KR20220110199A - 태반-유래 동종이계 car-t 세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포의 모집단을 개시하며, 여기서 상기 T 세포는 제대혈, 태반 관류액, 또는 이의 혼합물로부터 유래된 태반 T 세포이다. 이러한 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포로부터 유래된 것과 같은 대안적인 세포의 모집단에 비해 다수의 양태에서 개선되는 것으로 나타난다. 그것은 또한 이를 필요로 하는 환자에서 암 예컨대 혈액암, 예를 들어 B 세포 암, 또는 이의 증상을 치료하는 방법을 개시한다. 이들 방법은 환자에서 암 또는 이의 증상을 완화하는데 효과적인 발명 중 어느 하나의 T 세포의 모집단의 양을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
Description
본 출원은 2019년 12월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/943,760, 2019년 12월 5일에 출원된 62/944,349 및 2020년 6월 5일에 출원된 63/035,432에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
분야
본 발명은 부분적으로 키메라 항원 수용체(CAR) 세포 및 CAR 요법에 관한 것이다.
배경
CAR 요법은 암에 대한 결정적으로 중요한 도구로 부상하고 있다. 그러나, 이들 요법은 전형적으로 이펙터 세포 모집단으로서 환자 자신의 세포, 예를 들어 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 유래된 T 세포의 사용에 의존한다. 각 환자의 세포를 수확하고, 시험하고, 그리고 CAR 치료제로 전환해야 하기 때문에, CAR 요법은 1) 매우 비싸고; 그리고 2) 치료를 수행하고자 하는 및/또는 수행할 수 있는 특정 센터에서만 이용가능하다. 이들 단점으로 인해 CAR 요법이 필요한 많은 인구가 CAR 요법을 거의 이용할 수 없다. 본 발명은 부분적으로 이들 문제 및 기타 문제를 완화하기 위한 동종이계, 기성품 CAR 요법을 생성하는 것에 대한 것이다.
자가 CAR-T 요법은 혈액암 환자에 대한 표준 치유의 일부가 되었다. CAR-T 요법의 세포의 공급원은 환자의 PMBC에서 나온다. 동종이계 CAR-T 세포 요법의 개발은 PBMC를 공급원 물질로 또한 사용하는 임상 시험에 들어갔다. UCB-T 세포는 이를 동종이계 세포 요법의 공급원 물질로 되기에 더 적합하게 하는 상이한 생물학적 특성을 갖는다. 그들은 우세한 Tcm 및 Tnaive 표현형을 가지고, 증가된 증식 활성을 나타내고, PBMC에서 확장된 T 세포와 비교하여 더 긴 텔로미어/더 높은 텔로머라제 활성을 유지한다(Okas, et. al. Journal of Immunotherapy, 2010; Frumento, et. al. Journal of Transplantation, 2013). 그들은 HLA 불일치 및 손상된 동종이계 활성화에 대한 면역 내성이 더 뛰어나다(Barker, et. al. Blood, 2001; Chen, et al. Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2006). 그들은 치료 목적으로 임상 규모로 확장될 수 있다.
T 세포 및 NK 세포는 동종반응성의 핵심 세포 매개체이다. T 세포 수용체는 동종반응성에 관여하는 핵심 수용체이다. T-세포 수용체 유전자 비활성화는 감소된 동종반응성을 초래하였다. 숙주 NK 세포는 HLA-불일치된 공여자 세포를 사멸시키거나 HLA 분자를 발현하지 않는다. NK 세포 사멸을 회피하는 하나의 메커니즘은 NK 세포 기능을 억제하는 HLA-E 분자의 발현을 통한 것이다.
본 발명자들은 혈액암 및 고형암의 치료를 위한 동종이계 플랫폼에서 사용하기 위한 산후 인간 태반-유래 T 세포의 사용을 위한 독특한 플랫폼을 개발했다. 현재 연구에서 본 발명자들은 B 세포 악성종양의 치료를 위한 CD19 CAR-T 및 CD20 CAR-T 세포 요법 태반 T 세포 둘 모두로 개념 증명을 입증했다. 태반-유래 T 세포(P-T 세포)가 더 큰 면역 관용과 손상된 동종-반응을 입증함에도 불구하고, 본 발명자들은 P-T 세포에 대한 내인성 T 세포 수용체의 발현으로부터 유래하는 임의의 잠재적 GvHD를 우회하기 위한 추가의 위험-완화 전략으로서 단계인, T-세포 수용체 불변(TRAC) 녹아웃(KO), 예를 들어 CRISPR-매개된 T-세포 수용체 불변(TRAC) 녹아웃(KO)을 구상하고 입증했다. 필요한 경우, 이들 세포는 B2M을 발현하지 않고 키메라 HLA-E 분자를 발현하도록 유전적으로 추가로 변형되어 T/NK 세포에 의한 그 동종반응성/제거를 감소시킬 수 있다.
본 발명은 CAR 요법을 위한 세포의 공급원으로서 태반-유래 세포의 용도에 대한 것이다. 이들 세포는 태반, 태반 관류액 및 제대혈로부터 단리된 세포, 및 이들의 조합을 포함한다. 본 실시예에서, 제대혈 및/또는 태반 관류액으로부터의 세포가 사용되었고 이들 태반-유래 세포는 PBMC로부터의 것과 같은 다른 세포 공급원으로부터의 T 세포보다 유리한 것으로 나타났다.
본 명세서에서, 출원인은 태반-유래 세포가 PBMC의 것보다 더 적은 이펙터/메모리 세포를 갖는 보다 나이브 표현형을 가짐을 발견했으며, 이는 이 모집단의 한 가지 이점을 나타낸다. 부가하여, 출원인은 태반-유래 T 세포의 최대 3600-배 확장을 입증했다. 이들 발견에 기초하여, 본 발명의 일 양태는 태반-유래 T 세포, 예를 들어, CAR 요법을 위한 세포 유형으로서 제대혈-유래 T 세포 또는 생체외 확장된 제대혈-유래 T 세포의 사용이다.
출원인은 또한 그렇게 하는 방법을 개발했으며 이러한 세포가 예시적인 CAR로 높은 효율성에서 형질도입될 수 있고 표적을 결하는 세포를 사멸하지 않으면서 표적을 발현하는 세포를 쉽게 사멸시킬 수 있음을 보여주었다. 이 사멸 또는 그의 결여는 표적-발현하지만 표적-결여하지 않는 종양 세포에 대한 반응으로 유도된 이펙터 사이토카인 발현의 발현과 상관관계가 있었다.
출원인은 또한 태반-유래 T 세포가 PBMC보다 동종반응성이 현저히 낮다는 것을 입증했다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 CAR 요법에 사용하기 위한 태반-유래 세포, 예를 들어 제대혈-유래 세포 또는 확장된 제대혈-유래 세포의 용도를 교시한다.
출원인에 의해 발견된 추가 이점은 태반-유래 T 세포의 나이브 표현형이 그렇지 않으면 CAR 요법의 효과를 감소시킬 수 있는 Treg 세포의 고갈을 허용한다는 점이다. 이러한 고갈은 활성화된 T 세포에서 CD25의 발현으로 인해 PBMC에 대해 가능하지/실용적이지 않다.
동종이계 CAR 요법을 생성하기 위한 추가 노력에서, 출원인은 TCR의 일부, 여기서는 TRAC를 녹아웃시켰다. 출원인은 CRISPR를 사용하여 높은 효율성으로 태반-유래 T 세포의 유전자 변형을 수행하는 방법을 개발했다. 이러한 유전자 변형의 사용은 태반-유래 T 세포의 동종이계 이점을 더욱 증진시킬 것으로 기대된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 TCR 유전자, 예를 들어, TRAC를 녹아웃시키는 것과 같은 동종반응성을 감소시키기 위한 T 세포의 유전적 변형을 교시한다.
특정 CAR이 본 출원에서 사용되었지만, 1) 태반 유래된 T 세포의 사용; 2) T세포 유전자, 예를 들어 TRAC와 같은 TCR 유전자의 녹아웃; 및 3) 이들의 조합의 이점은 임의의 CAR에 적용 가능하고 CAR 요법을 유의하게 개선하고 감소된 GVHD로 동종이계 치료를 제공할 것으로 예상된다.
도 1은 T/NK 구동 동종반응성을 회피하기 위한 전략을 도시한다.
도 2는 태반-유래 동종이계 CAR-T 세포를 생성하는 과정의 개요를 도시한다.
도 3a-3c는 태반-유래 단리된 T 세포의 표현형을 도시한다.
도 4는 20일에서 태반-유래 T 세포의 시험관내 확장을 도시한다.
도 5a-5b는 13일차 후 재자극에 이어서 20일에 시험관내 확장된 태반-유래 T 세포의 표현형을 도시한다.
도 6은 15일차에 CD19 CAR 변형된 태반-유래 T 세포의 시험관내 확장을 도시한다.
도 7a-7b는 15일차 CD19 CAR 변형된 P-T 세포의 T 세포 분화 상태를 도시한다.
도 8은 T 이펙터 메모리(T em) 및 T 이펙터(T eff) 세포에서 CD57 발현을 도시한다.
도 9a-9e는 15일차 CD19 CAR 변형된 P-T 세포의 표현형 분석을 도시한다.
도 10a-10b는 P-T 세포에서 적정된 CD19 CAR 바이러스 벡터의 15일차 CD19 CAR 발현을 도시한다.
도 11은 상이한 태반 공여자로부터의 다중 P-T 제제에서 재생된 15일차 P-T 배수 확장을 도시한다.
도 12a-12b는 상이한 태반 공여자로부터의 다중 P-T 제제에서 재생된 15일차 CD19 CAR 발현을 도시한다.
도 13a-13b는 상이한 태반 공여자로부터의 다중 P-T 제제에서 재생된 15일차 CD19 CAR 발현을 도시한다.
도 14는 15일차 CD19 CAR+ T 세포 분화 상태 및 마커 발현의 확장된 표현형 분석을 도시한다.
도 15a-15b는 15일차 P-CD19 CAR-T 세포 활성 대 CD19+ 및 CD19- 표적의 ACEA 동역학적 세포독성 검정의 결과를 도시한다.
도 16a-16c는 15일차 P-CD19 CAR-T 세포 활성 대 CD19+ Daudi 및 Nalm6 세포 표적의 24-시간 사이토카인 방출 검정의 결과를 도시한다.
도 17a-17b는 파종성 CD19+ Daudi-Luc 마우스 모델에서 P-CD19 CAR-T 활성을 도시한다.
도 18은 Daudi-luc 파종성 모델에서 종양 세포 재-공격에 대한 P-CD19 CAR-T 활성을 도시한다.
도 19a-19e는 연구 흐름 분석의 P-CD19 CAR-RV T 종양 재공격 종료의 결과를 도시한다.
도 20a-20b는 UCB-T 세포에서 TRAC 녹아웃 효율을 도시한다.
도 21은 CRISPR을 사용한 15일차 P-T TRAC KO 효율을 도시한다.
도 22a-22b는 P-T CD19 CAR 발현에 대한 TRAC KO의 효과를 도시한다.
도 23a-23b는 P-CD19 CAR 활성에 대한 TRAC KO의 효과를 도시한다.
도 24는 항-CD3/CD28로 재자극에 이은 P-T CD19 CAR T 세포의 배수 확장을 도시한다.
도 25는 세포독성 검정에 의해 측정된 P-T 세포의 동종반응성을 도시한다.
도 26a-26b는 증식 검정에 의해 측정된 P-T 세포의 동종반응성을 도시한다.
도 27은 P-T TCR KO 세포에 대한 잔여 TCR α/β 발현을 도시한다.
도 28a-28b는 HLA-불일치된 PBMC로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 P-T 세포의 배수 확장을 도시한다.
도 29a-29b는 HLA-불일치된 PBMC로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 P-T 세포에서 활성화 마커 CD25의 발현을 도시한다.
도 230a-30f는 HLA-불일치된 PBMC로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 P-T 세포에 의한 전-염증 및 이펙터 단백질의 분비를 도시한다.
도 31a-31b는 HLA-불일치된 P-CD19 CAR-NT 세포로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 PBMC의 배수 확장을 도시한다.
도 32a-32b는 HLA-불일치된 P-CD19 CAR-NT 세포로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 PBMC에서 활성화 마커 CD25의 발현을 도시한다.
도 33a-33f는 HLA-불일치된 P-CD19 CAR-NT 세포로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 PBMC 세포에 의한 전-염증 및 이펙터 단백질의 분비를 도시한다.
도 34a-34c는 NCG 마우스 모델에서 P-T Treg 빈도 및 동종반응성의 결여를 도시한다.
도 35는 인간화된 CD34+(Hu-CD34) NSG 마우스에서 CyCART-19 및 CyCART-19 TRAC 녹아웃(KO)의 안전성 평가를 위한 연구 도식을 도시한다.
도 36은 -3일차에 Hu-CD34 NSG 마우스에서 인간 면역 세포의 생착을 도시한다.
도 37은 안전성 평가 연구에서 동물에 대한 체중 변화를 도시한다.
도 38은 GvHD 연관된 조직병리학적 변화가 CyCART-19(TRAC KO가 있거나 없음) 처리된 동물에서 간, 소장, 대장, 피부 및 폐에서 관찰되지 않았음을 입증하는 조직병리학 결과를 도시한다.
도 39a-39b는 안전성 평가 연구의 7일차에 혈장 사이토카인 수준을 도시한다.
도 40은 안전성 평가 연구에서 마우스의 말초 혈액에서 CyCART-19 세포의 계속된 지속성을 도시한다.
도 41은 전체 공여자 세포 또는 -3일차 기준선에 비해 말초 혈액에서 정규화된 인간 CD19+ 세포(%)를 도시한다.
도 42는 CD3+ T 세포 및 CD56+/CD3- NK 세포의 수가 -3일차와 비교하여 7일차에서 모든 CART-19 그룹에서 증가했음을 도시한다.
도 2는 태반-유래 동종이계 CAR-T 세포를 생성하는 과정의 개요를 도시한다.
도 3a-3c는 태반-유래 단리된 T 세포의 표현형을 도시한다.
도 4는 20일에서 태반-유래 T 세포의 시험관내 확장을 도시한다.
도 5a-5b는 13일차 후 재자극에 이어서 20일에 시험관내 확장된 태반-유래 T 세포의 표현형을 도시한다.
도 6은 15일차에 CD19 CAR 변형된 태반-유래 T 세포의 시험관내 확장을 도시한다.
도 7a-7b는 15일차 CD19 CAR 변형된 P-T 세포의 T 세포 분화 상태를 도시한다.
도 8은 T 이펙터 메모리(T em) 및 T 이펙터(T eff) 세포에서 CD57 발현을 도시한다.
도 9a-9e는 15일차 CD19 CAR 변형된 P-T 세포의 표현형 분석을 도시한다.
도 10a-10b는 P-T 세포에서 적정된 CD19 CAR 바이러스 벡터의 15일차 CD19 CAR 발현을 도시한다.
도 11은 상이한 태반 공여자로부터의 다중 P-T 제제에서 재생된 15일차 P-T 배수 확장을 도시한다.
도 12a-12b는 상이한 태반 공여자로부터의 다중 P-T 제제에서 재생된 15일차 CD19 CAR 발현을 도시한다.
도 13a-13b는 상이한 태반 공여자로부터의 다중 P-T 제제에서 재생된 15일차 CD19 CAR 발현을 도시한다.
도 14는 15일차 CD19 CAR+ T 세포 분화 상태 및 마커 발현의 확장된 표현형 분석을 도시한다.
도 15a-15b는 15일차 P-CD19 CAR-T 세포 활성 대 CD19+ 및 CD19- 표적의 ACEA 동역학적 세포독성 검정의 결과를 도시한다.
도 16a-16c는 15일차 P-CD19 CAR-T 세포 활성 대 CD19+ Daudi 및 Nalm6 세포 표적의 24-시간 사이토카인 방출 검정의 결과를 도시한다.
도 17a-17b는 파종성 CD19+ Daudi-Luc 마우스 모델에서 P-CD19 CAR-T 활성을 도시한다.
도 18은 Daudi-luc 파종성 모델에서 종양 세포 재-공격에 대한 P-CD19 CAR-T 활성을 도시한다.
도 19a-19e는 연구 흐름 분석의 P-CD19 CAR-RV T 종양 재공격 종료의 결과를 도시한다.
도 20a-20b는 UCB-T 세포에서 TRAC 녹아웃 효율을 도시한다.
도 21은 CRISPR을 사용한 15일차 P-T TRAC KO 효율을 도시한다.
도 22a-22b는 P-T CD19 CAR 발현에 대한 TRAC KO의 효과를 도시한다.
도 23a-23b는 P-CD19 CAR 활성에 대한 TRAC KO의 효과를 도시한다.
도 24는 항-CD3/CD28로 재자극에 이은 P-T CD19 CAR T 세포의 배수 확장을 도시한다.
도 25는 세포독성 검정에 의해 측정된 P-T 세포의 동종반응성을 도시한다.
도 26a-26b는 증식 검정에 의해 측정된 P-T 세포의 동종반응성을 도시한다.
도 27은 P-T TCR KO 세포에 대한 잔여 TCR α/β 발현을 도시한다.
도 28a-28b는 HLA-불일치된 PBMC로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 P-T 세포의 배수 확장을 도시한다.
도 29a-29b는 HLA-불일치된 PBMC로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 P-T 세포에서 활성화 마커 CD25의 발현을 도시한다.
도 230a-30f는 HLA-불일치된 PBMC로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 P-T 세포에 의한 전-염증 및 이펙터 단백질의 분비를 도시한다.
도 31a-31b는 HLA-불일치된 P-CD19 CAR-NT 세포로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 PBMC의 배수 확장을 도시한다.
도 32a-32b는 HLA-불일치된 P-CD19 CAR-NT 세포로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 PBMC에서 활성화 마커 CD25의 발현을 도시한다.
도 33a-33f는 HLA-불일치된 P-CD19 CAR-NT 세포로 4-일 공동-배양에 대한 반응으로 PBMC 세포에 의한 전-염증 및 이펙터 단백질의 분비를 도시한다.
도 34a-34c는 NCG 마우스 모델에서 P-T Treg 빈도 및 동종반응성의 결여를 도시한다.
도 35는 인간화된 CD34+(Hu-CD34) NSG 마우스에서 CyCART-19 및 CyCART-19 TRAC 녹아웃(KO)의 안전성 평가를 위한 연구 도식을 도시한다.
도 36은 -3일차에 Hu-CD34 NSG 마우스에서 인간 면역 세포의 생착을 도시한다.
도 37은 안전성 평가 연구에서 동물에 대한 체중 변화를 도시한다.
도 38은 GvHD 연관된 조직병리학적 변화가 CyCART-19(TRAC KO가 있거나 없음) 처리된 동물에서 간, 소장, 대장, 피부 및 폐에서 관찰되지 않았음을 입증하는 조직병리학 결과를 도시한다.
도 39a-39b는 안전성 평가 연구의 7일차에 혈장 사이토카인 수준을 도시한다.
도 40은 안전성 평가 연구에서 마우스의 말초 혈액에서 CyCART-19 세포의 계속된 지속성을 도시한다.
도 41은 전체 공여자 세포 또는 -3일차 기준선에 비해 말초 혈액에서 정규화된 인간 CD19+ 세포(%)를 도시한다.
도 42는 CD3+ T 세포 및 CD56+/CD3- NK 세포의 수가 -3일차와 비교하여 7일차에서 모든 CART-19 그룹에서 증가했음을 도시한다.
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포의 모집단을 제공하며, 여기서 상기 T 세포는 태반 T 세포이고 상기 CAR은 레트로바이러스 벡터로 바이러스 형질도입에 의해 세포로 도입되었다. 일부 실시형태에서, 상기 태반 T 세포는 제대혈 T 세포, 태반 관류액 T 세포, 또는 이의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 여기서 상기 태반 T 세포는 제대혈 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 태반 T 세포는 제대혈 T 세포 및 태반 관류액 T 세포의 혼합물이다.
이들 세포는, 예를 들어 말초 혈액 단핵 유래된 세포와 상이한 것으로 나타났으며, 실제로는 여러 양태에서 상기 세포보다 개선된 것으로 나타났다.
일부 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단에서 CAR+ T 세포의 우세한 하위모집단은 T scm/나이브 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, CAR+ T scm/나이브 세포의 상기 하위모집단은 CAR+ T 세포 모집단의 약 30% 초과, CAR+ T 세포 모집단의 약 40% 초과, CAR+ T 세포 모집단의 약 45% 초과, 또는 CAR+ T 세포 모집단의 약 50% 초과를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이펙터 메모리 표현형(Teff)을 갖는 CAR+ T 세포의 하위모집단은 CAR+ T 세포 모집단의 약 75% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 70% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 60% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 50% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 40% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 35% 미만, 또는 CAR+ T 세포 모집단의 약 30% 미만을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중심 메모리 표현형(Tcm)을 갖는 CAR+ T 세포의 하위모집단은 CAR+ T 세포 모집단의 약 10% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 8% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 6% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 5% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 4% 미만, 또는 CAR+ T 세포 모집단의 약 3% 미만을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비는 CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 50% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 60% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 70% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 80% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 90% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 100% 초과이다.
일부 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 증가된 항-종양 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD45RA를 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD27을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CCR7을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD127을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD57을 발현하는 세포의 더 낮은 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD62L을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD25를 발현하는 세포의 더 낮은 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 Lag-3+를 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 Tim-3을 발현하는 세포의 더 낮은 백분율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암 세포주의 더 큰 시험관내 사멸을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 퍼포린을 발현한다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 GM-CSF를 발현한다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 TNF-a를 발현한다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 IL-2를 발현한다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 그랜자임 B를 발현한다.
일부 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 생체내 암 모델에서 증가된 생존을 생성한다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 생체내 암 모델에서 감소된 체중 감소를 생성한다. 다른 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 생체내 암 모델에서 감소된 이식편 대 숙주 질환(GvHD)을 생성한다.
다른 실시형태에서, 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단은 또한 상기 CAR을 발현한다. 다른 실시형태에서, 상기 CAR은 형질감염에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되었다. 다른 실시형태에서, 상기 CAR은 바이러스 형질도입에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되었다. 다른 실시형태에서, 상기 CAR은 레트로바이러스 벡터로 바이러스 형질도입에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되었다. 다른 실시형태에서, 상기 CAR은 렌티바이러스 벡터로 바이러스 형질도입에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되었다. 다른 실시형태에서, 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입된 상기 CAR은 상기 T 세포의 모집단에 의해 발현된 동일한 CAR이다.
일부 실시형태에서, 상기 T 세포의 모집단은 숙주에 대한 면역원성을 감소시키기 위한 추가의 유전적 변경을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 유전적 변경은 유전자 녹아웃이다. 다른 실시형태에서, 상기 유전자 녹아웃은 T 세포 수용체(TCR) 녹아웃이다. 다른 실시형태에서, 상기 유전자 녹아웃은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 녹아웃이다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 유전적 변경은 형질감염, 레트로바이러스 형질도입 또는 렌티바이러스 형질도입에 의해 수행된다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 유전적 변경은 CRISPR, talen 또는 zn 핑거 기술의 사용에 의해 수행된다.
일부 실시형태에서, 상기 TRAC 녹아웃은 상기 TRAC 녹아웃이 없는 T 세포의 모집단과 비교하여 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에서 말초 혈액 단핵 세포에 대한 감소된 동종반응성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 감소된 동종반응성은 상기 T 세포의 모집단에 대한 CD25의 감소된 발현 또는 감소된 상향조절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 감소된 동종반응성은 전-염증성 또는 이펙터 단백질의 감소된 발현 또는 감소된 상향조절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 전-염증성 또는 이펙터 단백질은 IFN-g, TNF-a, 퍼포린, 그랜자임 B, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 감소된 동종반응성은 상기 말혈 단핵 세포의 감소된 증식/확장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 TRAC 녹아웃은 생체내 GVHD 모델에서 동종반응성이 결여되거나 감소된다.
본 발명은 또한 암 또는 그 증상 치료를 필요로 하는 환자에서 암 또는 이의 증상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 암 또는 이의 증상을 완화시키는데 효과적인 본 발명 중 임의의 하나의 T 세포 모집단의 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 암은 혈액암이다. 다른 실시형태에서, 상기 혈액암은 B 세포 암이다. 다른 실시형태에서, T 세포의 모집단은 상기 환자에 동종이계이다.
본 명세서에 사용된 "태반 관류액"은, 예를 들어, 태반 혈관계를 통해 태반, 예를 들어, 인간 태반의 적어도 일부를 통과한 관류 용액을 의미하고, 태반을 통한 통과 동안 관류 용액에 의해 수집된 복수의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "태반 관류액 세포"는 유핵 세포, 예를 들어, 태반 관류액으로부터 단리된 또는 단리가능한 전체 유핵 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "종양 세포 억제", "종양 세포 증식의 억제" 등은, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 3-단계 방법을 사용하여 생산된 T 세포 또는 T 세포 모집단을 종양 세포의 모집단과 근접하여 접촉시키거나 가져옴에 의해, 예를 들어 종양 세포의 모집단을 본 명세서에 기술된 3-단계 방법을 사용하여 생산된 T 세포 또는 T 세포 모집단과 접촉시킴에 의해, 예를 들어, 상기 종양 세포의 모집단에서 종양 세포 중 하나 이상을 사멸시킴에 의해, 예를 들어 종양 세포의 모집단의 성장을 늦추는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 접촉시키는 것은 시험관내 또는 생체외에서 일어난다. 다른 실시형태에서, 상기 접촉시키는 것은 생체내에서 일어난다.
본 명세서에 사용된 용어 "조혈 세포"는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "+"는 특정 세포 마커의 존재를 나타내기 위해 사용될 때 세포 마커가 이소형 대조군에 비해 형광 활성화된 세포 분류에서 검출가능하게 존재하거나; 또는 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR에서 백그라운드 이상으로 검출가능함을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "CAR+"는 이소형 대조군에 대한 형광 활성화된 세포 분류에 검출가능하게 존재하는 키메라 항원 수용체의 존재를 나타내기 위해 사용될 때이거나; 또는 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR에서 백그라운드 이상으로 검출가능하다.
본 명세서에 사용된 "-"는 특정 세포 마커의 존재를 나타내기 위해 사용될 때 세포 마커가 이소형 대조군에 대한 형광 활성화된 세포 분류에서 검출가능하게 존재하지 않거나; 또는 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR에서 백그라운드 이상으로 검출가능하지 않음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 면역 이펙터 세포에 있을 때 표적 세포, 전형적으로 암세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는, 가장 단순한 실시형태에서 전형적으로 2개인 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CAR은 아래 정의된 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인을 포함하는 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 시그널링 도메인(본 명세서에서 "세포내 시그널링 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 인접한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링할 수 있는, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 세포내 시그널링 도메인에 커플링할 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일 양태에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 연관된 제타 사슬(zeta chain)이다. 일 양태에서, 세포질 시그널링 도메인은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 시그널링 도메인을 추가로 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 2개 기능적 시그널링 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개 기능적 시그널링 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단(N-ter)에 선택적 리더 서열을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하며, 여기서 리더 서열은 세포막에 대한 CAR의 세포 프로세싱 및 국소화 동안 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다.
본 명세서에 기재된 것과 같은 특정 종양 메이커 X를 표적화하는 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv 또는 TCR)을 포함하는 CAR은 또한 XCAR로 지칭된다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 CD19CAR로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 "시그널링 도메인"은 2차 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 반응함으로써 이펙터로서 기능함에 의해 정의된 시그널링 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에서 정보를 전송함에 의해 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 명세서에 사용된 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론성 또는 단일클론성, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화-연결 Fv(sdFv), VH 및 CHI 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체 예컨대 sdAb(어느 하나의 VL 또는 VH), 낙타류 VHH 도메인, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 안으로 혼입될 수 있다(예를 들어, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형 III(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드 안으로 이식될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기술하는 미국 특허 번호: 6,703,199 참조).
본 명세서에 사용된 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 합성 링커, 예를 들어, 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고 단일 사슬 폴리펩티드로 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 유지한다. 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 scFv는 VL 및 VH 가변 영역을 어느 순서로든 가질 수 있으며, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 말단과 관련하여 scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 발명의 CAR의 부분은 항원 결합 도메인이, 예를 들어, 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단일 사슬 항체(scFv), 인간화된 항체 또는 이중특이성 항체를 포함하는 인접한 폴리펩타이드 사슬의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 일 양태에서, 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 양태에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 번호 체계), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 번호 체계)에 의해 기술된 것을 포함하여 다수의 잘-알려진 체계, 또는 이들의 조합을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 일 실시형태에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예를 들어, 그것은 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지고 복수 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이성 항체는 2개 이하의 항원에 대한 특이성을 갖는다. 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
본 명세서에 사용된 "항체 중쇄"는 이의 자연적으로 발생하는 형태로 항체 분자에 존재하고 정상적으로 항체가 속하는 부류를 결정하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "항체 경쇄"는 이의 자연적으로 발생하는 형태로 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "재조합 항체"는, 예를 들어, 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현되는 항체와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 지칭한다. 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 이용가능하고 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
본 명세서에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산 또는 특정 면역학적으로-적합한 세포의 활성화 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 따라서 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 하나 초과 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것과 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 도출하는 폴리펩티드를 인코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것이 쉽게 명백하다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 생성 합성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분이 있는 유체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "세포내 시그널링 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 시그널링 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어, CART 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함하여, 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포내 시그널링 도메인은 일차 세포내 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 일차 세포내 시그널링 도메인은 일차 자극, 또는 항원 의존적 시뮬레이션을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 시그널링 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 시그널링 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, CART의 경우, 일차 세포내 시그널링 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 시그널링 도메인은 공동-수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
일차 세포내 시그널링 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ΓTAM으로 알려진 시그널링 모티프를 포함할 수 있다. 일차 세포질 시그널링 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 공통 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 Rlla, FcR 베타(Fc 입실론 Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12로부터 유해된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 유전자은행 수탁 번호 BAG36664.1로 제공되는 단백질, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기로 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 " TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 사슬의 세포질 도메인 또는 이의 기능적 유도체로부터의 아미노산 잔기로 정의된다. 일 양태에서 제타의 세포질 도메인은 유전자은행 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 그의 기능적 이종상동체인 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기를 포함한다. 일 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열번호: 18로서 제공된 서열이다. 일 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열번호: 20로서 제공된 서열이다.
본 명세서에 사용된 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하고, 이에 의해 T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대 증식을 매개하지만 이에 제한되지 않는 T 세포 상의 동계 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체 뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CDl la/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 공동자극 분자의 추가 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD 160, CD 19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB 1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD 19a 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
공동자극 세포내 시그널링 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 다음의 단백질 패밀리: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 시그널링 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체에 제시될 수 있다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD 160, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
세포내 시그널링 도메인은 그것이 유래되는 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 시그널링 도메인, 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "4-IBB"는 유전자은행 수탁 번호 AAA62478.2로 제공된 아미노산 서열을 갖는 TNFR 슈퍼패밀리의 구성원, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기를 지칭하고; 그리고 "4-1BB 공동자극 도메인"은 유전자은행 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214-255, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기로 정의된다. 일 양태에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 서열번호: 14로서 제공된 서열 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기이다.
본 명세서에 사용된 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포, 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은 표적 세포의 면역 공격을 증강시키거나 촉진하는, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸 또는 성장이나 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우, 일차 자극 및 공동-자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
본 명세서에 사용된 "항암 효과"는, 예를 들어, 종양 부피의 감소, 암 세포 수의 감소, 암, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 펩티드, 폴리뉴클레오타이드, 세포 및 항체가 우선 암의 발현을 예방하는 능력에 의해 나타날 수 있다. 용어 "항종양 효과"는, 예를 들어, 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "자가"는 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하며, 그것은 나중에 개체 안으로 재-도입된다.
본 명세서에 사용된 "동종이계"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 개체는 하나 이상의 유전자좌에 있는 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종이계인 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원적으로 상호작용하기 위해 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
유전자 부가/변형의 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 본 발명에 적용가능하다. 예를 들어, CAR 전달 또는 유전자 녹아웃의 방법은 안정하거나 일시적인 형질감염 방법 또는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 형질도입에 의해 수행될 수 있다. 유전자 변형은, 예를 들어, CRISPR, talen 또는 기타 이러한 기술의 사용에 의해 이들 또는 다른 방법으로 수행될 수 있다.
실시예
실시예 1: 출발 물질, MNC 분리, 및 T 세포 단리
출발 물질 태반 혈액(인간 제대혈(UCB) 및/또는 인간 태반 관류액(HPP) 둘 모두를 포함함)은 LifebankUSA를 통해 사전 동의하에 수집하였다. 수집에 이어서, 출발 물질은 Hetastarch RBC 침전 또는 Ficoll-Paque 밀도 구배 세포 분리를 사용하여 단핵 세포(MNC)에 대해 농후화하였다. 그런 다음 MNC는 CD25+ T 조절 T 세포(Treg)를 고갈시키는 양성 선택의 과정을 거치고, Militenyi 비드 세포 분리 키트를 사용한 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 양성 선택의 과정이 이어진다. 단리된 T 세포의 분취량은 세포를 동결하기 이전에 혈청학 및 무균 시험뿐만 아니라 표현형 분석을 위해 취해진다.
단리된 P-T 세포의 표현형은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 구별된다. P-T 세포는 >78% CD3+CD56-T 세포를 함유하고 대부분 CD3+ CD45RA- CCR7+ CD27+ 중앙 메모리 T 세포 및 CD3+ CD45RA- CCR7- CD27+ 이펙터 메모리 T 세포의 낮은 빈도를 갖는 CD3+ CD45RA+ CCR7+ CD27+ 나이브 T 세포로 구성된다. CD25 고갈은 P-T 세포 내에서 CD3+ CD4+ CD25+ CD127- Treg의 빈도를 0.5% 미만으로 유의하게 감소시켰다.
CD34 조혈 줄기 세포/전구체-유래 태반 T-세포를 포함하지만 아직 시험되지 않은 추가의 출발 물질. T 세포로의 전구체의 확장 및 분화를 위한 과정은 50-60일이 소요될 수 있다. 현행 프로토콜과 함께 아래에 표시된 모집단은 상당한 CD4+/CD8+ 세포의 모집단이 존재하지만 완전히 분화된 단일 양성 T 세포가 쉽게 선택/농후화될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
태반 관류액 유래된 T 세포의 평가가 완료되었지만 현행 절차가 낮은 세포 수, 생존율 및 T 세포 순도를 산출하므로 단리 절차를 최적화할 필요가 있다.
실시예 2: T 세포 활성화 및 확장
비-변형된 P-T 세포:
단리된 P-T 세포는 해동되고, CD4+CD25+CD127-Treg의 제거를 위해 Miltenyi 항-CD25 비드를 사용하여 CD25-고갈을 겪고(T 세포 단리 단계 이전에 포함될 수 있음), Invitrogen으로부터의 항-CD3/항-CD28 Dynabeads(1:1 비드:세포 비율)를 사용하거나 또는 Miltenyi로부터의 항-CD3/항-CD28 나노입자 Transact(1:100 부피 희석)을 사용하여 활성화하였다. 그런 다음 세포는 100IU/mL IL-2, 10ng/mL IL-7 + 10ng/mL IL-15 또는 100IU/mL IL-2 + 10ng/mL IL-7을 사용하여 확장하였다. 추가의 재-자극은 12-14일차에 완료되고 세포는 배수 확장을 최대화하기 위해 Grex 용기에서 21일차까지 확장된다.
비-변형된 P-T 세포는 20일차까지 배양될 때 초기 자극으로 최대 600-배, 14일차에 재-자극(RS)으로 최대 3,600-배까지 확장될 수 있다.
다양한 배양 조건 하에서, 비-변형된, 20-일 확장된 P-T는 해동-후(PT), 비-배양된 PBMC와 비교하여 더 이른 분화 표현형을 나타내었고, 대부분 CD3+ CD45RA+ CD62L+ 나이브 T 세포 및 CD3+ CD45RA- CD62+ 중심 메모리 T 세포로 구성된 반면, 해동-후, 비-배양된 PBMC는 대부분 더 분화된 CD3+ CD45RA-/+ CD62L- 이펙터 메모리 및 말단 이펙터 T 세포로 구성하였다. P-T 세포의 초기 분화 상태를 감안할 때, 자극의 추가적 라운드가 가능해야 하고, 환자에서 지속될 중앙 메모리 T 세포와 종양 세포를 즉시 표적화하고 사멸할 이펙터 T 세포의 균형잡힌 혼합을 유지하면서 태반-유래 동종이계 CAR-T의 "기성품" 제조를 지지하기 위해 확장 배수를 유의하게 증가시켜야 한다.
CAR 변형된 P-T 세포:
(동결 이전에 CD25-고갈을 겪은) 단리된 T 세포는 해동되고 Miltenyi로부터의 항-CD3/항-CD28 나노입자 Transact(1:100 부피 희석)를 사용하여 활성화되었다. 그런 다음 세포는 100IU/mL IL-2를 사용하여 Grex 용기에서 확장되었다. 3일차에 세포는 바이러스 사전-스핀 방법을 사용하여 레트로넥틴-코팅된 플레이트 상에서 CD19 CAR 렌티바이러스(LV) 또는 레트로바이러스(RV)로 형질도입되었다. 세포는 그 다음 2-3일마다 발생하는 배지 공급으로 15일차까지 배양되었다.
CD19 CAR 변형된 P-T 세포는 재-자극 없이 배양 15일 후에 237-336-배 확장될 수 있다.
배양 15일 후, CD19 CAR 변형된 P-T 세포는 CD19 CAR PBMC-유래 T 세포와 비교하여 별개의 T 세포 분화 표현형을 나타내었다. P-T 세포는 CD3+ CD45RA+ CCR7+ 나이브/줄기 세포 메모리 T 세포와 CD3+ CD45RA+ CCR7- 이펙터 T 세포의 양호한 혼합물로 구성된 반면, PBMC-유래 CD19 CAR T 세포는 대부분 CD3+ CD45RA- CCR7- 이펙터 메모리 T 세포와 CD3+ CD45RA+ CCR7- 이펙터 T 세포로 구성되었다. P-T NT(형질도입되지 않음) 및 P-T CD19 CAR RV 세포는 P-T CD19 CAR LV 세포보다 더 많은 T 나이브/scm T 세포로 구성되었다.
더욱이, PBMC-유래 이펙터 메모리 T 세포(T em) 및 이펙터 T 세포(T eff)는 유의하게 더 높은 수준의 고갈 마커 CD57을 발현한 반면, P-T 세포 발현은 낮았다.
낮은 CD57 발현과 함께 P-T 세포 내 이펙터 T 세포 및 나이브/줄기 세포 메모리 T 세포의 더 큰 빈도 및 혼합은 시간이 지남에 따라 더 분화된 T 세포 하위집합을 자가-재생하고 보충하는 능력을 유지하면서 종양 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸할 수 있는 CAR-T 생성물을 제시한다.
전반적으로, 15일차 P-T NT 및 P-CD19 CAR T 세포는 높은 수준의 CD45RA, CD27, CCR7, CD127, 및 CD28을 발현하였고, 낮은 수준의 고갈 마커 CD57 및 면역 체크포인트 마커(면역 응답의 음성 조절자) PD-1, Lag-3 및 Tim-3을 발현하였다.
P-T 세포는 3일차에 아래 열거된 다양한 마우스 및 인간 scFv CD19 CAR 바이러스 벡터로 형질도입되었다:
- 뮤어라인(Murine)(Ms) scFv CD19 CAR 렌티바이러스(LV)
- JL4.19(EF1a-CD8-scFv-CD8-HTM-BBz)(SBI 벡터, UPENN CAR19)
- Vector Builder(VB) 및 SignaGen에 의해 생산된 연구-등급 바이러스
- 인간(Hu) scFv CD19 CAR 렌티바이러스(LV)
- JL huCAR19(CD8-신호-VL-링커-VH-CD8HTM-BBz)(Hu scFv를 제외하고 UPENN CAR과 동일)
- JK1 huCAR19(CD8-신호-VL-링커-VH-CD8HTM-28z)("NCI CAR": JL보다 4aa 더 긴 CD8 힌지 & 막횡단 도메인, CD28 공동자극 도메인, Hu scFv)
- JK2 huCAR19(CD8-신호-VL-링커-VH-CD8HTM-BBz)(NCI CAR과 동일하지만 41BB 공동자극 도메인, Hu scFv를 가짐)
- 3가지 인간 서열 모두는 연구-등급이고 SignaGen에 의해 생산된다.
- 뮤어라인(Ms) scFv CD19 CAR 레트로바이러스(RV)
- Sorrento Therapeutics에 의해 생산되고 제공됨
표 1: P-T CD19 CAR 작제물의 요약
CD19 CAR 형질도입 효율은 세포를 CD19 Fc-Fitc 시약으로 인큐베이션하고 유세포분석을 사용하여 백분율 CD19 CAR+ 세포를 정량화함에 의해 측정하였다. 15일차까지 P-T 세포는 모든 Ms scFv LV 또는 RV(Vector Builder, SignaGen 또는 Sorrento 제품)로 형질도입되었을 때 CD19 CAR을 발현하였고 Hu scFv JK2 및 JL 서열로 형질도입되었을 때 CD19 CAR을 발현했으며, 모두 4-1BB 공동자극 도메인으로 구성하였다. P-T 세포는 CD28 공동자극 도메인을 함유하는 Hu scFv JK1 서열로 형질도입될 때 CD19 CAR을 발현하지 않았다. 각 CD19 CAR에 대한 최적 MOI/농도는 Vector Builder Ms scFv CD19 CAR LV에 대해 MOI 50, SignaGen Ms scFv CD19 CAR LV에 대해 MOI 100, SignaGen Hu scFv CD19 CAR LV에 대해 MOI 200, 및 Sorrento Ms scFv CD19 CAR RV에 대해 2.5X인 것으로 결정하였다(계산된 역가 불명).
P-T 세포는 배양(연구-규모)에서 15일 후에 쉽게 확장될 수 있었다. 483-배의 가장 높은 배수 확장은 Ms CD19 CAR LV로 P-T 세포를 형질도입함에 의해 달성되었고, 132-배의 가장 낮은 배수 확장은 Hu JK1 CD19 CAR LV로 P-T 세포의 형질도입으로 얻어졌다.
15일차 P-CD19 CAR T 세포는 형질도입에 사용된 바이러스 벡터와 상관없이 높은 생존력 및 CD3+ CD56-T 세포 순도를 나타냈다. Vector Builder Ms scFv CD19 CAR LV로 형질도입된 P-T 세포는 SignaGen에 의해 생성된 동일한 Ms scFv CD19 CAR LV 서열과 비교하여 유의하게 더 높은 CD4+ T 세포를 초래했다. Sorrento의 Ms scFv CD19 CAR로 형질도입된 P-T 세포는 CD8+ T 세포의 가장 높은 빈도를 초래했고 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 균형잡힌 혼합을 초래했다.
각각의 CD19 CAR 바이러스 유형에 대해 최적화된 MOI/농도를 사용하여, CD19 CAR 발현은 15일차 P-T 세포에서 22-70% 범위였다. Vector Builder Ms scFv CD19 CAR LV는 대부분의 그 CD19 CAR 발현이 CD4+ T 세포 상에서 발현되는 반면, Sorrento의 Ms scFv CD19 CAR RV는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에 CD19 CAR 발현의 동등한 혼합과, CD8+ T 세포 내 CD19 CAR 발현의 가장 큰 전반적 빈도를 초래했다.
P-CD19 CAR T 세포의 확장된 표현형 분석은 RV 대 LV로 형질도입된 P-T 사이의 뚜렷한 표현형 차이를 입증했다. RV를 사용하면 CAR+ T scm/나이브 세포의 가장 높은 빈도로 덜 분화된 표현형이 관찰된 반면, LV로 형질도입된 P-T 세포는 CAR+ T scm/나이브 세포(특히 Hu JK2 LV)의 더 낮은 빈도로 보다 분화된 표현형을 관찰했다. 모든 CD19 CAR+ P-T 세포는 PBMC-유래 CD19 CAR+ T 세포와 비교하여 더 높은 빈도의 CD45RA, CCR7, CD27 및 더 낮은 빈도의 PD-1, TIM-3 및 고갈 마커 CD57을 발현했다.
실시예 3: CD19 CAR CAR 시험관내 및 생체내 활성
암 세포주에 대한 15일차 P-CD19 CAR-T 세포의 세포용해 활성
시험관내에서, P-CD19 CAR T 세포의 기능적 활성은 동적 ACEA 세포독성 검정에서 CD19+ 버킷 림프종(Daudi) 및 CD19+ 급성 림프모구성 백혈병(Nalm6) 세포주에 대해 평가되었고, P-T 세포의 활성은 PBMC Ms CD19 CAR RV와 비교되었다(n=6). CD19-K562 세포는 비-특이적 사멸을 평가하기 위해 음성 대조군으로 포함되었다.
암 세포주와 공동-배양에서 15일차 P-CD19 CAR-T의 사이토카인 방출
추가로, P-CD19 CAR T 세포의 시험관내 기능 활성을 사이토카인 방출 검정에서 CD19+ 버킷 림프종(Daudi) 및 CD19+ 급성 림프모구성 백혈병(Nalm6) 세포주에 대해 평가되었다. CD19-K562 세포는 P-CD19 CAR T 세포의 비-특이적 사멸을 평가하기 위한 표적으로 포함되었다. P-CD19 CAR-T 세포를 24-시간 동안 1:1의 E:T 비율로 CD19+/- 표적과 공동-배양하고, 세포 배양 상청액을 수집하고 다양한 사이토카인 및 이펙터 단백질의 분비에 대해 분석했다.
P-CD19 CAR-T 세포는 CD19+ Daudi 및 Nalm6 표적과 함께 공동-배양될 때 항원-특이적 방식으로 향-염증성 사이토카인 및 이펙터 단백질(IFN-g, 그랜자임 A, 그랜자임 B, GM-CSF, IL2, 퍼포린 및 TNF-a)을 분비했으며, Ms CD19 CAR RV에서 가장 큰 전반적인 분비가 관찰되었다. IL-6 및 IL-8의 최소 사이토카인 분비가 모든 표적에 걸쳐 관찰되었고 모든 사이토카인 및 단백질의 최소 분비가 P-CD19 CAR T 세포를 갖는 CD19-K562 세포에 대해 관찰되었다. CD19+ Daudi 및 Nalm6 표적 둘 모두에 대해, P-CD19 CAR RV T 세포는 그의 PBMC-유래 상대 부분과 비교하여 더 높은 농도의 그랜자임 B, GM-CSF, 퍼포린, TNF-a 및 특히 IL2를 분비했다. IL2의 유의하게 더 높은 분비는 더 큰 T 세포 확장, 증강된 T 세포 기능 및 생존을 촉진할 수 있는 덜 분화된, 더 많은 줄기-유사 모집단을 나타낸다.
P-CD19 CAR-T 생체내 활성
생체내에서, P-CD19 CAR T 세포의 항종양 활성은 NSG 마우스에서 파종성 림프종 이종이식 모델을 사용하여 평가되었다. 루시페라제 발현 Daudi 세포(3×106)를 0일차에 정맥내로(IV) 주사하고, 이어서 P-CD19 CAR T 세포를 IV 주사하였다. P-T 세포는 표 1에 요약된 CD8+ CD19 CAR+ 빈도에 따라 투여되었다(P-T: RV: 7일차에 14×106의 1회 용량; LV: 7일차에 20×106의 1회 용량 또는 7, 10, 14일차에 20×106의 3회 용량). 생물발광 영상화(BLI) 및 생존이 일차 연구 평가변수로 사용되었다.
표 2: 파종된 CD19+ Daudi-Luc 마우스 모델에서 P-CD19 CAR-T 투여
P-CD19 CAR T 세포는 비-TRAC 변형된 T 세포의 20×106의 3회 용량에서도 이 마우스 모델에서 내약성이 우수하고 안전하였다. 모든 P-CD19 CAR T 세포는 종양 부담을 유의하게 줄이고 생존을 개선했다. 치료 4주 후, 비히클 그룹은 100% 사망률을 보인 반면, P-CD19 CAR T-치료 그룹(N=5)으로부터의 모든 동물은 체중 감소를 포함한 임상 증상 없이 살아 남았다. P-CD19 CAR LV 처리된 그룹은 PBMC CD19 CAR(7MM) 처리된 그룹과 마찬가지로 종양 부하를 관리했다. P-CD19 CAR LV 세포를 사용한 다중-투여(3X)는 단일 용량에 비해 개선을 입증하였고 7MM PBMC CD19-CAR RV 처리된 그룹(둘 모두 총 2.1MM CD19-CAR+ CD8+ T 세포로 투여됨)보다 약간 더 나은 종양 관리 및 생존을 나타냈다. 특히, 단일 용량의 P-CD19 CAR LV 세포(0.6MM CD19-CAR+ CD8+ T 세포)는 2MM PBMC CD19 CAR RV 처리된 그룹(또한 0.6MM CD19-CAR+ CD8+ T 세포)보다 종양 부담을 줄이고 양호한 생존을 개선했다. 현저하게, P-CD19 CAR RV 처리된 마우스는 모든 처리 그룹을 능가하였고 120일차까지 100% 생존으로 종양 세포를 근절했다. 나이브/scm 및 이펙터 T 세포 둘 모두의 존재와 함께 덜 분화된 T 세포 표현형, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양호한 혼합, 더 큰 CD8+ CD19 CAR+ 발현 및 더 큰 사이토카인 분비(특히 T 세포 기능/생존을 지지하기 위한 IL2)는 모두 본 명세서에 기술되어 있으며, P-CD19 CAR T 세포, 특히 P-CD19 CAR RV T 세포로 생체내에서 관찰되는 더 큰 효능 및 증강된 생존에 집합적으로 기여하는 것으로 여겨진다.
P-CD19 CAR RV 처리된 그룹으로부터 생존한 마우스는 그 다음 추가의 Daudi 종양 세포로 재-공격되었다. 122일차에 Daudi 세포(3×106)를 발현하는 루시페라제가 P-CD19 CAR RV 처리된 생존 마우스뿐만 아니라, 새로운 비히클 대조군 그룹으로 작용하는 연령-일치된(6-개월령) 나이브 NSG 마우스에 정맥내로(IV) 주사되었다.
P-T CD19 CAR RV 세포는 Daudi 재-공격(122일차에)에 이어서 종양을 관리하고 생존을 215일까지 연장하는 것 외에도 종양을 제거하고 120일까지 100% 생존을 초래하는 유일한 치료법이었다.
더욱이, 재공격에 이은 4마리 생존 마우스의 연구 흐름 분석의 종료는 인간 P-T CD45+ CD56- CD3+ CD19 CAR+ 세포가 생체내에서 지속될 수 있고 연구 흐름 분석의 종료(185-215일차; n=4)에서, 비장 일에서 검출된 가장 큰 빈도 및 수의 세포로, 재-공격된 마우스의 혈액, 비장 및 골수에서 검출될 수 있음을 입증하였다.
실시예 4: UCB-T 세포에서 T-세포 수용체(TRAC) 녹아웃
TRAC는 TRAC 유전자좌의 제1 엑손에 대해 가이드 RNA(gRNA)를 사용하여 표적화되었다. Cas9 및 gRNA의 화학적으로 변형된 RNA 형태는 뉴클레오펙션(Lonza)을 통해 P-T 배양의 6-8일차에 P-T 세포 안으로 형질감염되었다. 유전자 변형 효율은 TCRα/β 또는 CD3에 대한 항체를 사용하여 유세포분석에 의해 모니터링되었다.
3개 별도 실험에서, TRAC 녹아웃 효율은 형질감염 3일 후에 측정되었다. x-축 상의 날짜는 형질감염 시간을 나타낸다. 90% 이상의 TRAC 유전자 녹아웃이 P-T 활성화의 방법 및 배양 조건(IL2로 Dynabeads 또는 IL7 및 IL15로 트랜스액트)에 관계없이 달성되었다. B. 세포 증식과 생존력은 CRISPR 과정에 의해 최소한으로 영향을 받았다. 다른 그룹 간에는 세포 증식 및 생존율의 유의한 변화가 없다.
추가로, P-T 세포가 3일차에 CD19 CAR LV 또는 RV로 형질도입되고, 이어서 6일차에 CRISPR을 사용하여 형질감염 및 TRAC KO가 된 경우, 15일차 P-T NT-TRAC KO 및 P-CD19 CAR-TRAC KO 세포는 >97% TRAC KO 효율을 나타냈다.
더욱이, TRAC KO는 P-T 세포에서 CD19+ Daudi 및 Nalm6 표적에 비해 CD19 CAR 발현 또는 시험관내 세포용해 활성에서 임의의 유의미한 변화를 초래하지 않았다.
실시예 5: 기능 검증의 TRAC 녹아웃 손실
기능 검증의 TRAC 녹아웃 손실은 항-CD3/CD28 나노입자로 P-T CD19 CAR-NT(비-형질감염됨) 및 P-T CD19 CAR-TRAC KO 세포를 재자극하고 4일 동안 세포를 배양함에 의해 완료하였다.
3개 P-T 공여자에서, CD19 CAR-NT 세포로 재자극 및 4일의 세포 배양에 이어서 3.2- 내지 5.1-배수 확장이 관찰된 반면, CD19 CAR-TRAC KO 세포의 재자극에 이어서 최소 배수 확장이 검출되어, 기능적 TCR/CD3 복합체의 손실이 확인하였다.
실시예 6: 시험관내 검정에서 측정된 UBC-T 세포의 동종반응성
P-T 세포에 대한 PMBC 또는 PBMC에 대한 P-T 세포의 동종반응성을 측정하기 위해 2개 독립적인 검정을 사용하였다. 첫 번째 것에서, 동종반응성은 4-시간 공동-배양에서 일 공여자로부터 다른 공여자에 대한 것으로 세포의 사멸 활성으로 측정하였다. 표적 세포는 PKH26으로 표지되었고 세포독성은 총 표적 세포에 대한 죽은 표적 세포의 백분율로 표현하였다.
2개 별도 실험에서, PBMC 또는 PBMC 유래된 T 세포가 P-T 세포로 공동-배양되었다. 일 공여자로부터의 PBMC는 다른 공여자로부터의 PBMC를 고효율로 사멸시켰다. 그러나 PBMC는 P-T 세포(CBT)를 사멸시키지 않았다. 별도 실험에서 PMBC 유래된 T 세포(PBT)는 암세포주 RPMI8226(RPMI)을 고효율로 사멸시켰다. 그러나 그들은 P-T 세포(CBT)를 사멸시키는 데 최소한의 활성을 가졌다. P-T 세포는 PBMC 유래된 T 세포도 사멸시키지 않았다.
두 번째 검정에서, 동종반응성은 다른 공여자 세포와 공동-배양될 때 일 공여자의 T 세포의 우선적 증식으로 측정하였다. 두 공여자로부터의 세포는 다른 염료(CFSE 및 PKH26)로 표지되고 4일 동안 1:1 비율로 공동-배양하였다. 염료의 희석은 세포 증식을 나타내고 높은 강도를 갖는 세포의 백분율의 감소 또는 평균 형광 강도의 변화로 표현될 수 있다.
P-T 세포 및 대조군 PBMC는 PKH26으로 표지되었고 PBMC는 CFSE로 표지되었다. CFSE로 표지된 PBMC, PHK26으로 표지된 P-T(CBT) 및 CFSE 또는 PKH26으로 표지된 PBMC의 혼합 배양이 대조군으로 사용되었다. P-T 단독 배양에 비해 PKH26-hi P-T(CBT) 세포의 백분율이 더 낮으며, 이는 PBMC와의 공동-배양에서 P-T 세포의 우선적인 증식을 나타낸다.
이 결과와 일치하여, P-T 세포의 MFI는 또한 P-T 세포 단독 및 PBMC 대조군을 갖는 PBMC와 비교하여 PBMC와의 공동-배양에서 하락하여 더 양호한 증식을 나타낸다. 대조적으로, 공동-배양에서 PBMC의 MFI는 PBMC 단독 또는 PBMC 배양을 갖는 PBMC와 비교하여 증가했다.
실시예 7: 시험관내 검정에서 측정된 P-T 대 HLA 불일치 PBMC의 동종반응성
P-T 세포의 동종반응성을 추가로 평가하기 위해, HLA-불일치된, PKH26 표지된 P-T는 CFSE 및 미토마이신-C(MMC) 처리된 PBMC와 1:1 비율로 4일 동안 단방향 혼합된 림프구 반응(MLR)에서 공동-배양되어 P-T 세포 대 PBMC의 임의의 동종반응성이 평가되었다(GvHD에 대한 가능성). 검정 판독값에는 P-T 세포의 배수 확장, P-T 세포에 대한 T 세포 활성화 마커 CD25의 상향조절뿐만 아니라 HLA-불일치된 PBMC에 대한 반응에서 P-T 세포에 의한 향-염증성 사이토카인 및 이펙터 단백질의 분비가 포함되었다.
표 3: P-T와 PBMC 공여자 사이의 HLA 불일치의 요약
TCR α/β 녹아웃 효율은 잔존하는 ~2% 이하 TCR α/β로 동종반응성 평가에 포함된 P-T 세포에서 매우 높았다. P-T D# 17695 NT-KO와 함께 Miltenyi 마이크로비드를 사용한 TCR α/β 고갈은 잔류 TCR α/β 발현을 더욱 감소시키고 개선했다.
세 P-T NT-NT 세포의 공여자(TCR α/β 변형 없음)는 4일 동안 4개 상이한 HLA-불일치된 PBMC와 공동-배양될 때 최소 증식을 나타내었다. 항-CD3/CD28 나노입자로 NT-NT 세포의 재-자극은 양성 대조군으로 역할을 했고 P-T NT-NT 동종반응성의 결여가 손상된/비-기능 T 세포로 기인한 것이 아니었음을 입증했다. P-T 세포로 관찰된 최소 증식은 P-T 세포가 TCR α/β KO 및 TCR α/β 고갈을 겪을 때 더욱 감소되었다(P-T D#17695로 표시됨).
세 P-T NT-NT 세포의 공여자(TCR α/β 변형 없음)는 4일 동안 4개 상이한 HLA-불일치된 PBMC와 공동-배양될 때 TNF-a 및 퍼포린의 최소/낮은 분비와 함께, 어느 정도의 IFN-g 및 그랜자임 B 분비를 나타내었다. P-T 세포로 관찰된 모든 사이토카인/이펙터 단백질 분비는 P-T 세포가 TCR α/β KO 및 TCR α/β 고갈을 겪은 다음 HLA-불일치된 PBMC와 공동-배양될 때 유의하게 감소되었다.
실시예 8: 시험관내 검정에서 측정된 PBMC 대 HLA 불일치된 P-T 세포의 동종반응성
유사한 방식으로, HLA-불일치된 P-T CD19 CAR T 세포에 대한 PBMC의 동종반응성이 또한 평가되었다. 이 설정에서 PBMC는 PKH26으로 표지되었고 단방향 MLR에서 4일 동안 1:1 비율에서 CFSE 및 Mitomycin-C(MMC) 처리된 P-CD19 CAR T 세포와 공동-배양되어 PBMC 세포 대 P-T(숙주 대 이식편)의 동종반응성이 평가되었다. 검정 판독값에는 PBMC의 배수 확장, PBMC 세포에서 T 세포 활성화 마커 CD25의 상향 조절뿐만 아니라 HLA-불일치된 P-CD19 CAR T 세포에 대한 반응에서 PBMC 세포에 의한 향-염증성 사이토카인 및 이펙터 단백질의 분비가 포함되었다.
세 PBMC의 공여자 모두는 4일 동안 HLA-불일치된 P-CD19 CAR T 세포와 공동-배양될 때 증식의 결여를 나타내었다. 항-CD3/CD28 나노입자로 PBMC 세포의 재-자극은 양성 대조군으로 역할을 했고 PBMC 동종반응성의 결여가 손상된/비-기능 T 세포에 기인한 것이 아니었음을 입증했다.
증식의 결여와 일관되게, 세 PBMC 공여자 모두는 또한 4일 동안 HLA-불일치된 P-CD19 CAR T 세포와 공동-배양될 때 T 세포 활성화 마커 CD25의 상향조절의 결핍을 나타내었다. 항-CD3/CD28 나노입자로 PBMC의 재-자극은 CD25 발현을 유의하게 증가시키는 양성 대조군으로 역할을 했고, PBMC 동종반응성의 결여가 손상된/비-기능 T 세포에 기인한 것이 아니었음을 입증했다.
세 PBMC 모두는 4일 동안 HLA-불일치된 P-CD19 CAR T 세포와 공동-배양될 때 향염증성 사이토카인 및 이펙터 단백질의 분비 증가를 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 관찰된 한 가지 예외는 PBMC #1이 P-CD19 CAR T 세포와 공동-배양될 때 TNF-a 분비의 증가였다.
종합하면, 이들 결과는 P-CD19 CAR T 세포가 HLA-불일치된 PBMC와 배양될 때 동종-반응을 유도하지 않고, 환자 면역 세포에 의한 그의 제거를 무효화하는 면역-특권의 특성을 나타낼 수 있음을 시사하며, 이는 생체내에서 그 개선된 지속성에 대한 가능성을 뒷받침한다.
실시예 9: 동물 모델에서 P-T 세포의 동종반응성
비-변형된 21-일 확장된 P-T 세포의 동종반응성(이종-동종반응성)이 GvHD의 NCG 마우스 모델에서 시험되었다. 이 모델에서 PBMC는 체중 감소로 측정될 수 있는 GvHD를 야기한다. 세 공여자 및 대조군 PMBC로부터의 3천만의 CD25 고갈된 P-T 세포가 IV 경로를 통해 NCG 마우스 안으로 주입되었다. 동물 체중은 시간이 지남에 따라 모니터링되었다.
동물의 체중 변화는 세포 주입의 당일 체중의 백분율로 표현되었다. 각 라인은 하나의 마우스를 나타낸다. PBMC 그룹에서 5마리 동물 모두는 28일의 과정 동안 체중이 감소하였고 희생되어야 했다. P-T 그룹에서는 유의한 체중 감소가 없었고 이종-GvHD를 유도하지 않았다. P-T 세포는 Treg를 제거하기 위한 확장 이전에 CD25-고갈되었기 때문에 GvHD의 결핍은 CD4+ CD25+ CD127- FoxP3+ 면역 조절 T 세포에 기인하지 않는다. P-CD19 CAR-T 및 P-CD19 CAR-TRAC KO T 세포의 동종반응성을 평가하기 위한 추가의 GvHD 연구가 진행 중이다.
실시예 10: 인간화된 CD34+(Hu-CD34) NSG 마우스에서 CyCART-19 및 CyCART-19 TRAC 녹아웃(KO)의 안전성 평가
이 연구의 목적은 인간 제대혈 CD34+ 세포(Hu-CD34 NSG)가 이식된 비-비만 당뇨병(NOD)-scid IL2R감마널(null)(NSG) 마우스에서 동종이계 GvHD, 신경독성 및 사이토카인 방출 증후군을 포함하는 CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO와 연관된 잠재적 독성을 평가하기 위한 것이었다.
7-개월령(CD34+ 제대혈 세포 이식 후 24-주) 암컷 Hu-CD34 NSG 마우스가 본 연구에 사용되었다. CD34 공여자의 HLA 클래스 I 그룹은 CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO 세포의 것에 6개 중 5개의 불일치를 가졌다. 말초 혈액의 유세포분석이 인간 CD45+ 세포의 이식을 확인하기 위해 -3일차에 수행되었다. 이식된 인간 CD45+ 세포의 백분율에 기초하여, 16마리 마우스를 다음의 4개 그룹으로 무작위화하였다: 무 처리(n=2), PBMC-CART-19(n=3), CyCART-19(n=5), CyCART-19 TRAC KO(n=6). 0일차에, CART 세포가 10×106 세포/마우스(대략적으로 400×106 세포/kg)의 용량으로 정맥내로(IV) 투여되었다.
10×106 세포/마우스의 용량으로 CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO로 처리된 마우스는 일찍 2일차에 체중 손실을 경험하였고, 체중은 14일차에 회복되었다. 혈장에서 증가된 사이토카인 생산은 7일차에 검출되었지만 21일차 및 35일차에는 검출되지 않았다. CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO 처리는 7일차에 CD34 공여자-유래 B 세포를 유의하게 감소시켰고 B 세포 회복은 21일차 및 35일차에서 관찰되었다.
조직병리학 분석은 CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO 처리된 동물에서 GvHD 연관된 변화가 관찰되지 않았음을 입증했다. 더욱이, CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO 처리 관련된 변화는 뇌, 폐, 간, 비장, 신장, 피부, 소장 및 대장을 포함하여 검사된 모든 기관 및 조직에서 관찰되지 않았다.
CyCART-19 및 CyCART-19 TRAC KO 세포는 7일차에 말초 혈액으로부터 검출되었지만 21일차 및 35일차에는 검출되지 않았다.
종합하면, 이 연구는 10×106 세포/마우스의 용량에서 CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO가 HLA-불일치된 Hu-CD34 NSG 마우스에서 동종이계 GvHD 및 신경독성을 유발하지 않았음을 입증하였다. 체중 감소, 증가된 사이토카인 생산 및 B 세포 사멸에 대한 결과는 CyCART-19 또는 CyCART-19 TRAC KO 처리가 10×106 세포/마우스의 용량에서 사이토카인 방출 증후군을 유도했음을 시사했다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 실시형태에 의해 범주가 제한되지 않는다. 실제로, 기술된 것 이외에 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 그 공개를 위한 것이고 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Claims (50)
- 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포의 모집단으로서, 상기 T 세포는 태반 T 세포이고, 상기 CAR은 레트로바이러스 벡터로 바이러스 형질도입에 의해 세포에 도입된, T 세포의 모집단.
- 제1항에 있어서, 상기 태반 T 세포는 제대혈 T 세포, 태반 관류액 T 세포, 또는 이의 혼합물인, T 세포의 모집단.
- 제1항에 있어서, 상기 태반 T 세포는 제대혈 T 세포인, T 세포의 모집단.
- 제1항에 있어서, 상기 태반 T 세포는 제대혈 T 세포와 태반 관류액 T 세포의 혼합물인, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAR+ T 세포의 우세한 하위모집단은 T scm/나이브 표현형을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제5항에 있어서, 상기 CAR+ T scm/나이브 세포의 하위모집단은 CAR+ T 세포 모집단의 약 30% 초과, CAR+ T 세포 모집단의 약 40% 초과, CAR+ T 세포 모집단의 약 45% 초과, 또는 CAR+ T 세포 모집단의 약 50% 초과를 포함하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 메모리 표현형(Teff)을 갖는 CAR+ T 세포의 하위모집단은 CAR+ T 세포 모집단의 약 75% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 70% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 60% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 50% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 40% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 35% 미만, 또는 CAR+ T 세포 모집단의 약 30% 미만을 포함하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 중심 메모리 표현형(Tcm)을 갖는 CAR+ T 세포의 하위모집단은 CAR+ T 세포 모집단의 약 10% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 8% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 6% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 5% 미만, CAR+ T 세포 모집단의 약 4% 미만, 또는 CAR+ T 세포 모집단의 약 3% 미만을 포함하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CD8+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비는 CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 50% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 60% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 70% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 80% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 90% 초과이고, CD4+인 CAR+ T 세포의 하위모집단의 상대적 존재비의 100% 초과인, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 증가된 항-종양 활성을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 숙주에 대한 면역원성을 감소시키는 유전적 변경을 포함하는, T 세포의 모집단.
- 제11항에 있어서, 상기 유전적 변경은 유전자 녹아웃인, T 세포의 모집단.
- 제12항에 있어서, 상기 유전자 녹아웃은 T 세포 수용체(TCR) 녹아웃인, T 세포의 모집단.
- 제13항에 있어서, 상기 유전자 녹아웃은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 녹아웃인, T 세포의 모집단.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적 변경은 형질감염, 레트로바이러스 형질도입 또는 렌티바이러스 형질도입에 의해 수행되는, T 세포의 모집단.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 유전적 변경은 CRISPR 기술의 사용에 의해 수행되는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TRAC 녹아웃은 상기 TRAC 녹아웃 없는 T 세포의 모집단과 비교하여 혼합된 림프구 반응(MLR) 검정에서 말초 혈액 단핵 세포에 대한 감소된 동종반응성을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제16항에 있어서, 상기 감소된 동종반응성은 상기 T 세포의 모집단 상에 CD25의 감소된 발현 또는 감소된 상향조절을 포함하는, T 세포의 모집단.
- 제16항에 있어서, 상기 감소된 동종반응성은 향-염증성 또는 이펙터 단백질의 감소된 발현 또는 감소된 상향조절을 포함하는, T 세포의 모집단.
- 제19항에 있어서, 상기 향-염증성 또는 이펙터 단백질은 IFN-g, TNF-a, 퍼포린, 그랜자임 B, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, T 세포의 모집단.
- 제16항에 있어서, 상기 감소된 동종반응성은 상기 말혈 단핵 세포의 감소된 증식/확장을 포함하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TRAC 녹아웃은 생체내 GVHD 모델에서 동종반응성을 결하거나 감소되는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD45RA를 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD27을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CCR7을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD127을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD57을 발현하는 세포의 더 낮은 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD62L을 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 CD25를 발현하는 세포의 더 낮은 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 Lag-3+를 발현하는 세포의 더 큰 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 Tim-3을 발현하는 세포의 더 낮은 백분율을 갖는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 더 큰 시험관내 암세포주의 사멸을 나타내는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 퍼포린을 발현하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 GM-CSF를 발현하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 TNF-a를 발현하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 IL-2를 발현하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 암세포주에 대한 시험관내 공격에서 더 많은 양의 그랜자임 B를 발현하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 생체내 암 모델에서 증가된 생존을 생성하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 생체내 암 모델에서 감소된 체중 감소를 생성하는, T 세포의 모집단.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단보다 생체내 암 모델에서 감소된 이식편 대 숙주 질환(GvHD)을 생성하는, T 세포의 모집단.
- 제23항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단은 또한 상기 CAR을 발현하는, T 세포의 모집단.
- 제41항에 있어서, 상기 CAR은 형질감염에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되는, T 세포의 모집단.
- 제41항에 있어서, 상기 CAR은 바이러스 형질도입에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되는, T 세포의 모집단.
- 제43항에 있어서, 상기 CAR은 레트로바이러스 벡터로 바이러스 형질도입에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되는, T 세포의 모집단.
- 제43항에 있어서, 상기 CAR은 렌티바이러스 벡터로 바이러스 형질도입에 의해 상기 말초 혈액 단핵 세포 T 세포의 모집단에 도입되는, T 세포의 모집단.
- 암 또는 그 증상 치료를 필요로 하는 환자에서 암 또는 이의 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 환자에서 암 또는 이의 증상을 경감시키는데 효과적인 양의 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 T 세포의 모집단을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 암은 혈액암인, 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 혈액암은 B 세포 암인, 방법.
- 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 CD19+ 암인, 방법.
- 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 모집단은 상기 환자에 동종이계인, 방법.
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