JP2022533252A - 脱核赤血球細胞を生成する方法 - Google Patents

脱核赤血球細胞を生成する方法 Download PDF

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Abstract

脱核赤血球細胞の集団を生成する方法が本明細書に提示される。本発明は、赤血球前駆細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を分化および／または成熟化中に灌流培養することにより、細胞増殖の増大、脱核率の上昇がもたらされ、したがって、脱核赤血球細胞の数の増加がもたらされ（例えば、赤血球前駆細胞の分化もしくは成熟化中の灌流培養の使用を含まない方法と比較して）、かつ／または、赤血球前駆細胞が成長および／または脱核し続けることができる時間の長さが増加するという発見に基づく。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年５月２４日出願の米国仮特許出願第６２／８５２，９３０号の優先権を主張するものである。
技術分野
本発明は、一般に、脱核赤血球細胞を生成する方法に関する。
背景
赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）は失血した患者に輸血される。さらに、赤血球を含めた操作された脱核赤血球細胞が、外因性タンパク質をそれを必要とする患者に輸送するまたは与える治療剤として開発中である。
概要
本発明は、赤血球前駆細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を分化および／または成熟化中に灌流培養することにより、細胞増殖の増大、脱核率の上昇がもたらされ、したがって、脱核赤血球細胞の数の増加がもたらされ（例えば、赤血球前駆細胞の分化もしくは成熟化中の灌流培養の使用を含まない方法と比較して）、かつ／または、赤血球前駆細胞が成長および／または脱核し続けることができる時間の長さが増加するという発見に基づく。
この発見を考慮して、脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法が本明細書で提供される。脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を容器中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法も本明細書で提供される。脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を容器中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたってバッチ培養または流加培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法も本明細書で提供される。
脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法が本明細書で提供される。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤血球前駆細胞を容器中に含まれる第１の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個である第１の細胞培養物をもたらすステップと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップとをさらに含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振とうフラスコである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は、約１５ｍＬ～約５Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は、約５０ｍＬ～約１．５Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は、約１００ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とうフラスコを０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振とう管である。一部の実施形態では、振とう管の容積は、約２ｍＬ～約５００ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は、約５０ｍＬ～約２００ｍＬである。
一部の実施形態では、振とう管は、円錐容器である。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、培養バッグである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約２５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物をバッチ培養することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。一部の実施形態では、流加培養は、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施形態では、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第１の細胞培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約１２日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約９日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は、５Ｌ～約５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は、約５Ｌ～約２，５００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は、約５Ｌ～約１００Ｌである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３で撹拌することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３で撹拌することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養は、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施形態では、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養を約４日～約１０日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養を約５日～約８日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は、５Ｌ～約５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は、約５Ｌ～約２，５００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は、約５Ｌ～約１００Ｌである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３で撹拌することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３で撹拌することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養は、（ｉ）追加的な体積の第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加すること、および（ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加することを含む。
一部の実施形態では、追加的な体積の（ｉ）における第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって連続的に添加する。
一部の実施形態では、追加的な体積の（ｉ）における第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって定期的に添加し、かつ／または追加的な体積の（ｉｉ）における第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、（ｉ）における第１の期間は、約１日～約７日である。一部の実施形態では、（ｉ）における第１の期間は、約３日～約５日である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、（ｉｉ）における第２の期間は、約１日～約１０日である。一部の実施形態では、（ｉｉ）における第２の期間は、約３日～約７日である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養を約８日～約１５日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養を約９日～約１３日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）および（ｄ）における灌流培養は、接線濾過の使用を含む。一部の実施形態では、接線濾過は、交互接線濾過（ＡＴＦ）である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、接線濾過は、平均孔径が約１０ｎｍ～約６．０μｍのフィルターの使用を含む。一部の実施形態では、フィルターの平均孔径は、約０．１μｍ～約３．０μｍである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。
脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を容器中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法が本明細書で提供される。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤血球前駆細胞を容器中に含まれる第１の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個である第１の細胞培養物をもたらすステップと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップとをさらに含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振とうフラスコである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１５ｍＬ～約５Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約５０ｍＬ～約１．５Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１００ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とうフラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振とう管である。一部の実施形態では、振とう管の容積は約２ｍＬ～約５００ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約５０ｍＬ～約２００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、振とう管は、円錐容器である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、培養バッグである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約２５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物をバッチ培養することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。一部の実施形態では、流加培養は、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施形態では、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第１の細胞培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のそれぞれを含む。
一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約１２日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約９日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、振とうフラスコである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１５ｍＬ～約３Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約５０ｍＬ～約１．５Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１００ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、振とうフラスコを０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、振とう管である。一部の実施形態では、振とう管の容積は約２ｍＬ～約５００ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約５０ｍＬ～約２００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、振とう管は、円錐容器である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、培養バッグである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約２５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、バイオリアクターである。一部の実施形態では、バイオリアクターの容積は１Ｌ～約１５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）におけるバイオリアクターの容積は５Ｌ～約５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）におけるバイオリアクターの容積は約５Ｌ～約２，５００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）におけるバイオリアクターの容積は約５Ｌ～約１００Ｌである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物をバッチ培養することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を流加培養することを含む。一部の実施形態では、流加培養は、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施形態では、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第２の細胞培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）のバッチ培養または流加培養を約４日～約１０日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約８日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における最初の細胞密度は１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は５Ｌ～約５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は約５Ｌ～約２，５００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における灌流バイオリアクターの容積は約５Ｌ～約１００Ｌである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を、約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養は、（ｉ）追加的な体積の第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加すること、および（ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加することを含む。
一部の実施形態では、追加的な体積の（ｉ）における第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって連続的に添加する。
一部の実施形態では、追加的な体積の（ｉ）における第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって定期的に添加し、かつ／または（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、（ｉ）における第１の期間は、約１日～約７日である。一部の実施形態では、（ｉ）における第１の期間は、約３日～約５日である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、（ｉｉ）における第２の期間は、約１日～約１０日である。一部の実施形態では、（ｉｉ）における第２の期間は、約３日～約７日である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養を約８日～約１５日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養を約９日～約１３日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養は、接線濾過の使用を含む。一部の実施形態では、接線濾過は、交互接線濾過（ＡＴＦ）である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、接線濾過は、平均孔径が約１０ｎｍ～約６．０μｍのフィルターの使用を含む。一部の実施形態では、フィルターの平均孔径は、約０．１μｍ～約３．０μｍである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。
脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を容器中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたってバッチ培養または流加培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法も本明細書で提供される。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤血球前駆細胞を容器中に含まれる第１の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個である第１の細胞培養物をもたらすステップと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップとをさらに含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振とうフラスコである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１５ｍＬ～約３Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約５０ｍＬ～約１．５Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１００ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とうフラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、振とう管である。一部の実施形態では、振とう管の容積は約２ｍＬ～約５００ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約５０ｍＬ～約２００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、振とう管は、円錐容器である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の容器は、培養バッグである。一部の実施形態では、培養バッグの容積が約５０ｍＬ～約２５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積が約５０ｍＬ～約５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物をバッチ培養することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。一部の実施形態では、流加培養は、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施形態では、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第１の細胞培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約１２日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約９日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｉ）における最初の細胞密度は１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は５Ｌ～約５，０００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は約５Ｌ～約２，５００Ｌである。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における灌流バイオリアクターの容積は約５Ｌ～約１００Ｌである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養は、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施形態では、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第２の培養培地を第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培養培地は、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養を約４日～約１０日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の灌流培養を約５日～約８日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）における最初の細胞密度は１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における容器は、振とうフラスコである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１５ｍＬ～約３Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約５０ｍＬ～約１．５Ｌである。一部の実施形態では、振とうフラスコの容積は約１００ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、振とうフラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における容器は、振とう管である。一部の実施形態では、振とう管の容積は約２ｍＬ～約５００ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである。一部の実施形態では、振とう管の容積は約５０ｍＬ～約２００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、振とう管は、円錐容器である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における容器は、培養バッグである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約２５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約５Ｌである。一部の実施形態では、培養バッグの容積は約５０ｍＬ～約５００ｍＬである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）における容器は、バイオリアクターである。一部の実施形態では、バイオリアクターの容積は１Ｌ～約１５，０００Ｌである。一部の実施形態では、バイオリアクターの容積は５Ｌ～約５，０００Ｌである。一部の実施形態では、バイオリアクターの容積は約５Ｌ～約２，５００Ｌである。一部の実施形態では、バイオリアクターの容積は約５Ｌ～約１００Ｌである。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物をバッチ培養することを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物を流加培養することを含む。一部の実施形態では、流加培養は、追加的な体積の第３の培養培地を第３の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施形態では、追加的な体積の第３の培養培地を第３の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第３の細胞培養培地を第３の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）におけるバッチ培養および流加培養は、（ｉ）追加的な体積の第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加すること、および（ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加することを含む。
一部の実施形態では、追加的な体積の（ｉ）における第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって連続的に添加する。
一部の実施形態では、追加的な体積の（ｉ）における第３の培養培地を第３の細胞培養物に第１の期間にわたって定期的に添加し、かつ／または（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地を第３の細胞培養物に第２の期間にわたって定期的に添加する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、（ｉ）における第１の期間は、約１日～約７日である。一部の実施形態では、（ｉ）における第１の期間は、約３日～約５日である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、（ｉｉ）における第２の期間は、約１日～約１０日である。一部の実施形態では、（ｉｉ）における第２の期間は、約３日～約７日である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのそれぞれを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）のバッチ培養および流加培養を約８日～約１５日にわたって実施する。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）のバッチ培養または流加培養を約９日～約１３日にわたって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０５個である。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の最初の細胞密度は、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０５個である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養は、接線濾過の使用を含む。一部の実施形態では、接線濾過は、交互接線濾過（ＡＴＦ）である。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、接線濾過は、平均孔径が約１０ｎｍ～約６．０μｍのフィルターの使用を含む。一部の実施形態では、フィルターの平均孔径は、約０．１μｍ～約３．０μｍである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、赤血球前駆細胞は、ヒト赤血球前駆細胞である。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞はＯ型陰性ヒトドナーから得られるものである。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞はＯ型陰性かつＫｅｌｌ陰性ヒトドナーから得られるものである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、脱核赤血球細胞の集団は、脱核ヒト赤血球細胞の集団である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）における第３の細胞培養物から脱核赤血球細胞の集団を単離するステップをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、（ｆ）ステップ（ｅ）において単離された脱核赤血球細胞の集団を製剤化するステップをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、（ｇ）ステップ（ｆ）において製剤化された脱核赤血球細胞の集団をそれを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、第１の細胞培養物中の赤血球前駆細胞に核酸を導入するステップをさらに含み、方法により、操作された脱核赤血球細胞の集団の産生がもたらされる。
一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の集団は、操作された脱核ヒト赤血球細胞である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードするものである。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、操作されたヒト脱核赤血球細胞は、１つまたは複数の外因性タンパク質を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の外因性タンパク質を細胞にクリックコンジュゲートすることをさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、細胞に低浸透圧でロードすることをさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、細胞に物理的操作によりロードすることをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性タンパク質のうちの１つは、操作されたヒト脱核赤血球細胞の細胞質基質内に存在する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性タンパク質のうちの１つは、操作されたヒト脱核赤血球細胞の膜に存在するタンパク質である。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性タンパク質のうちの１つは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、操作されたヒト脱核赤血球細胞の細胞質基質内に存在する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性タンパク質は、免疫調節分子を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性タンパク質は、抗原提示分子を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）における第３の細胞培養物から操作された脱核赤血球細胞の集団を単離するステップをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、（ｆ）ステップ（ｅ）において単離された操作された脱核赤血球細胞の集団を製剤化するステップをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、（ｇ）ステップ（ｆ）において製剤化された操作された脱核赤血球細胞の集団をそれを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された脱核赤血球細胞集団も本明細書で提供される。
本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された製剤も本明細書で提供される。
「集団」という用語は、所与の物品（例えば、本明細書に記載の例示的な脱核赤血球細胞のいずれか）のうちの２つまたはそれよりも多くを意味する。
「操作された脱核赤血球細胞」という用語は、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な外因性タンパク質の任意の組合せ）を含む脱核赤血球細胞（例えば、ヒト脱核赤血球細胞）を意味する。例えば、操作された脱核赤血球細胞は、細胞質基質内に存在する１つまたは複数の外因性タンパク質を有し得る。一部の実施例では、操作された脱核赤血球細胞は、原形質膜に存在する１つまたは複数の外因性タンパク質を有し得る。一部の実施例では、操作された赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）は、（ｉ）細胞質基質内に存在する１つまたは複数の外因性タンパク質および（ｉｉ）原形質膜に存在する１つまたは複数の外因性タンパク質を有し得る。操作された脱核赤血球細胞の非限定的な例としては、クリックコンジュゲートした脱核赤血球細胞、低浸透圧性負荷を受けた脱核赤血球細胞、および物理的操作による負荷を受けた脱核赤血球細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の物理的操作の例示的な型のいずれか）が挙げられる。操作された脱核赤血球細胞の追加的な非限定的な態様は本明細書に記載されている。
「クリックコンジュゲートした脱核赤血球細胞」という用語は、操作された脱核赤血球細胞の原形質膜に存在する別のタンパク質（例えば、脱核赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）の内因性タンパク質または異なる外因性タンパク質）と化学反応によってコンジュゲートされた少なくとも１つの外因性タンパク質を有する操作された脱核赤血球細胞を意味する。
「低浸透圧性負荷を受けた脱核赤血球細胞」という用語は、少なくとも部分的に、脱核赤血球細胞または赤血球前駆細胞を、１つまたは複数の外因性タンパク質を含む低イオン強度緩衝剤（例えば、本明細書に記載の例示的な低イオン強度緩衝剤のいずれか）に曝露させることによって生成された、操作された脱核赤血球細胞を意味する。低浸透圧性負荷を受けた脱核赤血球細胞を生成するために使用することができる方法の非限定的な例は本明細書に記載されている。低浸透圧性負荷を受けた脱核赤血球細胞を生成するための追加的な方法は当技術分野で公知である。
「物理的操作による負荷を受けた脱核赤血球細胞」という用語は、少なくとも部分的に、１つもしくは複数の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のもしくは当技術分野で公知の例示的な外因性タンパク質のいずれか）および／または１つもしくは複数の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のもしくは当技術分野で公知の例示的な外因性タンパク質のいずれか）をコードする核酸の赤血球前駆細胞への導入がもたらされるように赤血球前駆細胞を物理的に操作することによって生成された脱核赤血球細胞を意味する。１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする核酸を赤血球前駆細胞に導入するために使用することができる物理的操作の非限定的な例としては、電気穿孔および粒子媒介性トランスフェクションが挙げられる。１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする核酸を赤血球前駆細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）に導入するために使用することができる物理的操作のさらなる例は当技術分野で公知である。
「外因性タンパク質」という用語は、細胞内もしくは細胞上に導入されるタンパク質、または、当該タンパク質をコードする外因性核酸を細胞または細胞の前駆体に導入することによって細胞による発現が引き起こされるタンパク質を指す。一部の実施形態では、外因性タンパク質は、細胞または細胞の前駆体に導入された外因性核酸によってコードされるタンパク質であり、核酸は、必要に応じて細胞により保持されない。一部の実施形態では、外因性タンパク質は、化学的または酵素的手段によって細胞の表面にコンジュゲートされたタンパク質である。非限定的なクラスの外因性タンパク質としては、酵素、インターロイキン、サイトカイン受容体、Ｆｃ結合性分子、Ｔ細胞活性化リガンド、Ｔ細胞受容体、免疫阻害分子、ＭＨＣ分子、ＡＰＣ結合性分子、自己抗原、アレルゲン、毒素、標的化作用物質、受容体リガンド（例えば、受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニスト）、および抗体または抗体断片が挙げられる。操作された脱核赤血球細胞に存在し得る外因性タンパク質のさらなる例は本明細書に記載されている（例えば、表Ａ～Ｄを参照されたい）。操作された脱核赤血球細胞に存在し得る外因性タンパク質のさらなる例は当技術分野で公知である。
「膜に存在するタンパク質」という用語は、（１）脱核赤血球細胞の膜に物理的に付着しているもしくは当該膜中に少なくとも部分的に包埋しているタンパク質（例えば、膜貫通タンパク質、表在性膜タンパク質、脂質係留タンパク質（例えば、ＧＰＩ係留、Ｎ－ミリストイル化タンパク質、もしくはＳ－パルミトイル化タンパク質））、または（２）脱核赤血球細胞の膜に物理的に付着した同類受容体と安定に結合したタンパク質（例えば、脱核赤血球細胞の膜に物理的に付着した同類受容体に結合したリガンド）を意味する。哺乳動物細胞の膜におけるタンパク質の存在を決定するための非限定的な方法としては、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学的検査、細胞分画アッセイおよびウエスタンブロッティングが挙げられる。
「赤血球前駆細胞」という用語は、最終的に脱核赤血球細胞に分化／発達することができる哺乳動物細胞を意味する。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞は、臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ、ＨＳＰＣ）、脾コロニー形成（ＣＦＵ－Ｓ）細胞、骨髄系共通前駆（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー形成細胞、前期赤芽球系前駆細胞（ｂｕｒｓｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ－ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ／ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（ＢＦＵ－Ｅ）、巨核球・赤芽球前駆（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成単位、または後期赤芽球系前駆細胞（ＣＦＵ－Ｅ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはこれらの組合せである。一部の実施例では、赤血球前駆細胞は、ヒト赤血球前駆細胞である。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞は、Ｏ型陰性ヒトドナーから得られるものであり得る。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞は、Ｏ型陰性かつＫｅｌｌ陰性ヒトドナーから得られるものであり得る。
「対象」という用語は、任意の哺乳動物を指す。一部の実施形態では、対象または「処置を必要とする対象」は、霊長類（例えば、ヒト、シミアン（例えば、サル（例えば、マーモセットまたはヒヒ）、または類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、またはテナガザル））、齧歯類（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、またはラット）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、またはヤギであり得る。一部の実施形態では、対象または「処置に適した対象」は、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして慣習的に使用される哺乳動物であり得る（例えば、マウス、ブタ、ラット、または非ヒト霊長類を使用することができる）。一部の実施例では、対象は、医療専門家（例えば、医師、検査技師、医師の補助者、看護師、または臨床検査技師）によって処置の必要があると以前に診断または同定されている対象であり得る。
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象（例えば、本明細書に記載の例示的な対象のいずれか）における医学的疾患または状態の１つまたは複数の症状の数、重症度、頻度、および／または持続時間の低減を意味する。
「振とうフラスコ」という用語は、少なくとも１つの気体透過性表面（例えば、滅菌関門としても作用し得る気体透過性要素、例えば膜を有する末端部）および／または少なくとも１つのベントキャップを有し、その形状の少なくとも一部分がほぼ円錐台状である、ある体積の液体培養培地を保持することができる容器（例えば、滅菌容器）を意味する。例えば、振とうフラスコは、Ｔフラスコ、エルレンマイヤーフラスコ、または任意の当技術分野で認められているそれらの改変バージョンなどの細胞培養フラスコであり得る。
「振とう管」という用語は、少なくとも１つの気体透過性表面（例えば、滅菌関門としても作用し得る気体透過性要素、例えば膜を有する末端部）および／または少なくとも１つのベントキャップを有し、撹拌（例えば、回転式撹拌）の際に液体培養培地を容器内に保持することができ、その形状の少なくとも一部分がほぼ円柱状である、液体培養培地を保持することができる容器（例えば、滅菌容器）を意味する。例えば、振とう管は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）管（例えば、５０ｍＬまたは１５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）管）、または任意の当技術分野で認められているその等価物または改変バージョンであり得る。一部の実施例では、振とう管は、マルチウェルプレート中のウェル（例えば、丸底ウェルまたは平底ウェル）であり得る。
「流加培養」という用語は、第１の液体培養培地を細胞培養物から実質的にまたは著しく除去することなく、第２の液体培養培地を最初の細胞培養物に漸増的または連続的に添加することを含む培養方法を意味する。一部の場合では、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じ成分を実質的に同じ濃度で含む。他の場合では、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態であり、かつ／または乾燥粉末として添加される。
「灌流培養」という用語は、液体培養培地の細胞培養物への添加（漸増的または連続的に）と、液体培養培地の細胞培養物からの除去の両方を含む培養方法を意味する。除去および添加は、同時にまたは逐次的に、またはその２つの組合せで実施することができる。さらに、除去および添加は連続的に実施することができる。
除去される液体培養培地の体積と添加される液体培養培地の体積は、一部の場合では、培養期間全体またはその一部にわたって、２４時間の期間のそれぞれ（またはその代わりに、約１時間～約２４時間の漸増期間もしくは２４時間よりも長い漸増期間）にわたってほぼ同じに保持される。当技術分野で公知の通り、液体培養培地の体積の除去速度（体積／単位時間）および液体培養培地の体積の添加速度（体積／単位時間）は変動し得る。液体培養培地の体積の除去速度（体積／単位時間）および液体培養培地の体積の添加速度（体積／単位時間）は、ほぼ同じであり得る、または異なり得る。
あるいは、除去される体積および添加される体積を、培養期間中、２４時間の期間のそれぞれ（またはその代わりに、１時間から約２４時間の間の漸増期間もしくは２４時間よりも長い漸増期間）にわたって変化させる（例えば、徐々に増加させる）ことができる。例えば、培養期間にわたって２４時間の期間のそれぞれ（またはその代わりに、約１時間から約２４時間の間の漸増期間もしくは２４時間よりも長い漸増期間）の範囲内で除去される液体培養培地の体積および添加される液体培養培地の体積を培養期間にわたって増加させることができる（例えば、徐々に、または時差的な増加によって）。
液体培養培地の体積を、例えば、液体培養培地の体積を容器（例えば、バイオリアクター）から除去することができる機械的システムによってか、細胞を落ち着かせ、液体培養培地の体積をピペット操作を使用して除去することによってか、または、遠心力の使用を少なくとも部分的に含み得る方法によって除去することができる。その代わりに、またはそれに加えて、液体培養培地の体積を、赤血球前駆細胞および脱核赤血球細胞が除外される分子量カットオフを有する滅菌膜を通した液体培養培地の体積の浸出または重力流によって除去することができる。
液体培養培地の体積を容器（例えば、バイオリアクター）に自動的に、例えば蠕動ポンプまたは灌流ポンプによって添加することができる。
「動物成分を含まない液体培養培地」という用語は、哺乳動物に由来するいかなる成分（例えば、タンパク質または血清）も含有しない液体培養培地を意味する。
「無血清液体培養培地」という用語は、哺乳動物の血清を含有しない液体培養培地を意味する。
「合成液体培養培地」という用語は、全ての化学成分が既知の液体培養培地を意味する。例えば、胎児血清、血清アルブミン、または血清アルブミンは一般にはアルブミンと脂質の複合混合物を含有するので、合成液体培養培地はこれらの調製物を含有しない。
「撹拌」という用語は、容器中の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な細胞のいずれかを含む細胞培養物）を動かすことを意味する。撹拌は、任意の当技術分野で公知の方法、例えば、細胞培養物を含有する容器を円運動または楕円運動で動かす機器、例えば、回転式振とう機などを使用して実施することができる。その代わりにまたはそれに加えて、撹拌は、容器を傾けることまたは細胞培養物を含有する容器を回転させることによって実施することができる。一部の実施形態では、細胞培養物の撹拌を、細胞培養物を含有するバイオリアクター中で羽根車を使用することによって行うことができる。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施例では、細胞培養は、本明細書に記載の方法のいずれかの少なくとも一部のための細胞培養物の撹拌を含まない。
特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明において使用するための方法および材料が本明細書に記載されている；当技術分野で公知の他の適切な方法および材料を使用することもできる。材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。本明細書で言及されている刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は全て、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書に支配される。
本発明の他の特色および利点は以下の詳細な説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、灌流培養したＭ期赤血球細胞および対照条件下で培養したＭ期赤血球細胞の脱核のパーセンテージを示すグラフである。Ｍ期は本明細書に記載の方法のステップ（ｄ）に対応する。 図２は、灌流培養したＭ期赤血球細胞および対照条件下で培養した赤血球細胞の生存細胞密度を示すグラフである。 図３は、灌流培養したＤ期赤血球細胞の生存細胞密度および生存率を示すグラフである。Ｄ期は本明細書に記載の方法のステップ（ｂ）に対応する。
詳細な説明
脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法が本明細書で提供される。脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を容器中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法も本明細書で提供される。脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、（ｂ）第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の第２の細胞培養物を容器中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたってバッチ培養または流加培養するステップとを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法も本明細書で提供される。
一部の実施例では、本明細書に記載の方法により、本明細書に記載の方法のいずれかの最後に、例えば、分化または成熟化の間に灌流培養を使用することを含まない同様の方法と比較して、脱核率または脱核細胞のパーセンテージの上昇（例えば、少なくとも１％～約３００％の上昇（例えば、約１％～約２８０％の上昇、約１％～約２６０％の上昇、約１％～約２４０％の上昇、約１％～約２２０％の上昇、約１％～約２００％の上昇、約１％～約１８０％の上昇、約１％～約１６０％の上昇、約１％の上昇～約１４０％の上昇、約１％～約１２０％の上昇、約１％の上昇～約１００％の上昇、約１％の上昇～約８０％の上昇、約１％の上昇～約６０％の上昇、約１％の上昇～約４０％の上昇、約１％の上昇～約２０％の上昇、約１％の上昇～約１０％の上昇、約１％の上昇～約５％の上昇、約５％の上昇～約３００％の上昇、約５％～約２８０％の上昇、約５％～約２６０％の上昇、約５％～約２４０％の上昇、約５％～約２２０％の上昇、約５％～約２００％の上昇、約５％～約１８０％の上昇、約５％～約１６０％の上昇、約５％の上昇～約１４０％の上昇、約５％～約１２０％の上昇、約５％の上昇～約１００％の上昇、約５％の上昇～約８０％の上昇、約５％の上昇～約６０％の上昇、約５％の上昇～約４０％の上昇、約５％の上昇～約２０％の上昇、約５％の上昇～約１０％の上昇、約１０％の上昇～約３００％の上昇、約１０％～約２８０％の上昇、約１０％～約２６０％の上昇、約１０％～約２４０％の上昇、約１０％～約２２０％の上昇、約１０％～約２００％の上昇、約１０％～約１８０％の上昇、約１０％～約１６０％の上昇、約１０％の上昇～約１４０％の上昇、約１０％～約１２０％の上昇、約１０％の上昇～約１００％の上昇、約１０％の上昇～約８０％の上昇、約１０％の上昇～約６０％の上昇、約１０％の上昇～約４０％の上昇、約１０％の上昇～約２０％の上昇、約２０％の上昇～約３００％の上昇、約２０％～約２８０％の上昇、約２０％～約２６０％の上昇、約２０％～約２４０％の上昇、約２０％～約２２０％の上昇、約２０％～約２００％の上昇、約２０％～約１８０％の上昇、約２０％～約１６０％の上昇、約２０％の上昇～約１４０％の上昇、約２０％～約１２０％の上昇、約２０％の上昇～約１００％の上昇、約２０％の上昇～約８０％の上昇、約２０％の上昇～約６０％の上昇、約２０％の上昇～約４０％の上昇、約４０％の上昇～約３００％の上昇、約４０％～約２８０％の上昇、約４０％～約２６０％の上昇、約４０％～約２４０％の上昇、約４０％～約２２０％の上昇、約４０％～約２００％の上昇、約４０％～約１８０％の上昇、約４０％～約１６０％の上昇、約４０％の上昇～約１４０％の上昇、約４０％～約１２０％の上昇、約４０％の上昇～約１００％の上昇、約４０％の上昇～約８０％の上昇、約４０％の上昇～約６０％の上昇、約６０％の上昇～約３００％の上昇、約６０％～約２８０％の上昇、約６０％～約２６０％の上昇、約６０％～約２４０％の上昇、約６０％～約２２０％の上昇、約６０％～約２００％の上昇、約６０％～約１８０％の上昇、約６０％～約１６０％の上昇、約６０％の上昇～約１４０％の上昇、約６０％～約１２０％の上昇、約６０％の上昇～約１００％の上昇、約６０％の上昇～約８０％の上昇、約８０％の上昇～約３００％の上昇、約８０％～約２８０％の上昇、約８０％～約２６０％の上昇、約８０％～約２４０％の上昇、約８０％～約２２０％の上昇、約８０％～約２００％の上昇、約８０％～約１８０％の上昇、約８０％～約１６０％の上昇、約８０％の上昇～約１４０％の上昇、約８０％～約１２０％の上昇、約８０％の上昇～約１００％の上昇、約１００％の上昇～約３００％の上昇、約１００％～約２８０％の上昇、約１００％～約２６０％の上昇、約１００％～約２４０％の上昇、約１００％～約２２０％の上昇、約１００％～約２００％の上昇、約１００％～約１８０％の上昇、約１００％～約１６０％の上昇、約１００％の上昇～約１４０％の上昇、約１００％～約１２０％の上昇、約１２０％の上昇～約３００％の上昇、約１２０％～約２８０％の上昇、約１２０％～約２６０％の上昇、約１２０％～約２４０％の上昇、約１２０％～約２２０％の上昇、約１２０％～約２００％の上昇、約１２０％～約１８０％の上昇、約１２０％～約１６０％の上昇、約１２０％の上昇～約１４０％の上昇、約１４０％の上昇～約３００％の上昇、約１４０％～約２８０％の上昇、約１４０％～約２６０％の上昇、約１４０％～約２４０％の上昇、約１４０％～約２２０％の上昇、約１４０％～約２００％の上昇、約１４０％～約１８０％の上昇、約１４０％～約１６０％の上昇、約１６０％の上昇～約３００％の上昇、約１６０％～約２８０％の上昇、約１６０％～約２６０％の上昇、約１６０％～約２４０％の上昇、約１６０％～約２２０％の上昇、約１６０％～約２００％の上昇、約１６０％～約１８０％の上昇、約１８０％の上昇～約３００％の上昇、約１８０％～約２８０％の上昇、約１８０％～約２６０％の上昇、約１８０％～約２４０％の上昇、約１８０％～約２２０％の上昇、約１８０％～約２００％の上昇、約２００％の上昇～約３００％の上昇、約２００％～約２８０％の上昇、約２００％～約２６０％の上昇、約２００％～約２４０％の上昇、約２００％～約２２０％の上昇、約２２０％の上昇～約３００％の上昇、約２２０％～約２８０％の上昇、約２２０％～約２６０％の上昇、約２２０％～約２４０％の上昇、約２４０％の上昇～約３００％の上昇、約２４０％～約２８０％の上昇、約２４０％～約２６０％の上昇、約２６０％の上昇～約３００％の上昇、約２６０％～約２８０％の上昇、または約２８０％の上昇～約３００％の上昇））がもたらされる。
一部の実施例では、本明細書に記載の方法により、本明細書に記載の方法のいずれかの最後に、例えば、分化または成熟化の間に灌流培養を使用することを含まない同様の方法と比較して、脱核赤血球細胞（例えば、本明細書に記載の脱核赤血球細胞のいずれか）の濃度、数、または収量の約１％の増大～約３００％の増大（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）がもたらされる。
一部の実施例では、本明細書に記載の方法により、本明細書に記載の方法のいずれかの間に、例えば、分化または成熟化の間に灌流培養を使用することを含まない同様の方法と比較して、赤血球系前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌ）当たりの細胞分裂の平均数の約１％の増加～約３００％の増加（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）がもたらされる。
これらの方法の非限定的な態様を以下に記載する。当業者は理解することができる通り、以下に列挙されている例示的な態様を任意の組合せで使用することができ、また、当該分野で公知の他の態様と組み合わせることができる。
振とうフラスコ
本明細書に記載の方法の一部の態様は、振とうフラスコの使用を含む。一部の実施例では、振とうフラスコの容積は、約２ｍＬ～約５Ｌ、約２ｍＬ～約４．５Ｌ、約２ｍＬ～約４Ｌ、約２ｍＬ～約３．５Ｌ、約２ｍＬ～約３Ｌ、約２ｍＬ～約２．５Ｌ、約２ｍＬ～約２Ｌ、約２ｍＬ～約１．５Ｌ、約２ｍＬ～約１．０Ｌ、約２ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２ｍＬ～約９００ｍＬ、約２ｍＬ～約８５０ｍＬ、約２ｍＬ～約８００ｍＬ、約２ｍＬ～約７５０ｍＬ、約２ｍＬ～約７００ｍＬ、約２ｍＬ～約６５０ｍＬ、約２ｍＬ～約６００ｍＬ、約２ｍＬ～約５５０ｍＬ、約２ｍＬ～約５００ｍＬ、約２ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２ｍＬ～約４００ｍＬ、約２ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２ｍＬ～約３００ｍＬ、約２ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２ｍＬ～約２００ｍＬ、約２ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１００ｍＬ、約２ｍＬ～約８０ｍＬ、約２ｍＬ～約６０ｍＬ、約２ｍＬ～約４０ｍＬ、約２ｍＬ～約２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１０ｍＬ、約２ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約５Ｌ、約５ｍＬ～約４．５Ｌ、約５ｍＬ～約４Ｌ、約５ｍＬ～約３．５Ｌ、約５ｍＬ～約３Ｌ、約５ｍＬ～約２．５Ｌ、約５ｍＬ～約２Ｌ、約５ｍＬ～約１．５Ｌ、約５ｍＬ～約１．０Ｌ、約５ｍＬ～約９５０ｍＬ、約５ｍＬ～約９００ｍＬ、約５ｍＬ～約８５０ｍＬ、約５ｍＬ～約８００ｍＬ、約５ｍＬ～約７５０ｍＬ、約５ｍＬ～約７００ｍＬ、約５ｍＬ～約６５０ｍＬ、約５ｍＬ～約６００ｍＬ、約５ｍＬ～約５５０ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約８０ｍＬ、約５ｍＬ～約６０ｍＬ、約５ｍＬ～約４０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５Ｌ、約１０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１０ｍＬ～約４Ｌ、約１０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１０ｍＬ～約３Ｌ、約１０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１０ｍＬ～約２Ｌ、約１０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５Ｌ、約２０ｍＬ～約４．５Ｌ、約２０ｍＬ～約４Ｌ、約２０ｍＬ～約３．５Ｌ、約２０ｍＬ～約３Ｌ、約２０ｍＬ～約２．５Ｌ、約２０ｍＬ～約２Ｌ、約２０ｍＬ～約１．５Ｌ、約２０ｍＬ～約１．０Ｌ、約２０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約９００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約７００ｍＬ、約２０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約５Ｌ、約４０ｍＬ～約４．５Ｌ、約４０ｍＬ～約４Ｌ、約４０ｍＬ～約３．５Ｌ、約４０ｍＬ～約３Ｌ、約４０ｍＬ～約２．５Ｌ、約４０ｍＬ～約２Ｌ、約４０ｍＬ～約１．５Ｌ、約４０ｍＬ～約１．０Ｌ、約４０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約９００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約７００ｍＬ、約４０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約５Ｌ、約６０ｍＬ～約４．５Ｌ、約６０ｍＬ～約４Ｌ、約６０ｍＬ～約３．５Ｌ、約６０ｍＬ～約３Ｌ、約６０ｍＬ～約２．５Ｌ、約６０ｍＬ～約２Ｌ、約６０ｍＬ～約１．５Ｌ、約６０ｍＬ～約１．０Ｌ、約６０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約９００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約８００ｍＬ、約６０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約７００ｍＬ、約６０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約６００ｍＬ、約６０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約５Ｌ、約８０ｍＬ～約４．５Ｌ、約８０ｍＬ～約４Ｌ、約８０ｍＬ～約３．５Ｌ、約８０ｍＬ～約３Ｌ、約８０ｍＬ～約２．５Ｌ、約８０ｍＬ～約２Ｌ、約８０ｍＬ～約１．５Ｌ、約８０ｍＬ～約１．０Ｌ、約８０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約９００ｍＬ、約８０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約８０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約７００ｍＬ、約８０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約８０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５Ｌ、約１００ｍＬ～約４．５Ｌ、約１００ｍＬ～約４Ｌ、約１００ｍＬ～約３．５Ｌ、約１００ｍＬ～約３Ｌ、約１００ｍＬ～約２．５Ｌ、約１００ｍＬ～約２Ｌ、約１００ｍＬ～約１．５Ｌ、約１００ｍＬ～約１．０Ｌ、約１００ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約９００ｍＬ、約１００ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約７００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５Ｌ、約１２０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約４Ｌ、約１２０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約３Ｌ、約１２０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約２Ｌ、約１２０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１２０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１２０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５Ｌ、約１４０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約４Ｌ、約１４０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約３Ｌ、約１４０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約２Ｌ、約１４０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１４０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１４０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５Ｌ、約１６０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約４Ｌ、約１６０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約３Ｌ、約１６０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約２Ｌ、約１６０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１６０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１６０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５Ｌ、約１８０ｍＬ～約４．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約４Ｌ、約１８０ｍＬ～約３．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約３Ｌ、約１８０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約２Ｌ、約１８０ｍＬ～約１．５Ｌ、約１８０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１８０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約６５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５Ｌ、約２００ｍＬ～約４．５Ｌ、約２００ｍＬ～約４Ｌ、約２００ｍＬ～約３．５Ｌ、約２００ｍＬ～約３Ｌ、約２００ｍＬ～約２．５Ｌ、約２００ｍＬ～約２Ｌ、約２００ｍＬ～約１．５Ｌ、約２００ｍＬ～約１．０Ｌ、約２００ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約９００ｍＬ、約２００ｍＬ～約８５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約７５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約７００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５Ｌ、約２５０ｍＬ～約４．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約４Ｌ、約２５０ｍＬ～約３．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約３Ｌ、約２５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約２Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約２５０ｍＬ～約９５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約８５０ｍＬ、約
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一部の実施例では、振とうフラスコを、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（例えば、約０．１×ｇ～約４０×ｇ、約０．１×ｇ～約３０×ｇ、約０．１×ｇ～約２０×ｇ、約０．１×ｇ～約１５×ｇ、約０．１×ｇ～約１０×ｇ、約０．１×ｇ～約９．５×ｇ、約０．１×ｇ～約９．０×ｇ、約０．１×ｇ～約８．５×ｇ、約０．１×ｇ～約８．０×ｇ、約０．１×ｇ～約７．５×ｇ、約０．１×ｇ～約７．０×ｇ、約０．１×ｇ～約６．５×ｇ、約０．１×ｇ～約６．０×ｇ、約０．１×ｇ～約５．５×ｇ、約０．１×ｇ～約５．０×ｇ、約０．１×ｇ～約４．５×ｇ、約０．１×ｇ～約４．１×ｇ、約０．１×ｇ～約４．０×ｇ、約０．１×ｇ～約３．５×ｇ、約０．１×ｇ～約３．０×ｇ、約０．１×ｇ～約２．５×ｇ、約０．１×ｇ～約２．０×ｇ、約０．１×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．１×ｇ～約１．６×ｇ、約０．１×ｇ～約１．４×ｇ、約０．１×ｇ～約１．２×ｇ、約０．１×ｇ～約１．０×ｇ、約０．１×ｇ～約０．８×ｇ、約０．１×ｇ～約０．６×ｇ、約０．１×ｇ～約０．４×ｇ、約０．１×ｇ～約０．２３×ｇ、約０．２３×ｇ～約５０×ｇ、約０．２３×ｇ～約４０×ｇ、約０．２３×ｇ～約３０×ｇ、約０．２３×ｇ～約２０×ｇ、約０．２３×ｇ～約１５×ｇ、約０．２３×ｇ～約１０×ｇ、約０．２３×ｇ～約９．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約９．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約８．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約８．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約７．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約７．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約６．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約６．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約５．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約５．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約４．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約４．１×ｇ、約０．２３×ｇ～約４．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約３．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約３．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約２．５×ｇ、約０．２３×ｇ～約２．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．６×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．４×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．２×ｇ、約０．２３×ｇ～約１．０×ｇ、約０．２３×ｇ～約０．８×ｇ、約０．２３×ｇ～約０．６×ｇ、約０．２３×ｇ～約０．４×ｇ、約０．４×ｇ～約５０×ｇ、約０．４×ｇ～約４０×ｇ、約０．４×ｇ～約３０×ｇ、約０．４×ｇ～約２０×ｇ、約０．４×ｇ～約１５×ｇ、約０．４×ｇ～約１０×ｇ、約０．４×ｇ～約９．５×ｇ、約０．４×ｇ～約９．０×ｇ、約０．４×ｇ～約８．５×ｇ、約０．４×ｇ～約８．０×ｇ、約０．４×ｇ～約７．５×ｇ、約０．４×ｇ～約７．０×ｇ、約０．４×ｇ～約６．５×ｇ、約０．４×ｇ～約６．０×ｇ、約０．４×ｇ～約５．５×ｇ、約０．４×ｇ～約５．０×ｇ、約０．４×ｇ～約４．５×ｇ、約０．４×ｇ～約４．１×ｇ、約０．４×ｇ～約４．０×ｇ、約０．４×ｇ～約３．５×ｇ、約０．４×ｇ～約３．０×ｇ、約０．４×ｇ～約２．５×ｇ、約０．４×ｇ～約２．０×ｇ、約０．４×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．４×ｇ～約１．６×ｇ、約０．４×ｇ～約１．４×ｇ、約０．４×ｇ～約１．２×ｇ、約０．４×ｇ～約１．０×ｇ、約０．４×ｇ～約０．８×ｇ、約０．４×ｇ～約０．６×ｇ、約０．６×ｇ～約５０×ｇ、約０．６×ｇ～約４０×ｇ、約０．６×ｇ～約３０×ｇ、約０．６×ｇ～約２０×ｇ、約０．６×ｇ～約１５×ｇ、約０．６×ｇ～約１０×ｇ、約０．６×ｇ～約９．５×ｇ、約０．６×ｇ～約９．０×ｇ、約０．６×ｇ～約８．５×ｇ、約０．６×ｇ～約８．０×ｇ、約０．６×ｇ～約７．５×ｇ、約０．６×ｇ～約７．０×ｇ、約０．６×ｇ～約６．５×ｇ、約０．６×ｇ～約６．０×ｇ、約０．６×ｇ～約５．５×ｇ、約０．６×ｇ～約５．０×ｇ、約０．６×ｇ～約４．５×ｇ、約０．６×ｇ～約４．１×ｇ、約０．６×ｇ～約４．０×ｇ、約０．６×ｇ～約３．５×ｇ、約０．６×ｇ～約３．０×ｇ、約０．６×ｇ～約２．５×ｇ、約０．６×ｇ～約２．０×ｇ、約０．６×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．６×ｇ～約１．６×ｇ、約０．６×ｇ～約１．４×ｇ、約０．６×ｇ～約１．２×ｇ、約０．６×ｇ～約１．０×ｇ、約０．６×ｇ～約０．８×ｇ、約０．８×ｇ～約５０×ｇ、約０．８×ｇ～約４０×ｇ、約０．８×ｇ～約３０×ｇ、約０．８×ｇ～約２０×ｇ、約０．８×ｇ～約１５×ｇ、約０．８×ｇ～約１０×ｇ、約０．８×ｇ～約９．５×ｇ、約０．８×ｇ～約９．０×ｇ、約０．８×ｇ～約８．５×ｇ、約０．８×ｇ～約８．０×ｇ、約０．８×ｇ～約７．５×ｇ、約０．８×ｇ～約７．０×ｇ、約０．８×ｇ～約６．５×ｇ、約０．８×ｇ～約６．０×ｇ、約０．８×ｇ～約５．５×ｇ、約０．８×ｇ～約５．０×ｇ、約０．８×ｇ～約４．５×ｇ、約０．８×ｇ～約４．１×ｇ、約０．８×ｇ～約４．０×ｇ、約０．８×ｇ～約３．５×ｇ、約０．８×ｇ～約３．０×ｇ、約０．８×ｇ～約２．５×ｇ、約０．８×ｇ～約２．０×ｇ、約０．８×ｇ～約１．７８×ｇ、約０．８×ｇ～約１．６×ｇ、約０．８×ｇ～約１．４×ｇ、約０．８×ｇ～約１．２×ｇ、約０．８×ｇ～約１．０×ｇ、約１．０×ｇ～約５０×ｇ、約１．０×ｇ～約４０×ｇ、約１．０×ｇ～約３０×ｇ、約１．０×ｇ～約２０×ｇ、約１．０×ｇ～約１５×ｇ、約１．０×ｇ～約１０×ｇ、約１．０×ｇ～約９．５×ｇ、約１．０×ｇ～約９．０×ｇ、約１．０×ｇ～約８．５×ｇ、約１．０×ｇ～約８．０×ｇ、約１．０×ｇ～約７．５×ｇ、約１．０×ｇ～約７．０×ｇ、約１．０×ｇ～約６．５×ｇ、約１．０×ｇ～約６．０×ｇ、約１．０×ｇ～約５．５×ｇ、約１．０×ｇ～約５．０×ｇ、約１．０×ｇ～約４．５×ｇ、約１．０×ｇ～約４．１×ｇ、約１．０×ｇ～約４．０×ｇ、約１．０×ｇ～約３．５×ｇ、約１．０×ｇ～約３．０×ｇ、約１．０×ｇ～約２．５×ｇ、約１．０×ｇ～約２．０×ｇ、約１．０×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．０×ｇ～約１．６×ｇ、約１．０×ｇ～約１．４×ｇ、約１．０×ｇ～約１．２×ｇ、約１．２×ｇ～約５０×ｇ、約１．２×ｇ～約４０×ｇ、約１．２×ｇ～約３０×ｇ、約１．２×ｇ～約２０×ｇ、約１．２×ｇ～約１５×ｇ、約１．２×ｇ～約１０×ｇ、約１．２×ｇ～約９．５×ｇ、約１．２×ｇ～約９．０×ｇ、約１．２×ｇ～約８．５×ｇ、約１．２×ｇ～約８．０×ｇ、約１．２×ｇ～約７．５×ｇ、約１．２×ｇ～約７．０×ｇ、約１．２×ｇ～約６．５×ｇ、約１．２×ｇ～約６．０×ｇ、約１．２×ｇ～約５．５×ｇ、約１．２×ｇ～約５．０×ｇ、約１．２×ｇ～約４．５×ｇ、約１．２×ｇ～約４．１×ｇ、約１．２×ｇ～約４．０×ｇ、約１．２×ｇ～約３．５×ｇ、約１．２×ｇ～約３．０×ｇ、約１．２×ｇ～約２．５×ｇ、約１．２×ｇ～約２．０×ｇ、約１．２×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．２×ｇ～約１．６×ｇ、約１．２×ｇ～約１．４×ｇ、約１．４×ｇ～約５０×ｇ、約１．４×ｇ～約４０×ｇ、約１．４×ｇ～約３０×ｇ、約１．４×ｇ～約２０×ｇ、約１．４×ｇ～約１５×ｇ、約１．４×ｇ～約１０×ｇ、約１．４×ｇ～約９．５×ｇ、約１．４×ｇ～約９．０×ｇ、約１．４×ｇ～約８．５×ｇ、約１．４×ｇ～約８．０×ｇ、約１．４×ｇ～約７．５×ｇ、約１．４×ｇ～約７．０×ｇ、約１．４×ｇ～約６．５×ｇ、約１．４×ｇ～約６．０×ｇ、約１．４×ｇ～約５．５×ｇ、約１．４×ｇ～約５．０×ｇ、約１．４×ｇ～約４．５×ｇ、約１．４×ｇ～約４．１×ｇ、約１．４×ｇ～約４．０×ｇ、約１．４×ｇ～約３．５×ｇ、約１．４×ｇ～約３．０×ｇ、約１．４×ｇ～約２．５×ｇ、約１．４×ｇ～約２．０×ｇ、約１．４×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．４×ｇ～約１．６×ｇ、約１．６×ｇ～約５０×ｇ、約１．６×ｇ～約４０×ｇ、約１．６×ｇ～約３０×ｇ、約１．６×ｇ～約２０×ｇ、約１．６×ｇ～約１５×ｇ、約１．６×ｇ～約１０×ｇ、約１．６×ｇ～約９．５×ｇ、約１．６×ｇ～約９．０×ｇ、約１．６×ｇ～約８．５×ｇ、約１．６×ｇ～約８．０×ｇ、約１．６×ｇ～約７．５×ｇ、約１．６×ｇ～約７．０×ｇ、約１．６×ｇ～約６．５×ｇ、約１．６×ｇ～約６．０×ｇ、約１．６×ｇ～約５．５×ｇ、約１．６×ｇ～約５．０×ｇ、約１．６×ｇ～約４．５×ｇ、約１．６×ｇ～約４．１×ｇ、約１．６×ｇ～約４．０×ｇ、約１．６×ｇ～約３．５×ｇ、約１．６×ｇ～約３．０×ｇ、約１．６×ｇ～約２．５×ｇ、約１．６×ｇ～約２．０×ｇ、約１．６×ｇ～約１．７８×ｇ、約１．７８×ｇ～約５０×ｇ、約１．７８×ｇ～約４０×ｇ、約１．７８×ｇ～約３０×ｇ、約１．７８×ｇ～約２０×ｇ、約１．７８×ｇ～約１５×ｇ、約１．７８×ｇ～約１０×ｇ、約１．７８×ｇ～約９．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約９．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約８．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約８．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約７．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約７．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約６．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約６．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約５．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約５．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約４．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約４．１×ｇ、約１．７８×ｇ～約４．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約３．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約３．０×ｇ、約１．７８×ｇ～約２．５×ｇ、約１．７８×ｇ～約２．０×ｇ、約２．０×ｇ～約５０×ｇ、約２．０×ｇ～約４０×ｇ、約２．０×ｇ～約３０×ｇ、約２．０×ｇ～約２０×ｇ、約２．０×ｇ～約１５×ｇ、約２．０×ｇ～約１０×ｇ、約２．０×ｇ～約９．５×ｇ、約２．０×ｇ～約９．０×ｇ、約２．０×ｇ～約８．５×ｇ、約２．０×ｇ～約８．０×ｇ、約２．０×ｇ～約７．５×ｇ、約２．０×ｇ～約７．０×ｇ、約２．０×ｇ～約６．５×ｇ、約２．０×ｇ～約６．０×ｇ、約２．０×ｇ～約５．５×ｇ、約２．０×ｇ～約５．０×ｇ、約２．０×ｇ～約４．５×ｇ、約２．０×ｇ～約４．１×ｇ、約２．０×ｇ～約４．０×ｇ、約２．０×ｇ～約３．５×ｇ、約２．０×ｇ～約３．０×ｇ、約２．０×ｇ～約２．５×ｇ、約２．５×ｇ～約５０×ｇ、約２．５×ｇ～約４０×ｇ、約２．５×ｇ～約３０×ｇ、約２．５×ｇ～約２０×ｇ、約２．５×ｇ～約１５×ｇ、約２．５×ｇ～約１０×ｇ、約２．５×ｇ～約９．５×ｇ、約２．５×ｇ～約９．０×ｇ、約２．５×ｇ～約８．５×ｇ、約２．５×ｇ～約８．０×ｇ、約２．５×ｇ～約７．５×ｇ、約２．５×ｇ～約７．０×ｇ、約２．５×ｇ～約６．５×ｇ、約２．５×ｇ～約６．０×ｇ、約２．５×ｇ～約５．５×ｇ、約２．５×ｇ～約５．０×ｇ、約２．５×ｇ～約４．５×ｇ、約２．５×ｇ～約４．１×ｇ、約２．５×ｇ～約４．０×ｇ、約２．５×ｇ～約３．５×ｇ、約２．５×ｇ～約３．０×ｇ、約３．０×ｇ～約５０×ｇ、約３．０×ｇ～約４０×ｇ、約３．０×ｇ～約３０×ｇ、約３．０×ｇ～約２０×ｇ、約３．０×ｇ～約１５×ｇ、約３．０×ｇ～約１０×ｇ、約３．０×ｇ～約９．５×ｇ、約３．０×ｇ～約９．０×ｇ、約３．０×ｇ～約８．５×ｇ、約３．０×ｇ～約８．０×ｇ、約３．０×ｇ～約７．５×ｇ、約３．０×ｇ～約７．０×ｇ、約３．０×ｇ～約６．５×ｇ、約３．０×ｇ～約６．０×ｇ、約３．０×ｇ～約５．５×ｇ、約３．０×ｇ～約５．０×ｇ、約３．０×ｇ～約４．５×ｇ、約３．０×ｇ～約４．１×ｇ、約３．０×ｇ～約４．０×ｇ、約３．０×ｇ～約３．５×ｇ、約３．５×ｇ～約５０×ｇ、約３．５×ｇ～約４０×ｇ、約３．５×ｇ～約３０×ｇ、約３．５×ｇ～約２０×ｇ、約３．５×ｇ～約１５×ｇ、約３．５×ｇ～約１０×ｇ、約３．５×ｇ～約９．５×ｇ、約３．５×ｇ～約９．０×ｇ、約３．５×ｇ～約８．５×ｇ、約３．５×ｇ～約８．０×ｇ、約３．５×ｇ～約７．５×ｇ、約３．５×ｇ～約７．０×ｇ、約３．５×ｇ～約６．５×ｇ、約３．５×ｇ～約６．０×ｇ、約３．５×ｇ～約５．５×ｇ、約３．５×ｇ～約５．０×ｇ、約３．５×ｇ～約４．５×ｇ、約３．５×ｇ～約４．１×ｇ、約３．５×ｇ～約４．０×ｇ、約４．０×ｇ～約５０×ｇ、約４．０×ｇ～約４０×ｇ、約４．０×ｇ～約３０×ｇ、約４．０×ｇ～約２０×ｇ、約４．０×ｇ～約１５×ｇ、約４．０×ｇ～約１０×ｇ、約４．０×ｇ～約９．５×ｇ、約４．０×ｇ～約９．０×ｇ、約４．０×ｇ～約８．５×ｇ、
約４．０×ｇ～約８．０×ｇ、約４．０×ｇ～約７．５×ｇ、約４．０×ｇ～約７．０×ｇ、約４．０×ｇ～約６．５×ｇ、約４．０×ｇ～約６．０×ｇ、約４．０×ｇ～約５．５×ｇ、約４．０×ｇ～約５．０×ｇ、約４．０×ｇ～約４．５×ｇ、約４．０×ｇ～約４．１×ｇ、約４．１×ｇ～約５０×ｇ、約４．１×ｇ～約４０×ｇ、約４．１×ｇ～約３０×ｇ、約４．１×ｇ～約２０×ｇ、約４．１×ｇ～約１５×ｇ、約４．１×ｇ～約１０×ｇ、約４．１×ｇ～約９．５×ｇ、約４．１×ｇ～約９．０×ｇ、約４．１×ｇ～約８．５×ｇ、約４．１×ｇ～約８．０×ｇ、約４．１×ｇ～約７．５×ｇ、約４．１×ｇ～約７．０×ｇ、約４．１×ｇ～約６．５×ｇ、約４．１×ｇ～約６．０×ｇ、約４．１×ｇ～約５．５×ｇ、約４．１×ｇ～約５．０×ｇ、約４．１×ｇ～約４．５×ｇ、約４．５×ｇ～約５０×ｇ、約４．５×ｇ～約４０×ｇ、約４．５×ｇ～約３０×ｇ、約４．５×ｇ～約２０×ｇ、約４．５×ｇ～約１５×ｇ、約４．５×ｇ～約１０×ｇ、約４．５×ｇ～約９．５×ｇ、約４．５×ｇ～約９．０×ｇ、約４．５×ｇ～約８．５×ｇ、約４．５×ｇ～約８．０×ｇ、約４．５×ｇ～約７．５×ｇ、約４．５×ｇ～約７．０×ｇ、約４．５×ｇ～約６．５×ｇ、約４．５×ｇ～約６．０×ｇ、約４．５×ｇ～約５．５×ｇ、約４．５×ｇ～約５．０×ｇ、約５．０×ｇ～約５０×ｇ、約５．０×ｇ～約４０×ｇ、約５．０×ｇ～約３０×ｇ、約５．０×ｇ～約２０×ｇ、約５．０×ｇ～約１５×ｇ、約５．０×ｇ～約１０×ｇ、約５．０×ｇ～約９．５×ｇ、約５．０×ｇ～約９．０×ｇ、約５．０×ｇ～約８．５×ｇ、約５．０×ｇ～約８．０×ｇ、約５．０×ｇ～約７．５×ｇ、約５．０×ｇ～約７．０×ｇ、約５．０×ｇ～約６．５×ｇ、約５．０×ｇ～約６．０×ｇ、約５．０×ｇ～約５．５×ｇ、約５．５×ｇ～約５０×ｇ、約５．５×ｇ～約４０×ｇ、約５．５×ｇ～約３０×ｇ、約５．５×ｇ～約２０×ｇ、約５．５×ｇ～約１５×ｇ、約５．５×ｇ～約１０×ｇ、約５．５×ｇ～約９．５×ｇ、約５．５×ｇ～約９．０×ｇ、約５．５×ｇ～約８．５×ｇ、約５．５×ｇ～約８．０×ｇ、約５．５×ｇ～約７．５×ｇ、約５．５×ｇ～約７．０×ｇ、約５．５×ｇ～約６．５×ｇ、約５．５×ｇ～約６．０×ｇ、約６．０×ｇ～約５０×ｇ、約６．０×ｇ～約４０×ｇ、約６．０×ｇ～約３０×ｇ、約６．０×ｇ～約２０×ｇ、約６．０×ｇ～約１５×ｇ、約６．０×ｇ～約１０×ｇ、約６．０×ｇ～約９．５×ｇ、約６．０×ｇ～約９．０×ｇ、約６．０×ｇ～約８．５×ｇ、約６．０×ｇ～約８．０×ｇ、約６．０×ｇ～約７．５×ｇ、約６．０×ｇ～約７．０×ｇ、約６．０×ｇ～約６．５×ｇ、約６．５×ｇ～約５０×ｇ、約６．５×ｇ～約４０×ｇ、約６．５×ｇ～約３０×ｇ、約６．５×ｇ～約２０×ｇ、約６．５×ｇ～約１５×ｇ、約６．５×ｇ～約１０×ｇ、約６．５×ｇ～約９．５×ｇ、約６．５×ｇ～約９．０×ｇ、約６．５×ｇ～約８．５×ｇ、約６．５×ｇ～約８．０×ｇ、約６．５×ｇ～約７．５×ｇ、約６．５×ｇ～約７．０×ｇ、約７．０×ｇ～約５０×ｇ、約７．０×ｇ～約４０×ｇ、約７．０×ｇ～約３０×ｇ、約７．０×ｇ～約２０×ｇ、約７．０×ｇ～約１５×ｇ、約７．０×ｇ～約１０×ｇ、約７．０×ｇ～約９．５×ｇ、約７．０×ｇ～約９．０×ｇ、約７．０×ｇ～約８．５×ｇ、約７．０×ｇ～約８．０×ｇ、約７．０×ｇ～約７．５×ｇ、約７．５×ｇ～約５０×ｇ、約７．５×ｇ～約４０×ｇ、約７．５×ｇ～約３０×ｇ、約７．５×ｇ～約２０×ｇ、約７．５×ｇ～約１５×ｇ、約７．５×ｇ～約１０×ｇ、約７．５×ｇ～約９．５×ｇ、約７．５×ｇ～約９．０×ｇ、約７．５×ｇ～約８．５×ｇ、約７．５×ｇ～約８．０×ｇ、約８．０×ｇ～約５０×ｇ、約８．０×ｇ～約４０×ｇ、約８．０×ｇ～約３０×ｇ、約８．０×ｇ～約２０×ｇ、約８．０×ｇ～約１５×ｇ、約８．０×ｇ～約１０×ｇ、約８．０×ｇ～約９．５×ｇ、約８．０×ｇ～約９．０×ｇ、約８．０×ｇ～約８．５×ｇ、約８．５×ｇ～約５０×ｇ、約８．５×ｇ～約４０×ｇ、約８．５×ｇ～約３０×ｇ、約８．５×ｇ～約２０×ｇ、約８．５×ｇ～約１５×ｇ、約８．５×ｇ～約１０×ｇ、約８．５×ｇ～約９．５×ｇ、約８．５×ｇ～約９．０×ｇ、約９．０×ｇ～約５０×ｇ、約９．０×ｇ～約４０×ｇ、約９．０×ｇ～約３０×ｇ、約９．０×ｇ～約２０×ｇ、約９．０×ｇ～約１５×ｇ、約９．０×ｇ～約１０×ｇ、約９．０×ｇ～約９．５×ｇ、約９．５×ｇ～約５０×ｇ、約９．５×ｇ～約４０×ｇ、約９．５×ｇ～約３０×ｇ、約９．５×ｇ～約２０×ｇ、約９．５×ｇ～約１５×ｇ、約９．５×ｇ～約１０×ｇ、約１０×ｇ～約５０×ｇ、約１０×ｇ～約４０×ｇ、約１０×ｇ～約３０×ｇ、約１０×ｇ～約２０×ｇ、約１０×ｇ～約１５×ｇ、約１５×ｇ～約５０×ｇ、約１５×ｇ～約４０×ｇ、約１５×ｇ～約３０×ｇ、約１５×ｇ～約２０×ｇ、約２０×ｇ～約５０×ｇ、約２０×ｇ～約４０×ｇ、約２０×ｇ～約３０×ｇ、約３０×ｇ～約５０×ｇ、約３０×ｇ～約４０×ｇ、または約４０×ｇ～約５０×ｇ）で撹拌しながらインキュベートすることができる。
種々の振とうフラスコが市販されている。振とうフラスコの追加的な非限定的な態様は当技術分野で公知である。
振とう管
本明細書に記載の方法の一部の態様は、振とう管の使用を含む。一部の実施例では、振とう管の容積は、約１ｍＬ～約５００ｍＬ、約１ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１ｍＬ～約４００ｍＬ、約１ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１ｍＬ～約３００ｍＬ、約１ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１ｍＬ～約２００ｍＬ、約１ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１ｍＬ～約１００ｍＬ、約１ｍＬ～約８０ｍＬ、約１ｍＬ～約６０ｍＬ、約１ｍＬ～約４０ｍＬ、約１ｍＬ～約２０ｍＬ、約１ｍＬ～約１０ｍＬ、約１ｍＬ～約５ｍＬ、約１ｍＬ～約２ｍＬ、約２ｍＬ～約５００ｍＬ、約２ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２ｍＬ～約４００ｍＬ、約２ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２ｍＬ～約３００ｍＬ、約２ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２ｍＬ～約２００ｍＬ、約２ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１００ｍＬ、約２ｍＬ～約８０ｍＬ、約２ｍＬ～約６０ｍＬ、約２ｍＬ～約４０ｍＬ、約２ｍＬ～約２０ｍＬ、約２ｍＬ～約１０ｍＬ、約２ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約８０ｍＬ、約５ｍＬ～約６０ｍＬ、約５ｍＬ～約４０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、または約４５０ｍＬ～約５００ｍＬであり得る。
一部の実施例では、振とう管を、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）で撹拌しながらインキュベートすることができる。
種々の振とう管が市販されている。振とう管の追加的な非限定的な態様は当技術分野で公知である。
培養バッグ
本明細書に記載の方法の一部の態様は、培養バッグの使用を含む。一部の実施例では、培養バッグの容積は、約５０ｍＬ～約５００Ｌ、約５０ｍＬ～約４００Ｌ、約５０ｍＬ～約３００Ｌ、約５０ｍＬ～約２００Ｌ、約５０ｍＬ～約１００Ｌ、約５０ｍＬ～約５０Ｌ、５０ｍＬ～約２５Ｌ、約５０ｍＬ～約２０Ｌ、約５０ｍＬ～約１５Ｌ、約５０ｍＬ～約１０Ｌ、約５０ｍＬ～約８Ｌ、約５０ｍＬ～約６Ｌ、約５０ｍＬ～約５Ｌ、約５０ｍＬ～約４Ｌ、約５０ｍＬ～約３Ｌ、約５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約５０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約１００ｍＬ、約５０ｍＬ～約７５ｍＬ、約７５ｍＬ～約５００Ｌ、約７５ｍＬ～約４００Ｌ、約７５ｍＬ～約３００Ｌ、約７５ｍＬ～約２００Ｌ、約７５ｍＬ～約１００Ｌ、約７５ｍＬ～約５０Ｌ、７５ｍＬ～約２５Ｌ、約７５ｍＬ～約２０Ｌ、約７５ｍＬ～約１５Ｌ、約７５ｍＬ～約１０Ｌ、約７５ｍＬ～約８Ｌ、約７５ｍＬ～約６Ｌ、約７５ｍＬ～約５Ｌ、約７５ｍＬ～約４Ｌ、約７５ｍＬ～約３Ｌ、約７５ｍＬ～約２．５Ｌ、約７５ｍＬ～約２．０Ｌ、約７５ｍＬ～約１．８Ｌ、約７５ｍＬ～約１．６Ｌ、約７５ｍＬ～約１．４Ｌ、約７５ｍＬ～約１．２Ｌ、約７５ｍＬ～約１．０Ｌ、約７５ｍＬ～約９００ｍＬ、約７５ｍＬ～約８００ｍＬ、約７５ｍＬ～約７００ｍＬ、約７５ｍＬ～約６００ｍＬ、約７５ｍＬ～約５００ｍＬ、約７５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約４００ｍＬ、約７５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約３００ｍＬ、約７５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約２００ｍＬ、約７５ｍＬ～約１５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００Ｌ、約１００ｍＬ～約４００Ｌ、約１００ｍＬ～約３００Ｌ、約１００ｍＬ～約２００Ｌ、約１００ｍＬ～約１００Ｌ、約１００ｍＬ～約５０Ｌ、１００ｍＬ～約２５Ｌ、約１００ｍＬ～約２０Ｌ、約１００ｍＬ～約１５Ｌ、約１００ｍＬ～約１０Ｌ、約１００ｍＬ～約８Ｌ、約１００ｍＬ～約６Ｌ、約１００ｍＬ～約５Ｌ、約１００ｍＬ～約４Ｌ、約１００ｍＬ～約３Ｌ、約１００ｍＬ～約２．５Ｌ、約１００ｍＬ～約２．０Ｌ、約１００ｍＬ～約１．８Ｌ、約１００ｍＬ～約１．６Ｌ、約１００ｍＬ～約１．４Ｌ、約１００ｍＬ～約１．２Ｌ、約１００ｍＬ～約１．０Ｌ、約１００ｍＬ～約９００ｍＬ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約７００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約４００Ｌ、約１５０ｍＬ～約３００Ｌ、約１５０ｍＬ～約２００Ｌ、約１５０ｍＬ～約１００Ｌ、約１５０ｍＬ～約５０Ｌ、１５０ｍＬ～約２５Ｌ、約１５０ｍＬ～約２０Ｌ、約１５０ｍＬ～約１５Ｌ、約１５０ｍＬ～約１０Ｌ、約１５０ｍＬ～約８Ｌ、約１５０ｍＬ～約６Ｌ、約１５０ｍＬ～約５Ｌ、約１５０ｍＬ～約４Ｌ、約１５０ｍＬ～約３Ｌ、約１５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約１５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約１５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約１５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００Ｌ、約２００ｍＬ～約４００Ｌ、約２００ｍＬ～約３００Ｌ、約２００ｍＬ～約２００Ｌ、約２００ｍＬ～約１００Ｌ、約２００ｍＬ～約５０Ｌ、２００ｍＬ～約２５Ｌ、約２００ｍＬ～約２０Ｌ、約２００ｍＬ～約１５Ｌ、約２００ｍＬ～約１０Ｌ、約２００ｍＬ～約８Ｌ、約２００ｍＬ～約６Ｌ、約２００ｍＬ～約５Ｌ、約２００ｍＬ～約４Ｌ、約２００ｍＬ～約３Ｌ、約２００ｍＬ～約２．５Ｌ、約２００ｍＬ～約２．０Ｌ、約２００ｍＬ～約１．８Ｌ、約２００ｍＬ～約１．６Ｌ、約２００ｍＬ～約１．４Ｌ、約２００ｍＬ～約１．２Ｌ、約２００ｍＬ～約１．０Ｌ、約２００ｍＬ～約９００ｍＬ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約７００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約４００Ｌ、約２５０ｍＬ～約３００Ｌ、約２５０ｍＬ～約２００Ｌ、約２５０ｍＬ～約１００Ｌ、約２５０ｍＬ～約５０Ｌ、２５０ｍＬ～約２５Ｌ、約２５０ｍＬ～約２０Ｌ、約２５０ｍＬ～約１５Ｌ、約２５０ｍＬ～約１０Ｌ、約２５０ｍＬ～約８Ｌ、約２５０ｍＬ～約６Ｌ、約２５０ｍＬ～約５Ｌ、約２５０ｍＬ～約４Ｌ、約２５０ｍＬ～約３Ｌ、約２５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約２５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約２５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約２５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００Ｌ、約３００ｍＬ～約４００Ｌ、約３００ｍＬ～約３００Ｌ、約３００ｍＬ～約２００Ｌ、約３００ｍＬ～約１００Ｌ、約３００ｍＬ～約５０Ｌ、３００ｍＬ～約２５Ｌ、約３００ｍＬ～約２０Ｌ、約３００ｍＬ～約１５Ｌ、約３００ｍＬ～約１０Ｌ、約３００ｍＬ～約８Ｌ、約３００ｍＬ～約６Ｌ、約３００ｍＬ～約５Ｌ、約３００ｍＬ～約４Ｌ、約３００ｍＬ～約３Ｌ、約３００ｍＬ～約２．５Ｌ、約３００ｍＬ～約２．０Ｌ、約３００ｍＬ～約１．８Ｌ、約３００ｍＬ～約１．６Ｌ、約３００ｍＬ～約１．４Ｌ、約３００ｍＬ～約１．２Ｌ、約３００ｍＬ～約１．０Ｌ、約３００ｍＬ～約９００ｍＬ、約３００ｍＬ～約８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約７００ｍＬ、約３００ｍＬ～約６００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約４００Ｌ、約３５０ｍＬ～約３００Ｌ、約３５０ｍＬ～約２００Ｌ、約３５０ｍＬ～約１００Ｌ、約３５０ｍＬ～約５０Ｌ、３５０ｍＬ～約２５Ｌ、約３５０ｍＬ～約２０Ｌ、約３５０ｍＬ～約１５Ｌ、約３５０ｍＬ～約１０Ｌ、約３５０ｍＬ～約８Ｌ、約３５０ｍＬ～約６Ｌ、約３５０ｍＬ～約５Ｌ、約３５０ｍＬ～約４Ｌ、約３５０ｍＬ～約３Ｌ、約３５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約３５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約３５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約３５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００Ｌ、約４００ｍＬ～約４００Ｌ、約４００ｍＬ～約３００Ｌ、約４００ｍＬ～約２００Ｌ、約４００ｍＬ～約１００Ｌ、約４００ｍＬ～約５０Ｌ、４００ｍＬ～約２５Ｌ、約４００ｍＬ～約２０Ｌ、約４００ｍＬ～約１５Ｌ、約４００ｍＬ～約１０Ｌ、約４００ｍＬ～約８Ｌ、約４００ｍＬ～約６Ｌ、約４００ｍＬ～約５Ｌ、約４００ｍＬ～約４Ｌ、約４００ｍＬ～約３Ｌ、約４００ｍＬ～約２．５Ｌ、約４００ｍＬ～約２．０Ｌ、約４００ｍＬ～約１．８Ｌ、約４００ｍＬ～約１．６Ｌ、約４００ｍＬ～約１．４Ｌ、約４００ｍＬ～約１．２Ｌ、約４００ｍＬ～約１．０Ｌ、約４００ｍＬ～約９００ｍＬ、約４００ｍＬ～約８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約７００ｍＬ、約４００ｍＬ～約６００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約４００Ｌ、約４５０ｍＬ～約３００Ｌ、約４５０ｍＬ～約２００Ｌ、約４５０ｍＬ～約１００Ｌ、約４５０ｍＬ～約５０Ｌ、４５０ｍＬ～約２５Ｌ、約４５０ｍＬ～約２０Ｌ、約４５０ｍＬ～約１５Ｌ、約４５０ｍＬ～約１０Ｌ、約４５０ｍＬ～約８Ｌ、約４５０ｍＬ～約６Ｌ、約４５０ｍＬ～約５Ｌ、約４５０ｍＬ～約４Ｌ、約４５０ｍＬ～約３Ｌ、約４５０ｍＬ～約２．５Ｌ、約４５０ｍＬ～約２．０Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．８Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．６Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．４Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．２Ｌ、約４５０ｍＬ～約１．０Ｌ、約４５０ｍＬ～約９００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約７００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約５００Ｌ、約５００ｍＬ～約４００Ｌ、約５００ｍＬ～約３００Ｌ、約５００ｍＬ～約２００Ｌ、約５００ｍＬ～約１００Ｌ、約５００ｍＬ～約５０Ｌ、５００ｍＬ～約２５Ｌ、約５００ｍＬ～約２０Ｌ、約５００ｍＬ～約１５Ｌ、約５００ｍＬ～約１０Ｌ、約５００ｍＬ～約８Ｌ、約５００ｍＬ～約６Ｌ、約５００ｍＬ～約５Ｌ、約５００ｍＬ～約４Ｌ、約５００ｍＬ～約３Ｌ、約５００ｍＬ～約２．５Ｌ、約５００ｍＬ～約２．０Ｌ、約５００ｍＬ～約１．８Ｌ、約５００ｍＬ～約１．６Ｌ、約５００ｍＬ～約１．４Ｌ、約５００ｍＬ～約１．２Ｌ、約５００ｍＬ～約１．０Ｌ、約５００ｍＬ～約９００ｍＬ、約５００ｍＬ～約８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約７００ｍＬ、約５００ｍＬ～約６００ｍＬ、約６００ｍＬ～約５００Ｌ、約６００ｍＬ～約４００Ｌ、約６００ｍＬ～約３００Ｌ、約６００ｍＬ～約２００Ｌ、約６００ｍＬ～約１００Ｌ、約６００ｍＬ～約５０Ｌ、６００ｍＬ～約２５Ｌ、約６００ｍＬ～約２０Ｌ、約６００ｍＬ～約１５Ｌ、約６００ｍＬ～約１０Ｌ、約６００ｍＬ～約８Ｌ、約６００ｍＬ～約６Ｌ、約６００ｍＬ～約５Ｌ、約６００ｍＬ～約４Ｌ、約６００ｍＬ～約３Ｌ、約６００ｍＬ～約２．５Ｌ、約６００ｍＬ～約２．０Ｌ、約６００ｍＬ～約１．８Ｌ、約６００ｍＬ～約１．６Ｌ、約６００ｍＬ～約１．４Ｌ、約６００ｍＬ～約１．２Ｌ、約６００ｍＬ～約１．０Ｌ、約６００ｍＬ～約９００ｍＬ、約６００ｍＬ～約８００ｍＬ、約６００ｍＬ～約７００ｍＬ、約７００ｍＬ～約５００Ｌ、約７００ｍＬ～約４００Ｌ、約７００ｍＬ～約３００Ｌ、約７００ｍＬ～約２００Ｌ、約７００ｍＬ～約１００Ｌ、約７００ｍＬ～約５０Ｌ、７００ｍＬ～約２５Ｌ、約７００ｍＬ～約２０Ｌ、約７００ｍＬ～約１５Ｌ、約７００ｍＬ～約１０Ｌ、約７００ｍＬ～約８Ｌ、約７００ｍＬ～約６Ｌ、約７００ｍＬ～約５Ｌ、約７００ｍＬ～約４Ｌ、約７００ｍＬ～約３Ｌ、約７００ｍＬ～約２．５Ｌ、約７００ｍＬ～約２．０Ｌ、約７００ｍＬ～約１．８Ｌ、約７００ｍＬ～約１．６Ｌ、約７００ｍＬ～約１．４Ｌ、約７００ｍＬ～約１．２Ｌ、約７００ｍＬ～約１．０Ｌ、約７００ｍＬ～約９００ｍＬ、約７００ｍＬ～約８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約５００Ｌ、約８００ｍＬ～約４００Ｌ、約８００ｍＬ～約３００Ｌ、約８００ｍＬ～約２００Ｌ、約８００ｍＬ～約１００Ｌ、約８００ｍＬ～約５０Ｌ、８００ｍＬ～約２５Ｌ、約８００ｍＬ～約２０Ｌ、約８００ｍＬ～約１５Ｌ、約８００ｍＬ～約１０Ｌ、約８００ｍＬ～約８Ｌ、約８００ｍＬ～約６Ｌ、約８００ｍＬ～約５Ｌ、約８００ｍＬ～約４Ｌ、約８００ｍＬ～約３
Ｌ、約８００ｍＬ～約２．５Ｌ、約８００ｍＬ～約２．０Ｌ、約８００ｍＬ～約１．８Ｌ、約８００ｍＬ～約１．６Ｌ、約８００ｍＬ～約１．４Ｌ、約８００ｍＬ～約１．２Ｌ、約８００ｍＬ～約１．０Ｌ、約８００ｍＬ～約９００ｍＬ、約９００ｍＬ～約５００Ｌ、約９００ｍＬ～約４００Ｌ、約９００ｍＬ～約３００Ｌ、約９００ｍＬ～約２００Ｌ、約９００ｍＬ～約１００Ｌ、約９００ｍＬ～約５０Ｌ、９００ｍＬ～約２５Ｌ、約９００ｍＬ～約２０Ｌ、約９００ｍＬ～約１５Ｌ、約９００ｍＬ～約１０Ｌ、約９００ｍＬ～約８Ｌ、約９００ｍＬ～約６Ｌ、約９００ｍＬ～約５Ｌ、約９００ｍＬ～約４Ｌ、約９００ｍＬ～約３Ｌ、約９００ｍＬ～約２．５Ｌ、約９００ｍＬ～約２．０Ｌ、約９００ｍＬ～約１．８Ｌ、約９００ｍＬ～約１．６Ｌ、約９００ｍＬ～約１．４Ｌ、約９００ｍＬ～約１．２Ｌ、約９００ｍＬ～約１．０Ｌ、約１．０Ｌ～約５００Ｌ、約１．０Ｌ～約４００Ｌ、約１．０Ｌ～約３００Ｌ、約１．０Ｌ～約２００Ｌ、約１．０Ｌ～約１００Ｌ、約１．０Ｌ～約５０Ｌ、１．０Ｌ～約２５Ｌ、約１．０Ｌ～約２０Ｌ、約１．０Ｌ～約１５Ｌ、約１．０Ｌ～約１０Ｌ、約１．０Ｌ～約８Ｌ、約１．０Ｌ～約６Ｌ、約１．０Ｌ～約５Ｌ、約１．０Ｌ～約４Ｌ、約１．０Ｌ～約３Ｌ、約１．０Ｌ～約２．５Ｌ、約１．０Ｌ～約２．０Ｌ、約１．０Ｌ～約１．８Ｌ、約１．０Ｌ～約１．６Ｌ、約１．０Ｌ～約１．４Ｌ、約１．０Ｌ～約１．２Ｌ、約１．２Ｌ～約５００Ｌ、約１．２Ｌ～約４００Ｌ、約１．２Ｌ～約３００Ｌ、約１．２Ｌ～約２００Ｌ、約１．２Ｌ～約１００Ｌ、約１．２Ｌ～約５０Ｌ、１．２Ｌ～約２５Ｌ、約１．２Ｌ～約２０Ｌ、約１．２Ｌ～約１５Ｌ、約１．２Ｌ～約１０Ｌ、約１．２Ｌ～約８Ｌ、約１．２Ｌ～約６Ｌ、約１．２Ｌ～約５Ｌ、約１．２Ｌ～約４Ｌ、約１．２Ｌ～約３Ｌ、約１．２Ｌ～約２．５Ｌ、約１．２Ｌ～約２．０Ｌ、約１．２Ｌ～約１．８Ｌ、約１．２Ｌ～約１．６Ｌ、約１．２Ｌ～約１．４Ｌ、約１．４Ｌ～約５００Ｌ、約１．４Ｌ～約４００Ｌ、約１．４Ｌ～約３００Ｌ、約１．４Ｌ～約２００Ｌ、約１．４Ｌ～約１００Ｌ、約１．４Ｌ～約５０Ｌ、１．４Ｌ～約２５Ｌ、約１．４Ｌ～約２０Ｌ、約１．４Ｌ～約１５Ｌ、約１．４Ｌ～約１０Ｌ、約１．４Ｌ～約８Ｌ、約１．４Ｌ～約６Ｌ、約１．４Ｌ～約５Ｌ、約１．４Ｌ～約４Ｌ、約１．４Ｌ～約３Ｌ、約１．４Ｌ～約２．５Ｌ、約１．４Ｌ～約２．０Ｌ、約１．４Ｌ～約１．８Ｌ、約１．４Ｌ～約１．６Ｌ、約１．６Ｌ～約５００Ｌ、約１．６Ｌ～約４００Ｌ、約１．６Ｌ～約３００Ｌ、約１．６Ｌ～約２００Ｌ、約１．６Ｌ～約１００Ｌ、約１．６Ｌ～約５０Ｌ、１．６Ｌ～約２５Ｌ、約１．６Ｌ～約２０Ｌ、約１．６Ｌ～約１５Ｌ、約１．６Ｌ～約１０Ｌ、約１．６Ｌ～約８Ｌ、約１．６Ｌ～約６Ｌ、約１．６Ｌ～約５Ｌ、約１．６Ｌ～約４Ｌ、約１．６Ｌ～約３Ｌ、約１．６Ｌ～約２．５Ｌ、約１．６Ｌ～約２．０Ｌ、約１．６Ｌ～約１．８Ｌ、約１．８Ｌ～約５００Ｌ、約１．８Ｌ～約４００Ｌ、約１．８Ｌ～約３００Ｌ、約１．８Ｌ～約２００Ｌ、約１．８Ｌ～約１００Ｌ、約１．８Ｌ～約５０Ｌ、１．８Ｌ～約２５Ｌ、約１．８Ｌ～約２０Ｌ、約１．８Ｌ～約１５Ｌ、約１．８Ｌ～約１０Ｌ、約１．８Ｌ～約８Ｌ、約１．８Ｌ～約６Ｌ、約１．８Ｌ～約５Ｌ、約１．８Ｌ～約４Ｌ、約１．８Ｌ～約３Ｌ、約１．８Ｌ～約２．５Ｌ、約１．８Ｌ～約２．０Ｌ、約２．０Ｌ～約５００Ｌ、約２．０Ｌ～約４００Ｌ、約２．０Ｌ～約３００Ｌ、約２．０Ｌ～約２００Ｌ、約２．０Ｌ～約１００Ｌ、約２．０Ｌ～約５０Ｌ、２．０Ｌ～約２５Ｌ、約２．０Ｌ～約２０Ｌ、約２．０Ｌ～約１５Ｌ、約２．０Ｌ～約１０Ｌ、約２．０Ｌ～約８Ｌ、約２．０Ｌ～約６Ｌ、約２．０Ｌ～約５Ｌ、約２．０Ｌ～約４Ｌ、約２．０Ｌ～約３Ｌ、約２．０Ｌ～約２．５Ｌ、約２．５Ｌ～約５００Ｌ、約２．５Ｌ～約４００Ｌ、約２．５Ｌ～約３００Ｌ、約２．５Ｌ～約２００Ｌ、約２．５Ｌ～約１００Ｌ、約２．５Ｌ～約５０Ｌ、２．５Ｌ～約２５Ｌ、約２．５Ｌ～約２０Ｌ、約２．５Ｌ～約１５Ｌ、約２．５Ｌ～約１０Ｌ、約２．５Ｌ～約８Ｌ、約２．５Ｌ～約６Ｌ、約２．５Ｌ～約５Ｌ、約２．５Ｌ～約４Ｌ、約２．５Ｌ～約３Ｌ、約３Ｌ～約５００Ｌ、約３Ｌ～約４００Ｌ、約３Ｌ～約３００Ｌ、約３Ｌ～約２００Ｌ、約３Ｌ～約１００Ｌ、約３Ｌ～約５０Ｌ、３Ｌ～約２５Ｌ、約３Ｌ～約２０Ｌ、約３Ｌ～約１５Ｌ、約３Ｌ～約１０Ｌ、約３Ｌ～約８Ｌ、約３Ｌ～約６Ｌ、約３Ｌ～約５Ｌ、約３Ｌ～約４Ｌ、約４Ｌ～約５００Ｌ、約４Ｌ～約４００Ｌ、約４Ｌ～約３００Ｌ、約４Ｌ～約２００Ｌ、約４Ｌ～約１００Ｌ、約４Ｌ～約５０Ｌ、４Ｌ～約２５Ｌ、約４Ｌ～約２０Ｌ、約４Ｌ～約１５Ｌ、約４Ｌ～約１０Ｌ、約４Ｌ～約８Ｌ、約４Ｌ～約６Ｌ、約４Ｌ～約５Ｌ、約５Ｌ～約５００Ｌ、約５Ｌ～約４００Ｌ、約５Ｌ～約３００Ｌ、約５Ｌ～約２００Ｌ、約５Ｌ～約１００Ｌ、約５Ｌ～約５０Ｌ、５Ｌ～約２５Ｌ、約５Ｌ～約２０Ｌ、約５Ｌ～約１５Ｌ、約５Ｌ～約１０Ｌ、約５Ｌ～約８Ｌ、約５Ｌ～約６Ｌ、約６Ｌ～約５００Ｌ、約６Ｌ～約４００Ｌ、約６Ｌ～約３００Ｌ、約６Ｌ～約２００Ｌ、約６Ｌ～約１００Ｌ、約６Ｌ～約５０Ｌ、６Ｌ～約２５Ｌ、約６Ｌ～約２０Ｌ、約６Ｌ～約１５Ｌ、約６Ｌ～約１０Ｌ、約６Ｌ～約８Ｌ、約８Ｌ～約５００Ｌ、約８Ｌ～約４００Ｌ、約８Ｌ～約３００Ｌ、約８Ｌ～約２００Ｌ、約８Ｌ～約１００Ｌ、約８Ｌ～約５０Ｌ、８Ｌ～約２５Ｌ、約８Ｌ～約２０Ｌ、約８Ｌ～約１５Ｌ、約８Ｌ～約１０Ｌ、約１０Ｌ～約５００Ｌ、約１０Ｌ～約４００Ｌ、約１０Ｌ～約３００Ｌ、約１０Ｌ～約２００Ｌ、約１０Ｌ～約１００Ｌ、約１０Ｌ～約５０Ｌ、１０Ｌ～約２５Ｌ、約１０Ｌ～約２０Ｌ、約１０Ｌ～約１５Ｌ、約１５Ｌ～約５００Ｌ、約１５Ｌ～約４００Ｌ、約１５Ｌ～約３００Ｌ、約１５Ｌ～約２００Ｌ、約１５Ｌ～約１００Ｌ、約１５Ｌ～約５０Ｌ、１５Ｌ～約２５Ｌ、約１５Ｌ～約２０Ｌ、約２０Ｌ～約５００Ｌ、約２０Ｌ～約４００Ｌ、約２０Ｌ～約３００Ｌ、約２０Ｌ～約２００Ｌ、約２０Ｌ～約１００Ｌ、約２０Ｌ～約５０Ｌ、２０Ｌ～約２５Ｌ、約２５Ｌ～約５００Ｌ、約２５Ｌ～約４００Ｌ、約２５Ｌ～約３００Ｌ、約２５Ｌ～約２００Ｌ、約２５Ｌ～約１００Ｌ、約２５Ｌ～約５０Ｌ、約５０Ｌ～約５００Ｌ、約５０Ｌ～約４００Ｌ、約５０Ｌ～約３００Ｌ、約５０Ｌ～約２００Ｌ、約５０Ｌ～約１００Ｌ、約１００Ｌ～約５００Ｌ、約１００Ｌ～約４００Ｌ、約１００Ｌ～約３００Ｌ、約１００Ｌ～約２００Ｌ、約２００Ｌ～約５００Ｌ、約２００Ｌ～約４００Ｌ、約２００Ｌ～約３００Ｌ、約３００Ｌ～約５００Ｌ、約３００Ｌ～約４００Ｌ、または約４００Ｌ～約５００Ｌであり得る。
一部の実施例では、培養バッグを、毎分約５揺動サイクル～毎分約４０揺動サイクル、毎分約５揺動サイクル～毎分約３５揺動サイクル、毎分約５揺動サイクル～毎分約３０揺動サイクル、毎分約５揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクル、毎分約５揺動サイクル～毎分約２０揺動サイクル、毎分約５揺動サイクル～毎分約１５揺動サイクル、毎分約５揺動サイクル～毎分約１０揺動サイクル、毎分約１０揺動サイクル～毎分約４０揺動サイクル、毎分約１０揺動サイクル～毎分約３５揺動サイクル、毎分約１０揺動サイクル～毎分約３０揺動サイクル、毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクル、毎分約１０揺動サイクル～毎分約２０揺動サイクル、毎分約１０揺動サイクル～毎分約１５揺動サイクル、毎分約１５揺動サイクル～毎分約４０揺動サイクル、毎分約１５揺動サイクル～毎分約３５揺動サイクル、毎分約１５揺動サイクル～毎分約３０揺動サイクル、毎分約１５揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクル、毎分約１５揺動サイクル～毎分約２０揺動サイクル、毎分約２０揺動サイクル～毎分約４０揺動サイクル、毎分約２０揺動サイクル～毎分約３５揺動サイクル、毎分約２０揺動サイクル～毎分約３０揺動サイクル、毎分約２０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクル、毎分約２５揺動サイクル～毎分約４０揺動サイクル、毎分約２５揺動サイクル～毎分約３５揺動サイクル、毎分約２５揺動サイクル～毎分約３０揺動サイクル、毎分約３０揺動サイクル～毎分約４０揺動サイクル、毎分約３０揺動サイクル～毎分約３５揺動サイクル、または毎分約３５揺動サイクル～毎分約４０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることができる。
種々の培養バッグが市販されている。培養バッグの追加的な非限定的な態様は当技術分野で公知である。
バイオリアクター
本明細書に記載の方法の一部の態様は、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）の使用を含む。一部の実施例では、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）の容積は、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約１２，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約１０，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約８，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約６，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約８００Ｌ、約５００ｍＬ～約６００Ｌ、約５００ｍＬ～約４００Ｌ、約５００ｍＬ～約２００Ｌ、約５００ｍＬ～約１００Ｌ、約５００ｍＬ～約５０Ｌ、約５００ｍＬ～約２０Ｌ、約５００ｍＬ～約１０Ｌ、約５００ｍＬ～約５Ｌ、約５００ｍＬ～約１Ｌ、約５００ｍＬ～約７５０ｍＬ、約７５０ｍＬ～約１５，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１２，５００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１０，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約８，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約６，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約７５０ｍＬ～約８００Ｌ、約７５０ｍＬ～約６００Ｌ、約７５０ｍＬ～約４００Ｌ、約７５０ｍＬ～約２００Ｌ、約７５０ｍＬ～約１００Ｌ、約７５０ｍＬ～約５０Ｌ、約７５０ｍＬ～約２０Ｌ、約７５０ｍＬ～約１０Ｌ、約７５０ｍＬ～約５Ｌ、約７５０ｍＬ～約１Ｌ、約１Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１Ｌ～約８，０００Ｌ、約１Ｌ～約６，０００Ｌ、約１Ｌ～約４，０００Ｌ、約１Ｌ～約２，０００Ｌ、約１Ｌ～約１，０００Ｌ、約１Ｌ～約８００Ｌ、約１Ｌ～約６００Ｌ、約１Ｌ～約４００Ｌ、約１Ｌ～約２００Ｌ、約１Ｌ～約１００Ｌ、約１Ｌ～約５０Ｌ、約１Ｌ～約２０Ｌ、約１Ｌ～約１０Ｌ、約１Ｌ～約５Ｌ、約５Ｌ～約１５，０００Ｌ、約５Ｌ～約１２，５００Ｌ、約５Ｌ～約１０，０００Ｌ、約５Ｌ～約８，０００Ｌ、約５Ｌ～約６，０００Ｌ、約５Ｌ～約４，０００Ｌ、約５Ｌ～約２，０００Ｌ、約５Ｌ～約１，０００Ｌ、約５Ｌ～約８００Ｌ、約５Ｌ～約６００Ｌ、約５Ｌ～約４００Ｌ、約５Ｌ～約２００Ｌ、約５Ｌ～約１００Ｌ、約５Ｌ～約５０Ｌ、約５Ｌ～約２０Ｌ、約５Ｌ～約１０Ｌ、約１０Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１０Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１０Ｌ～約８，０００Ｌ、約１０Ｌ～約６，０００Ｌ、約１０Ｌ～約４，０００Ｌ、約１０Ｌ～約２，０００Ｌ、約１０Ｌ～約１，０００Ｌ、約１０Ｌ～約８００Ｌ、約１０Ｌ～約６００Ｌ、約１０Ｌ～約４００Ｌ、約１０Ｌ～約２００Ｌ、約１０Ｌ～約１００Ｌ、約１０Ｌ～約５０Ｌ、約１０Ｌ～約２０Ｌ、約２０Ｌ～約１５，０００Ｌ、約２０Ｌ～約１２，５００Ｌ、約２０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約２０Ｌ～約８，０００Ｌ、約２０Ｌ～約６，０００Ｌ、約２０Ｌ～約４，０００Ｌ、約２０Ｌ～約２，０００Ｌ、約２０Ｌ～約１，０００Ｌ、約２０Ｌ～約８００Ｌ、約２０Ｌ～約６００Ｌ、約２０Ｌ～約４００Ｌ、約２０Ｌ～約２００Ｌ、約２０Ｌ～約１００Ｌ、約２０Ｌ～約５０Ｌ、約５０Ｌ～約１５，０００Ｌ、約５０Ｌ～約１２，５００Ｌ、約５０Ｌ～約１０，０００Ｌ、約５０Ｌ～約８，０００Ｌ、約５０Ｌ～約６，０００Ｌ、約５０Ｌ～約４，０００Ｌ、約５０Ｌ～約２，０００Ｌ、約５０Ｌ～約１，０００Ｌ、約５０Ｌ～約８００Ｌ、約５０Ｌ～約６００Ｌ、約５０Ｌ～約４００Ｌ、約５０Ｌ～約２００Ｌ、約５０Ｌ～約１００Ｌ、約１００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１００Ｌ～約８，０００Ｌ、約１００Ｌ～約６，０００Ｌ、約１００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１００Ｌ～約２，０００Ｌ、約１００Ｌ～約１，０００Ｌ、約１００Ｌ～約８００Ｌ、約１００Ｌ～約６００Ｌ、約１００Ｌ～約４００Ｌ、約１００Ｌ～約２００Ｌ、約２００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約２００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約２００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約２００Ｌ～約８，０００Ｌ、約２００Ｌ～約６，０００Ｌ、約２００Ｌ～約４，０００Ｌ、約２００Ｌ～約２，０００Ｌ、約２００Ｌ～約１，０００Ｌ、約２００Ｌ～約８００Ｌ、約２００Ｌ～約６００Ｌ、約２００Ｌ～約４００Ｌ、約４００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約４００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約４００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約４００Ｌ～約８，０００Ｌ、約４００Ｌ～約６，０００Ｌ、約４００Ｌ～約４，０００Ｌ、約４００Ｌ～約２，０００Ｌ、約４００Ｌ～約１，０００Ｌ、約４００Ｌ～約８００Ｌ、約４００Ｌ～約６００Ｌ、約６００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約６００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約６００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約６００Ｌ～約８，０００Ｌ、約６００Ｌ～約６，０００Ｌ、約６００Ｌ～約４，０００Ｌ、約６００Ｌ～約２，０００Ｌ、約６００Ｌ～約１，０００Ｌ、約６００Ｌ～約８００Ｌ、約８００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約８００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約８００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約８００Ｌ～約８，０００Ｌ、約８００Ｌ～約６，０００Ｌ、約８００Ｌ～約４，０００Ｌ、約８００Ｌ～約２，０００Ｌ、約８００Ｌ～約１，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約６，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約２，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約２，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約６，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約４，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約６，０００Ｌ、約６，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約６，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約６，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約６，０００Ｌ～約８，０００Ｌ、約８，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約８，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、約８，０００Ｌ～約１０，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ～約１５，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ～約１２，５００Ｌ、または約１２，５００Ｌ～約１５，０００Ｌであり得る。
種々のバイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）が市販されている。バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）の追加的な非限定的な態様は当技術分野で公知である。
第２の細胞培養物をもたらすこと（ステップＡ）
本明細書に記載の方法のいずれかでは、ステップ（ａ）は、ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な赤血球前駆細胞のいずれか）を容器（例えば、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）、振とうフラスコ、振とう管、または培養バッグ）中に含有される第２の培養培地（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な第２の培養培地のいずれか）に配置して、最初の細胞密度が、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０４細胞／ｍＬ、約０．１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０４細胞／ｍＬ、０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０４細胞／ｍＬ、１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、または約０．５×１０７細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬである第２の細胞培養物をもたらすことを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、約０．１ｍＬ～約５，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約４，５００Ｌ、約０．１ｍＬ～約４，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約３，５００Ｌ、約０．１ｍＬ～約３，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約２，５００Ｌ、約０．１ｍＬ～約２，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１ｍＬ～約１，０００Ｌ、約０．１ｍＬ～約８００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約６００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約５００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約４５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約４００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約３５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約３００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約２５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約２００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約１５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約１００ｍＬ、約０．１ｍＬ～約５０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約２０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約１０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約５，０００Ｌ、約５ｍＬ～約４，５００Ｌ、約５ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５ｍＬ～約３，５００Ｌ、約５ｍＬ～約３，０００Ｌ、約５ｍＬ～約２，５００Ｌ、約５ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５ｍＬ～約１，５００Ｌ、約５ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５ｍＬ～約８００ｍＬ、約５ｍＬ～約６００ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１５０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約２０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約５０ｍＬ～約１５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約１５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１５０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約２００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約２５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約２５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約３００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約３００ｍＬ～約８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約６００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約３５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約３５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約４００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約４００ｍＬ～約８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約６００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約４，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約４，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約３，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約３，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約２，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約２，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約１，５００Ｌ、約４５０ｍＬ～約１，０００Ｌ、約４５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約５００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約５００ｍＬ～約８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約６００ｍＬ、約６００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約６００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約６００ｍＬ～約８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約５，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約４，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約４，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約３，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約３，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約２，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約２，０００Ｌ、約８００ｍＬ～約１，５００Ｌ、約８００ｍＬ～約１，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約３，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約３，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約２，５００Ｌ、約１，０００Ｌ～約２，０００Ｌ、約１，０００Ｌ～約１，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約５，０００Ｌ、約１，５００Ｌ～約４，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約４，０００Ｌ、約１，５００Ｌ～約３，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約３，０００Ｌ、約１，５００Ｌ～約２，５００Ｌ、約１，５００Ｌ～約２，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約２，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約３，５００Ｌ、約２，０００Ｌ～約３，０００Ｌ、約２，０００Ｌ～約２，５００Ｌ、約２，５００Ｌ～約５，０００Ｌ、約２，５００Ｌ～約４，５００Ｌ、約２，５００Ｌ～約４，０００Ｌ、約２，５００Ｌ～約３，５００Ｌ、約２，５００Ｌ～約３，０００Ｌ、約３，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約３，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約３，０００Ｌ～約４，０００Ｌ、約３，０００Ｌ～約３，５００Ｌ、約３，５００Ｌ～約５，０００Ｌ、約３，５００Ｌ～約４，５００Ｌ、約３，５００Ｌ～約４，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約５，０００Ｌ、約４，０００Ｌ～約４，５００Ｌ、約４，５００Ｌ～約５，０００Ｌの体積を配置することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、約１０μＬ～約０．１ｍＬ、約１０μＬ～約８０μＬ、約１０μＬ～約６０μＬ、約１０μＬ～約４０μＬ、約１０μＬ～約２０μＬ、約２０μＬ～約０．１ｍＬ、約２０μＬ～約８０μＬ、約２０μＬ～約６０μＬ、約２０μＬ～約４０μＬ、約４０μＬ～約０．１ｍＬ、約４０μＬ～約８０μＬ、約４０μＬ～約６０μＬ、約６０μＬ～約０．１ｍＬ、約６０μＬ～約８０μＬ、または約６０μＬ～約０．１ｍＬの体積を配置することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的なバイオリアクターのいずれか）である。ステップ（ａ）に使用することができるバイオリアクターのさらなる例および態様は当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、振とうフラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とうフラスコのいずれか）である。ステップ（ａ）に使用することができる振とうフラスコのさらなる例および態様は当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、振とう管（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な振とう管のいずれか）である。ステップ（ａ）に使用することができる振とう管のさらなる例および態様は当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）における容器は、培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な培養バッグのいずれか）である。
一部の実施例では、第２の培養培地は、以下のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を含む：トランスフェリン（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ）または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＩＬ－３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＳＣＦ）、デキサメタゾン（例えば、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのデキサメタゾン）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチド）、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのインスリン）。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、０．１％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ～約３．０％ｗ／ｖ、約３．０％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ、約３．０％ｗ／ｖ～約３．５％ｗ／ｖ、または約３．５％ｗ／ｖ～約４．０％ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、または約２．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ）のポロキサマー－１８８（Ｐ１８８）を含む。
一部の実施例では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２４０
μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２４０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２６０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約２８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３２０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約３２０μｇ／ｍＬ～約３４０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３４０μｇ／ｍＬ～約３６０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３６０μｇ／ｍＬ～約３８０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約３８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４２０μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４２０μｇ／ｍＬ～約４４０μｇ／ｍＬ、約４４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４４０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、約４４０μｇ／ｍＬ～約４６０μｇ／ｍＬ、約４６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４６０μｇ／ｍＬ～約４８０μｇ／ｍＬ、または約４８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ）を含む。
一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、または約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３（例えば、ヒトＩＬ－３）を含む。
一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６０
０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約９５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦ（例えば、ヒト幹細胞因子）を含む。
一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１２０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約８０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約６０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１ｎＭ、約１ｎＭ～約２００ｎＭ、約１ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、約１ｎＭ～約８０ｎＭ、約１ｎＭ～約６０ｎＭ、約１ｎＭ～約５０ｎＭ、約１ｎＭ～約４０ｎＭ、約１ｎＭ～約３０ｎＭ、約１ｎＭ～約２５ｎＭ、約１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１５ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約５ｎＭ、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約２ｎＭ～約２００ｎＭ、約２ｎＭ～約１８０ｎＭ、約２ｎＭ～約１６０ｎＭ、約２ｎＭ～約１４０ｎＭ、約２ｎＭ～約１２０ｎＭ、約２ｎＭ～約１００ｎＭ、約２ｎＭ～約８０ｎＭ、約２ｎＭ～約６０ｎＭ、約２ｎＭ～約５０ｎＭ、約２ｎＭ～約４０ｎＭ、約２ｎＭ～約３０ｎＭ、約２ｎＭ～約２５ｎＭ、約２ｎＭ～約２０ｎＭ、約２ｎＭ～約１５ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約５ｎＭ、約５ｎＭ～約２００ｎＭ、約５ｎＭ～約１８０ｎＭ、約５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約５ｎＭ～約１２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１００ｎＭ、約５ｎＭ～約８０ｎＭ、約５ｎＭ～約６０ｎＭ、約５ｎＭ～約５０ｎＭ、約５ｎＭ～約４０ｎＭ、約５ｎＭ～約３０ｎＭ、約５ｎＭ～約２５ｎＭ、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１０ｎＭ～約８０ｎＭ、約１０ｎＭ～約６０ｎＭ、約１０ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２５ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１５ｎＭ、約１５ｎＭ～約２００ｎＭ、約１５ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１５ｎＭ～約１００ｎＭ、約１５ｎＭ～約８０ｎＭ、約１５ｎＭ～約６０ｎＭ、約１５ｎＭ～約５０ｎＭ、約１５ｎＭ～約４０ｎＭ、約１５ｎＭ～約３０ｎＭ、約１５ｎＭ～約２５ｎＭ、約１５ｎＭ～約２０ｎＭ、約２０ｎＭ～約２００ｎＭ、約２０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約２０ｎＭ～約１００ｎＭ、約２０ｎＭ～約８０ｎＭ、約２０ｎＭ～約６０ｎＭ、約２０ｎＭ～約５０ｎＭ、約２０ｎＭ～約４０ｎＭ、約２０ｎＭ～約３０ｎＭ、約２０ｎＭ～約２５ｎＭ、約２５ｎＭ～約２００ｎＭ、約２５ｎＭ～約１８０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１２０ｎＭ、約２５ｎＭ～約１００ｎＭ、約２５ｎＭ～約８０ｎＭ、約２５ｎＭ～約６０ｎＭ、約２５ｎＭ～約５０ｎＭ、約２５ｎＭ～約４０ｎＭ、約２５ｎＭ～約３０ｎＭ、約３０ｎＭ～約２００ｎＭ、約３０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約３０ｎＭ～約１００ｎＭ、約３０ｎＭ～約８０ｎＭ、約３０ｎＭ～約６０ｎＭ、約３０ｎＭ～約５０ｎＭ、約３０ｎＭ～約４０ｎＭ、約４０ｎＭ～約２００ｎＭ、約４０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約４０ｎＭ～約１００ｎＭ、約４０ｎＭ～約８０ｎＭ、約４０ｎＭ～約６０ｎＭ、約４０ｎＭ～約５０ｎＭ、約５０ｎＭ～約２００ｎＭ、約５０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約５０ｎＭ～約１００ｎＭ、約５０ｎＭ～約８０ｎＭ、約５０ｎＭ～約６０ｎＭ、約６０ｎＭ～約２００ｎＭ、約６０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約６０ｎＭ～約１００ｎＭ、約６０ｎＭ～約８０ｎＭ、約８０ｎＭ～約２００ｎＭ、約８０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１２０ｎＭ、約８０ｎＭ～約１００ｎＭ、約１００ｎＭ～約２００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１２０ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１４０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１４０ｎＭ～約１８０ｎＭ、約１４０ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１６０ｎＭ～約２００ｎＭ、約１６０ｎＭ～約１８０ｎＭ、または約１８０ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む。
一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１
４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ，１８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、または約４８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチドを含む。ＥＰＯ模倣ペプチドの非限定的な例としては、例えば、ＥＰＯ模倣ペプチド（ＥＭＰ１；ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ 配列番号１）または定義された化学的リンカーもしくはより大きなポリマーＰＥＧリンカーのいずれかを使用したそのペプチド二量体（例えば、Johnson and Jolliffe、Nephrology Dialysis Transplantation 15 (9): 1274-1277、2000に記載されているものなど）、ＥＲＢ１－７（例えば、McConnell et al.、Biol. Chem. 379 (10): 1279-86、1998に記載されているものなど）、ＥＰＯ－Ｒ由来ペプチド（ＥＲＰ）（例えば、Naranda et al.、PNAS 96 (13): 7569-7574、1999に記載されているものなど）、Johnson et al.、Biochemistry 37 (11): 3699-3710、1998に記載されているＥＭＰ２０（ＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ（配列番号２））、ＡＧＥＭ４００（ヒドロキシエチルデンプン）、およびペゴルシヘマチド（例えば、Gupta and Wish、Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27 (5): 345-350、2018に記載されているものなど）が挙げられる。ＥＰＯ模倣ペプチドのさらなる例は当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の脂質（例えば、脂質混合物）を含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、０．１％ｗ／ｖ～約４％ｗ／ｖ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のヒト血清アルブミンを含む。本明細書に記載の第２の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第２の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のポロキサマー－１８８（Ｐ１８８）を含む。
一部の実施例では、第２の培養培地は、例えば、合成液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または動物成分を含まない合成液体培養培地、および／または無血清液体培養培地であり得る。
ステップＡの前の必要に応じた培養ステップ
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態は、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）複数の赤血球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な赤血球前駆細胞のいずれか）を容器（例えば、バイオリアクター、振とう管、または振とうフラスコ、例えば、本明細書に記載の例示的なバイオリアクター、振とう管、または振とうフラスコのいずれか）中に含まれる第１の培養培地に配置して、第１の細胞培養物（例えば、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約５×１０６個（例えば、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、０．１×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約０．１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、１×１０５細胞／ｍＬ～約１．５×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約１．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約３×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０５細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約２×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０６細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０６細胞／ｍＬ～約３×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬ、約３×１０６細胞／ｍＬ～約４×１０６細胞／ｍＬ、または約４×１０６細胞／ｍＬ～約５×１０６細胞／ｍＬである）をもたらすステップと、（ｉｉ）第１の細胞培養物を約１日～約１５日（例えば、約１日～約１４日、約１日～約１３日、約１日～約１２日、約１日～約１１日、約１日～約１０日、約１日～約９日、約１日～約８日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約１５日、約２日～約１４日、約２日～約１３日、約２日～約１２日、約２日～約１１日、約２日～約１０日、約２日～約９日、約２日～約８日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約１５日、約３日～約１４日、約３日～約１３日、約３日～約１２日、約３日～約１１日、約３日～約１０日、約３日～約９日、約３日～約８日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約１５日、約４日～約１４日、約４日～約１３日、約４日～約１２日、約４日～約１１日、約４日～約１０日、約４日～約９日、約４日～約８日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約１５日、約５日～約１４日、約５日～約１３日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約１５日、約６日～約１４日、約６日～約１３日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１５日、約７日～約１４日、約７日～約１３日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１５日、約８日～約１４日、約８日～約１３日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１５日、約９日～約１４日、約９日～約１３日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１５日、約１０日～約１４日、約１０日～約１３日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、約１１日～約１５日、約１１日～約１４日、約１１日～約１３日、約１１日～約１２日、約１２日～約１５日、約１２日～約１４日、約１２日～約１３日、約１３日～約１５日、約１３日～約１４日、または約１４日～約１５日）にわたって培養（例えば、バッチ培養、流加培養、または灌流培養）するステップとをさらに含み得る。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、複数の赤血球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な赤血球前駆細胞のいずれか）を振とうフラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とうフラスコのいずれか）中に含まれる第１の培養培地に配置することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を振とうフラスコ中、０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、複数の赤血球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な赤血球前駆細胞のいずれか）を振とう管（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とう管のいずれか）中に含まれる第１の培養培地に配置することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を振とう管中、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、複数の赤血球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な赤血球前駆細胞のいずれか）を本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の培養バッグ中に配置することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を培養バッグ中、毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクル（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の揺動速度でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物をバッチ培養することを含む。
流加培養
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を流加培養することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における流加培養は、追加的な体積の第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のいずれか）をある期間にわたって添加することを含む。一部の実施例では、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施例では、追加的な体積の第１の培養培地を第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加する。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）の直後の第１の細胞培養物の体積の約０．１×～約１０×（例えば、約０．１×～約９．５×、約０．１×～約９．０×、約０．１×～約８．５×、約０．１×～約８．０×、約０．１×～約７．５×、約０．１×～約７．０×、約０．１×～約６．５×、約０．１×～約６．０×、約０．１×～約５．５×、約０．１×～約５．０×、約０．１×～約４．５×、約０．１×～約４．０×、約０．１×～約３．５×、約０．１×～約３．０×、約０．１×～約２．５×、約０．１×～約２．０×、約０．１×～約１．５×、約０．１×～約１．０×、約０．１×～約０．５×、約０．１×～約０．３×、約０．１×～約０．２×、約０．２×～約１０×、約０．２×～約９．５×、約０．２×～約９．０×、約０．２×～約８．５×、約０．２×～約８．０×、約０．２×～約７．５×、約０．２×～約７．０×、約０．２×～約６．５×、約０．２×～約６．０×、約０．２×～約５．５×、約０．２×～約５．０×、約０．２×～約４．５×、約０．２×～約４．０×、約０．２×～約３．５×、約０．２×～約３．０×、約０．２×～約２．５×、約０．２×～約２．０×、約０．２×～約１．５×、約０．２×～約１．０×、約０．２×～約０．５×、約０．２×～約０．３×、約０．３×～約１０×、約０．３×～約９．５×、約０．３×～約９．０×、約０．３×～約８．５×、約０．３×～約８．０×、約０．３×～約７．５×、約０．３×～約７．０×、約０．３×～約６．５×、約０．３×～約６．０×、約０．３×～約５．５×、約０．３×～約５．０×、約０．３×～約４．５×、約０．３×～約４．０×、約０．３×～約３．５×、約０．３×～約３．０×、約０．３×～約２．５×、約０．３×～約２．０×、約０．３×～約１．５×、約０．３×～約１．０×、約０．３×～約０．５×、約０．５×～約１０×、約０．５×～約９．５×、約０．５×～約９．０×、約０．５×～約８．５×、約０．５×～約８．０×、約０．５×～約７．５×、約０．５×～約７．０×、約０．５×～約６．５×、約０．５×～約６．０×、約０．５×～約５．５×、約０．５×～約５．０×、約０．５×～約４．５×、約０．５×～約４．０×、約０．５×～約３．５×、約０．５×～約３．０×、約０．５×～約２．５×、約０．５×～約２．０×、約０．５×～約１．５×、約０．５×～約１．０×、約１．０×～約１０×、約１．０×～約９．５×、約１．０×～約９．０×、約１．０×～約８．５×、約１．０×～約８．０×、約１．０×～約７．５×、約１．０×～約７．０×、約１．０×～約６．５×、約１．０×～約６．０×、約１．０×～約５．５×、約１．０×～約５．０×、約１．０×～約４．５×、約１．０×～約４．０×、約１．０×～約３．５×、約１．０×～約３．０×、約１．０×～約２．５×、約１．０×～約２．０×、約１．０×～約１．５×、約１．５×～約１０×、約１．５×～約９．５×、約１．５×～約９．０×、約１．５×～約８．５×、約１．５×～約８．０×、約１．５×～約７．５×、約１．５×～約７．０×、約１．５×～約６．５×、約１．５×～約６．０×、約１．５×～約５．５×、約１．５×～約５．０×、約１．５×～約４．５×、約１．５×～約４．０×、約１．５×～約３．５×、約１．５×～約３．０×、約１．５×～約２．５×、約１．５×～約２．０×、約２．０×～約１０×、約２．０×～約９．５×、約２．０×～約９．０×、約２．０×～約８．５×、約２．０×～約８．０×、約２．０×～約７．５×、約２．０×～約７．０×、約２．０×～約６．５×、約２．０×～約６．０×、約２．０×～約５．５×、約２．０×～約５．０×、約２．０×～約４．５×、約２．０×～約４．０×、約２．０×～約３．５×、約２．０×～約３．０×、約２．０×～約２．５×、約２．５×～約１０×、約２．５×～約９．５×、約２．５×～約９．０×、約２．５×～約８．５×、約２．５×～約８．０×、約２．５×～約７．５×、約２．５×～約７．０×、約２．５×～約６．５×、約２．５×～約６．０×、約２．５×～約５．５×、約２．５×～約５．０×、約２．５×～約４．５×、約２．５×～約４．０×、約２．５×～約３．５×、約２．５×～約３．０×、約３．０×～約１０×、約３．０×～約９．５×、約３．０×～約９．０×、約３．０×～約８．５×、約３．０×～約８．０×、約３．０×～約７．５×、約３．０×～約７．０×、約３．０×～約６．５×、約３．０×～約６．０×、約３．０×～約５．５×、約３．０×～約５．０×、約３．０×～約４．５×、約３．０×～約４．０×、約３．０×～約３．５×、約３．５×～約１０×、約３．５×～約９．５×、約３．５×～約９．０×、約３．５×～約８．５×、約３．５×～約８．０×、約３．５×～約７．５×、約３．５×～約７．０×、約３．５×～約６．５×、約３．５×～約６．０×、約３．５×～約５．５×、約３．５×～約５．０×、約３．５×～約４．５×、約３．５×～約４．０×、約４．０×～約１０×、約４．０×～約９．５×、約４．０×～約９．０×、約４．０×～約８．５×、約４．０×～約８．０×、約４．０×～約７．５×、約４．０×～約７．０×、約４．０×～約６．５×、約４．０×～約６．０×、約４．０×～約５．５×、約４．０×～約５．０×、約４．０×～約４．５×、約４．５×～約１０×、約４．５×～約９．５×、約４．５×～約９．０×、約４．５×～約８．５×、約４．５×～約８．０×、約４．５×～約７．５×、約４．５×～約７．０×、約４．５×～約６．５×、約４．５×～約６．０×、約４．５×～約５．５×、約４．５×～約５．０×、約５．０×～約１０×、約５．０×～約９．５×、約５．０×～約９．０×、約５．０×～約８．５×、約５．０×～約８．０×、約５．０×～約７．５×、約５．０×～約７．０×、約５．０×～約６．５×、約５．０×～約６．０×、約５．０×～約５．５×、約５．５×～約１０×、約５．５×～約９．５×、約５．５×～約９．０×、約５．５×～約８．５×、約５．５×～約８．０×、約５．５×～約７．５×、約５．５×～約７．０×、約５．５×～約６．５×、約５．５×～約６．０×、約６．０×～約１０×、約６．０×～約９．５×、約６．０×～約９．０×、約６．０×～約８．５×、約６．０×～約８．０×、約６．０×～約７．５×、約６．０×～約７．０×、約６．０×～約６．５×、約６．５×～約１０×、約６．５×～約９．５×、約６．５×～約９．０×、約６．５×～約８．５×、約６．５×～約８．０×、約６．５×～約７．５×、約６．５×～約７．０×、約７．０×～約１０×、約７．０×～約９．５×、約７．０×～約９．０×、約７．０×～約８．５×、約７．０×～約８．０×、約７．０×～約７．５×、約７．５×～約１０×、約７．５×～約９．５×、約７．５×～約９．０×、約７．５×～約８．５×、約７．５×～約８．０×、約８．０×～約１０×、約８．０×～約９．５×、約８．０×～約９．０×、約８．０×～約８．５×、約８．５×～約１０×、約８．５×～約９．５×、約８．５×～約９．０×、約９．０×～約１０×、約９．０×～約９．５×、または約９．５×～約１０×を２４時間経つごとに添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第１の培養培地の第１の細胞培養物への添加を、第１の細胞培養物が標的特異的細胞密度、例えば、約１．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．５×１０６細胞／ｍＬ、約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約２．５×１０６細胞／ｍＬ、約３．０×１０６細胞／ｍＬ、約３．５×１０６細胞／ｍＬ、約４．０×１０６細胞／ｍＬ、約４．５×１０６細胞／ｍＬ、約５．０×１０６細胞／ｍＬ、約５．５×１０６細胞／ｍＬ、約６．０×１０６細胞／ｍＬ、約６．５×１０６細胞／ｍＬ、約７．０×１０６細胞／ｍＬ、約７．５×１０６細胞／ｍＬ、約８．０×１０６細胞／ｍＬ、約８．５×１０６細胞／ｍＬ、約９．０×１０６細胞／ｍＬ、約９．５×１０６細胞／ｍＬ、または約１．０×１０７細胞／ｍＬに達したところで開始する。
灌流培養
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物を灌流培養することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載のバイオリアクターのいずれかの中の）を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（例えば、約１０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約２０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１６０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１６０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、および約１８０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３）のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における灌流培養を、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日～約０．１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、または約５５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して実施することができる。一部の実施形態では、灌流速度をある期間にわたって増大させる。
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における灌流培養を約０．１の１日当たりの容器容積（ＶＶＤ）～約３ＶＶＤ（例えば、約０．１ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、または約２．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ）の灌流速度を使用して実施することができる。
一部の実施例では、ステップ（ｉｉ）における灌流培養は、少なくとも部分的に、追加的な体積の培養培地（例えば、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のいずれか））を第１の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施例では、追加的な体積の培養培地（例えば、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のいずれか））を第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の培養培地（例えば、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のいずれか））を第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加する。培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第１の培養培地のいずれか）の添加は、機械的に、例えば蠕動ポンプもしくは灌流ポンプを使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。
一部の実施例では、ステップ（ｉｉ）における灌流培養は、少なくとも部分的に、ある体積の培養培地（例えば、実質的に細胞を含まない培養培地）をある期間にわたって除去することを含む。一部の実施例では、培養培地（例えば、実質的に細胞を含まない培養培地）をある期間にわたって連続的に除去する。一部の実施形態では、培養培地をある期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）除去する。培養培地（例えば、実質的に細胞を含まない培養培地）の除去は、機械的に、例えば接線流濾過（ＴＦＦ）もしくは交互流濾過（alternating flow filtration）（ＡＴＦ）を使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。接線流濾過の追加的な非限定的な態様は本明細書に記載されている。一部の実施形態では、灌流培養は、接線濾過（例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）または交互接線濾過（ＡＴＦ））の使用を含む。一部の実施形態では、接線濾過（例えば、接線流濾過または交互接線濾過）は、平均孔径が、約１０ｎｍ～約６．０μｍ、約１０ｎｍ～約５．５μｍ、約１０ｎｍ～約５．０μｍ、約１０ｎｍ～約４．５μｍ、約１０ｎｍ～約４．０μｍ、約１０ｎｍ～約３．５μｍ、約１０ｎｍ～約３．０μｍ、約１０ｎｍ～約２．５μｍ、約１０ｎｍ～約２．０μｍ、約１０ｎｍ～約１．５μｍ、約１０ｎｍ～約１．０μｍ、約１０ｎｍ～約０．５μｍ、約１０ｎｍ～約０．２μｍ、１０ｎｍ～約０．１μｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６．０μｍ、約５０ｎｍ～約５．５μｍ、約５０ｎｍ～約５．０μｍ、約５０ｎｍ～約４．５μｍ、約５０ｎｍ～約４．０μｍ、約５０ｎｍ～約３．５μｍ、約５０ｎｍ～約３．０μｍ、約５０ｎｍ～約２．５μｍ、約５０ｎｍ～約２．０μｍ、約５０ｎｍ～約１．５μｍ、約５０ｎｍ～約１．０μｍ、約５０ｎｍ～約０．５μｍ、約５０ｎｍ～約０．２μｍ、約５０ｎｍ～約０．１μｍ、約０．１μｍ～約６．０μｍ、約０．１μｍ～約５．５μｍ、約０．１μｍ～約５．０μｍ、約０．１μｍ～約４．５μｍ、約０．１μｍ～約４．０μｍ、約０．１μｍ～約３．５μｍ、約０．１μｍ～約３．０μｍ、約０．１μｍ～約２．５μｍ、約０．１μｍ～約２．０μｍ、約０．１μｍ～約１．５μｍ、約０．１μｍ～約１．０μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約０．２μｍ、約０．２μｍ～約６．０μｍ、約０．２μｍ～約５．５μｍ、約０．２μｍ～約５．０μｍ、約０．２μｍ～約４．５μｍ、約０．２μｍ～約４．０μｍ、約０．２μｍ～約３．５μｍ、約０．２μｍ～約３．０μｍ、約０．２μｍ～約２．５μｍ、約０．２μｍ～約２．０μｍ、約０．２μｍ～約１．５μｍ、約０．２μｍ～約１．０μｍ、約０．２μｍ～約０．５μｍ、約０．５μｍ～約６．０μｍ、約０．５μｍ～約５．５μｍ、約０．５μｍ～約５．０μｍ、約０．５μｍ～約４．５μｍ、約０．５μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約３．５μｍ、約０．５μｍ～約３．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．５μｍ～約２．０μｍ、約０．５μｍ～約１．５μｍ、約０．５μｍ～約１．０μｍ、約１．０μｍ～約６．０μｍ、約１．０μｍ～約５．５μｍ、約１．０μｍ～約５．０μｍ、約１．０μｍ～約４．５μｍ、約１．０μｍ～約４．０μｍ、約１．０μｍ～約３．５μｍ、約１．０μｍ～約３．０μｍ、約１．０μｍ～約２．５μｍ、約１．０μｍ～約２．０μｍ、約１．０μｍ～約１．５μｍ、約１．５μｍ～約６．０μｍ、約１．５μｍ～約５．５μｍ、約１．５μｍ～約５．０μｍ、約１．５μｍ～約４．５μｍ、約１．５μｍ～約４．０μｍ、約１．５μｍ～約３．５μｍ、約１．５μｍ～約３．０μｍ、約１．５μｍ～約２．５μｍ、約１．５μｍ～約２．０μｍ、約２．０μｍ～約６．０μｍ、約２．０μｍ～約５．５μｍ、約２．０μｍ～約５．０μｍ、約２．０μｍ～約４．５μｍ、約２．０μｍ～約４．０μｍ、約２．０μｍ～約３．５μｍ、約２．０μｍ～約３．０μｍ、約２．０μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約６．０μｍ、約２．５μｍ～約５．５μｍ、約２．５μｍ～約５．０μｍ、約２．５μｍ～約４．５μｍ、約２．５μｍ～約４．０μｍ、約２．５μｍ～約３．５μｍ、約２．５μｍ～約３．０μｍ、約３．０μｍ～約６．０μｍ、約３．０μｍ～約５．５μｍ、約３．０μｍ～約５．０μｍ、約３．０μｍ～約４．５μｍ、約３．０μｍ～約４．０μｍ、約３．０μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約６．０μｍ、約３．５μｍ～約５．５μｍ、約３．５μｍ～約５．０μｍ、約３．５μｍ～約４．５μｍ、約３．５μｍ～約４．０μｍ、約４．０μｍ～約６．０μｍ、約４．０μｍ～約５．５μｍ、約４．０μｍ～約５．０μｍ、約４．０μｍ～約４．５μｍ、約４．５μｍ～約６．０μＭ、約４．５μｍ～約５．５μｍ、約４．５μｍ～約５．０μｍ、約５．０μｍ～約６．０μｍ、約５．０μｍ～約５．５μｍ、または約５．５μｍ～約６．０μｍの１つまたは複数のフィルターの使用を含む。
一部の実施形態では、第１の細胞培養物の灌流を、第１の細胞培養物が特定の標的細胞密度、例えば、１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．５×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０７個に達したところで開始する。
一部の実施形態では、第１の培養培地は、Ｆｌｔ－３リガンド（例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＦｌｔ－３リガンド）、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＳＣＦ）、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＩＬ－３）、およびＩＬ－６（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＩＬ－６）のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）を含む。本明細書に記載の第１の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＳＣＧＭ培地を含む。第１の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（例えば、約０．１ｍＭ～約９．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約９．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約８．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約８．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約７．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約７．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約６．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約６．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約４．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約４．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約３．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約３．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１．５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約０．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約４．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約３．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約３．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約２．５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～約１．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約３．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．５ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約４．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約３．５ｍＭ、約２．０ｍＭ～約３．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約２．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約２．５ｍＭ～約３．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約３．０ｍＭ～約４．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～約３．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約４．５ｍＭ、約３．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約５ｍＭ、約４．０ｍＭ～約４．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約５．０ｍＭ～約６．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～約５．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～約６．５ｍＭ、約５．５ｍＭ～約６．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約６．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約６．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約６．０ｍＭ～約７．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～約６．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約６．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約６．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約６．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約６．５ｍＭ～約７．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約７．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約７．０ｍＭ～約８．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～約７．５ｍＭ、約７．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約７．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約７．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約７．５ｍＭ～約８．５ｍＭ、約７．５ｍＭ～約８．０ｍＭ、約８．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約８．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、約８．０ｍＭ～約９．０ｍＭ、約８．０ｍＭ～約８．５ｍＭ、約８．５ｍＭ～約１０ｍＭ、約８．５ｍＭ～約９．５ｍＭ、約８．５ｍＭ～約９．０ｍＭ、約９．０ｍＭ～約１０ｍＭ、約９．０ｍＭ～約９．５ｍＭ、または約９．５ｍＭ～約１０ｍＭ）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。本明細書に記載の第１の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約４μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約６μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約７μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ
～約１７μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約９μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１１μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ～約１３μｇ／ｍＬ、１３μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ～約１４μｇ／ｍＬ、１４μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１６μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、１７μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１７μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約１７μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１８μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１８μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、または約１９μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ）のインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。
本明細書に記載の第１の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。本明細書に記載の第１の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、トランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ）（例えば、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約１５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、または約３５０～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ）を含む。
一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、または約１９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンド（例えば、組換えヒトＦｌｔ－３リガンド）を含む。
一部の実施形態では、第１の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ
／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約６５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約６５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約７５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約９５０ｎｇ／ｍＬ、または約９５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦ（例えば、組換えヒト幹細胞因子）を含む。
一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、または約１９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３（例えば、組換えヒトＩＬ－３）を含む。
一部の実施形態では、第１の培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１７０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、約１７０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／ｍＬ、または約１９０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６（例えば、組換えヒトＩＬ－６）を含む。
一部の実施例では、第１の培養培地は、例えば、合成液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または動物成分を含まない合成液体培養培地、および／または無血清液体培養培地であり得る。
培養ステップＢ
灌流培養
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を約２日～約１５日（例えば、約２日～約１４日、約２日～約１３日、約２日～約１２日、約２日～約１１日、約２日～約１０日、約２日～約９日、約２日～約８日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約１５日、約３日～約１４日、約３日～約１３日、約３日～約１２日、約３日～約１１日、約３日～約１０日、約３日～約９日、約３日～約８日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約１５日、約４日～約１４日、約４日～約１３日、約４日～約１２日、約４日～約１１日、約４日～約１０日、約４日～約９日、約４日～約８日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約１５日、約５日～約１４日、約５日～約１３日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約１５日、約６日～約１４日、約６日～約１３日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１５日、約７日～約１４日、約７日～約１３日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１５日、約８日～約１４日、約８日～約１３日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１５日、約９日～約１４日、約９日～約１３日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１５日、約１０日～約１４日、約１０日～約１３日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、約１１日～約１５日、約１１日～約１４日、約１１日～約１３日、約１１日～約１２日、約１２日～約１５日、約１２日～約１４日、約１２日～約１３日、約１３日～約１５日、約１３日～約１４日、または約１４日～約１５日）にわたって灌流培養すること（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する例示的なバイオリアクターのいずれかの中の第２の細胞培養物のいずれか）を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載のバイオリアクターのいずれかの中の）を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（例えば、約１０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約２０Ｗ／ｍ３、約１０Ｗ／ｍ３～約１５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約１５Ｗ／ｍ３～約２０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約２０Ｗ／ｍ３～約２５Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約２５Ｗ／ｍ３～約３０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約３０Ｗ／ｍ３～約３５Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約３５Ｗ／ｍ３～約４０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約４０Ｗ／ｍ３～約６０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約６０Ｗ／ｍ３～約８０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約８０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１００Ｗ／ｍ３～約１２０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１２０Ｗ／ｍ３～約１４０Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、約１４０Ｗ／ｍ３～約１６０Ｗ／ｍ３、約１６０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３、約１６０Ｗ／ｍ３～約１８０Ｗ／ｍ３、および約１８０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３）のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、または約５５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して実施することができる。一部の実施形態では、灌流速度をある期間にわたって増大させる。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における灌流培養を約０．１の１日当たりの容器容積（ＶＶＤ）～約３ＶＶＤ（例えば、約０．１ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．４ＶＶＤ、約０．１ＶＶＤ～約０．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．２ＶＶＤ～約０．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．４ＶＶＤ～約０．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約０．６ＶＶＤ～約０．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約０．８ＶＶＤ～約１．０ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約１．０ＶＶＤ～約１．２ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．２ＶＶＤ～約１．４ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．４ＶＶＤ～約１．６ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約１．６ＶＶＤ～約１．８ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約１．８ＶＶＤ～約２．０ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約２．０ＶＶＤ～約２．２ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．２ＶＶＤ～約２．４ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、約２．４ＶＶＤ～約２．６ＶＶＤ、約２．６ＶＶＤ～約３ＶＶＤ、約２．６ＶＶＤ～約２．８ＶＶＤ、または約２．８ＶＶＤ～約３ＶＶＤ）の灌流速度を使用して実施することができる。
一部の実施例では、ステップ（ｂ）における灌流培養は、少なくとも部分的に、追加的な体積の培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか））を第２の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施例では、追加的な体積の培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか））を第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか））を第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加する。培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか）の添加は、機械的に、例えば蠕動ポンプもしくは灌流ポンプを使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。
一部の実施例では、ステップ（ｂ）における灌流培養は、少なくとも部分的に、ある体積の培養培地（例えば、実質的に細胞を含まない培養培地）をある期間にわたって除去することを含む。一部の実施例では、培養培地（例えば、実質的に細胞を含まない培養培地）をある期間にわたって連続的に除去する。一部の実施形態では、培養培地をある期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）除去する。培養培地（例えば、実質的に細胞を含まない培養培地）の除去は、機械的に、例えば接線流濾過（ＴＦＦ）もしくは交互流濾過（ＡＴＦ）を使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。接線流濾過の追加的な非限定的な態様は本明細書に記載されている。
これらの方法の一部の実施例では、第２の培養培地は、以下のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を含む：トランスフェリン（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ））、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＩＬ－３（例えば、組換えヒトＩＬ－３））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、デキサメタゾン（例えば、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのデキサメタゾン）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド）、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのインスリン）。これらの方法の一部の実施例では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。これらの方法の一部の実施例では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、灌流培養は、接線濾過（例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）または交互接線濾過（ＡＴＦ））の使用を含む。一部の実施形態では、接線濾過（例えば、接線流濾過または交互接線濾過）は、平均孔径が、約１０ｎｍ～約６．０μｍ、約１０ｎｍ～約５．５μｍ、約１０ｎｍ～約５．０μｍ、約１０ｎｍ～約４．５μｍ、約１０ｎｍ～約４．０μｍ、約１０ｎｍ～約３．５μｍ、約１０ｎｍ～約３．０μｍ、約１０ｎｍ～約２．５μｍ、約１０ｎｍ～約２．０μｍ、約１０ｎｍ～約１．５μｍ、約１０ｎｍ～約１．０μｍ、約１０ｎｍ～約０．５μｍ、約１０ｎｍ～約０．２μｍ、１０ｎｍ～約０．１μｍ、約１０ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６．０μｍ、約５０ｎｍ～約５．５μｍ、約５０ｎｍ～約５．０μｍ、約５０ｎｍ～約４．５μｍ、約５０ｎｍ～約４．０μｍ、約５０ｎｍ～約３．５μｍ、約５０ｎｍ～約３．０μｍ、約５０ｎｍ～約２．５μｍ、約５０ｎｍ～約２．０μｍ、約５０ｎｍ～約１．５μｍ、約５０ｎｍ～約１．０μｍ、約５０ｎｍ～約０．５μｍ、約５０ｎｍ～約０．２μｍ、約５０ｎｍ～約０．１μｍ、約０．１μｍ～約６．０μｍ、約０．１μｍ～約５．５μｍ、約０．１μｍ～約５．０μｍ、約０．１μｍ～約４．５μｍ、約０．１μｍ～約４．０μｍ、約０．１μｍ～約３．５μｍ、約０．１μｍ～約３．０μｍ、約０．１μｍ～約２．５μｍ、約０．１μｍ～約２．０μｍ、約０．１μｍ～約１．５μｍ、約０．１μｍ～約１．０μｍ、約０．１μｍ～約０．５μｍ、約０．１μｍ～約０．２μｍ、約０．２μｍ～約６．０μｍ、約０．２μｍ～約５．５μｍ、約０．２μｍ～約５．０μｍ、約０．２μｍ～約４．５μｍ、約０．２μｍ～約４．０μｍ、約０．２μｍ～約３．５μｍ、約０．２μｍ～約３．０μｍ、約０．２μｍ～約２．５μｍ、約０．２μｍ～約２．０μｍ、約０．２μｍ～約１．５μｍ、約０．２μｍ～約１．０μｍ、約０．２μｍ～約０．５μｍ、約０．５μｍ～約６．０μｍ、約０．５μｍ～約５．５μｍ、約０．５μｍ～約５．０μｍ、約０．５μｍ～約４．５μｍ、約０．５μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約３．５μｍ、約０．５μｍ～約３．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．５μｍ～約２．０μｍ、約０．５μｍ～約１．５μｍ、約０．５μｍ～約１．０μｍ、約１．０μｍ～約６．０μｍ、約１．０μｍ～約５．５μｍ、約１．０μｍ～約５．０μｍ、約１．０μｍ～約４．５μｍ、約１．０μｍ～約４．０μｍ、約１．０μｍ～約３．５μｍ、約１．０μｍ～約３．０μｍ、約１．０μｍ～約２．５μｍ、約１．０μｍ～約２．０μｍ、約１．０μｍ～約１．５μｍ、約１．５μｍ～約６．０μｍ、約１．５μｍ～約５．５μｍ、約１．５μｍ～約５．０μｍ、約１．５μｍ～約４．５μｍ、約１．５μｍ～約４．０μｍ、約１．５μｍ～約３．５μｍ、約１．５μｍ～約３．０μｍ、約１．５μｍ～約２．５μｍ、約１．５μｍ～約２．０μｍ、約２．０μｍ～約６．０μｍ、約２．０μｍ～約５．５μｍ、約２．０μｍ～約５．０μｍ、約２．０μｍ～約４．５μｍ、約２．０μｍ～約４．０μｍ、約２．０μｍ～約３．５μｍ、約２．０μｍ～約３．０μｍ、約２．０μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約６．０μｍ、約２．５μｍ～約５．５μｍ、約２．５μｍ～約５．０μｍ、約２．５μｍ～約４．５μｍ、約２．５μｍ～約４．０μｍ、約２．５μｍ～約３．５μｍ、約２．５μｍ～約３．０μｍ、約３．０μｍ～約６．０μｍ、約３．０μｍ～約５．５μｍ、約３．０μｍ～約５．０μｍ、約３．０μｍ～約４．５μｍ、約３．０μｍ～約４．０μｍ、約３．０μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約６．０μｍ、約３．５μｍ～約５．５μｍ、約３．５μｍ～約５．０μｍ、約３．５μｍ～約４．５μｍ、約３．５μｍ～約４．０μｍ、約４．０μｍ～約６．０μｍ、約４．０μｍ～約５．５μｍ、約４．０μｍ～約５．０μｍ、約４．０μｍ～約４．５μｍ、約４．５μｍ～約６．０μＭ、約４．５μｍ～約５．５μｍ、約４．５μｍ～約５．０μｍ、約５．０μｍ～約６．０μｍ、約５．０μｍ～約５．５μｍ、または約５．５μｍ～約６．０μｍの１つまたは複数のフィルターの使用を含む。
一部の実施形態では、第２の細胞培養物の灌流を、第１の細胞培養物が特定の標的細胞密度、例えば、１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．５×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０７個に達したところで開始する。
バッチ培養または流加培養
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とうフラスコ、振とう管、培養バッグ、またはバイオリアクターのいずれかの中の第２の細胞培養物のいずれか）を約２日～約１５日（例えば、約２日～約１４日、約２日～約１３日、約２日～約１２日、約２日～約１１日、約２日～約１０日、約２日～約９日、約２日～約８日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約１５日、約３日～約１４日、約３日～約１３日、約３日～約１２日、約３日～約１１日、約３日～約１０日、約３日～約９日、約３日～約８日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約１５日、約４日～約１４日、約４日～約１３日、約４日～約１２日、約４日～約１１日、約４日～約１０日、約４日～約９日、約４日～約８日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約１５日、約５日～約１４日、約５日～約１３日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約１５日、約６日～約１４日、約６日～約１３日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１５日、約７日～約１４日、約７日～約１３日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１５日、約８日～約１４日、約８日～約１３日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１５日、約９日～約１４日、約９日～約１３日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１５日、約１０日～約１４日、約１０日～約１３日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、約１１日～約１５日、約１１日～約１４日、約１１日～約１３日、約１１日～約１２日、約１２日～約１５日、約１２日～約１４日、約１２日～約１３日、約１３日～約１５日、約１３日～約１４日、または約１４日～約１５日）にわたってバッチ培養または流加培養することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的なバイオリアクターのいずれか）中に配置された第２の細胞培養物をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物をバイオリアクター中、約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＰ／Ｖ値でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、振とうフラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とうフラスコのいずれか）中に配置された第２の細胞培養物をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を振とうフラスコ中、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、振とう管（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とう管のいずれか（例えば、円錐容器））中に配置された第２の細胞培養物をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を振とう管中、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な培養バッグのいずれか）中に配置された第２の細胞培養物をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を培養バッグ中、毎分１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクル（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の揺動速度でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物をバッチ培養することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、第２の細胞培養物を流加培養することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）における流加培養は、追加的な体積の第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか）をある期間にわたって添加することを含む。一部の実施例では、追加的な体積の培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか））を第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施例では、追加的な体積の培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか））を第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の直後の第２の細胞培養物の体積の約０．１×～約１０×（例えば、約０．１×～約９．５×、約０．１×～約９．０×、約０．１×～約８．５×、約０．１×～約８．０×、約０．１×～約７．５×、約０．１×～約７．０×、約０．１×～約６．５×、約０．１×～約６．０×、約０．１×～約５．５×、約０．１×～約５．０×、約０．１×～約４．５×、約０．１×～約４．０×、約０．１×～約３．５×、約０．１×～約３．０×、約０．１×～約２．５×、約０．１×～約２．０×、約０．１×～約１．５×、約０．１×～約１．０×、約０．１×～約０．５×、約０．１×～約０．３×、約０．１×～約０．２×、約０．２×～約１０×、約０．２×～約９．５×、約０．２×～約９．０×、約０．２×～約８．５×、約０．２×～約８．０×、約０．２×～約７．５×、約０．２×～約７．０×、約０．２×～約６．５×、約０．２×～約６．０×、約０．２×～約５．５×、約０．２×～約５．０×、約０．２×～約４．５×、約０．２×～約４．０×、約０．２×～約３．５×、約０．２×～約３．０×、約０．２×～約２．５×、約０．２×～約２．０×、約０．２×～約１．５×、約０．２×～約１．０×、約０．２×～約０．５×、約０．２×～約０．３×、約０．３×～約１０×、約０．３×～約９．５×、約０．３×～約９．０×、約０．３×～約８．５×、約０．３×～約８．０×、約０．３×～約７．５×、約０．３×～約７．０×、約０．３×～約６．５×、約０．３×～約６．０×、約０．３×～約５．５×、約０．３×～約５．０×、約０．３×～約４．５×、約０．３×～約４．０×、約０．３×～約３．５×、約０．３×～約３．０×、約０．３×～約２．５×、約０．３×～約２．０×、約０．３×～約１．５×、約０．３×～約１．０×、約０．３×～約０．５×、約０．５×～約１０×、約０．５×～約９．５×、約０．５×～約９．０×、約０．５×～約８．５×、約０．５×～約８．０×、約０．５×～約７．５×、約０．５×～約７．０×、約０．５×～約６．５×、約０．５×～約６．０×、約０．５×～約５．５×、約０．５×～約５．０×、約０．５×～約４．５×、約０．５×～約４．０×、約０．５×～約３．５×、約０．５×～約３．０×、約０．５×～約２．５×、約０．５×～約２．０×、約０．５×～約１．５×、約０．５×～約１．０×、約１．０×～約１０×、約１．０×～約９．５×、約１．０×～約９．０×、約１．０×～約８．５×、約１．０×～約８．０×、約１．０×～約７．５×、約１．０×～約７．０×、約１．０×～約６．５×、約１．０×～約６．０×、約１．０×～約５．５×、約１．０×～約５．０×、約１．０×～約４．５×、約１．０×～約４．０×、約１．０×～約３．５×、約１．０×～約３．０×、約１．０×～約２．５×、約１．０×～約２．０×、約１．０×～約１．５×、約１．５×～約１０×、約１．５×～約９．５×、約１．５×～約９．０×、約１．５×～約８．５×、約１．５×～約８．０×、約１．５×～約７．５×、約１．５×～約７．０×、約１．５×～約６．５×、約１．５×～約６．０×、約１．５×～約５．５×、約１．５×～約５．０×、約１．５×～約４．５×、約１．５×～約４．０×、約１．５×～約３．５×、約１．５×～約３．０×、約１．５×～約２．５×、約１．５×～約２．０×、約２．０×～約１０×、約２．０×～約９．５×、約２．０×～約９．０×、約２．０×～約８．５×、約２．０×～約８．０×、約２．０×～約７．５×、約２．０×～約７．０×、約２．０×～約６．５×、約２．０×～約６．０×、約２．０×～約５．５×、約２．０×～約５．０×、約２．０×～約４．５×、約２．０×～約４．０×、約２．０×～約３．５×、約２．０×～約３．０×、約２．０×～約２．５×、約２．５×～約１０×、約２．５×～約９．５×、約２．５×～約９．０×、約２．５×～約８．５×、約２．５×～約８．０×、約２．５×～約７．５×、約２．５×～約７．０×、約２．５×～約６．５×、約２．５×～約６．０×、約２．５×～約５．５×、約２．５×～約５．０×、約２．５×～約４．５×、約２．５×～約４．０×、約２．５×～約３．５×、約２．５×～約３．０×、約３．０×～約１０×、約３．０×～約９．５×、約３．０×～約９．０×、約３．０×～約８．５×、約３．０×～約８．０×、約３．０×～約７．５×、約３．０×～約７．０×、約３．０×～約６．５×、約３．０×～約６．０×、約３．０×～約５．５×、約３．０×～約５．０×、約３．０×～約４．５×、約３．０×～約４．０×、約３．０×～約３．５×、約３．５×～約１０×、約３．５×～約９．５×、約３．５×～約９．０×、約３．５×～約８．５×、約３．５×～約８．０×、約３．５×～約７．５×、約３．５×～約７．０×、約３．５×～約６．５×、約３．５×～約６．０×、約３．５×～約５．５×、約３．５×～約５．０×、約３．５×～約４．５×、約３．５×～約４．０×、約４．０×～約１０×、約４．０×～約９．５×、約４．０×～約９．０×、約４．０×～約８．５×、約４．０×～約８．０×、約４．０×～約７．５×、約４．０×～約７．０×、約４．０×～約６．５×、約４．０×～約６．０×、約４．０×～約５．５×、約４．０×～約５．０×、約４．０×～約４．５×、約４．５×～約１０×、約４．５×～約９．５×、約４．５×～約９．０×、約４．５×～約８．５×、約４．５×～約８．０×、約４．５×～約７．５×、約４．５×～約７．０×、約４．５×～約６．５×、約４．５×～約６．０×、約４．５×～約５．５×、約４．５×～約５．０×、約５．０×～約１０×、約５．０×～約９．５×、約５．０×～約９．０×、約５．０×～約８．５×、約５．０×～約８．０×、約５．０×～約７．５×、約５．０×～約７．０×、約５．０×～約６．５×、約５．０×～約６．０×、約５．０×～約５．５×、約５．５×～約１０×、約５．５×～約９．５×、約５．５×～約９．０×、約５．５×～約８．５×、約５．５×～約８．０×、約５．５×～約７．５×、約５．５×～約７．０×、約５．５×～約６．５×、約５．５×～約６．０×、約６．０×～約１０×、約６．０×～約９．５×、約６．０×～約９．０×、約６．０×～約８．５×、約６．０×～約８．０×、約６．０×～約７．５×、約６．０×～約７．０×、約６．０×～約６．５×、約６．５×～約１０×、約６．５×～約９．５×、約６．５×～約９．０×、約６．５×～約８．５×、約６．５×～約８．０×、約６．５×～約７．５×、約６．５×～約７．０×、約７．０×～約１０×、約７．０×～約９．５×、約７．０×～約９．０×、約７．０×～約８．５×、約７．０×～約８．０×、約７．０×～約７．５×、約７．５×～約１０×、約７．５×～約９．５×、約７．５×～約９．０×、約７．５×～約８．５×、約７．５×～約８．０×、約８．０×～約１０×、約８．０×～約９．５×、約８．０×～約９．０×、約８．０×～約８．５×、約８．５×～約１０×、約８．５×～約９．５×、約８．５×～約９．０×、約９．０×～約１０×、約９．０×～約９．５×、または約９．５×～約１０×）を２４時間経つごとに添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の培養培地（例えば、第２の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか）の第２の細胞培養物への添加を、第１の細胞培養物が特定の標的細胞密度、例えば、１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．５×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０７個に達したところで開始する。
培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の培養培地のいずれか）の添加は、機械的に、例えば蠕動ポンプを使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。
これらの方法の一部の実施例では、第２の培養培地は、以下のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を含む：トランスフェリン（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ））、ＩＬ－３（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＩＬ－３（例えば、組換えヒトＩＬ－３））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、デキサメタゾン（例えば、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのデキサメタゾン）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載のＥＰＯ模倣ペプチドのいずれか））、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのインスリン）。これらの方法の一部の実施例では、第２の培養培地は、脂質（例えば、脂質混合物）を含む。これらの方法の一部の実施例では、第２の培養培地は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。
第３の細胞培養物をもたらすこと（ステップＣ）
本明細書に記載の方法は、ある体積のステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のいずれか）を容器（例えば、バイオリアクター（例えば、灌流バイオリアクター）、振とう管、振とうフラスコ、または培養バッグ）中に含まれる第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）に配置して、最初の細胞密度が、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約０．５×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ～約２×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約２×１０５細胞／ｍＬ～約４×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約４×１０５細胞／ｍＬ～約６×１０５細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約６×１０５細胞／ｍＬ～約８×１０５細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約８×１０５細胞／ｍＬ～約０．１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、約０．５×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ～約０．５×１０７細胞／ｍＬ、または約０．５×１０７細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬである第３の細胞培養物をもたらすステップ（ステップ（ｃ））を含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、ある体積のステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のいずれか）をバイオリアクター（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有するバイオリアクターのいずれか（例えば、灌流バイオリアクター））中に含まれる第３の培養培地に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）である第３の細胞培養物をもたらすことを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、ある体積のステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のいずれか）を振とうフラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とうフラスコのいずれか）中に含まれる第３の培養培地に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）である第３の細胞培養物をもたらすことを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、ある体積のステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のいずれか）を振とう管（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とう管のいずれか（例えば、円錐容器））中に含まれる第３の培養培地に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）である第３の細胞培養物をもたらすことを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、ある体積のステップ（ｂ）の第２の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第２の細胞培養物のいずれか）を培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な培養バッグのいずれか）中に含まれる第３の培養培地に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）である第３の細胞培養物をもたらすことを含む。
一部の実施例では、第３の培養培地は、トランスフェリン（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ））、インスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのインスリン（例えば、組換えヒトインスリン））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、およびＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的なＥＰＯ模倣ペプチドのいずれか））のうちの１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、または４つ）を含む。本明細書に記載の第３の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。本明細書に記載の第３の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．０００％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．０００％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約８．０００％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、または約９．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、０．１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／
ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、または約４．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ）のヒト血漿を含む。一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ（例えば、約１Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約２Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、または約４Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ）のヘパリンを含む。一部の実施例では、第３の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、または約２．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ）のポロキサマー－１８８（Ｐ１８８）を含む。本明細書に記載の第３の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、約１ｍＭ～約７ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約４ｍＭ、約１ｍＭ～約３ｍＭ、約１ｍＭ～約２ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約２ｍＭ～約７ｍＭ、約２ｍＭ～約６ｍＭ、約２ｍＭ～約５ｍＭ、約２ｍＭ～約４ｍＭ、約２ｍＭ～約３ｍＭ、約３ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約３ｍＭ～約６ｍＭ、約３ｍＭ～約５ｍＭ、約３ｍＭ～約４ｍＭ、約４ｍＭ～約８ｍＭ、約４ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４ｍＭ～約５ｍＭ、約５ｍＭ～約８ｍＭ、約５ｍＭ～約７ｍＭ、約５ｍＭ～約６ｍＭ、約６ｍＭ～約８ｍＭ、約６ｍＭ～約７ｍＭ、または約７ｍＭ～約８ｍＭ）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施例では、第３の培養培地は、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、３５０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３５０μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約３５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、または４５０μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ）を含む。
一部の実施例では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ～約６００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ～約７００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ～約８００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ～約９００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ）を含む。
一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約
１４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ，１８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、または約４８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチドを含む。ＥＰＯ模倣ペプチドの非限定的な例は本明細書に記載されている。ＥＰＯ模倣ペプチドのさらなる例は当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。
一部の実施例では、第３の培養培地は、例えば、合成液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または動物成分を含まない合成液体培養培地、および／または無血清液体培養培地であり得る。
培養ステップＤ
灌流培養
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的なバイオリアクターのいずれか（例えば、灌流バイオリアクター）中の本明細書に記載の第３の細胞培養物のいずれか）を約５日～約２０日（例えば、約５日～約１９日、約５日～約１８日、約５日～約１７日、約５日～約１６日、約５日～約１５日、約５日～約１４日、約５日～約１３日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約２０日、約６日～約１９日、約６日～約１８日、約６日～約１７日、約６日～約１６日、約６日～約１５日、約６日～約１４日、約６日～約１３日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約２０日、約７日～約１９日、約７日～約１８日、約７日～約１７日、約７日～約１６日、約７日～約１５日、約７日～約１４日、約７日～約１３日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約２０日，約８日～約１９日、約８日～約１８日、約８日～約１７日、約８日～約１６日、約８日～約１５日、約８日～約１４日、約８日～約１３日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約２０日，約９日～約１９日、約９日～約１８日、約９日～約１７日、約９日～約１６日、約９日～約１５日、約９日～約１４日、約９日～約１３日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約２０日，約１０日～約１９日、約１０日～約１８日、約１０日～約１７日、約１０日～約１６日、約１０日～約１５日、約１０日～約１４日、約１０日～約１３日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、約１１日～約２０日，約１１日～約１９日、約１１日～約１８日、約１１日～約１７日、約１１日～約１６日、約１１日～約１５日、約１１日～約１４日、約１１日～約１３日、約１１日～約１２日、約１２日～約２０日，約１２日～約１９日、約１２日～約１８日、約１２日～約１７日、約１２日～約１６日、約１２日～約１５日、約１２日～約１４日、約１２日～約１３日、約１３日～約２０日，約１３日～約１９日、約１３日～約１８日、約１３日～約１７日、約１３日～約１６日、約１３日～約１５日、約１３日～約１４日、約１４日～約２０日，約１４日～約１９日、約１４日～約１８日、約１４日～約１７日、約１４日～約１６日、約１４日～約１５日、約１５日～約２０日，約１５日～約１９日、約１５日～約１８日、約１５日～約１７日、約１５日～約１６日、約１６日～約２０日，約１６日～約１９日、約１６日～約１８日、約１６日～約１７日、約１７日～約２０日，約１７日～約１９日、約１７日～約１８日、約１８日～約２０日、約１８日～約１９日、または約１９日～約２０日）にわたって灌流培養することを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地は脱核赤血球細胞（例えば、本明細書に記載の例示的な脱核赤血球細胞のいずれか）の集団を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載のバイオリアクターのいずれかの中の）を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（例えば、本明細書に記載の範囲のいずれかの部分範囲のいずれか）のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日～約０．５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約０．５ｎＬ／細胞／日～約１ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約１ｎＬ／細胞／日～約２ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約２ｎＬ／細胞／日～約４ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約４ｎＬ／細胞／日～約５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約５ｎＬ／細胞／日～約６ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約６ｎＬ／細胞／日～約８ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約８ｎＬ／細胞／日～約１０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約１０ｎＬ／細胞／日～約１５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約１５ｎＬ／細胞／日～約２０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約２０ｎＬ／細胞／日～約２５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約２５ｎＬ／細胞／日～約３０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約３０ｎＬ／細胞／日～約３５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約３５ｎＬ／細胞／日～約４０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約４０ｎＬ／細胞／日～約４５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、約４５ｎＬ／細胞／日～約５０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日、約５０ｎＬ／細胞／日～約５５ｎＬ／細胞／日、または約５５ｎＬ／細胞／日～約６０ｎＬ／細胞／日の灌流速度を使用して実施することができる。一部の実施形態では、灌流速度をある期間にわたって増大させる。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における灌流培養を約０．１ＶＶＤ～約３ＶＶＤ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の灌流速度を使用して実施することができる。
一部の実施例では、ステップ（ｄ）における灌流培養は、（ｉ）追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第１の期間にわたって添加すること；および（ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第２の期間にわたって添加することを含む。
一部の実施例では、（ｉ）における追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第２の期間にわたって連続的に添加する。
一部の実施例では、（ｉ）における追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第１の期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加し、かつ／または（ｉｉ）（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第２の期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加する。
培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地または第４の培養培地のいずれか）の添加は、機械的に、例えば蠕動ポンプを使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。
培養培地（例えば、実質的に細胞を含まない培養培地）の除去は、機械的に、例えば接線流濾過（ＴＦＦ）もしくは交互流濾過（ＡＴＦ）を使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。接線流濾過の追加的な非限定的な態様は本明細書に記載されている。
一部の実施例では、（ｉ）における第１の期間は、約１日～約１２日、約１日～約１１日、約１日～約１０日、約１日～約９日、約１日～約８日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約１２日、約２日～約１１日、約２日～約１０日、約２日～約９日、約２日～約８日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約１２日、約３日～約１１日、約３日～約１０日、約３日～約９日、約３日～約８日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約１２日、約４日～約１１日、約４日～約１０日、約４日～約９日、約４日～約８日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、または約１１日～約１２日である。
一部の実施例では、（ｉｉ）における第２の期間は、約１日～約１２日、約１日～約１１日、約１日～約１０日、約１日～約９日、約１日～約８日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約１２日、約２日～約１１日、約２日～約１０日、約２日～約９日、約２日～約８日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約１２日、約３日～約１１日、約３日～約１０日、約３日～約９日、約３日～約８日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約１２日、約４日～約１１日、約４日～約１０日、約４日～約９日、約４日～約８日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、または約１１日～約１２日である。
これらの方法の一部の実施例では、第４の培養培地は、以下のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、または３つ）を含む：トランスフェリン（例えば、約１００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ））、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのインスリン）。
本明細書に記載の第４の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。本明細書に記載の第４の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約８．０００％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約４．５％ｖ／ｖ～約５．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約５．０％ｖ／ｖ～約５．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約５．５％ｖ／ｖ～約６．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約６．０％ｖ／ｖ～約６．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約６．５％ｖ／ｖ～約７．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約７．０％ｖ／ｖ～約７．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約７．５％ｖ／ｖ～約８．０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約８．０％ｖ／ｖ～約８．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、約８．５％ｖ／ｖ～約９．０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約９．０％ｖ／ｖ～約９．５％ｖ／ｖ、または約９．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、０．１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ（例えば、約０．１％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約１．０％ｖ／ｖ～約１．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約１．５％ｖ／ｖ～約２．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約２．０％ｖ／ｖ～約２．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約２．５％ｖ／ｖ～約３．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約３．０％ｖ／ｖ～約３．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、約３．５％ｖ／ｖ～約４．０％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、約４．０％ｖ／ｖ～約４．５％ｖ／ｖ、または約４．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ）のヒト血漿を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ（例えば、約１Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約１Ｕ／ｍＬ～約２Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、約２Ｕ／ｍＬ～約３Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ、約３Ｕ／ｍＬ～約４Ｕ／ｍＬ、または約４Ｕ／ｍＬ～約５Ｕ／ｍＬ）のヘパリンを含む。一部の実施例では、第４の培養培地は、約０．１％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約
２．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ～約０．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、約１．５％ｗ／ｖ～約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ～約２．５％ｗ／ｖ、または約２．５％ｗ／ｖ～約３％ｗ／ｖ）のポロキサマー－１８８（Ｐ１８８）を含む。一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施例では、第４の培養培地は、約１００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ～約６００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ～約７００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ～約８００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ～約９００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ～約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ～約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ～約１．８ｍｇ／ｍＬ、または約１．８ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ）を含む。
一部の実施例では、第４の培養培地は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１
４０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１２０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ～約１４０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ～約１６０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、約１６０ｎｇ／ｍＬ～約１８０ｎｇ／ｍＬ，１８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ～約２２０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、約２２０ｎｇ／ｍＬ～約２４０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、約２４０ｎｇ／ｍＬ～約２６０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、約２６０ｎｇ／ｍＬ～約２８０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、約２８０ｎｇ／ｍＬ～約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ～約３２０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、約３２０ｎｇ／ｍＬ～約３４０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、約３４０ｎｇ／ｍＬ～約３６０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、約３６０ｎｇ／ｍＬ～約３８０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、約３８０ｎｇ／ｍＬ～約４００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ～約４２０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４２０ｎｇ／ｍＬ～約４４０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、約４４０ｎｇ／ｍＬ～約４６０ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約４６０ｎｇ／ｍＬ～約４８０ｎｇ／ｍＬ、または約４８０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチドを含む。ＥＰＯ模倣ペプチドの非限定的な例は本明細書に記載されている。ＥＰＯ模倣ペプチドのさらなる例は当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ約１５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約３５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約４５μｇ／ｍＬ、または約４５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、ヒトインスリン）を含む。
一部の実施形態では、灌流培養は、接線濾過（例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）または交互接線濾過（ＡＴＦ））の使用を含む。一部の実施形態では、接線濾過（例えば、ＴＦＦまたはＡＴＦ）は、平均孔径が約１０ｎｍ～約６．０μＭ（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の１つまたは複数のフィルターの使用を含む。
一部の実施例では、第４の培養培地は、例えば、合成液体培養培地、動物成分を含まない液体培養培地、または動物成分を含まない合成液体培養培地、および／または無血清液体培養培地であり得る。
一部の実施形態では、第３の細胞培養物の灌流を、第１の細胞培養物が特定の標的細胞密度、例えば、１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．５×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０７個に達したところで開始する。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の灌流培養を約８日～約１５日、約８日～約１４日、約８日～約１３日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１５日、約９日～約１４日、約９日～約１３日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１５日、約１０日～約１４日、約１０日～約１３日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、約１１日～約１５日、約１１日～約１４日、約１１日～約１３日、約１１日～約１２日、約１２日～約１５日、約１２日～約１４日、約１２日～約１３日、約１３日～約１５日、約１３日～約１４日、または約１４日～約１５日にわたって実施する。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個になる。
バッチ培養または流加培養
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とうフラスコ、振とう管、培養バッグ、またはバイオリアクターのいずれかの中の本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）を約５日～約２０日（例えば、約５日～約１９日、約５日～約１８日、約５日～約１７日、約５日～約１６日、約５日～約１５日、約５日～約１４日、約５日～約１３日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約２０日、約６日～約１９日、約６日～約１８日、約６日～約１７日、約６日～約１６日、約６日～約１５日、約６日～約１４日、約６日～約１３日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約２０日、約７日～約１９日、約７日～約１８日、約７日～約１７日、約７日～約１６日、約７日～約１５日、約７日～約１４日、約７日～約１３日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約２０日，約８日～約１９日、約８日～約１８日、約８日～約１７日、約８日～約１６日、約８日～約１５日、約８日～約１４日、約８日～約１３日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約２０日，約９日～約１９日、約９日～約１８日、約９日～約１７日、約９日～約１６日、約９日～約１５日、約９日～約１４日、約９日～約１３日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約２０日，約１０日～約１９日、約１０日～約１８日、約１０日～約１７日、約１０日～約１６日、約１０日～約１５日、約１０日～約１４日、約１０日～約１３日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、約１１日～約２０日，約１１日～約１９日、約１１日～約１８日、約１１日～約１７日、約１１日～約１６日、約１１日～約１５日、約１１日～約１４日、約１１日～約１３日、約１１日～約１２日、約１２日～約２０日，約１２日～約１９日、約１２日～約１８日、約１２日～約１７日、約１２日～約１６日、約１２日～約１５日、約１２日～約１４日、約１２日～約１３日、約１３日～約２０日，約１３日～約１９日、約１３日～約１８日、約１３日～約１７日、約１３日～約１６日、約１３日～約１５日、約１３日～約１４日、約１４日～約２０日，約１４日～約１９日、約１４日～約１８日、約１４日～約１７日、約１４日～約１６日、約１４日～約１５日、約１５日～約２０日，約１５日～約１９日、約１５日～約１８日、約１５日～約１７日、約１５日～約１６日、約１６日～約２０日，約１６日～約１９日、約１６日～約１８日、約１６日～約１７日、約１７日～約２０日，約１７日～約１９日、約１７日～約１８日、約１８日～約２０日、約１８日～約１９日、または約１９日～約２０日）にわたってバッチ培養または流加培養することを含み、ステップ（ｄ）の後、第３の培養培地は脱核赤血球細胞（例えば、本明細書に記載の例示的な脱核赤血球細胞のいずれか）の集団を含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的なバイオリアクターのいずれか）中に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）をバイオリアクター中、約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＰ／Ｖ値で撹拌しながらインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、振とうフラスコ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とうフラスコのいずれか）中に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）を振とうフラスコ中、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、振とう管（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な振とう管のいずれか（例えば、円錐容器））中に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）を振とう管中、約０．１×ｇ～約５０×ｇ（例えば、または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、培養バッグ（例えば、本明細書に記載の例示的な容積のいずれかを有する本明細書に記載の例示的な培養バッグのいずれか）中に配置された第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）をバッチ培養または流加培養することを含む。そのような実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）を培養バッグ中、毎分１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクル（または本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の揺動速度でインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）をバッチ培養することを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）を流加培養することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）における流加培養は、追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）にある期間にわたって添加することを含む。一部の実施例では、追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）にある期間にわたって連続的に添加する。一部の実施例では、追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）にある期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加する。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の直後の第３の細胞培養物の体積の約０．１×～約１０×（例えば、約０．１×～約９．５×、約０．１×～約９．０×、約０．１×～約８．５×、約０．１×～約８．０×、約０．１×～約７．５×、約０．１×～約７．０×、約０．１×～約６．５×、約０．１×～約６．０×、約０．１×～約５．５×、約０．１×～約５．０×、約０．１×～約４．５×、約０．１×～約４．０×、約０．１×～約３．５×、約０．１×～約３．０×、約０．１×～約２．５×、約０．１×～約２．０×、約０．１×～約１．５×、約０．１×～約１．０×、約０．１×～約０．５×、約０．１×～約０．３×、約０．１×～約０．２×、約０．２×～約１０×、約０．２×～約９．５×、約０．２×～約９．０×、約０．２×～約８．５×、約０．２×～約８．０×、約０．２×～約７．５×、約０．２×～約７．０×、約０．２×～約６．５×、約０．２×～約６．０×、約０．２×～約５．５×、約０．２×～約５．０×、約０．２×～約４．５×、約０．２×～約４．０×、約０．２×～約３．５×、約０．２×～約３．０×、約０．２×～約２．５×、約０．２×～約２．０×、約０．２×～約１．５×、約０．２×～約１．０×、約０．２×～約０．５×、約０．２×～約０．３×、約０．３×～約１０×、約０．３×～約９．５×、約０．３×～約９．０×、約０．３×～約８．５×、約０．３×～約８．０×、約０．３×～約７．５×、約０．３×～約７．０×、約０．３×～約６．５×、約０．３×～約６．０×、約０．３×～約５．５×、約０．３×～約５．０×、約０．３×～約４．５×、約０．３×～約４．０×、約０．３×～約３．５×、約０．３×～約３．０×、約０．３×～約２．５×、約０．３×～約２．０×、約０．３×～約１．５×、約０．３×～約１．０×、約０．３×～約０．５×、約０．５×～約１０×、約０．５×～約９．５×、約０．５×～約９．０×、約０．５×～約８．５×、約０．５×～約８．０×、約０．５×～約７．５×、約０．５×～約７．０×、約０．５×～約６．５×、約０．５×～約６．０×、約０．５×～約５．５×、約０．５×～約５．０×、約０．５×～約４．５×、約０．５×～約４．０×、約０．５×～約３．５×、約０．５×～約３．０×、約０．５×～約２．５×、約０．５×～約２．０×、約０．５×～約１．５×、約０．５×～約１．０×、約１．０×～約１０×、約１．０×～約９．５×、約１．０×～約９．０×、約１．０×～約８．５×、約１．０×～約８．０×、約１．０×～約７．５×、約１．０×～約７．０×、約１．０×～約６．５×、約１．０×～約６．０×、約１．０×～約５．５×、約１．０×～約５．０×、約１．０×～約４．５×、約１．０×～約４．０×、約１．０×～約３．５×、約１．０×～約３．０×、約１．０×～約２．５×、約１．０×～約２．０×、約１．０×～約１．５×、約１．５×～約１０×、約１．５×～約９．５×、約１．５×～約９．０×、約１．５×～約８．５×、約１．５×～約８．０×、約１．５×～約７．５×、約１．５×～約７．０×、約１．５×～約６．５×、約１．５×～約６．０×、約１．５×～約５．５×、約１．５×～約５．０×、約１．５×～約４．５×、約１．５×～約４．０×、約１．５×～約３．５×、約１．５×～約３．０×、約１．５×～約２．５×、約１．５×～約２．０×、約２．０×～約１０×、約２．０×～約９．５×、約２．０×～約９．０×、約２．０×～約８．５×、約２．０×～約８．０×、約２．０×～約７．５×、約２．０×～約７．０×、約２．０×～約６．５×、約２．０×～約６．０×、約２．０×～約５．５×、約２．０×～約５．０×、約２．０×～約４．５×、約２．０×～約４．０×、約２．０×～約３．５×、約２．０×～約３．０×、約２．０×～約２．５×、約２．５×～約１０×、約２．５×～約９．５×、約２．５×～約９．０×、約２．５×～約８．５×、約２．５×～約８．０×、約２．５×～約７．５×、約２．５×～約７．０×、約２．５×～約６．５×、約２．５×～約６．０×、約２．５×～約５．５×、約２．５×～約５．０×、約２．５×～約４．５×、約２．５×～約４．０×、約２．５×～約３．５×、約２．５×～約３．０×、約３．０×～約１０×、約３．０×～約９．５×、約３．０×～約９．０×、約３．０×～約８．５×、約３．０×～約８．０×、約３．０×～約７．５×、約３．０×～約７．０×、約３．０×～約６．５×、約３．０×～約６．０×、約３．０×～約５．５×、約３．０×～約５．０×、約３．０×～約４．５×、約３．０×～約４．０×、約３．０×～約３．５×、約３．５×～約１０×、約３．５×～約９．５×、約３．５×～約９．０×、約３．５×～約８．５×、約３．５×～約８．０×、約３．５×～約７．５×、約３．５×～約７．０×、約３．５×～約６．５×、約３．５×～約６．０×、約３．５×～約５．５×、約３．５×～約５．０×、約３．５×～約４．５×、約３．５×～約４．０×、約４．０×～約１０×、約４．０×～約９．５×、約４．０×～約９．０×、約４．０×～約８．５×、約４．０×～約８．０×、約４．０×～約７．５×、約４．０×～約７．０×、約４．０×～約６．５×、約４．０×～約６．０×、約４．０×～約５．５×、約４．０×～約５．０×、約４．０×～約４．５×、約４．５×～約１０×、約４．５×～約９．５×、約４．５×～約９．０×、約４．５×～約８．５×、約４．５×～約８．０×、約４．５×～約７．５×、約４．５×～約７．０×、約４．５×～約６．５×、約４．５×～約６．０×、約４．５×～約５．５×、約４．５×～約５．０×、約５．０×～約１０×、約５．０×～約９．５×、約５．０×～約９．０×、約５．０×～約８．５×、約５．０×～約８．０×、約５．０×～約７．５×、約５．０×～約７．０×、約５．０×～約６．５×、約５．０×～約６．０×、約５．０×～約５．５×、約５．５×～約１０×、約５．５×～約９．５×、約５．５×～約９．０×、約５．５×～約８．５×、約５．５×～約８．０×、約５．５×～約７．５×、約５．５×～約７．０×、約５．５×～約６．５×、約５．５×～約６．０×、約６．０×～約１０×、約６．０×～約９．５×、約６．０×～約９．０×、約６．０×～約８．５×、約６．０×～約８．０×、約６．０×～約７．５×、約６．０×～約７．０×、約６．０×～約６．５×、約６．５×～約１０×、約６．５×～約９．５×、約６．５×～約９．０×、約６．５×～約８．５×、約６．５×～約８．０×、約６．５×～約７．５×、約６．５×～約７．０×、約７．０×～約１０×、約７．０×～約９．５×、約７．０×～約９．０×、約７．０×～約８．５×、約７．０×～約８．０×、約７．０×～約７．５×、約７．５×～約１０×、約７．５×～約９．５×、約７．５×～約９．０×、約７．５×～約８．５×、約７．５×～約８．０×、約８．０×～約１０×、約８．０×～約９．５×、約８．０×～約９．０×、約８．０×～約８．５×、約８．５×～約１０×、約８．５×～約９．５×、約８．５×～約９．０×、約９．０×～約１０×、約９．０×～約９．５×、または約９．５×～約１０×）を２４時間経つごとに添加する。一部の実施形態では、追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）および／または第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）の第３の細胞培養物への添加を、第３の細胞培養物が特定の標的細胞密度、例えば、１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約２．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約３．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約４．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約５．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約６．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約７．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約８．５×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．０×１０６個、１ｍＬ当たり細胞約９．５×１０６個、または１ｍＬ当たり細胞約１．０×１０７個に達したところで開始する。
一部の実施例では、第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）は、トランスフェリン（例えば、約１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのトランスフェリン（例えば、ヒトアポトランスフェリン、ヒトホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ））、インスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのインスリン（例えば、組換えヒトインスリン））、ＳＣＦ（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＳＣＦ（例えば、組換えヒトＳＣＦ））、およびＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的なＥＰＯ模倣ペプチドのいずれか））のうちの１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、または４つ）を含む。本明細書に記載の第３の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。本明細書に記載の第３の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第３の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＬ－グルタミン（例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン）を含む。
一部の実施例では、ステップ（ｄ）における流加培養は、（ｉ）追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第１の期間にわたって添加すること；および（ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第２の期間にわたって添加することを含む。
一部の実施例では、（ｉ）における追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第２の期間にわたって連続的に添加する。
一部の実施例では、（ｉ）における追加的な体積の第３の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第１の期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加し、かつ／または（ｉｉ）（ｉｉ）における追加的な体積の第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）を第３の細胞培養物（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の細胞培養物のいずれか）に第２の期間にわたって定期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１１回、または１日１２回）添加する。
培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第３の培養培地のいずれかおよび／または本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）の添加は、機械的に、例えば蠕動ポンプを使用することによって、または手動で（例えば滅菌ピペット操作によって）実施することができる。
一部の実施例では、（ｉ）における第１の期間は、約１日～約１２日、約１日～約１１日、約１日～約１０日、約１日～約９日、約１日～約８日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約１２日、約２日～約１１日、約２日～約１０日、約２日～約９日、約２日～約８日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約１２日、約３日～約１１日、約３日～約１０日、約３日～約９日、約３日～約８日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約１２日、約４日～約１１日、約４日～約１０日、約４日～約９日、約４日～約８日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、または約１１日～約１２日である。
一部の実施例では、（ｉｉ）における第２の期間は、約１日～約１２日、約１日～約１１日、約１日～約１０日、約１日～約９日、約１日～約８日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約１２日、約２日～約１１日、約２日～約１０日、約２日～約９日、約２日～約８日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約１２日、約３日～約１１日、約３日～約１０日、約３日～約９日、約３日～約８日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約１２日、約４日～約１１日、約４日～約１０日、約４日～約９日、約４日～約８日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約１２日、約５日～約１１日、約５日～約１０日、約５日～約９日、約５日～約８日、約５日～約７日、約５日～約６日、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、または約１１日～約１２日である。
これらの方法の一部の実施例では、第４の培養培地（例えば、本明細書に記載の例示的な第４の培養培地のいずれか）は、以下のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、または３つ）を含む：トランスフェリン（例えば、約１００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのトランスフェリン（例えば、アポトランスフェリン、ホロトランスフェリン、またはこれらの組合せ））、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド（例えば、本明細書に記載の例示的なＥＰＯ模倣ペプチドのいずれか）（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのＥＰＯ（例えば、組換えヒトＥＰＯ）またはＥＰＯ模倣ペプチド）、およびインスリン（例えば、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬまたは本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれかのインスリン）。本明細書に記載の第４の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約０．１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）の血清（例えば、ヒトＡＢ血清）を含む。本明細書に記載の第４の培養培地のいずれかの一部の実施形態では、第４の培養培地は、約１ｍＭ～約８ｍＭ（例えば、本明細書に記載のこの範囲の部分範囲のいずれか）のＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）のバッチ培養または流加培養を、約８日～約１５日、約８日～約１４日、約８日～約１３日、約８日～約１２日、約８日～約１１日、約８日～約１０日、約８日～約９日、約９日～約１５日、約９日～約１４日、約９日～約１３日、約９日～約１２日、約９日～約１１日、約９日～約１０日、約１０日～約１５日、約１０日～約１４日、約１０日～約１３日、約１０日～約１２日、約１０日～約１１日、約１１日～約１５日、約１１日～約１４日、約１１日～約１３日、約１１日～約１２日、約１２日～約１５日、約１２日～約１４日、約１２日～約１３日、約１３日～約１５日、約１３日～約１４日、または約１４日～約１５日にわたって実施する。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個（または部分範囲である１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約４×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約６×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約８×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０８個のいずれか）になる。
脱核赤血球細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載の脱核赤血球細胞（例えば、ヒト脱核赤血球細胞）は、１つまたは複数のマイナー血液型抗原について陰性である（すなわち、それを含まない）、例えば、Ｌｅ（ａ－ｂ－）（Ｌｅｗｉｓ抗原系）、Ｆｙ（ａ－ｂ－）（Ｄｕｆｆｙ系）、Ｊｋ（ａ－ｂ－）（Ｋｉｄｄ系）、Ｍ－Ｎ－（ＭＮＳ系）、Ｋ－ｋ－（Ｋｅｌｌ系）、Ｌｕ（ａ－ｂ－）（Ｌｕｔｈｅｒａｎ系）、およびＨ抗原陰性（Ｂｏｍｂａｙ表現型）、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、脱核赤血球細胞はまた、Ｏ型および／またはＲｈ－である。マイナー血液型は、例えば、Agarwal et al.、"Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary care hospital in north India," Blood Res. 48 (1): 51-54、2013、およびMitra et al.、"Blood groups systems," Indian J. Anaesth. 58 (5): 524-528、2014に記載されており、これらの記載は参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の脱核赤血球細胞（例えば、ヒト脱核赤血球細胞）は、外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の外因性タンパク質のいずれか）を含まない単離された無培養脱核赤血球細胞と実質的に同じ浸透膜脆弱性を示す。一部の実施形態では、脱核赤血球細胞の集団の浸透圧脆弱性は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌで５０％未満の細胞溶解である。浸透圧脆弱性は、一部の実施形態では、ＷＯ２０１５／０７３５８７（この記載は、参照により本明細書に組み込まれる）の実施例５９に記載の方法を使用して決定される。
一部の実施形態では、脱核赤血球細胞（例えば、ヒト脱核赤血球細胞）の直径または体積は、野生型、無処理の脱核赤血球細胞とほぼ同じである。一部の実施形態では、脱核赤血球細胞の集団（例えば、ヒト脱核赤血球細胞）の平均直径は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ミクロン、または約４．０～約１２．０ミクロン、約４．０～約１１．５ミクロン、約４．０～約１１．０ミクロン、約４．０～約１０．５ミクロン、約４．０～約１０ミクロン、約４．０～約９．５ミクロン、約４．０～約９．０ミクロン、約４．０～約８．５ミクロン、約４．０～約８．０ミクロン、約４．０～約７．５ミクロン、約４．０～約７．０ミクロン、約４．０～約６．５ミクロン、約４．０～約６．０ミクロン、約４．０～約５．５ミクロン、約４．０～約５．０ミクロン、約４．０～約４．５ミクロン、約４．５～約１２．０ミクロン、約４．５～約１１．５ミクロン、約４．５～約１１．０ミクロン、約４．５～約１０．５ミクロン、約４．５～約１０．０ミクロン、約４．５～約９．５ミクロン、約４．５～約９．０ミクロン、約４．５～約８．５ミクロン、約４．５～約８．０ミクロン、約４．５～約７．５ミクロン、約４．５～約７．０ミクロン、約４．５～約６．５ミクロン、約４．５～約６．０ミクロン、約４．５～約５．５ミクロン、約４．５～約５．０ミクロン、約５．０～約１２．０ミクロン、約５．０～約１１．５ミクロン、約５．０～約１１．０ミクロン、約５．０～約１０．５ミクロン、約５．０～約１０．０ミクロン、約５．０～約９．５ミクロン、約５．０～約９．０ミクロン、約５．０～約８．５ミクロン、約５．０～約８．０ミクロン、約５．０～約７．５ミクロン、約５．０～約７．０ミクロン、約５．０～約６．５ミクロン、約５．０～約６．０ミクロン、約５．０～約５．５ミクロン、約５．５～約１２．０ミクロン、約５．５～約１１．５ミクロン、約５．５～約１１．０ミクロン、約５．５～約１０．５ミクロン、約５．５～約１０．０ミクロン、約５．５～約９．５ミクロン、約５．５～約９．０ミクロン、約５．５～約８．５ミクロン、約５．５～約８．０ミクロン、約５．５～約７．５ミクロン、約５．５～約７．０ミクロン、約５．５～約６．５ミクロン、約５．５～約６．０ミクロン、約６．０～約１２．０ミクロン、約６．０～約１１．５ミクロン、約６．０～約１１．０ミクロン、約６．０～約１０．５ミクロン、約６．０～約１０．０ミクロン、約６．０～約９．５ミクロン、約６．０～約９．０ミクロン、約６．０～約８．５ミクロン、約６．０～約８．０ミクロン、約６．０～約７．５ミクロン、約６．０～約７．０ミクロン、約６．０～約６．５ミクロン、約６．５～約１２．０ミクロン、約６．５～約１１．５ミクロン、約６．５～約１１．０ミクロン、約６．５～約１０．５ミクロン、約６．５～約１０．０ミクロン、約６．５～約９．５ミクロン、約６．５～約９．０ミクロン、約６．５～約８．５ミクロン、約６．５～約８．０ミクロン、約６．５～約７．５ミクロン、約６．５～約７．０ミクロン、約７．０～約１２．０ミクロン、約７．０～約１１．５ミクロン、約７．０～約１１．０ミクロン、約７．０～約１０．５ミクロン、約７．０～約１０．０ミクロン、約７．０～約９．５ミクロン、約７．０～約９．０ミクロン、約７．０～約８．５ミクロン、約７．０～約８．０ミクロン、約７．０～約７．５ミクロン、約７．５～約１２．０ミクロン、約７．５～約１１．５ミクロン、約７．５～約１１．０ミクロン、約７．５～約１０．５ミクロン、約７．５～約１０．０ミクロン、約７．５～約９．５ミクロン、約７．５～約９．０ミクロン、約７．５～約８．５ミクロン、約７．５～約８．０ミクロン、約８．０～約１２．０ミクロン、約８．０～約１１．５ミクロン、約８．０～約１１．０ミクロン、約８．０～約１０．５ミクロン、約８．０～約１０．０ミクロン、約８．０～約９．５ミクロン、約８．０～約９．０ミクロン、約８．０～約８．５ミクロン、約８．５～約１２．０ミクロン、約８．５～約１１．５ミクロン、約８．５～約１１．０ミクロン、約８．５～約１０．５ミクロン、約８．５～約１０．０ミクロン、約８．５～約９．５ミクロン、約８．５～約９．０ミクロン、約９．０～約１２．０ミクロン、約９．０～約１１．５ミクロン、約９．０～約１１．０ミクロン、約９．０～約１０．５ミクロン、約９．０～約１０．０ミクロン、約９．０～約９．５ミクロン、約９．５～約１２．０ミクロン、約９．５～約１１．５ミクロン、約９．５～約１１．０ミクロン、約９．５～約１０．５ミクロン、約９．５～約１０．０ミクロン、約１０．０～約１２．０ミクロン、約１０．０～約１１．５ミクロン、約１０．０～約１１．０ミクロン、約１０．０～約１０．５ミクロン、約１０．５～約１２．０ミクロン、約１０．５～約１１．５ミクロン、約１０．５～約１１．０ミクロン、約１１．０～約１２．０ミクロン、約１１．０～約１１．５ミクロン、または約１１．５～約１２．０ミクロンであり、必要に応じて、集団の標準偏差は、１ミクロン未満、２ミクロン未満、または３ミクロン未満である。脱核赤血球細胞の直径は、例えば、Ａｄｖｉａ １２０ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、またはＭｏｘｉ Ｚ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｏｒｆｌｏ）を使用して測定することができる。
一部の実施形態では、脱核赤血球細胞の平均血球体積の体積は、約１０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１００ｆＬ、約１０ｆＬ～約９５ｆＬ、約１０ｆＬ～約９０ｆＬ、約１０ｆＬ～約８５ｆＬ、約１０ｆＬ～約８０ｆＬ、約１０ｆＬ～約７５ｆＬ、約１０ｆＬ～約７０ｆＬ、約１０ｆＬ～約６５ｆＬ、約１０ｆＬ～約６０ｆＬ、約１０ｆＬ～約５５ｆＬ、約１０ｆＬ～約５０ｆＬ、約１０ｆＬ～約４５ｆＬ、約１０ｆＬ～約４０ｆＬ、約１０ｆＬ～約３５ｆＬ、約１０ｆＬ～約３０ｆＬ、約１０ｆＬ～約２５ｆＬ、約１０ｆＬ～約２０ｆＬ、約１０ｆＬ～約１５ｆＬ、約１５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約１５ｆＬ～約１００ｆＬ、約１５ｆＬ～約９５ｆＬ、約１５ｆＬ～約９０ｆＬ、約１５ｆＬ～約８５ｆＬ、約１５ｆＬ～約８０ｆＬ、約１５ｆＬ～約７５ｆＬ、約１５ｆＬ～約７０ｆＬ、約１５ｆＬ～約６５ｆＬ、約１５ｆＬ～約６０ｆＬ、約１５ｆＬ～約５５ｆＬ、約１５ｆＬ～約５０ｆＬ、約１５ｆＬ～約４５ｆＬ、約１５ｆＬ～約４０ｆＬ、約１５ｆＬ～約３５ｆＬ、約１５ｆＬ～約３０ｆＬ、約１５ｆＬ～約２５ｆＬ、約１５ｆＬ～約２０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約２０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約２０ｆＬ～約１００ｆＬ、約２０ｆＬ～約９５ｆＬ、約２０ｆＬ～約９０ｆＬ、約２０ｆＬ～約８５ｆＬ、約２０ｆＬ～約８０ｆＬ、約２０ｆＬ～約７５ｆＬ、約２０ｆＬ～約７０ｆＬ、約２０ｆＬ～約６５ｆＬ、約２０ｆＬ～約６０ｆＬ、約２０ｆＬ～約５５ｆＬ、約２０ｆＬ～約５０ｆＬ、約２０ｆＬ～約４５ｆＬ、約２０ｆＬ～約４０ｆＬ、約２０ｆＬ～約３５ｆＬ、約２０ｆＬ～約３０ｆＬ、約２０ｆＬ～約２５ｆＬ、約２５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約２５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約２５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約２５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約２５ｆＬ～約１００ｆＬ、約２５ｆＬ～約９５ｆＬ、約２５ｆＬ～約９０ｆＬ、約２５ｆＬ～約８５ｆＬ、約２５ｆＬ～約８０ｆＬ、約２５ｆＬ～約７５ｆＬ、約２５ｆＬ～約７０ｆＬ、約２５ｆＬ～約６５ｆＬ、約２５ｆＬ～約６０ｆＬ、約２５ｆＬ～約５５ｆＬ、約２５ｆＬ～約５０ｆＬ、約２５ｆＬ～約４５ｆＬ、約２５ｆＬ～約４０ｆＬ、約２５ｆＬ～約３５ｆＬ、約２５ｆＬ～約３０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約３０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約３０ｆＬ～約１００ｆＬ、約３０ｆＬ～約９５ｆＬ、約３０ｆＬ～約９０ｆＬ、約３０ｆＬ～約８５ｆＬ、約３０ｆＬ～約８０ｆＬ、約３０ｆＬ～約７５ｆＬ、約３０ｆＬ～約７０ｆＬ、約３０ｆＬ～約６５ｆＬ、約３０ｆＬ～約６０ｆＬ、約３０ｆＬ～約５５ｆＬ、約３０ｆＬ～約５０ｆＬ、約３０ｆＬ～約４５ｆＬ、約３０ｆＬ～約４０ｆＬ、約３０ｆＬ～約３５ｆＬ、約３５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約３５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約３５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約３５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約３５ｆＬ～約１００ｆＬ、約３５ｆＬ～約９５ｆＬ、約３５ｆＬ～約９０ｆＬ、約３５ｆＬ～約８５ｆＬ、約３５ｆＬ～約８０ｆＬ、約３５ｆＬ～約７５ｆＬ、約３５ｆＬ～約７０ｆＬ、約３５ｆＬ～約６５ｆＬ、約３５ｆＬ～約６０ｆＬ、約３５ｆＬ～約５５ｆＬ、約３５ｆＬ～約５０ｆＬ、約３５ｆＬ～約４５ｆＬ、約３５ｆＬ～約４０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約４０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約４０ｆＬ～約１００ｆＬ、約４０ｆＬ～約９５ｆＬ、約４０ｆＬ～約９０ｆＬ、約４０ｆＬ～約８５ｆＬ、約４０ｆＬ～約８０ｆＬ、約４０ｆＬ～約７５ｆＬ、約４０ｆＬ～約７０ｆＬ、約４０ｆＬ～約６５ｆＬ、約４０ｆＬ～約６０ｆＬ、約４０ｆＬ～約５５ｆＬ、約４０ｆＬ～約５０ｆＬ、約４０ｆＬ～約４５ｆＬ、約４５ｆＬ～約１７５ｆＬ、約４５ｆＬ～約１６０ｆＬ、約４５ｆＬ～約１４０ｆＬ、約４５ｆＬ～約１２０ｆＬ、約４５ｆＬ～約１００ｆＬ、約４５ｆＬ～約９５ｆＬ、約４５ｆＬ～約９０ｆＬ、約４５ｆＬ～約８５ｆＬ、約４５ｆＬ～約８０ｆＬ、約４５ｆＬ～約７５ｆＬ、約４５ｆＬ～約７０ｆＬ、約４５ｆＬ～約６５ｆＬ、約４５ｆＬ～約６０ｆＬ、約４５ｆＬ～約５５ｆＬ、約４５ｆＬ～約５０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約５０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約５０ｆＬ～約１００ｆＬ、約５０ｆＬ～約９５ｆＬ、約５０ｆＬ～約９０ｆＬ、約５０ｆＬ～約８５ｆＬ、約５０ｆＬ～約８０ｆＬ、約５０ｆＬ～約７５ｆＬ、約５０ｆＬ～約７０ｆＬ、約５０ｆＬ～約６５ｆＬ、約５０ｆＬ～約６０ｆＬ、約５０ｆＬ～約５５ｆＬ、約６０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約６０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約６０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約６０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約６０ｆＬ～約１００ｆＬ、約６０ｆＬ～約９５ｆＬ、約６０ｆＬ～約９０ｆＬ、約６０ｆＬ～約８５ｆＬ、約６０ｆＬ～約８０ｆＬ、約６０ｆＬ～約７５ｆＬ、約６０ｆＬ～約７０ｆＬ、約６０ｆＬ～約６５ｆＬ、約７０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約７０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約７０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約７０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約７０ｆＬ～約１００ｆＬ、約７０ｆＬ～約９５ｆＬ、約７０ｆＬ～約９０ｆＬ、約７０ｆＬ～約８５ｆＬ、約７０ｆＬ～約８０ｆＬ、約７０ｆＬ～約７５ｆＬ、約８０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約８０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約８０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約８０ｆＬ～約１２０ｆＬ、約８０ｆＬ～約１００ｆＬ、約８０ｆＬ～約９５ｆＬ、約８０ｆＬ～約９０ｆＬ、約８０ｆＬ～約８５ｆＬ、約１００ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１００ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１００ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１００ｆＬ～約１２０ｆＬ、約１２０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１２０ｆＬ～約１６０ｆＬ、約１２０ｆＬ～約１４０ｆＬ、約１４０ｆＬ～約１７５ｆＬ、約１４０ｆＬ～約１６０ｆＬ、または約１６０ｆＬ～約１７５ｆＬであり、必要に応じて、集団の標準偏差は、５０ｆＬ未満、４０ｆＬ未満、３０ｆＬ未満、２０ｆＬ未満、１０ｆＬ未満、５ｆＬ未満、または２ｆＬ未満である。平均血球体積は、例えば、血液学的分析機器、例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｍｏｘｉ Ｚ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｏｒｆｌｏ）、またはＳｙｓｍｅｘ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定することができる。
一部の実施形態では、脱核赤血球細胞は、ヒト（例えば、ヒトドナー赤血球前駆細胞に由来する）脱核赤血球細胞である。
一部の実施形態では、脱核赤血球細胞は、操作されたヒト脱核赤血球細胞である。一部の実施例では、操作された脱核赤血球細胞は、単一の外因性タンパク質（例えば、細胞質基質内に存在するまたは操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質）（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な外因性タンパク質のいずれか）を含む。
他の例では、操作された脱核赤血球細胞は、２つまたはそれよりも多くの外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載の例示的な外因性タンパク質のいずれか）を含む。一部の実施例では、２つまたはそれよりも多くの外因性タンパク質のうちの少なくとも１つは、操作された脱核赤血球細胞の細胞質基質内に存在し得る（例えば、酵素、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）。一部の実施例では、２つまたはそれよりも多くの外因性タンパク質のうちの少なくとも１つは、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在し得る（例えば、Ｆｃ結合性分子、サイトカイン受容体、Ｔ細胞活性化リガンド、Ｔ細胞受容体、免疫阻害分子、ＭＨＣ分子、ＡＰＣ結合性分子、自己抗原、アレルゲン、毒素、標的化作用物質、受容体リガンド（例えば、受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニスト）、または抗体または抗体断片）。
本明細書に記載の操作された赤血球細胞のいずれかが含み得る１つまたは複数の外因性タンパク質の非限定的な例を、以下の表Ａ～Ｄに、外因性タンパク質を含む操作された赤血球細胞を使用して処置することができる対応する疾患または状態に加えて列挙する。本明細書に記載の赤血球細胞のいずれかに含まれ得る外因性タンパク質のさらなる例は当技術分野で公知である。
Figure 2022533252000002
Figure 2022533252000003
Figure 2022533252000004
Figure 2022533252000005
一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は、クリックケミストリー反応の生成物であり得る（例えば、外因性タンパク質を、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して細胞の膜に存在するタンパク質（例えば、第２の外因性タンパク質または内因性タンパク質）とコンジュゲートすることができる）。一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は、本明細書に記載の方法のいずれかを使用したソルターゼ酵素を使用したコンジュゲーション反応の生成物であり得る（例えば、外因性タンパク質を細胞の膜に存在するタンパク質（例えば、第２の外因性タンパク質または内因性タンパク質）にコンジュゲートすることができる）。ソルターゼ酵素を使用したコンジュゲーション反応の非限定的な例は、どちらも参照により組み込まれる米国特許第１０，２６０，０３８号および米国特許出願公開第２０１６／００８２０４６Ａ１号に見いだすことができる。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態は、１つまたは複数の外因性タンパク質を細胞（例えば、本明細書に記載の細胞のいずれか、例えば、本明細書に記載の脱核赤血球細胞、操作された脱核赤血球細胞、または赤血球系前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌ）のいずれか）にクリックコンジュゲートすること（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して）をさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態は、細胞（例えば、本明細書に記載の細胞のいずれか、例えば、本明細書に記載の脱核赤血球細胞、操作された脱核赤血球細胞、または赤血球系前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌ）のいずれか）に低浸透圧でロードすることをさらに含む（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して）。本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態は、細胞（例えば、本明細書に記載の細胞のいずれか、例えば、本明細書に記載の脱核赤血球細胞、操作された脱核赤血球細胞、または赤血球系前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌ）のいずれか）に物理的操作（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して）によってロードすることをさらに含む。
一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は、脂質係留タンパク質、例えばＧＰＩアンカー、Ｎ－ミリストイル化タンパク質、またはＳ－パルミトイル化タンパク質であり得る。一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は、膜貫通タンパク質（例えば、１回膜貫通タンパク質もしくは複数回膜貫通タンパク質）または表在性膜タンパク質であり得る。一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は、膜貫通ドメインを含む融合タンパク質であり得る（例えば、低分子内在性膜タンパク質１（ＳＭＩＭ１）またはグリコホリンＡ（ＧＰＡ）の膜貫通ドメインを含む融合タンパク質）。一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は細胞外空間へのいかなるアミノ酸突出も有さない。一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は、操作された脱核赤血球細胞の細胞質基質へのいかなるアミノ酸突出も有さない。一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の膜に存在する外因性タンパク質は、細胞外空間へのアミノ酸突出および操作された脱核赤血球細胞の細胞質基質へのアミノ酸突出を有する。
本明細書に記載の方法は、ステップ（ａ）の前またはステップ（ａ）の間に（例えば、ステップ（ａ）の間の任意の時点の１日～３日にわたって、例えば、ステップ（ａ）開始時の１日～３日にわたって）１つまたは複数の組換えタンパク質をコードする核酸を赤血球前駆細胞（例えば、本明細書に記載の例示的な赤血球前駆細胞のいずれか）に導入することをさらに含み得る。１つまたは複数の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の外因性タンパク質のいずれか）をコードする１つまたは複数の核酸（例えば、ＤＮＡ発現ベクターまたはｍＲＮＡ）を赤血球前駆細胞（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の赤血球前駆細胞のいずれか）に導入することにより、操作された脱核赤血球細胞を作製することができる。ＤＮＡ発現ベクターを赤血球前駆細胞に導入するための典型的な方法としては、これだけに限定されないが、リポソーム媒介性移入、形質転換、遺伝子銃、トランスフェクション、および形質導入、例えば、ウイルス媒介性遺伝子移入（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびレトロウイルスに基づくベクターを含めたウイルスベクターを使用して実施する）が挙げられる。ＤＮＡ発現ベクターを赤血球前駆細胞に導入するための追加的な典型的な方法は、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、および細胞微量注射の使用を含む。
赤血球前駆細胞を、必要に応じて、１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の導入前に、操作された脱核赤血球細胞への分化に適した条件下で培養することができる。一部の実施形態では、得られた操作された脱核赤血球細胞は、成熟赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）に関連するタンパク質、例えば、ヘモグロビン（例えば、成体ヘモグロビンおよび／または胎児ヘモグロビン）、グリコホリンＡ、ならびに標準の方法（例えば、ウエスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ分析）によって検証および数量化することができる外因性タンパク質を含む。
一部の実施例では、脱核赤血球細胞または赤血球前駆細胞に外因性タンパク質をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトして、操作された脱核赤血球細胞を生成することができる。メッセンジャーＲＮＡは、外因性タンパク質をコードする配列を含有するｃＤＮＡプラスミド構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって引き出すことができる。例えば、外因性タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、特定のＲＮＡポリメラーゼに適合するプロモーター配列を含有するクローニングベクターに挿入することができる。例えば、クローニングベクターＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）は、それぞれＴ３ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに適合するＴ３プロモーター配列およびＴ７プロモーター配列を含有する。センスｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、プラスミドを、外因性タンパク質をコードする配列の末端に対応する終止コドンの下流の制限部位で直線化する。例えば、ＲＮＡＭａｘｘ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）などの市販のキットを使用してｍＲＮＡを直鎖ＤＮＡ鋳型から転写する。一部の場合では、５’－ｍ７ＧｐｐｐＧでキャッピングされたｍＲＮＡを生成することが望ましい可能性がある。そのように、直線化されたｃＤＮＡ鋳型の転写は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）のｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｃａｐｐｅｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して行うことができる。転写は、２０～１００μｌの反応体積、３７℃で３０分～４時間にわたって行うことができる。転写されたｍＲＮＡを、反応ミックスから、直線化されたＤＮＡ鋳型を除去するためのＤＮａｓｅ Ｉを用いて簡単に処理し、その後、塩化リチウム、酢酸ナトリウム、または酢酸アンモニウムの存在下で７０％エタノール中に沈殿させることによって精製する。転写されたｍＲＮＡの完全性は、アガロース－ホルムアルデヒドゲルまたは市販のＮｏｖｅｘ ｐｒｅ－ｃａｓｔ ＴＢＥゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を用いた電気泳動を使用して評価することができる。
外因性タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを脱核赤血球細胞または赤血球前駆細胞に、例えば、リポフェクションおよび電気穿孔（van Tandeloo et al.、Blood 98: 49-56、2001）を含めた種々の手法を使用して導入することができる。リポフェクションに関しては、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）中のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ５μｇをカチオン性脂質ＤＭＲＩＥ－Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：４の比で５～１５分間インキュベートする。
あるいは、例えば、ＤＯＴＡＰ、様々な形態のポリエチレンイミン、およびポリＬ－リシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）、およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ；例えば、Bettinger et al.、Nucleic Acids Res. 29: 3882-3891、2001）を含めた種々の他のカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーを使用して、赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトすることができる。得られたｍＲＮＡ／脂質複合体を細胞（１ｍＬ当たり細胞１～２×１０６個）と一緒に３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、培養物に戻す。電気穿孔に関しては、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）５００μＬ中約５～２０×１０６個の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ約２０μｇと混合し、０．４ｃｍのキュベット中、例えば、Ｅａｓｙｊｅｃｔ Ｐｌｕｓ ｄｅｖｉｃｅ（ＥｑｕｉＢｉｏ、Ｋｅｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して電気穿孔する。一部の場合では、種々の電圧、静電容量、および電気穿孔体積を試験して、特定のｍＲＮＡの赤血球前駆細胞へのトランスフェクションに有用な条件を決定することが必要であり得る。一般に、細胞にｍＲＮＡを効率的にトランスフェクトするのに必要な電気穿孔パラメータは、ＤＮＡの電気穿孔に必要なものよりも細胞に対する有害度が低いと思われる（van Tandeloo et al.、Blood 98: 49-56、2001）。
あるいは、ペプチド媒介性ＲＮＡ送達戦略を使用してｍＲＮＡを赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞にトランスフェクトすることができる（例えば、Bettinger et al.、Nucleic Acids Res. 29: 3882-3891、2001を参照されたい）。例えば、カチオン性脂質ポリエチレンイミン２ｋＤＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）をメリチンペプチド（Ａｌｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）と組み合わせて、特に有糸分裂後の初代細胞におけるｍＲＮＡトランスフェクションの効率を上昇させることができる。メリチンペプチドをＰＥＩと、例えば、ヘテロ二官能性架橋剤３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルなどのジスルフィド架橋剤を使用してコンジュゲートすることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡをメリチン－ＰＥＩと共に５～１５分間プレインキュベートして、ＲＮＡ／ペプチド／脂質複合体を形成する。次いで、この複合体を無血清培養培地中の細胞に５％ＣＯ２加湿環境中、３７℃で２～４時間にわたって添加し、次いで、除去し、トランスフェクトされた細胞をさらに培養する。
一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載の任意の外因性タンパク質または外因性タンパク質の任意の組合せ）をコードする核酸（例えば、本明細書に記載の例示的な核酸のいずれか）を赤血球前駆細胞に導入することにより、操作された脱核赤血球細胞を生成する。一部の実施形態では、外因性タンパク質はＤＮＡにコードされており、それを赤血球前駆細胞に導入する。一部の実施形態では、外因性タンパク質はＲＮＡにコードされており、それを赤血球前駆細胞に導入する。
１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする核酸の赤血球前駆細胞への導入は、例えば一過性のまたは安定なトランスフェクションおよび遺伝子治療手法を含めた種々のＤＮＡ技法を使用して、脱核赤血球細胞への最終分化の前に行うことができる。
ウイルス遺伝子移入を使用して、細胞に１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすることができる。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）などのレンチウイルス、および泡沫状ウイルスなどのスプーマウイルスを含めたいくつかのウイルスを遺伝子移入ビヒクルとして使用することができる（例えば、Osten et al.、HEP 178: 177-202、2007を参照されたい）。レトロウイルスは、例えば、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞に効率的に形質導入され、染色体に組み込まれ、それにより、安定な遺伝子移入が付与される。
１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする核酸を赤血球前駆細胞にトランスフェクトすることができる。適切なベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクターである（Malik et al.、Blood 91: 2664-2671、1998）。腫瘍形成レトロウイルスであるＭＭＬＶに基づくベクターが遺伝子治療臨床試験において現在使用されている（Hassle et al.、News Physiol. Sci. 17: 87-92、2002）。例えば、外因性タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ構築物を、標準の分子生物学技法を使用して、ＭＭＬＶベクター骨格で生成することができる。構築物を、例えばＰＡ３１７細胞などのパッケージング細胞株にトランスフェクトし、ウイルス上清を使用して、例えばＰＧ１３細胞などの産生細胞をトランスフェクトする。ＰＧ１３ウイルス上清を赤血球前駆細胞と一緒にインキュベートする。外因性タンパク質の発現を、例えば外因性タンパク質が操作されたヒト脱核赤血球細胞の膜に存在する場合には当該外因性タンパク質を対象とする蛍光標識抗体を用いたＦＡＣＳ分析（蛍光活性化細胞選別）を使用してモニタリングすることができる。外因性タンパク質が操作されたヒト脱核赤血球細胞の細胞質基質中に存在する場合にも同様の方法を使用することができる。
必要に応じて、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光追跡用分子をコードする核酸を、ウイルスに基づく手法を使用して赤血球前駆細胞にトランスフェクトすることができる（Tao et al.、Stem Cells 25: 670-678、2007）。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ）をコードするＤＮＡを含有するエコトピックレトロウイルスベクターを、例えばＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞株（Ｏｒｂｉｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．により分配される）などのパッケージング細胞を使用してパッケージングする。パッケージング細胞株は、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含めた、適当なウイルスパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定に発現する。ウイルス粒子が排出されたＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞からの上清を使用して赤血球前駆細胞に形質導入する。一部の場合では、レトロウイルス媒介性遺伝子移入の効率を改善するために、形質導入を、例えば、組換えフィブロネクチンの断片などの、特別にコーティングされた表面上で実施することができる（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。細胞をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングされたプレート中、レトロウイルスＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ上清プラス適切な補因子と一緒にインキュベートする。翌日、形質導入を繰り返すことができる。この場合、ＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓを発現する赤血球前駆細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって評価することができる。形質導入効率を評価するために使用することができる他のレポーター遺伝子としては、例えば、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびルシフェラーゼ、ならびに低親和性神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、およびヒト細胞表面ＣＤ２４抗原が挙げられる（Bierhuizen et al.、Leukemia 13: 605-613、1999）。
１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする核酸を赤血球前駆細胞に導入して操作された脱核赤血球細胞を生成するために、非ウイルスベクターを使用することができる。非ウイルスベクターを赤血球前駆細胞に導入するために、化学的方法および物理的方法を含めたいくつかの送達方法を使用することができる。
外因性タンパク質をコードする非ウイルスベクターの赤血球前駆細胞への導入を、カチオン性脂質およびポリマーなどの合成巨大分子を使用して行うことができる（Papapetrou et al.、Gene Therapy 12: S118-S130、2005）。カチオン性リポソームは、例えば、ＤＮＡと電荷相互作用を通じて複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／脂質複合体は負の細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。この手法を、例えば、造血細胞に対するトランスフェクションに使用することができる（例えば、Keller et al.、Gene Therapy 6: 931-938、1999を参照されたい）。赤血球前駆細胞に関しては、プラスミドＤＮＡ（例えばＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）などの無血清培地中）を市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）などのカチオン性リポソーム（無血清培地中）と混合し、少なくとも２０分間インキュベートして複合体を形成させる。ＤＮＡ／リポソーム複合体を赤血球前駆細胞に添加し、５～２４時間インキュベートし、その後、外因性タンパク質の導入遺伝子発現をアッセイすることができる。あるいは、他の市販のリポソームトランスフェクション剤を使用することができる（例えば、Ｉｎ ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）。
必要に応じて、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーを使用して、赤血球前駆細胞、例えば、造血および臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）由来ＣＤ３４＋細胞へのトランスフェクションを効率的に行うことができる（例えば、Shin et al.、Biochim. Biophys. Acta 1725: 377-384、2005を参照されたい）。ヒトＣＤ３４＋細胞をヒト臍帯血から単離し、２００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子および２０％熱失活血清を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地中で培養する。外因性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを、サイズが０．８Ｋから７５０Ｋまで変動する分枝または直鎖ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ； Ｆｅｒｍｅｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）と一緒にインキュベートする。ＰＥＩは、蒸留水１ｍＬ当たり４．２ｍｇ、およびＨＣｌを使用してｐＨ５．０までわずかに酸性化させたストック溶液として調製する。ＤＮＡをＰＥＩと室温で３０分にわたって、ＤＮＡ１μｇが３ｎｍｏｌのリン酸を含有し、ＰＥＩストック溶液１μＬが１０ｎｍｏｌのアミン窒素を含有するという算出に基づいた種々の窒素／リン酸比で組み合わせることができる。単離されたＣＤ３４＋細胞にＤＮＡ／カチオン性複合体を播種し、２８０×ｇで５分間遠心分離し、培養培地中で４時間またはそれよりも長い時間にわたり、外因性タンパク質の発現を評価するまでインキュベートする。
プラスミドベクターの適切な赤血球前駆細胞への導入を、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃、または粒子衝撃技術などの物理的方法を使用して行うことができる（Papapetrou、et al.、Gene Therapy 12: S118-S130、2005）。この場合、外因性タンパク質をコードするＤＮＡを金粒子に吸収させ、パーティクルガンによって細胞に投与する。この手法を、例えば、赤血球前駆細胞、例えば臍帯血由来の造血幹細胞へのトランスフェクションに使用することができる（例えば、Verma et al.、Gene Therapy 5: 692-699、1998を参照されたい）。そのように、臍帯血を単離し、リン酸緩衝食塩水中に３倍希釈する。ＣＤ３４＋細胞を抗ＣＤ３４モノクローナル抗体と二次抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズおよび磁気分離システムの組合せを使用して精製する（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭｉｎｉＭａｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）。ＣＤ３４＋富化細胞を本明細書に記載の通り培養することができる。トランスフェクションのために、外因性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを、粒子、例えば金ビーズ上に、塩化カルシウムおよびスペルミジンを用いた処理によって沈殿させる。ＤＮＡでコーティングされたビーズをエタノールで洗浄した後、ビーズを、例えばＢｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して培養細胞に送達することができる。トランスフェクションの効率を評価するために、例えばベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子を使用することができる。
必要に応じて、電気穿孔法を使用してプラスミドベクターを赤血球前駆細胞に導入する。電気穿孔により細胞膜に一過性のポアが創出され、それにより、例えばＤＮＡおよびＲＮＡを含めた種々の分子を細胞に導入することが可能になる。そのように、ＣＤ３４＋細胞を本明細書に記載の通り単離し、培養する。電気穿孔の直前に、細胞を室温、２５０×ｇで１０分間にわたる遠心分離によって単離し、例えば、１．０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ １０などの電気穿孔緩衝剤中に１ｍｌ当たり生存細胞０．２～１０×１０６個で再懸濁させる。プラスミドＤＮＡ（１～５０μｇ）を適当な電気穿孔キュベットに細胞懸濁液５００μＬと一緒に添加する。
電気穿孔は、例えば、ＥＣＭ ６００ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用し、２００Ｖから２８０Ｖまでにわたる電圧および２５ミリ秒から７０ミリ秒までにわたるパルス長を用いて行うことができる。いくつかの代替の電気穿孔機器が市販されており、この目的のために使用することができる（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．； Ｃｅｌｌｊｅｃｔ Ｄｕｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）。あるいは、単離されたＣＤ３４＋細胞の効率的な電気穿孔を、以下のパラメータを使用して実施することができる：４ｍｍのキュベット、１６００μΕ、５５０Ｖ／ｃｍ、および１ｍＬ当たり細胞１×１０５個で細胞５００μＬ当たりＤＮＡ１０μｇ（Oldak et al.、Acta Biochim. Polonica 49: 625-632、2002）。
電気穿孔の一形態であるヌクレオフェクションを使用して赤血球前駆細胞へのトランスフェクションを行うこともできる。この場合、ＤＮＡ（または他の試薬）の核への直接輸送を可能にし、したがって、細胞質における可能性のある分解のリスクを低減する細胞型特異的溶液中、電気パラメータを使用してトランスフェクションを実施する。例えば、Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．製）を使用して赤血球前駆細胞へのトランスフェクションを行うことができる。この場合、Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中１～５×１０６個の細胞をＤＮＡ１～５μｇと混合し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）機器で、製造者によって決定される予めプログラムされた設定を使用してトランスフェクションを行う。
赤血球前駆細胞へのトランスフェクションを、哺乳動物細胞においてゲノム内に組み込まれなければ自己複製することができない従来の発現ベクターを用いて、ウイルスによらずに行うことができる。あるいは、赤血球前駆細胞へのトランスフェクションを、染色体に組み込まれずに自律複製する遺伝学的単位として宿主核において持続するエピソームベクターを用いて行うことができる（Papapetrou et al.、Gene Therapy 12: S118-S130、2005）。これらのベクターには、通常は潜伏感染すると細胞において染色体外で複製するウイルス、例えば、ＥＢＶ、ヒトポリオーマウイルスＢＫ、ウシパピローマウイルス－１（ＢＰＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ）、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などに由来する遺伝子エレメントが活用される。哺乳動物人工染色体も非ウイルス遺伝子移入に使用することができる（Vanderbyl et al.、Exp. Hematol. 33: 1470-1476、2005）。
１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする外因性核酸を発現ベクター中に、当技術分野で公知の標準の分子生物学的方法、例えば、制限酵素消化、オーバーラップ伸長ＰＣＲ、およびＧｉｂｓｏｎアセンブリによってアセンブルすることができる。
外因性核酸は、内因性またはネイティブな膜タンパク質をコードする遺伝子と融合した、例えば脱核赤血球細胞の細胞表面上に通常は存在しない外因性タンパク質をコードする遺伝子を含み得、したがって、外因性タンパク質が細胞表面上に発現される。例えば、外因性タンパク質をコードする外因性遺伝子を、１型膜タンパク質のリーダー配列の後ろのＮ末端、２型膜タンパク質のＣ末端、またはＧＰＩ連結膜タンパク質のＧＰＩ付着部位の上流にクローニングすることができる。
標準のクローニング方法を使用して、融合した２つの遺伝子の間に柔軟なアミノ酸リンカーを導入することができる。例えば、柔軟なリンカーは、全長抗体からの単鎖抗体断片の生成に一般に使用される［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３（配列番号３）（Antibody Engineering: Methods & Protocols、B. Lo、ed.、Humana Press、2004、576 pp.）などのポリ－グリシン ポリ－セリンリンカー、または単鎖Ａｒｃリプレッサーを生成するために使用されるものなどのＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（配列番号４）ポリペプチド（Robinson & Sauer、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95: 5929-34、1998）である。一部の実施形態では、柔軟なリンカーにより、柔軟なリンカーを有さない等価の構築物よりも大きな柔軟性および立体的自由を有する外因性タンパク質がもたらされる。この付加的な柔軟性は、標的、例えば抗体もしくはタンパク質への結合、または活性部位が基質（例えば、標的）に到達可能でなければならないタンパク質の酵素反応を必要とする適用において有用である。
一部の実施形態では、提供される方法は、大きな核酸（具体的にはｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を赤血球前駆細胞に、赤血球前駆細胞を核酸と接触させ、核酸を、本明細書に記載のものなどの細胞への核酸の送達に有効な条件下で電気穿孔によって導入することによって送達することを含む。適切な電気穿孔機器としては、これだけに限定されないが、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲおよびＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＮＥＯＮ；ＢＴＸ ＧＥＭＩＮＩ ｓｙｓｔｅｍ；ならびにＭＡＸＣＹＴＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒが挙げられる。これらの方法では、ウイルスによる送達またはウイルスベクターを使用する必要がない。適切な核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡを含む。適切な核酸は、転移因子、安定なエピソーム、プラスミドＤＮＡ、または直鎖ＤＮＡを含めたＤＮＡも含む。
細胞株の電気穿孔のための条件は、例えば、Van Tendeloo et al.、Blood 98 (1): 49-56、2001による文献に記載されている。本明細書に記載の方法のための適切な電気穿孔条件は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：約５００Ｖから約２０００Ｖまで、約８００Ｖから約１８００Ｖまで、または約８５０Ｖから約１７００Ｖまでにわたるパルス電圧；約５ｍｓｅｃから約５０ｍｓｅｃまで、または約１０ｍｓｅｃから約４０ｍｓｅｃまでのパルス幅；および１～２パルス、１～３パルス、１～４パルス、または１～５パルスにわたるパルス数を含む。
赤血球前駆細胞の電気穿孔のための特に適切な条件は、例えば、４日にわたり：ａ）パルス電圧１３００～１４００、パルス幅：１０～２０ｍｓｅｃ、パルス数：１～３；ｂ）パルス電圧１４００、パルス幅：１０ｍｓｅｃ、パルス数：３；ｃ）パルス電圧１４００、パルス幅：２０ｍｓｅｃ、パルス数：１；およびｄ）パルス電圧１３００、パルス幅：１０ｍｓｅｃ、パルス数：３を含む。
赤血球前駆細胞の電気穿孔のための特に適切な条件は、例えば、８～９日にわたり：ａ）パルス電圧：１４００～１６００、パルス幅：２０、パルス数：１；ｂ）パルス電圧：１１００～１３００、パルス幅：３０、パルス数：１；ｃ）パルス電圧：１０００～１２００、パルス幅：４０、パルス数：１；ｄ）パルス電圧：１１００～１４００、パルス幅：２０、パルス数：２；ｅ）パルス電圧：９５０～１１５０、パルス幅：３０、パルス数：２；ｆ）パルス電圧：１３００～１６００、パルス幅：１０、パルス数：３を含む。これらの条件では、一般に、少なくとも約６０％またはそれよりも高い（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも約９７％、またはそれよりも高い）のトランスフェクション効率、および少なくとも約７０％またはそれよりも高い（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも約９７％、またはそれよりも高い）の細胞生存率が導かれる。
分化条件下の培養物中の赤血球前駆細胞の電気穿孔のための特に適切な条件は、例えば、１２～１３日にわたり：ａ）パルス電圧：１５００～１７００、パルス幅：２０、パルス数：１；およびｂ）パルス電圧：１５００～１６００、パルス幅：１０、パルス数：３を含む。これらの条件では、一般に、少なくとも約５０％またはそれよりも高い（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも約９７％、またはそれよりも高い）のトランスフェクション効率、および少なくとも約７０％またはそれよりも高い（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも約９７％、またはそれよりも高い）の細胞生存率が導かれる。
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｅｏｎ ｓｙｓｔｅｍに関して本明細書に開示される条件は、当業者が、異なる電気穿孔機器および／または異なる電気穿孔セットアップに適合するように常套的な実験だけで容易に調整することができ、また、本明細書に記載の特定の電気穿孔機器は開示される方法に限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載の電気穿孔条件を使用して、培養された赤血球前駆細胞に対して第１の時点で電気穿孔を行い、次いで、所望の期間にわたって（必要に応じて分化条件下で）培養し、次いで、第２の時点で再度電気穿孔を行う。一部の実施形態では、培養された赤血球前駆細胞に対して第１の時点で電気穿孔を行い、次いで、所望の期間にわたって（必要に応じて分化条件下で）培養し、次いで、第２の時点、第３の時点、第４の時点、第５の時点、または第６の時点で再度電気穿孔を行う。必要に応じて、第１の電気穿孔と第２の電気穿孔の間、第２の電気穿孔と第３の電気穿孔の間などの培養期間を変動させることができる。例えば、電気穿孔間の期間を所望の通り調整することができ、例えば、期間は、３０分間、１時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または２１日間であり得る。例えば、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を１日目と２日目、１日目と３日目、１日目と４日目、１日目と５日目、１日目と６日目、１日目と７日目、１日目と８日目、１日目と９日目、１日目と１０日目、１日目と１１日目、１日目と１２日目、１日目と１３日目、１日目と１４日目、１日目と１５日目、または１日目と１６日目に行うことができる。別の例では、細胞に対する電気穿孔を２日目と３日目、２日目と４日目、２日目と５日目、２日目と６日目、２日目と７日目、２日目と８日目、２日目と９日目、２日目と１０日目、２日目と１１日目、２日目と１２日目、２日目と１３日目、２日目と１４日目、２日目と１５日目、または２日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を３日目と４日目、３日目と５日目、３日目と６日目、３日目と７日目、３日目と８日目、３日目と９日目、３日目と１０日目、３日目と１１日目、３日目と１２日目、３日目と１３日目、３日目と１４日目、３日目と１５日目、または３日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、細胞に対する電気穿孔を４日目と５日目、４日目と６日目、４日目と７日目、４日目と８日目、４日目と９日目、４日目と１０日目、４日目と１１日目、４日目と１２日目、４日目と１３日目、４日目と１４日目、４日目と１５日目、または４日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、細胞に対する電気穿孔を５日目と６日目、５日目と７日目、５日目と８日目、５日目と９日目、５日目と１０日目、５日目と１１日目、５日目と１２日目、５日目と１３日目、５日目と１４日目、５日目と１５日目、または５日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を６日目と７日目、６日目と８日目、６日目と９日目、６日目と１０日目、６日目と１１日目、６日目と１２日目、６日目と１３日目、６日目と１４日目、６日目と１５日目、または６日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を７日目と８日目、７日目と９日目、７日目と１０日目、７日目と１１日目、７日目と１２日目、７日目と１３日目、７日目と１４日目、７日目と１５日目、または７日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を８日目と９日目、８日目と１０日目、８日目と１１日目、８日目と１２日目、８日目と１３日目、８日目と１４日目、８日目と１５日目、または８日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を９日目と１０日目、９日目と１１日目、９日目と１２日目、９日目と１３日目、９日目と１４日目、９日目と１５日目、または９日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を１０日目と１１日目、１０日目と１２日目、１０日目と１３日目、１０日目と１４日目、１０日目と１５日目、または１０日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を１１日目と１２日目、１１日目と１３日目、１１日目と１４日目、１１日目と１５日目、または１１日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を１２日目と１３日目、１２日目と１４日目、１２日目と１５日目、または１２日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を１３日目と１４日目、１３日目と１５日目、または１３日目と１６日目に行うことができる。さらに別の例では、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を１４日目と１５日目、または１４日目と１６日目に行うことができる。必要に応じて、赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を２回よりも多く、例えば、３回、４回、５回、または６回行うことができ、間隔は細胞の分化プロセスの任意の時点で所望の通り選択することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の電気穿孔条件を使用して、培養された赤血球前駆細胞に対する電気穿孔を分化の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、または１６日目に行う。
一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞は、クリックコンジュゲートした操作された脱核赤血球細胞であり得る。触媒性結合形成性ポリペプチドドメインを、例えば、細胞質基質内に存在するまたは膜に存在する赤血球前駆細胞上または赤血球前駆細胞内に発現させることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されたタンパク質であるＳｐｙ０１２８に由来するものを含めた、トランスペプチダーゼ、ソルターゼ、およびイソペプチダーゼを含めた多くの触媒性結合形成性ポリペプチドが存在する。Ｓｐｙ０１２８の自己触媒性イソペプチド結合形成性サブユニット（ＣｎａＢ２ドメイン）を分割することにより、互いに対する特異性を有する触媒活性を保持する２つの別個のポリペプチドがもたらされることが実証されている。この系のポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称される。混合すると、ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、ＳｐｙＴａｇのＡｓｐｌ１７とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＬｙｓ３１の間のイソペプチド結合形成を受ける（Zakeri and Howarth、JACS 132: 4526、2010）。この反応は、細胞環境に適合し、タンパク質／ペプチドコンジュゲーションに関して高度に特異的である（Zakeri et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109: E690-E697、2012）。ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒにより、エラスチン様タンパク質の翻訳後の形態的改変が方向付けられることが示されている。例えば、ＳｐｙＴａｇをＮ末端に位置付け、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをＣ末端に位置付けることにより、環状エラスチン様タンパク質の形成が方向付けられる（Zhang et al、J. Am. Chem. Soc. 2013）。
成分であるＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを交換し、したがって、分子ＡがＳｐｙＴａｇと融合し、分子ＢがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合した系と、分子ＡがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合し、分子ＢがＳｐｙＴａｇと融合した系が機能的に等価になるようにすることができる。本開示の目的に関しては、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを使用する場合、相補的な分子をその場所に代用することができることが理解されるべきである。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系などの触媒性結合形成性ポリペプチドを使用して、外因性タンパク質を、例えば赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞の表面に付着させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列を赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞の細胞外表面上に発現させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドを、例えば、１型または３型膜貫通タンパク質、例えばグリコホリンＡのＮ末端に融合すること、２型膜貫通タンパク質、例えばＫｅｌｌのＣ末端に融合すること、複数回膜貫通タンパク質、例えばＢａｎｄ３の細胞外末端にインフレームでまたは細胞外ループ内に挿入すること、ＧＰＩ－アクセプターポリペプチド、例えばＣＤ５５またはＣＤ５９と融合すること、脂質－鎖係留ポリペプチドと融合すること、または表在性膜タンパク質と融合することができる。外因性タンパク質をＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸を、ＳｐｙＴａｇ融合を発現する同じ赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞から発現させ、分泌させることができる。あるいは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列を、例えば、細菌の産生系、真菌の産生系、昆虫の産生系、哺乳動物の産生系、または無細胞産生系において外因的に産生させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると、外因性タンパク質を赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞の表面に付着させる共有結合が形成される。
一実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドを赤血球細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下でグリコホリンＡのＮ末端との融合物として発現させることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列と融合した外因性タンパク質を同じ赤血球細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下で発現させることができる。両方の融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの間にイソペプチド結合が形成され、それにより、赤血球細胞表面と外因性タンパク質の間に共有結合が形成される。
別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドを赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞においてＧａｔａｌプロモーターの制御下でグリコホリンＡのＮ末端との融合物として発現させることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列と融合した外因性タンパク質を適切な哺乳動物細胞発現系、例えばＨＥＫ２９３細胞において発現させることができる。ＳｐｙＴａｇ融合ポリペプチドが赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞上で発現されると、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合ポリペプチドが細胞と接触し得る。適切な反応条件下でＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの間にイソペプチド結合が形成され、それにより、赤血球前駆細胞表面または脱核赤血球細胞表面と外因性タンパク質の間に共有結合が形成される。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系などの触媒性結合形成性ポリペプチドを使用して、外因性タンパク質を赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞の細胞内空間に係留することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列を、導入遺伝子の直接発現、内因性細胞内タンパク質、例えばヘモグロビンなどとの融合、内因性細胞表面タンパク質、例えばＢａｎｄ３、グリコホリンＡ、Ｋｅｌｌなどの細胞内ドメインとの融合、または細胞骨格の構造成分との融合を含めたいくつかの方法によって赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞の細胞内空間において発現させることができる。ＳｐｙＴａｇ配列は、ポリペプチド末端に限定されず、内因性ポリペプチドの配列内部に組み込むことができ、したがって、ポリペプチドの翻訳および局在は撹乱されない。外因性タンパク質をＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列を、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現する同じ赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞内で発現させることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると共有結合が形成され、それが外因性タンパク質を赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞の細胞内空間内に係留するように働く。
一実施形態では、赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞は、ヘモグロビンベータと融合したＳｐｙＴａｇを細胞内に含む。赤血球前駆細胞を、ヘモグロビンプロモーター、ベータグロビン遺伝子、およびＳｐｙＴａｇ配列を含む遺伝子配列を用いて遺伝子改変することができ、したがって、翻訳されると、細胞内ベータグロビンがＣ末端でＳｐｙＴａｇと融合する。さらに、赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞は、外因性ポリペプチドの発現を駆動するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをコードするＧａｔａｌプロモーターにより導かれる遺伝子を発現し、したがって、翻訳されると、外因性ポリペプチドがＮ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合する。両方の融合タンパク質が発現されると、ベータグロビンと結合したＳｐｙＴａｇは、細胞内空間内の外因性ポリペプチドと結合したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとイソペプチド結合によって連結し、それにより、外因性ポリペプチドをベータグロビンに係留し、成熟化の間保持することが可能になる。
別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドを赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞内で外因性タンパク質との融合物として発現させることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドを同じ赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞内のグリコホリンＡのＣ末端（細胞内）との融合物として発現させることができる。両方の融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＴａｇポリペプチドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドの間にイソペプチド結合が形成され、それにより、膜係留内因性赤血球ポリペプチドと外因性タンパク質の間に共有結合が形成される。
ポリペプチド間で他の分子融合物を形成することができ、それには直接コンジュゲーションまたは間接的なコンジュゲーションが含まれる。ポリペプチドを互いに直接コンジュゲートすることもでき、リンカーを通じて間接的にコンジュゲートすることもできる。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、または核酸であり得る。ポリマーは、例えば、天然ポリマー、合成ポリマー、直鎖ポリマー、または分枝ポリマーであり得る。外因性タンパク質は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む異種融合タンパク質を含み得、当該融合タンパク質は、一方または両方の末端で互いに直接または介在するリンカー配列および／もしくは別の配列と接合したポリペプチドを含む。リンカーとのコンジュゲーションは、共有結合またはイオン結合によるものであり得る。
一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞は、低浸透圧性負荷を受けたヒト脱核赤血球細胞である。低張性負荷／溶解に関しては、赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞を低イオン強度緩衝剤に曝露させ、それらの細胞を破裂させる。外因性タンパク質は細胞内に分布する。脱核赤血球細胞または赤血球前駆細胞を、単離された脱核赤血球細胞のペレットに５ｍＭのリン酸緩衝剤（ｐＨ８）を３０～５０倍体積過剰で添加することによって低浸透圧性に溶解させることができる。得られた溶解した細胞膜を遠心分離によって単離する。溶解した細胞膜のペレットを再懸濁させ、低イオン強度緩衝剤中、外因性タンパク質の存在下で、例えば３０分間インキュベートする。あるいは、溶解した細胞膜を外因性タンパク質と一緒に、脱核赤血球細胞または赤血球前駆細胞への負荷が効率的になされるように決定された最良の条件に応じて、わずか１分または数日もの長さにわたってインキュベートすることができる。１つまたは複数の外因性タンパク質（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の例示的な外因性タンパク質のいずれか）をコードする核酸の低張性負荷に関しては、核酸を低張性Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、赤血球前駆細胞に注入することができる。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの濃度は、脱核赤血球細胞への負荷が効率的になされるように決定された最良の条件に応じて約２０ｍｍｏｌ／ｌから約１５０ｍｍｏｌ／ｌまでであり得る。
あるいは、赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞への外因性タンパク質の負荷を、低張液に対する制御された透析を使用して細胞を膨張させ、細胞膜にポアを創出することによって行うことができる（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号；同第５，７５３，２２１号；同第６，４９５，３５１号、および同第１０，０４６，００９号を参照されたい）。例えば、細胞のペレットを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４に再懸濁させ、１０ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭのグルコース、および４ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する低イオン強度緩衝剤、ｐＨ７．４に対して透析する。３０～６０分後、細胞を、外因性タンパク質を含有する、１６ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４、ｐＨ７．４溶液に対してさらに３０～６０分間さらに透析する。これらの手順は全て、４℃の温度で有利に実施することができる。一部の場合では、大量の赤血球前駆細胞または脱核赤血球細胞に負荷を透析手法によって行うことが有益であり得、この目的のために設計された特定の器具を使用することができる（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号、同第６，１３９，８３６号および同第６，４９５，３５１号を参照されたい）。
脱核赤血球細胞の単離および製剤化
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）における第３の細胞培養物から操作された脱核赤血球細胞の集団を単離するステップをさらに含み得る。操作された脱核赤血球細胞は、これだけに限定されないが、遠心分離（例えば、密度勾配遠心分離）、ＦＡＣＳ、およびＭＡＣＳなどの、当技術分野で公知の方法を使用して単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、（ｆ）ステップ（ｅ）において単離された操作された脱核赤血球細胞の集団を製剤化するステップをさらに含む。一部の実施例では、操作された脱核赤血球細胞の集団を製剤化するステップは、単離された操作された脱核赤血球細胞の集団を１つまたは複数の薬学的に許容される緩衝剤または賦形剤（例えば、リン酸緩衝食塩水）と混合することを含み得る。
一部の実施形態では、操作された脱核赤血球細胞の集団を、細胞の保管、輸送、および／または対象への投与に適した組成物（例えば、医薬組成物）に製剤化する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ステップ（ｆ）の製剤化された操作された脱核赤血球細胞の集団を、それを必要とする対象（例えば、操作された脱核赤血球細胞に存在する１つもしくは複数の外因性タンパク質が必要であると以前に同定もしくは診断された対象、または赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）の輸血および／もしくは増加が必要であると同定された対象）に投与するステップをさらに含む。これらの方法の一部の実施形態では、対象は、投与される操作された脱核赤血球細胞に存在する外因性タンパク質の１つまたは複数が必要であると以前に同定または診断されている。これらの方法の一部の実施形態では、製剤化された操作された脱核赤血球細胞の集団を対象に静脈内投与によって投与する。
組成物
本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された脱核赤血球細胞集団も本明細書で提供される。本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された脱核赤血球細胞集団のいずれかを含む組成物も本明細書で提供される。本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された製剤（例えば、医薬組成物）も本明細書で提供される。一部の実施形態では、製剤は、対象（例えば、本明細書に記載の対象のいずれか）への静脈内投与に適したものである。本明細書に記載の組成物または製剤のいずれかの一部の実施形態では、組成物または製剤は、本明細書に記載の脱核赤血球細胞のいずれかの剤形である。
キット
本明細書で提供される組成物、製剤、または脱核赤血球細胞集団のいずれかを含むキットも本明細書で提供される。本明細書に記載の組成物、製剤、または脱核赤血球細胞集団のいずれかを含有する１つまたは複数の滅菌容器（例えば、滅菌円錐管、滅菌ペトリ皿、滅菌バイアル（例えば、ホウケイ酸ガラスバイアル）、および滅菌プラスチックバッグ（ジ－２－エチルヘキシルフタレート（ＤＥＨＰ）－可塑化ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）バッグ、またはｎ－ブチリル－トリ（ｎ－ヘキシル）－シトレート（ＢＴＨＣ）－可塑化ＰＶＣバッグ）を含むキットも本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットのいずれかは、本明細書に記載の組成物、製剤、または脱核赤血球細胞集団のいずれかのそれを必要とする対象への投与に関する指示をさらに含み得る。
本明細書に記載のキットの一部の実施形態は、本明細書に記載の組成物、製剤、および脱核赤血球細胞集団のいずれかの適切な単一剤形を含む。例えば、本明細書に記載の組成物または製剤のいずれかの単一剤形の体積は、例えば、約０．５ｍＬ～約２Ｌ、約０．５ｍＬ～約１８００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１５００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１２００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１０００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約８００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約６００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約５００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約４００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約３００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約２００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１００ｍＬ、約０．５ｍＬ～約８０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約６０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約４０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、約０．５ｍＬ～約５ｍＬ、約０．５ｍＬ～約１．０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２Ｌ、約１．０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１．０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約２０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約１０ｍＬ、約１．０ｍＬ～約５ｍＬ、約５ｍＬ～約２Ｌ、約５ｍＬ～約１８００ｍＬ、約５ｍＬ～約１５００ｍＬ、約５ｍＬ～約１２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１０００ｍＬ、約５ｍＬ～約８００ｍＬ、約５ｍＬ～約６００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８００ｍＬ、約５ｍＬ～約５００ｍＬ、約５ｍＬ～約４５０ｍＬ、約５ｍＬ～約４００ｍＬ、約５ｍＬ～約３５０ｍＬ、約５ｍＬ～約３００ｍＬ、約５ｍＬ～約２５０ｍＬ、約５ｍＬ～約２００ｍＬ、約５ｍＬ～約１８０ｍＬ、約５ｍＬ～約１６０ｍＬ、約５ｍＬ～約１４０ｍＬ、約５ｍＬ～約１２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１００ｍＬ、約５ｍＬ～約８０ｍＬ、約５ｍＬ～約６０ｍＬ、約５ｍＬ～約４０ｍＬ、約５ｍＬ～約２０ｍＬ、約５ｍＬ～約１０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２Ｌ、約１０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１０ｍＬ～約８０ｍＬ、約１０ｍＬ～約６０ｍＬ、約１０ｍＬ～約４０ｍＬ、約１０ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２Ｌ、約２０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約８０ｍＬ、約２０ｍＬ～約６０ｍＬ、約２０ｍＬ～約４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２Ｌ、約４０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約４０ｍＬ～約１００ｍＬ、約４０ｍＬ～約８０ｍＬ、約４０ｍＬ～約６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２Ｌ、約６０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８００ｍＬ、約６０ｍＬ～約６００ｍＬ，約６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約６０ｍＬ～約１００ｍＬ、約６０ｍＬ～約８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２Ｌ、約８０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約８０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１２０ｍＬ、約８０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２Ｌ、約１００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１００ｍＬ～約８００ｍＬ、約１００ｍＬ～約６００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約４００ｍＬ、約１００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約３００ｍＬ、約１００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１００ｍＬ～約２００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１００ｍＬ～約１２０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２Ｌ、約１２０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１２０ｍＬ～約１４０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２Ｌ、約１４０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１４０ｍＬ～約１６０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１６０ｍＬ～約２００ｍＬ、約１６０ｍＬ～約１８０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２Ｌ、約１８０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約８００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約６００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約４００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約３００ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１８０ｍＬ～約２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２Ｌ、約２００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約２００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約２００ｍＬ～約８００ｍＬ、約２００ｍＬ～約６００ｍＬ、約２００ｍＬ～約５００ｍＬ、約２００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約４００ｍＬ、約２００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２００ｍＬ～約３００ｍＬ、約２００ｍＬ～約２５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約２Ｌ、約２５０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３５０ｍＬ、約２５０ｍＬ～約３００ｍＬ、約３００ｍＬ～約２Ｌ、約３００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約３００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約３００ｍＬ～約８００ｍＬ、約３００ｍＬ～約６００ｍＬ、約３００ｍＬ～約５００ｍＬ、約３００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３００ｍＬ～約４００ｍＬ、約３００ｍＬ～約３５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約２Ｌ、約３５０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４５０ｍＬ、約３５０ｍＬ～約４００ｍＬ、約４００ｍＬ～約２Ｌ、約４００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約４００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約４００ｍＬ～約８００ｍＬ、約４００ｍＬ～約６００ｍＬ、約４００ｍＬ～約５００ｍＬ、約４００ｍＬ～約４５０ｍＬ、約４５０ｍＬ～約２Ｌ、約４５０ｍＬ～約１８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約１５００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約１２００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約１０００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約８００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約６００ｍＬ、約４５０ｍＬ～約５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約２Ｌ、約５００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約５００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約５００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約５００ｍＬ～約８００ｍＬ、約５００ｍＬ～約６００ｍＬ、約６００ｍＬ～約２Ｌ、約６００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約６００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約６００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約６００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約６００ｍＬ～約８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約２Ｌ、約８００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約８００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約８００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約８００ｍＬ～約１０００ｍＬ、約１０００ｍＬ～約２Ｌ、約１０００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１０００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１０００ｍＬ～約１２００ｍＬ、約１２００ｍＬ～約２Ｌ、約１２００ｍＬ～約１８００ｍＬ、約１２００ｍＬ～約１５００ｍＬ、約１５００ｍＬ～約２Ｌ、約１５００ｍＬ～約１８００ｍＬ、または約１８００ｍＬ～約２Ｌであり得る。
対象を処置する方法
それを必要とする対象を処置する方法であって、本明細書に記載の組成物、製剤、または脱核赤血球細胞集団のいずれかを治療有効量で投与することを含む、方法も本明細書で提供される。一部の実施形態では、投与を静脈内投与によって実施する。
本明細書に記載の方法のいずれかの一部の実施形態は、１つまたは複数の追加的な治療剤を対象に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な治療剤は、本明細書で提供される組成物のいずれかと実質的に同じ時点で対象に投与することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加的な治療剤を、本明細書に記載の組成物のいずれかを対象に投与する前または投与した後に対象に投与することができる。
本発明を以下の実施例でさらに記載し、実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
赤血球細胞の灌流培養
赤血球細胞分化の後期「Ｍ」期（本明細書に記載の方法のいずれかのステップ（ｄ））に交互接線流（ＡＴＦ）系をバイオリアクターに接続した。期に特異的な培地をバイオリアクター系に灌流させ、他の条件は全て一定に保った。１日当たり細胞当たり０．０１～０．２ｎＬの細胞に特異的な灌流速度（ＣＳＰＲ）を使用した。
灌流培養（ＡＴＦ）した赤血球細胞および対照赤血球細胞（流加培養したもの）の脱核パーセンテージを「Ｍ」期の経過にわたって測定した。図１に示されている通り、灌流培養した赤血球細胞は流加培養した対照細胞と比較して有意に高い脱核率に達し、培養１３日目の脱核率は７０％～８０％であった。
灌流培養した赤血球細胞および対照赤血球細胞の細胞密度を「Ｍ」期（本明細書に記載の方法のステップ（ｄ））の経過にわたってＮｏｖｏＣｙｔｅ細胞カウンターを使用して測定した。図２に示されている通り、灌流培養した細胞のピーク細胞密度は１ｍＬ当たり細胞およそ１．４×１０７個に達した。対照的に、対照流加培養細胞の密度は１ｍＬ当たり細胞２×１０６個を超えなかった。
同様のＡＴＦ系セットアップを使用して、赤血球細胞分化の「Ｄ」期（本明細書に記載の方法のステップ（ｂ）に対応する）の間の灌流培養を試験した。灌流培養した赤血球細胞の細胞密度を「Ｄ」期の経過にわたってＮｏｖｏＣｙｔｅ細胞カウンターを使用して測定した。図３に示されている通り、灌流培養した赤血球細胞のピーク密度は１ｍＬ当たり細胞およそ１．３～１．７×１０７個に達すると同時に高い生存率が維持された。「Ｄ」期の最後に、灌流培養した赤血球細胞の密度は１ｍＬ当たり細胞１．０×１０７個に達し、比較して対照流加培養細胞の密度は１ｍＬ当たり１．５～３×１０６個に達した（データは示していない）。
これらの結果から、驚いたことに、赤血球細胞を「Ｍ」期および／または「Ｄ」期の間に灌流培養することにより、分化している赤血球前駆細胞の細胞密度および脱核の増大がもたらされることが実証された。
他の実施形態
本発明がその詳細な説明と併せて記載されているが、前述の説明は、本発明を例示するものであり、その範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。他の態様、利点、および改変も以下の特許請求の範囲の範囲内に入ることが理解されるべきである。

Claims (529)

  1. 脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、
    （ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｂ）前記第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の前記第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）の前記第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップと、
    を含み、
    ステップ（ｄ）の後、前記第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法。
  2. ステップ（ａ）の前に、
    （ｉ）複数の赤血球前駆細胞を容器中に含まれる第１の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個である前記第１の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｉｉ）前記第１の細胞培養物を約１日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ｉ）の前記容器が振とうフラスコである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記振とうフラスコの容積が、約１５ｍＬ～約５Ｌである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記振とうフラスコの容積が、約５０ｍＬ～約１．５Ｌである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記振とうフラスコの容積が、約１００ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項５に記載の方法。
  7. ステップ（ｉｉ）が、前記振とうフラスコを０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項２から６までのいずれか一項に記載の方法。
  8. ステップ（ｉｉ）が、前記振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項７に記載の方法。
  9. ステップ（ｉ）の前記容器が振とう管である、請求項２に記載の方法。
  10. 前記振とう管の容積が、約２ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記振とう管の容積が、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記振とう管の容積が、約５０ｍＬ～約２００ｍＬである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記振とう管が円錐容器である、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の方法。
  14. ステップ（ｉｉ）が、前記振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項９から１３までのいずれか一項に記載の方法。
  15. ステップ（ｉｉ）が、前記振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ステップ（ｉ）の前記容器が培養バッグである、請求項２に記載の方法。
  17. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約２５Ｌである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５Ｌである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項１８に記載の方法。
  20. ステップ（ｉｉ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む、請求項１６から１９までのいずれか一項に記載の方法。
  21. ステップ（ｉｉ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. ステップ（ｉｉ）が、前記第１の細胞培養物をバッチ培養することを含む、請求項２から２１までのいずれか一項に記載の方法。
  23. ステップ（ｉｉ）が、前記第１の細胞培養物を流加培養することを含む、請求項２から２１までのいずれか一項に記載の方法。
  24. 流加培養が、追加的な体積の前記第１の培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記追加的な体積の第１の培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記追加的な体積の第１の細胞培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記第１の培養培地が、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つまたは複数を含む、請求項２から２６までのいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記第１の培養培地が、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のそれぞれを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記第１の培養培地が、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記第１の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項２から３０までのいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記第１の培養培地が、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項２から３２までのいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む、請求項２から３３までのいずれか一項に記載の方法
  35. 前記第１の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記第１の培養培地が、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む、請求項２から３５までのいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記第１の培養培地が、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第１の培養培地が、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項２から３７までのいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項３８に記載の方法。
  43. 前記第１の培養培地が、脂質を含む、請求項２から４２までのいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記第１の培養培地が、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項２から４３までのいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記第１の培養培地が、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記第１の培養培地が、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記第１の培養培地が、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約１２日にわたって実施する、請求項２から４７までのいずれか一項に記載の方法。
  49. ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約９日にわたって実施する、請求項４８に記載の方法。
  50. ステップ（ｉ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である、請求項２から４９までのいずれか一項に記載の方法。
  51. ステップ（ｉ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である、請求項５０に記載の方法。
  52. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである、請求項１から５１までのいずれか一項に記載の方法。
  53. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、５Ｌ～約５，０００Ｌである、請求項５２に記載の方法。
  54. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約２，５００Ｌである、請求項５３に記載の方法。
  55. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約１００Ｌである、請求項５４に記載の方法。
  56. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
  57. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. ステップ（ｂ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項１から５７までのいずれか一項に記載の方法。
  59. ステップ（ｂ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項５８に記載の方法。
  60. ステップ（ｂ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項５９に記載の方法。
  61. ステップ（ｂ）における前記灌流培養が、追加的な体積の前記第２の培養培地を前記第２の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む、請求項１から６０までのいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記追加的な体積の第２の培養培地を、前記第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記追加的な体積の第２の培養培地を前記第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する、請求項６１に記載の方法。
  64. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１から６３までのいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのそれぞれを含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記第２の培養培地が、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１から６６までのいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記第２の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項１から６８までのいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項１から７１までのいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記第２の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項１から７４までのいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１から７７までのいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記第２の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１から８０までのいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記第２の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記第２の培養培地が、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１から８２までのいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項８３に記載の方法。
  87. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項８３に記載の方法。
  88. 前記第２の培養培地が、脂質を含む、請求項１から８７までのいずれか一項に記載の方法。
  89. ステップ（ｂ）の前記灌流培養を約４日～約１０日にわたって実施する、請求項１から８８までのいずれか一項に記載の方法。
  90. ステップ（ｂ）の前記灌流培養を約５日～約８日にわたって実施する、請求項８９に記載の方法。
  91. ステップ（ａ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である、請求項１から９０までのいずれか一項に記載の方法。
  92. ステップ（ａ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である、請求項９１に記載の方法。
  93. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである、請求項１から９２までのいずれか一項に記載の方法。
  94. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、５Ｌ～約５，０００Ｌである、請求項９３に記載の方法。
  95. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約２，５００Ｌである、請求項９４に記載の方法。
  96. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約１００Ｌである、請求項９５に記載の方法。
  97. ステップ（ｄ）が、前記第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項１から９６までのいずれか一項に記載の方法。
  98. ステップ（ｄ）が、前記第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項９７に記載の方法。
  99. ステップ（ｄ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項１から９８までのいずれか一項に記載の方法。
  100. ステップ（ｄ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項９９に記載の方法。
  101. ステップ（ｄ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項１００に記載の方法。
  102. ステップ（ｄ）における前記灌流培養が、
    （ｉ）追加的な体積の前記第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加すること、および
    （ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加すること
    を含む、請求項１から１０１までのいずれか一項に記載の方法。
  103. （ｉ）における前記追加的な体積の第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または
    （ｉｉ）における前記追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第２の期間にわたって連続的に添加する、
    請求項１０２に記載の方法。
  104. （ｉ）における前記追加的な体積の第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第１の期間にわたって定期的に添加し、かつ／または
    （ｉｉ）における前記追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第２の期間にわたって定期的に添加する、
    請求項１０２に記載の方法。
  105. （ｉ）における前記第１の期間が、約１日～約７日である、請求項１０２から１０４までのいずれか一項に記載の方法。
  106. （ｉ）における前記第１の期間が、約３日～約５日である、請求項１０５に記載の方法。
  107. （ｉｉ）における前記第２の期間が、約１日～約１０日である、請求項１０２から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
  108. （ｉｉ）における前記第２の期間が、約３日～約７日である、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む、請求項１から１０８までのいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのそれぞれを含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記第３の培養培地が、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１から１１１までのいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記第３の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項１から１１３までのいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記第３の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記第３の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１から１１９までのいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記第３の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記第３の培養培地が、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記第３の培養培地が、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む、請求項１から１２５までのいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記第３の培養培地が、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む、請求項１０２から１２７までのいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのそれぞれを含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記第４の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１０２から１３０までのいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記第４の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１０２から１３２までのいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記第４の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１０２から１３５までのいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記第４の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記第４の培養培地が、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１０２から１３７までのいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項１３９に記載の方法。
  142. 前記第４の培養培地が、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む、請求項１０２から１４１までのいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記第４の培養培地が、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む、請求項１４２に記載の方法。
  144. ステップ（ｄ）の前記灌流培養を、約８日～約１５日にわたって実施する、請求項１から１４３までのいずれか一項に記載の方法。
  145. ステップ（ｄ）の前記灌流培養を、約９日～約１３日にわたって実施する、請求項１４４に記載の方法。
  146. ステップ（ｃ）の最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０５個である、請求項１から１４５までのいずれか一項に記載の方法。
  147. ステップ（ｃ）の最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０５個である、請求項１４６に記載の方法。
  148. ステップ（ｂ）および（ｄ）における前記灌流培養が、接線濾過の使用を含む、請求項１から１４７までのいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記接線濾過が、交互接線濾過（ＡＴＦ）である、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記接線濾過が、平均孔径が約１０ｎｍ～約６．０μｍのフィルターの使用を含む、請求項１４８または１４９に記載の方法。
  151. 前記フィルターの平均孔径が、約０．１μｍ～約３．０μｍである、請求項１５０に記載の方法。
  152. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項１から１５１までのいずれか一項に記載の方法。
  153. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項１５２に記載の方法。
  154. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項１５３に記載の方法。
  155. 脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、
    （ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を容器中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｂ）前記第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の前記第２の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）の前記第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたって灌流培養するステップと、
    を含み、
    ステップ（ｄ）の後、前記第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法。
  156. ステップ（ａ）の前に、
    （ｉ）複数の赤血球前駆細胞を容器中に含まれる第１の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個の前記第１の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｉｉ）前記第１の細胞培養物を約１日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと
    をさらに含む、請求項１５５に記載の方法。
  157. ステップ（ｉ）の前記容器が振とうフラスコである、請求項１５６に記載の方法。
  158. 前記振とうフラスコの容積が、約１５ｍＬ～約５Ｌである、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記振とうフラスコの容積が、約５０ｍＬ～約１．５Ｌである、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記振とうフラスコの容積が、約１００ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項１５９に記載の方法。
  161. ステップ（ｉｉ）が、前記振とうフラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項１５６から１６０までのいずれか一項に記載の方法。
  162. ステップ（ｉｉ）が、前記振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項１６１に記載の方法。
  163. ステップ（ｉ）の前記容器が振とう管である、請求項１５６に記載の方法。
  164. 前記振とう管の容積が、約２ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記振とう管の容積が、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記振とう管の容積が、約５０ｍＬ～約２００ｍＬである、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記振とう管が円錐容器である、請求項１６３から１６６までのいずれか一項に記載の方法。
  168. ステップ（ｉｉ）が、前記振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項１６３から１６７までのいずれか一項に記載の方法。
  169. ステップ（ｉｉ）が、前記振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項１６８に記載の方法。
  170. ステップ（ｉ）の前記容器が培養バッグである、請求項１５６に記載の方法。
  171. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約２５Ｌである、請求項１７０に記載の方法。
  172. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５Ｌである、請求項１７１に記載の方法。
  173. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項１７２に記載の方法。
  174. ステップ（ｉｉ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む、請求項１７０から１７３までのいずれか一項に記載の方法。
  175. ステップ（ｉｉ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む、請求項１７４に記載の方法。
  176. ステップ（ｉｉ）が、前記第１の細胞培養物をバッチ培養することを含む、請求項１５６から１７５までのいずれか一項に記載の方法。
  177. ステップ（ｉｉ）が、前記第１の細胞培養物を流加培養することを含む、請求項１５６から１７５までのいずれか一項に記載の方法。
  178. 流加培養が、追加的な体積の前記第１の培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む、請求項１７７に記載の方法。
  179. 前記追加的な体積の第１の培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する、請求項１７８に記載の方法。
  180. 前記追加的な体積の第１の細胞培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する、請求項１７８に記載の方法。
  181. 前記第１の培養培地が、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つまたは複数を含む、請求項１５６から１８０までのいずれか一項に記載の方法。
  182. 前記第１の培養培地が、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のそれぞれを含む、請求項１８１に記載の方法。
  183. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む、請求項１８１または１８２に記載の方法。
  184. 前記第１の培養培地が、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む、請求項１８３に記載の方法。
  185. 前記第１の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項１５６から１８４までのいずれか一項に記載の方法。
  186. 前記第１の培養培地が、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項１８５に記載の方法。
  187. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項１５６から１８６までのいずれか一項に記載の方法。
  188. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む、請求項１５６から１８７までのいずれか一項に記載の方法
  189. 前記第１の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む、請求項１８８に記載の方法。
  190. 前記第１の培養培地が、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む、請求項１５６から１８９までのいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記第１の培養培地が、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１９０に記載の方法。
  192. 前記第１の培養培地が、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１５６から１９１までのいずれか一項に記載の方法。
  193. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項１９２に記載の方法。
  194. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項１９２に記載の方法。
  195. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項１９２に記載の方法。
  196. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項１９２に記載の方法。
  197. 前記第１の培養培地が、脂質を含む、請求項１５６から１９６までのいずれか一項に記載の方法。
  198. 前記第１の培養培地が、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１５６から１９７までのいずれか一項に記載の方法。
  199. 前記第１の培養培地が、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１９８に記載の方法。
  200. 前記第１の培養培地が、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１９９に記載の方法。
  201. 前記第１の培養培地が、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項２００に記載の方法。
  202. ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約１２日にわたって実施する、請求項１５６から２０１までのいずれか一項に記載の方法。
  203. ステップ（ｉｉ）のバッチ培養または流加培養を約５日～約９日にわたって実施する、請求項２０２に記載の方法。
  204. ステップ（ｉ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である、請求項１５６から２０３までのいずれか一項に記載の方法。
  205. ステップ（ｉ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である、請求項２０４に記載の方法。
  206. ステップ（ａ）の前記容器が振とうフラスコである、請求項１５５から２０５までのいずれか一項に記載の方法。
  207. 前記振とうフラスコの容積が、約１５ｍＬ～約３Ｌである、請求項２０６に記載の方法。
  208. 前記振とうフラスコの容積が、約５０ｍＬ～約１．５Ｌである、請求項２０７に記載の方法。
  209. 前記振とうフラスコの容積が、約１００ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項２０８に記載の方法。
  210. ステップ（ｂ）が、前記振とうフラスコを０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項１５５から２０９までのいずれか一項に記載の方法。
  211. ステップ（ｂ）が、前記振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項２１０に記載の方法。
  212. ステップ（ａ）の前記容器が振とう管である、請求項１５５から２０５までのいずれか一項に記載の方法。
  213. 前記振とう管の容積が、約２ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項２１２に記載の方法。
  214. 前記振とう管の容積が、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである、請求項２１３に記載の方法。
  215. 前記振とう管の容積が、約５０ｍＬ～約２００ｍＬである、請求項２１４に記載の方法。
  216. 前記振とう管が円錐容器である、請求項２１２から２１５までのいずれか一項に記載の方法。
  217. ステップ（ｂ）が、前記振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項２１２から２１６までのいずれか一項に記載の方法。
  218. ステップ（ｂ）が、前記振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項２１７に記載の方法。
  219. ステップ（ａ）の前記容器が培養バッグである、請求項１５５から２０５までのいずれか一項に記載の方法。
  220. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約２５Ｌである、請求項２１９に記載の方法。
  221. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５Ｌである、請求項２２０に記載の方法。
  222. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項２２１に記載の方法。
  223. ステップ（ｂ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む、請求項２１９から２２２までのいずれか一項に記載の方法。
  224. ステップ（ｂ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む、請求項２２３に記載の方法。
  225. ステップ（ａ）における前記容器が、バイオリアクターである、請求項１５５から２０５までのいずれか一項に記載の方法。
  226. 前記バイオリアクターの容積が、１Ｌ～約１５，０００Ｌである、請求項２２５に記載の方法。
  227. ステップ（ａ）における前記バイオリアクターの容積が、５Ｌ～約５，０００Ｌである、請求項２２６に記載の方法。
  228. ステップ（ａ）における前記バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約２，５００Ｌである、請求項２２７に記載の方法。
  229. ステップ（ａ）における前記バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約１００Ｌである、請求項２２８に記載の方法。
  230. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項２２５から２２９までのいずれか一項に記載の方法。
  231. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項２３０に記載の方法。
  232. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物をバッチ培養することを含む、請求項１５５から２３１までのいずれか一項に記載の方法。
  233. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を流加培養することを含む、請求項１５５から２３１までのいずれか一項に記載の方法。
  234. 流加培養が、追加的な体積の前記第２の培養培地を前記第２の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む、請求項２３３に記載の方法。
  235. 前記追加的な体積の第２の培養培地を前記第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する、請求項２３４に記載の方法。
  236. 前記追加的な体積の第２の細胞培養培地を前記第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する、請求項２３５に記載の方法。
  237. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１５５から２３６までのいずれか一項に記載の方法。
  238. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、請求項２３７に記載の方法。
  239. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのそれぞれを含む、請求項２３８に記載の方法。
  240. 前記第２の培養培地が、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１５５から２３９までのいずれか一項に記載の方法。
  241. 前記第２の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項２４０に記載の方法。
  242. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項１５５から２４１までのいずれか一項に記載の方法。
  243. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項２４２に記載の方法。
  244. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項２４３に記載の方法。
  245. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項１５５から２４４までのいずれか一項に記載の方法。
  246. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項２４５に記載の方法。
  247. 前記第２の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む、請求項２４６に記載の方法。
  248. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項１５５から２４７までのいずれか一項に記載の方法。
  249. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項２４８に記載の方法。
  250. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項２４９に記載の方法。
  251. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１５５から２５０までのいずれか一項に記載の方法。
  252. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項２５１に記載の方法。
  253. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項２５２に記載の方法。
  254. 前記第２の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１５５から２５３までのいずれか一項に記載の方法。
  255. 前記第２の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項２５４に記載の方法。
  256. 前記第２の培養培地が、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１５５から２５５までのいずれか一項に記載の方法。
  257. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項２５６に記載の方法。
  258. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項２５６に記載の方法。
  259. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項２５６に記載の方法。
  260. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項２５６に記載の方法。
  261. 前記第２の培養培地が、脂質を含む、請求項１５５から２６０までのいずれか一項に記載の方法。
  262. ステップ（ｂ）の前記バッチ培養または流加培養を約４日～約１０日にわたって実施する、請求項１５５から２６１までのいずれか一項に記載の方法。
  263. ステップ（ｂ）の前記バッチ培養または流加培養を約５日～約８日にわたって実施する、請求項２６２に記載の方法。
  264. ステップ（ａ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である、請求項１５５から２６３までのいずれか一項に記載の方法。
  265. ステップ（ａ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である、請求項２６４に記載の方法。
  266. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである、請求項１５５から２６５までのいずれか一項に記載の方法。
  267. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、５Ｌ～約５，０００Ｌである、請求項２６６に記載の方法。
  268. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約２，５００Ｌである、請求項２６７に記載の方法。
  269. ステップ（ｃ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約１００Ｌである、請求項２６８に記載の方法。
  270. ステップ（ｄ）が、前記第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項１５５から２６９までのいずれか一項に記載の方法。
  271. ステップ（ｄ）が、前記第３の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項２７０に記載の方法。
  272. ステップ（ｄ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項１５５から２７１までのいずれか一項に記載の方法。
  273. ステップ（ｄ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項２７２に記載の方法。
  274. ステップ（ｄ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項２７３に記載の方法。
  275. ステップ（ｄ）における前記灌流培養が、
    （ｉ）追加的な体積の前記第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加すること、および
    （ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加すること
    を含む、請求項１５５から２７４までのいずれか一項に記載の方法。
  276. （ｉ）における前記追加的な体積の第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または
    （ｉｉ）における前記追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第２の期間にわたって連続的に添加する、
    請求項２７５に記載の方法。
  277. （ｉ）における前記追加的な体積の第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第１の期間にわたって定期的に添加し、かつ／または
    （ｉｉ）における前記追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第２の期間にわたって定期的に添加する、
    請求項２７５に記載の方法。
  278. （ｉ）における前記第１の期間が、約１日～約７日である、請求項２７５から２７７までのいずれか一項に記載の方法。
  279. （ｉ）における前記第１の期間が、約３日～約５日である、請求項２７８に記載の方法。
  280. （ｉｉ）における前記第２の期間が、約１日～約１０日である、請求項２７５から２７９までのいずれか一項に記載の方法。
  281. （ｉｉ）における前記第２の期間が、約３日～約７日である、請求項２８０に記載の方法。
  282. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む、請求項１５５から２８１までのいずれか一項に記載の方法。
  283. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む、請求項２８２に記載の方法。
  284. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのそれぞれを含む、請求項２８３に記載の方法。
  285. 前記第３の培養培地が、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項１５５から２８４までのいずれか一項に記載の方法。
  286. 前記第３の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項２８５に記載の方法。
  287. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項１５５から２８６までのいずれか一項に記載の方法。
  288. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項２８７に記載の方法。
  289. 前記第３の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む、請求項２８８に記載の方法。
  290. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項１５５から２８９までのいずれか一項に記載の方法。
  291. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項２９０に記載の方法。
  292. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項２９１に記載の方法。
  293. 前記第３の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項１５５から２９２までのいずれか一項に記載の方法。
  294. 前記第３の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項２９３に記載の方法。
  295. 前記第３の培養培地が、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項１５５から２９４までのいずれか一項に記載の方法。
  296. 前記第３の培養培地が、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミンまたはＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項２９５に記載の方法。
  297. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項２９６に記載の方法。
  298. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項２９６に記載の方法。
  299. 前記第３の培養培地が、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む、請求項１５５から２９８までのいずれか一項に記載の方法。
  300. 前記第３の培養培地が、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む、請求項２９９に記載の方法。
  301. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む、請求項２７５から３００までのいずれか一項に記載の方法。
  302. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む、請求項３０１に記載の方法。
  303. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのそれぞれを含む、請求項３０２に記載の方法。
  304. 前記第４の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項２７５から３０３までのいずれか一項に記載の方法。
  305. 前記第４の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３０４に記載の方法。
  306. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項２７５から３０５までのいずれか一項に記載の方法。
  307. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項３０６に記載の方法。
  308. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項３０７に記載の方法。
  309. 前記第４の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項２７５から３０８までのいずれか一項に記載の方法。
  310. 前記第４の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項３０９に記載の方法。
  311. 前記第４の培養培地が、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項２７５から３１０までのいずれか一項に記載の方法。
  312. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンまたはＬ－グリシル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項３１１に記載の方法。
  313. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項３１２に記載の方法。
  314. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項３１２に記載の方法。
  315. 前記第４の培養培地が、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む、請求項２７５から３１４までのいずれか一項に記載の方法。
  316. 前記第４の培養培地が、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む、請求項３１５に記載の方法。
  317. ステップ（ｄ）の前記灌流培養を、約８日～約１５日にわたって実施する、請求項１５５から３１６までのいずれか一項に記載の方法。
  318. ステップ（ｄ）の前記灌流培養を、約９日～約１３日にわたって実施する、請求項３１７に記載の方法。
  319. ステップ（ｃ）の最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０５個である、請求項１５５から３１８までのいずれか一項に記載の方法。
  320. ステップ（ｃ）の最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０５個である、請求項３１９に記載の方法。
  321. ステップ（ｄ）における前記灌流培養が、接線濾過の使用を含む、請求項１５５から３２０までのいずれか一項に記載の方法。
  322. 前記接線濾過が、交互接線濾過（ＡＴＦ）である、請求項３２１に記載の方法。
  323. 前記接線濾過が、平均孔径が約１０ｎｍ～約６．０μｍのフィルターの使用を含む、請求項３２１または３２２に記載の方法。
  324. 前記フィルターの平均孔径が、約０．１μｍ～約３．０μｍである、請求項３２３に記載の方法。
  325. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項１５５から３２４までのいずれか一項に記載の方法。
  326. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項３２５に記載の方法。
  327. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項３２６に記載の方法。
  328. 脱核赤血球細胞の集団を生成する方法であって、
    （ａ）ある体積の赤血球前駆細胞の第１の細胞培養物を灌流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１×１０７個である第２の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｂ）前記第２の細胞培養物を約２日～約１５日にわたって灌流培養するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）のある体積の前記第２の細胞培養物を容器中に含まれる第３の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約１×１０５～約１×１０７個である第３の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）の前記第３の細胞培養物を約５日～２０日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと、
    を含み、
    ステップ（ｄ）の後、前記第３の培養培地が脱核赤血球細胞の集団を含む、方法。
  329. ステップ（ａ）の前に、
    （ｉ）複数の赤血球前駆細胞を容器中に含まれる第１の培養培地中に配置して、最初の細胞密度が１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０６個の前記第１の細胞培養物をもたらすステップと、
    （ｉｉ）前記第１の細胞培養物を約１日～約１５日にわたってバッチ培養または流加培養するステップと
    をさらに含む、請求項３２８に記載の方法。
  330. ステップ（ｉ）の前記容器が振とうフラスコである、請求項３２９に記載の方法。
  331. 前記振とうフラスコの容積が、約１５ｍＬ～約３Ｌである、請求項３３０に記載の方法。
  332. 前記振とうフラスコの容積が、約５０ｍＬ～約１．５Ｌである、請求項３３１に記載の方法。
  333. 前記振とうフラスコの容積が、約１００ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項３３２に記載の方法。
  334. ステップ（ｉｉ）が、前記振とうフラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項３２９から３３３までのいずれか一項に記載の方法。
  335. ステップ（ｉｉ）が、前記振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項３３４に記載の方法。
  336. ステップ（ｉ）の前記容器が振とう管である、請求項３２９に記載の方法。
  337. 前記振とう管の容積が、約２ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項３３６に記載の方法。
  338. 前記振とう管の容積が、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである、請求項３３７に記載の方法。
  339. 前記振とう管の容積が、約５０ｍＬ～約２００ｍＬである、請求項３３８に記載の方法。
  340. 前記振とう管が円錐容器である、請求項３３６から３３９までのいずれか一項に記載の方法。
  341. ステップ（ｉｉ）が、前記振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項３３６から３４０までのいずれか一項に記載の方法。
  342. ステップ（ｉｉ）が、前記振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項３４１に記載の方法。
  343. ステップ（ｉ）の前記容器が培養バッグである、請求項３２９に記載の方法。
  344. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約２５Ｌである、請求項３４３に記載の方法。
  345. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５Ｌである、請求項３４４に記載の方法。
  346. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項３４５に記載の方法。
  347. ステップ（ｉｉ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む、請求項３４３から３４６までのいずれか一項に記載の方法。
  348. ステップ（ｉｉ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む、請求項３４７に記載の方法。
  349. ステップ（ｉｉ）が、前記第１の細胞培養物をバッチ培養することを含む、請求項３２９から３４８までのいずれか一項に記載の方法。
  350. ステップ（ｉｉ）が、前記第１の細胞培養物を流加培養することを含む、請求項３２９から３４８までのいずれか一項に記載の方法。
  351. 流加培養が、追加的な体積の前記第１の培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む、請求項３５０に記載の方法。
  352. 前記追加的な体積の第１の培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する、請求項３５１に記載の方法。
  353. 前記追加的な体積の第１の細胞培養培地を前記第１の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する、請求項３５１に記載の方法。
  354. 前記第１の培養培地が、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のうちの１つまたは複数を含む、請求項３２９から３５３までのいずれか一項に記載の方法。
  355. 前記第１の培養培地が、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ－３、およびＩＬ－６のそれぞれを含む、請求項３５４に記載の方法。
  356. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む、請求項３５４または３５５に記載の方法。
  357. 前記第１の培養培地が、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ－３リガンドを含む、請求項３５６に記載の方法。
  358. 前記第１の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項３２９から３５７までのいずれか一項に記載の方法。
  359. 前記第１の培養培地が、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項３５８に記載の方法。
  360. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項３２９から３５９までのいずれか一項に記載の方法。
  361. 前記第１の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む、請求項３２９から３６０までのいずれか一項に記載の方法。
  362. 前記第１の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６を含む、請求項３６１に記載の方法。
  363. 前記第１の培養培地が、約１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンをさらに含む、請求項３２９から３６２までのいずれか一項に記載の方法。
  364. 前記第１の培養培地が、約８μｇ／ｍＬ～約１２μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項３６３に記載の方法。
  365. 前記第１の培養培地が、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項３２９から３６４までのいずれか一項に記載の方法。
  366. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項３６５に記載の方法。
  367. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項３６５に記載の方法。
  368. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項３６５に記載の方法。
  369. 前記第１の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項３６５に記載の方法。
  370. 前記第１の培養培地が、脂質を含む、請求項３２９から３６９までのいずれか一項に記載の方法。
  371. 前記第１の培養培地が、約５０μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３２９から３７０までのいずれか一項に記載の方法。
  372. 前記第１の培養培地が、約１５０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３７１に記載の方法。
  373. 前記第１の培養培地が、約１６０μｇ／ｍＬ～約２４０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３７２に記載の方法。
  374. 前記第１の培養培地が、約１８０μｇ／ｍＬ～約２２０μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３７３に記載の方法。
  375. ステップ（ｉｉ）の前記バッチ培養または流加培養を約５日～約１２日にわたって実施する、請求項３２９から３７４までのいずれか一項に記載の方法。
  376. ステップ（ｉｉ）の前記バッチ培養または流加培養を約５日～約９日にわたって実施する、請求項３７５に記載の方法。
  377. ステップ（ｉ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である、請求項３２９から３７６までのいずれか一項に記載の方法。
  378. ステップ（ｉ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である、請求項３７７に記載の方法。
  379. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５００ｍＬ～約１５，０００Ｌである、請求項３２８から３７８までのいずれか一項に記載の方法。
  380. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、５Ｌ～約５，０００Ｌである、請求項３７９に記載の方法。
  381. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約２，５００Ｌである、請求項３８０に記載の方法。
  382. ステップ（ａ）における前記灌流バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約１００Ｌである、請求項３８１に記載の方法。
  383. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項３２８から３８２までのいずれか一項に記載の方法。
  384. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項３８３に記載の方法。
  385. ステップ（ｂ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約０．５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約４０ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項３２８から３８４までのいずれか一項に記載の方法。
  386. ステップ（ｂ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約５ｎＬ～１日当たり細胞当たり約３５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項３８５に記載の方法。
  387. ステップ（ｂ）における前記灌流培養を、１日当たり細胞当たり約１０ｎＬ～１日当たり細胞当たり約２５ｎＬの灌流速度を使用して実施する、請求項３８６に記載の方法。
  388. ステップ（ｂ）における前記灌流培養が、追加的な体積の前記第２の培養培地を前記第２の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む、請求項３２８から３８７までのいずれか一項に記載の方法。
  389. 前記追加的な体積の第２の培養培地を、前記第２の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する、請求項３８８に記載の方法。
  390. 前記追加的な体積の第２の培養培地を前記第２の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する、請求項３８８に記載の方法。
  391. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびインスリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項３２８から３９０までのいずれか一項に記載の方法。
  392. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのうちの３つまたはそれよりも多くを含む、請求項３９１に記載の方法。
  393. 前記第２の培養培地が、トランスフェリン、ＩＬ－３、ＳＣＦ、デキサメタゾン、ＥＰＯ、およびインスリンのそれぞれを含む、請求項３９２に記載の方法。
  394. 前記第２の培養培地が、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３２８から３９３までのいずれか一項に記載の方法。
  395. 前記第２の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３９４に記載の方法。
  396. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項３２８から３９５までのいずれか一項に記載の方法。
  397. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項３９６に記載の方法。
  398. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を含む、請求項３９７に記載の方法。
  399. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項３２８から３９８までのいずれか一項に記載の方法。
  400. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項３９９に記載の方法。
  401. 前記第２の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む、請求項４００に記載の方法。
  402. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約２００ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項３２８から４０１までのいずれか一項に記載の方法。
  403. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項４０２に記載の方法。
  404. 前記第２の培養培地が、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭのデキサメタゾンを含む、請求項４０３に記載の方法。
  405. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項３２８から４０４までのいずれか一項に記載の方法。
  406. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項４０５に記載の方法。
  407. 前記第２の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項４０６に記載の方法。
  408. 前記第２の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項３２８から４０７までのいずれか一項に記載の方法。
  409. 前記第２の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項４０８に記載の方法。
  410. 前記第２の培養培地が、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項３２８から４０９までのいずれか一項に記載の方法。
  411. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項４１０に記載の方法。
  412. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項４１０に記載の方法。
  413. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＬ－グリシル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項４１０に記載の方法。
  414. 前記第２の培養培地が、約５ｍＭ～約７ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項４１０に記載の方法。
  415. 前記第２の培養培地が、脂質を含む、請求項３２８から４１４までのいずれか一項に記載の方法。
  416. ステップ（ｂ）の前記灌流培養を約４日～約１０日にわたって実施する、請求項３２８から４１５までのいずれか一項に記載の方法。
  417. ステップ（ｂ）の前記灌流培養を約５日～約８日にわたって実施する、請求項４１６に記載の方法。
  418. ステップ（ａ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．１×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約２×１０５個である、請求項３２８から４１７までのいずれか一項に記載の方法。
  419. ステップ（ａ）における最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約０．５×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約１．５×１０５個である、請求項４１８に記載の方法。
  420. ステップ（ｃ）の前記容器が振とうフラスコである、請求項３２８から４１９までのいずれか一項に記載の方法。
  421. 前記振とうフラスコの容積が、約１５ｍＬ～約３Ｌである、請求項４２０に記載の方法。
  422. 前記振とうフラスコの容積が、約５０ｍＬ～約１．５Ｌである、請求項４２１に記載の方法。
  423. 前記振とうフラスコの容積が、約１００ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項４２２に記載の方法。
  424. ステップ（ｄ）が、前記振とうフラスコを約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項３２８から４２３までのいずれか一項に記載の方法。
  425. ステップ（ｄ）が、前記振とうフラスコを約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項４２４に記載の方法。
  426. ステップ（ｃ）の前記容器が振とう管である、請求項３２８から４１９までのいずれか一項に記載の方法。
  427. 前記振とう管の容積が、約２ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項４２６に記載の方法。
  428. 前記振とう管の容積が、約１０ｍＬ～約２５０ｍＬである、請求項４２７に記載の方法。
  429. 前記振とう管の容積が、約５０ｍＬ～約２００ｍＬである、請求項４２８に記載の方法。
  430. 前記振とう管が円錐容器である、請求項４２６から４２９までのいずれか一項に記載の方法。
  431. ステップ（ｄ）が、前記振とう管を約０．１×ｇ～約４．１×ｇでインキュベートすることを含む、請求項４２６から４３０までのいずれか一項に記載の方法。
  432. ステップ（ｄ）が、前記振とう管を約０．２３×ｇ～約１．７８×ｇでインキュベートすることを含む、請求項４３１に記載の方法。
  433. ステップ（ｃ）の前記容器が培養バッグである、請求項３２８から４１９までのいずれか一項に記載の方法。
  434. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約２５Ｌである、請求項４３３に記載の方法。
  435. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５Ｌである、請求項４３４に記載の方法。
  436. 前記培養バッグの容積が、約５０ｍＬ～約５００ｍＬである、請求項４３５に記載の方法。
  437. ステップ（ｄ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約５０揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることをさらに含む、請求項４３３から４３６までのいずれか一項に記載の方法。
  438. ステップ（ｄ）が、前記培養バッグを毎分約１０揺動サイクル～毎分約２５揺動サイクルの揺動速度でインキュベートすることを含む、請求項４３７に記載の方法。
  439. ステップ（ｃ）における前記容器が、バイオリアクターである、請求項３２８から４１９までのいずれか一項に記載の方法。
  440. 前記バイオリアクターの容積が、１Ｌ～約１５，０００Ｌである、請求項４３９に記載の方法。
  441. 前記バイオリアクターの容積が、５Ｌ～約５，０００Ｌである、請求項４４０に記載の方法。
  442. 前記バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約２，５００Ｌである、請求項４４１に記載の方法。
  443. 前記バイオリアクターの容積が、約５Ｌ～約１００Ｌである、請求項４４２に記載の方法。
  444. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約２００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項４３９から４４３までのいずれか一項に記載の方法。
  445. ステップ（ｂ）が、前記第２の細胞培養物を約１０Ｗ／ｍ３～約１００Ｗ／ｍ３のＰ／Ｖ値で撹拌することを含む、請求項４４４に記載の方法。
  446. ステップ（ｄ）が、前記第３の細胞培養物をバッチ培養することを含む、請求項３２８から４４５までのいずれか一項に記載の方法。
  447. ステップ（ｄ）が、前記第３の細胞培養物を流加培養することを含む、請求項３２８から４４５までのいずれか一項に記載の方法。
  448. 流加培養が、追加的な体積の前記第３の培養培地を前記第３の細胞培養物にある期間にわたって添加することを含む、請求項４４７に記載の方法。
  449. 前記追加的な体積の第３の培養培地を前記第３の細胞培養物にある期間にわたって連続的に添加する、請求項４４８に記載の方法。
  450. 前記追加的な体積の第３の細胞培養培地を前記第３の細胞培養物にある期間にわたって定期的に添加する、請求項４４８に記載の方法。
  451. ステップ（ｄ）における前記バッチ培養および流加培養が、
    （ｉ）追加的な体積の前記第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に第１の期間にわたって添加すること、および
    （ｉｉ）追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に第２の期間にわたって添加すること
    を含む、請求項３２８から４５０までのいずれか一項に記載の方法。
  452. （ｉ）における前記追加的な体積の第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第１の期間にわたって連続的に添加し、かつ／または
    （ｉｉ）における前記追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第２の期間にわたって連続的に添加する、
    請求項４５１に記載の方法。
  453. （ｉ）における前記追加的な体積の第３の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第１の期間にわたって定期的に添加し、かつ／または
    （ｉｉ）における前記追加的な体積の第４の培養培地を前記第３の細胞培養物に前記第２の期間にわたって定期的に添加する、
    請求項４５１に記載の方法。
  454. （ｉ）における前記第１の期間が、約１日～約７日である、請求項４５１から４５３までのいずれか一項に記載の方法。
  455. （ｉ）における前記第１の期間が、約３日～約５日である、請求項４５４に記載の方法。
  456. （ｉｉ）における前記第２の期間が、約１日～約１０日である、請求項４５１から４５５までのいずれか一項に記載の方法。
  457. （ｉｉ）における前記第２の期間が、約３日～約７日である、請求項４５６に記載の方法。
  458. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む、請求項３２８から４５７までのいずれか一項に記載の方法。
  459. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む、請求項４５８に記載の方法。
  460. 前記第３の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、ＳＣＦ、およびＥＰＯのそれぞれを含む、請求項４５９に記載の方法。
  461. 前記第３の培養培地が、約１μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約５００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項３２８から４６０までのいずれか一項に記載の方法。
  462. 前記第３の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約３００μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項４６１に記載の方法。
  463. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項３２８から４６２までのいずれか一項に記載の方法。
  464. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む、請求項４６３に記載の方法。
  465. 前記第３の培養培地が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｎＬのＳＣＦを含む、請求項４６４に記載の方法。
  466. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項３２８から４６５までのいずれか一項に記載の方法。
  467. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項４６６に記載の方法。
  468. 前記第３の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項４６７に記載の方法。
  469. 前記第３の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項３２８から４６８までのいずれか一項に記載の方法。
  470. 前記第３の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項４６９に記載の方法。
  471. 前記第３の培養培地が、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項３２８から４７０までのいずれか一項に記載の方法。
  472. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項４７１に記載の方法。
  473. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項４７２に記載の方法。
  474. 前記第３の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項４７２に記載の方法。
  475. 前記第３の培養培地が、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む、請求項３２８から４７４までのいずれか一項に記載の方法。
  476. 前記第３の培養培地が、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む、請求項４７５に記載の方法。
  477. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの１つまたは複数を含む、請求項４５１から４７６までのいずれか一項に記載の方法。
  478. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのうちの２つまたはそれよりも多くを含む、請求項４７７に記載の方法。
  479. 前記第４の培養培地が、トランスフェリン、インスリン、およびＥＰＯのそれぞれを含む、請求項４７８に記載の方法。
  480. 前記第４の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約２ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項４５１から４７９までのいずれか一項に記載の方法。
  481. 前記第４の培養培地が、約１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン～約１．５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む、請求項４８０に記載の方法。
  482. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項４５１から４８１までのいずれか一項に記載の方法。
  483. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項４８２に記載の方法。
  484. 前記第４の培養培地が、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＥＰＯを含む、請求項４８３に記載の方法。
  485. 前記第４の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項４５１から４８４までのいずれか一項に記載の方法。
  486. 前記第４の培養培地が、約０．１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬのインスリンを含む、請求項４８５に記載の方法。
  487. 前記第４の培養培地が、約１ｍＭ～約８ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項４５１から４８６までのいずれか一項に記載の方法。
  488. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシル－Ｌ－グルタミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン、またはこれらの組合せを含む、請求項４８７に記載の方法。
  489. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－グルタミンを含む、請求項４８８に記載の方法。
  490. 前記第４の培養培地が、約３ｍＭ～約５ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む、請求項４８８に記載の方法。
  491. 前記第４の培養培地が、約０．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの血清を含む、請求項４５１から４９０までのいずれか一項に記載の方法。
  492. 前記第４の培養培地が、約４％ｖ／ｖ～約６％ｖ／ｖの血清を含む、請求項４９１に記載の方法。
  493. ステップ（ｄ）の前記バッチ培養または流加培養を約８日～約１５日にわたって実施する、請求項３２８から４９２までのいずれか一項に記載の方法。
  494. ステップ（ｄ）の前記バッチ培養または流加培養を約９日～約１３日にわたって実施する、請求項４９３に記載の方法。
  495. ステップ（ｃ）の最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約２．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約８．０×１０５個である、請求項３２８から４９４までのいずれか一項に記載の方法。
  496. ステップ（ｃ）の最初の細胞密度が、１ｍＬ当たり細胞約４．０×１０５個～１ｍＬ当たり細胞約６．０×１０５個である、請求項４９５に記載の方法。
  497. ステップ（ｂ）における前記灌流培養が、接線濾過の使用を含む、請求項３２８から４９６までのいずれか一項に記載の方法。
  498. 前記接線濾過が、交互接線濾過（ＡＴＦ）である、請求項４９７に記載の方法。
  499. 前記接線濾過が、平均孔径が約１０ｎｍ～約６．０μｍのフィルターの使用を含む、請求項４９７または４９８に記載の方法。
  500. 前記フィルターの平均孔径が、約０．１μｍ～約３．０μｍである、請求項４９９に記載の方法。
  501. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０６個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項３２８から５００までのいずれか一項に記載の方法。
  502. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約１×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項５０１に記載の方法。
  503. ステップ（ｄ）の結果、細胞密度が、１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約５×１０７個～１ｍＬ当たり脱核赤血球細胞約２×１０８個になる、請求項５０２に記載の方法。
  504. 前記赤血球前駆細胞が、ヒト赤血球前駆細胞である、請求項１から５０３までのいずれか一項に記載の方法。
  505. 前記赤血球前駆細胞がＯ型陰性ヒトドナーから得られるものである、請求項５０４に記載の方法。
  506. 前記赤血球前駆細胞がＯ型陰性かつＫｅｌｌ陰性ヒトドナーから得られるものである、請求項５０５に記載の方法。
  507. 前記脱核赤血球細胞の集団が、脱核ヒト赤血球細胞の集団である、請求項１から５０６までのいずれか一項に記載の方法。
  508. （ｅ）ステップ（ｄ）における前記第３の細胞培養物から前記脱核赤血球細胞の集団を単離するステップをさらに含む、請求項１から５０７までのいずれか一項に記載の方法。
  509. （ｆ）ステップ（ｅ）において単離された前記脱核赤血球細胞の集団を製剤化するステップをさらに含む、請求項５０８に記載の方法。
  510. （ｇ）ステップ（ｆ）において前記製剤化された脱核赤血球細胞の集団を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む、請求項５０９に記載の方法。
  511. ステップ（ａ）の前に、前記第１の細胞培養物中の前記赤血球前駆細胞に核酸を導入するステップをさらに含み、
    操作された脱核赤血球細胞の集団の産生がもたらされる、
    請求項１から５０６までのいずれか一項に記載の方法。
  512. 前記操作された脱核赤血球細胞の集団が、操作された脱核ヒト赤血球細胞である、請求項５１１に記載の方法。
  513. 前記核酸が、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードするものである、請求項５１１または５１２に記載の方法。
  514. 前記操作されたヒト脱核赤血球細胞が、１つまたは複数の外因性タンパク質を含む、請求項５１１から５１３までのいずれか一項に記載の方法。
  515. １つまたは複数の外因性タンパク質を前記細胞にクリックコンジュゲートすることをさらに含む、請求項５１４に記載の方法。
  516. 前記細胞に低浸透圧でロードすることをさらに含む、請求項５１４に記載の方法。
  517. 前記細胞に物理的操作によりロードすることをさらに含む、請求項５１４に記載の方法。
  518. 前記１つまたは複数の外因性タンパク質のうちの１つが、前記操作されたヒト脱核赤血球細胞の細胞質基質内に存在する、請求項５１４から５１７までのいずれか一項に記載の方法。
  519. 前記１つまたは複数の外因性タンパク質のうちの１つが、前記操作されたヒト脱核赤血球細胞の膜に存在するタンパク質である、請求項５１４から５１８までのいずれか一項に記載の方法。
  520. 前記１つまたは複数の外因性タンパク質のうちの１つがフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが前記操作されたヒト脱核赤血球細胞の細胞質基質内に存在する、請求項５１４から５１７までのいずれか一項に記載の方法。
  521. 前記１つまたは複数の外因性タンパク質が、免疫調節分子を含む、請求項５１４から５１７までのいずれか一項に記載の方法。
  522. 前記１つまたは複数の外因性タンパク質が、抗原提示分子を含む、請求項５１４から５１７までのいずれか一項に記載の方法。
  523. （ｅ）ステップ（ｄ）における前記第３の細胞培養物から前記操作された脱核赤血球細胞の集団を単離するステップをさらに含む、請求項５１１から５２２までのいずれか一項に記載の方法。
  524. （ｆ）ステップ（ｅ）において単離された前記操作された脱核赤血球細胞の集団を製剤化するステップをさらに含む、請求項５２３に記載の方法。
  525. （ｇ）ステップ（ｆ）において前記製剤化された操作された脱核赤血球細胞の集団を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む、請求項５２４に記載の方法。
  526. 請求項１から５０８までのいずれか一項に記載の方法によって産生される脱核赤血球細胞の集団。
  527. 請求項５０９に記載の方法によって作製される製剤。
  528. 請求項５１１から５２３までのいずれか一項に記載の方法によって産生される脱核赤血球細胞の集団。
  529. 請求項５２４に記載の方法によって作製される製剤。
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