CN112048482A - 一种nk样细胞的培养方法 - Google Patents

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吴迪
魏志辉
王翠花
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Abstract

本发明提供了一种NK样细胞的培养方法，所述方法包括以下步骤：(1)将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，得到NK样细胞；(2)将所述NK样细胞与人工抗原呈递细胞共培养；其中，所述RNP复合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。本发明将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，使得基因编辑系统转入原代T细胞中进行高效的基因编辑，将所述NK样细胞与人工抗原呈递细胞共培养，可以在2周内快速获得大量高纯度的NK样细胞，制备得到具有显著增强的杀伤作用的NK样细胞。

Description

一种NK样细胞的培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种NK样细胞的培养方法。
背景技术
近年来细胞免疫疗法在癌症治疗中展现出了巨大的潜力，被认为是最有希望攻克癌症的方法，其中，基于T细胞的免疫治疗技术受到了广泛关注，是目前的研究热点。为了克服主要组织相容性复合体(MHC)的限制性，研究人员研究T细胞的激活分化机制，尝试对其进行基因改造。Li等人将小鼠T细胞重编程成为NK样细胞(induced T-to-natural killercells，ITNK细胞)(Li,P.et al.Reprogramming of T cells to natural killer-likecells upon Bcl11b deletion.Science329,85-89(2010).)，并于近年采用CRISPR/Cas9技术成功地将人T细胞重编程成为ITNK细胞。
NK样细胞具有T细胞和NK细胞的双重功能，相较于T细胞或NK细胞具有显著提高的肿瘤杀伤功能。而将NK样细胞应用于免疫治疗的一大障碍是难以生产大量功能完全的NK样细胞，同时缺少体外扩增NK样细胞的标准方法。
目前常用的NK细胞的培养方法包括血液细胞分离法、细胞因子或化学药品刺激法和饲养细胞法，但是这些方法普遍存在着操作繁琐、成本高、周期长、数量无法满足需求的问题，且不十分适用于NK样细胞的培养。
因此，有必要根据NK样细胞的特有属性，建立一种简单高效的NK样细胞培养方法，以期在短期内获得大量的NK样细胞。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种NK样细胞的培养方法，所述方法将具有基因编辑功能的RNP复合物电转入激活的T细胞中，制备NK样细胞，并采用人工抗原呈递细胞作为饲养细胞培养NK样细胞，显著提高了NK样细胞的数量和寿命。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种NK样细胞的培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，得到NK样细胞；
(2)将所述NK样细胞与人工抗原呈递细胞共培养；
其中，所述RNP复合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。
本发明中，将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，保证了基因编辑系统高效转入原代T细胞中，获得了具有T细胞和NK细胞双重功能的NK样细胞，将所述NK样细胞与人工抗原呈递细胞共培养，实现了快速稳定培养出临床级别数量的NK样细胞的效果。
优选地，所述T细胞来源于外周血和/或脐带血。
优选地，所述活化的T细胞采用抗人CD3抗体和抗人CD28抗体进行。
优选地，所述抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的摩尔比为(1～5):1，例如可以是1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。
本发明中，摩尔比为(1～5):1的抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的组合对T细胞的活化效果最好，有利于促进RNP复合物导入T细胞中并降低电转操作对T细胞的毒性，低于或高于(1～5):1比例的抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的组合不能实现对T细胞的充分活化。
优选地，所述crRNA包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
SEQ ID NO:1：gaagcagtgtggcggcagctgttttagagcta。
优选地，所述tracrRNA包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
SEQ ID NO:2：tagcaagttaaaataaggctagtcatttatcacattgaaaatctggcaccgagtcggtg。
优选地，所述电转的电压为800～2500V，例如可以是800V、1000V、1100V、1200V、1300V、1400V、1500V、1600V、1700V、1800V、1900V、2000V、2100V、2200V、2300V、2400V或2500V。
优选地，所述电转的时间为1～8ms，例如可以是1ms、2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms或8ms。
优选地，对于2mm电击杯，所述电转的电压为1000～2000V，时间为1～4ms。
优选地，所述人工抗原呈递细胞包括表达IL-15的K562细胞、表达OX40L的K562细胞或表达IL-15和OX40L的K562细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为表达IL-15和OX40L的K562细胞。
优选地，所述人工抗原递呈细胞经γ射线或丝裂霉素C处理。
优选地，所述γ射线的强度为100～200Gy，例如可以是100Gy、110Gy、120Gy、130Gy、140Gy、150Gy、160Gy、170Gy、180Gy、190Gy或200Gy。
优选地，所述丝裂霉素C的浓度为10～20μg/mL，例如可以是10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL。
优选地，所述NK样细胞与所述人工抗原呈递细胞的数量比为1:(0.1～10)，例如可以是1:0.1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
优选地，所述共培养的时间为3～14天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
本发明中，采用表达IL-15和/或OX40L的工程化K562细胞作为饲养细胞与NK样细胞共培养3～14天，可以在2周内快速获得大量高纯度的NK样细胞，且所述NK样细胞保持着较强的杀瘤活性，有效避免了NK样细胞的过度培养。
作为优选技术方案，本发明提供了一种NK样细胞的培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从外周血和/或脐带血中分离单个核细胞并分选得到T细胞，采用摩尔比为(1～5):1的抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的组合活化T细胞；
(2)将靶向Bcl11b基因的RNP复合物在电压为1000～2000V的条件下电转入活化的T细胞，所述电转的时间为1～4ms；
(3)将电转后的细胞与人工抗原呈递细胞按照1:(0.1～10)的比例共培养3～14天，所述人工抗原递呈细胞预先经100～200Gyγ射线或10～20μg/mL丝裂霉素C处理。
第二方面，本发明提供了一种NK样细胞，所述NK样细胞采用第一方面所述的方法培养得到。
第三方面，本发明提供了第二方面所述的NK样细胞在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括实体瘤和/或血液肿瘤。
优选地，所述实体瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述血液肿瘤包括急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤或浆细胞样树突细胞肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，使得基因编辑系统转入原代T细胞中进行高效的基因编辑，显著降低了细胞毒性，将所述NK样细胞与人工抗原呈递细胞共培养，可以在2周内快速获得大量高纯度的NK样细胞，且所述NK样细胞保持着较强的杀瘤活性，有效避免了NK样细胞的过度培养；
(2)本发明制备得到高纯度的识别杀伤肿瘤细胞的NK样细胞，体外杀伤作用稳定、寿命长，较T细胞和NK细胞具有显著提高的细胞杀伤功能。
附图说明
图1为不同细胞的体外杀伤作用；
图2为NK样细胞的功能稳定性分析。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1RNP复合物的制备
根据Bcl11b基因设计crRNA(SEQ ID NO:1)和tracrRNA(SEQ ID NO:2)，进行基因合成，将crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白按照1:2:2的比例混匀，采用OPTI-MEMTM配制得到浓度为40μM RNP混合溶液，待用。
实施例2人工抗原递呈细胞的制备
将IL-15和OX40L的编码基因采用T2A连接，构建融合基因，全基因合成后在融合基因的两端添加EcoRI和SalI酶切位点；合成的融合基因经过EcoRI和SalI酶切后，克隆入pFastBac1质粒；
将野生型K562细胞重悬于10mL Opti-MEM中，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL缓冲液中，加入重组质粒，进行电转，电转结束后进行puromycin筛选，得到稳定表达IL-15和OX40L的K562细胞。
实施例3NK样细胞的培养
(1)采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，分选出来的T细胞采用T细胞培养基稀释至细胞浓度为2.5×106个/mL；
(2)将4mL T细胞接种于培养皿中，加入100ng/mL抗人CD3抗体和100ng/mL抗人CD28抗体的组合进行活化；
(3)3天后，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min，用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL Opti-MEM中，加入浓度为40μM的RNP复合物，混匀后转移至电Lonza电击杯，将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，设定电转的电压为800V，时间为4ms；
(4)将电转后的细胞与1×107个表达IL-15和OX40L的K562细胞共培养3天，得到NK样细胞。
实施例4NK样细胞的制备
(1)采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，分选出来的T细胞采用T细胞培养基稀释至细胞浓度为2.5×106个/mL；
(2)将4mL T细胞接种于培养皿中，加入200ng/mL抗人CD3抗体和100ng/mL抗人CD28抗体的组合进行活化；
(3)3天后，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min，用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL Opti-MEM中，加入浓度为40μM的RNP复合物，混匀后转移至电Lonza电击杯，将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，设定电转的电压为1000V，时间为4ms；
(3)将电转后的细胞与1×106个表达IL-15和OX40L的K562细胞共培养5天，得到NK样细胞。
实施例5NK样细胞的制备
(1)采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，分选出来的T细胞采用T细胞培养基稀释至细胞浓度为2.5×106个/mL；
(2)将4mL T细胞接种于培养皿中，加入300ng/mL抗人CD3抗体和100ng/mL抗人CD28抗体的组合进行活化；
(3)3天后，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min，用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL Opti-MEM中，加入浓度40μM的RNP复合物，混匀后转移至电Lonza电击杯，将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，设定电转的电压为1200V，时间为3ms；
(4)将电转后的细胞与5×107个表达IL-15和OX40L的K562细胞共培养7天，得到NK样细胞。
实施例6NK样细胞的制备
(1)采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，分选出来的T细胞采用T细胞培养基稀释至细胞浓度为2.5×106个/mL；
(2)将4mL T细胞接种于培养皿中，加入400ng/mL抗人CD3抗体和100ng/mL抗人CD28抗体的组合进行活化；
(3)5天后，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min，用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL Opti-MEM中，加入浓度为40μM的RNP复合物，混匀后转移至电Lonza电击杯，将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，设定电转的电压为2000V，时间为1ms；
(4)将电转后的细胞与8×107个表达IL-15和OX40L的K562细胞共培养10天，得到NK样细胞。
实施例7NK样细胞的制备
(1)采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，分选出来的T细胞采用T细胞培养基稀释至细胞浓度为2.5×106个/mL；
(2)将4mL T细胞接种于培养皿中，加入500ng/mL抗人CD3抗体和100ng/mL抗人CD28抗体的组合进行活化；
(3)6天后，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min，用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL Opti-MEM中，加入浓度为40μM的RNP复合物，混匀后转移至电Lonza电击杯，将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，设定电转的电压为2000V，时间为2ms；
(4)将电转后的细胞与1×108个表达IL-15和OX40L的K562细胞共培养14天，得到NK样细胞。
对比例1
与实施例3相比，对比例1的T细胞未经抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的活化直接电转RNP复合物，其他条件与实施例3相同。
对比例2
与实施例3相比，对比例2的NK样细胞不与表达IL-15和OX40L的K562细胞共培养，而是接种于培养基中，其他条件与实施例3相同。
对比例3
与实施例3相比，对比例3向活化的T细胞中不电转RNP复合物，作为空白对照，其他条件与实施例3相同。
NK样细胞的杀伤作用
将实施例3～7、对比例1～3的NK样细胞、T细胞和NK细胞分别与5×103个卵巢癌细胞系SKOV3共培养于U型96孔板中，效应细胞与靶标细胞的比例(E:T)为4:1，每组实验重复3次；
经过18小时的共培养后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较不同实施例和对比例的NK样对KG1的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图1所示，实施例制备的NK样细胞的体外杀伤效率高于对比例制备的NK样细胞、T细胞和NK细胞；对比例1～2由于条件不合理，影响了NK样细胞的杀伤效率。
NK样细胞的功能稳定性
将实施例4的NK样细胞与表达IL-15和OX40L的K562细胞继续共培养1个月，每隔5天收集细胞，检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。
结果如图2所示，一个月时间内，NK样细胞基本可以保持稳定的杀伤能力，与人工抗原递呈细胞细胞共培养15天后，细胞表现出一定程度的耗竭，具体表现为细胞体积缩小、部分细胞出现凋亡现象，可能是由于人工抗原呈递细胞对NK样细胞扩增的过度促进，因此，将NK样细胞与表达IL-15和OX40L的K562培养约14天后，可以去除人工抗原呈递细胞，采用基础培养基培养。
综上所述，本发明将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，使得基因编辑系统转入原代T细胞中进行高效的基因编辑，显著降低了细胞毒性，将所述NK样细胞与人工抗原呈递细胞共培养，可以在2周内快速获得大量高纯度的NK样细胞，制备得到具有显著增强的杀伤作用的NK样细胞。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种NK样细胞的培养方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaagcagtgt ggcggcagct gttttagagc ta 32
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagcaagtta aaataaggct agtcatttat cacattgaaa atctggcacc gagtcggtg 59

Claims (10)

1.一种NK样细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将靶向Bcl11b基因的RNP复合物电转入活化的T细胞，得到NK样细胞；
(2)将所述NK样细胞与人工抗原呈递细胞共培养；
其中，所述RNP复合物包括靶向Bcl11b基因的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T细胞来源于外周血和/或脐带血。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述活化的T细胞采用抗人CD3抗体和抗人CD28抗体进行；
优选地，所述抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的摩尔比为(1～5):1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述crRNA包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
优选地，所述tracrRNA包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述电转的电压为800～2500V；
优选地，所述电转的时间为1～8ms；
优选地，对于2mm电击杯，所述电转的电压为1000～2000V，时间为1～4ms。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述人工抗原呈递细胞包括表达IL-15的K562细胞、表达OX40L的K562细胞或表达IL-15和OX40L的K562细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述人工抗原递呈细胞经γ射线或丝裂霉素C处理；
优选地，所述γ射线的强度为100～200Gy；
优选地，所述丝裂霉素C的浓度为10～20μg/mL。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述NK样细胞与所述人工抗原呈递细胞的数量比为1:(0.1～10)；
优选地，所述共培养的时间为3～14天。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)从外周血和/或脐带血中分离单个核细胞并分选得到T细胞，采用摩尔比为(1～5):1的抗人CD3抗体和抗人CD28抗体的组合活化T细胞；
(2)将靶向Bcl11b基因的RNP复合物在电压为1000～2000V的条件下电转入活化的T细胞，所述电转的时间为1～4ms；
(3)将电转后的细胞与人工抗原呈递细胞按照1:(0.1～10)的比例共培养3～14天，所述人工抗原递呈细胞预先经100～200Gyγ射线或10～20μg/mL丝裂霉素C处理。
9.一种NK样细胞，其特征在于，所述NK样细胞采用权利要求1-8任一项所述的方法培养得到。
10.权利要求9所述的NK样细胞在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括实体瘤和/或血液肿瘤；
优选地，所述实体瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述血液肿瘤包括急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤或浆细胞样树突细胞肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
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