TW202241470A - 治療人類個體腫瘤之方法 - Google Patents

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克里斯蒂娜 庫格林
巴勃羅 卡諾尼
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Abstract

本文提供了治療人類個體癌症的方法，該方法包括投予含有人類去核類紅血球的醫藥組合物。

Description

治療人類個體腫瘤之方法
相關申請的交叉引用
本申請案主張2021年1月8日提交的美國臨時專利申請號63/135,520、2021年1月8日提交的美國臨時專利申請號63/135,525、2021年1月8日提交的美國臨時專利申請號63/135,542、2021年3月14日提交的美國臨時專利申請號63/160,860、2021年3月14日提交的美國臨時專利申請號63/160,859、2021年3月15日提交的美國臨時專利申請號63/161,266以及2021年11月29日提交的美國臨時專利申請號63/283,841的優先權。這些先申請案的揭露被視為本申請案所公開的一部分，且其全部內容併入本案中。
本發明廣泛地涉及治療人類個體腫瘤之方法，包括給予該個體人類去核類紅血球。
序列表
本申請案包含以電子方式提交的序列表，其是檔名為47472-0081WO1_ST25.txt的ASCII文字檔。該文字檔於2022年1月6日建立，檔案大小為63 KB。該ASCII 文字檔中的內容在此透過引用方式完整併入本案中。
關於經工程化的去核類紅血球，目前正在將其開發作為可攜帶或呈現外源性多肽的治療劑，並投予有需要的患者。
本文提供了治療有需要之人類個體中固態腫瘤或非固態腫瘤的方法，其包括透過靜脈給藥方式，以約每2周至約每47天一次的給藥頻率，向人類個體投予含有約1×10 8至約1×10 11人類去核類紅血球的醫藥組合物，其包含一具有位於其細胞外表面上的(i) IL-15或其功能性片段以及(ii) IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：肛門癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、 胃食道癌、胃食道連接處腺癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤和肉瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，人類個體罹有非固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述非固態腫瘤是白血病或淋巴癌。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述白血病為急性骨髓性白血病 (AML)。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每2週一次至約每4週一次。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每3週一次。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包含約1×10 10至約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包含約3×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包含約3×10 10至約7×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包含約5×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該方法包括在誘導期向人類個體投予該至少三劑，並在維持期向人類個體投予一或多劑。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之該至少三劑包括約1×10 10至約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之該至少三劑包括約3×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期是以大約每3週一次的給藥頻率向人類個體投予該至少三劑。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑包括約1×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑中的第一劑，是在誘導期向人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後給予該人類個體。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑包括約3×10 10至約7×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑包括約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期是以大約每3週一次的給藥頻率向人類個體投予該至少三劑。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之該一或多劑包括約1×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑中的第一劑，是在誘導期向人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後給予該人類個體。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類去核類紅血球包含至少1,000複製的第一外源性多肽和至少1,000複製的第二外源性多肽。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述人類去核類紅血球是藉由以下過程所製成，該過程包括：將編碼第一外源性多肽的核酸以及編碼第二外源性多肽的核酸引入到有核類紅血球前驅細胞中；在足以表現第一外源性多肽和第二外源性多肽的條件下，將有核類紅血球前驅細胞進行培養；將有核類紅血球前驅細胞進行去核。
本文另外還提供了治療有需要之人類個體中固態腫瘤的方法，其包括透過靜脈給藥方式，向人類個體投予(a) 含有約1×10 8至約1×10 11人類去核類紅血球的醫藥組合物以及(b) 含有免疫檢查點抑制劑的醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的IL-15或其功能性片段以及IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：肛門癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、 胃食道癌、胃食道連接處腺癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤和肉瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)醫藥組合物的劑量包括約5×10 9至約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)醫藥組合物的劑量包括約1×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)醫藥組合物的劑量包括約3×10 10至約7×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)醫藥組合物的劑量包括約5×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，免疫檢查點抑制劑是pembrolizumab(帕博利珠單抗)。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(b)醫藥組合物的劑量包括約180毫克至約220毫克的帕博利珠單抗。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(b)醫藥組合物的劑量包括約200毫克的帕博利珠單抗。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)醫藥組合物的劑量和(b)醫藥組合物的劑量基本上是在同一時間投予。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在將(b)醫藥組合物的劑量投予於個體之前，先將(a)醫藥組合物的劑量投予於個體。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在將(a)醫藥組合物的劑量投予於個體之前，先將(b)醫藥組合物的劑量投予於個體。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該方法包括以約每2周至約每47天一次的給藥頻率，在誘導期向人類個體投予至少三劑的(a)醫藥組合物，並在維持期向人類個體投予一劑或更多劑的(a)醫藥組合物。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑包括約1×10 10至約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑包括約3×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期是以大約每3週一次的給藥頻率向人類個體投予至少三劑的醫藥組合物。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑包括約1×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑中的第一劑，是在誘導期向人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後向該人類個體進行給藥。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑包括約3×10 10至約7×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑包括約5×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期是以大約每3週一次的給藥頻率向人類個體投予至少三劑。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑包括約1×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑中的第一劑，是在誘導期向人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後向該人類個體進行給藥。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該方法包括以大約每3週一次的給藥頻率投予二劑或更多劑的(b)醫藥組合物。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，免疫檢查點抑制劑是帕博利珠單抗。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的(b)醫藥組合物包括約180毫克至約220毫克的帕博利珠單抗。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的(b)醫藥組合物包括約200毫克的帕博利珠單抗。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類去核類紅血球包含至少1,000複製的第一外源性多肽和至少1,000複製的第二外源性多肽。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述人類去核類紅血球是藉由以下過程所製成，該過程包括：將編碼第一外源性多肽的核酸以及編碼第二外源性多肽的核酸引入到有核類紅血球前驅細胞中；在足以表現第一外源性多肽和第二外源性多肽的條件下，將有核類紅血球前驅細胞進行培養；將有核類紅血球前驅細胞進行去核。
本文另外還提供了治療有需要之成年人類個體中急性骨髓性白血病的方法，其包括透過靜脈給藥方式，以約每3周至約每5周一次的給藥頻率，向成年人類個體投予含有約5×10 7至約5×10 10人類去核類紅血球的醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的IL-15或其功能性片段以及IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其細胞外表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，急性骨髓性白血病是復發的或是難以用急性骨髓性白血病之標準療法進行治療的急性骨髓性白血病。 在本文描述之任何方法的一些實施方案中，急性骨髓性白血病是經細胞學診斷證實的急性骨髓性白血病。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每25天一次至約每35天一次。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每4週一次。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 7至約5×10 8人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 8人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 8至約5×10 9人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 9人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 9至約5×10 9人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約3×10 9人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 9至約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類去核類紅血球包含至少1,000複製的第一外源性多肽和至少1,000複製的第二外源性多肽。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述人類去核類紅血球是藉由以下過程所製成，該過程包括：將編碼第一外源性多肽的核酸以及編碼第二外源性多肽的核酸引入到人類有核類紅血球前驅細胞中；在足以表現第一外源性多肽和第二外源性多肽的條件下，將人類有核類紅血球前驅細胞進行培養；將人類有核類紅血球前驅細胞進行去核。
本文另外還提供了治療有需要之成年人類個體中固態腫瘤的方法，其包括：(a)透過靜脈給藥方式，向成年人類個體投予含有約1×10 9至約1×10 10人類去核類紅血球的第一劑醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的(i)IL-15或其功能性片段、以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽；(b)在步驟(a)後約5天至約9天，透過腫瘤內給藥方式，投予含有約8×10 8至約8×10 9人類去核類紅血球的第二劑醫藥組合物；(c)在步驟(b)後約5天至約9天，透過腫瘤內給藥方式，投予含有約8×10 8至約8×10 9人類去核類紅血球的第三劑醫藥組合物；以及(d)在步驟(a)後約3周至約5周，透過靜脈給藥方式，投予含有約5×10 7至約5×10 10人類去核類紅血球的第四劑醫藥組合物。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該方法還包括(e)在步驟(d)後約3周至約5周，以約每3周至約每5周一次的給藥頻率，額外投予一劑或更多劑含有約5×10 7至約5×10 10人類去核類紅血球的醫藥組合物。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該成年人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、胃食道癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該成年人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤和肉瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每25天一次至約每35天一次。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每4週一次。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述第一劑醫藥組合物包括約6×10 9人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，步驟(b)是在步驟(a)後約7天進行。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述第二劑醫藥組合物包括約2×10 9人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，步驟(c)是在步驟(b)後約7天進行。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述第三劑醫藥組合物包括約2×10 9人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，步驟(d)是在步驟(a)後約4週進行。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述第四劑醫藥組合物包括約1×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，步驟(e)是在步驟(d)後約4週進行。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約4週一次。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述額外一劑或更多劑的醫藥組合物包含約5×10 7至約5×10 8人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述額外一劑或更多劑的醫藥組合物包含約5×10 8至約5×10 9人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述額外一劑或更多劑的醫藥組合物包含約5×10 9至約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述額外一劑或更多劑的醫藥組合物包含約1×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類去核類紅血球包含至少1,000複製的外源性融合多肽和至少1,000複製的外源性多肽。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述人類去核類紅血球是藉由以下過程所製成，該過程包括：將編碼第一外源性多肽的核酸以及編碼第二外源性多肽的核酸引入到人類有核類紅血球前驅細胞中；在足以表現第一外源性多肽和第二外源性多肽的條件下，將人類有核類紅血球前驅細胞進行培養；將人類有核類紅血球前驅細胞進行去核。
本文還提供了治療有需要之成年人類個體中固態腫瘤的方法，其包括透過靜脈給藥方式，以約每3周至約每47天一次的給藥頻率，向成年人類個體投予含有約5×10 7至約5×10 10人類去核類紅血球的醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的(i)IL-15或其功能性片段以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該成年人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、胃食道癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該成年人類個體罹有選自於由下列癌症所組成之群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤和肉瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每3週一次至約每5週一次。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每25天一次至約每35天一次。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每4週一次。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約4週一次至約47天一次。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約6週一次。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 7至約5×10 8人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 8人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 8至約5×10 9人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 9人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 9至約5×10 9人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約3×10 9人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 9至約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約1×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該人類去核類紅血球包含至少1,000複製的第一外源性多肽和至少1,000複製的第二外源性多肽。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述人類去核類紅血球是藉由以下過程所製成，該過程包括：將編碼第一外源性多肽的核酸以及編碼第二外源性多肽的核酸引入到有核類紅血球前驅細胞中；在足以表現第一外源性多肽和第二外源性多肽的條件下，將有核類紅血球前驅細胞進行培養；將有核類紅血球前驅細胞進行去核。
術語「經工程化人類去核類紅血球」是指包含一種或多種 (例如：二、三、四、五或六種) 外源性多肽 (例如：本文所描述的或本領域已知的例示性外源性多肽的任意組合) 的人類去核類紅血球。舉例而言，經工程化人類去核類紅血球可以具有一種或多種存在其細胞質基質中的外源性多肽。在一些例子中，經工程化人類去核類紅血球可以具有一種或多種存在其細胞外表面上的外源性多肽。在一些例子中，經工程化人類去核類紅血球可以具有(i)一或多種存在其細胞質基質中的外源性多肽，以及(ii)一種或多種存在其細胞外表面上的外源性多肽。經工程化人類去核類紅血球的非限制性例子包括：接合的人類去核類紅血球、經低滲壓裝載的人類去核類紅血球以及透過物理操作 (例如：本文所描述的或本領域已知的任何例示性物理操作類型) 裝載的人類去核類紅血球。本文還描述了其他非限制性的經工程化人類去核類紅血球。
術語「接合的人類去核類紅血球」是指經工程化人類去核類紅血球，透過酵素和/或肽序列的催化活性，和/或化學反應，使其細胞膜上具有至少一種與另一種多肽 (例如：人類去核類紅血球的內源性多肽或不同的外源性多肽) 相互接合的外源性多肽。
術語「經低滲壓裝載的人類去核類紅血球」是指至少部分是藉由將人類去核類紅血球或人類類紅血球前驅細胞暴露於包含一種或多種外源性多肽的低離子強度緩衝液 (例如：任何本文所描述的例示性低離子強度緩衝液) 而生成的經工程化人類去核類紅血球。本文描述了可用於生成經低滲壓裝載的人類去核類紅血球之非限制性例示方法。其他用於生成經低滲壓裝載的人類去核類紅血球之方法在本領域中是已知的。
術語「透過物理操作裝載的人類去核類紅血球」是指至少部分是藉由將人類類紅血球前驅細胞以物理性操作方式而生成的人類去核類紅血球，致使編碼一種或多種外源性多肽的核酸 (例如：本文所描述的或本領域已知的任何例示性外源性多肽) 和/或一種或多種外源性多肽 (例如：本文所描述的任何外源性多肽) 被引入到人類類紅血球前驅細胞中。可用於將編碼一種或多種外源性多肽的核酸引入到人類類紅血球前驅細胞中的非限制性物理操作例子包括電穿孔和顆粒介導的轉染。其他可用於將編碼一種或多種外源性多肽的核酸引入到人類類紅血球前驅細胞中的物理操作例子是本領域已知的。
術語「外源性多肽」是指被引入到細胞內或細胞上的多肽，或是藉由將編碼多肽的外源性核酸引入到細胞或該細胞的前驅細胞內而引起細胞表現的多肽。在一些實施方案中，外源性多肽是由被引入到細胞或該細胞的前驅細胞內之外源性核酸所編碼的多肽，該核酸任選地不被細胞保留。在一些實施方案中，外源性多肽是透過化學或酶促手段進而與細胞外表面接合的多肽。本文描述了可存在於經工程化人類去核類紅血球中的外源性多肽的實例。
當詞語「在細胞外表面上」在外源性多肽的上下文中使用時，其是指 (1) 物理上附著在或至少部分嵌入到人類去核類紅血球細胞膜中的外源性多肽 (例如：跨膜多肽、外周膜多肽、脂質錨定多肽 (例如：GPI錨定多肽、N-肉豆蔻醯化多肽或S-棕櫚醯化多肽)) 或 (2) 與其同源受體穩定結合的外源性多肽，其中該同源受體是物理上附著在人類去核類紅血球的細胞膜上 (例如：與其同源受體結合的配體，其中該同源受體是物理上附著在人類去核類紅血球的細胞膜上)。用來確定外源性多肽是否存在於人類去核類紅血球的細胞外表面上的非限制性方法包括螢光活化細胞分選 (FACS)、免疫組織化學、細胞分離法和西方墨點法。
術語「人類類紅血球前驅細胞」是指能夠最終分化/發育成為人類去核類紅血球的人類細胞。在一些實施方案中，人類類紅血球前驅細胞是臍帶血幹細胞、CD34陽性細胞、造血幹/先驅細胞 (HSC、HSPC)、脾集落形成 (CFU-S) 細胞、普通骨髓先驅細胞 (CMP)、囊胚集落形成細胞、爆式類紅血球/紅血球集落形成單位 (BFU-E)、巨核細胞-類紅血球先驅細胞 (MEP)、類紅血球集落形成單位、或集落形成單位紅血球(CFU-E)、誘導多能幹細胞 (iPSC)、間質幹細胞 (MSC)、或其組合。
術語「成年人類個體」是指年齡18歲或以上的人 (例如：年齡20歲或以上、年齡25歲或以上、年齡30歲或以上、年齡35歲或以上、年齡40歲或以上、年齡45歲或以上、年齡50歲或以上、年齡55歲或以上、年齡60歲或以上、年齡65歲或以上、年齡70歲或以上、年齡75歲或以上、年齡80歲或以上、年齡85歲或以上、年齡90歲或以上、年齡95歲或以上或年齡100歲或以上)。
術語「兒科人類個體」是指年齡18歲以下的人 (例如：17歲及以下、16歲及以下、15歲及以下、14歲及以下、13歲及以下、12歲及以下、11歲及以下、10歲及以下、9歲及以下、8歲及以下、7歲及以下、6歲及以下、5歲及以下、4歲及以下、3歲及以下、2歲及以下或1歲及以下)。
如本文所用，「治療」是指人類個體 (例如：本文所描述的任何例示性人類個體) 中一種或多種醫學疾病或病症的症狀，在數量上、嚴重程度上、頻率上和/或持續時間上有所減少。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義均與本發明所屬領域之普通技術人員所通常理解的含義相同。用於本發明的方法和材料已描述於本文之中；本領域已知的其他適合方法和材料也可用於本發明。材料、方法和實施例均僅供解說之用，並非有意加以限制。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、資料庫條目和其他參考文獻均透過引用方式完整併入。
本發明的其他特徵和優點，將透過以下的詳細說明、圖式以及申請專利範圍加以清楚呈現。
本文提供了治療有需要之人類個體中固態腫瘤或非固態腫瘤的方法，其包括透過靜脈給藥方式，以約每2周至約每47天一次的給藥頻率，向人類個體投予含有約1×10 8至約1×10 11人類去核類紅血球的醫藥組合物，其包含一具有位於其細胞外表面上的(i)IL-15或其功能性片段、以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其細胞外表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。 第一外源性多肽
在一些實施方案中，本公開的特徵在於人類去核類紅血球包括第一外源性多肽以及第二外源性多肽，該第一外源性多肽包括位於人類去核類紅血球之細胞外表面上的(i)介白素-15 (IL-15) 或其功能性片段、以及(ii)介白素-15受體α (IL-15RA) 或其功能性片段，該第二外源性多肽包括4-1BBL或其功能性片段。
在一些實施方案中，該IL-15包括未成熟形式的野生型人類IL-15。在一些實施方案中，該IL-15可以包括與MRISKPHLRSISIQIQIQSAGLPKTEANWVNVISDKCFLLEQVISLESGDASIHDTVENLIANNSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO: 1) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同，至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。在一些實施方案中，該IL-15包括SEQ ID NO: 1的序列。
在一些實施方案中，該IL-15包括成熟形式的野生型人類IL-15或其功能性片段。在一些實施方案中，該IL-15可以包括與NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO: 2) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同，至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的序列。在一些實施方案中，該IL-15包括SEQ ID NO: 2的序列。
在一些實施方案中，該IL-15是由與AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGC (SEQ ID NO: 3) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，該IL-15是由與AACTGGGTAAACGTCATAAGCCACCAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTAGTGCACGACACTTTACACGGAGATCAGACGTCTCCCCCCACGCACGCATGAAGTCTCTCTCGAACTGCAATTTCTCGAATTTCGAATTCAGGTCACGCATCCAGTCATCGAATCAATCTCAGTCATACTCACATCAATCTGCAATACTGGTCAATAATAACTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGTAGAATGTGAAGGTGAATGTGAAGGTGTGAAGGTGGTGGAGTGUGAAGCTGGUGAGTGTGTGAGTGTCAGTCAGTCAATGTCAATACTTGAGTCAATACTCTCAGTCAATACTAGT (SEQ ID NO: 4) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，IL-15的功能性片段包含至少10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、或160個胺基酸。在一些實施方案中，IL-15的功能性片段包含少於20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個或160個胺基酸。在一些實施方案中，IL-15的功能性片段保留了至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、95%、98%或99%的野生型人類IL-15多肽與IL-15RA多肽相互結合的能力，如同以本領域習知的測定法進行測量，例如：ELISA、表面電漿共振 (SPR) 結合分析或共免疫沉澱法。在一些實施方案中，IL-15多肽的功能性片段保留了至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、98%或99%的野生型人類IL-15多肽誘發IL-15介導的訊息傳遞的能力，如同以本領域習知的測定法進行測量，例如：電泳遷移分析法、ELISA和其他免疫測定法。在一些實施方案中，IL-15多肽的功能性片段可以是該IL-15多肽的IL-15受體結合片段。
在一些實施方案中，介白素-15受體α (IL-15RA) 或其功能性片段可以包括未成熟形式的野生型人類IL-15RA。在一些實施方案中，該IL-15RA可以包括與MAPRRARGCRTLGLPALLLLLRPPATRGITCPPSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSTGTTEISSHESSHGTPSPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL (SEQ ID NO: 5) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。在一些實施方案中，IL-15RA多肽包括SEQ ID NO: 5的序列。
在一些實施方案中，該IL-15RA包括成熟形式的野生型人類IL-15RA。在一些實施方案中，該IL-15RA可以包括與ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL (SEQ ID NO: 6) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。在一些實施方案中，該IL-15RA包括SEQ ID NO: 6的序列。
在一些實施方案中，該IL-15RA包括IL-15RA多肽的細胞外部分。舉例而言，該IL-15RA多肽可能缺乏野生型IL-15RA的跨膜結構域，以及任選地野生型IL-15RA的細胞內結構域。在一些實施方案中，該IL-15RA包括未成熟形式的細胞外野生型人類IL-15RA。在一些實施方案中，該IL-15RA多肽可以包括與MAPRRARGCRTLGLPALLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHSSHSSHGPGPQQGHSDTT (SEQ ID NO: 7) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。在一些實施方案中，IL-15RA多肽包括SEQ ID NO: 7的序列。
在一些實施方案中，該IL-15RA包括成熟形式的細胞外野生型人類IL-15RA。在一些實施方案中，該IL-15RA包括與ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT (SEQ ID NO: 8) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。在一些實施方案中，IL-15RA多肽包括SEQ ID NO: 8的序列。
在一些實施方案中，該IL-15RA是由與ATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACT (SEQ ID NO: 9) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，該IL-15RA或其功能性片段包括位在該受體細胞外結構域之外顯子2中的「壽司 (sushi) 結構域」 (Wei et al., J Immunol. 2001; 167:277-282)。在一些實施方案中，具有野生型人類IL-15RA之壽司結構域的IL-15RA或其功能性片段包括與ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR (SEQ ID NO: 10) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的序列。在一些實施方案中，該IL-15RA或其功能性片段包括野生型人類IL-15RA的壽司結構域，該IL-15RA包括SEQ ID NO: 10的序列。
在一些實施方案中，該IL-15RA包括野生型人類IL-15RA或其功能性片段的壽司結構域以及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100個額外的野生型人類IL-15RA的胺基酸。在一些實施方案中，該IL-15RA或其功能性片段包括野生型人類IL-15RA的壽司結構域以及13個額外的野生型人類IL-15RA的胺基酸。在一些實施方案中，該IL-15RA包括與ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS (SEQ ID NO: 11) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。在一些實施方案中，IL-15RA多肽包括SEQ ID NO: 11的序列。
在一些實施方案中，該IL-15RA是由與ATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCC (SEQ ID NO: 12) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，該IL-15RA的功能性片段包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200個胺基酸。在一些實施方案中，該IL-15RA的功能性片段包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200個胺基酸，並且包含IL-15RA壽司結構域。在一些實施方案中，該IL-15RA片段或變體保留了至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、95%、98%或99%的野生型人類IL-15RA與IL-15相互結合的能力，如同以本領域習知的測定法進行測量，例如：ELISA、表面電漿共振 (SPR) 結合分析、共免疫沉澱法。在一些實施方案中，IL-15RA變體或片段保留了至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、98%或99%的野生型人類IL-15RA多肽誘發IL-15介導的訊息傳遞的能力，如同以本領域習知的測定法進行測量，例如：電泳遷移分析法、ELISA和其他免疫測定法。在一些實施方案中，該IL-15RA多肽的功能性片段可以包括IL-15RA多肽的壽司結構域和跨膜結構域之中的其一或是二者。在一些實施方案中，該IL-15RA多肽的功能性片段包括壽司結構域。在一些實施方案中，該IL-15RA多肽的功能性片段包括跨膜結構域。
在一些實施方案中，該第一外源性多肽還包括訊號肽。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括訊號肽，該訊號肽包括表3所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括訊號肽，該訊號肽包括GPA訊號肽。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括訊號肽，其具有SEQ ID NO: 13 (其是由SEQ ID NO: 14的核酸序列所編碼而成) 的胺基酸序列。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括前導 (訊號) 序列，其包括SEQ ID NO: 13的胺基酸序列、IL-15多肽以及IL-15RA多肽。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括前導 (訊號) 序列，其包括SEQ ID NO: 13的胺基酸序列、含有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列之成熟人類IL-15多肽、以及含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列之IL-15RA多肽。在一些實施方案中，該成熟人類IL-15多肽與該IL-15RA多肽是透過具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列之彈性連接子相互連接。
在一些實施方案中，一個或多個連接子被設置在IL-15或其功能性片段與IL-15RA或其功能性片段之間。可以使用本文所提供的任何連接子。在一些實施方案中，該連接子是長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個胺基酸的肽。在一些實施方案中，該連接子的長度足以保有使IL-15與IL-15RA相互結合的能力。在其他實施方案中，該連接子的長度足以保有使IL-15/IL-15RA複合物與βγIL-15受體複合物相互結合以及作為促效劑進而介導IL-15訊息傳導的能力。在一些實施方案中，該連接子包括表2所列出的胺基酸序列。在一些實施方案中，該連接子包括胺基酸序列 (GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，該連接子是由 (GGGGS)n 連接子所組成 (SEQ ID NO: 16)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，該連接子包括胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 15)。
其他習知技術者所熟知的合適的連接子可用於連接IL-15和IL-15RA多肽。 在一些實施方案中，連接子的長度可以是介於5個至25個胺基酸之間、介於5個至20個胺基酸之間、介於10個至25個胺基酸之間，或介於10個至20個胺基酸之間。在一些實施方案中，連接子的長度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸。在一些實施方案中，該連接子是非免疫原性的。
在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括IL-15多肽或其功能性片段以及IL-15RA多肽的細胞外區域。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括與NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT (SEQ ID NO: 17) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽是由與AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACT (SEQ ID NO: 18) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括IL-15多肽以及IL-15RA多肽的壽司結構域。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括SEQ ID NO: 19的胺基酸序列。在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括與NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS (SEQ ID NO: 19) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽是由與AACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGTGGTGGAGGGAGCGGGGGTGGTGGATCCATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCC (SEQ ID NO: 20) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，該第一外源性多肽包括IL-15多肽或其功能性片段以及IL-15RA多肽或其功能性片段 (例如：IL-15結合片段)。本文所描述的任何IL-15多肽均可與本文所描述的任何IL-15RA多肽結合以形成第一外源性多肽。在一些實施方案中，IL-15多肽或其功能性片段與IL-15RA多肽或其功能性片段的細胞外部分是以複合物的形式存在。在一些實施方案中，IL-15多肽與IL-15RA多肽的細胞外部分是以融合多肽 (例如：第一外源性融合多肽) 的形式存在。在一些實施方案中，IL-15多肽透過連接子與IL-15RA多肽的細胞外部分連接。在一些實施方案中，IL-15多肽與IL-15RA多肽是以複合物的形式存在。IL-15/IL-15RA複合物的組成物彼此間可以利用非共價鍵或共價鍵 (例如：透過肽鍵來組合胺基酸序列) 直接融合。
在一些實施方案中，第一外源性多肽、IL-15多肽、IL-15RA多肽、或IL-15/IL-15RA複合物不會從人類類紅血球 (例如：人類去核類紅血球) 中釋放出來。在一些實施方案中，IL-15多肽、IL-15RA多肽、或IL-15/IL-15RA複合物或融合多肽是附著在人類類紅血球的細胞膜上 (例如：人類去核類紅血球的細胞膜)。在一些實施方案中，第一外源性多肽還包括多肽序列 (例如跨膜區域)，該多肽序列可以將多肽錨定在人類類紅血球細胞膜上 (本文稱為錨定物或跨膜結構域)。在一些實施方案中，將第一外源性多肽錨定在人類類紅血球細胞膜上的多肽序列是與第一外源性多肽中的另一多肽相互異源。在一些實施方案中，將多肽錨定在人類類紅血球細胞膜上的多肽序列是與IL-15多肽和/或IL-15RA多肽相互異源。在一些實施方案中，將多肽錨定在人類類紅血球細胞膜上的多肽序列是GPA序列。
在一些實施方案中，其他可用於將第一外源性多肽錨定到人類類紅血球細胞膜 (例如：人類去核類紅血球細胞膜) 的多肽是習知技術者已知的，並且考慮將其納入到含有IL-15、IL-15RA或IL-15/IL-15RA融合物的第一外源性多肽中。非限制性實例包括：小整合膜蛋白-1 (SMIM1)、運鐵蛋白受體、Fas配體 (FasL)、Kell和Band 3。
在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域可以包括第I型膜多肽或其跨膜部分。舉例而言，在一些第一外源性多肽的實施方案中，所述錨定物或跨膜結構域包括第I型膜多肽或其跨膜部分，其是選自於由血型糖蛋白A (GPA)、血型糖蛋白B (GPB)、basigin (亦稱為CD147)、CD44、CD58 (亦稱為LFA3)、細胞間黏附分子-4 (ICAM4)、基底細胞黏附分子 (BCAM)、CR1、CD99、類紅血球母細胞膜相關蛋白 (ERMAP)、連接黏附分子A (JAM-A)、神經澱粉蛋白 (NPTN)、AMIGO2以及類唐氏症細胞黏附分子-1 (DSCAML1) 所組成的群組。在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域包括或由第II型膜多肽或其跨膜部分所組成。舉例而言，在一些第一外源性多肽的實施方案中，所述錨定物或跨膜結構域包括第II型膜蛋白或其跨膜部分，其是選自於由小整合膜蛋白-1 (SMIM1)、運鐵蛋白受體 (CD71)、Fas配體 (FasL) 跨膜蛋白以及Kell所組成的群組。在一些第一外源性多肽的實施方案中，錨定物是GPI連接的膜多肽。在一些第一外源性多肽的實施方案中，GPI連接的膜多肽錨定物是選自於由CD59、CD55以及Semaphorin 7A (SEMA7A) 所組成的群組。
在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域可以包括小整合膜蛋白-1 (SMIM1) 或其跨膜部分。在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域包括血型糖蛋白A (GPA) 或其片段 (例如其跨膜部分)。在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域包括表1所提供的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括IL-15多肽或其功能性片段以及野生型人類IL-15RA的跨膜區域。在一些實施方案中，第一外源性多肽包括IL-15多肽或其功能性片段以及跨膜區域 (例如本文所描述的任何例示性跨膜區域或跨膜結構域)。
在一些實施方案中，連接子是設置在錨定物或跨膜結構域與IL-15多肽、IL-15RA多肽或IL-15/IL-15RA多肽之間。合適的連接子包括但不限於表2所提供的任何連接子胺基酸序列。在一些實施方案中，位於錨定物或跨膜結構域 (例如GPA) 與IL-15多肽、IL-15RA多肽或IL-15/IL-15RA融合多肽之間的連接子包含或由HA連接子所組成。在一些實施方案中，連接子包括或由SEQ ID NO: 21的胺基酸序列所組成。
在一些實施方案中，第一外源性多肽還可以包括錨定物。在一些實施方案中，第一外源性多肽可以包括SEQ ID NO: 22的胺基酸序列 (其是由SEQ ID NO: 23的核酸序列所編碼而成)、介白素-15 (IL-15) 多肽和介白素-15受體α (IL-15RA) 多肽的細胞外部分。在一些實施方案中，第一外源性多肽可以包括含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的錨定物、含有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的成熟人類IL-15、以及含有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的成熟人類細胞外IL-15RA，由此成熟人類IL-15胺基酸序列與成熟人類細胞外IL-15 RA胺基酸序列是透過含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的彈性連接子相互連接。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括含有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的訊號肽 (例如GPA訊號肽)、含有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的成熟人類IL-15、含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的彈性連接子 (例如連接成熟人類IL-15與成熟人類細胞外IL-15RA)、含有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的成熟人類細胞外IL-15RA、含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的連接子、以及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的錨定物。在一些實施方案中，第一外源性多肽包括 (例如從N端到C端) 含有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的成熟人類IL-15、含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的彈性連接子 (例如連接成熟人類IL-15與成熟人類細胞外IL-15RA)、含有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的成熟人類細胞外IL-15RA、含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的連接子、以及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的錨定物。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括與MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ (SEQ ID NO: 24) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽是由與ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTAAATGTGATTTCAGACCTGAAAAAAATCGAAGACCTTATTCAATCCATGCACATCGACGCGACACTTTATACTGAATCAGACGTACACCCGTCCTGTAAGGTTACTGCGATGAAGTGCTTTCTGTTGGAATTGCAAGTGATCTCCCTCGAATCAGGGGATGCATCCATTCATGATACCGTCGAGAATTTGATCATTCTGGCAAATAACTCCCTCAGTAGTAACGGGAATGTGACCGAGTCTGGGTGTAAGGAGTGCGAAGAGTTGGAGGAAAAGAATATCAAAGAATTCCTTCAGTCCTTTGTTCACATCGTGCAAATGTTTATTAATACATCTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA (SEQ ID NO: 25) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括與MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ (SEQ ID NO: 26) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同，至少95%相同，至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽是由與ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA (SEQ ID NO: 27) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括與MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ (SEQ ID NO: 28) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽是由與ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGTGGTGGAGGGAGCGGGGGTGGTGGATCCATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCCGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA (SEQ ID NO: 29) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括與MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ (SEQ ID NO: 30) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽是由與ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTAAATGTGATTTCAGACCTGAAAAAAATCGAAGACCTTATTCAATCCATGCACATCGACGCGACACTTTATACTGAATCAGACGTACACCCGTCCTGTAAGGTTACTGCGATGAAGTGCTTTCTGTTGGAATTGCAAGTGATCTCCCTCGAATCAGGGGATGCATCCATTCATGATACCGTCGAGAATTTGATCATTCTGGCAAATAACTCCCTCAGTAGTAACGGGAATGTGACCGAGTCTGGGTGTAAGGAGTGCGAAGAGTTGGAGGAAAAGAATATCAAAGAATTCCTTCAGTCCTTTGTTCACATCGTGCAAATGTTTATTAATACATCTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA (SEQ ID NO: 31) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括與MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ (SEQ ID NO: 32) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽是由與ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA (SEQ ID NO: 33) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，第一外源性多肽包括SEQ ID NO: 24的胺基酸序列。在一些實施方案中，第一外源性多肽包括SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。在一些實施方案中，第一外源性多肽包括SEQ ID NO: 28的胺基酸序列。在一些實施方案中，第一外源性多肽包括SEQ ID NO: 30的胺基酸序列。在一些實施方案中，第一外源性多肽包括SEQ ID NO: 32的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一外源性多肽如US 2019/0298769中所述，其透過引用全部併入本文。 第二外源性多肽
本文所描述的人類去核類紅血球除了包括位在其細胞外表面上的第一外源性多肽(例如：本文所描述的任何第一外源性多肽)，還包括一含有位在其細胞外表面上的4-1BBL或其功能性片段之第二外源性多肽。
本文所使用的4-1BBL多肽是指由腫瘤壞死因子超家族成員9基因 (TNFSF9或CD137L) 所編碼而成的胺基酸序列。4-1BBL是4-1BB (亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (TNFRSF9) 或CD137) 的配體，4-1BB是在免疫系統細胞之細胞外表面上發現的受體家族的成員，參見Alderson et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:2219-2227。
在一些實施方案中，4-1BBL是以天然的三聚體形式存在。
在一些實施方案中，4-1BBL可以包括與ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE (SEQ ID NO: 34) 或其功能性片段至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的序列。在一些實施方案中，4-1BBL包括SEQ ID NO: 34的序列。
在一些實施方案中，4-1BBL是由與GCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA (SEQ ID NO: 35) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，第二外源性多肽可以包括與MYGKIIFVLLLSEIVSISAACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGSGGGPEDEPGSGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ (SEQ ID NO: 36) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的序列。在一些實施方案中，4-1BBL多肽包括SEQ ID NO: 36的序列。
在一些實施方案中，第二外源性融合多肽是由與ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAAGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCCCCGAGGACGAGCCCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA (SEQ ID NO: 37) 至少70%相同 (例如：至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同或100%相同) 的核酸序列所編碼而成。
在一些實施方案中，第二外源性多肽包括前導 (訊號) 序列。在一些實施方案中，4-1BBL或其功能性片段是與前導 (訊號) 序列相互融合。前導 (訊號) 序列的非限制性實例包括表3所提供的胺基酸序列。在一些實施方案中，前導 (訊號) 序列包括GPA訊號肽。在一些實施方案中，前導 (訊號) 序列包括SEQ ID NO: 13的胺基酸序列。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括4-1BBL或其功能性片段以及SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的前導 (訊號) 序列。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括含有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的前導 (訊號) 序列以及具有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的4-1BBL。
在一些實施方案中，第二外源性多肽是附著在人類類紅血球的細胞膜上 (例如：人類去核類紅血球的細胞膜)。在一些實施方案中，第二外源性多肽還包括錨定物或跨膜結構域，其可以將第二外源性多肽錨定在人類類紅血球細胞膜上 (例如：人類去核類紅血球的細胞膜)。在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域是與第二外源性多肽 (例如4-1BBL) 相互異源。在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域包括內源性紅血球跨膜多肽或其片段或跨膜部分。在某些實施方案中，錨定物或跨膜結構域包括GPA或其跨膜部分。在一些實施方案中，錨定物或跨膜結構域包括小整合膜蛋白-1 (SMIM1)、運鐵蛋白受體、Fas配體 (FasL)、Kell、Band 3或其跨膜部分 (例如跨膜結構域)。在一些實施方案中，第二外源性多肽可以包含本文所描述的任何錨定物或跨膜結構域。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括表1所示的錨定物或跨膜結構域。
在一些實施方案中，第二外源性多肽包括一個或多個連接子 (例如本文所描述的任何例示性連接子)。舉例而言，第二外源性多肽可以包括表2所提供的一個或多個連接子。在一些實施方案中，連接子是設置在4-1BBL或其功能性片段與第二外源性多肽中的錨定物或跨膜結構域之間。
在一些實施方案中，第二外源性多肽還可以包括訊號肽 (例如本文所描述的任何例示性訊號肽)。舉例而言，第二外源性多肽可以包括表3所提供的訊號肽。
在一些實施方案中，第二外源性多肽包括訊號肽、4-1BBL或其功能性片段以及錨定物。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括訊號肽、4-1BBL或其功能性片段、連接子以及錨定物。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括 (例如從N端到C端) 含有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的訊號肽、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的4-1BBL或其功能性片段、含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列 (其是由SEQ ID NO: 39的核酸序列所編碼而成) 的連接子 (例如設置在4-1BBL或其功能性片段與錨定物之間) 以及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的錨定物。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括4-1BBL或其功能性片段、連接子以及錨定物。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括 (例如從N端到C端) 含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的4-1BBL或其功能性片段、含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的連接子 (例如設置在4-1BBL或其功能性片段與錨定物之間)、以及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的錨定物。在一些實施方案中，第二外源性多肽包括或由SEQ ID NO: 36的胺基酸序列 (其是由SEQ ID NO: 37的核酸序列編碼而成) 所組成。
在一些實施方案中，第一和/或第二外源性多肽可具有真核細胞 (例如哺乳動物細胞、人類細胞) 的轉譯後修飾特徵。在一些實施方案中，第一和/或第二外源性多肽是被糖基化、被磷酸化、或二者兼具。糖蛋白的體外檢測通常是利用修飾的過碘酸希夫法 (PAS)，藉由十二烷基硫酸钠聚丙烯醯胺膠體電泳 (SDS-PAGE) 和西方墨點法來完成。糖蛋白的細胞定位可以利用本領域已知的凝集素螢光接合物來完成。磷酸化可以利用磷酸特異性抗體以西方墨點法來評估。
轉譯後修飾還包括與疏水基團接合 (例如：豆蔻醯化、棕櫚酸酯化、聚異戊二烯化或糖基磷脂醯肌醇化)、與輔因子接合 (例如：脂醯化、黃素部分 (例如FMN或FAD)、血紅素C附著、磷酸泛醯巰基乙胺化(Phosphopantetheinylation)或亞視黃基(Retinylidene)希夫鹼形成)、diphthamide形成、乙醇胺磷酸甘油附著、羧腐胺離胺酸(hypusine)形成、醯化 (例如O-醯化、N-醯化或S-醯化)、甲醯化、乙醯化、烷基化 (例如甲基化或乙基化)、醯胺化、丁醯化、γ-羧基化、丙二醯化、羥基化、碘化、核苷酸附加 (例如ADP-核糖基化)、氧化、磷酸酯 (O-連接) 或氨基磷酸酯 (N-連接) 形成 (例如磷酸化或腺苷酸化)、丙醯化、焦麩胺酸形成、S-麩胱甘肽基化、S-亞硝基化、琥珀醯化、硫酸化、干擾素刺激基因修飾、類小泛素化、泛素化、類泛素化或胺基酸化學修飾 (例如：瓜氨酸化、脫醯胺化、去除化或氨基甲醯化)、雙硫鍵形成、外消旋化 (例如脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸外消旋化)。在實施方案中，糖基化包括向精氨酸、天冬醯胺、半胱氨酸、羥離胺酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或色氨酸附加糖基，進而產生糖蛋白。在實施方案中，糖基化包括例如O-連接糖基化或N-連接糖基化。
在一些實施方案中，第一和/或第二外源性多肽是融合多肽，例如是與內源性紅血球多肽或其片段融合，例如是跨膜糖蛋白，例如是GPA或其跨膜片段。在一些實施方案中，第一和/或第二外源性多肽是與促進二聚化或多聚化的結構域相互融合，例如是與另一個融合外源性多肽相互融合，其任選地包含二聚化結構域。在一些實施方案中，二聚化結構域包括抗體分子的一部分，例如Fc結構域或CH3結構域。在一些實施方案中，第一和第二二聚化結構域包括knob-in-hole突變 (例如knob鏈中的T366Y突變和hole鏈中的Y407T突變)，以促進異源二聚化。 錨定物 / 跨膜結構域
在一些實施方案中，跨膜結構域包括或由第I型膜多肽的跨膜結構域所組成。在一些實施方案中，第I型膜多肽是選自於由血型糖蛋白A (GPA)、血型糖蛋白B (GPB)、Basigin (亦稱為CD147)、CD44、CD58 (亦稱為LFA3)、細胞間黏附分子-4 (ICAM4)、基底細胞黏附分子 (BCAM)、CR1、CD99、類紅血球母細胞膜相關蛋白 (ERMAP)、連接黏附分子A (JAM-A)、神經澱粉蛋白 (NPTN)、AMIGO2以及類唐氏症細胞黏附分子-1 (DSCAML1) 所組成的群組。在一些實施方案中，跨膜結構域包括或由第II型膜多肽的跨膜結構域所組成。在一些實施方案中，第II型膜多肽是選自於由小整合膜蛋白-1 (SMIM1)、運鐵蛋白受體 (CD71)、Fas配體 (FasL) 跨膜蛋白以及Kell所組成的群組。在一些實施方案中，將外源性多肽錨定到人類去核類紅血球細胞膜上的多肽序列包括或由 (例如片段的) GPI連接的膜多肽所組成，或衍生自於 (例如片段的) GHP連接的膜多肽。在一些實施方案中，GPI連接的膜多肽是選自於由CD59、CD55、以及Semaphorin 7A (SEMA7A) 所組成的群組。
在具體實施方案中，跨膜結構域包括血型糖蛋白A (GPA) 或其跨膜部分。不受理論約束，在某些實施方案中，GPA是優選的，因為它具有可以與網狀紅血球細胞骨架相互作用的細胞質結構域，其在細胞分化和成熟時具有保留GPA的作用。在一些實施方案中，跨膜結構域包括小整合膜蛋白-1 (SMIM1) 或其跨膜部分。在一些實施方案中，錨定物是選自於表1所列出的胺基酸序列。 表1. 錨定物序列
SEQ ID NO: 序列名稱 序列描述 胺基酸序列
40 GPA 全長的血型糖蛋白A MYGKIIFVLLLSAIVSISALSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
22 GPA 包含跨膜結構域的血型糖蛋白A片段 LSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
41 SMIM1 小整合膜蛋白-1 MQPQESHVHYSRWEDGSRDGVSLGAVSSTEEASRCRRISQRLCTGKLGIAMKVLGGVALFWIIFILGYLTGYYVHKCK
連接子
在一些實施方案中，第一外源性多肽和/或第二外源性多肽 (例如本文所描述的任何例示性多肽) 可以包括一個或多個連接子。舉例而言，連接子可以設置在細胞激素多肽序列 (例如IL-15或其功能性片段) 與跨膜結構域序列之間，或在IL-15或其功能性片段與IL-15RA或其功能性片段之間。
在一些實施方案中，連接子包括或由長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個胺基酸所組成。在一些實施方案中，連接子包括或由長度介於約5個至約25個之間的胺基酸、長度介於約5個至約20個之間的胺基酸、長度介於約10個至約25個之間的胺基酸、或長度介於約10個至約20個之間的胺基酸所組成。在一些實施方案中，可用於本發明的連接子包括或由長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸所組成。在一個優選的實施方案中，連接子是非免疫原性的。
在一些實施方案中，連接子是選自於表2所示的胺基酸序列。 表2. 連接子序列
SEQ ID NO. 序列描述 胺基酸序列
42 G4S連接子 GGGGS
15 (G4S) 3連接子 GGGGSGGGGSGGGGS
43 連接子-HA-連接子 GGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGS
21 連接子 GGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGS
38 連接子 GGSGGSGGGPEDEPGSGSGGGSGGGS
44 連接子 GSGSGSGSGSEDEDEDEDGSGSGSGSGS
45 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
46 連接子 GSGSGSGSEDGSGSGSGS
47 連接子 GSGSGSGSGSGSGSGSGS
48 連接子 GCGGSGGGGSGGGGS
49 連接子 SGRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSPA
50 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
51 Snorkel連接子 SGRGASSGSSGSGSQKKPRYEIRWKVVVISAILALVVLTVISLIILIMLWGSGMQSPA
在一些實施方案中，連接子包括胺基酸序列 (GGGGS)n (SEQ ID NO: 16)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，連接子是由 (GGGGS)n 連接子所組成 (SEQ ID NO: 16)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，連接子包括胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 15)。在一些實施方案中，連接子是由SEQ ID NO: 16的胺基酸序列所組成。在一些實施方案中，連接子包括SEQ ID NO: 43的胺基酸序列。在一些實施方案中，連接子是由SEQ ID NO: 43的胺基酸序列所組成。在一些實施方案中，連接子包括SEQ ID NO: 21的胺基酸序列。在一些實施方案中，連接子是由SEQ ID NO: 21的胺基酸序列所組成。在一些實施方案中，連接子包括SEQ ID NO: 38的胺基酸序列。在一些實施方案中，連接子是由SEQ ID NO: 38的胺基酸序列所組成。
其他可用於第一外源性多肽或第二外源性多肽 (例如本文所描述的任何外源性多肽) 的合適連接子是本領域已知的。 前導 ( 訊號 ) 序列
在一些實施方案中，第一外源性多肽或第二外源性多肽 (例如本文所描述的任何例示性外源性多肽) 包括前導 (訊號) 序列。在一些實施方案中，前導序列是選自於表3所示的序列。 表3. 前導 (訊號) 序列
SEQ ID NO. 序列描述 胺基酸序列
13 GPA訊號肽 MYGKIIFVLLLSEIVSISA
52 Ig重鏈V區3訊號肽 MGWSCIILFLVATATGVHS
53 輕鏈前導序列 MRVPAQLLGLLLLWLPGARC
例示的人類去核類紅血球
在一些實施方案中，人類去核類紅血球的組合包括：含有位在其細胞外表面上的4-1BBL或其片段之第二外源性多肽，其與跨膜多肽 (例如GPA或其跨膜片段) 相連，以及含有位在其細胞外表面上的IL-15或其片段之第一外源性多肽，其與IL-15受體α (IL-15Rα) 或其片段的細胞外部分 (例如IL-15Rα壽司結合結構域) 相連，其與跨膜多肽 (例如GPA或其跨膜片段) 相連，例如美國專利申請案公開號2019/0298769中所述， 其透過引用併入本文)。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球的組合包括：含有位在其細胞外表面上的4-1BBL或其片段之第二外源性多肽，其與跨膜多肽 (例如血型糖蛋白A或其跨膜片段) 相連，以及含有位在其細胞外表面上的IL-15或其片段之第一外源性多肽，其與IL-15Rα或其片段的細胞外部分 (例如IL-15Rα壽司結合結構域) 相連，其與跨膜多肽 (例如血型糖蛋白A或其跨膜片段) 相連(例如美國專利申請案公開號2019/0298769中所述， 其透過引用併入本文)。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球不是經低滲壓裝載的細胞。在一些實施方案中，人類去核類紅血球不包含轉肽酶轉移特徵。
在一些實施方案中，本文所述的人類去核類紅血球表面不存在 (即不包括) 一種或多種次要血型系統抗原，例如：Le (a陰性b陰性) (針對Lewis血型抗原系統)、Fy (a陰性b陰性) (針對Duffy系統)、Jk (a陰性b陰性) (針對Kidd系統)、M陰性N陰性 (針對MNS系統)、K陰性k陰性 (針對Kell系統)、Lu (a陰性b陰性) (針對Lutheran系統) 以及H抗原陰性 (孟買表型)，或其任意組合。在一些實施方案中，人類去核類紅血球也是O型和/或Rh陰性。舉例而言，次要血型系統已描述在Agarwal et al., “Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary care hospital in north India,” Blood Res. 48(1):51–54, 2013，以及Mitra et al., “Blood groups systems,” Indian J. Anaesth. 58(5):524–528, 2014，其描述透過引用併入本文。
在一些實施方案中，本文所描述的人類去核類紅血球與不包含外源性多肽 (例如本文所描述的或本領域已知的任何外源性多肽) 之經分離且未培養的人類去核類紅血球表現出基本上相同的滲透細胞膜脆性。在一些實施方案中，人類去核類紅血球群體在0.3%、0.35%、0.4%、0.45%或0.5% NaCl條件下，具有小於50%細胞裂解的滲透脆性。在一些實施方案中，滲透脆性是利用WO 2015/073587中實施例59所描述的方法所測定 (其描述透過引用併入本文)。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球具有與野生型、未經處理的去核類紅血球大致相同的直徑或體積。在一些實施方案中，人類去核類紅血球群體的平均直徑為約4、5、6、7、8、9、10、11、或12微米、或約4.0至約12.0微米、約4.0至約11.0微米、約4.0至約10微米、約4.0至約9.0微米、約4.0至約8.0微米、約4.0至約7.0微米、約4.0至約6.0微米、約4.0至約5.0微米、約5.0至約12.0微米、約5.0至約11.0微米、約5.0至約10.0微米、約5.0至約9.0微米、約5.0至約8.0微米、約5.0至約7.0微米、約5.0至約6.0微米、約6.0至約12.0微米、約6.0至約11.0微米、約6.0至約10.0微米、約6.0至約9.0微米、約6.0至約8.0微米、約6.0至約7.0微米、約7.0至約12.0微米、約7.0至約11.0微米、約7.0至約10.0微米、約7.0至約9.0微米、約7.0至約8.0微米、約8.0至約12.0微米、約8.0至約11.0微米、約8.0至約10.0微米、約8.0至約9.0微米、約9.0至約12.0微米、約9.0至約11.0微米、約9.0至約10.0微米、約10.0至約12.0微米、約10.0至約11.0微米或約11.0微米至約12.0微米，並且可任選地群體標準差是小於1、2、或3微米。人類去核類紅血球的直徑可以利用例如Advia 120血液學系統或Moxi Z細胞計數器 (Orflo) 進行測量。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球的類紅血球平均體積為約10 fL至約175 fL、約10 fL至約160 fL、約10 fL至約140 fL、約10 fL至約120 fL、約10 fL至約100 fL、約10 fL至約90 fL、約10 fL至約80 fL、約10 fL至約70 fL、約10 fL至約60 fL、約10 fL至約50 fL、約10 fL至約40 fL、約10 fL至約30 fL、約10 fL至約20 fL、約20 fL至約175 fL、約20 fL至約160 fL、約20 fL至約140 fL、約20 fL至約120 fL、約20 fL至約100 fL、約20 fL至約90 fL、約20 fL至約80 fL、約20 fL至約70 fL、約20 fL至約60 fL、約20 fL至約50 fL、約20 fL至約40 fL、約20 fL至約30 fL、約30 fL至約175 fL、約30 fL至約160 fL、約30 fL至約140 fL、約30 fL至約120 fL、約30 fL至約100 fL、約30 fL至約90 fL、約30 fL至約80 fL、約30 fL至約70 fL、約30 fL至約60 fL、約30 fL至約50 fL、約30 fL至約40 fL、約40 fL至約175 fL、約40 fL至約160 fL、約40 fL至約140 fL、約40 fL至約120 fL、約40 fL至約100 fL、約40 fL至約90 fL、約40 fL至約80 fL、約40 fL至約70 fL、約40 fL至約60 fL、約40 fL至約50 fL、約50 fL至約175 fL、約50 fL至約160 fL、約50 fL至約140 fL、約50 fL至約120 fL、 約50 fL至約100 fL、約50 fL至約90 fL、約50 fL至約80 fL、約50 fL至約70 fL、約50 fL至約60 fL、約60 fL至約175 fL、約60 fL至約160 fL、約60 fL至約140 fL、約60 fL至約120 fL、約60 fL至約100 fL、約60 fL至約90 fL、約60 fL至約80 fL、約60 fL至約70 fL、約70 fL至約175 fL、約70 fL至約160 fL、約70 fL至約140 fL、約70 fL至約120 fL、約70 fL至約100 fL、約70 fL至約90 fL、約70 fL至約80 fL、約80 fL至約175 fL、約80 fL至約160 fL、約80 fL至約140 fL、約80 fL至約120 fL、約80 fL至約100 fL、約80 fL至約90 fL、約100 fL至約175 fL、約100 fL至約160 fL、約100 fL至約140 fL、約100 fL至約120 fL、約120 fL至約175 fL、約120 fL至約160 fL、約120 fL至約140 fL、約140 fL至約175 fL、約140 fL至約160 fL或約160 fL至約175 fL，並且可任選地群體標準差是小於50 fL、40 fL、30 fL、20 fL、10 fL、5 fL或2 fL。類紅血球平均體積可以利用例如血液學分析儀器，如Coulter計數器、Moxi Z細胞計數器 (Orflo) 或Sysmex血液學分析儀進行測量。
在一些實施方案中，本文所描述的人類去核類紅血球具有一個或多個 (例如：2、3、4、或更多個) 本文所描述的物理性特徵，例如：滲透脆性、細胞大小、血紅素濃度或磷脂醯絲胺酸含量。雖然不希望受理論束縛，但在一些實施方案中，表現外源性多肽的人類去核類紅血球具有類似於野生型、未經處理的人類去核類紅血球的物理性特徵。相比之下，經低滲壓裝載的人類去核類紅血球有時表現出異常的物理性特徵，例如：滲透脆性增加、細胞大小改變、血紅素濃度降低、或細胞膜外葉上的磷脂醯絲胺酸含量增加。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球包括由外源性核酸所編碼的外源性多肽，該外源性核酸並未被細胞保留、尚未經純化或尚未完全存在於人類去核類紅血球之外。 在一些實施方案中，人類去核類紅血球是在缺乏穩定劑的組合物中。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球具有與野生型、未經處理的人類去核類紅血球相似的血紅素含量。在一些實施方案中，人類去核類紅血球包括大於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或大於10%的胎兒血紅素。在一些實施方案中，人類去核類紅血球包括至少約20、22、24、26、28、或30皮克(pg)，且可任選地高達約30皮克的總血紅素。在一些實施方案中，血紅素含量是利用WO2015/073587中實施例33的Drabkin試劑方法進行測定。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球在其細胞膜的外葉上具有與野生型、未經處理的人類去核類紅血球大致相同的磷脂醯絲胺酸含量。磷脂醯絲胺酸主要是位於野生型、未經處理之人類去核類紅血球的細胞膜內葉上，並且透過低滲壓裝載可以導致磷脂醯絲胺酸分佈到外葉上，其可在外葉上觸發免疫反應。在一些實施方案中，人類去核類紅血球群體包括少於約30、25、20、15、10、9、8、6、5、4、3、2、或1%之Annexin V染色呈陽性的細胞。在一些實施方案中，磷脂醯絲胺酸的暴露是透過針對可選擇性與磷脂醯絲胺酸結合的Annexin V-FITC進行染色，並藉由流式細胞技術測量FITC螢光，例如利用WO2015/073587中實施例54的方法，來進行評估。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球群體包括至少約50%、60%、70%、80%、90%、或95% (且可任選地高達90%或100%) 的GPA陽性細胞。在一些實施方案中，GPA的存在可利用螢光活化細胞分選技術來進行檢測。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球在人類個體中的半衰期為至少30、45、或90天。
在一些實施方案中，含有人類去核類紅血球的細胞群體包括少於約10、5、4、3、2、或1%的鋸齒狀紅血球。
在一些實施方案中，含有多個人類去核類紅血球的醫藥組合物可以投予於人類個體 (例如本文所描述的任何個體)。在這樣的實施方案中，醫藥組合物中大於50%、60%、70%、80%或90%的人類細胞可以是無核的。在一些實施方案中，細胞 (例如人類去核類紅血球) 包含無功能的 (例如已經失活的) 細胞核。
在一些本文所描述的任何醫藥組合物之實施方案中，人類去核類紅血球是經工程化的人類去核類紅血球。在一些實施例中，經工程化人類去核類紅血球包括單個外源性多肽。在其他實施例中，經工程化人類去核類紅血球包括二個或更多個外源性多肽 (例如本文所描述的任何例示性外源性多肽)。
在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽可以是點擊化學反應的產物 (例如：可以使用本文所描述的任何方法，將外源性多肽與存在於細胞膜上的多肽 (例如額外的外源性多肽或內源性多肽) 進行接合)。在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽可以是使用轉肽酶(sortase)之接合反應的產物 (例如：可以使用本文所描述的任何方法，將外源性多肽與存在於人類細胞膜上的多肽 (例如額外的外源性多肽或內源性多肽) 進行接合)。使用轉肽酶之接合反應的非限制性實例可以在美國專利號10,260,038和美國公開專利號2016/0082046 A1中找到。在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽可以是脂質錨定的多肽，例如：GPI錨定物、N-肉豆蔻醯化多肽或S-棕櫚醯化多肽。在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽可以是跨膜多肽(例如單次或多次跨膜多肽)或外周膜多肽。在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽可以是含有跨膜結構域的融合多肽 (例如含有小整合膜蛋白-1 (SMIM1) 或血型糖蛋白A (GPA) 之跨膜結構域的融合多肽)。在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽不具有任何突出到細胞外空間的胺基酸。在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽不具有任何突出到經工程化去核類紅血球之細胞質基質中的胺基酸。在一些實施方案中，存在於經工程化人類去核類紅血球細胞膜上的外源性多肽具有突出到細胞外空間的胺基酸以及突出到經工程化人類去核類紅血球之細胞質基質中的胺基酸。WO2014/183071或WO2014/183066中描述了利用分選標記 (sortagging) 來生產人類去核類紅血球的例示性方法，其均透過引用完整併入本文中。
經工程化人類去核類紅血球可以透過將可編碼一個或多個外源性多肽 (例如本文所描述的或本領域已知的任何外源性多肽) 的一個或多個核酸 (例如DNA表現載體或mRNA) 引入到人類類紅血球前驅細胞 (例如本文所描述的或本領域已知的任何人類類紅血球前驅細胞) 中而產生。將DNA表現載體引入到人類類紅血球前驅細胞中的例示性方法包括但不限於脂質體介導的轉移、轉型、基因槍、轉染以及轉導，例如病毒介導的基因轉移 (例如使用病毒載體來執行，包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體以及基於反轉錄病毒的載體)。將DNA表現載體引入到人類類紅血球前驅細胞中的其他例示性方法包括例如使用裸DNA、CaPO 4沉澱、DEAE葡聚糖、電穿孔、原生質體融合、脂質轉染以及細胞顯微注射。
人類類紅血球前驅細胞可以在允許分化為經工程化人類去核類紅血球的適當條件下，選擇性地進行培養，例如：在引入一個或多個可編碼一個或多個外源性多肽的核酸之前和/或之後。在一些實施方案中，所得到的經工程化人類去核類紅血球包括與成熟人類紅血球相關的多肽，例如：血紅素 (例如成年人血紅素和/或胎兒血紅素)、血型糖蛋白A以及外源性多肽，其可透過標準方法 (例如西方墨點法或螢光活化細胞分選分析) 來進行驗證和定量。
在一些實施方案中，二個或更多個外源性多肽是在單個核酸中進行編碼，例如單個載體。在實施方案中，單個載體具有針對每個基因的個別啟動子，具有二個多肽，其最初被轉譯成在中間位置具有蛋白酶裂解位點的單個多肽，為了使隨後的蛋白水解處理可以產生二個外源性多肽，或任何其他合適的構型。在一些實施方案中，二個或更多個多肽是在二個或更多個核酸中進行編碼，例如每個載體編碼一個外源性多肽。
所述核酸可以是例如DNA或RNA。許多病毒可用作為基因轉移載體，舉例而言包括反轉錄病毒、莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV)、腺病毒、腺相關病毒 (AAV)、單純皰疹病毒 (HSV)、慢病毒如人類免疫缺陷病毒1 (HIV 1) 以及泡沫反轉錄病毒如泡沫病毒。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球可以被擴增至少1,000倍、2,000倍、5,000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍或100,000倍 (並且任選地可高達100,000倍、200,000倍或500,000倍)。在一些實施方案中，細胞數是利用自動細胞計數器進行測量。
在一些實施例中，人類去核類紅血球或人類類紅血球前驅細胞可以用編碼外源性多肽的mRNA進行轉染，以便產生經工程化人類去核類紅血球。信使RNA可以衍生於含有可編碼外源性多肽之序列的cDNA質體構築體的體外轉錄。舉例而言，編碼外源性多肽的cDNA序列可以被插入到含有與特定RNA聚合酶相容的啟動子序列之選殖載體中。舉例來說，選殖載體ZAP Express® pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, Calif., USA) 含有分別與T3和T7 RNA聚合酶相容的T3和T7啟動子序列。關於正義mRNA的體外轉錄，在對應於編碼外源性多肽之序列末端的終止密碼子下游的限制位點處，將質體進行線性化。 使用市售試劑組將線性DNA模板轉錄成mRNA，例如RNAMaxx®高產量轉錄試劑組 (Stratagene, La Jolla, Calif., USA)。在一些例子中，理想的是產生5'-m7GpppG-capped mRNA。因此，可以使用例如Ambion的mMESSAGE mMACHINE高產量加帽RNA轉錄試劑組 (Austin, Tex., USA)，將經線性化的cDNA模板進行轉錄。轉錄可以在37°C下，以20至100 μL的反應體積進行30分鐘至4小時。經轉錄的mRNA是透過以下方式將其從反應混合物中純化出來：先以DNase I進行短暫處理，以便清除經線性化的DNA模板，接著在氯化鋰、乙酸鈉或乙酸銨存在下，以70%乙醇進行沉澱。經轉錄mRNA的完整性可以利用瓊脂糖甲醛凝膠或市售Novex預製TBE凝膠 (Novex, Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) 進行電泳加以評估。
可以利用多種方法將編碼外源性多肽的信使RNA引入到人類去核類紅血球或人類類紅血球前驅細胞中，包括例如脂質轉染和電穿孔 (van Tandeloo et al., Blood 98:49-56, 2001)。舉例而言，關於脂質轉染，將在Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) 中的5 μg經體外轉錄mRNA與陽離子脂質DMRIE-C (Invitrogen) 以1:4的比例混合，反應5至15分鐘。
或者，可以利用各種其他陽離子脂質或陽離子聚合物，用mRNA來轉染人類類紅血球前驅細胞，包括例如DOTAP、各種形式的聚乙烯亞胺和聚L-賴氨酸 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo., USA) 以及Superfect (Qiagen, Inc., Valencia, Calif., USA；參見例如Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001)。將所得到的mRNA/脂質複合物與細胞 (1×10 6至2×10 6細胞/毫升) 在37°C下培養2小時，洗滌後並接續培養。舉例而言，關於電穿孔，將在500 μL Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) 中的約5x10 6至20x10 6細胞與約20 μg經體外轉錄的mRNA互相混合，並利用例如Easyject Plus裝置 (EquiBio, Kent, United Kingdom)，在0.4-cm小管中進行電穿孔。在一些例子中，可能需要測試各種電壓、電容和電穿孔體積，以便確定將特定mRNA轉染到人類類紅血球前驅細胞中的有用條件。一般來說，用mRNA有效轉染細胞所需的電穿孔參數似乎對細胞的危害是小於DNA電穿孔所需的參數 (van Tandeloo et al., Blood 98:49-56, 2001)。
或者，可以使用肽介導的RNA遞送策略，將mRNA轉染到人類去核類紅血球或人類類紅血球前驅細胞中 (參見例如Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001)。舉例來說，可以將陽離子脂質聚乙烯亞胺2 kDA (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo., USA) 與Melittin肽 (Alta Biosciences, Birmingham, UK) 互相合併，以便提高mRNA轉染的效率，特別是在有絲分裂後的初代細胞中。可以利用雙硫鍵交聯劑將該Melittin肽與PEI進行接合，例如異構雙官能基團交聯劑琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯。將經體外轉錄的mRNA與mellitin-PEI預培養5至15分鐘，以便形成RNA/肽/脂質複合物。接著將該複合物加入到無血清培養基中的細胞，在37°C、5% CO 2增濕環境下，培養2至4小時，然後將其除去，並進一步培養經轉染的細胞。
在一些實施方案中，經工程化人類去核類紅血球是透過將編碼一個或多個外源性多肽 (例如本文所述的任何外源性多肽或外源性多肽的任意組合) 的核酸 (例如本文所述的任何例示性核酸) 引入到人類類紅血球前驅細胞中而產生。在一些實施方案中，外源性多肽是由被引入到人類類紅血球前驅細胞中的DNA所編碼。在一些實施方案中，外源性多肽是由被引入到人類類紅血球前驅細胞中的RNA所編碼。
在最後分化為人類去核類紅血球之前，可以利用各種DNA技術，包括例如暫態或穩定轉染以及基因治療方法，將編碼一個或多個外源性多肽的核酸引入到人類類紅血球前驅細胞中。
病毒基因轉移可用於將編碼一個或多個外源性多肽的核酸轉染到細胞中。許多病毒可用作為基因轉移載體，包括莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV)、腺病毒、腺相關病毒 (AAV)、單純皰疹病毒 (HSV)、慢病毒如人類免疫缺陷病毒1 (HIV1) 以及泡沫反轉錄病毒如泡沫病毒 (參見例如Osten et al., HEP 178:177-202, 2007)。舉例而言，反轉錄病毒可以有效地轉導哺乳動物細胞，包括人類細胞在內，並嵌入到染色體中，從而實現穩定的基因轉移。
編碼一個或多個外源性多肽的核酸可以轉染到人類類紅血球前驅細胞中。合適的載體是莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV) 載體 (Malik et al., Blood 91:2664-2671, 1998)。基於莫洛尼鼠白血病病毒載體，即致癌反轉錄病毒，目前已用於基因治療臨床試驗 (Hassle et al., News Physiol. Sci. 17:87-92, 2002)。舉例來說，利用標準分子生物學技術，可以在MMLV載體骨架中生成含有可編碼外源性多肽之cDNA的DNA構築體。該構築體被轉染到包裝細胞株中，例如PA317細胞，並且利用病毒上清液來轉染生產者細胞，例如PG13細胞。將PG13病毒上清液與人類類紅血球前驅細胞一起培養。外源性多肽的表現可以例如利用針對外源性多肽的螢光標記抗體，透過FACS (螢光活化細胞分選) 進行分析，監測外源性多肽是否存在於經工程化人類去核類紅血球的細胞膜上。可以使用類似的方法，監測外源性多肽是否存在於經工程化人類去核類紅血球的細胞質基質中。
任選地，編碼螢光追蹤分子的核酸，例如綠色螢光蛋白 (GFP)，可以透過基於病毒的方法被轉染到人類類紅血球前驅細胞中 (Tao et al., Stem Cells 25:670-678, 2007)。含有編碼增強型綠色螢光蛋白 (EGFP) 或紅色螢光蛋白 (例如DsRed-Express) 之DNA的親嗜性反轉錄病毒載體可以利用包裝細胞進行包裝，例如Phoenix-Eco細胞株 (由Orbigen, San Diego, Calif.分發)。包裝細胞株可穩定地表現正確病毒包裝所需的病毒多肽，包括例如gag、pol以及env。 利用從Phoenix-Eco細胞所得到之含有病毒顆粒的上清液來轉導人類類紅血球前驅細胞。在一些例子中，轉導可以在經特殊塗覆的表面上進行，例如重組纖網蛋白片段，以便提高反轉錄病毒介導的基因轉移效率 (例如RetroNectin, Takara Bio USA, Madison, Wis.)。將細胞與反轉錄病毒Phoenix-Eco上清液以及合適的輔助因子在經RetroNectin塗覆的皿中進行培養。可以在隔天重複進行轉導。在此例子中，表現EGFP或DsRed-Express之人類類紅血球前驅細胞的百分比可以透過螢光活化細胞分選進行評估。其他可用於評估轉導效率的報導基因包括例如β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、螢光素酶以及低親和力神經生長因子受體 (LNGFR) 和人類細胞表面CD24抗原 (Bierhuizen et al., Leukemia 13:605-613, 1999)。
非病毒載體可用於將編碼一個或多個外源性多肽的核酸引入到人類類紅血球前驅細胞中，以便產生經工程化人類去核類紅血球。許多遞送方法可用於將非病毒載體引入到人類類紅血球前驅細胞中，包括化學和物理方法。
可以利用合成的大分子 (例如陽離子脂質和聚合物)，將編碼外源性多肽的非病毒載體引入到人類類紅血球前驅細胞中 (Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005)。舉例來說，陽離子脂質體可透過電荷相互作用而與DNA形成複合物。帶正電的DNA/脂質複合物可與負電細胞表面相結合，並透過細胞吞噬作用被細胞吞入。舉例而言，這種方法可用於轉染造血細胞 (參見例如Keller et al., Gene Therapy 6:931-938, 1999)。對於人類類紅血球前驅細胞，質體DNA (在無血清培養基中，例如OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)) 是與陽離子脂質體 (在無血清培養基中) 相互混合，例如市售轉染試劑Lipofectamine™ (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)，並培養至少20分鐘以形成複合物。將DNA/脂質體複合物添加到人類類紅血球前驅細胞中，並培養5至24小時，之後可以測定外源性多肽的轉基因表現。或者，可以使用其他市售的脂質體轉染試劑 (例如In vivo GeneSHUTTLE™, Qbiogene, Carlsbad, Calif.)。
任選地，陽離子聚合物例如聚乙烯亞胺 (PEI) 可用於有效地轉染人類類紅血球前驅細胞，例如造血和臍帶血衍生的CD34陽性細胞 (參見Shin et al., Biochim. Biophys. Acta 1725:377-384, 2005)。人類CD34陽性細胞是從人類臍帶血中分離出來，並培養在補充有200 ng/ml幹細胞因子和20%熱滅活血清的IMDM培養基中。將編碼外源性多肽的質體DNA與大小從0.8 K至750 K不等的支鏈或直鏈PEI一起培養 (Sigma Aldrich, Saint Louis, Mo., USA; Fermetas, Hanover, Md., USA)。PEI是以蒸餾水製備成濃度為4.2 mg/mL的原液，並使用HCl將其微酸化至pH 5.0。根據1 μg DNA含有3 nmol磷酸以及1 μLPEI原液含有10 nmol氨基氮的計算，DNA可以在室溫下以各種氮/磷酸比例與PEI進行混合30分鐘。將經分離的CD34陽性細胞併同與DNA/陽離子複合物進行接種，以轉速280xg離心5分鐘，並在培養基中培養4小時或更長時間，直到進行評估外源性多肽表現時為止。
可以利用物理方法，例如：顆粒介導的轉染、基因槍、生物彈道技術或粒子撞擊技術，將質體載體引入到合適的人類類紅血球前驅細胞中 (Papapetrou, et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005)。在此例子中，編碼外源性多肽的DNA是被吸附到黃金顆粒上，並透過顆粒槍施加於細胞中。舉例而言，這種方法可用於轉染人類類紅血球前驅細胞，例如源自於臍帶血的造血幹細胞 (參見例如Verma et al., Gene Therapy 5:692-699, 1998)。就此，將臍帶血分離出來，並以磷酸鹽緩衝液稀釋三倍。利用抗CD34單株抗體併同經二級抗體塗覆的磁性微珠以及磁性分離系統 (例如Miltenyi MiniMac System, Auburn, Calif., USA)，將CD34陽性細胞純化出來。富含CD34陽性的細胞可以按照本文所述的方法進行培養。關於轉染，編碼外源性多肽的質體DNA是透過氯化鈣和精三胺處理而沉澱到顆粒上，例如黃金微珠。在用乙醇洗滌DNA塗覆的微珠後，可以利用例如Biolistic PDS-1000/He系統 (Bio-Rad, Hercules, Calif., USA)，將微珠輸送到經培養的細胞中。報導基因例如β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、螢光素酶或綠色螢光蛋白可用來評估轉染效率。
任選地，電穿孔方法可用於將質體載體引入到人類類紅血球前驅細胞中。電穿孔可以在細胞膜中產生瞬態孔洞，允許將各種分子引入到細胞中，包括例如DNA和RNA。因此，依照本文所述的方法將CD34陽性細胞分離出來，並加以培養。在電穿孔之前，將細胞在室溫下以轉速250xg離心10分鐘，進行分離，並重新懸浮在電穿孔緩衝液中，例如補充有1.0%人類血清白蛋白 (HSA) 的X-VIVO 10，使每毫升緩衝液中含有0.2x10 6至10x10 6活細胞。將質體DNA (1至50μg) 與500μL細胞懸浮液一同加入到適當的電穿孔小管中。
舉例來說，可以利用ECM 600電穿孔儀 (Genetronics, San Diego, Calif., USA) 進行電穿孔，電壓範圍為200 V至280 V，脈衝長度範圍為25毫秒至70毫秒。許多替代的電穿孔儀器是市售的，均可用於此目的 (例如Gene Pulser Xcell™、BioRad、Hercules、Calif.; Cellject Duo, Thermo Science, Milford, Mass.)。或者，可以使用以下的參數針對經分離的CD34陽性細胞進行有效的電穿孔：4 mm小管，1600μE，550 V/cm以及每500μL細胞液 (每毫升細胞液中含有1x10 5細胞) 加入10μg DNA (Oldak et al., Acta Biochim. Polonica 49:625-632, 2002)。
細胞核轉染是電穿孔的一種形式，也可用於轉染人類類紅血球前驅細胞。在此例子中，轉染是利用電參數條件，在細胞類型特異性溶液中進行，該特異性溶液可以使DNA (或其他試劑) 被直接運輸到細胞核中，從而降低其在細胞質中可能被降解的風險。舉例而言，Human CD34 Cell Nucleofector™試劑組 (來自Ammaxa Inc.) 可用於轉染人類類紅血球前驅細胞。在此例子中，將在Human CD34 Cell Nucleofector™溶液中的1 x10 6至5x10 6細胞與1至5μg DNA互相混合，並使用經製造商確定的預設設定，在Nucleofector™儀器中進行轉染。
人類類紅血球前驅細胞可以用傳統的表現載體進行非病毒式轉染，該表現載體無法在哺乳動物細胞中自我複製，除非將其嵌入到基因組中。或者，人類類紅血球前驅細胞可以用游離基因組載體進行轉染，該載體能夠以自主複製的遺傳單元形式持續存在於宿主細胞核中，而不嵌入到染色體中 (Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005)。這些載體是利用源自於病毒的遺傳元件，該病毒於潛伏感染時通常是在細胞中的染色體外進行複製，例如：愛潑斯坦-巴爾病毒、BK人類多瘤性病毒、牛乳突病毒-1 (BPV-1)、單純皰疹病毒-1 (HSV) 以及猿猴病毒40 (SV40)。哺乳動物人工染色體也可用於非病毒式基因轉移 (Vanderbyl et al., Exp. Hematol. 33:1470-1476, 2005)。
編碼一個或多個外源性多肽的外源性核酸可以透過本領域已知的標準分子生物學方法組裝成表現載體，例如限制性酶切、重疊延伸PCR以及Gibson組裝。
外源性核酸可以包括編碼外源性多肽的基因，其通常不存在於例如人類去核類紅血球的細胞外表面上，將該基因與編碼內源性或天然膜多肽的基因相互融合，使得外源性多肽可以在細胞外表面上進行表現。舉例來說，編碼外源性多肽的外源性基因可以在第I型膜多肽的前導序列之後的N端、第II型膜多肽的C端、或GPI連接膜多肽之GPI附著位點的上游進行選殖。
標準的選殖方法可用於將彈性胺基酸連接子引入到二個融合基因之間。舉例來說，彈性連接子是聚甘氨酸聚絲氨酸連接子，例如：[Gly 4Ser] 3(SEQ ID NO: 15)，其通常用於從全長抗體中產生單鏈抗體片段 (Antibody Engineering: Methods & Protocols, B. Lo, ed., Humana Press, 2004, 576 pp.) 或Ala-Gly-Ser-Thr (SEQ ID NO: 54) 多肽，例如用於產生單鏈Arc抑制蛋白的多肽 (Robinson & Sauer, Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 95: 5929-34, 1998)。在一些實施方案中，與沒有彈性連接子的等效構築體相比，彈性連接子提供了外源性多肽更大的靈活度和空間排列自由度。這種附加的靈活度在需要與標的物例如抗體或多肽相互結合的應用中或在活性位點必須可被受質 (例如標的物) 所觸及的多肽酶促反應中是有用的。
在一些實施方案中，提供的方法例如本文所述的方法包括藉由將人類類紅血球前驅細胞與核酸接觸，並在有效將核酸遞送到細胞中的條件下，透過電穿孔將核酸引入，進而將大核酸 (特別是RNA，例如mRNA) 遞送到人類類紅血球前驅細胞中。合適的電穿孔器包括但不限於Bio-Rad GENE PULSER與GENE PULSER II、the Life Technologies NEON、BTX GEMINI system以及MAXCYTE電穿孔器。這些方法不需要病毒遞送或使用病毒載體。合適的核酸包括RNA，例如mRNA。合適的核酸還包括DNA，像是轉位子、穩定游離基因組、質體DNA或線性DNA。
文獻中已經描述了細胞株電穿孔的條件，例如Van Tendeloo et al., Blood  98(l):49-56, 2001。適用於本文所述方法的合適電穿孔條件包括：以Life Technologies Neon Transfection System而言：脈衝電壓範圍為約500 V至約2000 V、約800 V至約1800 V或約850 V至約1700 V；脈衝寬度範圍為約5毫秒至約50毫秒或約10毫秒至約40毫秒；以及脈衝數範圍為1個脈衝至2個脈衝、1個脈衝至3個脈衝、1個脈衝至4個脈衝、或1個脈衝至5個脈衝。
特別適合用於人類類紅血球前驅細胞的電穿孔條件包括例如4天：a) 脈衝電壓1300至1400，脈衝寬度：10至20毫秒，脈衝數：1-3；b) 脈衝電壓1400，脈衝寬度：10毫秒，脈衝數：3；c) 脈衝電壓1400，脈衝寬度：20毫秒，脈衝數：1；d) 脈衝電壓1300，脈衝寬度：10毫秒，脈衝數：3。
特別適合用於人類類紅血球前驅細胞的電穿孔條件包括例如8至9天：a) 脈衝電壓：1400至1600，脈衝寬度：20，脈衝數：1；b) 脈衝電壓：1100至1300，脈衝寬度：30，脈衝數：1；c) 脈衝電壓：1000至1200，脈衝寬度：40，脈衝數：1；d) 脈衝電壓：1100至1400，脈衝寬度：20，脈衝數：2；e) 脈衝電壓：950至1150，脈衝寬度：30，脈衝數：2；f) 脈衝電壓：1300至1600，脈衝寬度：10，脈衝數：3。這些條件通常可以造成的轉染效率為至少約60%或更高 (例如至少約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少約97%或更高)，以及細胞存活率為至少約70%或更高 (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%或至少約97%或更多)。
特別適合用於在分化條件下所培養的人類類紅血球前驅細胞之電穿孔條件包括例如12至13天：a) 脈衝電壓：1500至1700，脈衝寬度：20，脈衝數：1；以及b) 脈衝電壓：1500至1600，脈衝寬度：10，脈衝數：3。這些條件通常可以造成的轉染效率為至少約50%或更高 (例如至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少約97%或更高)，以及細胞存活率為至少約70%或更高 (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%或至少約97%或更多)。
本文所公開有關Life Technologies Neon system的條件可以透過習知技術者僅以常規實驗即可輕易調整，以便適應不同的電穿孔器和/或不同的電穿孔裝置，並且本文所描述的特定電穿孔器不因所公開的方法而受限制。
在一些實施方案中，利用本文所述的電穿孔條件，將經培養的人類類紅血球前驅細胞進行第一次電穿孔，然後培養一段所需的時間 (任選地在分化條件下)，之後再次進行第二次電穿孔。在一些實施方案中，將經培養的人類類紅血球前驅細胞進行第一次電穿孔，然後培養一段所需的時間 (任選地在分化條件下)，之後再次進行第二次、第三次、第四次、第五次或第六次電穿孔。任選地，介於第一次與第二次電穿孔之間的培養期間、介於第二次與第三次電穿孔之間的培養期間，依此類推，可以有所不同。舉例而言，介於各個電穿孔之間的期間可以根據需要進行調整，例如該期間可以是30分鐘、1小時、6小時、12小時、18小時、24小時、30小時、36小時、48小時、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天14天或21天。舉例來說，人類類紅血球前驅細胞可以在第1天和第2天、第1天和第3天、第1天和第4天、第1天和第5天、第1天和第6天、第1天和第7天、第1天和第8天、第1天和第9天、第1天和第10天、第1天和第11天、第1天和第12天、第1天和第13天、第1天和第14天、第1天和第15天，或第1天和第16天進行電穿孔。在另一實施例中，細胞可以在第2天和第3天、第2天和第4天、第2天和第5天、第2天和第6天、第2天和第7天、第2天和第8天、第2天和第9天、第2天和第10天、第2天和第11天、第2天和第12天、第2天和第13天、第2天和第14天、第2天和第15天，或第2天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第3天和第4天、第3天和第5天、第3天和第6天、第3天和第7天、第3天和第8天、第3天和第9天、第3天和第10天、第3天和第11天、第3天和第12天、第3天和第13天、第3天和第14天、第3天和第15天，或第3天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，細胞可以在第4天和第5天、第4天和第6天、第4天和第7天、第4天和第8天、第4天和第9天、第4天和第10天、第4天和第11天、第4天和第12天、第4天和第13天、第4天和第14天、第4天和第15天，或第4天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，細胞可以在第5天和第6天、第5天和第7天、第5天和第8天、第5天和第9天、第5天和第10天、第5天和第11天、第5天和第12天、第5天和第13天、第5天和第14天、第5天和第15天，或第5天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第6天和第7天、第6天和第8天、第6天和第9天、第6天和第10天、第6天和第11天、第6天和第12天、第6天和第13天、第6天和第14天、第6天和第15天，或第6天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第7天和第8天、第7天和第9天、第7天和第10天、第7天和第11天、第7天和第12天、第7天和第13天、第7天和第14天、第7天和第15天，或第7天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第8天和第9天、第8天和第10天、第8天和第11天、第8天和第12天、第8天和第13天、第8天和第14天、第8天和第15天，或第8天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第9天和第10天、第9天和第11天、第9天和第12天、第9天和第13天、第9天和第14天、第9天和第15天，或第9天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第10天和第11天、第10天和第12天、第10天和第13天、第10天和第14天、第10天和第15天，或第10天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第11天和第12天、第11天和第13天、第11天和第14天、第11天和第15天，或第11天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第12天和第13天、第12天和第14天、第12天和第15天，或第12天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第13天和第14天、第13天和第15天，或第13天和第16天進行電穿孔。在又一實施例中，人類類紅血球前驅細胞可以在第14天和第15天，或第14天和第16天進行電穿孔。任選地，人類類紅血球前驅細胞可以進行二次以上的電穿孔，例如三次、四次、五次或六次，並且其間隔可以根據需求選擇在細胞分化過程中的任何時間點。
在一些實施方案中，利用本文所述的電穿孔條件，將經培養的人類類紅血球前驅細胞在分化的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天進行電穿孔。
在一些實施方案中，經工程化人類去核類紅血球可以是點擊接合的經工程化人類去核類紅血球。可催化形成鍵結的多肽結構域可以表現在例如人類類紅血球前驅細胞上或其中、存在於細胞質基質中或存在於細胞膜上。存在有許多可催化形成鍵結的多肽，包括轉肽酶、分選酶以及異肽酶，包括源自於Spy0128的多肽，Spy0128是從化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中分離出來的多肽。過去已經證實將Spy0128之可自催化形成異肽鍵的亞基 (CnaB2結構域) 拆開可以導致產生二個不同的多肽，其均保有對彼此具有特異性的催化活性。在此系統中的多肽被稱作為SpyTag以及SpyCatcher。SpyTag和SpyCatcher一經混合後，便會在SpyTag中的Asp117與SpyCatcher中的Lys31之間形成異肽鍵 (Zakeri and Howarth, JACS 132:4526, 2010)。該反應與細胞環境是彼此相容的，並且對蛋白質/肽接合具有高度特異性 (Zakeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:E690-E697, 2012)。SpyTag和SpyCatcher已被證明可以指導類彈力素蛋白的轉譯後拓撲修飾。舉例來說，在N端放置SpyTag以及在C端放置SpyCatcher可以指導環狀類彈力素蛋白的形成 (Zhang et al, J. Am. Chem. Soc. 2013)。
SpyTag和SpyCatcher可以互相置換，準此，將分子A與SpyTag融合以及將分子B與SpyCatcher融合的系統，其在功能上是等效於將分子A與SpyCatcher融合以及將分子B與SpyTag融合的系統。出於本公開的目的，當使用SpyTag和SpyCatcher時，可以理解的是彼此間的互補分子可以互相替換。
可催化形成鍵結的多肽，例如SpyTag/SpyCatcher系統，可用於將外源性多肽附著到例如人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球的細胞外表面上。SpyTag多肽序列可以被表現在類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球的細胞外表面上。舉例而言，SpyTag多肽可以與第I型或第III型跨膜多肽例如血型糖蛋白A的N端相互融合、與第II型跨膜多肽的C端相互融合，例如Kell，其是框內插入到多次跨膜多肽例如Band 3的細胞外末端或細胞外環中、與GPI接受體多肽例如CD55或CD59相互融合、與脂鏈錨定多肽相互融合，或與外周膜多肽相互融合。外源性多肽可以與SpyCatcher相互融合。編碼SpyCatcher融合體的核酸可以由表現SpyTag融合體的同一人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球所表現和分泌。 或者，編碼SpyCatcher融合體的核酸序列可以在例如細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物、或無細胞生產系統中被外源性地產生。當SpyTag多肽與SpyCatcher多肽反應時，將形成共價鍵，其可將外源性多肽附著到人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球的細胞外表面。
在一個實施方案中，SpyTag多肽可以在人類類紅血球中，在Gatal啟動子的控制下被表現成與血型糖蛋白A的N端相互融合。與SpyCatcher多肽序列融合的外源性多肽可以在同一類紅血球中在Gatal啟動子的控制下進行表現。二個融合多肽一經表現後，便可在SpyTag多肽與SpyCatcher多肽之間形成異肽鍵，進而在人類類紅血球細胞表面 (人類類紅血球的細胞外表面) 與外源性多肽之間形成共價鍵。
在另一個實施方案中，SpyTag多肽可以在人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球中，在Gatal啟動子的控制下被表現成與血型糖蛋白A的N端相互融合。與SpyCatcher多肽序列融合的外源性多肽可以在合適的哺乳動物細胞表現系統中進行表現，例如HEK293細胞。一旦在人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球上表現SpyTag融合多肽，SpyCatcher融合多肽便可與細胞進行接觸。在合適的反應條件下，SpyTag多肽與SpyCatcher多肽之間便會形成異肽鍵，進而在人類類紅血球前驅細胞表面或人類去核類紅血球表面與外源性多肽之間形成共價鍵。
可催化形成鍵結的多肽，例如SpyTag/SpyCatcher系統，可用於將外源性多肽錨定到人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球的細胞內空間。SpyTag多肽序列可以透過許多方法在人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球的細胞內空間進行表現，包括直接表現轉基因、與內源性細胞內多肽例如血紅素相互融合、與內源性細胞表面多肽 (例如Band 3、血型糖蛋白A、Kell) 的細胞內結構域相互融合，或與細胞骨架的結構組成部分相互融合。SpyTag序列不限於位在多肽末端，且可以被整合到內源性多肽的內部序列中，使得多肽的轉譯和定位不會受到干擾。外源性多肽可以與SpyCatcher相互融合。編碼SpyCatcher融合體的核酸序列可以在表現SpyTag融合體的同一人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球中進行表現。當SpyTag多肽與SpyCatcher多肽反應時，便會形成共價鍵，其可將外源性多肽錨定在人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球的細胞內空間。
在一個實施方案中，人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球可以表現與血紅素β在細胞內相互融合的SpyTag。人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球可以透過含有血紅素啟動子、β球蛋白基因以及SpyTag序列的基因序列進行基因改造，使得在轉譯後，細胞內β球蛋白可以在其C端與SpyTag相互融合。此外，人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球可以表現由Gatal啟動子引導的基因，該基因編碼SpyCatcher而驅動多肽表現 (例如苯丙氨酸羥化酶 (PAH) 表現)，使得在轉譯後，細胞內多肽 (例如PAH) 可以在其N端與SpyCatcher相互融合。二個融合多肽一經表現後，SpyTag結合的β球蛋白便可透過異肽鍵在細胞內空間與SpyCatcher結合的多肽 (例如PAH) 互相連接，進而允許多肽 (例如PAH) 被錨定在β球蛋白上，並且在成熟過程中被保留。
在另一個實施方案中，SpyTag多肽可以在人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球中被表現成與外源性多肽相互融合。SpyCatcher多肽可以在同一人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球中被表現成與血型糖蛋白A的C端 (細胞內) 相互融合。二個融合多肽一經表現後，便可在SpyTag多肽與SpyCatcher多肽之間形成異肽鍵，進而在膜錨定的內源性類紅血球多肽與外源性多肽之間形成共價鍵。
其他分子融合可以在多肽之間形成，並包括直接的或間接的接合。多肽之間可以直接相互接合或透過連接子間接接合。連接子可以是肽、聚合物、適配體或核酸。聚合物可以是例如天然的、合成的、線性的或分支的。外源性多肽可以包括異源融合多肽，其包括第一多肽以及第二多肽，該融合多肽包括直接相互連接或透過位於中間的連接子序列和/或位於其一端或兩端的其他序列相互連接的多肽。與連接子的接合可以是透過共價鍵或離子鍵。
在一些實施方案中，經工程化人類去核類紅血球是經低滲壓裝載的人類去核類紅血球。關於低滲壓裝載/裂解，將人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球暴露在低離子強度緩衝液中，進而導致它們爆裂。外源性多肽分佈在細胞內。人類去核類紅血球或人類類紅血球前驅細胞可以透過將30至50倍過量體積的5 mM磷酸鹽緩衝液 (pH 8) 加入到經分離的去核類紅血球團塊中來進行低滲壓裂解。藉由離心將所得到的經裂解細胞膜分離出來。將經裂解的細胞膜團塊重新懸浮在存有外源性多肽的低離子強度緩衝液中，並加以培養例如30分鐘。或者，經裂解的細胞膜可以與外源性多肽一起培養短至一分鐘或長達數天，取決於確定能有效裝載人類去核類紅血球或人類類紅血球前驅細胞的最佳條件。為了低滲壓裝載編碼一個或多個外源性多肽 (例如本文所描述的或本領域已知的任何例示性外源性多肽) 的核酸，可以將核酸懸浮在低滲壓的Tris-HCl溶液 (pH 7.0) 中，並注射到人類類紅血球前驅細胞中。Tris-HCl的濃度可以從約20 mmol/L至約150 mmol/L，此取決於確定能有效裝載人類去核類紅血球的最佳條件。
或者，人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球可以利用經控制的低滲壓溶液透析來使細胞膨脹並在細胞膜中產生孔洞，進而裝載外源性多肽 (參見例如美國專利號4,327,710；5,753,221；6,495,351以及10,046,009)。舉例來說，將細胞團塊重新懸浮於10 mM HEPES，140 mM氯化鈉，5 mM葡萄糖，pH 7.4的溶液中，並在含有10 mM磷酸二氫鈉，10 mM碳酸氫鈉，20 mM葡萄糖以及4 mM氯化鎂，pH 7.4的低離子強度緩衝液中進行透析。在30至60分鐘後，將細胞在含有外源性多肽的16 mM磷酸二氫鈉，pH 7.4溶液中作進一步透析30至60分鐘。所有這些流程都可以有利地在4°C的溫度下進行。在一些例子中，透過透析方法來裝載大量人類類紅血球前驅細胞或人類去核類紅血球是有益的，並且可以使用為此目的而設計的特定裝置 (參見例如美國專利號4,327,710；6,139,836以及6,495,351)。
製造包含外源性多肽的人類去核類紅血球 (例如網狀紅血球或紅血球) 的例示性方法已描述在例如WO2015/073587、WO2015/153102、WO2020/243006以及WO2020/219909中，其均透過引用全部併入本文中。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球群體含有少於1%活的人類無核細胞，例如檢測不到含有活的人類無核細胞。在一些實施方案中，去核化可以藉由FACS，利用核染色來進行量測。在一些實施方案中，細胞群體中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80% (任選地高達約70%、80%、90%或100%) 的人類去核類紅血球包括一個或多個 (例如2個、3個、4個或更多個) 外源性多肽。在一些實施方案中，外源性多肽的表現可以藉由FACS，利用針對多肽的經標記抗體來進行量測。在一些實施方案中，細胞群體中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80% (任選地高達約70%、80%、90%或100%) 的細胞是無核的，並且包括一個或多個 (例如2個、3個、4個或更多個) 外源性多肽。 成年人類個體急性骨髓性白血病的治療方法
本文提供了治療有需要之成年人類個體中急性骨髓性白血病的方法，其包括透過靜脈給藥方式，以約每2周至約每5周一次的給藥頻率，向成年人類個體投予含有約5×10 7至約5×10 10、約5×10 7至約1×10 10、約5×10 7至約5×10 9，約5×10 7至約1x10 9、約5×10 7至約5x10 8、約5×10 7至約1x10 8、約1x10 8至約5x10 10、約1x10 8至約1x10 10、約1x10 8至約5x10 9、約1x10 8至約1x10 9、約1x10 8至約5x10 8、約5x10 8至約5x10 10、約5x10 8至約1x10 10、約5x10 8至約5x10 9、約5x10 8至約1x10 9、約1x10 9至約5x10 10、約1x10 9至約1x10 10、約1x10 9至約5x10 9、約5x10 9至約5x10 10、約5×10 9至約1×10 10或約1×10 10至約5×10 10人類去核類紅血球的醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的IL-15或其功能性片段以及IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其細胞外表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。在一些實施方案中，是以約每2周至約每4周 (例如約每3周) 一次的給藥頻率，投予含有約8×109至約2×1010 (約1×1010) 人類去核類紅血球的醫藥組合物。
在一些實施方案中，其中急性骨髓性白血病是復發的或是難以用急性骨髓性白血病之標準療法進行治療的急性骨髓性白血病。在一些實施方案中，其中急性骨髓性白血病是經細胞學診斷證實的急性骨髓性白血病。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，給藥頻率是大約每25天至大約每35天一次 (例如大約每25天至大約每34天、大約每25天至大約每33天、大約每25天至大約每32天、大約每25天至大約每31天、大約每25天至大約每30天、大約每25天至大約每29天、大約每25天至大約每28天、大約每25天至大約每27天、大約每25天至大約每27天、大約每26天至大約每27天、大約每26天至大約每35天、大約每26天至大約每34天、大約每26天至大約每33天、大約每26天至大約每32天、大約每26天至大約每31天、大約每26天至大約每30天、大約每26天至大約每29天、大約每26天至大約每28天、大約每26天至大約每27天、大約每27天至大約每35天、大約每27天至大約每34天、大約每27天至大約每33天、大約每27天至大約每32天、大約每27天至大約每31天、大約每27天至大約每30天、大約每27天至大約每29天、大約每27天至大約每28天、大約每28天至大約每35天、大約每28天至大約每34天、大約每28天至大約每33天、大約每28天至大約每32天、大約每28天至大約每31天、大約每28天至大約每30天、大約每28天至大約每29天、大約每29天至大約每35天、大約每29天至大約每34天、大約每29天至大約每33天、大約每29天至大約每32天、大約每29天至大約每31天、大約每29天至大約每30天、大約每30天至大約每35天、大約每30天至大約每34天、大約每30天至大約每33天、大約每30天至大約每32天、大約每30天至大約每31天、大約每31天至大約每35天、大約每31天至大約每34天、大約每31天至大約每33天、大約每31天至大約每32天、大約每32天至大約每35天、大約每32天至大約每34天、大約每32天至大約每33天、大約每33天至大約每35天、大約每33天至大約每34天、或大約每34天至大約每35天)。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 7至約5×10 8(例如約5×10 7至約4×10 8、約5×10 7至約2×10 8、約5×10 7至約1×10 8、約5×10 7至約8×10 7、約5×10 7至約6×10 7、約6×10 7至約5×10 8、約6×10 7至約4×10 8、約6×10 7至約2×10 8、約6×10 7至約1×10 8、約6×10 7至約8×10 7、約8×10 7至約5×10 8、約8×10 7至約4×10 8、約8×10 7至約2×10 8、約8×10 7至約1×10 8、約1×10 8至約5×10 8、約1×10 8至約4×10 8、約1×10 8至約2×10 8、約2×10 8至約5×10 8、約2×10 8至約4×10 8、約4×10 8至約5×10 8、或約1×10 8) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 8至約5×10 9(例如約5×10 8至約4×10 9、約5×10 8至約2×10 9、約5×10 8至約1×10 9、約5×10 8至約8×10 8、約5×10 8至約6×10 8、約6×10 8至約5×10 9、約6×10 8至約4×10 9、約6×10 8至約2×10 9、約6×10 8至約1×10 9、約6×10 8至約8×10 8、約8×10 8至約5×10 9、約8×10 8至約4×10 9、約8×10 8至約2×10 9、約8×10 8至約1×10 9、約1×10 9至約5×10 9、約1×10 9至約4×10 9、約1×10 9至約2×10 9、約2×10 9至約5×10 9、約2×10 9至約4×10 9、約4×10 9至約5×10 9、或約1×10 9) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的一些實施方案中，藥物組合物的劑量包括約1×10 9至約5×10 9(例如約1×10 9至約4×10 9、約1×10 9至約3×10 9、約1×10 9至約2×10 9、約2×10 9至約5×10 9、約2x10 9至約4x10 9、約2×10 9至約3×10 9、約3×10 9至約5×10 9、約3×10 9至約4×10 9、約4×10 9至約5×10 9、或約3×10 9) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的此類實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 9至約5×10 10(例如約5×10 9至約4×10 10、約5×10 9至約2×10 10、約5×10 9至約1×10 10、約5×10 9至約8×10 9、約5×10 9至約6×10 9、約6×10 9至約5×10 10、約6×10 9至約4×10 10、約6×10 9至約2×10 10、約6×10 9至約1×10 10、約6×10 9至約8×10 9、約8×10 9至約5×10 10、約8×10 9至約4×10 10、約8×10 9至約2×10 10、約8×10 9至約1×10 10、約1×10 10至約5×10 10、約1×10 10至約4×10 10、約1×10 10至約2×10 10、約2×10 10至約5×10 10、約2×10 10至約4×10 10、約4×10 10至約5×10 10、或約1×10 10) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
本文所描述的任何方法的一些實施方案還包括向成年人類個體投予一種或多種額外的治療劑。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑是癌症治療劑。在一些實施方案中，癌症治療劑是選自於以下群組：免疫檢查點分子抑製劑 (例如本文所述的任何例示性免疫檢查點分子抑製劑)、化療劑、治療性抗體、嵌合抗原受體-T細胞、激酶抑製劑、或可溶性細胞激素。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以與本文所提供的任何組合物基本上同時投予成年人類個體。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以在向成年人類個體施以本文所述的任何組合物之前或之後投予於成年人類個體。
舉例而言，在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑包括可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2的製劑，以及/或可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2結合的製劑 (以非限制性例子來說，是一種或多種的納武單抗(nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO、BRISTOL MYERS SQUIBB)、帕博利珠單抗 (KEYTRUDA, MERCK)、匹地珠單抗(pidilizumab) (CT-011, CURE TECH)、MK-3475 (MERCK)、BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB)以及MPDL328OA (ROCHE))。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑包括可以阻斷、減少和/或抑制CTLA-4活性和/或CTLA-4與其一種或多種受體 (例如CD80、CD86、AP2M1、SHP-2、和PPP2R5A) 結合的製劑。舉例來說，在一些實施方案中，抑制CTLA-4活性的製劑是抗體，如伊匹單抗(ipilimumab)(MDX-010、MDX-101、Yervoy、BRISTOL MYERS SQUIBB) 以及/或曲美單抗(tremelimumab) (PFIZER)。此外，在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑包括針對免疫檢查點分子的阻斷抗體，例如BTLA、HVEM、TIM3、GALS、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160 (也稱為BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、GITR、GITRL、半乳糖凝集素-9、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a、TMIGD2以及各種B-7家族配體 (包括但不限於B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6以及B7-H7)。
本文所描述的任何醫藥組合物均可如WO 2020/219909 (透過引用併入本文) 所述配製而成。
投予包含 (例如表現) 外源性製劑 (例如多肽) 的人類去核類紅血球 (例如網狀紅血球) 的方法已描述在例如WO2015/073587、WO2015/153102以及WO2019/173798中，其均透過引用全部併入本文中。 成年人類個體固態腫瘤的治療方法
本文提供了治療有需要之成年人類個體中固態腫瘤的方法，其包括：(a)：透過靜脈給藥方式，向成年人類個體投予含有約1×10 9至約2×10 10人類去核類紅血球的第一劑醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的(i)IL-15或其功能性片段、以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽；(b)：在(a)後約5天至約9天，透過腫瘤內給藥方式，投予含有約8×10 8至約8×10 9人類去核類紅血球的第二劑醫藥組合物；(c)：在(b)後約5天至約9天，透過腫瘤內給藥方式，投予含有約8×10 8至約8×10 9人類去核類紅血球的第三劑醫藥組合物；以及(d)：在(a)後約3周至約5周，透過靜脈給藥方式，投予含有約5×10 7至約5×10 10人類去核類紅血球的第四劑醫藥組合物。一些實施方案還包括步驟(e)：在步驟(d)後約3周至約5周，以約每3周至約每5周一次的給藥頻率，額外投予一劑或更多劑 (例如二劑或更多劑、三劑或更多劑、四劑或更多劑、五劑或更多劑、六劑或更多劑、八劑或更多劑、十劑或更多劑、或十二劑或更多劑) 含有約5×10 7至約5×10 10人類去核類紅血球的醫藥組合物。在一些實施方案中，步驟(a)包括透過靜脈給藥方式投予第一劑的醫藥組合物，該醫藥組合物包括約8×10 9至約2×10 10(例如約1×10 10) 人類去核類紅血球。在一些實施方案中，步驟(d)包括在步驟(d)後約3周，透過靜脈給藥方式投予第四劑的醫藥組合物，該醫藥組合物包括約8×10 9至約2×10 10(約1×10 10) 人類去核類紅血球。在一些實施方案中，步驟(e)包括額外投予一劑或更多劑的醫藥組合物，該醫藥組合物包括約8×10 9至約2×10 10(例如約1×10 10) 人類去核類紅血球。
在一些實施方案中，第一劑的醫藥組合物包括約1×10 9至約1×10 10(例如約1×10 9至約9×10 9、約1×10 9至約8×10 9、約1×10 9至約7×10 9、約1×10 9至約6×10 9、 約1 x 10 9至約5 x 10 9、約1 x 10 9至約4 x 10 9、約1 x 10 9至約3 x 10 9、約1 x 10 9至約2 x 10 9、約2 x 10 9至約1 x 10 10、約2 x 10 9至約9 x 10 9、約2 x 10 9至約8 x 10 9、約2 x 10 9至約7 x 10 9、約2 x 10 9至約6 x 10 9、約2 x 10 9至約5 x 10 9、約2 x 10 9至約4 x 10 9、約2 x 10 9至約3 x 10 9、約3 x 10 9至約1 x 10 10、約3 x 10 9至約9 x 10 9、約3 x 10 9至約8 x 10 9、約3 x 10 9至約7 x 10 9、約3 x 10 9至約6 x 10 9、約3 x 10 9至約5 x 10 9、約3 x 10 9至約4 x 10 9、約4 x 10 9至約1 x 10 10、約4 x 10 9至約9 x 10 9、約4 x 10 9至約8 x 10 9、約4 x 10 9至約7 x 10 9、約4 x 10 9至約6 x 10 9、約4 x 10 9至約5 x 10 9、約5 x 10 9至約1 x 10 10、約5 x 10 9至約9 x 10 9、約5 x 10 9至約8 x 10 9、約5 x 10 9至約7 x 10 9、約5 x 10 9至約6 x 10 9、約6 x 10 9至約1 x 10 10、約6 x 10 9至約9 x 10 9、約6 x 10 9至約8 x 10 9、約6 x 10 9至約7 x 10 9、約7 x 10 9至約1 x 10 10、約7 x 10 9至約9 x 10 9、約7 x 10 9至約8 x 10 9、約8 x 10 9至約1 x 10 10、約8 x 10 9至約9 x 10 9、或約9×10 9至約1×10 10) 的人類去核類紅血球。
在一些實施方案中，步驟(b)是在步驟(a)後約5至約9天 (例如約5至約8天、約5至約7天、約5至約6天、約6至約8天、約6至約7天、約7至約8天、約8至約9天) 進行。
在一些實施方案中，第二劑的醫藥組合物包括約8×10 8至約8×10 9(例如約8×10 8至約7×10 9、約8×10 8至約6×10 9、約8×10 8至約5×10 9、約8×10 8至約4×10 9、約8 x 10 8至約3 x 10 9、約8 x 10 8至約2 x 10 9、約8 x 10 8至約1 x 10 9、約8 x 10 8至約9 x 10 8、約9 x 10 8至約8 x 10 9、約9 x 10 8至約7 x 10 9、約9 x 10 8至約6 x 10 9、約9 x 10 8至約5 x 10 9、約9 x 10 8至約4 x 10 9、約9 x 10 8至約3 x 10 9、約9 x 10 8至約2 x 10 9、約9 x 10 8至約1 x 10 9、約1 x 10 9至約8 x 10 9、約1 x 10 9至約7 x 10 9、 約1 x 10 9至約6 x 10 9、約1 x 10 9至約5 x 10 9、約1 x 10 9至約4 x 10 9、約1 x 10 9至約3 x 10 9、約1 x 10 9至約2 x 10 9、約2 x 10 9至約8 x 10 9、約2 x 10 9至約7 x 10 9、約2 x 10 9至約6 x 10 9、約2 x 10 9至約5 x 10 9、約2 x 10 9至約4 x 10 9、約2 x 10 9至約3 x 10 9、約3 x 10 9至約8 x 10 9、約3 x 10 9至約7 x 10 9、約3 x 10 9至約6 x 10 9、約3 x 10 9至約5 x 10 9、約3 x 10 9至約4 x 10 9、約4 x 10 9至約8 x 10 9、約4 x 10 9至約7 x 10 9、約4 x 10 9至約6 x 10 9、約4 x 10 9至約5 x 10 9、約5 x 10 9至約8 x 10 9、約5 x 10 9至約7 x 10 9、約5 x 10 9至約6 x 10 9、約6×10 9至約8×10 9、約6×10 9至約7×10 9、或約7×10 9至約8×10 9) 的人類去核類紅血球。
在一些實施方案中，步驟(c)是在步驟(b)後約5天至約9天 (例如約5天至約8天、約5天至約7天、約5天至約6天、約6天至約8天、約6天至約7天、約7天至約8天、或約8天至約9天) 進行。
在一些實施方案中，第三劑的醫藥組合物包括約8×10 8至約8×10 9(例如約8×10 8至約7×10 9、約8×10 8至約6×10 9、約8×10 8至約5×10 9、約8×10 8至約4×10 9、約8x10 8至約3x10 9、約8x10 8至約2x10 9、約8x10 8至約1x10 9、約8x10 8至約9x10 8、約9x10 8至約8x10 9、約9x10 8至約7x10 9、約9x10 8至約6x10 9、約9x10 8至約5x10 9、約9x10 8至約4x10 9、約9x10 8至約3x10 9、約9x10 8至約2x10 9、約9x10 8至約1x10 9、約1x10 9至約8x10 9、約1x10 9至約7x10 9、約1x10 9至約6x10 9、約1x10 9至約5x10 9、約1x10 9至約4x10 9、約1x10 9至約3x10 9、約1x10 9至約2x10 9、約2x10 9至約8x10 9、約2x10 9至約7x10 9、約2x10 9至約6x10 9、約2x10 9至約5x10 9、約2x10 9至約4x10 9、約2x10 9至約3x10 9、約3x10 9至約8x10 9、約3x10 9至約7x10 9、約3x10 9至約6x10 9、約3x10 9至約5x10 9、約3x10 9至約4x10 9、約4x10 9至約8x10 9、約4x10 9至約7x10 9、約4x10 9至約6x10 9、約4x10 9至約5x10 9、約5x10 9至約8x10 9、約5x10 9至約7x10 9、約5x10 9至約6x10 9、約6x10 9至約8x10 9、約6x10 9至約7x10 9、或約7x10 9至約8x10 9) 的人類去核類紅血球。
在一些實施方案中，步驟(d)是在步驟(c)後約3周至約5周 (例如約21天至約35天、約21天至約34天、約21天至約32天、約21天至約30天、約21天至約28天、約21天至約26天、約21天至約24天、約21天至約22天、約22天至約35天、約22天至約34天、約22天至約32天、約22天至約30天、約22天至約28天、約22天至約26天、約22天至約24天、約24天至約35天、約24天至約34天、約24天至約32天、約24天至約30天、約24天至約28天、 約26天至約35天、約26天至約34天、約26天至約32天、約26天至約30天、約26天至約28天、約28天至約35天、約28天至約34天、約28天至約32天、約28天至約30天、約30天至約35天、約30天至約34天、約30天至約32天、或約32天至約35天) 進行。在一些實施方案中，步驟(d)是在步驟(c)後約4周進行。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，步驟(e)中的給藥頻率是大約每25天至大約每35天一次 (例如大約每25天至大約每34天、大約每25天至大約每33天、大約每25天至大約每32天、大約每25天至大約每31天、大約每25天至大約每30天、大約每25天至大約每29天、大約每25天至大約每28天、大約每25天至大約每27天、大約每25天至大約每27天、大約每26天至大約每27天、大約每26天至大約每35天、大約每26天至大約每34天、大約每26天至大約每33天、大約每26天至大約每32天、大約每26天至大約每31天、大約每26天至大約每30天、大約每26天至大約每29天、大約每26天至大約每28天、大約每26天至大約每27天、大約每27天至大約每35天、大約每27天至大約每34天、大約每27天至大約每33天、大約每27天至大約每32天、大約每27天至大約每31天、大約每27天至大約每30天、大約每27天至大約每29天、大約每27天至大約每28天、大約每28天至大約每35天、大約每28天至大約每34天、大約每28天至大約每33天、大約每28天至大約每32天、大約每28天至大約每31天、大約每28天至大約每30天、大約每28天至大約每29天、大約每29天至大約每35天、大約每29天至大約每34天、大約每29天至大約每33天、大約每29天至大約每32天、大約每29天至大約每31天、大約每29天至大約每30天、大約每30天至大約每35天、大約每30天至大約每34天、大約每30天至大約每33天、大約每30天至大約每33天、大約每30天至大約每32天、大約每30天至大約每31天、大約每31天至大約每35天、大約每31天至大約每34天、大約每31天至大約每33天、大約每31天至大約每32天、大約每32天至大約每35天、大約每32天至大約每34天、大約每32天至大約每33天、大約每33天至大約每35天、大約每33天至大約每34天、或大約每34天至大約每35天)。在一些實施方案中，步驟(e)中的給藥頻率是大約每4週一次。
在任何這些方法的一些實施方案中，步驟(d)中的第四劑和/或步驟(e)中的額外一劑或多劑的醫藥組合物包括從約1×10 7到約1×10 10(例如從約1 x 10 7至約8 x 10 9、從約 1 x 10 7至約6 x 10 9、從約 1 x 10 7至約4 x 10 9、從約1 x 10 7至約2 x 10 9、從約 1 x 10 7至約1 x 10 9、從約 1 x 10 7至約8 x 10 8、從約 1 x 10 7至約6 x 10 8、從約1 x 10 7至約4 x 10 8、從約 1 x 10 7至約2 x 10 8、從約 1 x 10 7至約1 x 10 8、從約 1 x 10 7至約8 x 10 7、從約 1 x 10 7至約6 x 10 7、從約 1 x 10 7至約4 x 10 7、從約 1 x 10 7至約2 x 10 7、從約2 x 10 7至約1 x 10 10、從約 2 x 10 7至約8 x 10 9、從約 2 x 10 7至約6 x 10 9、從約 2 x 10 7至約4 x 10 9、從約 2 x 10 7至約2 x 10 9、從約 2 x 10 7至約1 x 10 9、從約 2 x 10 7至約8 x 10 8、從約 2 x 10 7至約6 x 10 8、從約 2 x 10 7至約4 x 10 8、從約 2 x 10 7至約2 x 10 8、從約 2 x 10 7至約1 x 10 8、從約 2 x 10 7至約8 x 10 7、從約 2 x 10 7至約6 x 10 7、從約 2 x 10 7至約4 x 10 7、從約 4 x 10 7至約1 x 10 10、從約 4 x 10 7至約8 x 10 9、從約 4 x 10 7至約6 x 10 9、從約 4 x 10 7至約4 x 10 9、從約 4 x 10 7至約2 x 10 9、從約 4 x 10 7至約1 x 10 9、從約 4 x 10 7至約8 x 10 8、從約 4 x 10 7至約6 x 10 8、從約 4 x 10 7至約4 x 10 8、從約 4 x 10 7至約2 x 10 8、從約 4 x 10 7至約1 x 10 8、從約 4 x 10 7至約8 x 10 7、從約 4 x 10 7至約6 x 10 7、從約 6 x 10 7至約1 x 10 10、從約 6 x 10 7至約8 x 10 9、從約 6 x 10 7至約6 x 10 9、從約 6 x 10 7至約4 x 10 9、從約 6 x 10 7至約2 x 10 9、從約 6 x 10 7至約1 x 10 9、從約 6 x 10 7至約8 x 10 8、從約 6 x 10 7至約6 x 10 8、從約 6 x 10 7至約4 x 10 8、從約 6 x 10 7至約2 x 10 8、從約 6 x 10 7至約1 x 10 8、從約 6 x 10 7至約8 x 10 7、從約 8 x 10 7至約1 x 10 10、從約 8 x 10 7至約8 x 10 9、從約 8 x 10 7至約8 x 10 9、從約 6 x 10 7至約8 x 10 9、從約 8 x 10 7至約2 x 10 9、從約 8 x 10 7至約1 x 10 9、從約 8 x 10 7至約8 x 10 8、從約 8 x 10 7至約6 x 10 8、從約 8 x 10 7至約4 x 10 8、從約 8 x 10 7至約2 x 10 8、從約 8 x 10 7至約1 x 10 8、從約 1 x 10 8至約1 x 10 10、從約 1 x 10 8至約8 x 10 9、從約 1 x 10 8至約8 x 10 9、從約 1 x 10 8至約8 x 10 9、從約 1 x 10 8至約2 x 10 9、從約 1 x 10 8至約1 x 10 9、從約 1 x 10 8至約8 x 10 8、從約 1 x 10 8至約6 x 10 8、從約 1 x 10 8至約4 x 10 8、從約 1 x 10 8至約2 x 10 8、從約 4 x 10 8至約1 x 10 10、從約 4 x 10 8至約8 x 10 9、從約 4 x 10 8至約8 x 10 9、從約 4 x 10 8至約8 x 10 9、從約 4 x 10 8至約2 x 10 9、從約 4 x 10 8至約1 x 10 9、從約 4 x 10 8至約8 x 10 8、從約 4 x 10 8至約6 x 10 8、從約 6 x 10 8至約1 x 10 10、從約 6 x 10 8至約8 x 10 9、從約 6 x 10 8至約8 x 10 9、從約 6 x 10 8至約8 x 10 9、從約 6 x 10 8至約2 x 10 9、從約 6 x 10 8至約1 x 10 9、從約 6 x 10 8至約8 x 10 8、從約8 x 10 8至約1 x 10 10、從約 8 x 10 8至約8 x 10 9、從約 8 x 10 8至約8 x 10 9、從約 8 x 10 8至約8 x 10 9、從約 8 x 10 8至約2 x 10 9、從約 6 x 10 8至約1 x 10 9、從約 4 x 10 8至約8 x 10 8、從約 1 x 10 9至約1 x 10 10、從約 1 x 10 9至約8 x 10 9、從約 1 x 10 9至約6 x 10 9、從約 1 x 10 9至約4 x 10 9、從約1 x 10 9至約2 x 10 9) 的人類去核類紅血球。
在任何這些方法的一些實施方案中，步驟(d)中的第四劑和/或步驟(e)中的額外一劑或多劑的醫藥組合物包括約5×10 7至約5×10 8(例如約 5 x 10 7至約 4 x 10 8、約 5 x 10 7至約 2 x 10 8、約 5 x 10 7至約 1 x 10 8、約 5 x 10 7至約 8 x 10 7、約 5 x 10 7至約 6 x 10 7、約 6 x 10 7至約 5 x 10 8、約 6 x 10 7至約 4 x 10 8、約 6 x 10 7至約 2 x 10 8、約 6 x 10 7至約 1 x 10 8、約 6 x 10 7至約 8 x 10 7、約 8 x 10 7至約 5 x 10 8、約 8 x 10 7至約 4 x 10 8、約 8 x 10 7至約 2 x 10 8、約 8 x 10 7至約 1 x 10 8、約 1 x 10 8至約 5 x 10 8、約 1 x 10 8至約 4 x 10 8、約 1 x 10 8至約 2 x 10 8、約 2 x 10 8至約 5 x 10 8、約 2 x 10 8至約 4 x 10 8、約 4 x 10 8至約 5 x 10 8、或約 1 x 10 8) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的一些實施方案中，步驟(d)中的第四劑和/或步驟(e)中的額外一劑或多劑的醫藥組合物包括約5×10 8至約5×10 9(例如約5×10 8至約4×10 9、約5×10 8至約2×10 9、約5x10 8至約1x10 9、約5×10 8至約8×10 8、約5×10 8至約6×10 8、約6×10 8至約5×10 9、約6×10 8至約4×10 9、約6×10 8至約2×10 9、約6×10 8至約1×10 9、約6×10 8至約8×10 8、約8x10 8至約5x10 9、約8x10 8至約4x10 9、約8x10 8至約2x10 9、約8x10 8至約1x10 9、約1x10 9至約5x10 9、約1x10 9至約4x10 9、約1x10 9至約2x10 9、約2×10 9至約5×10 9、約2×10 9至約4×10 9、約4×10 9至約5×10 9、或約1×10 9) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的此類實施方案中，步驟(d)中的第四劑和/或步驟(e)中的額外一劑或多劑的醫藥組合物包括約5×10 9至約5×10 10(例如約5 x 10 9、至約4 x 10 10、約 5 x 10 9、至約2 x 10 10、約 5 x 10 9、至約1 x 10 10、約 5 x 10 9、至約8 x 10 9、約 5 x 10 9、至約6 x 10 9、約 6 x 10 9、至約5 x 10 10、約 6 x 10 9、至約4 x 10 10、約 6 x 10 9、至約2 x 10 10、約 6 x 10 9、至約1 x 10 10、約 6 x 10 9、至約8 x 10 9、約 8 x 10 9、至約5 x 10 10、約 8 x 10 9、至約4 x 10 10、約 8 x 10 9、至約2 x 10 10、約 8 x 10 9、至約1 x 10 10、約 1 x 10 10、至約5 x 10 10、約 1 x 10 10、至約4 x 10 10、約 1 x 10 10、至約2 x 10 10、約 2 x 10 10、至約5 x 10 10、約 2 x 10 10、至約4 x 10 10、約 4 x 10 10、至約5 x 10 10、或約1 x 10 10) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
本文提供了治療成年人類個體中軟組織肉瘤的方法，其包括：(a)：透過靜脈給藥方式，向成年人類個體投予含有約5×10 9至約7×10 9(例如約6×10 9) 人類去核類紅血球的第一劑醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的(i)IL-15或其功能性片段、以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽；(b)：在(a)後約6天至約8天 (例如約7天)，透過腫瘤內給藥方式，投予含有約1×10 9至約3×10 9(例如約2×10 9) 人類去核類紅血球的第二劑醫藥組合物；(c)：在(b)後約6天至約8天 (例如約7天)，透過腫瘤內給藥方式，投予含有約1×10 9至約3×10 9(例如約2×10 9) 人類去核類紅血球的第三劑醫藥組合物；以及(d)：在(a)後約3周至約5周，透過靜脈給藥方式，投予含有約0.1×10 10至約2×10 10(例如約1×10 10) 人類去核類紅血球的第四劑醫藥組合物。一些實施方案還包括(e)：在步驟(d)後約3周至約5周，以約每3周至約每5周的給藥頻率，額外投予一劑或更多劑 (例如二劑或更多劑、三劑或更多劑、四劑或更多劑、五劑或更多劑、六劑或更多劑、八劑或更多劑、十劑或更多劑、或十二劑或更多劑) 含有約0.1×10 10至約2×10 10(例如約1×10 10) 人類去核類紅血球的醫藥組合物。
此外，本文提供了治療有需要之成年人類個體中固態腫瘤的方法，其包括透過靜脈給藥方式，以約每2周至約每47天一次的給藥頻率，向成年人類個體投予含有從約 5 x 10 7至約5 x 10 10、從約 5 x 10 7至約1 x 10 10、從約 5 x 10 7至約5 x 10 9、從約 5 x 10 7至約1 x 10 9、從約 5 x 10 7至約5 x 10 8、從約 5 x 10 7至約1 x 10 8、從約 1 x 10 8至約5 x 10 10、從約 1 x 10 8至約1 x 10 10、從約 1 x 10 8至約5 x 10 9、從約 1 x 10 8至約1 x 10 9、從約 1 x 10 8至約5 x 10 8、從約 5 x 10 8至約5 x 10 10、從約 5 x 10 8至約1 x 10 10、從約 5 x 10 8至約5 x 10 9、從約 5 x 10 8至約1 x 10 9、從約 1 x 10 9至約5 x 10 10、從約 1 x 10 9至約1 x 10 10、從約 1 x 10 9至約5 x 10 9、從約5 x 10 9至約5 x 10 10、從約 5 x 10 9至約1 x 10 10、or 從約 1 x 10 10至約5 x 10 10人類去核類紅血球的醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上(例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)的(i)IL-15或其功能性片段、以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性融合多肽，以及一具有位於其細胞外表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約8×10 9至約2×10 10(例如約1×10 10) 的人類去核類紅血球，給藥頻率為約每2周至約每4周一次 (例如約每3周)。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約0.1×10 10至約2×10 10(例如約1×10 10) 的人類去核類紅血球，給藥頻率為約每19天至約每23天一次 (例如約每3周)。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約2×10 10至約4×10 10(約3×10 10) 的人類去核類紅血球，給藥頻率為約每26天至約每30天 (例如約每4周)。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，給藥頻率為大約每21天至大約每47天 (例如約每21天至約每46天、約每21天至約每44天、約每21天至約每42天、約每21天至約每40天、約每21天至約每38天、約每21天至約每36天、約每21天至約每34天、約每21天至約每32天、約每21天至約每30天、約每21天至約每28天、約每21天至約每26天、約每21天至約每24天、約每22天至約每47天、約每22天至約每46天、約每22天至約每44天、約每22天至約每42天、約每22天至約每40天、約每22天至約每38天、約每22天至約每36天、約每22天至約每34天、約每22天至約每32天、約每22天至約每30天、約每22天至約每28天、約每22天至約每26天、約每22天至約每24天、約每24天至約每47天、約每24天至約每46天、約每24天至約每44天、約每24天至約每42天、約每24天至約每40天、約每24天至約每38天、約每24天至約每36天、約每24天至約每34天、約每24天至約每32天、約每24天至約每30天、約每24天至約每28天、約每24天至約每26天、約每26天至約每47天、約每26天至約每46天、約每26天至約每44天、約每26天至約每42天、約每26天至約每40天、約每26天至約每38天、約每26天至約每36天、約每26天至約每34天、約每26天至約每32天、約每26天至約每30天、約每26天至約每28天、約每28天至約每47天、約每28天至約每46天、約每28天至約每44天、約每28天至約每42天、約每28天至約每40天、約每28天至約每38天、約每28天至約每36天、約每28天至約每34天、約每28天至約每32天、約每28天至約每30天、約每30天至約每47天、約每30天至約每46天、約每30天至約每44天、約每30天至約每42天、約每30天至約每40天、約每30天至約每38天、約每30天至約每36天、約每30天至約每34天、約每30天至約每32天、約每32天至約每47天、約每32天至約每46天、約每32天至約每44天、約每32天至約每42天、約每32天至約每40天、約每32天至約每38天、約每32天至約每36天、約每32天至約每34天、約每34天至約每47天、約每34天至約每46天、約每34天至約每44天、約每34天至約每42天、約每34天至約每40天、約每34天至約每38天、約每34天至約每36天、約每36天至約每47天、約每36天至約每46天、約每36天至約每44天、約每36天至約每42天、約每36天至約每40天、約每36天至約每38天、約每38天至約每47天、約每38天至約每46天、約每38天至約每44天、約每38天至約每42天、約每38天至約每40天、約每40天至約每47天、約每40天至約每46天、約每40天至約每44天、約每40天至約每42天、約每42天至約每47天、約每42天至約每46天、約每42天至約每44天、約每44天至約每47天、約每44天至約每46天、或約每45天至約每47天)。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，給藥頻率為大約每25天至大約每35天 (例如約每25天至約每34天、約每25天至約每33天、約每25天至約每32天、約每25天至約每31天、約每25天至約每30天、約每25天至約每29天、約每25天至約每28天、約每25天至約每27天、約每26天至約每35天、約每26天至約每34天、約每26天至約每33天、約每26天至約每32天、約每26天至約每31天、約每26天至約每30天、約每26天至約每29天、約每26天至約每28天、約每27天至約每35天、約每27天至約每34天、約每27天至約每33天、約每27天至約每32天、約每27天至約每31天、約每27天至約每30天、約每27天至約每29天、約每27天至約每28天、約每28天至約每35天、約每28天至約每34天、約每28天至約每33天、約每28天至約每32天、約每28天至約每31天、約每28天至約每30天、約每29天至約每35天、約每29天至約每34天、約每29天至約每33天、約每29天至約每32天、約每29天至約每31天、約每30天至約每35天、約每30天至約每34天、約每30天至約每33天、約每30天至約每32天、約每31天至約每35天、約每31天至約每34天、約每31天至約每33天、約每32天至約每35天、約每32天至約每34天、或約每33天至約每35天)。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 7至約5×10 8(例如約 5 x 10 7至約4 x 10 8、約5 x 10 7至約2 x 10 8、約5 x 10 7至約1 x 10 8、約5 x 10 7至約8 x 10 7、約5 x 10 7至約6 x 10 7、約6 x 10 7至約5 x 10 8、約6 x 10 7至約4 x 10 8、約6 x 10 7至約2 x 10 8、約6 x 10 7至約1 x 10 8、約6 x 10 7至約8 x 10 7、約8 x 10 7至約5 x 10 8、約8 x 10 7至約4 x 10 8、約8 x 10 7至約2 x 10 8、約8 x 10 7至約1 x 10 8、約1 x 10 8至約5 x 10 8、約1 x 10 8至約4 x 10 8、約1 x 10 8至約2 x 10 8、約2 x 10 8至約5 x 10 8、約2 x 10 8至約4 x 10 8、約4 x 10 8至約5 x 10 8、或約 1 x 10 8) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 8至約5×10 9(例如約 5 x 10 8至約4 x 10 9、約5 x 10 8至約2 x 10 9、約5 x 10 8至約1 x 10 9、約5 x 10 8至約8 x 10 8、約5 x 10 8至約6 x 10 8、約6 x 10 8至約5 x 10 9、約6 x 10 8至約4 x 10 9、約6 x 10 8至約2 x 10 9、約6 x 10 8至約1 x 10 9、約6 x 10 8至約8 x 10 8、約8 x 10 8至約5 x 10 9、約8 x 10 8至約4 x 10 9、約8 x 10 8至約2 x 10 9、約8 x 10 8至約1 x 10 9、約1 x 10 9至約5 x 10 9、約1 x 10 9至約4 x 10 9、約1 x 10 9至約2 x 10 9、約2 x 10 9至約5 x 10 9、約2 x 10 9至約4 x 10 9、約4 x 10 9至約5 x 10 9、或約 1 x 10 9) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的一些實施方案中，藥物組合物的劑量包括約1×10 9至約5×10 9(例如約 1 x 10 9至約4 x 10 9、約1 x 10 9至約3 x 10 9、約1 x 10 9至約2 x 10 9、約2 x 10 9至約5 x 10 9、約2 x 10 9至約4 x 10 9、約2 x 10 9至約3 x 10 9、約3 x 10 9至約5 x 10 9、約3 x 10 9至約4 x 10 9、約4 x 10 9至約5 x 10 9、或約 3 x 10 9) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的此類實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約5×10 9至約5×10 10(例如約 5 x 10 9至約4 x 10 10、約5 x 10 9至約2 x 10 10、約5 x 10 9至約1 x 10 10、約5 x 10 9至約8 x 10 9、約5 x 10 9至約6 x 10 9、約6 x 10 9至約5 x 10 10、約6 x 10 9至約4 x 10 10、約6 x 10 9至約2 x 10 10、約6 x 10 9至約1 x 10 10、約6 x 10 9至約8 x 10 9、約8 x 10 9至約5 x 10 10、約8 x 10 9至約4 x 10 10、約8 x 10 9至約2 x 10 10、約8 x 10 9至約1 x 10 10、約1 x 10 10至約5 x 10 10、約1 x 10 10至約4 x 10 10、約1 x 10 10至約2 x 10 10、約2 x 10 10至約5 x 10 10、約2 x 10 10至約4 x 10 10、約4 x 10 10至約5 x 10 10、或約 1 x 10 10) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約0.1×10 8至約2×10 8(例如約1×10 8) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)，並以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的頻率透過靜脈給藥。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約0.1×10 9至約2×10 9(例如約1×10 9) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)，並以約40天至約44天一次 (例如約42天) 的頻率透過靜脈給藥。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約2×10 9至約4×10 9(例如約3×10 9) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)，並以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的頻率透過靜脈給藥。
在任何這些方法的一些實施方案中，醫藥組合物的劑量包括約0.1×10 10至約2×10 10(例如約1×10 10) 的人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球)，並以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的頻率透過靜脈給藥。
在一些實施方案中，成年人類個體患有肛門癌 (例如肛門鱗狀細胞癌或轉移性肛門癌，例如轉移性肛門鱗狀細胞癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1×10 8至約2×10 8(例如約1×10 8) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有結腸直腸癌 (例如轉移性結腸直腸癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1×10 8至約2×10 8(例如約1×10 8) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有間皮瘤 (例如轉移性間皮瘤)，並且透過靜脈給藥方式，以約40天至約44天一次 (例如約42天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1×10 9至約2×10 9(例如約1×10 9) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有眼部黑色素瘤或葡萄膜黑色素瘤 (例如轉移性眼部黑色素瘤或轉移性葡萄膜黑色素瘤)，並且透過靜脈給藥方式，以約40天至約44天一次 (例如約42天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1×10 9至約2×10 9(例如約1×10 9) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有卵巢癌 (例如轉移性卵巢癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約40天至約44天一次 (例如約42天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1×10 9至約2×10 9(例如約1×10 9) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有前列腺癌 (例如去勢抗性前列腺癌、轉移性前列腺癌或轉移性去勢抗性前列腺癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約2×10 9到約4×10 9(例如約3×10 9) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有結腸直腸癌 (例如轉移性結腸直腸癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約2×10 9至約4×10 9(例如約3×10 9) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有黑色素瘤 (例如黏膜黑色素瘤、轉移性黑色素瘤或轉移性黏膜黑色素瘤)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約2×10 9至約4×10 9(例如約3×10 9) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有葡萄膜黑色素瘤或眼部黑色素瘤 (例如轉移性葡萄膜黑色素瘤或轉移性眼部黑色素瘤，例如有肝轉移的葡萄膜黑色素瘤或有肝轉移的眼部黑色素瘤)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1x10 10至約2x10 10(例如約1x10 10) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有非小細胞肺癌 (例如轉移性非小細胞肺癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約2×10 10至約4×10 10(例如約3×10 10) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有胰腺癌 (例如轉移性胰腺癌、胰腺導管腺癌或轉移性胰腺導管腺癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1x10 10至約2x10 10(例如約1x10 10) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有胃食道癌 (例如胃食道連接處 (GEJ) 腺癌、轉移性胃食道癌或轉移性胃食道連接處 (GEJ) 腺癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約0.1x10 10至約2x10 10(例如約1x10 10) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在一些實施方案中，成年人類個體患有前列腺癌 (例如轉移性前列腺癌)，並且透過靜脈給藥方式，以約26天至約30天一次 (例如約28天) 的給藥頻率，向該個體投予含有約2×10 9至約4×10 9(例如約3×10 9) 人類去核類紅血球 (例如本文所描述的任何例示性人類去核類紅血球) 的醫藥組合物。
在任何這些方法的一些實施方案中，該成年人類個體罹有選自於以下群組中的癌症：膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、胃食道癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤 (例如軟組織肉瘤)、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。
在任何這些方法的一些實施方案中，該成年人類個體罹有選自於以下群組中的癌症：結腸直腸癌、肛門癌、間皮瘤、眼部黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌以及肉瘤 (例如軟組織肉瘤)。在一些實施方案中，黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在本文所述的任何方法的一些實施方案中，癌症是轉移性癌症 (例如本文所述的任何例示性癌症的轉移性癌症)。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
本文所描述的任何方法的一些實施方案還包括向成年人類個體投予一種或多種額外的治療劑。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑是癌症治療劑。在一些實施方案中，癌症治療劑是選自於以下群組：免疫檢查點分子抑製劑 (例如本文所述的任何例示性免疫檢查點分子抑製劑)、化療劑、治療性抗體、嵌合抗原受體-T細胞、激酶抑製劑或可溶性細胞激素。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以與本文所提供的任何組合物基本上同時投予成年人類個體。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以在向成年人類個體施以本文所述的任何組合物之前或之後投予於成年人類個體。
本文所描述的任何方法的一些實施方案還包括向成年人類個體投予一種或多種額外的治療劑。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑是癌症治療劑。在一些實施方案中，癌症治療劑是選自於以下群組：免疫檢查點分子抑製劑 (例如本文所述的任何例示性免疫檢查點分子抑製劑)、化療劑、治療性抗體、嵌合抗原受體-T細胞、激酶抑製劑或可溶性細胞激素。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以與本文所提供的任何組合物基本上同時投予成年人類個體。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以在向成年人類個體投予本文所述的任何組合物之前或之後投予於成年人類個體。
舉例而言，在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑包括可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2的製劑，以及/或可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2結合的製劑 (以非限制性例子來說，是一種或多種的納武單抗 (ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO、BRISTOL MYERS SQUIBB)、帕博利珠單抗 (KEYTRUDA, MERCK)、匹地珠單抗(CT-011, CURE TECH)、MK-3475 (MERCK)、BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB)以及MPDL328OA (ROCHE))。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑包括可以阻斷、減少和/或抑制CTLA-4活性和/或CTLA-4與其一種或多種受體 (例如CD80、CD86、AP2M1、SHP-2和PPP2R5A) 結合的製劑。舉例來說，在一些實施方案中，抑制CTLA-4活性的製劑是抗體，如伊匹單抗 (MDX-010、MDX-101、Yervoy、BRISTOL MYERS SQUIBB) 以及/或曲美單抗 (PFIZER)。此外，在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑包括針對免疫檢查點分子的阻斷抗體，例如BTLA、HVEM、TIM3、GALS、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160 (也稱為BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、GITR、GITRL、半乳糖凝集素-9、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a、TMIGD2以及各種B-7家族配體 (包括但不限於B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6以及B7-H7)。 人類個體固態腫瘤或非固態腫瘤的治療方法
本文提供了治療有需要之人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 中固態腫瘤或非固態腫瘤的方法，其包括以約每2周至約每47天一次的給藥頻率，向人類個體投予 (例如靜脈內給藥或腫瘤內給藥) 含有約1×10 8至約1×10 11人類去核類紅血球的醫藥組合物 (例如，約1 x 10 8至約8 x 10 10、約1 x 10 8至約6 x 10 10、約1 x 10 8至約4 x 10 10、約1 x 10 8至約2 x 10 10、約1 x 10 8至約1 x 10 10、約1 x 10 8至約8 x 10 9、約1 x 10 8至約6 x 10 9、約1 x 10 8至約4 x 10 9、約1 x 10 8至約2 x 10 9、約1 x 10 8至約1 x 10 9、約1 x 10 8至約8 x 10 8、約1 x 10 8至約6 x 10 8、約1 x 10 8至約4 x 10 8、約1 x 10 8至約2 x 10 8、約2 x 10 8至約1 x 10 11、約2 x 10 8至約8 x 10 10、約2 x 10 8至約6 x 10 10、約2 x 10 8至約4 x 10 10、約2 x 10 8至約2 x 10 10、約2 x 10 8至約1 x 10 10、約2 x 10 8至約8 x 10 9、約2 x 10 8至約6 x 10 9、約2 x 10 8至約4 x 10 9、約2 x 10 8至約2 x 10 9、約2 x 10 8至約1 x 10 9、約2 x 10 8至約8 x 10 8、約2 x 10 8至約6 x 10 8、約2 x 10 8至約4 x 10 8、約4 x 10 8至約1 x 10 11、約4 x 10 8至約8 x 10 10、約4 x 10 8至約6 x 10 10、約4 x 10 8至約4 x 10 10、約4 x 10 8至約2 x 10 10、約4 x 10 8至約1 x 10 10、約4 x 10 8至約8 x 10 9、約4 x 10 8至約6 x 10 9、約4 x 10 8至約4 x 10 9、約4 x 10 8至約2 x 10 9、約4 x 10 8至約1 x 10 9、約4 x 10 8至約8 x 10 8、約4 x 10 8至約6 x 10 8、約6 x 10 8至約1 x 10 11、約6 x 10 8至約8 x 10 10、約6 x 10 8至約6 x 10 10、約6 x 10 8至約4 x 10 10、約6 x 10 8至約2 x 10 10、約6 x 10 8至約1 x 10 10、約6 x 10 8至約8 x 10 9、約6 x 10 8至約6 x 10 9、約6 x 10 8至約4 x 10 9、約6 x 10 8至約2 x 10 9、約6 x 10 8至約1 x 10 9、約6 x 10 8至約8 x 10 8、約8 x 10 8至約1 x 10 11、約8 x 10 8至約8 x 10 10、約8 x 10 8至約6 x 10 10、約8 x 10 8至約4 x 10 10、約8 x 10 8至約2 x 10 10、約8 x 10 8至約1 x 10 10、約8 x 10 8至約8 x 10 9、約8 x 10 8至約6 x 10 9、約8 x 10 8至約4 x 10 9、約8 x 10 8至約2 x 10 9、約8 x 10 8至約1 x 10 9、約1 x 10 9至約1 x 10 11、約1 x 10 9至約8 x 10 10、約1 x 10 9至約6 x 10 10、約1 x 10 9至約4 x 10 10、約1 x 10 9至約2 x 10 10、約1 x 10 9至約1 x 10 10、約1 x 10 9至約8 x 10 9、約1 x 10 9至約6 x 10 9、約1 x 10 9至約4 x 10 9、約1 x 10 9至約2 x 10 9、約2 x 10 9至約1 x 10 11、約2 x 10 9至約8 x 10 10、約2 x 10 9至約6 x 10 10、約2 x 10 9至約4 x 10 10、約2 x 10 9至約2 x 10 10、約2 x 10 9至約1 x 10 10、約2 x 10 9至約8 x 10 9、約2 x 10 9至約6 x 10 9、約2 x 10 9至約4 x 10 9、約4 x 10 9至約1 x 10 11、約4 x 10 9至約8 x 10 10、約4 x 10 9至約6 x 10 10、約4 x 10 9至約4 x 10 10、約4 x 10 9至約2 x 10 10、約4 x 10 9至約1 x 10 10、約4 x 10 9至約8 x 10 9、約4 x 10 9至約6 x 10 9、約6 x 10 9至約1 x 10 11、約6 x 10 9至約8 x 10 10、約6 x 10 9至約6 x 10 10、約6 x 10 9至約4 x 10 10、約6 x 10 9至約2 x 10 10、約6 x 10 9至約1 x 10 10、約6 x 10 9至約8 x 10 9、約8 x 10 9至約1 x 10 11、約8 x 10 9至約8 x 10 10、約8 x 10 9至約6 x 10 10、約8 x 10 9至約4 x 10 10、約8 x 10 9至約2 x 10 10、約8 x 10 9至約1 x 10 10、約1 x 10 10至約1 x 10 11、約1 x 10 10至約8 x 10 10、約1 x 10 10至約6 x 10 10、約1 x 10 10至約4 x 10 10、約1 x 10 10至約2 x 10 10、約2 x 10 10至約1 x 10 11、約2 x 10 10至約8 x 10 10、約2 x 10 10至約6 x 10 10、約2 x 10 10至約4 x 10 10、約4 x 10 10至約1 x 10 11、約4 x 10 10至約8 x 10 10、約4 x 10 10至約6 x 10 10、約6 x 10 10至約1 x 10 11、約6 x 10 10至約8 x 10 10或約8 x 10 10至約1 x 10 11人類去核類紅血球)，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的(i)IL-15或其功能性片段、以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，給藥頻率為約每2周至約每47天一次(例如，約每2周至約每46天、約每2周至約每44天、約每2周至約每42天、約每2周至約每40天、約每2周至約每38天、約每2周至約每36天、約每2周至約每35天、約每2周至約每34天、約每2周至約每32天、約每2周至約每30天、約每2周至約每28天、約每2周至約每26天、約每2周至約每24天、約每2周至約每22天、約每2周至約每21天、約每2周至約每20天、約每2周至約每18天、約每2周至約每16天、約每16天至約每47天、約每16天至約每46天、約每16天至約每44天、約每16天至約每42天、約每16天至約每40天、約每16天至約每38天、約每16天至約每36天、約每16天至約每34天、約每16天至約每32天、約每16天至約每30天、約每16天至約每28天、約每16天至約每26天、約每16天至約每24天、約每16天至約每22天、約每16天至約每20天、約每16天至約每18天、約每18天至約每47天、約每18天至約每46天、約每18天至約每44天、約每18天至約每42天、約每18天至約每40天、約每18天至約每38天、約每18天至約每36天,about每18天至約每34天、約每18天至約每32天、約每18天至約每30天、約每18天至約每28天、約每18天至約每26天、約每18天至約每24天、約每18天至約每22天、約每18天至約每20天、約每20天至約每47天、約每20天至約每46天、約每20天至約每44天、約每20天至約每42天、約每20天至約每40天、約每20天至約每38天、約每20天至約每36天、約每20天至約每34天、約每20天至約每32天、約每20天至約每30天、約每20天至約每28天、約每20天至約每26天、約每20天至約每24天、約每20天至約每22天、約每22天至約每47天、約每22天至約每46天、約每22天至約每44天、約每22天至約每42天、約每22天至約每40天、約每22天至約每38天、約每22天至約每36天、約每22天至約每34天、約每22天至約每32天、約每22天至約每30天、約每22天至約每28天、約每22天至約每26天、約每22天至約每24天、約每24天至約每47天、約每24天至約每46天、約每24天至約每44天、約每24天至約每42天、約每24天至約每40天、約每24天至約每38天、約每24天至約每36天、約每24天至約每34天、約每24天至約每32天、約每24天至約每30天、約每24天至約每28天、約每24天至約每26天、約每26天至約每47天、約每26天至約每46天、約每26天至約每44天、約每26天至約每42天、約每26天至約每40天、約每26天至約每38天、約每26天至約每36天、約每26天至約每34天、約每26天至約每32天、約每26天至約每30天、約每26天至約每28天、約每28天至約每47天、約每28天至約每46天、約每28天至約每44天、約每28天至約每42天、約每28天至約每40天、約每28天至約每38天、約每28天至約每36天、約每28天至約每34天、約每28天至約每32天、約每28天至約每30天、約每30天至約每47天、約每30天至約每46天、約每30天至約每44天、約每30天至約每42天、約每30天至約每40天、約每30天至約每38天、約每30天至約每36天、約每30天至約每34天、約每30天至約每32天、約每32天至約每47天、約每32天至約每46天、約每32天至約每44天、約每32天至約每42天、約每32天至約每40天、約每32天至約每38天、約每32天至約每36天、約每32天至約每34天、約每34天至約每47天、約每34天至約每46天、約每34天至約每44天、約每34天至約每42天、約每34天至約每40天、約每34天至約每38天、約每34天至約每36天、約每36天至約每47天、約每36天至約每46天、約每36天至約每44天、約每36天至約每42天、約每36天至約每40天、約每36天至約每38天、約每38天至約每47天、約每38天至約每46天、約每38天至約每44天、約每38天至約每42天、約每38天至約每40天、約每40天至約每47天、約每40天至約每46天、約每40天至約每44天、約每40天至約每42天、約每42天至約每47天、約每42天至約每46天、約每42天至約每44天、約每44天至約每47天、約每44天至約每46天、或約每45天至約每47天)。
在一些實施方案中，給藥頻率為約每2周至約每4周一次(例如，約每2周至約每26天、約每2周至約每24天、約每2周至約每22天、約每2周至約每20天、約每2周至約每18天、約每2周至約每16天、約每16天至約每4周、約每16天至約每26天、約每16天至約每24天、約每16天至約每22天、約每16天至約每20天、約每16天至約每18天、約每18天至約每4周、約每18天至約每26天、約每18天至約每24天、約每18天至約每22天、約每18天至約每20天、約每20天至約每4周、約每20天至約每26天、約每20天至約每24天、約每20天至約每22天、約每22天至約每4周、約每22天至約每26天、約每22天至約每24天、約每24天至約每4周、約每24天至約每26天、或約每26天至約每4周)。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述給藥頻率是約每3週一次。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包括約1x10 10到約5x10 10(例如約1×10 10至約4×10 10、約1×10 10至約3×10 10、約1×10 10至約2×10 10、約2×10 10至約5×10 10、約2×10 10至約4×10 10、約2×10 10至約3×10 10、約3×10 10至約5×10 10、約3×10 10至約4×10 10、或約4×10 10至約5×10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包含約3×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包括約3 x 10 10至約7 x 10 10(例如約3 x 10 10至約6 x 10 10、約3 x 10 10至約5 x 10 10、約3 x 10 10至約4 x 10 10、約4 x 10 10至約7 x 10 10、約4 x 10 10至約6 x 10 10、約4 x 10 10至約5 x 10 10、約5 x 10 10至約7 x 10 10、約5 x 10 10至約6 x 10 10、或約6 x 10 10至約7 x 10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，二劑或更多劑的醫藥組合物包含約5×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該方法包括在誘導期向人類個體投予至少三劑的醫藥組合物，並在維持期向人類個體投予一劑或更多劑的醫藥組合物。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑的醫藥組合物包括約1x10 10至約5x10 10(例如約1x10 10至約4x10 10、約1x10 10至約3x10 10、約1x10 10至約2x10 10、約2x10 10至約5x10 10、約2x10 10至約4x10 10、約2x10 10至約3x10 10、約3x10 10至約5x10 10、約3x10 10至約4x10 10、或約4x10 10至約5x10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑的醫藥組合物包括約3×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期是以大約每3週一次的給藥頻率向人類個體投予至少三劑的醫藥組合物。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑的醫藥組合物包括約8x10 9至約3x10 10(例如約8×10 9至約2×10 10、約8×10 9至約1×10 10、約8×10 9至約9×10 9、約9×10 9至約3×10 10、約9×10 9至約2×10 10、約9×10 9至約1×10 10、約1×10 10至約3×10 10、約1×10 10至約2×10 10、或約2×10 10至約3×10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑的醫藥組合物包括約1×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑中的第一劑，是在誘導期向人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後向該人類個體進行給藥。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑的醫藥組合物包括約3x10 10至約7x10 10(例如約3×10 10至約6×10 10、約3×10 10至約5×10 10、約3×10 10至約4×10 10、約4×10 10至約7×10 10、約4×10 10至約6×10 10、約4×10 10至約5×10 10、約5×10 10至約7×10 10、約5×10 10至約6×10 10、或約6×10 10至約7×10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期向人類個體所投予之至少三劑的醫藥組合物包括約5×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在誘導期是以大約每3週一次的給藥頻率向人類個體投予至少三劑的醫藥組合物。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑的醫藥組合物包括約8x10 9至約3x10 10(例如約8×10 9至約2×10 10、約8×10 9至約1×10 10、約8×10 9至約9×10 9、約9×10 9至約3×10 10、約9×10 9至約2×10 10、約9×10 9至約1×10 10、約1×10 10至約3×10 10、約1×10 10至約2×10 10、或約2×10 10至約3×10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑的醫藥組合物包括約1×10 10人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在維持期向人類個體所投予之一劑或更多劑中的第一劑，是在誘導期向人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑給藥完畢時，大約3週後向該人類個體進行給藥。
在一些實施方案中，人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 罹有固態腫瘤。在任何這些方法的一些實施方案中，該人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 罹有選自於以下群組中的癌症：肛門癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、 胃食道癌、胃食道連接處腺癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。
在任何這些方法的一些實施方案中，該人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 罹有選自於以下群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤和肉瘤 (例如軟組織肉瘤)。在一些實施方案中，黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在任何這些方法的一些實施方案中，癌症是轉移性癌症 (例如本文所述的任何例示性癌症的轉移性癌症)。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，人類個體罹有非固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述非固態腫瘤是白血病或淋巴癌。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述白血病為急性骨髓性白血病 (AML)。
本文所描述的任何方法的一些實施方案還包括向人類個體投予一種或多種額外的治療劑。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑是癌症治療劑。在一些實施方案中，癌症治療劑是選自於以下群組：免疫檢查點分子抑製劑 (例如本文所述的任何例示性免疫檢查點分子抑製劑) (在本文中亦稱為「免疫檢查點抑製劑」)、化療劑、治療性抗體、嵌合抗原受體-T細胞、激酶抑製劑或可溶性細胞激素。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以與本文所提供的任何組合物基本上同時投予人類個體。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以在向人類個體投予本文所述的任何組合物之前或之後投予於人類個體。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，該方法進一步包括向人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 投予一個或多個劑量的免疫檢查點抑制劑。
舉例而言，在一些實施方案中，免疫檢查點抑製劑為可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2的製劑，以及/或可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2結合的製劑 (以非限制性例子來說，是一種或多種的納武單抗 (ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO、BRISTOL MYERS SQUIBB)、帕博利珠單抗 (KEYTRUDA，MERCK)、德瓦魯單抗(durvalumab) (IMFINZI)、阿替利珠單抗(atezolizumab) (TECENTRIQ)、阿維魯單抗(avelumab) (BAVENCIO)、西米普利單抗(cemiplimab) (LIBTAYO)、信迪利單抗(sintilimab) (IBI308)、特瑞普利單抗(toripalimab) (JS 001)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab) (SHR1210)、多西林單抗(dostarlimab) (JEMPERLI)、JTX-4014 (Jounce Therapeutics)、斯巴達珠單抗(spartalizumab) (PDR001)、替雷利珠單抗(tislelizumab) (BGB-A317)、INCMGA00012 (MGA012)、AMP-224、AMP-514 (MEDI0680)、KN035、CK-301、AUNP12、CA-170、BMS-986189 (BRISTOL MYERS SQUIBB)、匹地珠單抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475 (MERCK)、BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB)以及MPDL328OA (ROCHE))。在一些實施方案中，免疫檢查點抑製劑為可以阻斷、減少和/或抑制CTLA-4活性和/或CTLA-4與其一種或多種受體 (例如CD80、CD86、AP2M1、SHP-2和PPP2R5A) 結合的製劑。舉例來說，在一些實施方案中，抑制CTLA-4活性的免疫檢查點抑製劑是抗體，如伊匹單抗 (MDX-010、MDX-101、Yervoy、BRISTOL MYERS SQUIBB) 以及/或曲美單抗 (PFIZER)。此外，在一些實施方案中，免疫檢查點抑製劑是針對免疫檢查點分子的阻斷抗體，例如BTLA、HVEM、TIM3、GALS、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160 (也稱為BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、GITR、GITRL、半乳糖凝集素-9、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a、TMIGD2以及各種B-7家族配體 (包括但不限於B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6以及B7-H7)。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑是帕博利珠單抗。在一些實施方案中，向人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 投予二劑或更多劑的帕博利珠單抗。在一些實施方案中，以至少每三周一次的頻率，向人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 投予二劑或更多劑的帕博利珠單抗。在一些實施方案中，二劑或更多劑的帕博利珠單抗包括約180毫克至約420毫克 (例如，about 180 mg 至約 400 mg、約180 mg 至約 380 mg、約180 mg 至約 360 mg、約180 mg 至約 340 mg、約180 mg 至約 320 mg、約180 mg 至約 300 mg、約180 mg 至約 280 mg、約180 mg 至約 260 mg、約180 mg 至約 240 mg、約180 mg 至約 220 mg、約180 mg 至約 200 mg、約200 mg 至約 420 mg、約200 mg 至約 400 mg、約200 mg 至約 380 mg、約200 mg 至約 360 mg、約200 mg 至約 340 mg、約200 mg 至約 320 mg、約200 mg 至約 300 mg、約200 mg 至約 280 mg、約200 mg 至約 260 mg、約200 mg 至約 240 mg、約200 mg 至約 220 mg、約220 mg 至約 420 mg、約220 mg 至約 400 mg、約220 mg 至約 380 mg、約220 mg 至約 360 mg、約220 mg 至約 340 mg、約220 mg 至約 320 mg、約220 mg 至約 300 mg、約220 mg 至約 280 mg、約220 mg 至約 260 mg、約220 mg 至約 240 mg、約240 mg 至約 420 mg、約240 mg 至約 400 mg、約240 mg 至約 380 mg、約240 mg 至約 360 mg、約240 mg 至約 340 mg、約240 mg 至約 320 mg、約240 mg 至約 300 mg、約240 mg 至約 280 mg、約240 mg 至約 260 mg、約260 mg 至約 420 mg、約260 mg 至約 400 mg、約260 mg 至約 380 mg、約260 mg 至約 360 mg、約260 mg 至約 340 mg、約260 mg 至約 320 mg、約260 mg 至約 300 mg、約260 mg 至約 280 mg、約280 mg 至約 420 mg、約280 mg 至約 400 mg、約280 mg 至約 380 mg、約280 mg 至約 360 mg、約280 mg 至約 340 mg、約280 mg 至約 320 mg、約280 mg 至約 300 mg、約300 mg 至約 420 mg、約300 mg 至約 400 mg、約300 mg 至約 380 mg、約300 mg 至約 360 mg、約300 mg 至約 340 mg、約300 mg 至約 320 mg、約320 mg 至約 420 mg、約320 mg 至約 400 mg、約320 mg 至約 380 mg、約320 mg 至約 360 mg、約320 mg 至約 340 mg、約340 mg 至約 420 mg、約340 mg 至約 400 mg、約340 mg 至約 380 mg、約340 mg 至約 360 mg、約360 mg 至約 420 mg、約360 mg 至約 400 mg、約360 mg 至約 380 mg、約380 mg 至約 420 mg、約380 mg 至約 400 mg、或約 400 mg 至約 420 mg) 的帕博利珠單抗。在一些實施方案中，二劑或更多劑的帕博利珠單抗包括約180毫克至約220毫克 (例如200毫克) 的帕博利珠單抗。本文所描述的任何醫藥組合物均可如WO 2020/219909 (透過引用併入本文) 所述配製而成。
投予包含 (例如表現) 外源性製劑 (例如多肽) 的人類去核類紅血球 (例如網狀紅血球) 的方法已描述在例如WO2015/073587、WO2015/153102以及WO2019/173798中，其均透過引用全部併入本文中。
本文還提供了治療有需要之人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 中固態腫瘤或非固態腫瘤的方法，其包括向人類個體投予 (例如靜脈內給藥或腫瘤內給藥) 含有(a)約1×10 8至約1×10 11人類去核類紅血球的醫藥組合物 (例如about 1 x 10 8至約 8 x 10 10、約1 x 10 8至約 6 x 10 10、約1 x 10 8至約 4 x 10 10、約1 x 10 8至約 2 x 10 10、約1 x 10 8至約 1 x 10 10、約1 x 10 8至約 8 x 10 9、約1 x 10 8至約 6 x 10 9、約1 x 10 8至約 4 x 10 9、約1 x 10 8至約 2 x 10 9、約1 x 10 8至約 1 x 10 9、約1 x 10 8至約 8 x 10 8、約1 x 10 8至約 6 x 10 8、約1 x 10 8至約 4 x 10 8、約1 x 10 8至約 2 x 10 8、約2 x 10 8至約 1 x 10 11、約2 x 10 8至約 8 x 10 10、約2 x 10 8至約 6 x 10 10、約2 x 10 8至約 4 x 10 10、約2 x 10 8至約 2 x 10 10、約2 x 10 8至約 1 x 10 10、約2 x 10 8至約 8 x 10 9、約2 x 10 8至約 6 x 10 9、約2 x 10 8至約 4 x 10 9、約2 x 10 8至約 2 x 10 9、約2 x 10 8至約 1 x 10 9、約2 x 10 8至約 8 x 10 8、約2 x 10 8至約 6 x 10 8、約2 x 10 8至約 4 x 10 8、約4 x 10 8至約 1 x 10 11、約4 x 10 8至約 8 x 10 10、約4 x 10 8至約 6 x 10 10、約4 x 10 8至約 4 x 10 10、約4 x 10 8至約 2 x 10 10、約4 x 10 8至約 1 x 10 10、約4 x 10 8至約 8 x 10 9、約4 x 10 8至約 6 x 10 9、約4 x 10 8至約 4 x 10 9、約4 x 10 8至約 2 x 10 9、約4 x 10 8至約 1 x 10 9、約4 x 10 8至約 8 x 10 8、約4 x 10 8至約 6 x 10 8、約6 x 10 8至約 1 x 10 11、約6 x 10 8至約 8 x 10 10、約6 x 10 8至約 6 x 10 10、約6 x 10 8至約 4 x 10 10、約6 x 10 8至約 2 x 10 10、約6 x 10 8至約 1 x 10 10、約6 x 10 8至約 8 x 10 9、約6 x 10 8至約 6 x 10 9、約6 x 10 8至約 4 x 10 9、約6 x 10 8至約 2 x 10 9、約6 x 10 8至約 1 x 10 9、約6 x 10 8至約 8 x 10 8、約8 x 10 8至約 1 x 10 11、約8 x 10 8至約 8 x 10 10、約8 x 10 8至約 6 x 10 10、約8 x 10 8至約 4 x 10 10、約8 x 10 8至約 2 x 10 10、約8 x 10 8至約 1 x 10 10、約8 x 10 8至約 8 x 10 9、約8 x 10 8至約 6 x 10 9、約8 x 10 8至約 4 x 10 9、約8 x 10 8至約 2 x 10 9、約8 x 10 8至約 1 x 10 9、約1 x 10 9至約 1 x 10 11、約1 x 10 9至約 8 x 10 10、約1 x 10 9至約 6 x 10 10、約1 x 10 9至約 4 x 10 10、約1 x 10 9至約 2 x 10 10、約1 x 10 9至約 1 x 10 10、約1 x 10 9至約 8 x 10 9、約1 x 10 9至約 6 x 10 9、約1 x 10 9至約 4 x 10 9、約1 x 10 9至約 2 x 10 9、約2 x 10 9至約 1 x 10 11、約2 x 10 9至約 8 x 10 10、約2 x 10 9至約 6 x 10 10、約2 x 10 9至約 4 x 10 10、約2 x 10 9至約 2 x 10 10、約2 x 10 9至約 1 x 10 10、約2 x 10 9至約 8 x 10 9、約2 x 10 9至約 6 x 10 9、約2 x 10 9至約 4 x 10 9、約4 x 10 9至約 1 x 10 11,  about 4 x 10 9至約 8 x 10 10、約4 x 10 9至約 6 x 10 10、約4 x 10 9至約 4 x 10 10、約4 x 10 9至約 2 x 10 10、約4 x 10 9至約 1 x 10 10、約4 x 10 9至約 8 x 10 9、約4 x 10 9至約 6 x 10 9、約6 x 10 9至約 1 x 10 11、約6 x 10 9至約 8 x 10 10、約6 x 10 9至約 6 x 10 10、約6 x 10 9至約 4 x 10 10、約6 x 10 9至約 2 x 10 10、約6 x 10 9至約 1 x 10 10、約6 x 10 9至約 8 x 10 9、約8 x 10 9至約 1 x 10 11、約8 x 10 9至約 8 x 10 10、約8 x 10 9至約 6 x 10 10、約8 x 10 9至約 4 x 10 10、約8 x 10 9至約 2 x 10 10、約8 x 10 9至約 1 x 10 10、約1 x 10 10至約 1 x 10 11、約1 x 10 10至約 8 x 10 10、約1 x 10 10至約 6 x 10 10、約1 x 10 10至約 4 x 10 10、約1 x 10 10至約 2 x 10 10、約2 x 10 10至約 1 x 10 11、約2 x 10 10至約 8 x 10 10、約2 x 10 10至約 6 x 10 10、約2 x 10 10至約 4 x 10 10、約4 x 10 10至約 1 x 10 11、約4 x 10 10至約 8 x 10 10、約4 x 10 10至約 6 x 10 10、約6 x 10 10至約 1 x 10 11、約6 x 10 10至約 8 x 10 10、或約 8 x 10 10至約 1 x 10 11人類去核類紅血球)，以及(b)免疫檢查點抑製劑的醫藥組合物，該人類去核類紅血球包含一具有位於其細胞外表面上的(i)IL-15或其功能性片段、以及(ii)IL-15受體α或其功能性片段的第一外源性多肽，以及一具有位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段的第二外源性多肽。
在任何方法的一些實施方案中，該人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 罹有固態腫瘤。在任何這些方法的一些實施方案中，該人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 罹有選自於以下群組中的癌症：肛門癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、 胃食道癌、胃食道連接處腺癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。
在任何這些方法的一些實施方案中，該人類個體 (例如成年人類個體或兒科人類個體) 罹有選自於以下群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤和肉瘤 (例如軟組織肉瘤)。在一些實施方案中，黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在任何這些方法的一些實施方案中，癌症是轉移性癌症 (例如本文所述的任何例示性癌症的轉移性癌症)。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，人類個體罹有非固態腫瘤。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述非固態腫瘤是白血病或淋巴癌。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，所述白血病為急性骨髓性白血病 (AML)。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)的醫藥組合物的劑量包括約5x10 9到約5x10 10(例如約5 x 10 9至約 4 x 10 10、約5 x 10 9至約 3 x 10 10、約5 x 10 9至約 2 x 10 10、約5 x 10 9至約 1 x 10 10、約5 x 10 9至約 9 x 10 9、約5 x 10 9至約 8 x 10 9、約5 x 10 9至約 7 x 10 9、約5 x 10 9至約 6 x 10 9、約6 x 10 9至約 5 x 10 10、約6 x 10 9至約 4 x 10 10、約6 x 10 9至約 3 x 10 10、約6 x 10 9至約 2 x 10 10、約6 x 10 9至約 1 x 10 10、約6 x 10 9至約 9 x 10 9、約6 x 10 9至約 8 x 10 9、約6 x 10 9至約 7 x 10 9、約7 x 10 9至約 5 x 10 10、約7 x 10 9至約 4 x 10 10、約7 x 10 9至約 3 x 10 10、約7 x 10 9至約 2 x 10 10、約7 x 10 9至約 1 x 10 10、約7 x 10 9至約 9 x 10 9、約7 x 10 9至約 8 x 10 9、約8 x 10 9至約 5 x 10 10、約8 x 10 9至約 4 x 10 10、約8 x 10 9至約 3 x 10 10、約8 x 10 9至約 2 x 10 10、約8 x 10 9至約 1 x 10 10、約8 x 10 9至約 9 x 10 9、約9 x 10 9至約 5 x 10 10、約9 x 10 9至約 4 x 10 10、約9 x 10 9至約 3 x 10 10、約9 x 10 9至約 2 x 10 10、約9 x 10 9至約 1 x 10 10、約1 x 10 10至約 5 x 10 10、約1 x 10 10至約 4 x 10 10、約1 x 10 10至約 3 x 10 10、約1 x 10 10至約 2 x 10 10、約2 x 10 10至約 5 x 10 10、約2 x 10 10至約 4 x 10 10、約2 x 10 10至約 3 x 10 10、約3 x 10 10至約 5 x 10 10、約3 x 10 10至約 4 x 10 10、或約 4 x 10 10至約 5 x 10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)的醫藥組合物的劑量包括約3×10 10人類去核類紅血球。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)的醫藥組合物的劑量包括約3x10 10到約7x10 10(例如約3x10 10至約6x10 10、約3x10 10至約5x10 10、約3x10 10至約4x10 10、約4x10 10至約7x10 10、約4x10 10至約6x10 10、約4x10 10至約5x10 10、約5x10 10至約7x10 10、約5x10 10至約6x10 10、或約6x10 10至約7x10 10) 的人類去核類紅血球。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)的醫藥組合物的劑量包括約5×10 10人類去核類紅血球。
在一些實施方案中，免疫檢查點抑製劑是帕博利珠單抗。在一些實施方案中，(b)的醫藥組合物的劑量包括約180毫克至約420毫克 (例如約180 mg 至約 400 mg、約180 mg 至約 380 mg、約180 mg 至約 360 mg、約180 mg 至約 340 mg、約180 mg 至約 320 mg、約180 mg 至約 300 mg、約180 mg 至約 280 mg、約180 mg 至約 260 mg、約180 mg 至約 240 mg、約180 mg 至約 220 mg、約180 mg 至約 200 mg、約200 mg 至約 420 mg、約200 mg 至約 400 mg、約200 mg 至約 380 mg、約200 mg 至約 360 mg、約200 mg 至約 340 mg、約200 mg 至約 320 mg、約200 mg 至約 300 mg、約200 mg 至約 280 mg、約200 mg 至約 260 mg、約200 mg 至約 240 mg、約200 mg 至約 220 mg、約220 mg 至約 420 mg、約220 mg 至約 400 mg、約220 mg 至約 380 mg、約220 mg 至約 360 mg、約220 mg 至約 340 mg、約220 mg 至約 320 mg、約220 mg 至約 300 mg、約220 mg 至約 280 mg、約220 mg 至約 260 mg、約220 mg 至約 240 mg、約240 mg 至約 420 mg、約240 mg 至約 400 mg、約240 mg 至約 380 mg、約240 mg 至約 360 mg、約240 mg 至約 340 mg、約240 mg 至約 320 mg、約240 mg 至約 300 mg、約240 mg 至約 280 mg、約240 mg 至約 260 mg、約260 mg 至約 420 mg、約260 mg 至約 400 mg、約260 mg 至約 380 mg、約260 mg 至約 360 mg、約260 mg 至約 340 mg、約260 mg 至約 320 mg、約260 mg 至約 300 mg、約260 mg 至約 280 mg、約280 mg 至約 420 mg、約280 mg 至約 400 mg、約280 mg 至約 380 mg、約280 mg 至約 360 mg、約280 mg 至約 340 mg、約280 mg 至約 320 mg、約280 mg 至約 300 mg、約300 mg 至約 420 mg、約300 mg 至約 400 mg、約300 mg 至約 380 mg、約300 mg 至約 360 mg、約300 mg 至約 340 mg、約300 mg 至約 320 mg、約320 mg 至約 420 mg、約320 mg 至約 400 mg、約320 mg 至約 380 mg、約320 mg 至約 360 mg、約320 mg 至約 340 mg、約340 mg 至約 420 mg、約340 mg 至約 400 mg、約340 mg 至約 380 mg、約340 mg 至約 360 mg、約360 mg 至約 420 mg、約360 mg 至約 400 mg、約360 mg 至約 380 mg、約380 mg 至約 420 mg、約380 mg 至約 400 mg、或約 400 mg 至約 420 mg) 的帕博利珠單抗。在一些實施方案中，(b)的醫藥組合物的劑量包括約180毫克至約220毫克 (例如約200毫克) 的帕博利珠單抗。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，(a)的醫藥組合物的劑量和(b)的醫藥組合物的劑量基本上是在同一時間投予。
在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在將(b)的醫藥組合物的劑量投予於個體之前，先將(a)的醫藥組合物的劑量投予於個體。在本文描述之任何方法的一些實施方案中，在將(a)的醫藥組合物的劑量投予於個體之前，先將(b)的醫藥組合物的劑量投予於個體。
本文所描述的任何方法的一些實施方案還包括向人類個體投予一種或多種額外的治療劑。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑是癌症治療劑。在一些實施方案中，癌症治療劑是選自於以下群組：化療劑、治療性抗體、嵌合抗原受體-T細胞、激酶抑製劑或可溶性細胞激素。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以與本文所提供的任何組合物基本上同時投予人類個體。在一些實施方案中，一種或多種額外的治療劑可以在向人類個體投予本文所述的任何組合物之前或之後投予於人類個體。
舉例而言，在一些實施方案中，免疫檢查點抑製劑為可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2的製劑，以及/或可以阻斷、減少和/或抑制PD-1與PD-L1或PD-L2結合的製劑 (以非限制性例子來說，是一種或多種的納武單抗(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO、BRISTOL MYERS SQUIBB)、帕博利珠單抗 (KEYTRUDA，MERCK)、德瓦魯單抗(IMFINZI)、阿替利珠單抗(TECENTRIQ)、阿維魯單抗(BAVENCIO)、西米普利單抗(LIBTAYO)、信迪利單抗(IBI308)、特瑞普利單抗(JS 001)、卡瑞利珠單抗(SHR1210)、多西林單抗(JEMPERLI)、JTX-4014 (Jounce Therapeutics)、斯巴達珠單抗(PDR001)、替雷利珠單抗(BGB-A317)、INCMGA00012 (MGA012)、AMP-224、AMP-514 (MEDI0680)、KN035、CK-301、AUNP12、CA-170、BMS-986189 (BRISTOL MYERS SQUIBB)、匹地珠單抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475 (MERCK)、BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB)以及MPDL328OA (ROCHE))。在一些實施方案中，免疫檢查點抑製劑為可以阻斷、減少和/或抑制CTLA-4活性和/或CTLA-4與其一種或多種受體 (例如CD80、CD86、AP2M1、SHP-2和PPP2R5A) 結合的製劑。舉例來說，在一些實施方案中，抑制CTLA-4活性的免疫檢查點抑製劑是抗體，如伊匹單抗 (MDX-010、MDX-101、Yervoy、BRISTOL MYERS SQUIBB) 以及/或曲美單抗 (PFIZER)。此外，在一些實施方案中，免疫檢查點抑製劑是針對免疫檢查點分子的阻斷抗體，例如BTLA、HVEM、TIM3、GALS、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160 (也稱為BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、GITR、GITRL、半乳糖凝集素-9、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a、TMIGD2以及各種B-7家族配體 (包括但不限於B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6以及B7-H7)。
本文所描述的任何醫藥組合物均可如WO 2020/219909 (透過引用併入本文) 所述配製而成。
投予包含(例如表現)外源性製劑(例如多肽)的人類去核類紅血球(例如網狀紅血球)的方法已描述在例如WO2015/073587、WO2015/153102以及WO2019/173798中，其均透過引用全部併入本文中。 製劑組
本文還提供了製劑組，其包括本文所提供之任何劑量的醫藥組合物以及執行本文所述之任何方法的指示說明。在一些實施方案中，人類去核類紅血球包括至少1,000複製、至少10,000複製或至少15,000複製的第一外源性多肽。在一些實施方案中，人類去核類紅血球包括約1,000複製至約100,000複製、約1,000複製至約80,000複製、約1,000複製至約60,000複製、約1,000複製至約50,000複製、約1,000複製至約40,000複製、約1,000複製至約30,000複製、約1,000複製至約20,000複製、約1,000複製至約10,000複製、約1,000複製至約5,000複製、約5,000複製至約100,000複製、約5,000複製至約80,000複製、約5,000複製至約60,000複製、約5,000複製至約50,000複製、約5,000複製至約40,000複製、約5,000複製至約30,000複製、約5,000複製至約20,000複製、約5,000複製至約10,000複製、約10,000複製至約100,000複製、約10,000複製至約80,000複製、約10,000複製至約60,000複製、約10,000複製至約50,000複製、約10,000複製至約40,000複製約10,000複製至約30,000複製約10,000複製至約20,000複製約20,000複製至約100,000複製約20,000複製至約80,000複製約20,000複製至約60,000複製約20,000複製至約50,000複製約20,000複製至約40,000複製約20,000複製至約30,000複製約30,000複製至約100,000複製約30,000複製至約80,000複製約30,000複製至約60,000複製約30,000複製至約50,000複製約30,000複製至約40,000複製約40,000複製至約100,000複製約40,000複製至約80,000複製約40,000複製至約60,000複製約40,000複製至約50,000複製約50,000複製至約100,000複製約50,000複製至約80,000複製約50,000複製至約60,000複製約60,000複製至約100,000複製約60,000複製至約80,000複製或約80,000複製至約100,000複製的第一外源性多肽。
在一些實施方案中，人類去核類紅血球包括至少1,000複製、至少10,000複製或至少15,000複製的第二外源性多肽。在一些實施方案中，人類去核類紅血球包括約1,000複製至約100,000複製約1,000複製至約80,000複製約1,000複製至約60,000複製約1,000複製至約50,000複製約1,000複製至約40,000複製約1,000複製至約30,000複製約1,000複製至約20,000複製約1,000複製至約10,000複製約1,000複製至約5,000複製約5,000複製至約100,000複製約5,000複製至約80,000複製約5,000複製至約60,000複製約5,000複製至約50,000複製約5,000複製至約40,000複製約5,000複製至約30,000複製約5,000複製至約20,000複製約5,000複製至約10,000複製約10,000複製至約100,000複製約10,000複製至約80,000複製約10,000複製至約60,000複製約10,000複製至約50,000複製約10,000複製至約40,000複製約10,000複製至約30,000複製約10,000複製至約20,000複製約20,000複製至約100,000複製約20,000複製至約80,000複製約20,000複製至約60,000複製約20,000複製至約50,000複製約20,000複製至約40,000複製約20,000複製至約30,000複製約30,000複製至約100,000複製約30,000複製至約80,000複製約30,000複製至約60,000複製約30,000複製至約50,000複製約30,000複製至約40,000複製約40,000複製至約100,000複製約40,000複製至約80,000複製約40,000複製至約60,000複製約40,000複製至約50,000複製約50,000複製至約100,000複製約50,000複製至約80,000複製約50,000複製至約60,000複製約60,000複製至約100,000複製約60,000複製至約80,000複製或約80,000複製至約100,000複製的第二外源性多肽。
本文所描述的任何醫藥組合物劑量均可如WO 2020/219909 (透過引用併入本文) 所述配製而成，並投予成年人類個體。
本文還提供了製劑組，其包括一個或多個含有本文所述之任何組合物的無菌容器 (例如無菌錐形管、無菌培養皿、無菌小瓶 (例如硼矽酸鹽玻璃小瓶) 以及無菌塑膠袋 (鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯 (DEHP)-塑化聚氯乙烯 (PVC) 袋，或正丁醯基三 (正己基)-檸檬酸鹽 (BTHC) 塑化聚氯乙烯袋)。在一些實施方案中，本文所提供的任何製劑組可進一步包括用於向有需要的成年人類個體靜脈內投予任何醫藥組合物的指示說明。
本文所述製劑組的一些實施方案包括本文所述任何醫藥組合物的合適單一劑型。舉例而言，本文所述任何醫藥組合物之單一劑型的體積可以是例如約 0.5 mL至約 2 L、約 0.5 mL至約 1800 mL、約 0.5 mL至約 1500 mL、約 0.5 mL至約 1200 mL、約 0.5 mL至約 1000 mL、約 0.5 mL至約 800 mL、約 0.5 mL至約 600 mL、約 0.5 mL至約 400 mL、約 0.5 mL至約 200 mL、約 0.5 mL至約 180 mL、約 0.5 mL至約 160 mL、約 0.5 mL至約 140 mL、約 0.5 mL至約 120 mL、約 0.5 mL至約 100 mL、約 0.5 mL至約 80 mL、約 0.5 mL至約 60 mL、約 0.5 mL至約 40 mL、約 0.5 mL至約 20 mL、約 0.5 mL至約 10 mL、約 0.5 mL至約 5 mL、約 0.5 mL至約 1.0 mL、約 1.0 mL至約 2 L、約 1.0 mL至約 1800 mL、約 1.0 mL至約 1500 mL、約 1.0 mL至約 1200 mL、約 1.0 mL至約 1000 mL、約 1.0 mL至約 800 mL、約 1.0 mL至約 600 mL、約 1.0 mL至約 400 mL、約 1.0 mL至約 200 mL、約 1.0 mL至約 180 mL、約 1.0 mL至約 160 mL、約 1.0 mL至約 140 mL、約 1.0 mL至約 120 mL、約 1.0 mL至約 100 mL、約 1.0 mL至約 80 mL、約 1.0 mL至約 60 mL、約 1.0 mL至約 40 mL、約 1.0 mL至約 20 mL、約 1.0 mL至約 10 mL、約 1.0 mL至約 5 mL、約 5 mL至約 2 L、約 5 mL至約 1800 mL、約 5 mL至約 1500 mL、約 5 mL至約 1200 mL、約 5 mL至約 1000 mL、約 5 mL至約 800 mL、約 5 mL至約 600 mL、約 5 mL至約 400 mL、 約 5 mL至約 200 mL、約 5 mL至約 180 mL、約 5 mL至約 160 mL、約 5 mL至約 140 mL、約 5 mL至約 120 mL、約 5 mL至約 100 mL、約 5 mL至約 80 mL、約 5 mL至約 60 mL、約 5 mL至約 40 mL、約 5 mL至約 20 mL、約 5 mL至約 10 mL、約 10 mL至約 2 L、約 10 mL至約 1800 mL、約 10 mL至約 1500 mL、約 10 mL至約 1200 mL、約 10 mL至約 1000 mL、約 10 mL至約 800 mL、約 10 mL至約 600 mL、約 10 mL至約 400 mL、約 10 mL至約 200 mL、約 10 mL至約 180 mL、約 10 mL至約 160 mL、約 10 mL至約 140 mL、約 10 mL至約 120 mL、約 10 mL至約 100 mL、約 10 mL至約 80 mL、約 10 mL至約 60 mL、約 10 mL至約 40 mL、約 10 mL至約 20 mL、約 20 mL至約 2 L、約 20 mL至約 1800 mL、約 20 mL至約 1500 mL、約 20 mL至約 1200 mL、約 20 mL至約 1000 mL、約 20 mL至約 800 mL、約 20 mL至約 600 mL、約 20 mL至約 400 mL、約 20 mL至約 200 mL、約 20 mL至約 180 mL、約 20 mL至約 160 mL、約 20 mL至約 140 mL、約 20 mL至約 120 mL、約 20 mL至約 100 mL、約 20 mL至約 80 mL、約 20 mL至約 60 mL、約 20 mL至約 40 mL、約 40 mL至約 2 L、約 40 mL至約 1800 mL、約 40 mL至約 1500 mL、 約 40 mL至約 1200 mL、約 40 mL至約 1000 mL、約 40 mL至約 800 mL、約 40 mL至約 600 mL、約 40 mL至約 400 mL、約 40 mL至約 200 mL、約 40 mL至約 180 mL、約 40 mL至約 160 mL、約 40 mL至約 140 mL、約 40 mL至約 120 mL、約 40 mL至約 100 mL、約 40 mL至約 80 mL、約 40 mL至約 60 mL、約 60 mL至約 2 L、約 60 mL至約 1800 mL、約 60 mL至約 1500 mL、約 60 mL至約 1200 mL、約 60 mL至約 1000 mL、約 60 mL至約 800 mL、約 60 mL至約 600 mL、約 60 mL至約 400 mL、約 60 mL至約 200 mL、約 60 mL至約 180 mL、約 60 mL至約 160 mL、約 60 mL至約 140 mL、約 60 mL至約 120 mL、約 60 mL至約 100 mL、約 60 mL至約 80 mL、約 80 mL至約 2 L、約 80 mL至約 1800 mL、約 80 mL至約 1500 mL、約 80 mL至約 1200 mL、約 80 mL至約 1000 mL、約 80 mL至約 800 mL、約 80 mL至約 600 mL、約 80 mL至約 400 mL、約 80 mL至約 200 mL、約 80 mL至約 180 mL、約 80 mL至約 160 mL、約 80 mL至約 140 mL、約 80 mL至約 120 mL、約 80 mL至約 100 mL、約 100 mL至約 2 L、約 100 mL至約 1800 mL、約 100 mL至約 1500 mL、約 100 mL至約 1200 mL、約 100 mL至約 1000 mL、約 100 mL至約 800 mL、約 100 mL至約 600 mL、約 100 mL至約 400 mL、約 100 mL至約 200 mL、約 100 mL至約 180 mL、約 100 mL至約 160 mL、約 100 mL至約 140 mL、約 100 mL至約 120 mL、約 120 mL至約 2 L、約 120 mL至約 1800 mL、約 120 mL至約 1500 mL、約 120 mL至約 1200 mL、約 120 mL至約 1000 mL、約 120 mL至約 800 mL、約 120 mL至約 600 mL、約 120 mL至約 400 mL、 約 120 mL至約 200 mL、約 120 mL至約 180 mL、約 120 mL至約 160 mL、約 120 mL至約 140 mL、約 140 mL至約 2 L、約 140 mL至約 1800 mL、約 140 mL至約 1500 mL、約 140 mL至約 1200 mL、約 140 mL至約 1000 mL、約 140 mL至約 800 mL、約 140 mL至約 600 mL、約 140 mL至約 400 mL、約 140 mL至約 200 mL、約 140 mL至約 180 mL、約 140 mL至約 160 mL、約 160 mL至約 2 L、約 160 mL至約 1800 mL、約 160 mL至約 1500 mL、約 160 mL至約 1200 mL、約 160 mL至約 1000 mL、約 160 mL至約 800 mL、約 160 mL至約 600 mL、約 160 mL至約 400 mL、約 160 mL至約 200 mL、約 160 mL至約 180 mL、約 180 mL至約 2 L、約 180 mL至約 1800 mL、約 180 mL至約 1500 mL、約 180 mL至約 1200 mL、約 180 mL至約 1000 mL、約 180 mL至約 800 mL、約 180 mL至約 600 mL、約 180 mL至約 400 mL、約 180 mL至約 200 mL、約 200 mL至約 2 L、約 200 mL至約 1800 mL、約 200 mL至約 1500 mL、約 200 mL至約 1200 mL、約 200 mL至約 1000 mL、約 200 mL至約 800 mL、約 200 mL至約 600 mL、約 200 mL至約 400 mL、約 400 mL至約 2 L、約 400 mL至約 1800 mL、約 400 mL至約 1500 mL、約 400 mL至約 1200 mL、約 400 mL至約 1000 mL、約 400 mL至約 800 mL、約 400 mL至約 600 mL、約 600 mL至約 2 L、約 600 mL至約 1800 mL、約 600 mL至約 1500 mL、約 600 mL至約 1200 mL、約 600 mL至約 1000 mL、約 600 mL至約 800 mL、約 800 mL至約 2 L、約 800 mL至約 1800 mL、約 800 mL至約 1500 mL、約 800 mL至約 1200 mL、約 800 mL至約 1000 mL、約 1000 mL至約 2 L、約 1000 mL至約 1800 mL、約 1000 mL至約 1500 mL、約 1000 mL至約 1200 mL、約 1200 mL至約 2 L、約 1200 mL至約 1800 mL、約 1200 mL至約 1500 mL、約 1500 mL至約 2 L、約 1500 mL至約 1800 mL、or 約 1800 mL至約 2 L。 實施例 實施例 1. 經遺傳工程設計以表現第一融合多肽之人類類紅血球的生成IL-15和IL-15/IL-15RA融合構築體
如下表4所示，製備了各種編碼融合多肽的DNA構築體，用於在人類紅血球中進行表現。 表 4.IL-15和IL-15/IL-15RA融合構築體以及多肽。SEQ ID NO是指胺基酸序列。
構築體 / 多肽 描述 SEQ ID NO:
V3IL-15 血型糖蛋白A訊號肽 (SEQ ID NO: 13) - 成熟人類IL-15 (SEQ ID NO: 2) - 連接子 – HA -連接子 (SEQ ID NO: 43) - 血型糖蛋白A (SEQ ID NO: 22) 24
V4IL-15 + IL-15RA (細胞外) 血型糖蛋白A訊號肽 (SEQ ID NO: 13) - 成熟人類 IL-15 (SEQ ID NO: 2) - 彈性連接子 (SEQ ID NO: 15) - 成熟人類細胞外IL-15RA (SEQ ID NO: 8) - 連接子-HA- 連接子 (SEQ ID NO: 43) - 血型糖蛋白A (SEQ ID NO: 22) 26
V5IL-15 + IL-15RA (壽司結構域加上13個胺基酸) 血型糖蛋白A訊號肽 (SEQ ID NO: 13) - 成熟人類 IL-15 (SEQ ID NO: 2) - 彈性連接子 (SEQ ID NO: 15) - 成熟人類IL-15RA (壽司結構域加上13個胺基酸) (SEQ ID NO: 11) - 連接子-HA-連接子 (SEQ ID NO: 43) - 血型糖蛋白A (SEQ ID NO: 22)   28
V3.1 血型糖蛋白A訊號肽 (SEQ ID NO: 13) - 成熟人類IL-15 (SEQ ID NO: 2) - 連接子 (SEQ ID NO: 21) - 血型糖蛋白A (SEQ ID NO: 22) 30
V4.1 血型糖蛋白A訊號肽 (SEQ ID NO: 13) - 成熟人類IL-15 (SEQ ID NO: 2) - 彈性連接子 (SEQ ID NO: 15) - 成熟人類細胞外IL-15RA (SEQ ID NO: 8) - 連接子 (SEQ ID NO: 21) - 血型糖蛋白A (SEQ ID NO: 22) 32
IL-15/IL-15RA 融合多肽 成熟人類IL-15 (SEQ ID NO: 2) - 彈性連接子 (SEQ ID NO: 15) - 成熟人類細胞外 IL-15RA (SEQ ID NO: 8) 17
IL-15/IL-15RA (壽司結構域加上13個胺基酸) 融合多肽 成熟人類IL-15 (SEQ ID NO: 2) - 彈性連接子 (SEQ ID NO: 15) - 成熟人類IL-15RA (壽司結構域加上13個胺基酸) (SEQ ID NO: 11) 19
如下所述，DNA構築體被選殖到慢病毒載體的多重選殖位中，在MSCV啟動子序列的控制下在類紅血球中進行表現。 慢病毒載體的生產
將構築體選殖到由MSCV啟動子序列 (System Biosciences) 所控制之慢病毒載體pCDH的多重選殖位中。用pPACKH1 (System Biosciences) 以及含有構築體的慢病毒載體pCDH來轉染293T細胞，使其產生慢病毒。將細胞置於新鮮的培養基中。在更換培養基後48小時，以轉速1,500rpm離心5分鐘，收集病毒上清液。 將上清液加以收集、過濾，並在-80℃下將等分樣品進行冷凍。 類紅血球的擴增和分化
使用源自於正常人類捐贈者之經動員周邊血液細胞的人類CD34陽性細胞。擴增/分化過程包括3個階段。在第一階段，將經解凍的CD34陽性類紅血球前驅細胞培養在Iscove's MDM (IMDM) 培養基中，該培養基包括重組人類胰島素、人類轉鐵蛋白、重組人類幹細胞因子以及重組人類介白素3。在第二階段，將類紅血球培養在IMDM培養基中，該培養基補充有重組人類胰島素、人類轉鐵蛋白、重組人類幹細胞因子、人類重組紅血球生成素以及L-穀氨醯胺。在第三階段，將類紅血球培養在IMDM培養基中，該培養基補充有人類轉鐵蛋白、重組人類胰島素、人類重組紅血球生成素以及肝素。將培養物保持在37°C，5% CO 2培養箱中。 類紅血球前驅細胞的轉導
將類紅血球前驅細胞在上述培養過程的第一階段中進行轉導。將培養基中的類紅血球前驅細胞與慢病毒上清液和聚凝胺相互混合。藉由旋轉接種，在室溫下以2,000rpm的轉速旋轉培養皿90分鐘來實現感染。在旋轉接種後，將細胞在37°C下培養過夜。 抗體結合
利用經PE標記的抗IL-15RA抗體(例如抗IL-15RA抗體 (JM7A4) (ab91270)，AbCam)結合來驗證經工程化類紅血球中第一外源性多肽的表現。透過流式細胞儀來分析APC螢光或PE螢光，進而測量抗體結合情況。根據經染色未受轉導的細胞來設定圈選範圍。 實施例 2. 經遺傳工程設計以表現第二多肽之人類類紅血球的生成4-1BBL構築體
如下表5所示，製備了DNA構築體，以用於在類紅血球中進行表現。 表 5. 4-1BBL 構築體。 SEQ ID NOs 是指胺基酸序列。
構築體 描述 SEQ ID NO:
4-1BBL 血型糖蛋白A訊號肽 (SEQ ID NO: 13) – 人類細胞外4-1BBL (SEQ ID NO: 34) – 4-1BBL連接子 (SEQ ID NO: 28) - 血型糖蛋白A (SEQ ID NO: 22) 36
慢病毒載體的生產
4-1BBL基因構築體如表6所示。將基因選殖到由MSCV啟動子序列所控制之慢病毒載體的多重選殖位中。用pPACKH1 (System Biosciences) 以及含有構築體的慢病毒載體pCDH來轉染293T細胞，使其產生慢病毒。將細胞置於新鮮的培養基中。在更換培養基後48小時，以轉速1,500rpm離心5分鐘，收集病毒上清液。將上清液加以收集、過濾，並在-80℃下將等分樣品進行冷凍。 類紅血球的擴增和分化
使用源自於正常人類捐贈者之可移動周邊血液細胞的人類CD34陽性細胞。擴增/分化過程包括三個階段。在第一階段，將經解凍的CD34陽性類紅血球前驅細胞培養在Iscove's MDM (IMDM) 培養基中，該培養基包括重組人類胰島素、人類轉鐵蛋白、重組人類幹細胞因子以及重組人類介白素3。在第二階段，將類紅血球培養在IMDM培養基中，該培養基補充有重組人類胰島素、人類轉鐵蛋白、重組人類幹細胞因子、人類重組紅血球生成素以及L-穀氨醯胺。在第三階段，將類紅血球培養在IMDM培養基中，該培養基補充有人類轉鐵蛋白、重組人類胰島素、人類重組紅血球生成素以及肝素。將培養物保持在37°C，5% CO 2培養箱中。 類紅血球前驅細胞的轉導
將類紅血球前驅細胞在上述培養過程的第一階段中進行轉導。將培養基中的類紅血球前驅細胞與慢病毒上清液和聚凝胺相互混合。藉由旋轉接種，在室溫下以2,000rpm的轉速旋轉培養皿90分鐘來實現感染。在旋轉接種後，將細胞在37°C下培養過夜。 抗體結合
利用經PE標記的抗4-1BBL抗體(例如經純化的抗人類4-1BB配體(CD137L)抗體，BioLegend)結合來驗證經工程化類紅血球中第二外源性多肽的表現。透過流式細胞儀來分析PE螢光，進而測量抗體結合情況。根據經染色未受轉導的細胞來設定圈選範圍。 實施例 3. 經遺傳工程設計以表現第一外源性多肽以及第二外源性多肽之人類類紅血球的生成慢病毒載體的生產
將構築體選殖到由MSCV啟動子序列(System Biosciences)所控制之慢病毒載體pCDH的多重選殖位中，使得一個載體包括IL-15/IL-15RA基因，另一個載體包括4-1BBL基因。用pPACKH1(System Biosciences)以及含有構築體的慢病毒載體pCDH來共同轉染293T細胞，使其產生慢病毒。將細胞置於新鮮的培養基中。在更換培養基後48小時，以轉速1,500 rpm離心5分鐘，收集病毒上清液。將上清液加以收集、過濾，並在-80℃下將等分樣品進行冷凍。
或者，將IL-15/IL-15RA融合多肽基因和4-1BBL基因構築並選殖到由MSCV啟動子序列(System Biosciences)所控制之慢病毒載體pCDH的多重選殖位中，使得單一載體包括IL-15/IL-15RA基因和4-1BBL基因。用pPACKH1(System Biosciences)以及含有IL-15/IL-15RA基因和4-1BBL基因的慢病毒載體pCDH來共同轉染293T細胞，使其產生慢病毒。將細胞置於新鮮的培養基中。在更換培養基後48小時，以轉速1,500rpm離心5分鐘，收集病毒上清液。將上清液加以收集、過濾，並在-80℃下將等分樣品進行冷凍。 紅血球的擴增和分化
使用源自於正常人類捐贈者之經動員周邊血液細胞的人類CD34陽性細胞。擴增/分化過程包括3個階段。在第一階段，將經解凍的CD34陽性類紅血球前驅細胞培養在IMDM培養基中，該培養基包括重組人類胰島素、人類轉鐵蛋白、重組人類幹細胞因子以及重組人類介白素3。在第二階段，將類紅血球培養在IMDM培養基中，該培養基補充有重組人類胰島素、人類轉鐵蛋白、重組人類幹細胞因子、人類重組紅血球生成素以及L-穀氨醯胺。在第三階段，將類紅血球培養在IMDM培養基中，該培養基補充有人類轉鐵蛋白、重組人類胰島素、人類重組紅血球生成素以及肝素。將培養物保持在37°C以及5% CO 2培養箱中。 類紅血球前驅細胞的轉導
將類紅血球前驅細胞在上述培養過程的第一階段中進行轉導。將培養基中的類紅血球前驅細胞與慢病毒上清液和聚凝胺相互混合。藉由旋轉接種，在室溫下以2,000rpm的轉速旋轉培養皿90分鐘來實現感染。在旋轉接種後，將細胞在37°C下培養過夜。 抗體結合
利用經PE標記的抗IL-15RA抗體(例如抗IL-15RA抗體 (JM7A4) (ab91270)，AbCam)結合來驗證經工程化類紅血球中第一外源性多肽的表現。利用經PE標記的抗4-1BBL抗體(例如經純化的抗人類4-1BB配體(CD137L)抗體，BioLegend)結合來驗證經工程化類紅血球中第二外源性多肽的表現。透過流式細胞儀來分析PE螢光，進而測量抗體結合情況。根據經染色未受轉導的細胞來設定圈選範圍。 實施例 4. 在細胞外表面上含有 IL-15/IL-15RA 和 4-1BBL 的小鼠類紅血球以及抗 PD-1 抗體的組合在小鼠中顯示了抗腫瘤效果
小鼠替代紅血球是利用點擊化學生物接合的原理來進行工程改造(Kolb et al., Angew Chemie 40:2004-2201, 2001)。這種方法是利用6-疊氮己酸磺基-N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯所提供的疊氮基團與二苯並環辛炔(DBCO)基團之間的特異性反應，以產生與重組蛋白接合的小鼠紅血球。重組小鼠4-1BBL和Fc-人類IL-15/IL-15Rα融合物(IL-15TP)是在Expi293F TM細胞(Thermo Fisher Scientific)中生產、純化，並在標記前濃縮到大於1 mg/mL。 蛋白質製劑中的內毒素測量值是小於每毫克10個內毒素單位(EU)。在生產和純化之後，4-1BBL和IL-15TP被接合到DBCO基團上，該基團在點擊反應中與疊氮基團反應。從全血中獲得的小鼠紅血球經過濾以去除白血球，並用6-疊氮己酸磺基-N-羥基琥珀醯亞胺酯進行標記。經過一夜的培養期間，經標記的小鼠紅血球可與4-1BBL和IL-15TP中之一者或二者進行化學接合。經接合的細胞用磷酸鹽緩衝液(PBS)加以清洗，並以抗小鼠4-1BBL抗體或抗小鼠IgG2a抗體進行染色，再透過流式細胞儀進行分析，以確定蛋白標記效率。
對照組的小鼠紅血球以類似方法加以製備，並沒有添加任何DBCO標記的蛋白質。
針對在細胞外表面上具有IL-15TP和4-1BBL的小鼠紅血球進行評估，以確定其在有或沒有抗PD-1抗體治療下對腫瘤小鼠的療效。C57BL/6小鼠在第0天進行靜脈接種B16F10黑色素瘤 (1×10 5細胞/小鼠)。在腫瘤接種後的第1天、第4天和第8天，向小鼠投予1×10 9對照組小鼠紅血球、與4-1BBL單獨接合的小鼠紅血球、與IL-15TP單獨接合的小鼠紅血球、與4-1BBL和IL-15TP同時接合的mRBC-240細胞，或與4-1BBL和IL-15TP同時接合的mRBC-240細胞併同150µg抗PD-1抗體(clone RMP1-14, aPD-1)。在第14天，對小鼠進行安樂死，收集其肺部，並統計肺部轉移情況。
圖1中的數據顯示，在接受以下治療的小鼠中，其腫瘤生長有明顯的抑制作用：(i) 與4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球 (p=0.0041，單因子變異數分析)；(ii) 對照組小鼠紅血球以及抗PD-1抗體 (p=0.0045)；(iii) 與4-1BBL單獨接合的小鼠紅血球以及抗PD-1抗體 (P＜0.0001)；(iv) 與IL-15TP單獨接合的小鼠紅血球以及抗PD-1抗體 (P＜0.0001)；以及(v) 與4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球以及抗PD-1抗體(P=0.0007)。
在一項非GLP的安全性研究中，包括對目前已知與4-1BB和IL-15促效劑相關毒性的重點評估，C57BL/6小鼠在第1天、第5天、第8天和第11天接受了以下治療：(1) 與4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球，其劑量為1×10 9、3×10 8或1×10 8細胞；(2) 與IL-15TP接合的小鼠紅血球 (1×10 9細胞)；(3) 與4-1BBL接合的小鼠紅血球 (1×10 9細胞)；(4) 對照組小鼠紅血球 (mRBC-CTRL，1×10 9細胞)；(5) 磷酸鹽緩衝液(PBS)；(6) 抗PD-1抗體 (clone RMP1-14, aPD-1, 150克)；或(7) 與4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球 (1×10 9、3×10 8、或1×10 8細胞) 以及抗PD-1抗體。投予促效劑抗小鼠4-1BB單株抗體選殖3H3 (3H3，50克和200克) 作為肝臟毒性的陽性對照。在任何接受小鼠紅血球治療的小鼠(對照組小鼠紅血球、與4-1BBL單獨接合的小鼠紅血球、與IL-15TP單獨接合的小鼠紅血球、或與4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球)中，不論是以單一藥物或併同抗PD-1抗體，都沒有觀察到身體或器官重量上的變化。並無證據表明在有或沒有抗PD-1抗體治療下，接受小鼠紅血球治療的小鼠產生肝臟毒性。具體來說，轉氨酶沒有增加，沒有CD8陽性T細胞或巨噬細胞浸潤到肝臟中，也沒有肝臟發炎的證據。參見圖2A至圖2D。全血細胞計數(CBC)顯示，與用對照組小鼠紅血球進行治療的小鼠相比，在用與4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球、與4-1BBL單獨接合的小鼠紅血球，或與IL-15TP單獨接合的小鼠紅血球進行治療的小鼠中，其血液學參數並沒有變化。投予促效劑抗小鼠4-1BB單株抗體選殖3H3(陽性對照組)會導致丙氨酸氨基轉移酶(ALT)升高，以及CD8陽性T細胞和巨噬細胞的肝臟浸潤增加。參見圖2A至圖2D。 實施例 5. 單獨使用 RTX-240 或與檢查點抑制劑聯合使用的安全性和耐受性評估
在細胞外表面上具有4-1BBL和IL-15TP的人類去核紅血球(如實施例3所述產生)是如實施例3所述而生成(RTX-240)。
目前正在評估RTX-240在復發/難治性或局部晚期固態腫瘤以及復發/難治性急性骨髓性白血病中的安全性和耐受性。此外，目前正在評估RTX-240與帕博利珠單抗聯合用於復發/難治性或局部晚期固態腫瘤的安全性和耐受性。此外，RTX-240單方治療的最佳給藥間隔也正在確定中。
RTX-240用於治療復發/難治性或局部晚期固態腫瘤或復發/難治性急性骨髓性白血病患者的開放式、多中心、多劑量給藥、首次人體試驗、第1/2期研究目前也正在進行。多達234位患者將被納入這項研究。
該研究是由四個不同的部分所組成：
該研究的第一部分將招募多達50位患者。第1部分主要是在評估RTX-240單方治療於復發/難治性或局部晚期固態腫瘤的安全性和藥理學，並確定建議的第2期劑量(RP2D)以及最佳給藥間隔，以便在該研究的第2部分中做進一步探索。在第1部分中所定義的RP2D可以是僅靜脈注射(IV)或是IV/腫瘤內注射 (IT) 組合的劑量含量。
第2部分將在四個組別中招募多達140位患者。第2部分主要是在評估RTX-240單方治療於特定固態腫瘤之RP2D的安全性和抗腫瘤活性。
第3部分將在5個組別中招募多達26位患者。第3部分主要是在評估RTX-240單方治療於復發/難治性急性骨髓性白血病的安全性和藥理學，並確定RP2D以及最佳給藥間隔，以便在後續的研究中做進一步探索。
第4部分將在4個組別中招募多達18位患者。第4部分主要是在評估RTX-240與標準劑量的帕博利珠單抗(每3周[Q3W]200毫克)組合治療復發/難治性或局部晚期固態腫瘤的安全性和藥理學，並確定該組合的RP2D。
研究的每一部分都將包括篩選期、治療期以及長期追蹤期(LTFU)。
在研究的第2部分中，將針對每個組別獨立進行期中分析，以確定該組別的進一步擴大與因無效而終止。
研究中所有部分的治療都將持續到疾病進展/治療失敗、不可接受的毒性、或撤回同意為止。僅在第4部分，帕博利珠單抗將在完成35次帕博利珠單抗治療(約2年)後停止；RTX-240治療將繼續。治療次數將從第一劑帕博利珠單抗開始計算。
該研究已經從第1部分的安全性組別(組別-1，劑量水平-1)開始。一旦確定了組別-1的安全性，第1部分的RTX-240劑量調升便可繼續，以及第3部分的劑量調升可以從安全性組別(組別-1，劑量水平-1)開始。第1部分將包括兩個結合IV注射和IT注射給藥方案的組別以及一個僅IT注射的組別。參見圖3所概述的研究設計示意圖。 劑量調升以及最佳給藥間隔的確定
第1部分、第3部分、和第4部分的劑量調升將採用針對劑量毒性的雙參數適應性貝葉斯邏輯回歸模型(BLRM)，利用具有較弱訊息的事前分布，以控制過量用藥的劑量遞增(EWOC)原則作為指導(Babb 1998, Neuenschwander 2008)，以便提出建議劑量並估計最大耐受劑量(MTD)，以及/或確定RTX-240單方治療對復發/難治性或局部晚期固態腫瘤(第1部分)和復發/難治性急性骨髓性白血病(第3部分)以及與帕博利珠單抗聯合治療(第4部分)之建議的第二期劑量。第1部分中的現有資訊將用於定義第4部分的事前分布。將使用三個獨立的BLRM，研究的每個第1期部分將使用1個模型。在進行劑量調升之前，至少3位劑量限制性毒性(DLT)可評估的患者將以一劑量水平進行治療，但第1部分以及第3部分的劑量水平-1除外，其將在每個第1期部分的初步安全性組別中招募2位DLT可評估的患者。
在第1部分中招募至劑量水平-1的第一位患者將接受2劑RTX-240，間隔4周給藥，然後才允許第二位患者入組。第二位患者可以在第一位患者接受第二劑RTX-240後7天入組，或者如果第一位患者因安全性以外的原因而沒有接受第二劑RTX-240，則可以在第一位患者的劑量限制性毒性評估期後入組。在完成初步安全性組別後，第1部分將繼續進行組別-1(劑量水平-1)的招募，第3部分將從安全性組別(組別-1，劑量水平-1)開始。第3部分的安全性組別(組別-1)將招募2位患者；在第3部分組別-1的第二位患者可以在第一位患者接受第一劑RTX-240後7天入組。在第1部分和第3部分的初步安全性組別完成後，患者的招募沒有等待期。在RTX-240起始劑量作為單方治療的安全性經過評估後，第4部分(組別1)將開始進行。第4部分中的第二位患者可以在第一位患者接受第二劑RTX-240以及帕博利珠單抗後7天入組。在第二位患者招募至第四部分的組別-1後，患者的招募沒有等待期。
所有第1期組別的劑量限制性毒性評估期為28天。DLT可評估的患者被定義為接受至少一劑RTX-240並在此後受監測28天的患者，或在28天內因DLT而停止研究治療的患者。
在確定了患者於特定劑量水平下的DLT狀態後，從而獲得在不同劑量水平下之DLT的事後概率分佈。本分析的結果將根據估計概率進行總結，即每個劑量水平的真實基礎DLT概率是處於以下各區間內： - 劑量不足區間：(0, 16%) - 目標毒性區間：(16%, 33%) - 過量毒性/超過劑量 (OD) 區間：(33%, 100%)
根據EWOC原則，除非根據目前的數據，一劑量水平的超過劑量概率≤25%，即概率(OD) ≤25%，否則該劑量水平將被認為對下一個組別是不可接受的。
在劑量調升過程中，如果基於累積的數據，目前估計的MTD是落在經本研究調查的劑量水平範圍內，且在16%至33%的目標毒性區間內，其DLT率至少有50%概率，那麼研究監督委員會(SMC)可以確定已達到MTD。MTD/RP2D之最終決定將由試驗委託者作出。 患者適格標準
要參加本研究，患者必須符合下表6所概述的以下標準。 表 6. 納入標準
特定疾病：1. 復發/難治性或局部晚期、不可切除、經組織學或細胞學診斷證實的固態腫瘤 (第1部分、第2部分和第4部分) 或復發/難治性、經細胞學診斷證實的AML(第3部分)是被定義為以下之任何一項 ：a. 經過1個或多個週期的治療後，第一線誘導治療失敗 b. 緩解持續期間少於6個月後首次復發 c. 復發的或難以用救援性療法進行治療 d. 第二次或後續復發。具有臨床相關突變 (例如FLT3、IDH1、IDH2) 的復發/難治性AML患者必須已接受標準的標靶治療。
2. 根據固態腫瘤反應評估標準(RECIST)第1.1版(第1部分、第2部分和第4部分)判定為可測量的疾病。關於第1部分中根據RECIST第1.1版判定為不可測量、可評估疾病的患者，試驗主持人應與試驗委託者之醫療監督人員聯繫。
3. 從先前治療的急性不良反應中恢復到小於等於第一級或基準(所有部分)。先前檢查點抑制劑治療的慢性、可控制的不良反應是可接受的(第一部分和第二部分)。
4. 完成先前的治療，包括放射治療，在研究治療前大於等於28天或5個半衰期，以較短者為準。
血液學、生物化學和器官功能：5. 充足的器官功能被定義為： a. 在肝臟內沒有癌症的情況下，天冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶小於等於3倍的正常上限值(ULN)，或在原發性或轉移性肝臟腫瘤的情況下，小於等於5倍的ULN。 b. 除了有記錄的吉伯特氏症候群(小於等於5倍的ULN)病例外，在肝臟內沒有癌症的情況下，總膽紅素小於等於1.5倍的ULN，或在原發性或轉移性肝臟腫瘤的情況下，總膽紅素小於等於3倍的ULN。 c. 血清白蛋白 ≥ 2.5 g/dL (第1部分、第2部分和第4部分)。 d. 血清或血漿肌酐酸 ≤ 1.5倍的ULN，和/或根據Cockcroft-Gault公式計算的腎小球濾過率 ≥ 50 mL/min/1.73。 e. 左心室射出率 ≥ 45%。
6. 充足的血液細胞數 (第1部分、第2部分和第4部分) 被定義為 ：a. 絕對嗜中性白血球數 ≥ 1×10 3/μL，無骨髓生長因子支持 ≥ 1周。 b. 血小板數 ≥ 100×10 3/μL，未輸注血小板 ≥ 1周。 c. 血紅素 ≥ 9g/dL，未輸注類紅血球 ≥ 2周。
一般事項：7. 提供書面知情同意書。
8. 男性或女性 ≥ 18歲。
9. 美國東岸癌症臨床研究合作組織日常體能狀態評分為0分或1分(第1部分、第2部分和第4部分)或0分至2分(第3部分)。
10. 如果有生育能力，同意在整個研究治療過程中以及在研究治療的最後一劑後6個月內使用高效率的 (女性) 或可接受的 (男性) 避孕方法。
關於部分的特定要求：11.  至少存在一個可見的、可觸及的或可透過影像學檢測的病變，並且適合於IT注射 (僅適用於第一部分所計畫招募到包括IT給藥組別中的患者)。
12.  參加本研究第2部分的患者必須被診斷為以下情況之一 ：a. 組別1：非小細胞肺癌 (NSCLC) - 具有EGFR、ALK或ROS-1突變的患者必須先前接受過或不符合針對其各自突變的治療。 b. 組別2：黑色素瘤。 c. 組別3：腎細胞癌。 d. 組別4：高度微衛星不穩定性或錯配修復缺陷的腫瘤、梅克爾細胞癌或皮膚鱗狀細胞癌。
13.  參加本研究第2部分的NSCLC或黑色素瘤患者必須願意提供自完成最近的抗癌治療以來所獲得的新鮮腫瘤活檢或組織塊標本，除非獲得該組織會使患者面臨不可接受的風險，且該要求已被試驗委託者醫療監督人員所免除。
14.  第四部分：患者必須在接受先前的計畫性死亡受體-1(PD-1)或計劃性細胞死亡配體-1(PD-L1)阻斷抗體(PD-1/PD-L1 Ab)後復發或難以用該阻斷抗體進行治療。第4部分的患者可以已經接受過1至3次含有檢查點抑制劑的先前治療。對於本研究的所有其他部分，允許事先接受PD-1/PD-L1 Ab治療，但不是必需的。
符合下表7所概述之以下任何標準的患者將被排除在本研究之外。 表 7. 排除標準
特定疾病：A. 診斷為原發性中樞神經系統 (CNS) 惡性腫瘤。
B. 已知的中樞神經系統轉移，除非無症狀、先前接受過治療，且穩定，未使用類固醇 ≥ 4周(第1部分、第2部分和第4部分)或已知的CNS白血病(第3部分)。
C. 先前接受過異體造血幹細胞移植(HSCT)，但參加第3部分的患者若已滿足以下所有條件者除外 ：a. HSCT是在第一次RTX-240給藥前超過100天所進行的。 b. 參加後1個月內沒有出現急性移植物對抗宿主疾病(GVHD)的活躍症狀。 c. 根據美國國家衛生研究院的一致標準判定為 ≤ 輕度、慢性GVHD。 d. 必須停止免疫抑制治療，患者只能接受相當於每天小於等於10毫克潑尼松的皮質類固醇劑量。允許使用鈣調磷酸酶抑制劑。 e. 有巨細胞病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、腺病毒或人類皰疹病毒-6病史的患者必須沒有活躍的感染癥兆和/或症狀。
D. 白血病胚細胞數 ≥ 25×10 3/μL (第三部分)。
血液學、生物化學和器官功能：E. 已知對研究治療的任何成分 (包括賦形劑) 的過敏反應。
F. 臨床上顯著的、活躍的、未受控制的感染，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)，或B型或C型肝炎病毒(HBV；HCV)。為了有受控的感染 ：a. HIV患者在參加前必須接受有效的抗反轉錄病毒治療 ≥ 4周，並且HIV量 ＜ 400複製/微升，在過去12個月內沒有後天免疫缺乏症候群所定義的伺機性感染，並且分化群4陽性 (CD4陽性) 細胞數 ≥ 350細胞/微升。 b. HBV患者必須接受抗病毒治療，且HBV量低於檢測極限值。 c. HCV患者必須已經完成抗病毒治療，且HCV量低於檢測極限值。
G. 臨床上顯著的凝血功能障礙，不包括為了預防或過往血栓所接受之抗凝血治療而造成的改變。對於包括IT給藥的組別，抗凝血治療必須能夠被安全地中斷或設法防止出血和相關併發症。
H. 未受控制的高血壓。
I. 在研究治療的28天內或5個半衰期內使用任何適應症的研究性藥物。
J. 研究治療後3年內的其他惡性腫瘤，不包括完全切除的基底細胞癌、非黑色素瘤皮膚癌、第1期子宮癌或其他有類似結果的惡性腫瘤。
K. 自體免疫溶血性貧血。
L. 伴發性疾病，包括需要主動免疫抑制的免疫相關不良事件(irAEs)或臨床上顯著第三級或以上irAE的病史(對於具有臨床上顯著第三級或以上免疫相關不良事件病史的患者，試驗主持人應諮詢試驗委託者醫療監督人員)。
M. 使用機構的標準類型和篩選測試，抗體篩選呈陽性。
一般事項：N. 試驗主持人認為會妨礙安全、道德和不受限制地遵守研究要求的任何醫療性、社會性或其他條件。
O. 懷孕或哺乳期。
P. 參加研究前4周內做過重大手術。
第四部分的特定排除標準：Q. 對PD-1/PD-L1阻斷抗體有嚴重過敏反應病史，除非先前成功地再次使用PD-1/PD-L1阻斷抗體。
R. 目前有非感染性肺炎或有放射性肺炎或需要使用類固醇的肺炎病史。有第2級或以上的免疫相關肺炎、肝炎、骨質疏鬆症或其他內分泌疾病的病史。
只有符合所有納入標準且沒有排除標準的患者才被納入本研究。
本研究正在進行中，但已執行了期中分析。迄今為止，接受治療之研究參與者的基準人口統計學如圖6所示。 研究用藥、劑量和給藥方式
RTX-240是一種由同種異體經培養的人類去核紅血球所組成的細胞療法，其可表現4-1BB配體以及反式呈現的介白素-15，其是位在細胞表面上的介白素-15與IL-15受體α的融合體(IL-15TP)。RTX-240是以每6周進行一次IV給藥和/或IT注射給藥，但在安全性組別期間，RTX-240是以每4周進行一次IV給藥。其他的給藥間隔可以根據貝葉斯邏輯回歸模型(BLRM)的指導以及研究監督委員會(SMC)的建議來進行探討。
帕博利珠單抗是一種人類化的免疫球蛋白G4計畫性死亡受體-1阻斷抗體，其僅在本研究的第四部分中與RTX-240聯合使用。在第4部分中，將以每3週一次(Q3W)的給藥頻率，以靜脈注射投予200毫克的帕博利珠單抗，在劑量調升組別中，RTX-240是以每3週一次(Q3W)的頻率進行給藥。
RTX-240的臨時劑量明定在圖3所示的研究示意圖中。實際劑量水平是根據BLRM的指導。 最大耐受劑量
第一期各部分的MTD將被獨立評估，且其將被估計為在滿足控制過量用藥劑量遞增(EWOC)標準(過量用藥概率 ≤ 25%)的劑量之中，是具有最高概率會落在目標毒性區間(DLT概率介於16%與33%之間)的劑量。 建議的第二期劑量
RP2D是基於安全性、抗腫瘤活性、PK/PD、以及可行性下，所選擇用於進一步研究的劑量。在第1部分(固態腫瘤)中所確定的RP2D將在本研究的第2部分中進行研究。在第3部分(AML)和第四部分(帕博利珠單抗)中所訂的RP2D可以在後續的研究中進行研究。在本研究第1期的所述部分中，RP2D可以是等於或低於MTD的任何劑量水平。由SMC負責確定RP2D。關於劑量選擇的最終決定將由試驗委託者做出。 最佳給藥間隔的確定
隨著安全性、PK、以及PD數據的出現，可以調整給藥間隔以便優化安全性和免疫活化。在本研究之第1期各部分中給藥間隔的最終選擇將由試驗委託者決定。 樣本數量的確定
如上文研究設計中所述，本研究的所有部分將招募至多234位患者。
在本研究第1期之所述部分中的實際招募人數將取決於在劑量調升期間所觀察到的安全性狀況。在本研究第2部分的實際招募人數預計將少於最大樣本數量，這是因為利用所觀察到的數據而實施無效停止標準。 統計分析計畫
作為一般方法，連續變項將使用平均值、標準差、中位數、最小值以及最大值來進行彙總。類別變項將使用頻率計數和百分比來進行彙總。事件發生時間數據將使用Kaplan-Meier方法來進行彙總。在適當的情況下，將顯示點估計值的信賴區間，並生成中位數和其他分位數的估計值，以及個別時間點 (用於事件發生時間數據)。 不良事件和嚴重不良事件
不良事件(AE)是指與人類使用治療措施相關的任何不良醫療事件，無論它是否被認為與治療措施有關。這包括發生在臨床試驗參與者身上的任何癥兆、症狀或臨床上顯著的檢驗改變，無論該事件是否與研究治療措施有明確的時間或因果關係。該發現可以是新的，也可以是現有病情的惡化。
如果檢驗改變需要治療措施，包括住院治療，或是與臨床癥兆或症狀有關，則該檢驗改變將被認為是臨床上顯著的。
不良事件是透過對研究參與者仔細監測而確定的，包括確定間隔病史、身體系統檢查、體格檢查和常規檢驗及其他評估。
如果試驗主持人認為AE符合以下任何標準，則該不良事件為嚴重不良事件(SAE) ：- 死亡 - 危及生命 - 需要住院治療或延長現有的住院時間 - 導致持續性或嚴重的喪失行為能力或正常活動的中斷 - 先天性畸形 - 重要醫療事件
重要醫療事件是指不符合任何其他標準的AE，但根據適當的醫療判斷被認為是嚴重的。它危及患者，並可能需要醫療或手術治療來防止發生上述結果中的一種。
不良事件與與研究治療的關係將由試驗主持人和試驗委託者利用表8中的指南來進行評估。與RTX-240和帕博利珠單抗(僅第4部分)的相關性將被單獨評估。 表 8. 不良事件與研究藥物的關係
分類 定義 通報目的分類
確定相關 有明確的證據表明存在因果關係，並且可以排除其他可能的促成因素。臨床事件發生在與研究治療有關的可信時序內，且無法以併發疾病或其他治療措施來解釋。停止研究治療後的反應在臨床上應有可信的依據。該事件必須在藥理學上或現象學上是明確的，如有需要，再次接受研究治療即出現該事件。 相關
極有可能相關 有證據表明存在因果關係，並且其他因素的影響是不太可能的。臨床事件發生在研究治療後的合理時序內，不太可能歸因於併發疾病或其他治療措施，並且可合理解釋停止研究治療後的臨床反應。 相關
可能相關 有一些證據表明存在因果關係 (例如事件發生在投予研究治療後的合理時序內)。然而，其他因素亦可能導致該事件的發生 (例如參與者的臨床病況、其他併發事件)。 相關
不太可能相關 臨床事件與投予研究治療的時間關係使得不太可能存在因果關係 (例如該事件未發生在投予研究治療後的合理時序內，或有其他可信的原因)。 不相關
不相關 臨床事件與投予研究治療的時間關係使得不太可能存在因果關係 (例如該事件未發生在投予研究治療後的合理時序內，或有其他可信的原因)。 不相關
統計分析
作為一般方法，連續變項將使用平均值、標準差、中位數、最小值以及最大值來進行彙總。類別變項將使用頻率計數和百分比來進行彙總。事件發生時間數據將使用Kaplan-Meier方法來進行彙總。在適當的情況下，將顯示點估計值的信賴區間，並生成中位數和其他分位數的估計值，以及個別時間點(用於事件發生時間數據)。
除非另有說明，否則本研究將使用以下方法 ：- 二項式終點的單一比例 - 使用Clopper-Pearson方法來計算雙邊信賴區間；p值將根據預先指定的二項式參數虛無假設，使用精確的二項分佈來進行單邊檢定。 - 比例差 - 使用Newcombe計分法來計算雙邊信賴區間，不進行連續性校正；p值將不予計算。 - 事件發生時間中位數 – 使用Kaplan-Meier方法來估計事件發生時間中位數；使用Brookmeyer-Crowley方法來計算雙邊信賴區間；p值將不予計算。 - 固定時間點的事件發生時間分析 - 使用Kaplan-Meier方法來估計特定時間點的無事件概率；使用Complementary log-log方法來計算雙邊信賴區間；p值將不予計算。
人口統計學和其他基準資料包括年齡、性別、種族、民族、身高、體重、ECOG日常體能狀態基準、初步診斷、診斷和篩檢時的疾病分期以及先前治療(包括全身性治療、放療和手術)，將按照患者個別列出，並使用描述性統計(連續資料)或列聯表(類別資料)，按照總體以及劑量水平、組別或其他適當分類進行彙總。 主要療效終點分析
在第2部分中，主要療效終點的統計檢定將在每個組別中單獨進行(給定了在完整分析群體中的單邊顯著水平為0.025情況下)。在完整分析群體中，沒有反應數據的患者將被算作無反應者。
根據預先指定的二項式參數虛無假設，使用精確的二項分佈來計算單邊p值。每個組別的虛無假設將具體列在統計分析計畫中。
在適當的情況下，將利用比例差和相關的95%信賴區間，基於描述性總結來對二個組別間的客觀反應率進行比較。本研究的目的並不在於正式檢定組別間的差異。 結果總結
雖然本研究正在進行中，且招募仍在繼續，但已執行了期中分析。第1部分的五個劑量組別已經完成，16位患者已進行安全性評估，15位患者已進行療效評估。未觀察到劑量限制性毒性或與治療相關的第3/4級不良事件。參見圖7。 此外，有2位有部分反應的患者(1位未經確認)以及4位病況穩定的患者。
圖4顯示了在轉移性第3線治療處置下，在1E8 Q4W IV組別中投予RTX-240後所觀察到的經確認部分反應。該患者是一位60歲的女性，患有肛門鱗狀細胞癌，先前曾接受過第1線藥物抗PD-L1(LY3300054)、第2線藥物阿替利珠單抗以及實驗性促效劑(ICOS)的治療。圖4的圖格1顯示了基準電腦斷層掃描圖像，其中箭頭指向兩個目標病變。圖格2、3、4 和 5顯示了以每4週1次的給藥頻率，目標病變大小分別在靜脈注射RTX-240後的2、4、6和8個月消退。在接受9次治療後，該患者的目標病變大小減小了54% (如圖格5所示)。
圖5顯示了在轉移性第2線治療處置下，在1E10 Q4W IV組別中投予RTX-240後所觀察到的未經確認部分反應。該患者是一位54歲的男性，患有已轉移到肝臟的轉移性葡萄膜黑色素瘤，先前在第一線轉移性治療處置下接受了納武單抗/伊匹單抗治療。 圖5的圖格1顯示了基準肝目標病變。圖格2和圖格3顯示了2個月和4個月或在第3次和第5次投予RTX-240後的目標病變。如圖格3所示，在16週時可觀察到肝目標病變完全消退。 其他實施方案
應當理解的是雖然本發明已經結合詳細說明進行了描述，但前述描述旨在說明而不是限制本發明的範圍，本發明是由所附的申請專利範圍來界定。其他方面、優點和修飾均在以下請求項的範圍內。
序列附錄
SEQ ID NO: 識別標的 序列
1 未成熟人類IL-15 MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
2 成熟人類IL-15 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
3 編碼成熟人類IL-15 (SEQ ID NO: 2) 的核酸 AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGC
4 編碼成熟人類IL-15 (SEQ ID NO: 2) 的核酸 AACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGT
5 未成熟全長人類IL-15受體α MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVE MEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
6 成熟全長人類IL-15受體α ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
7 未成熟細胞外人類IL-15受體α MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
8 成熟細胞外人類IL-15受體α ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
9 編碼SEQ ID NO: 8 (成熟細胞外人類IL-15受體α) 的核酸序列 ATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACT
10 人類IL-15受體壽司結構域 ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
11 人類IL-15受體壽司結構域 + 13個額外的IL-15受體α胺基酸 ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS
12 編碼SEQ ID NO: 11的核酸序列 ATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCC
13 GPA訊號肽 MYGKIIFVLLLSEIVSISA
14 編碼SEQ ID NO: 13的核酸序列 ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCA
15 (G4S) 3連接子 GGGGSGGGGSGGGGS
16 (GGGGS) n (GGGGS) n其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10
17 成熟人類IL-15 + (G4S) 3連接子 + 成熟細胞外可溶性人類IL-15受體α NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
18 編碼SEQ ID NO: 17的核酸序列 AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACT
19 成熟人類IL-15 + (G4S) 3連接 + IL-15受體α壽司結構域 + 13個額外的IL-15受體α胺基酸 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS
20 編碼 SEQ ID NO: 19的核酸序列 AACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGTGGTGGAGGGAGCGGGGGTGGTGGATCCATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCC
21 連接子 GGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGS
22 GPA多肽 LSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
23 編碼SEQ ID NO: 22的核酸序列 TTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
24 IL-15 V3構築體 MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
25 編碼SEQ ID NO:24 (IL-15 V3) 的核酸序列 ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTAAATGTGATTTCAGACCTGAAAAAAATCGAAGACCTTATTCAATCCATGCACATCGACGCGACACTTTATACTGAATCAGACGTACACCCGTCCTGTAAGGTTACTGCGATGAAGTGCTTTCTGTTGGAATTGCAAGTGATCTCCCTCGAATCAGGGGATGCATCCATTCATGATACCGTCGAGAATTTGATCATTCTGGCAAATAACTCCCTCAGTAGTAACGGGAATGTGACCGAGTCTGGGTGTAAGGAGTGCGAAGAGTTGGAGGAAAAGAATATCAAAGAATTCCTTCAGTCCTTTGTTCACATCGTGCAAATGTTTATTAATACATCTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
26 IL-15/IL-15Ra V4 構築體 MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
27 編碼 SEQ ID NO: 26 (IL-15-V4) 的核酸序列 ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
28 IL-15/IL-15Ra (壽司結構域 + 13個胺基酸) V5構築體 MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
29 編碼SEQ ID NO:28 (IL-15 V5) 的核酸序列 ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGTGGTGGAGGGAGCGGGGGTGGTGGATCCATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCCGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
30 IL-15 V3.1構築體 MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
31 編碼SEQ ID NO:30 (IL-15 V3.1) 的核酸序列 ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTAAATGTGATTTCAGACCTGAAAAAAATCGAAGACCTTATTCAATCCATGCACATCGACGCGACACTTTATACTGAATCAGACGTACACCCGTCCTGTAAGGTTACTGCGATGAAGTGCTTTCTGTTGGAATTGCAAGTGATCTCCCTCGAATCAGGGGATGCATCCATTCATGATACCGTCGAGAATTTGATCATTCTGGCAAATAACTCCCTCAGTAGTAACGGGAATGTGACCGAGTCTGGGTGTAAGGAGTGCGAAGAGTTGGAGGAAAAGAATATCAAAGAATTCCTTCAGTCCTTTGTTCACATCGTGCAAATGTTTATTAATACATCTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
32 IL-15/IL-15Ra V4.1構築體 MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
33 編碼SEQ ID NO:32 (IL-15-V4.1) 的核酸序列 ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAAACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
34 細胞外4-1BBL多肽 ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
35 編碼細胞外 4-1BBL (SEQ ID NO: 34) 的核酸序列 GCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
36 4-1BBL構築體 MYGKIIFVLLLSEIVSISAACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGSGGGPEDEPGSGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
37 編碼4-1BBL構築體 (SEQ ID NO: 36) 的核酸序列 ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAAGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCCCCGAGGACGAGCCCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
38 4-1BBL連接子 GGSGGSGGGPEDEPGSGSGGGSGGGS
39 編碼SEQ ID NO: 38的核酸序列 GGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCCCCGAGGACGAGCCCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCC
40 全長血型糖蛋白A胺基酸 MYGKIIFVLLLSAIVSISALSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
41 SMIM1多肽 MQPQESHVHYSRWEDGSRDGVSLGAVSSTEEASRCRRISQRLCTGKLGIAMKVLGGVALFWIIFILGYLTGYYVHKCK
42 G4S連接子 GGGGS
43 連接子-HA-連接子 GGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGS
44 連接子 GSGSGSGSGSEDEDEDEDGSGSGSGSGS
45 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
46 連接子 GSGSGSGSEDGSGSGSGS
47 連接子 GSGSGSGSGSGSGSGSGS
48 連接子 GCGGSGGGGSGGGGS
49 連接子 SGRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSPA
50 連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
51 Snorkel連接子 SGRGASSGSSGSGSQKKPRYEIRWKVVVISAILALVVLTVISLIILIMLWGSGMQSPA
52 免疫球蛋白重鏈可變區3訊號肽 MGWSCIILFLVATATGVHS
53 輕鏈前導序列 MRVPAQLLGLLLLWLPGARC
54 胺基酸連接子 AGST
圖1顯示了在有無與抗PD-1抗體共同治療下，在細胞外表面上具有IL-15/IL-15-RA和4-1BBL的小鼠類紅血球對腫瘤小鼠的療效評估。
圖2A至2D顯示了非GLP的研究結果，該研究的主要重點在於：針對目前已知與4-1BB和IL-15促效劑有關的毒性，評估該毒性對於接受對照藥物小鼠紅血球 (mRBCs)、4-1BBL單獨接合的小鼠紅血球、IL-15TP單獨接合的小鼠紅血球、4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球、4-1BBL和IL-15TP同時接合的小鼠紅血球並搭配抗PD-1抗體、單獨以抗PD-1抗體，或單獨以抗3H3抗體治療之小鼠的影響。圖2A顯示了受治療小鼠體內之丙氨酸氨基轉移酶 (ALT/SGPT) 的含量 (U/L)，圖2B顯示了受治療小鼠之肝臟中CD8陽性細胞的數量，圖2C顯示了受治療小鼠之肝臟中巨噬細胞的數量，以及圖2D顯示了受治療小鼠之肝臟中CD8陽性Eomes陽性KLRG陽性細胞的數量。
圖3是概述目前正在進行的開放式、多中心、多劑量給藥、首次人體試驗、第I/II期之研究設計示意圖，針對在細胞外表面上同時具有4-1BBL和IL-15TP的人類去核類紅血球 (RTX-240)，用於治療復發性/難治性或局部晚期固態腫瘤或復發/難治性急性骨髓性白血病患者。
圖4是一組電腦斷層掃描圖像，顯示了在肛門鱗狀細胞癌患者中，於投予細胞外表面上同時具有4-1BBL和IL-15TP的人類去核類紅血球 (RTX-240) 後所觀察到之經確認的部分反應。圖格1顯示了基準電腦斷層掃描圖像，其中箭頭指向兩個目標病變。圖格2、3、4 和 5顯示了以每4週1次的給藥頻率，目標病變大小分別在靜脈注射RTX-240後的2、4、6和8個月消退。在接受9次治療後，患者的目標病變大小減小了54% (圖格5)。
圖5是一組電腦斷層掃描圖像，顯示了在轉移性葡萄膜黑色素瘤患者中，於投予細胞外表面上同時具有4-1BBL和IL-15TP的人類去核類紅血球 (RTX-240) 後所觀察到的部分反應。圖格1顯示了基準肝目標病變。圖格2和圖格3顯示了2個月和4個月或在第3次和第5次投予RTX-240後的目標病變。如圖格3所示，在16週時可觀察到肝目標病變完全消退。
圖6是顯示迄今為止接受治療之研究參與者的基準人口統計學表格。
圖7是顯示迄今為止在接受治療之研究參與者中所觀察到的治療相關不良事件 (AE) 和免疫相關不良事件的表格。
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Claims (63)

  1. 一種治療有需要之人類個體中固態腫瘤或非固態腫瘤的方法，包括以約每2周至約每47天一次的頻率，向該人類個體靜脈投予含有約1×10 8至約1×10 11的包含一第一外源性多肽以及一第二外源性多肽的人類去核類紅血球的醫藥組合物，該第一外源性多肽包括位於該人類去核類紅血球細胞外表面上的(i) IL-15或其功能性片段、以及(ii) IL-15受體α或其功能性片段，該第二外源性多肽包括位於其表面上的4-1BBL或其功能性片段。
  2. 如請求項1所述之治療方法，其中該人類個體罹有選自於由下列所組成之群組中的癌症：肛門癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、胃食道癌、胃食道連接處腺癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該人類個體罹有選自於由下列所組成之群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤、和肉瘤。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、或黏膜黑色素瘤。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中該固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。
  6. 如請求項1至5所述之方法，其中該固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。
  7. 如請求項1至6所述之方法，其中該固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
  8. 如請求項1所述之方法，其中該人類個體罹有非固態腫瘤。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該非固態腫瘤是白血病或淋巴癌。
  10. 如請求項8所述之方法，其中該白血病為急性骨髓性白血病 (AML)。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中該頻率是約每2週一次至約每4週一次。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該頻率是約每3週一次。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之治療方法，其中二劑或更多劑的該醫藥組合物包括約1×10 10至約5×10 10該人類去核類紅血球。
  14. 如請求項13所述之方法，其中二劑或更多劑的該醫藥組合物包括約3×10 10該人類去核類紅血球。
  15. 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中二劑或更多劑的該醫藥組合物包含約3×10 10至約7×10 10該人類去核類紅血球。
  16. 如請求項15所述之方法，其中二劑或更多劑的該醫藥組合物包括約5×10 10該人類去核類紅血球。
  17. 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中該方法包括在誘導期向該人類個體投予該至少三劑，並在維持期向該人類個體投予該一或多劑。
  18. 如請求項17所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約1×10 10至約5×10 10該人類去核類紅血球。
  19. 如請求項18所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約3 x 10 10該人類去核類紅血球。
  20. 如請求項18或19所述之方法，其中在該誘導期是以大約每3週一次的頻率向該人類個體投予該至少三劑。
  21. 如請求項17至20中任一項所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之該一或多劑包括約1×10 10該人類去核類紅血球。
  22. 如請求項21所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之一劑或更多劑中的第一劑，是在該誘導期向該人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後投予該人類個體。
  23. 如請求項17所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約3×10 10至約7×10 10該人類去核類紅血球。
  24. 如請求項23所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約5 x 10 10該人類去核類紅血球。
  25. 如請求項23和24所述之方法，其中在該誘導期是以大約每3週一次的給藥頻率向該人類個體投予該至少三劑。
  26. 如請求項23至25中任一項所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之該一或多劑包括約1×10 10該人類去核類紅血球。
  27. 如請求項26所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之該一或多劑中的第一劑，是在該誘導期向該人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後投予該人類個體。
  28. 如請求項1至27中任一項所述之方法，其中該人類去核類紅血球包含至少1,000複製的該第一外源性多肽和至少1,000複製的該第二外源性多肽。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之方法，其中該人類去核類紅血球是藉由以下過程所製成，該過程包括 ：將編碼該第一外源性多肽的核酸以及編碼該第二外源性多肽的核酸引入到一有核類紅血球前驅細胞中； 在足以表現該第一外源性多肽和該第二外源性多肽的條件下，將該有核類紅血球前驅細胞進行培養；以及 將該有核類紅血球前驅細胞進行去核。
  30. 一種治療有需要之人類個體中固態腫瘤的方法，包括向該人類個體靜脈投予 (a) 一劑量之含有約1×10 8至約1×10 11的包含一第一外源性多肽以及一第二外源性多肽的人類去核類紅血球的醫藥組合物，該第一外源性多肽包括位於該人類去核類紅血球細胞外表面上的IL-15或IL-15功能性片段以及IL-15受體α或IL-15受體α功能性片段，該第二外源性多肽包括位於該人類去核類紅血球表面上的4-1BBL或其功能性片段，以及 (b) 一劑量之含有免疫檢查點抑制劑的醫藥組合物。
  31. 如請求項30所述之方法，其中該人類個體罹有選自於由下列所組成之群組中的癌症：肛門癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、中樞神經系統癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、眼癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道癌、 胃食道癌、胃食道連接處腺癌、泌尿生殖系統癌、頭頸部的頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌 (NSCLC)、非鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、間皮瘤、鼻咽癌 (NPC)、神經系統癌、神經內分泌癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、前列腺癌、去勢抗性前列腺癌、腎細胞癌 (RCC)、腎透明細胞癌、腎乳突細胞癌、肉瘤、皮膚癌、軟組織癌、鱗狀細胞癌、睾丸癌、睾丸生殖細胞癌、甲狀腺癌、尿道癌以及子宮癌，或其轉移性病變。
  32. 如請求項31所述之方法，其中該人類個體罹有選自於由下列所組成之群組中的癌症：結直腸癌、肛門癌、間皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺導管腺癌、胃食道連接處腺癌、黑色素瘤、和肉瘤。
  33. 如請求項32所述之方法，其中該黑色素瘤是眼部黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、或黏膜黑色素瘤。
  34. 如請求項30至33中任一項所述之方法，其中該固態腫瘤是不可切除的固態腫瘤。
  35. 如請求項30至34所述之方法，其中該固態腫瘤是局部晚期的固態腫瘤。
  36. 如請求項30至35所述之方法，其中該固態腫瘤是復發的或是難以用固態腫瘤之標準療法進行治療的固態腫瘤。
  37. 如請求項30至36中任一項所述之方法，其中該(a)的醫藥組合物的劑量包括約5×10 9至約5×10 10該人類去核類紅血球。
  38. 如請求項37所述之方法，其中該(a)的醫藥組合物的劑量包括約1×10 10該人類去核類紅血球。
  39. 如請求項30至36中任一項所述之方法，其中該(a)的醫藥組合物的劑量包括約3 x 10 10至約7 x 10 10該人類去核類紅血球。
  40. 如請求項39所述之方法，其中該(a)的醫藥組合物的劑量包括約5×10 10該人類去核類紅血球。
  41. 如請求項30至40中任一項所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑是帕博利珠單抗。
  42. 如請求項41所述之方法，其中該(b)的醫藥組合物的劑量包括約180毫克至約220毫克的帕博利珠單抗。
  43. 如請求項42所述之方法，其中該(b)的醫藥組合物的劑量包括約200毫克的帕博利珠單抗。
  44. 如請求項30至43中任一項所述之方法，其中該(a)的醫藥組合物的劑量和該(b)的醫藥組合物的劑量基本上是在同一時間投予。
  45. 如請求項30至43中任一項所述之方法，其中在將該(b)的醫藥組合物的劑量投予於該人類個體之前，先將該(a)的醫藥組合物的劑量投予於該人類個體。
  46. 如請求項30至43中任一項所述之方法，其中在將該(a)的醫藥組合物的劑量投予於該人類個體之前，先將該(b)的醫藥組合物的劑量投予於該人類個體。
  47. 如請求項30至36中任一項所述之方法，其中該方法包括以約每2周至約每47天一次的頻率，在誘導期向該人類個體投予至少三劑的該(a)的醫藥組合物，並在維持期向該人類個體投予一劑或更多劑的該(a)的醫藥組合物。
  48. 如請求項47所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約1×10 10至約5×10 10該人類去核類紅血球。
  49. 如請求項48所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約3 x 10 10該人類去核類紅血球。
  50. 如請求項48或49所述之方法，其中在該誘導期是以大約每3週一次的頻率向該人類個體投予該至少三劑。
  51. 如請求項47至50中任一項所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之該一或多劑包括約1×10 10該人類去核類紅血球。
  52. 如請求項51所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之該一或多劑中的第一劑，是在該誘導期向該人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後投予該人類個體。
  53. 如請求項47所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約3×10 10至約7×10 10該人類去核類紅血球。
  54. 如請求項53所述之方法，其中在該誘導期向該人類個體所投予之該至少三劑包括約5 x 10 10該人類去核類紅血球。
  55. 如請求項53和54所述之方法，其中在該誘導期是以大約每3週一次的頻率向該人類個體投予該至少三劑。
  56. 如請求項53至55中任一項所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之該一或多劑包括約1×10 10該人類去核類紅血球。
  57. 如請求項56所述之方法，其中在該維持期向該人類個體所投予之一或多劑中的第一劑，是在該誘導期向該人類個體所投予之至少三劑中的最後一劑大約3週後投予該人類個體。
  58. 如請求項47至57中任一項所述之治療方法，其中該治療方法包括以大約每3週一次的給藥頻率投予二或更多劑的(b)的醫藥組合物。
  59. 如請求項58所述之方法，其中該免疫檢查點抑制劑是帕博利珠單抗。
  60. 如請求項59所述之方法，其中二或更多劑的該(b)的醫藥組合物包括約180毫克至約220毫克的帕博利珠單抗。
  61. 如請求項60所述之方法，其中二劑或更多劑的該(b)的醫藥組合物包括約200毫克的帕博利珠單抗。
  62. 如請求項30至61中任一項所述之方法，其中該人類去核類紅血球包含至少1,000複製的該第一外源性多肽和至少1,000複製的該第二外源性多肽。
  63. 如請求項30至62中任一項所述之方法，其中該人類去核類紅血球是藉由以下過程所製成，該過程包括: 將編碼該第一外源性多肽的核酸以及編碼該第二外源性多肽的核酸引入到一有核類紅血球前驅細胞中； 在足以表現該第一外源性多肽和該第二外源性多肽的條件下，將該有核類紅血球前驅細胞進行培養；以及 將該有核類紅血球前驅細胞進行去核。
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