BR112020015889A2 - Processo de fabricação de sistemas fechados para células car-t - Google Patents
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Abstract
algumas modalidades fornecidas no presente documento referem-se a métodos e composições para produzir células t geneticamente modificadas. em algumas dessas modalidades, as células t cd4+ e cd8+ são cocultivadas em um único volume sem soro. em algumas modalidades, células t cd4+ e cd8+ cocultivadas podem ser transduzidas com um vetor lentiviral, e uma população de células transduzidas t pode ser colhida dentro de um período mais curto do que os outros métodos convencionais.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE SISTEMAS FECHADOS PARA CÉLULAS CAR-T” Pedido Relacionado
[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Prov. U.S. Nº. 62/627.129 depositado em 6 de fevereiro de 2018 intitulada “CLOSED-SYSTEM MANUFACTURING PROCESS FOR CAR-T CELLS” que é, através deste documento, expressamente incorporada a título de referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
[002] Algumas modalidades fornecidas no presente documento referem-se a métodos e composições para produzir células T geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, as células CD4+ e CD8+ são cultivadas em um único volume livre de soro. Em algumas modalidades, células T CD4+ e CD8+ cocultivadas são transduzidas com um vetor lentiviral, e uma população de células T transduzidas é colhida dentro de um período mais curto de tempo em comparação com métodos convencionais.
Fundamentos da Invenção
[003] A modificação genética de células tem sido usada em vários campos pesquisa, medicina, biotecnologia industrial e agricultura. Existem várias técnicas disponíveis, para inserir um gene em um genoma hospedeiro.
Por exemplo, um ácido nucleico pode ser injetado através do envelope nuclear de uma célula diretamente no núcleo ou administrado a uma célula usando vetores virais para produzir células geneticamente modificadas.
[004] A transfecção com um vetor viral é uma técnica comum para a produção de células geneticamente modificadas, como células T, em uma técnica conhecida como transdução viral. O ácido nucleico é introduzido nas células usando um vírus como um carreador, como um lentivírus ou adenovírus.
[005] A transdução viral pode ser usada para inserir ou modificar genes em células, como células de mamíferos utilizando um plasmídeo. O plasmídeo usado na transdução viral contém os genes a serem transferidos flanqueados por sequências virais que são usados por proteínas virais para reconhecer e empacotar o genoma viral em partículas virais. Esse plasmídeo é inserido na célula junto com outras construções de DNA que podem transportar genes virais necessários para a formação de virions infecciosos. As proteínas virais expressas por essas construções de embalagem podem ligar as sequências no DNA/RNA que devem ser transferidas e inseridas nas partículas virais. Tipicamente, por razoes de segurança, nenhum dos plasmídeos usados contém todas as sequências necessárias para a formação do vírus, de modo que a transfecção simultânea de múltiplos plasmídeos é necessária para obter virions infecciosos. Além disso, apenas o plasmídeo que transporta as sequências a serem transferidas contém sinais que permitem que os materiais genéticos sejam empacotados em virions, de modo que nenhum dos genes que codificam proteínas virais seja empacotado. Os vírus coletados dessas células são então aplicados às células a serem alteradas. Os estágios iniciais dessas infecções imitam a infecção por vírus naturais e levam à expressão dos genes transferidos e (no caso de vetores de lentivírus/retrovírus) a inserção do DNA a ser transferido para o genoma celular. No entanto, como o material genético transferido não codifica nenhuma dos genes virais, essas infecções não geram novos vírus.
Sumário da invenção
[006] Algumas modalidades descritas no presente documento referem-se a processos para produzir células T modificadas por lentivírus com manipulação física mínima e dentro de um prazo mais curto do que as abordagens convencionais. Em algumas modalidades, os subconjuntos CD4 e CD8 de células T são colocados em uma cocultura em um único meio de composição feito de um meio base, um suplemento de proteína, e um coquetel de citocinas. A modificação do lentivírus também pode ser realizada nesse sistema concentrando magneticamente as células T e incubando uma mistura de transdução com as células por um tempo definido ou selecionado in situ.
[007] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidos no presente documento incluem um método de fabricação de células T geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, as células T geneticamente modificadas compreendem um receptor de antígeno quimérico (CAR). Alguns desses métodos podem incluir o fornecimento de células T CD8+ e células T CD4+ em um primeiro meio em um único vaso de cultura, colocando um segundo meio no único vaso de cultura, produzindo assim células T CD4+ cocultivadas e células T CD8+, que são iniciadas para transdução, colheita de células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas; e transdução das células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas com um vetor, produzindo assim células T geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, isto é, opcionalmente, o método é realizado em um gabinete de segurança biológica (BSC) e em alguns casos, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o método é realizado fora de um gabinete de segurança biológica (BSC). Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral, vetor adenoassociado ou um vetor adenoviral. De preferência, a transdução é realizada concentrando magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas, por exemplo, em CTS Dynabeads CD3/CD28, e incubando uma mistura de transdução com as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas por um período definido.
Em algumas alternativas, o meio de cultura é removido do vaso de cultura antes de adicionar o meio de transdução às células.
Em algumas alternativas, o período definido é em um intervalo de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 2 horas a cerca de 5 horas.
Em algumas alternativas, o meio de cultura removido é reintroduzido no vaso no final do período definido.
Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende o vetor.
Nesses métodos, o primeiro meio é, de preferência, um meio livre de citocinas e o segundo meio, de preferência, compreende pelo menos uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-15, ou IL-21 ou qualquer combinação dos mesmos). Em alguns casos, a pelo menos uma citocina é IL-15, IL-21 ou IL-7. De preferência,
nesses métodos, a etapa de transdução é realizada 24 horas após a etapa de iniciação das células T CD4+ e células T
CD8+ iniciadas.
Em algumas abordagens alternativas, o primeiro e ou segundo meios compreendem adicionalmente um suplemento de proteína e, em alguns casos, a mistura de transdução compreende adicionalmente sulfato de protamina ou uma interleucina ou ambos.
Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende adicionalmente sulfato de protamina ou polibreno ou ambos.
Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende IL-2, IL-21, IL-15 ou IL-7 ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, ao usar esses métodos, as células geneticamente modificadas T CD4+ e células T CD8+ são colhidas, as células geneticamente modificadas T CD4+ e células T CD8+ são colhidas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 dias após a etapa de transdução ou qualquer número de dias dentro de um intervalo definido por quaisquer períodos de tempo mencionados acima. Em algumas alternativas, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína para terapia e a proteína para terapia, desejavelmente, compreende citocinas, citocina quimérica/proteínas coestimulatórias, proteína pró ou anti-inflamatórias. De preferência, nesses métodos, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico e em algumas alternativas, as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas são adicionalmente modificadas com uma nuclease.
Em alguns desses métodos, a nuclease é uma nuclease de dedo de zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), o sistema CRISPR/Cas, endonucleases guiadas por RNA ou endonucleases homing remodificadas geneticamente por meganuclease geneticamente modificada.
Além disso, em alguns casos, o receptor de antígeno quimérico compreende um peptídeo sinal, um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar, um domínio coestimulador, ou um domínio intracelular de um receptor de células T ou todos esses domínios. De preferência, esses métodos produzem células T geneticamente modificadas que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR), como um CAR específico para ligação ou interação com CD19, e por algumas abordagens o vetor compreende adicionalmente um segundo ácido nucleico que codifica um marcador genético (por exemplo, EGFRt). Em algumas alternativas, o processo de fabricação de células T geneticamente modificadas, como células T CD4 e CD8 dentro de um único vaso, pode ser realizado em 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias ou por um tempo que está dentro de um intervalo de tempo definido por quaisquer dois períodos de tempo mencionados acima. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina é IL-7, IL-15, ou IL-21. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina é IL-2, IL-7, IL-15, ou IL-21.
[008] Em um segundo aspecto, é fornecido um método de fabricação de células T geneticamente modificadas, em que as células T geneticamente modificadas compreendem um receptor de antígeno quimérico. O método compreende: a) fornecer células T CD8+ e células T CD4+ dentro de duas frações separadas de um primeiro meio, b) fornecer pelo menos uma citocina nas frações separadas do primeiro meio, em que as frações separadas compreendem células T CD8+ em uma primeira fração e células T CD4+ em uma segunda fração, c) combinar a primeira fração e segunda fração que contém as células T CD8+ e células T CD4+, produzindo assim uma fração celular combinada., d) fornecendo Dynabeads (por exemplo, CTS Dynabeads CD3/CD28) para a fração celular combinada e concentrando magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+, e) removendo as Dynabeads, f) adicionando a fração celular combinada que compreende as células CD4+ e CD8+ em um único vaso de cultura, g) fornecendo um segundo meio, que compreende uma mistura de citocinas, em que a mistura compreende pelo menos uma citocina; produzindo assim células T CD4+ combinadas iniciadas e células T CD8+, h) transduzir as células T CD4+ combinadas iniciadas e células T CD8+ com um vetor, produzindo assim células T geneticamente modificadas; e i) colher as células. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina da etapa b) é IL-7, IL-15,ou IL-21 ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas alternativas, a IL-21, IL-15 e IL-7 estão em uma proporção de 10:5:1. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina da etapa g) é IL-21, IL-15 ou IL-7 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas alternativas, a IL-21, IL-15 e IL-7 estão na proporção de 2:0.2:1.
Breve Descrição dos Desenhos
[009] A Figura 1 mostra um vaso G-Rex100MCS que pode ser usado em algumas modalidades da produção das células T geneticamente modificadas.
[010] A Figura 2 representa uma modalidade exemplificativa de um processo para a preparação de células T geneticamente modificadas.
Descrição detalhada
[011] Algumas modalidades fornecidas no presente documento referem-se a métodos e composições para produzir células T geneticamente modificadas. Em algumas dessas modalidades, as células T CD4+ e CD8+ são cultivadas em um único volume sem soro. Em algumas modalidades, as células T CD4+ e CD8+ cocultivadas são transduzidas com um vetor lentiviral, e uma população de células transduzidas T são colhidas dentro de um período mais curto de tempo em comparação com os métodos convencionais.
[012] O processo atual de produção de células geneticamente modificadas para uso em uma terapia pode ser caro e é estimado que os produtos comercialmente disponíveis para a produção dessas células possam estar no intervalo de $20.000 a $40.000. A produção das células também é difícil e trabalhosa, o que requer monitoramento e alimentação constante de células em condições estéreis, bem como, a técnica imprecisa do crescimento de células em sacos de cultura de células disponíveis comercialmente (por exemplo, sacos de cultura de células Gibco, saco de cultura de células Miltenyi). O processo de fabricação das células geneticamente modificadas também pode ser demorado, no qual o produto pode crescer por cerca de 14 a 21 dias ou mais cm monitoramento rigoroso, o que pode limitar o número de produtos simultâneos sendo produzidos. Em geral, o processo é um método demorado e trabalhoso para produzir as células geneticamente modificadas para terapias. Algumas modalidades fornecidas no presente documento incluem processos com “etapas de processo aberto”, nas quais há um único vetor, ou único paciente por quarto e onde existem gabinetes de biossegurança (BSC; também conhecido como gabinete de segurança biológica) e centrífugas.
[013] Algumas modalidades dos métodos fornecidos no presente documento referem-se à transdução e crescimento eficientes de células T CD4 e CD8 transduzidas. Em algumas modalidades, as células T transduzidas contêm uma carga útil terapêutica, como um receptor de antígeno quimérico.
Em algumas dessas modalidades, a população de células T pode ser usada uma transfusão autóloga. Em algumas modalidades, o crescimento das células transduzidas é suficientemente eficiente para fornecer uma população de células T transduzidas e uma quantidade suficiente para terapia de um indivíduo dentro de menos do que 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7, dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, ou 3 dias.
Em algumas modalidades, uma quantidade suficiente para terapia de um indivíduo pode incluir uma população de células T CD4+ e CD8+ transduzidas de cerca de 2 milhões células a cerca de 2 bilhões células, de cerca de 10 milhões células a cerca de 1 bilhões células, de cerca de 50 milhões células a cerca de 1 bilhões células, de cerca de 500 milhões células a cerca de 1 bilhões células ou uma quantidade de células dentro de um intervalo definido por quaisquer duas das quantidades mencionadas acima. Em algumas modalidades, as células T CD4+ e CD8+ de um indivíduo são cultivadas em um único volume em um único vaso. Em algumas modalidades, o meio de crescimento é livre de soro. Em algumas modalidades, o meio de crescimento é suplementado com pelo menos uma citocina. Em algumas modalidades, o meio de crescimento é suplementado com IL- 21, IL-15, e IL-7.
[014] Em algumas modalidades, células T geneticamente modificadas, como células T CD4 e CD8 são preparadas dentro de um único vaso. Em algumas alternativas, o processo de fabricação de células T geneticamente modificadas, como células T CD4 e CD8 dentro de um único vaso, pode ser realizado em 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias ou por um tempo que está dentro de um intervalo de tempo definido por dois dos períodos mencionados acima. A cocultura dos dois tipos de células na presença de um meio único permite que a cultura seja concluída, de preferência, dentro de sete dias, em um único vaso, enquanto que usando técnicas convencionais, a cultura precisa ser realizada por 14 a 21 dias ou mais dias
(por exemplo, mais de um mês) com os dois subconjuntos crescidos separadamente em dois vasos. A transdução in situ usando as modalidades descritas no presente documento é muito mais simples e rápida do que as abordagens convencionais e permite que todo o processo seja realizado com equipamento mínimo e em um modo de sistema completamente fechado.
[015] Uma modalidade exemplificativa de um processo ou sistema para preparar células T geneticamente modificadas de um indivíduo é representada na Figura 2.
Conforme mostrado na Figura 2, no Dia X, um indivíduo sofre aférese para obter células T, as células CD4+ e CD8+ são selecionadas e classificadas, e armazenadas em bancos de nitrogênio líquido. No Dia 0, as células T armazenadas são iniciadas por cultura em um vaso GRex. No Dia 2, as células iniciadas são transduzidas com um vetor lentiviral. No Dia 7, as células transduzidas são colhidas, e podem ser armazenadas.
Termos
[016] Os termos na revelação no presente documento devem ter seu significado claro e comum quando lidos à luz do relatório descritivo. Um especialista no assunto da técnica entenderia os termos conforme usados em vista de todo o relatório descritivo.
[017] Conforme usado no presente documento, “um”
ou “uma” pode significar um ou mais de um.
[018] Conforme usado no presente documento, o termos “cerca de” indica que um valor inclui a variação inerente de erro para o método que é empregado para determinar um valor, ou a variação que existe entre os experimentos.
[019] Conforme descrito no presente documento, “geneticamente modificado” e “geneticamente modificado” têm seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, um processo para modificar um organismo ou uma célula como uma bactéria, célula T, célula bacteriana, célula eucariótica, inseto, planta ou mamífero com material genético, como ácido nucleico, que foi alterado usando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, um ácido nucleico como DNA pode ser inserido no genoma hospedeiro, primeiro isolando e copiando o material genético de interesse usando métodos de clonagem molecular para gerar uma sequência de DNA, ou sintetizando o DNA, e, em seguida, inserindo essa construção no organismo hospedeiro. Os genes também podem ser removidos, ou “eliminados”, usando uma nuclease. O direcionamento genético é uma técnica diferente que usa a recombinação homóloga para alterar um gene endógeno, e pode ser usada para deletar um gene, remover exons, adicionar um gene, ou introduzir mutações pontuais.
[020] A modificação genética realizada por transdução é descrita no presente documento. A “transdução” refere-se a métodos de transferência de material genético, como, por exemplo, DNA ou RNA, para uma célula por meio de um vetor. Técnicas comuns usam vetores virais, eletroporação, e reagente químicos para aumentar a permeabilidade da célula. O DNA pode ser transferido por um a vírus, ou por um vetor viral. São descritos no presente documento métodos para modificar células T CD4+ e/ou CD8+ imunes. A fim de alcançar alta expressão de genes terapêuticos e/ou para aumentar a quantidade de receptores de antígeno quiméricos em uma superfície celular, por exemplo, as células T são transduzidas com material genético que codifica uma proteína ou um receptor de antígeno quimérico. As células T podem ser geneticamente modificadas usando um vírus, por exemplo. Os vírus comumente usados para terapia de gene são adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), retrovírus ou lentivíruses, por exemplo.
[021] Várias técnicas de transdução foram desenvolvidas, as quais utilizam partículas virais infecciosas recombinantes para um entregador do ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico.
Isso representa uma abordagem atualmente preferida para a transdução de linfócitos T. Conforme descrito no presente documento, os vetores virais usados para transdução podem incluir vetores virais utilizados derivados do vírus símio 40, adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), vetores lentivirais, ou retrovírus. Assim, os métodos de transferência e expressão gênica são numerosos, mas essencialmente funcionam para introduzir e expressar material genético em células de mamíferos. Várias das técnicas acima podem ser usadas para transduzir células hematopoiéticas ou linfoides, incluindo transfecção de fosfato de cálcio, fusão de protoplastos, eletroporação, ou infecção por adenovírus recombinantes, vírus adenoassociado, lentivírus, ou vetores de retrovírus. Os linfócitos T primários foram transduzidos com sucesso por eletroporação e por infecção retroviral ou lentiviral. Como tal, os vetores retrovirais e lentivirais fornecem uma abordagem altamente eficiente para a transferência de genes para as células eucarióticas, como células T. Além disso, a integração retroviral ou lentiviral ocorre de maneira controlada e resulta na integração estável de um ou algumas cópias da nova informação genética por célula. Conforme descrito no presente documento, as células podem ser transduzidas in situ.
[022] Um “vetor de expressão” ou “vetor” tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene que é expresso em uma célula hospedeira. Tipicamente, um vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene, e um terminador de transcrição. A expressão gênica é geralmente colocada sob o controle de um promotor e diz-se que esse gene está “operacionalmente ligado” ao promotor. Da mesma forma, um elemento regulador e um promotor principal estão operacionalmente ligados se o elemento modular a atividade do promotor principal.
[023] Os vetores virais podem ter elementos para fornecer expressão dos ácidos nucleicos heterólogos na célula. Os vectores incluem, mas não estão limitados a genomas de plasmídeos, minicírculos, leveduras, e virais.
Em algumas alternativas, os vetores são plasmídeo, minicírculos, vetores virais, DNA ou mRNA. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral ou um retrovetor viral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral.
[024] “Espinoculação” tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, inoculação centrífuga (de culturas de células).
[025] “Meio” tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir,
mas não está limitado a, por exemplo, sólido ou líquido ou semissólido projetado para suportar o crescimento de microrganismos ou células. Diferentes tipos de meio são usados para o cultivo de diferentes tipos de células e, em alguns contextos, podem ser chamados de um meio de base. Em algumas alternativas no presente documento, o meio é suplementado para apoiar o crescimento de células que contém CD4 e CD8 em um único vaso, como um G-Rex100MCS (Figura 1). O meio de base pode incluir um produto comercial, por exemplo, XVIVO-15 (fornecido pela Lonza) ou PRIME-XV (fornecido pela Irvine Scientific). O único vaso pode ser permeável ao gás, e pode incluir um substrato de cultura flexível. Para esses vasos, existe praticamente um reservatório ilimitado de nutrientes/resíduos. O vaso tem um suporte texturizado, que gera alta reprodutibilidade da superfície de cultura. O sistema é totalmente compatível com o sistema fechado. Desejavelmente, não há praticamente nenhuma manutenção de cultura, na qual muitas etapas de processamento podem ser realizadas no vaso, minimizando manipulações brutas. Além disso, mais de 2 bilhões de células podem ser geradas em uma semana, deixando uma pegada de resíduos menor do que os sacos de cultura.
[026] “Gabinete de Biossegurança,” (BSC) tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, um espaço de trabalho de laboratório fechado, ventilado para trabalhar com segurança com materiais contaminados (ou potencialmente contaminados com patógenos que exigem um nível de biossegurança definido). Existem vários tipos diferentes de BSC, diferenciados pelo grau de biocontenção necessário. Os protocolos para trabalhar em um BSC são conhecidos pelos especialistas no assunto da técnica e estão disponíveis comercialmente (por exemplo, gabinetes de segurança biológica da Thermo Scientific).
[027] “Suplemento de proteína” tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, misturas de proteínas comercialmente disponíveis para adicionar a um meio para crescimento celular. Suplementos de proteína podem ser fornecidos por empresas comerciais, como Knockout-SR (fornecido por ThermoFisher Scientific) ou soro fetal bovino.
[028] “Nuclease” ou “endonuclease” tem seu significado claro e comum quando lidas à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma enzima configurada para clivar as ligações fosfodiéster entre as subunidades nucleotídicas dos ácidos nucleicos. Em algumas alternativas um polinucleotídeo que codifica uma nuclease é fornecido a uma célula para modificação genética da célula. Sem ser limitativo, os exemplos de endonucleases podem incluir, por exemplo, uma enzima CRISPR ou uma endonuclease de restrição. Em algumas alternativas no presente documento, as células podem ser geneticamente modificadas por uma nuclease antes da transdução com um vetor viral.
[029] Uma “enzima de restrição” ou “endonuclease de restrição” tem seu significado claro e comum quando lida à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitada, por exemplo, uma enzima que reconhece e se liga ao DNA em ou próximo a sequências nucleotídicas de reconhecimento específicas para que ele possa cortar em locais de clivagem de restrição. Em algumas alternativas, o local de reconhecimento da endonuclease é específico para uma endonuclease de restrição.
[030] “Nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição” (TALENS) tem seu significado claro e comum quando lida à luz do relatório descritivo e pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, enzimas de restrição artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação ao DNA do efetor Tal a um domínio de clivagem de DNA. Os efetores Tal são proteínas bacterianas de ligação ao DNA que consistem em módulos de 34 aminoácidos altamente homólogos que podem se ligar a um nucleotídeo com alta afinidade. A variável do décimo segundo e décimo terceiro aminoácidos do módulo TALENS, denominada di-nucleotídeo de variável repetida, confere especificidade à base (por exemplo, NN→G/A, NI→A, NG→T, NK→G, HD→C, e NS→A/T/C/G) e matrizes TALEN que têm como alvo uma sequência podem ser geradas montando os módulos individuais. A relação entre a sequência de aminoácido e o elemento de reconhecimento de DNA permitiu a engenharia de domínios de ligação a DNA pela seleção de uma combinação de segmentos de repetição que entram em contato com o Diresidue Variável de Repetição (RVDs) correlacionado. TALENS pode ser usado para editar genomas induzindo quebras de fita dupla (DSBs) nas células de interesse, em que as células respondem invocando vários tipos de mecanismos de reparo.
[031] “Proteínas de dedos de zinco” (ZFP) significado claro e comum quando lidas à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo, proteínas de ligação ao DNA. Os motivos ZFP mais comuns para edição de genoma, por exemplo, são os dedos Cys2-His2, e cada tipo é específico para um nucleotídeo trigêmeo. Os domínios ZFP artificiais podem ser gerados para atingir sequências de DNA que geralmente têm 9 a 18nt de comprimento pela montagem de dedos de zinco individuais.
O termo “Proteínas de dedos de zinco de Designer,” refere- se a proteínas de dedo de zinco com especificidades de ligação de DNA reprojetadas propositalmente que podem fornecer uma tecnologia amplamente aplicável para direcionar domínios funcionais para quase qualquer gene de interesse em muitos tipos de células. As nucleases de dedos de zinco (ZFNs) são uma ferramenta poderosa para realizar a manipulação genômica direcionada em uma variedade de tipos de células em humanos. Os ZFNs consistem em um domínio de dedos de zinco de ligação de DNA manipulado ligado a um domínio de endonuclease não específico e pode introduzir quebras de fita dupla (DSBs) que estimulam tanto a recombinação homóloga quanto não homóloga, que pode então ser aproveitada para realizar a manipulação genômica. Como tal, os ZFPs têm potencial em aplicações tanto de pesquisa quanto terapia genética.
[032] As Repetições Palindrômicas Curtas entre Espaços Regularmente Agrupados (CRISPR) têm seu significado claro e comum quando lidas à luz do relatório descritivo, e podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo, um loci de DNA que pode conter repetições curtas de sequências de bases, nas quais cada repetição é seguida por segmentos curtos do DNA espaçador da exposição viral. As regiões CRISPR podem ser associadas a genes cas que codificam proteínas relacionadas a CRISPRs. O sistema CRISPR/Cas é um sistema imunológico procariótico que confere resistência a elementos genéticos estranhos, como plasmídeos e fagos e fornece uma forma de imunidade adquirida. Os espaçadores CRISPR reconhecem e cortam esses elementos genéticos exógenos de maneira análoga ao RNAi em organismos eucarióticos. Como mecanismo de edição do genoma, uma endonuclaese guiada por RNA, uma proteína Cas, e um RNA guia apropriado podem ser entregues em uma célula e o genoma do organismo pode ser cortado em um local desejado.
CRISPRS são um mecanismo eficiente para direcionar/modificar genes.
[033] A nuclease “MegaTal” tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo e pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, uma arquitetura de nuclease híbrida, que combina a engenhariabilidade de um efetor TAL com a especificidade da sequência de clivagem de um domínio de clivagem por meganuclease (mn). A arquitetura do MegaTal permite a geração de nucleases ativas e específicas que são compatíveis com os métodos de entrega de células virais e não virais.
[034] “Receptor de Antígeno Quimérico” (CAR) tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo e pode incluir, mas não está limitado a, um receptor de células T quimérico, um receptor de células T artificial ou um receptor geneticamente modificado. Esses receptores podem ser usados para enxertar a especificidade de um anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação do mesmo em uma célula desejada (por exemplo,
uma célula T). Frequentemente, a transferência da sequência de codificação do CAR para uma célula receptora é realizada usando um vetor retrovetor. A estrutura do CAR pode compreender fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) derivados de anticorpos monoclonais, fundidos à transmembrana CD3-zeta e endodomínio. Essas moléculas resultam na transmissão de um sinal zeta em resposta ao reconhecimento pelo scFv de seu alvo.
[035] “CD19” tem seu significado claro e comum quando lido à luz do relatório descritivo, e pode incluir, mas não está limitado a, uma proteína que é encontrada na superfície dos glóbulos brancos e pode se reunir com o receptor de antígeno de linfócitos B, a fim de diminuir o limiar de estimulação dependente do receptor de antígeno. O CD19 é expresso em células dendríticas foliculares e células B. o CD19 está presente nas células B desde as primeiras células reconhecíveis da linhagem B durante o desenvolvimento de blastos de células B, mas é perdido na maturação das células plasmáticas. O CD19 atua principalmente como um correceptor de células B em conjunto com CD21 e CD81. Após a ativação, a cauda citoplasmática do CD19 torna-se fosforilada, o que leva à ligação pelas quinases da família Src e ao recrutamento da PI-3 quinase.
Como nas células T, várias moléculas de superfície formam o receptor de antígeno e formam um complexo nos linfócitos B.
[036] Como um todo, os métodos alternativos para a produção de células geneticamente modificadas descritas no presente documento permitem desejavelmente que todas as etapas sejam executadas em um sistema completamente fechado, o que permite que esse processo seja realizado para produzir produtos para vários pacientes, usando várias construções virais (por exemplo, construções lentivirais), no mesmo espaço e ao mesmo tempo sem separação física adicional além do material de cultura e chicotes de tubos necessários para a execução do processo. Isso tem implicações importantes para o projeto de instalações e fluxos de trabalho, permitindo um uso muito mais eficiente da área de fabricação e do pessoal.
[037] Esses métodos podem ser usados para gerar células T portadoras de antígeno quimérico (CAR) por transdução viral. As células também podem estar sujeitas a outras manipulações ou modificações genéticas nos sistemas incorporados descritos no presente documento e, de preferência, podem ser modificados por lentivírus, vírus adenoassociado, adenovírus ou retrovírus.
Certos métodos de preparação de células T geneticamente modificadas
[038] Em algumas alternativas, um método de fabricação de células T geneticamente modificadas, em que as células T geneticamente modificadas compreendem um receptor de antígeno quimérico, é fornecido, o método compreende: fornecer células T CD8+ e células T CD4+ em um primeiro meio em um único vaso de cultura; colocar um segundo meio no único vaso de cultura, produzindo assim células T CD4+ cocultivadas e células T CD8+, que são iniciadas para transdução; colher as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas; e transduzir as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas com um vetor, produzindo assim,
células T geneticamente modificadas.
Em algumas alternativas, o método é realizado em um gabinete de segurança biológica (BSC). Em algumas alternativas, o método é realizado fora de um gabinete de segurança biológica (BSC). Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral.
Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral, um vetor adenoassociado, ou um vetor adenoviral.
Em algumas alternativas, a transdução é realizada concentrando magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas, por exemplo, em CTS Dynabeads
CD3/CD28 e incubando uma mistura de transdução com as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas por um período definido.
Em algumas alternativas, o meio de cultura é removido do vaso de cultura antes de adicionar o meio de transdução às células.
Em algumas alternativas, o período definido está em um intervalo de cerca de 1 hora a cerca de
24 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 2 horas a cerca de 5 horas. Em algumas alternativas, o meio de cultura removido é reintroduzido no vaso no final do período definido. Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende o vetor. Em algumas alternativas, o primeiro meio é um meio livre de citocinas.
Em algumas alternativas, o segundo meio compreende pelo menos uma citocina. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina é IL-2, IL-7, IL-15, ou IL-21 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina é IL-21, IL-15, e IL-7. Em algumas alternativas, a etapa de transdução é realizada 24 horas após a etapa de colheita das células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas. Em algumas alternativas, o primeiro e ou segundo meio compreendem adicionalmente um suplemento de proteína. Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende adicionalmente sulfato de protamina ou polibreno ou ambos. Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende adicionalmente uma interleucina. Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende Il-2, IL- 21, IL-15 ou IL-7 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas alternativas, as células T CD4+ geneticamente modificadas e células T CD8+ são colhidas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 dias após a etapa de transdução ou qualquer número de dias dentro de um intervalo definido por dois períodos mencionados acima. Em algumas alternativas, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína para terapia.
Em algumas alternativas, a proteína para terapia compreende citocinas, citocina quimérica/proteína coestimulatórias, ou proteínas pró ou anti-inflamatórias.
Em algumas alternativas, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico.
Em algumas alternativas, as células T
CD4+ e células T CD8+ iniciadas são adicionalmente modificadas com uma nuclease.
Em algumas alternativas, a nuclease é uma nuclease de dedo de zinco (ZFNs), Nucleases
Efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), o sistema CRISPR/Cas, endonucleases guiada por RNA ou
Endonucleases homing remodificadas geneticamente por meganuclease geneticamente modificada.
Em algumas alternativas, o receptor de antígeno quimérico compreende um peptídeo sinal, um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar, um domínio coestimulador, e um domínio intracelular de um receptor de células T.
Em algumas alternativas, as células T geneticamente modificadas expressam um receptor de antígeno quimérico
(CAR), como um CAR específico para ligação ou interação com
CD19. Em algumas alternativas, o vetor compreende adicionalmente um segundo ácido nucleico que codifica um marcador genético.
Em algumas alternativas, o marcador genético é EGFRt.
Em algumas alternativas, o processo de fabricação de células T geneticamente modificadas, como células T CD4 e CD8 dentro de um único vaso pode ser realizado em 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias ou por um período dentro de um intervalo de tempo definido por dois períodos mencionados acima. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina é IL-7, IL-15, ou IL-21 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina é IL-2, IL-7, IL- 15, e IL-21.
[039] Em algumas alternativas, é fornecido um método de fabricação de células T geneticamente modificadas, em que as células T geneticamente modificadas compreendem um receptor de antígeno quimérico, o método compreende: a) fornecer células T CD8+ e células T CD4+ dentro de duas frações separadas de um primeiro meio, b) fornecer pelo menos uma citocina nas frações separadas do primeiro meio, em que as frações separadas compreendem células T CD8+ em uma primeira fração e células T CD4 em uma segunda fração; c) combinar a primeira fração e segunda fração que contém as células T CD8+ e células T CD4+, produzindo assim uma fração celular combinada; d) fornecer microesferas magnéticas, como Dynabeads (por exemplo, CTS Dynabeads CD3/CD28) para a fração celular combinada e concentrar magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+; e) remover as microesferas magnéticas, por exemplo,
Dynabeads; f) adicionar a fração celular combinada que compreende as células CD4+ e CD8+ em um único vaso de cultura; g) fornecer um segundo meio, que compreende uma mistura de citocinas, em que a mistura compreende pelo menos uma citocina; produzindo assim células T CD4+ combinadas iniciadas e células T CD8+; h) transduzir as células T CD4+ e células T CD8+ combinadas iniciadas com um vetor, produzindo assim células T geneticamente modificadas; e i) colher as células. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina da etapa b) é IL-7, IL-15, e IL-21. Em algumas alternativas, a IL-21, IL-15 e IL-7 estão na proporção de 10:5:1. Em algumas alternativas, a pelo menos uma citocina da etapa g) é IL-21, IL-15 e IL-
7. Em algumas alternativas, a IL-21, IL-15 e IL-7 estão na proporção de 2:0.2:1. Em algumas alternativas, o método é realizado em um gabinete de segurança biológica (BSC). Em algumas alternativas, o método é realizado fora de um gabinete de segurança biológica (BSC). Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral, um vetor adenoassociado, ou um vetor adenoviral. Em algumas alternativas, a transdução é realizada concentrando magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas, por exemplo, em CTS Dynabeads CD3/CD28 e incubando uma mistura de transdução com as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas para um período definido.
Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende o vetor.
Em algumas alternativas, a etapa de transdução é realizada 24 horas após a etapa de colheita das células T
CD4+ e células T CD8+ iniciadas.
Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende adicionalmente sulfato de protamina ou polibreno ou ambos.
Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende adicionalmente uma interleucina.
Em algumas alternativas, a mistura de transdução compreende Il-2, IL-21, IL-15 e/ou IL-7. Em algumas alternativas, as células geneticamente modificadas
T CD4+ e células T CD8+ são colhidas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, ou 14 dias após a etapa de transdução ou qualquer número de dias dentro de um intervalo definido por quaisquer dois períodos mencionados acima.
Em algumas alternativas, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína para terapia.
Em algumas alternativas, a proteína para terapia compreende citocinas,
citocina quimérica/proteínas coestimulatórias, ou proteína pró ou anti-inflamatórias.
Em algumas alternativas, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico.
Em algumas alternativas, as células T
CD4+ e células T CD8+ iniciadas são adicionalmente modificadas com uma nuclease.
Em algumas alternativas, a nuclease é uma nuclease de dedo de zinco (ZFNs), Nucleases
Efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), o sistema CRISPR/Cas, endonuclease guiada por RNA ou Endonucleases homing remodificadas geneticamente por meganuclease geneticamente modificada. Em algumas alternativas, o receptor de antígeno quimérico compreende um peptídeo sinal, um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar, um domínio coestimulador, e/ou um domínio intracelular de um receptor de células T. Em algumas alternativas, as células T geneticamente modificadas expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas alternativas, o vetor compreende adicionalmente um segundo ácido nucleico que codifica um marcador genético. Em algumas alternativas, o marcador genético é EGFRt. Em algumas alternativas, o processo de fabricação de células T geneticamente modificadas, como células T CD4 e CD8 dentro de um único vaso pode ser realizado em 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias ou por um tempo que está dentro de um intervalo de tempo definido por quaisquer dois dos períodos de tempo mencionados acima.
Exemplos Exemplo 1 — Um processo de preparo único em um único vaso
[040] Um protocolo exemplificativo para realização de um processo de preparo em um único vaso é fornecido na
TABELA 1.
Tabela 1 Estágio (tempo) Etapas Fazer 1,2 l de meio suplementar (SM). a. Descongelar uma alíquota de 25 ml de meio de Reposição de Soro Knockout (KO) (Thermo Fisher Scientific, São Diego CA) em um bloco de aquecimento de 37 °C, invertendo com frequência. b. Remover 24 ml de meio XVIVO-15 (Lonza BioWhittaker) de um frasco de 1 l, e adicionar 24 ml da alíquota ao frasco de 1 l de meio XVIVO-15. c. Em um tubo cônico de 50 ml, extrair 40 ml de XVIVO+KO e adicionar 1 ml de IL-21, 100 µl de IL-15, e 500 µl de IL- 7 (todos os estoques de 10 ng/µl).
2. Pipetar 48 ml de SM em cada um dos dois tubos cônicos de 50 ml.
3. Descongelar dois frascos 50e6 de células de células T isoladas CD8 e CD4, transferindo os frascos de células para os tubos cônicos de 50 ml adequadamente marcados. Iniciação: (Dia 0) 4. Centrifugar por 10 min a 400 g, e aspirar o sobrenadante com cuidado.
5. Enquanto a centrífuga estiver em funcionamento, montar uma tampa Jensen (uma tampa Jensen permite acesso ao conteúdo de um vaso, como um meio de frasco, sem abrir o vaso; a tampa inclui uma abertura com filtro de ar, e uma abertura com tubulação que entra o vaso e se estende para fora do vaso) com extensão de tubo no frasco de meio de 1 l XVIVO e bombear 980 ml SM em um G-Rex100MCS (Wilson Wolf, Saint Paul, MN). Colocar na incubadora até a Etapa
11.
6. Suspender novamente as células CD4 em um volume final de 10 ml, e remover uma amostra de contagem.
7. Suspender novamente as células CD8 em um volume final de 10 ml, e remover uma amostra de contagem.
8. Contar as células.
9. Determinar os volumes necessários para 62,5e6 de cada tipo de célula.
10. Quando o volume de suspensão de célula para o G-Rex tiver sido determinado, adicionar 0,9375 ml CTS Dynabeads com anticorpos fixados a CD3 e CD28 para ativar as células (Thermo Fisher Scientific, São Diego, CA) a um tubo cônico de 50 ml que contém meio de 30 ml, e lavar as microesferas no ímã CTS (Dynamag; Thermo Fisher Scientific, São Diego, CA).
11. Remover as microesferas do ímã, adicionar volumes de suspensão de células ao tubo de microesferas, e adicionar meio ao tubo com um volume total de 30 ml. Agora deve haver 30 ml de suspensão de células a ~4,2e6 células/ml em um único tubo cônico de 50 ml. Trocar a tampa do tubo cônico de 50 ml com uma tampa do tubo Burton (semelhante à tampa de Jensen para um tubo cônico de 50) com PAC-03 fixado e transferir rapidamente a mistura de célula/microesfera para o G-Rex100MCS preenchido.
1. Remover o G-Rex100MCS do incubador. Substituir a conexão CLAVE na porta mais curta por uma extensão de tubulação. Colocar delicadamente o G- Rex100MCS no ímã CTS e transfira o meio para o TP1000 (pacote de transferência, 1000ml) através da linha de células. Colocar o excesso de meio em uma incubadora a 37 °C.
2. Remover um frasco do vetor Transdução: lentiviral do freezer a -80 °C e (Dia +1) descongele na bancada.
3. Preparar 25 ml de transdução (Tx) Misture em um tubo Burton, combinado o seguinte: a. 25 ml de meio b. 300 µl de sulfato de protamina c. 100 µl de vetor d. Concentração final de citocina 1X (25 µl IL-21, 2,5 µl IL-15, e 12,5 µl IL-7).
4. Usando um PAC-03, transferir o TxMix para o G-Rex100MCS ainda localizado no ímã CTS.
5. Transferir gentilmente o G-Rex100MCS para uma incubadora de CO2 5% a 37 °C, e incubar por 4 horas.
6. Após a incubação, substituir o meio no G-Rex100MCS do TP1000 através da extensão mais curta do tubo. Quando ~100 ml de meio tiver sido transferido para o G-Rex100MCS, agitar gentilmente para suspender novamente as células destacadas para incentivar a distribuição uniforme após o aumento de volume.
1. Remover o G-Rex100MCS da incubadora com agitação mínima. Usando a linha de meio, transfira o máximo de meio possível para um TP1000.
2. Girar o G-Rex100MCS o suficiente para retirar todas as células através da parte inferior. Transferir células da linha ‘células’ para uma “célula” marcada como TP600. Enxaguar o G- Rex100MCS drenando a gravidade ~50 ml de meio de volta para o G-Rex100MCS e transferir para o saco de células. Agitar o saco para retirar as microesferas restantes das células.
3. Soldar um tubo Hamlett tarado no saco de células, e identifica-lo como Colheita: “células removidas do cordão”. Prender (Dia +7) a linha, colocar o saco de células no ímã CTS, fechar a tampa, e incubar 2 minutos.
4. Inclinar o ímã a 45° e remover o grampo para drenar as células para o tubo Hamlett. Fazer o volume do tubo Hamlett para 500 ml usando meio do TP1000 usado na etapa 1, misturar bem, e remover uma amostra de 1 ml de coloração de contagem/fluxo.
5. Girar as células a 400 g x 15 min.
6. Contar as células usando o contador NC3000 e reservar uma amostra de coloração de fluxo.
7. Preparar criotubos marcados suficientes para acomodar as células geradas a 100e6/ml.
8. Suspender novamente as células no meio de congelamento Cryostor CS5 (BioLife Solutions) para uma densidade de 100e6/ml e transferir para os frascos preparados.
9. Congelar os frascos durante a noite a -80°C em um freezermate, em seguida, transferir para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
Exemplo 2 — Um processo de preparo único em um único vaso
[041] Um exemplo de protocolo para executar um único processo de preparo em um único vaso é fornecido na TABELA 2.
Tabela 2 Estágio (tempo) Etapas
1. Fazer 200 ml de meio suplementado (SM). a. Descongelar uma alíquota de 5 ml de meio de reposição de soro Knockout (KSR) em um bloco de aquecimento a 37 °C, invertendo com frequência. b. Para 196 ml de meio XVIVO-15, adicionar 4 ml do KSR, e 200 µl de IL- 21, 20 µl de IL-15, e 100 µl de IL-7 (todos os estoques de 10 ng/ul).
2. Pipetar 48 ml de SM em cada um dos Iniciação: dois tubos cônicos de 50 ml. (Dia 0)
3. Descongelar dois frascos de 50e6 células de células T CD8 e CD4 primárias isoladas, transferindo os frascos de células para os tubos cônicos de 50 ml adequadamente marcados.
4. Centrifugar por 10 min a 400 g, e aspirar o sobrenadante com cuidado.
5. Suspender novamente as células CD4 em um volume final de 10 ml SM, e remover uma amostra de contagem.
6. Suspender novamente as células CD8 em um volume final de 10 ml SM, e remover uma amostra de contagem.
7. Determinar os volumes necessários para 62,5e6 de cada tipo de célula.
8. Quando o volume de suspensão de células para o G-Rex tiver sido determinado, adicionar 0,9375 ml de CTS Dynabeads com anticorpos fixados CD3 e CD28 para ativar as células (Thermo Fisher Scientific, São Diego, CA) a um tubo cônico de 50 ml que contém 30 ml de meio, e lavar as microesferas no ímã CTS (Dynamag; Thermo Fisher Scientific, São Diego, CA).
9. Remover o tubo de microesfera do ímã e adicionar os volumes de suspensão de células adequados ao tubo para suspender novamente as microesferas. Adicionar SM à mistura célula/microesfera a um volume final de 40 ml, e transferir as células para um saco de VueLife o mais rápido possível. Encher o volume de trabalho restante do saco de VueLife com SM, misturar sacudindo, e colocar em uma incubadora de CO2 a 37 °C.
1. Remover um frasco de vetor lentiviral do freezer a -80 °C e descongelar na bancada.
2. Preparar 25 ml de transdução (Tx) Misture em um tubo Burton combinando o seguinte: a. 25 ml de meio b. 300 µl de sulfato de protamina c. 100 µl de vetor d. concentração final de citocina 1X Transdução: (25 µl de IL-21, 2,5 µl de IL-15, e (Dia +1) 12,5 µl de IL-7).
3. Colocar o saco VueLife em um Dynamag CTS ou ímã semelhante, drenar o meio do saco VueLife em um recipiente secundário, como um Transfer Pack ou Tubo Jensen.
4. Adicionar a TxMix da Etapa 2 ao saco VueLife. Desconectar todas as linhas do saco e colocar em uma incubadora a 37°C por 3 horas.
5. Durante as 3 horas de incubação, fazer 900 ml de meio X-VIVO 15 completa e transferir 875 ml para um G- Rex100MCS.
6. Após as 3 horas de incubação, transferir a Mistura célula/microesfera/TxMix para o meio que contém G-Rex100MCS. Enxaguar o saco VueLife com o meio restante reservado antes da transdução para o G-Rex.
7. Vedar o G-Rex e colocar em uma incubadora CO2 a 37°C. Colheita: Conforme Exemplo 1. (Dia +7) Exemplo 3 — Um único processo de preparo em um único vaso comparado ao processo convencional
[042] Um único processo de preparo em um único vaso foi realizado em um método substancialmente semelhante ao processo descrito no Exemplo 1. A TABELA 3 compara o único processo de preparo em um único vaso (84121) com um método convencional usado em um experimento clínico PLAT- 02, para preparar células T geneticamente modificadas. Nos métodos PLAT-02, as células foram cultivadas nos sacos com meio que contém soro fetal bovino (FBS), e as populações CD4 e CD8 foram cultivadas separadamente.
Tabela 3 Método 84121 Método PLAT-02 (7 dias de processo (protocolo para produção de convencional para Parâmetro: células produção de células geneticamente geneticamente modificadas) modificadas) Cultura CD4+/ células T CD4 e CD8 células T CD4 e CD8
CD8+: crescem juntas no crescem G-Rex. separadamente em sacos VueLife. Tempo de 7 dias. Mais de 14 dias. Cultura: Tempo de 30 horas, na Cerca de 130 horas, Manipulação: prática. manuseio frequente. Sem contagem Alíquotas tiradas Ajustes de durante as para contagem volume ao meio incubações, meio de frequente, ajustes de cultura: volume restante de meio de volume constante. necessários.
[043] Em relação ao uso de termos plurais e/ou singulares no presente documento, aqueles especialistas no assunto da técnica podem traduzir do plural para o singular e/ou do singular para o plural conforme apropriado ao contexto e/ou aplicação. As várias permutações no singular/plural podem ser expressamente estabelecidas no presente documento por uma questão de clareza.
[044] Será entendido por aqueles especialistas no assunto da técnica que, em geral, os termos usados no presente documento, e especialmente nas reivindicações anexas (por exemplo, corpos das reivindicações anexas) são geralmente entendidos como termos “abertos” (por exemplo, o termo “incluindo” deve ser interpretado como “incluindo, mas não limitado a,” o termo “que tem” deve ser interpretado como “que tem pelo menos,” o termo “inclui” deve ser interpretado como “inclui, mas não está limitado a,” etc.). Será adicionalmente entendido por aqueles dentro do assunto que, se for pretendido um número específico de uma recitação de reivindicação introduzida como uma intenção, será explicitamente recitada na reivindicação, e na ausência dessa recitação, essa intenção não está presente.
Por exemplo, como um auxílio no entendimento, as reivindicações anexas a seguir podem conter o uso de frases introdutórias “pelo menos uma” e “uma ou mais” para introduzir recitações de reivindicações.
No entanto, o uso dessas frases deve ser interpretado como implicando que a introdução de uma recitação de reivindicação pelos artigos indefinidos “um” ou “uma” limita qualquer reivindicação específica que contenha apenas essa recitação, mesmo quando a mesma reivindicação inclui as frases introdutórias “um ou mais” ou “pelo menos uma” e artigos indefinidos como “um”
ou “uma” (por exemplo, “um” e/ou “uma” devem ser interpretados para significar “pelo menos um” ou “um ou mais”); o mesmo vale para o uso de artigos definidos usados para introduzir recitações de reivindicações.
Além disso,
mesmo que um número específico de uma recitação de reivindicação introduzida seja explicitamente recitado,
aqueles especialistas no assunto da técnica reconhecerão que essa recitação deve ser interpretada para significar pelo menos o número recitado (por exemplo, a recitação simples de “duas recitações,” sem outros modificadores,
significa pelo menos duas recitações, ou duas ou mais recitações). Além disso, nos casos em que uma convenção análoga a “pelo menos um de A, B, e C, etc.” é usado, em geral, tal construção é planejada no sentido em que especialista no assunto da técnica entenderia a convenção (por exemplo, “um sistema que tem pelo menos um de A, B, e C” incluiria, mas não seria limitado a sistemas que têm A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, e/ou A, B, e C juntos, etc.). Nesse casos em que uma convenção análoga a “pelo menos um de A, B, ou C, etc.” é usada, em geral, tal construção é planejada no sentido em que um especialista no assunto da técnica entenderia a convenção (por exemplo, “um sistema que tem pelo menos um A, B, ou C” incluiria, mas não seria limitado a sistemas que tem A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, e/ou A, B, e C juntos, etc.). Será adicionalmente entendido por aqueles que estão dentro da técnica que virtualmente qualquer palavra e/ou frase disjuntiva que apresenta dois ou mais termos alternativos, seja na descrição, reivindicações, ou desenhos, deve ser entendida para contemplar as possibilidades de incluir um dos termos, um dos termos ou ambos. Por exemplo, a frase “A ou B” será entendida para incluir as possibilidades de “A” ou “B” ou “A e B.”
[045] Além disso, onde características ou aspectos da divulgação são descritos em termos de grupos Markush, os especialistas no assunto da técnica reconhecerão que a revelação também é descrita em termos de qualquer membro do grupo ou subgrupo individual de membros do grupo Markush.
[046] Qualquer uma das características de uma modalidade do primeiro aspecto ao segundo aspecto é aplicável a todos os aspectos e modalidades identificados no presente documento. Além disso, qualquer uma das características de uma modalidade do primeiro aspecto ou segundo aspecto é independentemente combinável, parcialmente ou totalmente com outras modalidades descritas no presente documento de qualquer maneira, por exemplo, uma, duas, ou três ou mais modalidades podem ser combináveis no todo ou em parte.
Claims (41)
1. Método para fabricar células T geneticamente modificadas, caracterizado pelo fato de que as células T geneticamente modificadas compreendem um receptor de antígeno quimérico, sendo que o método compreende: fornecer células T CD8+ e células T CD4+ em um primeiro meio em um único vaso de cultura; colocar um segundo meio no único vaso de cultura, produzindo assim células T CD4+ e células T CD8+ cocultivadas, que são iniciadas para transdução; colher as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas; e transduzir as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas com um vetor, produzindo assim células T geneticamente modificadas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em um gabinete de segurança biológica (BSC).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é realizado fora de um gabinete de segurança biológica (BSC).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor lentiviral, um vetor adenoassociado, ou um vetor adenoviral.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a transdução é realizada concentrando magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas, por exemplo, em CTS Dynabeads CD3/CD28 e incubar uma mistura de transdução com as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas por um período definido.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é removido do vaso de cultura antes de adicionar o meio de transdução às células.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o período definido está em um intervalo de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 12 horas, ou cerca de 2 horas a cerca 5 horas.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura removido é reintroduzido no vaso no final do período definido.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que a mistura de transdução compreende o vetor.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio é um meio livre de citocinas, ou falta soro fetal bovino ou soro fetal de bezerro ou qualquer combinação dos mesmos.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o segundo meio compreende pelo menos uma citocina.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma citocina é IL-2, IL-7, IL-15, ou IL-21.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma citocina é IL-21, IL-15, e IL-7.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de transdução é realizada 24 horas após a etapa de colheita das células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o primeiro e ou segundo meios compreendem adicionalmente um suplemento de proteína.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 16, caracterizado pelo fato de que a mistura de transdução compreende adicionalmente sulfato de protamina ou polibreno ou ambos.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 17, caracterizado pelo fato de que a mistura de transdução compreende adicionalmente uma interleucina.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a mistura de transdução compreende Il-2, IL-21, IL-15 ou IL-7 ou qualquer combinação dos mesmos.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que as células T CD4+ geneticamente modificadas e células T CD8+ são colhidas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 dias após a etapa de transdução ou qualquer número de duas dentro de um intervalo definido por quaisquer dois períodos de tempo mencionados acima.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína para terapia.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a proteína para terapia compreende uma citocina, uma citocina quimérica/proteína coestimulatória, ou uma proteína pró ou anti-inflamatória ou qualquer combinação dos mesmos.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas são adicionalmente modificadas com uma nuclease.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a nuclease é uma nuclease de dedo de zinco (ZFNs), Nuclease Efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), um sistema CRISPR/Cas, uma endonuclease guiada por RNA ou uma endonuclease homing remodificada geneticamente por meganuclease geneticamente modificada.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende um peptídeo sinal, um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar, um domínio coestimulador, e um domínio intracelular de um receptor de células T.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelo fato de que as células T geneticamente modificadas expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR), como um CAR específico para ligação ou interação com CD19.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende adicionalmente um segundo ácido nucleico que codifica um marcador genético.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o marcador genético é um receptor de fator de crescimento epidérmico truncado (EGFRt).
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o processo de fabricação das células T geneticamente modificadas, como células T CD4 e CD8 dentro de um único vaso é realizado em 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias ou por um tempo que é dentro de um intervalo de tempo definido por quaisquer dois dos períodos mencionados acima.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma citocina é IL-7, IL-15, ou IL-21 ou qualquer combinação dos mesmos.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma citocina é IL-2, IL-7, IL-15, e IL-21.
33. Método de fabricação de células T geneticamente modificadas, caracterizado pelo fato de que as células T geneticamente modificadas compreendem um receptor de antígeno quimérico, sendo que o método compreende:
(a) fornecer células T CD8+ e células T CD4+ dentro de duas frações separadas de um primeiro meio,
(b) fornecer pelo menos uma citocina nas frações separadas do primeiro meio, em que as frações separadas compreendem células T CD8+ em uma primeira fração e células
T CD4+ em uma segunda fração;
(c) combinar a primeira fração e segunda fração que contém as células T CD8+ e células T CD4+, produzindo assim uma fração celular combinada;
(d) fornecer microesferas magnéticas como Dynabeads
(por exemplo, CTS Dynabeads CD3/CD28) à fração celular combinada e concentrar magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+;
(e) remover as microesferas magnéticas, por exemplo,
Dynabeads;
(f) adição da fração celular combinada que compreende as células CD4+ e CD8+ em um único vaso de cultura;
(g) fornecer um segundo meio que compreende uma mistura de citocinas, em que a mistura compreende pelo menos uma citocina; produzindo assim células T CD4+ combinadas iniciadas e células T CD8+;
(h) transduzir as células T CD4+ combinadas iniciadas e células T CD8+ com um vetor, produzindo assim células T geneticamente modificadas; e (i) colheita das células.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma citocina da etapa b) é IL-7, IL-15, ou IL-21 ou qualquer combinação dos mesmos.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que IL-21, IL-15 e IL-7 são fornecidas na proporção de 10:5:1.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma citocina da etapa g) é IL-21, IL-15 e IL-7.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que IL-21, IL-15 e IL-7 são fornecidos na proporção de 2:0.2:1.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que a transdução é realizada concentrando magneticamente as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas, por exemplo, em CTS Dynabeads CD3/CD28 e incubando uma mistura de transdução com as células T CD4+ e células T CD8+ iniciadas por um período definido.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é removido do vaso de cultura antes de adicionar o meio de transdução às células.
40. Método, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que o período definido está no intervalo de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, de cerca de 2 horas a cerca de 12 horas, ou de cerca de 2 horas a cerca de 5 horas.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura removido é reintroduzido no vaso no final do período definido.
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