CN111801104A - Car-t细胞的封闭系统制造过程 - Google Patents

Abstract

本文提供的一些实施方式涉及用于制备基因修饰T细胞的方法和组合物。在一些此类实施方式中，以单个无血清体积培养CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中，可用慢病毒载体转导共培养的CD4+和CD8+T细胞，并且可在比其他常规方法更短的时间内收获经转导的T细胞的群体。

Description

CAR-T细胞的封闭系统制造过程

相关的申请

本申请要求2018年2月6日提交的名称为“CAR-T细胞的封闭系统制造过程”的美国临时申请No.62/627,129的优先权，以引用的方式将其整体明确地并入本文。

技术领域

本文提供的一些实施方式涉及用于制备基因修饰T细胞的方法和组合物。在一些此类实施方式中，以单个无血清体积(single serum-free volume)培养CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中，用慢病毒载体转导共培养的CD4+和CD8+T细胞，并且与常规方法相比，在更短的时间内收获经转导的T细胞的群体。

背景技术

细胞的基因修饰已用于许多领域，例如研究、医学、工业生物技术和农业。存在多种用于将基因插入宿主基因组中的可用技术。例如，可通过细胞的核被膜而将核酸直接注射到细胞核中，或使用病毒载体将核酸给予至细胞以产生基因修饰细胞。

用病毒载体进行的转染是在称为病毒转导的技术中产生基因修饰细胞(例如T细胞)的常用技术。使用诸如慢病毒或腺病毒的病毒作为载体将核酸引入细胞。

病毒转导可用于使用质粒在细胞(例如哺乳动物细胞)中插入或修饰基因。病毒转导中使用的质粒包含侧翼为病毒序列的待转移的基因，所述病毒序列被病毒蛋白质用来识别病毒基因组并将其包装成病毒颗粒。该质粒与可能携带形成感染性病毒粒子所需的病毒基因的其他DNA构建体一起插入细胞。由这些包装构建体表达的病毒蛋白可结合待转移并插入病毒颗粒中的DNA/RNA上的序列。通常，出于安全原因，所使用的质粒均不包含病毒形成所需的所有序列，因此需要同时转染多个质粒以获得感染性病毒粒子。而且，仅携带有待转移序列的质粒包含允许将遗传物质包装在病毒粒子中的信号，从而使得编码病毒蛋白的基因都不会被包装。然后将从这些细胞收集的病毒应用于待改变的细胞。这些感染的初始阶段模拟天然病毒的感染，并引起经转移的基因的表达以及(在慢病毒/逆转录病毒载体的情况中)待转移的DNA向细胞基因组中的插入。然而，由于经转移的遗传物质不编码任何病毒基因，因此这些感染不会产生新病毒。

发明内容

本文描述的一些实施方式涉及比起常规方式，以最少的物理操作并在更短的时间段内制备经慢病毒修饰的T细胞的方法。在一些实施方式中，将T细胞的CD4和CD8亚群置于由基础培养基、蛋白质补充剂和细胞因子混合物制成的独特(unique)培养基组合物中的共培养物中。也可在该体系中通过磁性地富集T细胞并将转导混合物在原位与细胞孵育确定或选定的时间进行慢病毒修饰。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括制造基因修饰T细胞的方法。在一些实施方式中，基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。一些此类方法可包括在单个培养容器中的第一培养基中提供CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞；将第二培养基放入单个培养容器中，从而产生共培养的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，对它们进行起始处理(initiated)以用于转导；收获经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞；并用载体转导经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，从而产生基因修饰T细胞。在一些实施方式中，即任选地，该方法在生物安全柜(BSC)中进行，并且在某些情况下，载体为病毒载体。在一些实施例中，该方法在生物安全柜(BSC)的外部进行。在一些替代方式中，载体为慢病毒载体、腺相关载体或腺病毒载体。优选地，通过如下进行转导：例如在CTS Dynabeads CD3/CD28上磁性地富集经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞，以及将转导混合物与经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞一起孵育确定的时间段。在一些替代方式中，在将转导介质添加到细胞之前，从培养容器中移去培养基。在一些替代方式中，确定的时间段处于约1小时至约24小时、约2小时至约12小时或约2小时至约5小时的范围内。在一些替代方式中，在确定的时间段结束时，将移去的培养基重新引入到容器中。在一些替代方式中，转导混合物包含载体。在这些方法中，第一培养基优选为无细胞因子的培养基，并且第二培养基优选包含至少一种细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15或IL-21或其任意组合)。在一些情况下，至少一种细胞因子为IL-15、IL-21或IL-7。优选地，在这些方法中，转导步骤在经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞的起始处理步骤之后24小时进行。在一些替代方式中，第一和/或第二培养基还包含蛋白质补充剂，并且在某些情况下，转导混合物还包含硫酸鱼精蛋白或白介素或两者。在一些替代方式中，转导混合物还包含硫酸鱼精蛋白或聚凝胺或两者。在一些替代方式中，转导混合物包含IL-2、IL-21、IL-15或IL-7或其任意组合。优选地，通过使用这些方法，在转导步骤后3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或由上述任意两个时间段定义的范围内的任意天数收获基因修饰CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些替代方式中，载体包含编码用于治疗的蛋白的核酸，并且用于治疗的蛋白理想地包括细胞因子、嵌合细胞因子/共刺激蛋白、促炎蛋白或抗炎蛋白。优选地，在这些方法中，载体包含编码嵌合抗原受体的核酸，并且在一些替代方式中，进一步用核酸酶修饰经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞。在某些此类方法中，核酸酶为锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、RNA引导的核酸内切酶或经工程化的大范围核酸酶再工程化的归巢核酸内切酶。另外，在一些情况下，嵌合抗原受体包含T细胞受体的信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域或胞内结构域或所有这些结构域。优选地，这些方法产生表达嵌合抗原受体(CAR)(例如对与CD19的结合或相互作用而言特异性的CAR)的基因修饰T细胞，并且通过一些方式，载体进一步包含编码遗传学标签(例如，EGFRt)的第二核酸。在一些替代方式中，在单个容器内制造基因修饰T细胞(例如CD4和CD8 T细胞)的过程可在3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天进行，或进行由上述任意两个时间段定义的时间范围内的时间。在一些替代方式中，至少一种细胞因子为IL-7、IL-15或IL-21。在一些替代方式中，至少一种细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。

在第二方面，提供了制造基因修饰T细胞的方法，其中，所述基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体。该方法包括：a)在第一培养基的两个分开的部分中提供CD8+T细胞和CD4+T细胞；b)向第一培养基的分开的部分中提供至少一种细胞因子，其中，分开的部分包括在第一部分中的CD8+T细胞和在第二部分中的CD4+T细胞；c)将含有CD8+T细胞和CD4+T细胞的第一部分和第二部分合并，从而产生合并的细胞部分；d)向合并的细胞部分提供Dynabeads(例如CTS Dynabeads CD3/CD28)，并磁性地富集CD4+T细胞和CD8+T细胞；e)移去Dynabeads；f)将含有CD4+和CD8+细胞的合并的细胞部分加入单个培养容器中；g)提供包含细胞因子的混合物的第二培养基，其中，所述混合物包含至少一种细胞因子，从而产生合并的经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞；h)用载体转导合并的经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞，从而产生基因修饰T细胞；以及i)收获细胞。在一些替代方式中，步骤b)的至少一种细胞因子为IL-7、IL-15或IL-21或其任意组合。在一些替代方式中，IL-21、IL-15和IL-7的比例为10:5:1。在一些替代方式中，步骤g)的至少一种细胞因子为IL-21、IL-15或IL-7或其任意组合。在一些替代方式中，IL-21、IL-15和IL-7的比例为2:0.2:1。

附图说明

图1示出了可用于产生基因修饰T细胞的一些实施方式中的G-Rex100MCS容器。

图2描绘了用于制备基因修饰T细胞的方法的示例性实施方式。

具体实施方式

本文提供的一些实施方式涉及用于制备基因修饰T细胞的方法和组合物。在一些此类实施方式中，以单个无血清体积培养CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中，用慢病毒载体转导共培养的CD4+和CD8+T细胞，并且与常规方法相比，在更短的时间内收获经转导的T细胞的群体。

当前生产用于治疗的基因修饰细胞的工艺可能是昂贵的，并且用于生产这些细胞的可商购的产品的估价可能在$20,000至$40,000的范围内。细胞的生产也是困难且劳动密集的，其需要在无菌条件下对细胞进行连续监测和喂养，以及在可商购的细胞培养袋(例如，Gibco细胞培养袋、Miltenyi细胞培养袋)中使细胞生长的不明确的技术。制备基因修饰细胞的过程也可能很耗时，其中，在密切监视下使产物生长约14-21天或更长时间，这可能会限制同时产生的产物的数量。总体而言，该方法是制备用于治疗的基因修饰细胞的费时且劳动密集的方法。本文提供的一些实施方式包括具有“开放过程步骤”的过程，其中，每个房间有单个患者或有单个载体，并且有生物安全柜(BSC；也称为生物学安全柜)和离心机。

本文提供的方法的一些实施方式涉及经转导的CD4和CD8 T细胞的有效转导和生长。在一些实施方式中，经转导的T细胞含有治疗性有效载荷，例如嵌合抗原受体。在一些此类实施方式中，T细胞的群体可用于自体输血。在一些实施方式中，经转导的细胞的生长足够有效用以提供处于足以在少于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天内治疗受试者的量的经转导的T细胞的群体。在一些实施方式中，足以治疗受试者的量可包括从约200万细胞至约20亿细胞、从约1000万细胞至约10亿细胞、从约5000万细胞至约10亿细胞、从约5亿细胞至约10亿细胞、或在由上述任意两个量定义的范围内的量的细胞的经转导的CD4+和CD8+T细胞的群体。在一些实施方式中，来自受试者的CD4+和CD8+T细胞在单个容器中以单个体积培养。在一些实施方式中，生长培养基是无血清的。在一些实施方式中，生长培养基补充有至少一种细胞因子。在一些实施方式中，生长培养基补充有IL-21、IL-15和IL-7。

在一些实施方式中，在单个容器内制备基因修饰T细胞，例如CD4和CD8 T细胞。在一些替代方式中，在单个容器内制造基因修饰T细胞(例如CD4和CD8 T细胞)的过程可在3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天内进行，或进行由上述任意两个时间段定义的时间范围内的时间。在独特培养基的存在下共同培养两种细胞类型使得能够在单个容器中、优选在7天内完成培养，而使用常规技术，随着两个亚群分别在两个容器中生长，培养需要进行14-21天或更多天(例如，超过一个月)。使用本文描述的实施方式的原位转导比常规方式更简单和快速，并且允许整个过程用最少的设备并且以完全封闭的系统的形式进行。

图2描述了用于从受试者制备基因修饰T细胞的方法或系统的示例性实施方式。如图2所示，在第X天，受试者经历单采血液分离术以获得T细胞，选择并分选CD4+和CD8+T细胞，并储存在液氮库中。在第0天，通过在GRex容器中进行培养来起始处理储存的T细胞。在第2天，用慢病毒载体转导经起始处理的细胞。在第7天，将经转导的细胞收获，并可进行储存。

术语

当根据说明书阅读时，应当对本文公开内容中的术语赋予其普通和常见的含义。基于整个说明书，本领域技术人员将理解所使用的术语。

如本文所使用的，“一个/一种”(a和an)可表示一个或多于一个。

如本文所使用的，术语“约”表示包括用于确定值的方法的误差的固有变化、或实验之间存在的变化的值。

如本文所述，当根据说明书阅读时，“基因修饰”和“基因修饰的”具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于例如修饰生物体或细胞(例如具有遗传物质如核酸的细菌、T细胞、细菌细胞、真核细胞、昆虫、植物或哺乳动物，将所述遗传物质使用基因工程技术进行改变)的工艺。例如，可以通过如下将核酸(例如DNA)插入宿主基因组中：首先使用分子克隆方法分离并复制感兴趣的遗传物质以生成DNA序列，或者通过合成DNA，然后将该构建体插入宿主生物体。也可使用核酸酶去除或“敲除”基因。基因靶向是使用同源重组来改变内源基因的不同的技术，并可用于删除基因、去除外显子、添加基因或引入点突变。

本文描述了通过转导进行的基因修饰。“转导”是指通过载体将遗传物质(例如DNA或RNA)转移至细胞的方法。常用技术使用病毒载体、电穿孔和化学试剂来提高细胞通透性。可通过病毒或病毒载体转移DNA。本文描述的是用于修饰免疫CD4+和/或CD8+T细胞的方法。例如，为了实现治疗基因的高表达和/或增加细胞表面上的嵌合抗原受体的量，用编码蛋白质或嵌合抗原受体的遗传物质转导T细胞。例如，可使用病毒对T细胞进行基因修饰。例如，通常用于基因治疗的病毒为腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒。

已经开发了多种转导技术，其利用重组感染性病毒颗粒来递送编码嵌合抗原受体的核酸。这代表了目前优选的T淋巴细胞转导的方式。如本文所述，用于转导的病毒载体可包括衍生自猴病毒40、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体或逆转录病毒的病毒载体。因此，基因转移和表达方法很多，但实质上发挥了在哺乳动物细胞中引入和表达遗传物质的作用。上述技术中的多种可用于转导造血或淋巴样细胞，包括：磷酸钙转染、原生质体融合、电穿孔，或者用重组腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或逆转录病毒载体感染。通过电穿孔以及逆转录病毒或慢病毒感染已成功转导了原代T淋巴细胞。如此，逆转录病毒和慢病毒载体提供了将基因转移到真核细胞(例如T细胞)的高效的方式。而且，逆转录病毒或慢病毒整合以受控的方式发生，并引起每个细胞稳定整合一个或数个新的遗传信息的拷贝。如本文所述，可原位转导细胞。

当根据说明书阅读时，“表达载体”或“载体”具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常置于启动子的控制之下，并且据说这一基因“可操作地连接至”与启动子。类似地，如果调节元件调控核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子可操作地连接。

病毒载体可具有调节元件以提供异源核酸在细胞中的表达。载体包括但不限于质粒、微环、酵母和病毒基因组。在一些替代方式中，载体为质粒、微环、病毒载体、DNA或mRNA。在一些替代方式中，载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些替代方式中，载体为慢病毒载体。

当根据说明书阅读时，“旋转接种”具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如细胞培养物的离心接种。

当根据说明书阅读时，“培养基”具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如设计用于支持微生物或细胞的生长的固体或液体或半固体。不同类型的培养基用于使不同类型的细胞生长，在某些情况下，可将其称为基础培养基。在本文的一些替代方式中，补充培养基以支持单个容器(例如G-Rex100MCS(图1))中的含有CD4和CD8的细胞的生长。基础培养基可包括商业化产品，例如XVIVO-15(由Lonza提供)或PRIME-XV(由IrvineScientific提供)。单个容器可为透气的，并且可包括柔性培养基底。对于此类的容器，实际上有无限的营养物/废物储存库。该容器具有带纹理的支撑，产生高的培养表面的再现性。该系统为完全封闭系统兼容的。期望地，实际上没有培养维护，其中许多处理步骤可在容器内进行，从而最少化总的操作。此外，一周内可产生超过20亿细胞，与培养袋相比，留下的废物痕迹更少。

当根据说明书阅读时，“生物安全柜”(BSC)具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如，用于安全处理受需要确定的生物安全水平的病原体污染(可能受病原体污染)的物质的密闭、通风的实验室工作区。根据所需的生物防护程度来区分，存在几种不同类型的BSC。在BSC中工作的方案是本领域技术人员已知的，并且是可商购的(例如，ThermoScientific生物安全柜)。

当根据说明书阅读时，“蛋白质补充剂”具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如用于添加到细胞生长培养基中的可商购的蛋白质混合物。蛋白质补充剂可由商业公司提供，例如Knockout-SR(由ThermoFisher Scientific提供)或胎牛血清。

当根据说明书阅读时，“核酸酶”或“核酸内切酶”具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如被配置为切割核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。在一些替代方式中，将编码核酸酶的多核苷酸提供至细胞以用于细胞的基因修饰。不受限制地，核酸内切酶的实例可包括，例如CRISPR酶或限制性核酸内切酶。在本文的一些替代方式中，可在用病毒载体转导之前通过核酸酶对细胞进行基因修饰。

当根据说明书阅读时，“限制性酶”或“限制性核酸内切酶”具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如在特异性识别核苷酸序列处或附近识别并结合DNA以使其可在限制性切割位点切割的酶。在一些替代方式中，核酸内切酶识别位点对限制性核酸内切酶是特异性的。

当根据说明书阅读时，“转录激活因子样效应物核酸酶”(TALENS)具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如通过将Tal效应物DNA结合结构域融合至DNA切割结构域而产生的人工限制性酶。Tal效应物为细菌DNA结合蛋白，由高度同源的34个氨基酸模块组成，该模块能够以高亲和力结合一个核苷酸。TALENS模块的第12和第13个可变氨基酸(称为重复可变的二核苷酸)赋予碱基特异性(例如NN→G/A、NI→A、NG→T、NK→G、HD→C、以及NS→A/T/C/G)，并且靶向期望的核苷酸序列的TALEN阵列可通过组装单独的模块来生成。氨基酸序列与DNA识别元件之间的关系允许通过选择与相关的重复可变的双残基(RVD)接触的重复片段的组合来对特定的DNA结合结构域进行工程化。TALENS可用于通过诱导感兴趣的细胞中的双链断裂(DSB)来编辑基因组，其中，细胞通过调用数种类型的修复机制而应答。

当根据说明书阅读时，“锌指蛋白”(ZFP)具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如真核DNA结合蛋白。例如，用于基因组编辑的最常见的ZFP基序为Cys2-His2指，并且每种类型对于核苷酸三联体而言都是特异性的。可通过单个锌指的组装来生成人工ZFP结构域，以靶向通常为9-18nt长的特定DNA序列。术语“Designer锌指蛋白”是指具有有目的地再工程化的DNA结合特异性的锌指蛋白，可提供将功能结构域靶向至许多类型细胞中几乎所有感兴趣的基因的广泛适用的技术。锌指核酸酶(ZFN)是用于在人类的多种细胞类型中进行靶向的基因组操作的功能强大的工具。ZFN由与非特异性核酸内切酶结构域连接的经工程化的DNA结合锌指结构域组成，并可引入刺激同源和非同源重组的双链断裂(DSB)，然后可利用其进行基因组操作。就其而言，ZFP在研究和基因治疗应用中都有潜力。

当根据说明书阅读时，成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)具有其普通且常见的含义，并且可包括但不限于，例如可包含碱基序列的短重复的DNA位点，其中每次重复之后是来自病毒暴露的间隔DNA的短片段。CRISPR区域可与编码CRISPR相关的蛋白质的cas基因相关联。CRISPR/Cas系统为原核免疫系统，可赋予对外源遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性，并提供获得性免疫的一种形式。CRISPR间隔区以类似于真核生物体中的RNAi的方式识别和切割这些外源遗传元件。作为基因组编辑机制，可将RNA引导的核酸内切酶、Cas蛋白和适当的向导RNA递送到细胞中，并可在期望的位置切割生物体的基因组。CRISPRS为靶向/修饰基因的有效机制。

当根据说明书阅读时，“MegaTal”核酸酶具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，例如杂交核酸酶构造，其将TAL效应物的可工程性与大范围核酸酶(mn)切割结构域的切割序列特异性相结合。MegaTal的构造允许生成与病毒和非病毒细胞递送方法兼容的活性和特异性核酸酶。

当根据说明书阅读时，“嵌合抗原受体”(CAR)具有其普通和常见的含义，并且可包括但不限于，嵌合T细胞受体、人工T细胞受体或基因工程受体。这些受体可用于将单克隆抗体或其结合部分的特异性移植到期望的细胞(例如T细胞)上。通常，使用逆转录病毒载体完成CAR的编码序列向受体细胞的转移。CAR的结构可包含源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，其与CD3-ζ跨膜区和胞内域融合。此类分子响应于其靶标的scFv识别而引起ζ信号的传输。

当根据说明书阅读时，“CD19”具有其普通且常见的含义，并且可包括但不限于在白细胞表面上发现并可与B淋巴细胞的抗原受体组装在一起以降低抗原受体依赖性刺激的阈值的蛋白质。CD19在滤泡树突状细胞和B细胞上表达。CD19存在于在发育成B细胞胚细胞期间来自最早可识别的B谱系细胞的B细胞上，但在成熟为浆细胞时会丧失。CD19主要与CD21和CD81一起充当B细胞共受体。激活后，CD19的胞质尾变得磷酸化，从而引起由Src家族激酶结合并募集PI-3激酶。与在T细胞上一样，数个表面分子形成抗原受体并在B淋巴细胞上形成复合物。

总体而言，制备本文所述的基因修饰细胞的替代方法期望允许所有步骤在完全封闭的系统中进行，这允许在同一时间于同一空间内使用多个病毒构建体(例如慢病毒构建体)进行该过程以制备用于多个患者的产品，除了执行该过程所需的培养皿和管状用具外，没有额外的物理分离。这对设施和工作流程设计具有重要意义，从而可允许更有效地利用制造场地和员工。

此类方法可用于通过病毒转导生成荷载嵌合抗原的(CAR)T细胞。还可使细胞在本文所述的具体化的系统中经受其它操作或基因修饰，并且优选可通过慢病毒、腺相关病毒、腺病毒或逆转录病毒进行修饰。

制备基因修饰T细胞的某些方法

在一些替代方式中，提供了一种制造基因修饰T细胞的方法，其中，所述基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体，所述方法包括：在单个培养皿中的第一培养基中提供CD8+T细胞和CD4+T细胞；将第二培养基放入所述单个培养皿中，从而产生共培养的CD4+T细胞和CD8+T细胞，对所述细胞进行起始处理以用于转导；收获经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞；用载体转导经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞，从而产生基因修饰T细胞。在一些替代方式中，该方法在生物安全柜(BSC)中进行。在一些替代方式中，该方法在生物安全柜(BSC)的外部进行。在一些替代方式中，载体为病毒载体。在一些替代方式中，载体为慢病毒载体、腺相关载体或腺病毒载体。在一些替代方式中，通过如下进行转导：例如在CTS Dynabeads CD3/CD28上磁性地富集经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞，以及将转导混合物与经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞一起孵育确定的时间段。在一些替代方式中，在将转导介质添加到细胞之前，从培养容器中移去培养基。在一些替代方式中，确定的时间段在约1小时至约24小时、约2小时至约12小时或约2小时至约5小时的范围内。在一些替代方式中，在确定的时间段结束时，将移去的培养基重新引入到容器中。在一些替代方式中，转导混合物包含载体。在一些替代方式中，第一培养基为无细胞因子的培养基。在一些替代方式中，第二培养基包含至少一种细胞因子。在一些替代方式中，至少一种细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15或IL-21或其任意组合。在一些替代方式中，至少一种细胞因子为IL-21、IL-15和IL-7。在一些替代方式中，转导步骤在经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞的收获步骤之后24小时进行。在一些替代方式中，第一和/或第二培养基进一步包含蛋白质补充剂。在一些替代方式中，转导混合物进一步包含硫酸鱼精蛋白或聚凝胺或两者。在一些替代方式中，转导混合物进一步包含白介素。在一些替代方式中，转导混合物包含IL-2、IL-21、IL-15或IL-7或其任意组合。在一些替代方式中，在转导步骤后3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或由上述任意两个时间段定义的范围内的任意天数收获所述基因修饰CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些替代方式中，载体包含编码用于治疗的蛋白的核酸。在一些替代方式中，用于治疗的蛋白包括细胞因子、嵌合细胞因子/共刺激蛋白或促炎蛋白或抗炎蛋白。在一些替代方式中，载体包含编码嵌合抗原受体的核酸。在一些替代方式中，用核酸酶进一步修饰经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞。在某些替代方式中，核酸酶为锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、RNA引导的核酸内切酶或经工程化的大范围核酸酶再工程化的归巢核酸内切酶。在一些替代方式中，嵌合抗原受体包含T细胞受体的信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内结构域。在一些替代方式中，基因修饰T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，例如对与CD19的结合或相互作用而言特异性的CAR。在一些替代方式中，载体还包含编码遗传学标签的第二核酸。在一些替代方式中，遗传学标签为EGFRt。在一些替代方式中，在单个容器内制造基因修饰T细胞(例如CD4和CD8 T细胞)的过程可在3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天内进行，或进行由上述任意两个时间段定义的时间范围内的时间。在一些替代方式中，至少一种细胞因子为IL-7、IL-15或IL-21或其任意组合。在一些替代方式中，至少一种细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15和IL-21。

在一些替代方式中，提供了一种制造基因修饰T细胞的方法，其中，所述基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体，所述方法包括：a)在第一培养基的两个分开的部分中提供CD8+T细胞和CD4+T细胞；b)向第一培养基的分开的部分中提供至少一种细胞因子，其中，分开的部分包括在第一部分中的CD8+T细胞和在第二部分中的CD4+T细胞；c)将含有CD8+T细胞和CD4+T细胞的第一部分和第二部分合并，从而产生合并的细胞部分；d)向合并的细胞部分提供诸如Dynabeads(例如CTS Dynabeads CD3/CD28)的磁珠，并磁性地富集CD4+T细胞和CD8+T细胞；e)移去磁珠(例如Dynabeads)；f)将含有CD4+和CD8+细胞的合并的细胞部分加入单个培养容器中；g)提供包含细胞因子的混合物的第二培养基，其中，该混合物包含至少一种细胞因子，从而产生合并的经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞；h)用载体转导合并的经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞，从而产生基因修饰T细胞；以及i)收获细胞。在一些替代方式中，步骤b)的至少一种细胞因子为IL-7、IL-15和IL-21。在一些替代方式中，IL-21、IL-15和IL-7的比例为10:5:1。在一些替代方式中，步骤g)的至少一种细胞因子为IL-21、IL-15和IL-7。在一些替代方式中，IL-21、IL-15和IL-7的比例为2:0.2:1。在一些替代方式中，该方法在生物安全柜(BSC)中进行。在一些替代方式中，该方法在生物安全柜(BSC)的外部进行。在一些替代方式中，载体为病毒载体。在一些替代方式中，载体为慢病毒载体、腺相关载体或腺病毒载体。在一些替代方式中，通过如下进行转导：例如在CTS Dynabeads CD3/CD28上磁性地富集经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞，以及将转导混合物与经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞一起孵育确定的时间段。在一些替代方式中，转导混合物包含载体。在一些替代方式中，转导步骤在经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞的收获步骤之后24小时进行。在一些替代方式中，转导混合物进一步包含硫酸鱼精蛋白或聚凝胺或两者。在一些替代方式中，转导混合物进一步包含白介素。在一些替代方式中，转导混合物包含IL-2、IL-21、IL-15和/或IL-7。在一些替代方式中，在转导步骤后3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或由上述任意两个时间段定义的范围内的任意天数收获所述基因修饰CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些替代方式中，载体包含编码用于治疗的蛋白的核酸。在一些替代方式中，用于治疗的蛋白包括细胞因子、嵌合细胞因子/共刺激蛋白或促炎蛋白或抗炎蛋白。在一些替代方式中，载体包含编码嵌合抗原受体的核酸。在一些替代方式中，用核酸酶进一步修饰经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞。在某些替代方式中，核酸酶为锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、RNA引导的核酸内切酶或经工程化的大范围核酸酶再工程化的归巢核酸内切酶。在一些替代方式中，嵌合抗原受体包含T细胞受体的信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内结构域。在一些替代方式中，基因修饰T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些替代方式中，载体还包含编码遗传学标签的第二核酸。在一些替代方式中，遗传学标签为EGFRt。在一些替代方式中，在单个容器内制造基因修饰T细胞(例如CD4和CD8 T细胞)的过程可在3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天内进行，或进行由上述任意两个时间段定义的时间范围内的时间。

实施例

实施例1-在单个容器中的单列过程

在表1中提供了用于在单个容器中实施单列过程的示例性方案。

表1

实施例2-单个容器中的单列过程

在表2中提供了用于在单个容器中实施单列过程的示例方案。

表2

实施例3-与常规过程相比的单个容器中的单列过程

以与实施例1中所述的过程基本相似的方法，实施在单个容器中的单列过程。表3对单个容器中的单列过程(84121)与PLAT-02临床试验中使用的用于制备基因修饰T细胞的常规方法进行了比较。在PLAT-02方法中，将细胞在具有含胎牛血清(FBS)的培养基的袋中进行培养，并分别培养CD4和CD8群体。

表3

关于本文中的复数和/或单数术语的使用，为了适应上下文和/或应用，本领域技术人员可将复数转化为单数和/或将单数转化为复数。为了清楚起见，可在本文中明确地阐述各种单数/复数置换。

本领域技术人员将理解，通常，本文中、尤其是在所附权利要求中使用的术语(例如，所附权利要求的主体)通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包含/包括”应解释为“包含/包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含/包括”应解释为“包含/包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果打算要特定数量的引入的权利要求引述，则将在权利要求中明确地陈述这种意图，并且在没有这种陈述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附的权利要求可包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入权利要求的引述。然而，使用这样的短语不应该被解释为暗示由不定冠词“一个”或“一种”引入的权利要求引述将任何包含此类引入的权利要求引述的特定权利要求限制为仅包含一个此类叙述的实施方式，甚至当同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词例如“一个”或“一种”(例如，“一个”和/或“一种”应解释为意味着“至少一个”或“一个或多个”)；对于用于引入权利要求引述的定冠词的使用也是如此。另外，本领域技术人员将认识到，即使明确叙述了具体数量的引入的权利要求引述，这样的引述应被解释为意味着至少为所引述的数目(例如，没有其他修饰语的“两项引述”的光秃秃的引述是指至少两项引述、或两项或更多的引述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的那些情况下，通常这一结构旨在具有本领域技术人员可以理解该约定的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，一起具有A和B，一起具有A和C，一起具有B和C，和/或一起具有A、B和C等)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的约定的那些情况下，通常这一结构旨在具有本领域技术人员可以理解约定的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，一起具有A和B，一起具有A和C，一起具有B和C，和/或一起具有A、B和C等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，存在两个以上的替代术语的任何转折词和/或短语都应理解为考虑了包括这些术语中的一个、这些术语中的任一个、或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任何单个成员或成员亚组描述本公开内容。

第一方面至第二方面的实施方式的任何特征均适用于本文所说明的所有方面和实施方式。此外，第一方面或第二方面的实施方式的任何特征可以以任何方式与本文描述的其他实施方式独立地部分或完全地组合，例如，一个、两个或三个以上的实施方式可整体或部分组合。

Claims (41)

1.一种制造基因修饰T细胞的方法，其中，所述基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体，所述方法包括：

在单个培养容器中的第一培养基中提供CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞；

将第二培养基放入所述单个培养容器中，从而产生共培养的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，对所述细胞进行起始处理以用于转导；

收获经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞；以及

用载体转导所述经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，从而产生基因修饰T细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法在生物安全柜(BSC)中进行。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法在生物安全柜(BSC)的外部进行。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述载体为病毒载体。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述载体为慢病毒载体、腺相关载体或腺病毒载体。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，通过如下进行所述转导：例如在CTSDynabeads CD3/CD28上磁性地富集所述经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，以及将转导混合物与所述经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞一起孵育确定的时间段。

7.如权利要求6所述的方法，其中，在将转导介质添加至所述细胞之前，从所述培养容器中移去所述培养基。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述确定的时间段处于约1小时至约24小时、约2小时至约12小时或约2小时至约5小时的范围内。

9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，在所述确定的时间段结束时，将移去的所述培养基重新引入所述容器中。

10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中，所述转导混合物包含所述载体。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述第一培养基为无细胞因子的培养基或者缺少胎牛血清或小牛血清、或其任意组合。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述第二培养基包含至少一种细胞因子。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子为IL-21、IL-15和IL-7。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述转导步骤在所述经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的收获步骤之后24小时进行。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述第一培养基和/或第二培养基还包含蛋白补充剂。

17.如权利要求6-16中任一项所述的方法，其中，所述转导混合物进一步包含硫酸鱼精蛋白或聚凝胺或两者。

18.如权利要求6-17中任一项所述的方法，其中，所述转导混合物进一步包含白介素。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述转导混合物包含IL-2、IL-21、IL-15或IL-7或其任意组合。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，在所述转导步骤后3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或由上述任意两个时间段定义的范围内的任意天数收获基因修饰CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述载体包含编码用于治疗的蛋白的核酸。

22.如权利要求21所述的方法，其中，所述用于治疗的蛋白包括细胞因子、嵌合细胞因子/共刺激蛋白、或者促炎蛋白或抗炎蛋白或其任意组合。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述载体包含编码嵌合抗原受体的核酸。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，进一步用核酸酶修饰所述经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞。

25.如权利要求24所述的方法，其中，所述核酸酶为锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、RNA引导的核酸内切酶或经工程化的大范围核酸酶再工程化的归巢核酸内切酶。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体包含T细胞受体的信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内结构域。

27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中，所述基因修饰T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，例如对与CD19的结合或相互作用而言特异性的CAR。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述载体进一步包含编码遗传学标签的第二核酸。

29.如权利要求28所述的方法，其中，所述遗传学标签为截短的表皮生长因子受体(EGFRt)。

30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，在单个容器内制造基因修饰T细胞、例如CD4和CD8 T细胞的过程可在3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天内进行，或进行由上述任意两个时间段定义的时间范围内的时间。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子为IL-7、IL-15或IL-21或其任意组合。

32.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述至少一种细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15和IL-21。

33.一种制造基因修饰T细胞的方法，其中，所述基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体，所述方法包括：

(a)在第一培养基的两个分开的部分中提供CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞；

(b)向所述第一培养基的分开的部分中提供至少一种细胞因子，其中，所述分开的部分包括在第一部分中的CD8⁺T细胞和在第二部分中的CD4⁺T细胞；

(c)将含有CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的所述第一部分和第二部分合并，从而产生合并的细胞部分；

(d)向合并的细胞部分提供诸如Dynabeads(例如CTSDynabeads CD3/CD28)的磁珠，并磁性地富集所述CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞；

(e)移去磁珠，例如Dynabeads；

(f)将含有CD4⁺细胞和CD8⁺细胞的所述合并的细胞部分加入单个培养容器中；

(g)提供包含细胞因子的混合物的第二培养基，其中，所述混合物包含至少一种细胞因子，从而产生合并的经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞；

(h)用载体转导所述合并的经初起处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，从而产生基因修饰T细胞；以及

(i)收获所述细胞。

34.如权利要求33所述的方法，其中，步骤b)的所述至少一种细胞因子为IL-7、IL-15或IL-21或其任意组合。

35.如权利要求34所述的方法，其中，以10:5:1的比例提供IL-21、IL-15和IL-7。

36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中，步骤g)的所述至少一种细胞因子为IL-21、IL-15和IL-7。

37.如权利要求36所述的方法，其中，以2:0.2:1的比例提供IL-21、IL-15和IL-7。

38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中，通过如下进行所述转导：例如在CTSDynabeads CD3/CD28上磁性地富集所述经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，以及将转导混合物与所述经起始处理的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞一起孵育确定的时间段。

39.如权利要求38所述的方法，其中，在将转导介质添加至所述细胞之前，从所述培养容器中移去所述培养基。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中，所述确定的时间段处于约1小时至约24小时、约2小时至约12小时或约2小时至约5小时的范围内。

41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中，在所述确定的时间段结束时，将移去的所述培养基重新引入所述容器中。

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