和/或扩增步骤的培养条件下获得。
15.药物组合物，其包含根据权利要求9-11所述的核苷酸序列，或根据权利要求12所述的载体，或根据权利要求13-14所述的细胞，连同一种或多种赋形剂和/或佐剂。
16.根据权利要求1-8中任一项所述的CD30嵌合抗原受体、根据权利要求9-11中任一项所述的核苷酸序列、根据权利要求12所述的载体、根据权利要求13-14所述的细胞、根据权利要求15所述的药物组合物，用于医学用途。
17.根据权利要求1-8中任一项所述的CD30嵌合抗原受体、根据权利要求9-11中任一项所述的核苷酸序列、根据权利要求12所述的载体、根据权利要求13-14所述的细胞、根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗CD30+癌症，例如CD30+PDL1+癌症，特别是L428-PDL1+癌症，如淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、实体瘤、如肌纤维母细胞肉瘤、横纹肌肉瘤、组织细胞肉瘤、胚胎癌、腺癌、间皮瘤、混合生殖细胞肿瘤(GCT)、非精原细胞瘤GCT、头颈部癌、卵黄囊瘤、血管肉瘤、垂体腺瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤或精原细胞瘤。
CN201980019143.8A 2018-03-13 2019-03-12 用于治疗cd30+肿瘤的car-cd30 t细胞 Pending CN112261950A (zh)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113402618A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 徐州医科大学 Ski在制备增效型CAR-T细胞中的应用
CN113527514A (zh) * 2021-06-30 2021-10-22 徐州医科大学 Gstp1在制备增效型CAR-T中的应用
WO2022187078A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-09 Nantbio, Inc. Anti-cd30 monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors
CN115975056A (zh) * 2023-02-07 2023-04-18 徐州医科大学 利用天然蛋白tsh作为抗原结合位点构建靶向tshr的car-t细胞

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020018732A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 Ab Studio Inc. Novel systems for screening internalizing antibody and uses thereof
CA3143108A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Ultramodular igg3-based spacer domain and multi-function site for implementation in chimeric antigen receptor design
CA3190797A1 (en) * 2020-08-10 2022-02-17 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Siglec-6-binding polypeptides
WO2023122337A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016134284A1 (en) * 2015-02-19 2016-08-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2017066122A1 (en) * 2015-10-15 2017-04-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd30 chimeric antigen receptors
CN107759699A (zh) * 2017-10-18 2018-03-06 银丰生物工程集团有限公司 靶向cd30抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201206559D0 (en) * 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
GB201403972D0 (en) * 2014-03-06 2014-04-23 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
AU2015301460B2 (en) * 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
WO2016166630A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
KR20240038121A (ko) * 2015-05-30 2024-03-22 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 스캐폴드 및 이를 포함하는 세포-표적화 분자
US20220204582A1 (en) * 2016-12-02 2022-06-30 University Of Southern California Synthetic immune receptors and methods of use thereof
AU2018269194A1 (en) * 2017-05-15 2019-11-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bicistronic chimeric antigen receptors and their uses
US20210107966A1 (en) * 2018-05-07 2021-04-15 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Natural killer cell products and methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016134284A1 (en) * 2015-02-19 2016-08-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2017066122A1 (en) * 2015-10-15 2017-04-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd30 chimeric antigen receptors
CN107759699A (zh) * 2017-10-18 2018-03-06 银丰生物工程集团有限公司 靶向cd30抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022187078A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-09 Nantbio, Inc. Anti-cd30 monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors
US11814436B2 (en) 2021-03-01 2023-11-14 Nantbio, Inc. Anti-CD30 monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors
CN113402618A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 徐州医科大学 Ski在制备增效型CAR-T细胞中的应用
CN113527514A (zh) * 2021-06-30 2021-10-22 徐州医科大学 Gstp1在制备增效型CAR-T中的应用
CN115975056A (zh) * 2023-02-07 2023-04-18 徐州医科大学 利用天然蛋白tsh作为抗原结合位点构建靶向tshr的car-t细胞
CN115975056B (zh) * 2023-02-07 2023-12-01 徐州医科大学 利用天然蛋白tsh作为抗原结合位点构建靶向tshr的car-t细胞

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