JP2023504196A - 胎盤由来の同種ｃａｒ－ｔ細胞およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞集団を開示し、上記Ｔ細胞は、臍帯血、胎盤灌流液、またはそれらの混合物に由来する胎盤Ｔ細胞である。そのような細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞に由来するもの等の代替的な細胞集団と比べて、いくつかの態様が改善されることが示されている。また、血液がん等のがん、例えば、Ｂ細胞がん、またはその症状の治療を必要とする患者における、それらのがんの治療方法も開示している。これらの方法は、患者のがんまたはその症状を緩和するのに有効な量の本発明のいずれか１つのＴ細胞集団を患者に投与することを含む。【選択図】図１
Description
本出願は、２０１９年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９４３，７６０号、２０１９年１２月５日に出願された同第６２／９４４，３４９号、および２０２０年６月５日に出願された同第６３／０３５，４３２号の優先権を主張し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞およびＣＡＲ療法に一部関する。
ＣＡＲ療法は、がんに対する非常に重要なツールとして台頭してきている。しかしながら、これらの療法は、典型的には、患者自身の細胞、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞をエフェクター細胞集団として使用することに依存する。各患者の細胞を採取し、試験し、ＣＡＲ治療薬に変換しなければならないため、ＣＡＲ療法は、１）非常に高価であり、２）治療を実施する意志がある、および／または実施することができる特定の施設でのみ利用可能である。これらの欠点により、ＣＡＲ療法は、それを必要とする多くの集団にはほとんど利用不可能である。本発明は、これらおよび他の問題を緩和することを目的とした、容易に利用可能な同種ＣＡＲ療法を創造することに一部関する。
自家ＣＡＲ－Ｔ療法は、血液がん患者の標準治療の一部となっている。ＣＡＲ－Ｔ療法の細胞源は、患者のＰＭＢＣに由来する。同じくＰＢＭＣを原材料として使用する同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の開発は、臨床試験に入っている。ＵＣＢ－Ｔ細胞は、異なる生物学的特性を有し、これにより、同種細胞療法の原材料としてより適したものとなる。それらは、優勢なＴｃｍおよびＴｎａｉｖｅ表現型を有し、ＰＢＭＣから増殖させたＴ細胞と比較して、増加した増殖活性を示し、より長いテロメア／より高いテロメラーゼ活性を保持する（Ｏｋａｓ，ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１０；Ｆｒｕｍｅｎｔｏ，ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０１３）。ＨＬＡミスマッチに対するより高い免疫寛容、および同種活性化の障害を示す（Ｂａｒｋｅｒ，ｅｔ．ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００１；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００６）。これらは、治療目的で臨床規模に増殖させることができる。
Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、同種反応性の主要な細胞メディエーターである。Ｔ細胞受容体は、同種反応性に関与する主要な受容体である。Ｔ細胞受容体遺伝子の不活性化は、同種反応性の低下をもたらした。宿主ＮＫ細胞は、ＨＬＡミスマッチであるか、またはＨＬＡ分子を発現しないドナー細胞を死滅させる。ＮＫ細胞死を回避するための１つの機構は、ＮＫ細胞機能を阻害するＨＬＡ－Ｅ分子の発現によるものである。
我々は、血液がんおよび固形がんの治療のために同種プラットフォームで使用するための、分娩後のヒト胎盤に由来するＴ細胞を使用するための独自のプラットフォームを開発した。本研究において、我々は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療について、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴおよびＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の両方の胎盤Ｔ細胞を用いた概念の証明を実証した。胎盤由来Ｔ細胞（Ｐ－Ｔ細胞）は、より高い免疫寛容およびアロ応答の障害を示すにもかかわらず、我々は、Ｔ細胞受容体α定常鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト（ＫＯ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ媒介性のＴ細胞受容体α定常鎖（ＴＲＡＣ）ノックアウト（ＫＯ）のステップを、Ｐ－Ｔ細胞上の内因性Ｔ細胞受容体の発現に起因する任意の潜在的ＧｖＨＤを回避するための追加のリスク緩和戦略として、想定し、実証した。必要に応じて、これらの細胞は、Ｔ／ＮＫ細胞によるそれらの同種反応性／クリアランスを低下させるように、Ｂ２Ｍを発現せず、かつキメラＨＬＡ－Ｅ分子を発現するように、さらに遺伝的組換えすることができる。
本発明は、ＣＡＲ療法のための細胞源としての胎盤由来細胞の使用に関する。これらの細胞には、胎盤、胎盤灌流液、および臍帯血から単離された細胞、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。本発明の実施例では、臍帯血由来の細胞および／または胎盤灌流液由来の細胞が使用されており、これらの胎盤由来細胞は、ＰＢＭＣ由来のもの等の他の細胞源由来のＴ細胞よりも有利であることが示されている。
本明細書において、出願人は、胎盤由来細胞が、ＰＢＭＣのものよりも少ないエフェクター／メモリー細胞を有する、よりナイーブな表現型を有するという、この集団の１つの利点を発見した。さらに、出願人は、最大３６００倍の胎盤由来Ｔ細胞の増殖を実証している。これらの発見に基づいて、本発明の一態様は、ＣＡＲ療法のための細胞型としての、胎盤由来Ｔ細胞、例えば、臍帯血由来Ｔ細胞またはエクスビボで増殖させた臍帯血由来Ｔ細胞の使用である。
出願人はまた、それを行うための方法を開発し、そのような細胞が、例示的なＣＡＲを用いて高効率で形質導入することができ、標的を発現する細胞を容易に死滅させる一方で、標的を欠いている細胞は死滅させないことを示した。この死滅またはその欠如は、標的を欠く腫瘍細胞ではなく、標的を発現する腫瘍細胞に応答して誘発されるエフェクターサイトカイン発現の発現と相関していた。
出願人はまた、胎盤由来Ｔ細胞がＰＢＭＣよりも同種反応性が有意に低いことを実証した。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＡＲ療法で使用するための胎盤由来細胞、例えば、臍帯血由来細胞または増殖させた臍帯血由来細胞の使用を教示する。
出願人によって発見された追加の利点は、胎盤由来Ｔ細胞のナイーブ表現型が、そうでなければＣＡＲ療法の有効性を低下させる可能性のあるＴｒｅｇ細胞の枯渇を可能にすることである。そのような枯渇は、活性化されたＴ細胞上でのＣＤ２５の発現に起因して、ＰＢＭＣでは不可能であり／実用的ではない。
同種ＣＡＲ療法を創造するためのさらなる努力において、出願人はＴＣＲの一部、本明細書におけるＴＲＡＣをノックアウトした。出願人は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、胎盤由来Ｔ細胞の遺伝子組換えを高効率で行うための方法を開発した。そのような遺伝子組換えの使用は、胎盤由来Ｔ細胞の同種であることの利点をさらに高めることが期待される。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＴＣＲ遺伝子、例えば、ＴＲＡＣをノックアウトする等の同種反応性を低下させるためのＴ細胞の遺伝子組換えを教示する。
特定のＣＡＲが本出願で使用されているが、以下の利点がある：１）胎盤由来Ｔ細胞の使用、２）Ｔ細胞遺伝子、例えば、ＴＲＡＣ等のＴＣＲ遺伝子のノックアウト、および３）それらの組み合わせは、任意のＣＡＲに適用可能であり、ＣＡＲ療法を著しく改善し、ＧＶＨＤの低下を伴う同種治療を提供することが予想される。
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞集団であって、上記Ｔ細胞が胎盤Ｔ細胞であり、上記ＣＡＲが、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって細胞に導入されているＴ細胞集団を提供する。いくつかの実施形態において、上記胎盤Ｔ細胞は、臍帯血Ｔ細胞、胎盤灌流液Ｔ細胞、またはそれらの混合物である。いくつかの実施形態において、上記胎盤Ｔ細胞は、臍帯血Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、上記胎盤Ｔ細胞は、臍帯血Ｔ細胞と胎盤灌流液Ｔ細胞との混合物である。
これらの細胞は、例えば末梢血単核由来細胞とは異なり、いくつかの態様において、実際に上記細胞よりも改善されることが示されている。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞集団では、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の優勢な亜集団は、Ｔ ｓｃｍ／ナイーブ表現型を有する。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲ＋Ｔ ｓｃｍ／ナイーブ細胞の亜集団は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３０％超、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４０％超、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４５％超、またはＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約５０％超を占める。
いくつかの実施形態において、エフェクターメモリー表現型（Ｔ ｅｆｆ）を有するＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約７５％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約７０％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約６０％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約５０％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４０％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３５％未満、またはＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３０％未満を占める。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー表現型（Ｔｃｍ）を有するＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約１０％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約８％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約６％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約５％未満、ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４％未満、またはＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３％未満を占める。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量は、ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量の５０％超であり、ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量の６０％超であり、ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量の７０％超であり、ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量の８０％超であり、ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量の９０％超であり、ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量の１００％超である。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも増加した抗腫瘍活性を有する。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の割合が高い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ２７を発現する細胞の割合が高い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＣＲ７を発現する細胞の割合が高い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ１２７を発現する細胞の割合が高い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ５７を発現する細胞の割合が低い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ６２Ｌを発現する細胞の割合が高い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ２５を発現する細胞の割合が低い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＬａｇ－３＋を発現する細胞の割合が高い。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＴｉｍ－３を発現する細胞の割合が低い。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多いがん細胞株のインビトロでの死滅を示す。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のパーフォリンを発現する。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のＧＭ－ＣＳＦを発現する。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のＴＮＦ－αを発現する。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のＩＬ－２を発現する。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のグランザイムＢを発現する。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビボがんモデルにおいて、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも高い生存率をもたらす。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビボがんモデルにおいて、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも少ない体重減少をもたらす。他の実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、インビボがんモデルにおいて、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも少ない移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらす。
他の実施形態において、上記末梢血単核球Ｔ細胞集団は、上記ＣＡＲも発現する。他の実施形態において、上記ＣＡＲは、トランスフェクションによって上記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態において、上記ＣＡＲは、ウイルス形質導入によって上記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態において、上記ＣＡＲは、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって上記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態において、上記ＣＡＲは、レンチウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって上記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態において、上記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入された上記ＣＡＲは、上記Ｔ細胞集団によって発現されるのと同じＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞集団は、宿主に対する免疫原性を低下させるためのさらなる遺伝子改変を含む。他の実施形態において、上記遺伝子改変は、遺伝子ノックアウトである。他の実施形態において、上記遺伝子ノックアウトは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ノックアウトである。他の実施形態において、上記遺伝子ノックアウトは、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）ノックアウトである。他の実施形態において、上記さらなる遺伝子改変は、トランスフェクション、レトロウイルス形質導入、またはレンチウイルス形質導入によってもたらされる。他の実施形態において、上記さらなる遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ、ｔａｌｅｎ、またはｚｎフィンガー技術の使用によってもたらされる。
いくつかの実施形態において、上記ＴＲＡＣノックアウトは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、上記ＴＲＡＣノックアウトなしのＴ細胞集団と比較して末梢血単核球に対する同種反応性が低下している。いくつかの実施形態において、上記同種反応性の低下は、上記Ｔ細胞集団上のＣＤ２５の発現の低下または上方制御の低下を含む。いくつかの実施形態において、上記同種反応性の低下は、炎症促進性またはエフェクタータンパク質の発現の低下または上方制御の低下を含む。いくつかの実施形態において、上記炎症促進性またはエフェクタータンパク質は、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、グランザイムＢ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、上記同種反応性の低下は、上記末梢血単核球の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の低下を含む。いくつかの実施形態において、上記ＴＲＡＣノックアウトは、インビボＧＶＨＤモデルにおいて同種反応性を欠いているか、またはそれが低下している。
本発明はまた、がんまたはその症状の治療を必要とする患者においてがんまたはその症状を治療する方法であって、患者のがんまたはその症状を緩和するのに有効な量の本発明のいずれか１つのＴ細胞集団を患者に投与するステップを含む方法も提供する。いくつかの実施形態において、上記がんは、血液がんである。他の実施形態において、上記血液がんは、Ｂ細胞がんである。他の実施形態において、Ｔ細胞集団は、上記患者と同種である。
本明細書で使用する場合、「胎盤灌流液」は、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部、例えば、胎盤脈管構造を通過した灌流液を意味し、胎盤を通過する間に灌流液によって採取された複数の細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「胎盤灌流液細胞」は、胎盤灌流液から単離された、または胎盤灌流液から単離可能な有核細胞、例えば、全有核細胞を意味する。
本明細書で使用される場合、「腫瘍細胞抑制」、「腫瘍細胞増殖の抑制」等は、例えば、本明細書に記載の３段階方法を使用して産生されたＴ細胞またはＴ細胞集団を腫瘍細胞集団と接触させるまたは近接させることによって、例えば、腫瘍細胞集団を本明細書に記載の３段階方法を使用して産生されたＴ細胞またはＴ細胞集団と接触させることによって、例えば、上記腫瘍細胞集団中の腫瘍細胞のうちの１つ以上を死滅させることによって、腫瘍細胞集団の成長を遅延させることを含む。特定の実施形態において、上記接触は、インビトロまたはエクスビボで行われる。他の実施形態において、上記接触は、インビボで行われる。
本明細書で使用される場合、「造血細胞」という用語は、造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「＋」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、この細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照よりも検出可能なように存在すること、または定量的もしくは半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてバックグラウンドを超えて検出可能であることを意味する。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ＋」は、キメラ抗原受容体の存在を示すために使用される場合、蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照よりも検出可能なように存在するか、または定量的もしくは半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてバックグラウンドを超えて検出可能である。
本明細書で使用される場合、「－」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、この細胞マーカーが、蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照よりも検出可能なようには存在しないこと、または定量的もしくは半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてバックグラウンドを超えて検出可能ではないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」は、最も単純な実施形態では典型的には２つのである一連のポリペプチドを指し、免疫エフェクター細胞内では、細胞に、標的細胞、典型的にはがん細胞に対する特異性、および細胞内シグナル生成をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに以下に定義するような刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む。いくつかの態様において、一連のポリペプチドは、互いに連続している。いくつかの実施形態において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下で、ポリペプチドを互いに連結させることができる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結させることができる二量体化スイッチを含む。一態様において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合したゼータ鎖である。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）に任意選択的なリーダー配列を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化の間に、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意選択的に切断される。
本明細書に記載されるもの等の特異的腫瘍マーカーＸを標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、またはＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲと称される。
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達ドメイン」は、第２のメッセンジャーを生成することによって、またはそのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することによって、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用するタンパク質の機能部分を指す。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、複数鎖もしくは一本鎖、または無傷の免疫グロブリンであってもよく、天然源または組換え源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）能力を保持する、抗体の少なくとも１つの部分を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）等の単一ドメイン抗体、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片等の抗体断片から形成される多重特異性抗体、ならびに単離されたＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、およびビス－ｓｃＦｖに組み込むこともできる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６，２００５を参照のこと）。抗原結合断片はまた、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）等のポリペプチドに基づいて、足場に移植することもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。本明細書で使用される場合、指定されない限り、ｓｃＦｖは、ＶＬおよびＶＨ可変領域を、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に対して、いずれの順序で有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよいか、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
抗体またはその抗体断片を含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体または二重特異性抗体を含む、連続したポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）に記載されるもの、またはそれらの組み合わせを含む、多数の周知のスキームのいずれかを使用して決定され得る。
本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」または「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。「結合ドメイン」または「抗体分子」という用語は、抗体および抗体断片を包含する。一実施形態において、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、および第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」は、抗体分子の天然の立体構造に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、これは、通常、抗体が属するクラスを決定する。
本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」は、抗体分子の天然の立体構造に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
本明細書で使用される場合、「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成される抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、ＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現する抗体であって、ＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当該技術分野において利用可能かつ周知である組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を用いて得られている抗体を意味すると解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を惹起する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、または特定の免疫学的能力のある細胞の活性化のいずれか、またはその両方を伴い得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがって、その用語が本明細書で使用される「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明は、１つより多くの遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原は、合成により生成され得るか、または生体試料に由来し得るか、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または他の生体成分を有する流体が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲＴ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性およびヘルパー活性が挙げられる。
一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含むことができる。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナル、または抗原非依存的刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含んでもよく、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含んでもよい。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはΓΤΑΜとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲｉｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ゼータ」または代替的に「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」または「ＴＣＲ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿等からの等価残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」または代替的に「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分な、ゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基、またはそれらの機能的誘導体として定義される。一態様において、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、またはそれらの機能的オルソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿等からの等価残基を含む。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１８として提供される配列である。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号２０として提供される配列である。
本明細書で使用される場合、「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってＴ細胞による、限定されないが増殖等の共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ １６０、ＣＤ １９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢ １、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーで表すことができる：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ＮＫ細胞受容体。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド等が挙げられる。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、または天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的断片もしくは誘導体を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「４－１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿等からの等価残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指す。「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５として定義されるか、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿等からの等価残基を含む。一態様において、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号１４として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿等からの等価残基である。
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、α／β Ｔ細胞およびγ／δ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、ならびに骨髄由来食細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、例えば、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅、または成長もしくは増殖の阻害を促進するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は、免疫エフェクター機能または応答の例である。
本明細書で使用される場合、「抗がん効果」は、例えば、腫瘍体積の減少、がん細胞の数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、がん細胞増殖の低下、がん細胞生存率の低下、またはがん状態に関連する様々な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって顕在化され得る生物学的効果を指す。「抗がん効果」はまた、そもそもがんの発生の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても顕在化され得る。「抗腫瘍効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、または腫瘍細胞生存率の低下を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって顕在化され得る生物学的効果を指す。
本明細書で使用される場合、「自家」は、それが後に個体に再導入されるのと同じ個体に由来する任意の材料を指す。
本明細書で使用される場合、「同種」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の物質を指す。１つ以上の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合、２つ以上の個体が互いに同種であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体由来の同種物質は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。
遺伝子付加／組換えの方法は、当該技術分野において周知であり、本発明に適用可能である。例えば、ＣＡＲ送達または遺伝子ノックアウトの方法は、安定的もしくは一過性のトランスフェクション方法によって、またはレンチウイルスもしくはレトロウイルスの形質導入によって行われ得る。遺伝子組換えは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ｔａｌｅｎ、または他のそのような技術を使用することによって、これらまたは他の方法で行われ得る。
実施例１：出発物質、ＭＮＣ分離、およびＴ細胞単離
出発物質の胎盤血（ヒト臍帯血（ＵＣＢ）および／またはヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）の両方を含む）は、ＬｉｆｅｂａｎｋＵＳＡを通してインフォームドコンセントによって採取される。採取後、ＨｅｔａｓｔａｒｃｈによるＲＢＣ沈降またはＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅによる密度勾配細胞分離を用いて、出発物質を単核細胞（ＭＮＣ）について濃縮する。次いで、ＣＤ２５＋Ｔ調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるためにＭＮＣの陽性選択プロセスを行った後、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉビーズ細胞分離キットを使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を陽性選択する。細胞を凍結する前に、血清学的および無菌検査、ならびに表現型分析のために、単離されたＴ細胞のアリコートを採取する。
出発物質の胎盤血（ヒト臍帯血（ＵＣＢ）および／またはヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）の両方を含む）は、ＬｉｆｅｂａｎｋＵＳＡを通してインフォームドコンセントによって採取される。採取後、ＨｅｔａｓｔａｒｃｈによるＲＢＣ沈降またはＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅによる密度勾配細胞分離を用いて、出発物質を単核細胞（ＭＮＣ）について濃縮する。次いで、ＣＤ２５＋Ｔ調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるためにＭＮＣの陽性選択プロセスを行った後、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉビーズ細胞分離キットを使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を陽性選択する。細胞を凍結する前に、血清学的および無菌検査、ならびに表現型分析のために、単離されたＴ細胞のアリコートを採取する。
単離されたＰ－Ｔ細胞の表現型は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とは異なる。Ｐ－Ｔ細胞は、＞７８％のＣＤ３＋ＣＤ５６－Ｔ細胞を含有し、低頻度のＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋セントラルメモリーＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－ＣＤ２７＋エフェクターメモリーＴ細胞とともに、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－ＣＤ２７＋ナイーブＴ細胞から主になる。ＣＤ２５枯渇は、Ｐ－Ｔ細胞内のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇの頻度を０．５％未満まで有意に低下させた。
ＣＤ３４造血幹細胞／前駆細胞由来の胎盤Ｔ細胞を含むが、まだ試験されていない、追加の出発物質。前駆細胞のＴ細胞への増殖および分化のプロセスは、５０～６０日を要する場合がある。現在のプロトコルを用いた以下に示される集団には、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の有意な集団が存在するが、完全に分化した単一陽性Ｔ細胞は、容易に選択／濃縮することができることに留意することが重要である。
胎盤灌流液由来のＴ細胞の評価は完了しているが、現在の手順では、低い細胞数、生存率、およびＴ細胞の純度がもたらされるため、分離手順を最適化する必要がある。
実施例２：Ｔ細胞の活性化および増殖
非修飾Ｐ－Ｔ細胞：
単離されたＰ－Ｔ細胞を解凍し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇの除去（Ｔ細胞単離ステップの前に含めることができる）のためにＭｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ２５ビーズを使用してＣＤ２５枯渇を行い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：１ビーズ：細胞比）を使用して、またはＭｉｌｔｅｎｙｉの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子Ｔｒａｎｓａｃｔ（１：１００体積希釈）を使用して活性化する。次いで、細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、または１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を用いて増殖する。追加の再刺激を１２～１４日目に完了し、倍数増殖を最大化するために、Ｇｒｅｘ容器内で２１日目まで細胞を増殖させる。
非修飾Ｐ－Ｔ細胞：
単離されたＰ－Ｔ細胞を解凍し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇの除去（Ｔ細胞単離ステップの前に含めることができる）のためにＭｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ２５ビーズを使用してＣＤ２５枯渇を行い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：１ビーズ：細胞比）を使用して、またはＭｉｌｔｅｎｙｉの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子Ｔｒａｎｓａｃｔ（１：１００体積希釈）を使用して活性化する。次いで、細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、または１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を用いて増殖する。追加の再刺激を１２～１４日目に完了し、倍数増殖を最大化するために、Ｇｒｅｘ容器内で２１日目まで細胞を増殖させる。
非修飾Ｐ－Ｔ細胞は、２０日目まで培養する場合、初期刺激で最大６００倍、１４日目の再刺激（ＲＳ）で最大３，６００倍に増殖させることができる。
様々な培養条件下で、非修飾の２０日間増殖させたＰ－Ｔは、解凍後（ＰＴ）の非培養ＰＢＭＣと比較して早い分化表現型を示し、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２＋セントラルメモリーＴ細胞から主になっていたのに対し、解凍後の非培養ＰＢＭＣは、分化度がより高いＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－／＋ ＣＤ６２Ｌ－エフェクターメモリーおよび末端エフェクターＴ細胞から主になっていた。Ｐ－Ｔ細胞の早期分化状態を考慮すると、追加のラウンドの刺激は実現可能であり、患者に残存するセントラルメモリーＴ細胞と、腫瘍細胞を即座に標的化して死滅させるエフェクターＴ細胞とのバランスのとれた混合を維持しながら、胎盤由来同種ＣＡＲ－Ｔの「容易に実行可能な」製造を支持するように倍数増殖を有意に増加させるはずである。
ＣＡＲ修飾Ｐ－Ｔ細胞：
単離されたＴ細胞（凍結前にＣＤ２５枯渇を受けた）を解凍し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子Ｔｒａｎｓａｃｔ（１：１００体積希釈）を使用して活性化した。次いで、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いて、Ｇｒｅｘ容器内で細胞を増殖させた。３日目に、ウイルスのプレスピン法を用いて、レトロネクチンでコーティングされたプレート上で、ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ）またはレトロウイルス（ＲＶ）のいずれかで細胞を形質導入した。次いで、２～３日毎に培地供給を行いながら、１５日目まで細胞を培養した。
単離されたＴ細胞（凍結前にＣＤ２５枯渇を受けた）を解凍し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子Ｔｒａｎｓａｃｔ（１：１００体積希釈）を使用して活性化した。次いで、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いて、Ｇｒｅｘ容器内で細胞を増殖させた。３日目に、ウイルスのプレスピン法を用いて、レトロネクチンでコーティングされたプレート上で、ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ）またはレトロウイルス（ＲＶ）のいずれかで細胞を形質導入した。次いで、２～３日毎に培地供給を行いながら、１５日目まで細胞を培養した。
ＣＤ１９ ＣＡＲ修飾Ｐ－Ｔ細胞は、再刺激なしで、１５日間の培養後に２３７～３３６倍に増殖させることができる。
１５日間の培養後、ＣＤ１９ ＣＡＲ修飾Ｐ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲ ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と比較して明確なＴ細胞分化表現型を示した。Ｐ－Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ナイーブ／幹細胞メモリーＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－エフェクターＴ細胞の良好な混合物からなり、ＰＢＭＣ由来のＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－エフェクターメモリーＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－エフェクターＴ細胞から主になっていた。Ｐ－Ｔ ＮＴ（形質導入されていない）およびＰ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ細胞は、Ｐ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ細胞よりも多くのＴナイーブ／ｓｃｍ Ｔ細胞からなっていた。
さらに、ＰＢＭＣ由来エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ ｅｍ）およびエフェクターＴ細胞（Ｔ ｅｆｆ）は、有意により高いレベルの消耗マーカーＣＤ５７を発現したが、Ｐ－Ｔ細胞の発現は低かった。
Ｐ－Ｔ細胞内のエフェクターＴ細胞およびナイーブ／幹細胞メモリーＴ細胞のより高い頻度および混合は、低ＣＤ５７発現とともに、腫瘍細胞を効率的に標的化して死滅させることができる一方で、その分化度がより高いＴ細胞サブセットを経時的に自己更新し、かつ補充する能力を維持するＣＡＲ－Ｔ生成物を表す。
全体として、１５日目のＰ－Ｔ ＮＴおよびＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、およびＣＤ２８を発現し、低レベルの消耗マーカーＣＤ５７、および免疫チェックポイントマーカー（免疫応答の負の制御因子）ＰＤ－１、Ｌａｇ－３、およびＴｉｍ－３を発現した。
以下に列挙する様々なマウスおよびヒトｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲウイルスベクターで、３日目にＰ－Ｔ細胞を形質導入した：
－マウス（Ｍｓ）ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ）
－ＪＬ４．１９（ＥＦ１ａ－ＣＤ８－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＨＴＭ－ＢＢｚ）（ＳＢＩベクター、ＵＰＥＮＮ ＣＡＲ１９）
－Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ（ＶＢ）およびＳｉｇｎａＧｅｎによって生成された研究グレードのウイルス
－ヒト（Ｈｕ）ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ）
－ＪＬ ｈｕＣＡＲ１９（ＣＤ８－ｓｉｇｎａｌ－ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ－ＣＤ８ＨＴＭ－ＢＢｚ）（Ｈｕ ｓｃＦｖを除いてＵＰＥＮＮ ＣＡＲと同一）
－ＪＫ１ ｈｕＣＡＲ１９（ＣＤ８－ｓｉｇｎａｌ－ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ－ＣＤ８ＨＴＭ－２８ｚ）（「ＮＣＩ ＣＡＲ」、ＪＬよりも４ａａ長いＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、Ｈｕ ｓｃＦｖ）
－ＪＫ２ ｈｕＣＡＲ１９（ＣＤ８－シグナル－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＤ８ＨＴＭ－ＢＢｚ）（ＮＣＩ ＣＡＲと同じであるが、４１ＢＢ共刺激ドメインを有する、Ｈｕ ｓｃＦｖ）
－３つのヒト配列はすべて研究グレードであり、ＳｉｇｎａＧｅｎによって生成される
－マウス（Ｍｓ）ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲレトロウイルス（ＲＶ）
－Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって生成および提供される
表１：Ｐ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物の概要
－マウス（Ｍｓ）ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ）
－ＪＬ４．１９（ＥＦ１ａ－ＣＤ８－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＨＴＭ－ＢＢｚ）（ＳＢＩベクター、ＵＰＥＮＮ ＣＡＲ１９）
－Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ（ＶＢ）およびＳｉｇｎａＧｅｎによって生成された研究グレードのウイルス
－ヒト（Ｈｕ）ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ）
－ＪＬ ｈｕＣＡＲ１９（ＣＤ８－ｓｉｇｎａｌ－ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ－ＣＤ８ＨＴＭ－ＢＢｚ）（Ｈｕ ｓｃＦｖを除いてＵＰＥＮＮ ＣＡＲと同一）
－ＪＫ１ ｈｕＣＡＲ１９（ＣＤ８－ｓｉｇｎａｌ－ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ－ＣＤ８ＨＴＭ－２８ｚ）（「ＮＣＩ ＣＡＲ」、ＪＬよりも４ａａ長いＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、Ｈｕ ｓｃＦｖ）
－ＪＫ２ ｈｕＣＡＲ１９（ＣＤ８－シグナル－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＤ８ＨＴＭ－ＢＢｚ）（ＮＣＩ ＣＡＲと同じであるが、４１ＢＢ共刺激ドメインを有する、Ｈｕ ｓｃＦｖ）
－３つのヒト配列はすべて研究グレードであり、ＳｉｇｎａＧｅｎによって生成される
－マウス（Ｍｓ）ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲレトロウイルス（ＲＶ）
－Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって生成および提供される
ＣＤ１９ ＣＡＲの形質導入効率は、細胞をＣＤ１９ Ｆｃ－Ｆｉｔｃ試薬でインキュベートし、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞の割合を定量化することによって測定した。１５日目までに、Ｐ－Ｔ細胞は、すべてのＭｓ ｓｃＦｖ ＬＶまたはＲＶ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ、ＳｉｇｎａＧｅｎ、またはＳｏｒｒｅｎｔｏから）で形質導入されたときにＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、Ｈｕ ｓｃＦｖ ＪＫ２およびＪＬ配列（すべて４－１ＢＢ共刺激ドメインからなる）で形質導入されたときにＣＤ１９ ＣＡＲを発現した。Ｐ－Ｔ細胞は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含有するＨｕ ｓｃＦｖ ＪＫ１配列で形質導入されたときは、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現しなかった。各ＣＤ１９ ＣＡＲの最適なＭＯＩ／濃度は、Ｖｅｃｔｏｒ ＢｕｉｌｄｅｒのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶではＭＯＩ ５０、ＳｉｇｎａＧｅｎのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶではＭＯＩ １００、ＳｉｇｎａＧｅｎのＨｕ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶではＭＯＩ ２００、およびＳｏｒｒｅｎｔｏのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶでは２．５倍（計算された力価は不明）であると決定された。
１５日間の培養後、Ｐ－Ｔ細胞は、容易に増殖させることができる（研究規模）。Ｍｓ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶでＰ－Ｔ細胞を形質導入することにより、４８３倍の最高倍数増殖を達成し、Ｈｕ ＪＫ１ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶでＰ－Ｔ細胞を形質導入することにより、１３２倍の最低倍数増殖を達成した。
１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、形質導入に使用されるウイルスベクターに関係なく、高い生存率およびＣＤ３＋ＣＤ５６－Ｔ細胞の純度を示した。Ｖｅｃｔｏｒ ＢｕｉｌｄｅｒのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶで形質導入されたＰ－Ｔ細胞は、ＳｉｇｎａＧｅｎによって生成された同じＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ配列と比較して、有意に高いＣＤ４＋ Ｔ細胞をもたらした。ＳｏｒｒｅｎｔｏのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲで形質導入されたＰ－Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最も高い頻度、およびＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞とのバランスのとれた混合をもたらした。
各ＣＤ１９ ＣＡＲウイルスタイプについて最適化されたＭＯＩ／濃度を用いると、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現は、１５日目のＰ－Ｔ細胞において２２～７０％の範囲であった。Ｖｅｃｔｏｒ ＢｕｉｌｄｅｒのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶは、そのＣＤ１９ ＣＡＲ発現の大部分をＣＤ４＋Ｔ細胞上でもたらしたのに対し、ＳｏｒｒｅｎｔｏのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現の等しい混合、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞内のＣＤ１９ ＣＡＲ発現の最大の全体的頻度をもたらした。
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の拡張表現型分析は、ＲＶ対ＬＶで形質導入されたＰ－Ｔの間に明確な表現型の違いを示した。ＲＶでは、ＣＡＲ＋Ｔ ｓｃｍ／ナイーブ細胞の頻度が最も高く、分化度がより低い表現型が観察されたのに対し、ＬＶで形質導入されたＰ－Ｔ細胞では、ＣＡＲ＋Ｔ ｓｃｍ／ナイーブ細胞の頻度がより低く、分化度がより高い表現型が観察された（特に、Ｈｕ ＪＫ ２（ＬＶ）。すべてのＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｐ－Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ由来のＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７の発現頻度が高く、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、および消耗マーカーＣＤ５７の発現頻度が低かった。
実施例３：ＣＤ１９ ＣＡＲ ＣＡＲのインビトロおよびインビボ活性
がん細胞株に対する１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの機能活性を、Ｋｉｎｅｔｉｃ ＡＣＥＡ細胞毒性アッセイにおいて、ＣＤ１９＋バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ１９＋急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｌｍ６）細胞株と比較して評価し、Ｐ－Ｔ細胞の活性を、ＰＢＭＣのＭｓ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶと比較した（ｎ＝６）。ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を、非特異的な死滅を評価するための陰性対照として含めた。
がん細胞株に対する１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの機能活性を、Ｋｉｎｅｔｉｃ ＡＣＥＡ細胞毒性アッセイにおいて、ＣＤ１９＋バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ１９＋急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｌｍ６）細胞株と比較して評価し、Ｐ－Ｔ細胞の活性を、ＰＢＭＣのＭｓ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶと比較した（ｎ＝６）。ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を、非特異的な死滅を評価するための陰性対照として含めた。
がん細胞株との共培養における１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔのサイトカイン放出
さらに、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ機能活性を、サイトカイン放出アッセイにおいて、ＣＤ１９＋バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ１９＋急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｌｍ６）細胞株と比較して評価した。ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の非特異的な死滅を評価するための標的として含めた。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で２４時間、ＣＤ１９＋／－標的と共培養し、細胞培養上清を回収し、様々なサイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌について分析した。
さらに、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ機能活性を、サイトカイン放出アッセイにおいて、ＣＤ１９＋バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ１９＋急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｌｍ６）細胞株と比較して評価した。ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の非特異的な死滅を評価するための標的として含めた。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で２４時間、ＣＤ１９＋／－標的と共培養し、細胞培養上清を回収し、様々なサイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌について分析した。
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６標的と共培養したときに、炎症促進性サイトカインおよびエフェクタータンパク質（ＩＦＮ－ｇ、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ２、パーフォリン、およびＴＮＦ－α）を抗原特異的な様式で分泌し、最大の全体的分泌がＭｓ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶで観察された。すべての標的にわたってサイトカインＩＬ－６およびＩＬ－８の最小限の分泌が観察され、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞では、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞に対してすべてのサイトカインおよびタンパク質の最小限の分泌が観察された。ＣＤ１９＋ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６標的の両方に対して、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ Ｔ細胞は、それらのＰＢＭＣ由来の対応物と比較して、より高い濃度のグランザイムＢ、ＧＭ－ＣＳＦ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、および特にＩＬ２を分泌した。ＩＬ２の有意に高い分泌は、より高いＴ細胞増殖、増強されたＴ細胞機能、および生存を促進することができる、分化度がより低く、より幹細胞様の集団を示唆するものである。
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔのインビボ活性
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの抗腫瘍活性を、ＮＳＧマウスにおける播種性リンパ腫異種移植片モデルを使用して評価した。Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０６）を発現するルシフェラーゼを０日目に静脈内（ＩＶ）注射し、続いてＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞をＩＶ注射した。Ｐ－Ｔ細胞を、表１に概説したＣＤ８＋ＣＤ１９ ＣＡＲ＋の頻度に従って投与した（Ｐ－Ｔ：ＲＶ：７日目に１用量の１４×１０６、ＬＶ：７日目に１用量の２０×１０６、または７日目、１０日目および１４日目に３用量の２０×１０６）。生物発光イメージング（ＢＬＩ）および生存率を、主要研究エンドポイントとして用いた。
表２：播種性ＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉ－ＬｕｃマウスモデルにおけるＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔの投与
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの抗腫瘍活性を、ＮＳＧマウスにおける播種性リンパ腫異種移植片モデルを使用して評価した。Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０６）を発現するルシフェラーゼを０日目に静脈内（ＩＶ）注射し、続いてＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞をＩＶ注射した。Ｐ－Ｔ細胞を、表１に概説したＣＤ８＋ＣＤ１９ ＣＡＲ＋の頻度に従って投与した（Ｐ－Ｔ：ＲＶ：７日目に１用量の１４×１０６、ＬＶ：７日目に１用量の２０×１０６、または７日目、１０日目および１４日目に３用量の２０×１０６）。生物発光イメージング（ＢＬＩ）および生存率を、主要研究エンドポイントとして用いた。
Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、非ＴＲＡＣ修飾Ｔ細胞の２０×１０６の３回投与でも、このマウスモデルにおいて十分に耐容性があり、安全であった。すべてのＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍負荷を有意に低下させ、生存率を改善した。処置の４週間後、ビヒクル群は１００％の死亡率を示したが、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ処置群（Ｎ＝５）のすべての動物は、体重減少を含む臨床症状もなく、依然として生存していた。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ処置群は、ＰＢＭＣ ＣＤ１９ ＣＡＲ（７ＭＭ）処置群と同様に、腫瘍負荷を管理した。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ細胞を用いた複数回投与（３回）は、単回投与と比べて改善を示し、７ＭＭのＰＢＭＣ ＣＤ１９－ＣＡＲ ＲＶ処置群よりもわずかに良好な腫瘍管理および生存率を示した（どちらも合計２．１ＭＭのＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞で投与）。特に、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ細胞（０．６ＭＭのＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）の単回用量は、２ＭＭのＰＢＭＣ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ処置群（また、０．６ＭＭのＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）よりも良好に腫瘍負荷を低下させ、生存率を改善した。意外にも、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ処置マウスは、すべての処置群より優れており、１２０日目まで１００％の生存率で腫瘍細胞を根絶させた。分化度の低いＴ細胞表現型は、ナイーブ／ｓｃｍおよびエフェクターＴ細胞の両方、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の良好な混合物、より高いＣＤ８＋ＣＤ１９ ＣＡＲ＋発現、ならびにより高いサイトカイン分泌（特に、Ｔ細胞機能／生存を支持するＩＬ２）（すべて本明細書に記載される）の存在とともに、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞、特にＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ Ｔ細胞の場合にインビボで観察されるよりも高い有効性および増強された生存に集合的に寄与すると考えられる。
次いで、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ処置群からの生存マウスを、追加のＤａｕｄｉ腫瘍細胞で再チャレンジした。１２２日目に、Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０６）を発現するルシフェラーゼを、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶで処置した生存マウス、および年齢適合（６ヶ月齢）ナイーブＮＳＧマウスに静脈内（ＩＶ）注射して、新しいビヒクル対照群として機能させた。
Ｐ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ細胞は、Ｄａｕｄｉ再チャレンジ後（１２２日目）に腫瘍を管理して、生存期間を２１５日まで延長したことに加えて、腫瘍を排除するための唯一の処置であり、１２０日まで１００％の生存率をもたらした。
さらに、再チャレンジ後の４匹の生存マウスの試験終了時フロー分析は、ヒトＰ－Ｔ ＣＤ４５＋ＣＤ５６－ＣＤ３＋ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞が、インビボで存続することができ、また、試験終了時フロー分析（１８５～２１５日目；ｎ＝４）で、再チャレンジしたマウスの血液、脾臓、および骨髄で検出され得、脾臓で検出される細胞の頻度および数が最も多いことを実証した。
実施例４：ＵＣＢ－Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＲＡＣ）ノックアウト
ＴＲＡＣ遺伝子座の第１のエクソンに対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いてＴＲＡＣを標的化した。Ｐ－Ｔ培養の６～８日目に、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの化学修飾したＲＮＡ形態を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）によりＰ－Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＴＣＲα／βまたはＣＤ３に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって、遺伝子組換え効率をモニタリングした。
ＴＲＡＣ遺伝子座の第１のエクソンに対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いてＴＲＡＣを標的化した。Ｐ－Ｔ培養の６～８日目に、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの化学修飾したＲＮＡ形態を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）によりＰ－Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＴＣＲα／βまたはＣＤ３に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって、遺伝子組換え効率をモニタリングした。
３つの別々の実験において、トランスフェクションの３日後に、ＴＲＡＣノックアウト効率を測定した。Ｘ軸の日付は、トランスフェクションの時間を示す。Ｐ－Ｔ活性化の方法および培養条件（ＤｙｎａｂｅａｄｓとＩＬ２、またはＴｒａｎｓａｃｔとＩＬ７およびＩＬ１５）に関係なく、９０％を超えるＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトを達成した。Ｂ．細胞の増殖および生存率には、ＣＲＩＳＰＲプロセスによって最小限の影響が及ぼされた。異なる群間での細胞増殖および生存率に有意な変化は認められない。
加えて、Ｐ－Ｔ細胞を３日目にＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶまたはＲＶで形質導入し、続いて、６日目にＣＲＩＳＰＲを使用してトランスフェクションおよびＴＲＡＣ ＫＯを行った場合、１５日目のＰ－Ｔ ＮＴ－ＴＲＡＣ ＫＯおよびＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ ＫＯ細胞は、＞９７％のＴＲＡＣ ＫＯ効率を示した。
さらに、ＴＲＡＣ ＫＯは、Ｐ－Ｔ細胞におけるＣＤ１９＋ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６標的と比較して、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現またはインビトロ細胞溶解活性に有意な変化をもたらさなかった。
実施例５：ＴＲＡＣノックアウトによる機能損失の検証
ＴＲＡＣノックアウトによる機能喪失の検証は、Ｐ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＴ（非トランスフェクト）およびＰ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ ＫＯ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子で再刺激し、細胞を４日間培養することによって完了した。
ＴＲＡＣノックアウトによる機能喪失の検証は、Ｐ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＴ（非トランスフェクト）およびＰ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ ＫＯ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子で再刺激し、細胞を４日間培養することによって完了した。
３つのＰ－Ｔドナーにおいて、再刺激および４日間の細胞培養後に、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＴ細胞で３．２～５．１倍の増殖が観察されたのに対し、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ ＫＯ細胞の再刺激後には最小の倍数増殖が検出され、機能的ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の喪失が確認された。
実施例６：インビトロアッセイで測定されたＵＢＣ－Ｔ細胞の同種反応性
２つの独立したアッセイを使用して、Ｐ－Ｔ細胞に対するＰＭＢＣの、またはＰＢＭＣに対するＰ－Ｔ細胞の同種反応性を測定した。最初のアッセイでは、４時間の共培養において、一方のドナーから別のドナーへの細胞の死滅活性として同種反応性が測定された。標的細胞をＰＫＨ２６で標識し、細胞毒性を全標的細胞に対する死滅した標的細胞の割合として表した。
２つの独立したアッセイを使用して、Ｐ－Ｔ細胞に対するＰＭＢＣの、またはＰＢＭＣに対するＰ－Ｔ細胞の同種反応性を測定した。最初のアッセイでは、４時間の共培養において、一方のドナーから別のドナーへの細胞の死滅活性として同種反応性が測定された。標的細胞をＰＫＨ２６で標識し、細胞毒性を全標的細胞に対する死滅した標的細胞の割合として表した。
２つの別々の実験において、ＰＢＭＣまたはＰＢＭＣ由来Ｔ細胞をＰ－Ｔ細胞と共培養した。一方のドナーからのＰＢＭＣは、別のドナーからのＰＢＭＣを高効率で死滅させた。しかしながら、ＰＢＭＣは、Ｐ－Ｔ細胞（ＣＢＴ）を死滅させなかった。別の実験では、ＰＭＢＣ由来Ｔ細胞（ＰＢＴ）は、がん細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＲＰＭＩ）を高効率で死滅させた。しかしながら、それらはＰ－Ｔ細胞（ＣＢＴ）を死滅させる際には最小限の活性を示した。Ｐ－Ｔ細胞もＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を死滅させなかった。
第２のアッセイでは、同種反応性は、別のドナーと共培養したときの、一方のドナーのＴ細胞の優先的増殖として測定された。２つのドナーからの細胞を、異なる色素（ＣＦＳＥおよびＰＫＨ２６）で標識し、４日間、１：１の比で共培養する。色素の希釈は、細胞増殖を示唆するものであり、高強度を示す細胞の割合の減少、または平均蛍光強度の変化として表すことができる。
Ｐ－Ｔ細胞および対照ＰＢＭＣをＰＫＨ２６で標識し、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識する。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ、ＰＨＫ２６標識Ｐ－Ｔ（ＣＢＴ）、およびＣＦＳＥまたはＰＫＨ２６のいずれかで標識したＰＢＭＣの混合培養物が対照として機能した。Ｐ－Ｔのみの培養物と比較して、ＰＫＨ２６－ｈｉ Ｐ－Ｔ（ＣＢＴ）細胞の割合が低く、ＰＢＭＣとの共培養におけるＰ－Ｔ細胞の優先的増殖が示唆される。
この結果と一致して、Ｐ－Ｔ細胞のＭＦＩも、ＰＢＭＣとの共培養において、Ｐ－Ｔ細胞のみ、およびＰＢＭＣ対照を含むＰＢＭＣと比較して低下し、より良好な増殖が示された。対照的に、共培養におけるＰＢＭＣのＭＦＩは、ＰＢＭＣのみまたはＰＢＭＣ培養物を含むＰＢＭＣと比較して増加した。
実施例７：インビトロアッセイで測定されたＰ－Ｔ対ＨＬＡミスマッチＰＢＭＣの同種反応性
Ｐ－Ｔ細胞の同種反応性をさらに評価するために、ＨＬＡミスマッチのＰＫＨ２６標識Ｐ－Ｔを、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、ＣＦＳＥおよびマイトマイシン－Ｃ（ＭＭＣ）で処置したＰＢＭＣと１：１の比で４日間共培養して、Ｐ－Ｔ細胞対ＰＢＭＣの任意の同種反応性（ＧｖＨＤの可能性）を評価した。アッセイ読み出しには、Ｐ－Ｔ細胞の倍数増殖、Ｐ－Ｔ細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５の上方制御、ならびにＨＬＡミスマッチＰＢＭＣに応答したＰ－Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌が含まれた。
表３：Ｐ－ＴとＰＢＭＣドナーとの間のＨＬＡミスマッチの概要
Ｐ－Ｔ細胞の同種反応性をさらに評価するために、ＨＬＡミスマッチのＰＫＨ２６標識Ｐ－Ｔを、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、ＣＦＳＥおよびマイトマイシン－Ｃ（ＭＭＣ）で処置したＰＢＭＣと１：１の比で４日間共培養して、Ｐ－Ｔ細胞対ＰＢＭＣの任意の同種反応性（ＧｖＨＤの可能性）を評価した。アッセイ読み出しには、Ｐ－Ｔ細胞の倍数増殖、Ｐ－Ｔ細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５の上方制御、ならびにＨＬＡミスマッチＰＢＭＣに応答したＰ－Ｔ細胞による炎症促進性サイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌が含まれた。
ＴＣＲ α／βノックアウト効率は、同種反応性評価に含めたＰ－Ｔ細胞において非常に高く、約２％以下のＴＣＲ α／βが残っている状態であった。Ｐ－Ｔ Ｄ番号１７６９５ ＮＴ－ＫＯを有するＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズを使用したＴＣＲ α／β枯渇は、残りのＴＣＲ α／β発現をさらに低下させ、改善した。
Ｐ－Ｔ ＮＴ－ＮＴ細胞の３つのドナー（ＴＣＲ α／β修飾なし）は、４つの異なるＨＬＡミスマッチＰＢＭＣと４日間共培養したときに最小限の増殖を示した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子によるＮＴ－ＮＴ細胞の再刺激は、陽性対照として機能し、Ｐ－Ｔ ＮＴ－ＮＴ同種反応性の欠如が、損なわれた／機能しないＴ細胞に起因しないことが実証された。Ｐ－Ｔ細胞で観察された最小限の増殖は、Ｐ－Ｔ細胞がＴＣＲ α／β ＫＯおよびＴＣＲ α／β枯渇（Ｐ－Ｔ Ｄ番号１７６９５で示される）を受けたときにさらに低下した。
Ｐ－Ｔ ＮＴ－ＮＴ細胞の３つのドナー（ＴＣＲ α／β修飾なし）は、４つの異なるＨＬＡミスマッチＰＢＭＣと４日間共培養したときに、ＴＮＦ－αおよびパーフォリンの最小限／低い分泌を伴って、ある程度のＩＦＮ－ｇおよびグランザイムＢの分泌を示した。Ｐ－Ｔ細胞で観察されたすべてのサイトカイン／エフェクタータンパク質の分泌は、Ｐ－Ｔ細胞がＴＣＲ α／β ＫＯおよびＴＣＲ α／β枯渇を受け、次いでＨＬＡミスマッチＰＢＭＣと共培養したときに有意に低下した。
実施例８：インビトロアッセイで測定されたＰＢＭＣ対ＨＬＡミスマッチＰ－Ｔ細胞の同種反応性
同様に、ＨＬＡミスマッチＰ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞に対するＰＢＭＣの同種反応性も評価した。この設定では、一方向ＭＬＲにおいて、ＰＢＭＣをＰＫＨ２６で標識し、ＣＦＳＥおよびマイトマイシン－Ｃ（ＭＭＣ）で処置したＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と１：１の比で４日間共培養して、ＰＢＭＣ細胞対Ｐ－Ｔの同種反応性（宿主対移植片）を評価した。アッセイ読み出しには、ＰＢＭＣの倍数増殖、ＰＢＭＣ細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５の上方制御、ならびにＨＬＡミスマッチＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞に応答したＰＢＭＣ細胞による炎症促進性サイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌が含まれた。
同様に、ＨＬＡミスマッチＰ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞に対するＰＢＭＣの同種反応性も評価した。この設定では、一方向ＭＬＲにおいて、ＰＢＭＣをＰＫＨ２６で標識し、ＣＦＳＥおよびマイトマイシン－Ｃ（ＭＭＣ）で処置したＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と１：１の比で４日間共培養して、ＰＢＭＣ細胞対Ｐ－Ｔの同種反応性（宿主対移植片）を評価した。アッセイ読み出しには、ＰＢＭＣの倍数増殖、ＰＢＭＣ細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５の上方制御、ならびにＨＬＡミスマッチＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞に応答したＰＢＭＣ細胞による炎症促進性サイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌が含まれた。
ＰＢＭＣの３つすべてのドナーは、ＨＬＡミスマッチＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と４日間共培養したときに、増殖の欠如を示した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子によるＰＢＭＣ細胞の再刺激は、陽性対照として機能し、ＰＢＭＣ同種反応性の欠如が、損なわれた／機能しないＴ細胞に起因しないことが実証された。
増殖の欠如と一致して、３つすべてのＰＢＭＣドナーもまた、４日間、ＨＬＡミスマッチＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養したときに、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５の上方制御の欠如を示した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子によるＰＢＭＣの再刺激は、陽性対照として機能し、ＣＤ２５発現を有意に増加させ、ＰＢＭＣの同種反応性の欠如が、損なわれた／機能しないＴ細胞に起因しないことが実証された。
３つすべてのＰＢＭＣは、４日間、ＨＬＡミスマッチＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養したときに、炎症性サイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌において、ほとんどまたは全く増加を示さなかった。観察された唯一の例外は、ＰＢＭＣ番号１をＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養したときのＴＮＦ－α分泌の増加であった。
総合すると、これらの結果から、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＨＬＡミスマッチＰＢＭＣとともに培養したときにアロ応答を誘発せず、患者の免疫細胞によるクリアランスを打ち消す免疫特権の特徴を示し得ることが示唆され、インビボでのそれらの改善された存続性の可能性を支持する。
実施例９：動物モデルにおけるＰ－Ｔ細胞の同種反応性
ＧｖＨＤのＮＣＧマウスモデルにおいて、非修飾の２１日間増殖させたＰ－Ｔ細胞の同種反応性（異種－同種反応性）を試験した。このモデルでは、ＰＢＭＣは、体重減少として測定され得るＧｖＨＤを引き起こす。３つのドナーからのＣＤ２５枯渇Ｐ－Ｔ細胞３０００万個および対照ＰＭＢＣを、ＩＶ経路を介してＮＣＧマウスに注射した。動物の体重を経時的にモニタリングした。
ＧｖＨＤのＮＣＧマウスモデルにおいて、非修飾の２１日間増殖させたＰ－Ｔ細胞の同種反応性（異種－同種反応性）を試験した。このモデルでは、ＰＢＭＣは、体重減少として測定され得るＧｖＨＤを引き起こす。３つのドナーからのＣＤ２５枯渇Ｐ－Ｔ細胞３０００万個および対照ＰＭＢＣを、ＩＶ経路を介してＮＣＧマウスに注射した。動物の体重を経時的にモニタリングした。
動物の体重変化は、細胞注射の日における体重の割合として表した。各線は１匹のマウスを表す。２８日間にわたってＰＢＭＣ群の５匹の動物すべての体重が減少し、屠殺しなければならなかった。Ｐ－Ｔ群ではいずれも著しい体重減少を認めず、異種ＧｖＨＤを誘発しなかった。Ｐ－Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇを除去するために増殖前にＣＤ２５を枯渇させたため、ＧｖＨＤの欠如はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋免疫調節Ｔ細胞に起因するものではない。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴおよびＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ ＫＯ Ｔ細胞の同種反応性を評価するために、さらなるＧｖＨＤ研究が進行中である。
実施例１０：ヒト化ＣＤ３４＋（Ｈｕ－ＣＤ３４）ＮＳＧマウスにおけるＣｙＣＡＲＴ－１９およびＣｙＣＡＲＴ－１９ＴＲＡＣノックアウト（ＫＯ）の安全性評価
この試験の目的は、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（Ｈｕ－ＣＤ３４ ＮＳＧ）を生着した非肥満糖尿病（ＮＯＤ）スキッドＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおける同種ＧｖＨＤ、神経毒性およびサイトカイン放出症候群を含む、ＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯに関連する潜在的な毒性を評価することであった。
この試験の目的は、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（Ｈｕ－ＣＤ３４ ＮＳＧ）を生着した非肥満糖尿病（ＮＯＤ）スキッドＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおける同種ＧｖＨＤ、神経毒性およびサイトカイン放出症候群を含む、ＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯに関連する潜在的な毒性を評価することであった。
７ヶ月齢（ＣＤ３４＋臍帯血球生着後２４週間）の雌Ｈｕ－ＣＤ３４ ＮＳＧマウスを本試験に使用した。ＣＤ３４ドナーのＨＬＡクラスＩ群は、ＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯ細胞に対する６つのミスマッチのうち５つを有していた。末梢血のフローサイトメトリー分析を－３日目に実施して、ヒトＣＤ４５＋細胞の生着を検証した。生着したヒトＣＤ４５＋細胞の割合に基づいて、１６匹のマウスを以下の４つの群に無作為化した：処置なし（ｎ＝２）、ＰＢＭＣ－ＣＡＲＴ－１９（ｎ＝３）、ＣｙＣＡＲＴ－１９（ｎ＝５）、ＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯ（ｎ＝６）。０日目に、ＣＡＲＴ細胞を１０×１０６細胞／マウス（約４００×１０６細胞／ｋｇ）の用量で静脈内（ＩＶ）投与した。
１０×１０６細胞／マウスの用量でＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯで処置したマウスは、早ければ２日目に体重減少を経験し、１４日目に体重が回復した。血漿中のサイトカイン産生の増加は、７日目に検出されたが、２１日目および３５日目には検出されなかった。ＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯ処置は、７日目にＣＤ３４ドナー由来Ｂ細胞を有意に低下させ、２１日目および３５日目にＢ細胞の回復が観察された。
組織病理学的解析は、ＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯ処置動物においてＧｖＨＤ関連の変化が観察されなかったことを実証した。さらに、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、皮膚、小腸および大腸を含む検査されたいずれの臓器および組織においても、ＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯ処置に関連する変化は観察されなかった。
ＣｙＣＡＲＴ－１９およびＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯ細胞は、７日目に末梢血から検出されたが、２１日目および３５日目には検出されなかった。
総合すると、本試験は、１０×１０６細胞／マウスの用量のＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯが、ＨＬＡミスマッチＨｕ－ＣＤ３４ ＮＳＧマウスにおいて同種ＧｖＨＤおよび神経毒性を引き起こさなかったことを実証した。体重減少、サイトカイン産生の増加、およびＢ細胞死の結果は、ＣｙＣＡＲＴ－１９またはＣｙＣＡＲＴ－１９ ＴＲＡＣ ＫＯ処置が、１０×１０６細胞／マウスの用量でサイトカイン放出症候群を誘導したことを示唆した。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲に属することが意図される。
本明細書で引用されるすべての参考文献は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれるのと同程度まで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日よりも前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。
Claims (50)
- キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞集団であって、前記Ｔ細胞が、胎盤Ｔ細胞であり、前記ＣＡＲが、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって前記細胞に導入されている、Ｔ細胞集団。
- 前記胎盤Ｔ細胞が、臍帯血Ｔ細胞、胎盤灌流液Ｔ細胞、またはそれらの混合物である、請求項１に記載のＴ細胞集団。
- 前記胎盤Ｔ細胞が、臍帯血Ｔ細胞である、請求項１に記載のＴ細胞集団。
- 前記胎盤Ｔ細胞が、臍帯血Ｔ細胞と胎盤灌流液Ｔ細胞との混合物である、請求項１に記載のＴ細胞集団。
- ＣＡＲ＋Ｔ細胞の優勢な亜集団が、Ｔ ｓｃｍ／ナイーブ表現型を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記ＣＡＲ＋Ｔ ｓｃｍ／ナイーブ細胞の亜集団が、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３０％超、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４０％超、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４５％超、または前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約５０％超を占める、請求項５に記載のＴ細胞集団。
- エフェクターメモリー表現型（Ｔ ｅｆｆ）を有する前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団が、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約７５％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約７０％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約６０％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約５０％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４０％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３５％未満、または前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３０％未満を占める、請求項１～６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- セントラルメモリー表現型（Ｔｃｍ）を有する前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団が、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約１０％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約８％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約６％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約５％未満、前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約４％未満、または前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞集団の約３％未満を占める、請求項１～７のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。ｓ
- ＣＤ８＋である前記ＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量が、ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の相対存在量の５０％超であり、前記ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の前記相対存在量の６０％超であり、前記ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の前記相対存在量の７０％超であり、前記ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の前記相対存在量の８０％超であり、前記ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の前記相対存在量の９０％超であり、前記ＣＤ４＋であるＣＡＲ＋Ｔ細胞の亜集団の前記相対存在量の１００％超である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも増加した抗腫瘍活性を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、宿主に対する免疫原性を低下させるための遺伝子改変を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記遺伝子改変が、遺伝子ノックアウトである、請求項１１に記載のＴ細胞集団。
- 前記遺伝子ノックアウトが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ノックアウトである、請求項１２に記載のＴ細胞集団。
- 前記遺伝子ノックアウトが、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）ノックアウトである、請求項１３に記載のＴ細胞集団。
- 前記遺伝子改変が、トランスフェクション、レトロウイルス形質導入、またはレンチウイルス形質導入によってもたらされる、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- さらなる遺伝子改変が、ＣＲＩＳＰＲ技術の使用によってもたらされる、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記ＴＲＡＣノックアウトが、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、前記ＴＲＡＣノックアウトなしのＴ細胞集団と比較して末梢血単核球に対する同種反応性が低下している、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記同種反応性の低下が、前記Ｔ細胞集団上のＣＤ２５の発現の低下または上方制御の低下を含む、請求項１６に記載のＴ細胞集団。
- 前記同種反応性の低下が、炎症促進性またはエフェクタータンパク質の発現の低下または上方制御の低下を含む、請求項１６に記載のＴ細胞集団。
- 前記炎症促進性またはエフェクタータンパク質が、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－α、パーフォリン、グランザイムＢ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載のＴ細胞集団。
- 前記同種反応性の低下が、前記末梢血単核球の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の低下を含む、請求項１６に記載のＴ細胞集団。
- 前記ＴＲＡＣノックアウトが、インビボＧＶＨＤモデルにおいて同種反応性を欠いているか、またはそれが低下している、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の割合が高い、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ２７を発現する細胞の割合が高い、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＣＲ７を発現する細胞の割合が高い、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ１２７を発現する細胞の割合が高い、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ５７を発現する細胞の割合が低い、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ６２Ｌを発現する細胞の割合が高い、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＣＤ２５を発現する細胞の割合が低い、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＬａｇ－３＋を発現する細胞の割合が高い、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりもＴｉｍ－３を発現する細胞の割合が低い、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多いがん細胞株のインビトロでの死滅を示す、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のパーフォリンを発現する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のＧＭ－ＣＳＦを発現する、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のＴＮＦ－αを発現する、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のＩＬ－２を発現する、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビトロチャレンジで、がん細胞株に対して末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも多くの量のグランザイムＢを発現する、請求項１～３６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビボがんモデルにおいて、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも高い生存率をもたらす、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビボがんモデルにおいて、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも少ない体重減少をもたらす、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記Ｔ細胞集団が、インビボがんモデルにおいて、末梢血単核球Ｔ細胞集団よりも少ない移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらす、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記末梢血単核球Ｔ細胞集団が、前記ＣＡＲも発現する、請求項２３～４０のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
- 前記ＣＡＲが、トランスフェクションによって前記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている、請求項４１に記載のＴ細胞集団。
- 前記ＣＡＲが、ウイルス形質導入によって前記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている、請求項４１に記載のＴ細胞集団。
- 前記ＣＡＲが、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって前記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている、請求項４３に記載のＴ細胞集団。
- 前記ＣＡＲが、レンチウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって前記末梢血単核球Ｔ細胞集団に導入されている、請求項４３に記載のＴ細胞集団。
- がんまたはその症状の治療を必要とする患者においてがんまたはその症状を治療する方法であって、前記患者の前記がんまたはその症状を緩和するのに有効な量の請求項１～３８のいずれか一項に記載のＴ細胞集団を前記患者に投与するステップを含む、方法。
- 前記がんが、血液がんである、請求項４６に記載の方法。
- 前記血液がんが、Ｂ細胞がんである、請求項４７に記載の方法。
- 前記がんが、ＣＤ１９＋がんである、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｔ細胞集団が、前記患者と同種である、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
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