CN117750970A - 包含nkg2d、cxcr2和dap10/dap12融合多肽的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了包含NKG2D多肽和CXCR2多肽以及任选地包含DNAX活化蛋白10(DAP10)多肽和DNAX活化蛋白12(DAP12)多肽的融合多肽的免疫应答细胞。此外，还提供了制备和使用这种免疫应答细胞的方法。

Description

包含NKG2D、CXCR2和DAP10/DAP12融合多肽的组合物及其使用 方法

背景技术

使用嵌合抗原受体(CAR)工程T细胞的免疫疗法已被证明在B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的治疗中具有变革性。然而，由于缺乏肿瘤选择性靶点，这项技术在实体瘤免疫疗法中的应用受到阻碍。大多数肿瘤抗原是细胞内的，因而不容易被CAR T细胞识别。因此，目前正在开发的大多数实体瘤导向的CAR都涉及在肿瘤细胞中上调的靶点，但在正常组织中发现这些靶点的水平较低。

NKG2D配体是少数具有高度肿瘤选择性的靶群之一。在人体中，它们包括一组几乎在所有肿瘤细胞类型中都异常表达的8种应激诱导蛋白(MICA、MICB、ULBP1-6)。此外，NKG2D配体还在肿瘤相关的基质元件如内皮、调节性T细胞和髓源性抑制细胞上被发现(Parihar,R.,et al.,2019,Cancer Immunol.Res.7(3):363-375；Schmiedel&Mandelboim,2018,Front.Immunol.(9)2040)。NKG2D基因缺陷的小鼠表现出对上皮和淋巴恶性肿瘤的免疫监视作用受损。NKG2D配体是安全的治疗靶点的证据得到了它们没有在健康组织中被发现的事实的支持。使用自体NKG2D靶向CAR的临床试验尚未发现任何重大的安全性问题(见https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30396908/)。

NKG2D受体由自然杀伤细胞(NK)和一些T细胞群天然表达。每个NKG2D同源二聚体通过质膜内的互补带电氨基酸与两个同源二聚体DAP10接头分子结合。这种相互作用是NKG2D细胞表面表达和功能所必需的。DAP10在通过磷脂酰肌醇3-激酶提供共刺激的能力方面类似于CD28，但重要的是，它缺乏促进调节性T细胞的非必要招募的p56lck结合基序(Kofler,et al.,2011,Mol.Ther.19:760-767)。DAP10共刺激的效力因其在内化后持续发出信号的能力而凸显。然而，由于DAP10缺乏基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，NKG2D的参与不会导致T细胞的完全激活。

目前已开发了多种CAR，它们使用不同的方法提供ITAM依赖性信号1外以及协同刺激(也称为信号2)，因为这两种信号类型都是引起T细胞完全激活所必需的。第一个靶向NKG2D的CAR由Sentman等人开发，并由NKG2D与CD3ζ融合组成(Zhang et al,2005,Blood106:1544-1551)。虽然名义上是第一代CAR，但它与T细胞中的内源性DAP10相关，这意味着信号1和信号2都被提供。这种CAR目前正由Celyad Oncology公司作为Cyad-01进行临床开发。最近，Chang et al.(2013,Cancer Res.73:1777-1786)改造了NK细胞，使其除了外源性DAP10外，还共表达一种相同的CAR。此外，还描述了另外两种NKG2D CAR，它们结合了4-1BB(Song et al.,2013,Hum.Gene Ther.24:295-305)或CD28(Lehner et al.,2012,PLoS One7:e31210)，以提供替代DAP10的共刺激形式。所有这些CAR都能杀死T细胞介导的肿瘤细胞，同时产生细胞因子，而Chang et al.描述的CAR也显示出短暂的体内抗肿瘤活性。

CXCR2受体的配体包括含有(Glu-Leu-Arg)ELR基序的半胱氨酸-X-半胱氨酸(CXC)家族的趋化因子，即CXCL1-3和CXCL5-8。肿瘤内的这些趋化因子不仅由恶性细胞产生，也由成纤维细胞和巨噬细胞等基质元件产生(Thuwajit et al.,2018,Med Res Rev.38:1235-54；Thongchot et al,2021,Int J Oncol.58:14)。此外，肿瘤细胞可以培养基质细胞产生这些因子，从而促进疾病进展和对细胞毒性化疗的抗性(Le Naour,2020,J Mol CellBiol.12:202-15)。

CXC家族中研究得最多的成员为CXCL8，也称为白细胞介素(IL)-8。循环CXCL8的水平在某些癌症患者中升高，包括卵巢肿瘤(Zhang,et al.,2019,Oncol Lett.17:2365-9)、恶性间皮瘤(Judge,et al.2016,Ann Surg Oncol.23:1496-500)、胰腺癌(Hou,etal.2018，J Clin Med.7:502)、乳腺癌(Milovanovic,et al.2019,Cytokine 118:93-98；Autenshlyus,et al.2021,35:20587384211034089)、食管癌(Huang,et al.CancerBiomark.29:139-149)和头颈部癌(Rezaei,et al.2019,39:727-739)。除了CXCL8，CXCR2配体CXCL1、CXCL3和CXCL5的高水平产生也在几种癌症中有所描述。

发明内容

在第一方面，本公开描述了一种免疫应答细胞，其包含NKG2D多肽、CXCR2多肽和融合多肽，所述融合多肽包含DNAX活化10(DAP10)多肽或其功能性变体和DNAX活化12(DAP12)多肽或其功能性变体。在一些实施方案中，所述NKG2D多肽、CXCR2多肽、DAP10多肽和DAP12多肽中的每一个都为哺乳动物多肽。在一些实施方案中，所述NKG2D多肽、CXCR2多肽、DAP10多肽和DAP12多肽中的每一个都为人多肽。在一些实施方案中，所述NKG2D多肽的序列与SEQID NO:14的序列具有至少约85％的序列同一性。在一些实施方案中，所述NKG2D多肽为人NKG2D多肽的功能性变体，并且具有一个或多个突变，所述突变添加、删除或取代SEQ IDNO:14中的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，所述NKG2D多肽的功能性变体为具有SEQID NO:14的序列的多肽的截短形式。在一些实施方案中，所述功能性变体为嵌合NKG2D多肽。在一些实施方案中，所述功能性变体为人-鼠嵌合NKG2D多肽。

在一些实施方案中，所述DAP10多肽为DAP10的功能性变体，其包含与SEQ ID NO:1的DAP10多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DAP10多肽为DAP10多肽的功能性变体，并且具有一个或多个点突变，所述点突变添加、删除或取代SEQ ID NO:1中的任意氨基酸。在一些实施方案中，所述DAP10多肽为具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的截短形式的DAP10多肽的功能性变体。在一些实施方案中，所述DAP10多肽包含SEQID NO:1-8中的任一氨基酸序列或由它们组成。

在一些实施方案中，所述DAP12多肽为DAP12的功能性变体，其包含与SEQ ID NO:9的DAP12多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述DAP12多肽为DAP12的功能性变体，其具有一个或多个点突变，所述点突变添加、删除或取代SEQ ID NO:9中的任意氨基酸。在一些实施方案中，所述DAP12多肽为具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽的截短形式的DAP12多肽的功能性变体。在一些实施方案中，所述DAP12多肽包含SEQ IDNO:9-13中任一氨基酸序列或由它们组成。

在一些实施方案中，所述DAP10多肽和所述DAP12多肽通过连接子连接。在一些实施方案中，所述连接子包含SEQ ID NO:18-46中的任一氨基酸序列或由它们组成。

在一些实施方案中，所述融合多肽包含N末端序列。在一些实施方案中，所述融合多肽包含C末端序列。在一些实施方案中，所述N末端或C末端序列包含His标签、FLAG标签、Arg标签、T7标签、Strep标签、S标签、AviTagTM、适体标签、myc标签、CD8α前导序列、4-1BB胞内结构域、V5标签或CD27胞内结构域中的一种或多种。在一些实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID NO:60-63中任一序列或由它们组成。

在一些实施方案中，所述CXCR2多肽具有与SEQ ID NO:87具有至少约85％序列同一性的序列。在具体的实施方案中，所述CXCR2多肽具有SEQ ID NO:87的序列。

在一些实施方案中，本公开的免疫应答细胞为T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞为αβT细胞、γδT细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或它们的任意组合。

在第二方面，本公开描述了一种包含嵌合NKG2D多肽和CXCR2多肽的免疫应答细胞。在一些实施方案中，所述嵌合NKG2D多肽包含人NKG2D胞外结构域或其变体和鼠NKG2D跨膜结构域或其变体。在具体的实施方案中，所述人NKG2D胞外结构域具有SEQ ID NO:95-97中的任一所示的序列。在一些实施方案中，所述嵌合NKG2D多肽包含人NKG2D胞外结构域的变体，所述变体与SEQ ID NO:95-97中的任一序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，所述鼠NKG2D跨膜结构域具有SEQ ID NO:98-101中的任一所示的序列。在一些实施方案中，所述嵌合NKG2D多肽包含鼠NKG2D胞外结构域的变体，所述变体与SEQ ID NO:98-101中的任一序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞进一步包含至少一种DAP12多肽或其变体。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞进一步包含至少一种DAP10多肽或其变体。在一个优选的实施方案中，所述细胞包含与SEQ ID NO:102具有至少90％序列同一性的多肽。

本公开还描述了一种编码NKG2D多肽、CXCR2多肽和任选的DNAX活化(DAP10)多肽、DNAX活化(DAP12)多肽和/或融合多肽的核酸分子。

本公开还描述了一种制备免疫应答细胞的方法，包括以下步骤：(i)用本公开所述的核酸分子或载体转导T细胞或自然杀伤(NK)细胞，和(ii)培养T细胞或自然杀伤(NK)细胞，使得转导的细胞表达NKG2D多肽、CXCR2多肽和任选的DAP10/DAP12融合多肽。在优选的实施方案中，所述NKG2D多肽与细胞膜结合。

本公开还描述了一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本公开所述的免疫应答细胞。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞由受试者自体的T细胞或自然杀伤(NK)细胞制备。在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤癌症。在一些实施方案中，所述实体瘤癌症为肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、甲状腺癌、食道癌、小肠癌或它们的任意组合。

附图说明

本公开的这些和其他特征、方面和优点将通过以下描述和附图得到更好的理解，其中：

图1为展示已生成的每个构建体的结构的示意图。根据本公开，N1012包含由外源性人NKG2D蛋白和融合的外源性DAP10/12同源二聚体组成的复合物。N1012包含如表2所示的SEQ ID NO:64。1012_10_N包含与DAP10共表达的NKG2D以及与DAP12内结构域融合的DAP10胞外和跨膜结构域的FLAG标记的融合物。NKG2D复合物包含外源性人NKG2D蛋白，其与细胞中已经存在的内源性DAP10相互作用，并仅供比较之用。

图2显示了293T细胞在转染表达N1012的逆转录病毒质粒(如图1所示)或单独转染NKG2D三天后，NKG2D在细胞表面和细胞内(ICS)的表达情况，与未转导(UT)的293T细胞进行了比较。

图3A-3B显示了用单独编码NKG2D或N1012的逆转录病毒载体转导活化的未分化人T细胞后，T细胞CD4⁺亚群中细胞表面NKG2D表达的转导百分比(图3A)和荧光强度的中位值(MFI-图3B)。还显示了UT T细胞中的表达和MFI，以供比较。

图4显示了经转导以表达N1012、NKG2D或缺乏NKG2D的对照CAR的活化的未分化T细胞的CD4⁺和CD8⁺亚群中细胞表面NKG2D的代表性表达模式。提供在UT T细胞中NKG2D的表达情况作为比较。

图5显示了11种不同的肿瘤细胞系在与N1012⁺、NKG2D⁺或UT T细胞以不同的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后的存活率。肿瘤细胞存活率在72小时后用MTT检测法进行评估，并以未与T细胞共培养时观察到的存活率的百分比表示。

图6A-6B显示了由N1012、NKG2D和UT T细胞在与8种不同的肿瘤细胞系以1:1的CART细胞:靶细胞比率共培养期间分泌的细胞因子(IFN-γ(图6A)和IL-2(图6B)的水平。72小时后去除共培养上清液，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评估细胞因子的存在。

图7A-7F显示了肿瘤细胞和/或胰腺星状细胞PS1在与N1012⁺、NKG2D⁺或UT T细胞以不同的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后的存活率。图7A显示了胰腺星状细胞PS1在与N1012⁺、NKG2D⁺或UT T细胞以不同的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后的存活率。当以1:1的CAR T细胞:靶细胞比例加入N1012⁺T细胞时，N1012⁺T细胞还能有效溶解以1:1比例生长在一起的PS1和BxPC3细胞组成的单层细胞(图7B)。这与加入NKG2D⁺或UT T细胞后观察到的缺乏功效的情况形成对比。在这两种情况下，靶细胞的存活率都是在48小时后通过MTT检测法进行评估的，并以与没有T细胞共培养时观察到的存活率的百分比表示。在与N1012⁺、NKG2D⁺或UT T细胞以1:1的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后，肿瘤细胞和基质细胞单层的存活率如图7C(BxPC3_LT+PS1)和图7D(PaTU+PS1)所示。虽然观察到N1012⁺T细胞能有效溶解肿瘤细胞和基质细胞，但与NKG2D或UT T细胞共同培养时，观察到靶细胞存活率的轻微降低(图7C-7D)。图7C(BxPC3_LT)和图7D(PaTU_GFP)显示了肿瘤细胞单独与N1012⁺、NKG2D⁺或UT T细胞以1:1的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后的存活率。肿瘤细胞和基质细胞单层在与N1012⁺、A2028z⁺、NKG2D⁺或UT T细胞以1:1的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后的存活率如图7E和图7F所示(最多5轮再刺激后)。图7E还显示了在与N1012⁺、A2028z⁺、NKG2D⁺或UT T细胞以1:1的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后的单独肿瘤细胞的存活率(BxPC3_LT)。A2028z为一种靶向αvβ6整联蛋白的CAR，其杀死肿瘤细胞，但不杀死PS1基质细胞(Whilding,et al,2017,MolTher.25:2427)。图7G和7H显示了上述共培养过程中由N1012⁺、A2028z⁺、NKG2D⁺和UT T细胞分泌的IFN-γ的水平。测定肿瘤单独分泌的IFN-γ的水平作为阴性对照。图7I和7J显示了在与N1012⁺、NKG2D⁺或UT T细胞共培养后，将表达GFP的PaTU肿瘤细胞与表达mCherry的PS1细胞混合(1:1的比例，分别持续3天或8天)的肿瘤球状体的存活率。n.d.表示未检测到。图7K显示了与肿瘤球状体共培养72小时后由N1012⁺、UT T细胞和单独肿瘤分泌的IFN-γ的水平。

图8A-8D显示了与UT T细胞或单独表达NKG2D的T细胞相比，表达N1012的T细胞经受多轮重复刺激(“再刺激”)的能力。表达N1012的T细胞通过多轮刺激介导Ju77间皮瘤Ju77细胞和HN3_LUC头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞的溶解(图8A)。与间皮瘤(Ju77，Ren)、HNSCC(HN3_LUC)或胰腺癌(BxPC3_LT)细胞共培养时成功再刺激周期的总数如图8B所示。在Ju77或HN3_LUC肿瘤细胞的反复刺激下T细胞的增殖情况如图8C所示。与用Ju77、Ren或HN3_LUC肿瘤细胞培养的第1天相比，T细胞的最大扩增倍数如图8D所示。相反，UT T细胞或单独表达NKG2D的细胞对靶细胞溶解或增殖的作用极小。

图9A-9B显示了通过逆转录病毒转导CAR T细胞的工程，用于荷瘤小鼠的体内评估。图9A显示了转导N1012或NKG2D后，NKG2D在CD4⁺和CD8⁺T细胞中的细胞表面表达。与来自同一供体的表达靶向CAR、T4的泛ErbB的T细胞进行了比较，如Davies et al.,2012,Mol.Med.18:565-576所述。还使用了第二种泛ErbB靶向CAR，命名为TMY，其缺少包含在T4中的4αβ结构域并且还具有一个略微改变的CD28铰链(其中MYPPPY序列被10个氨基酸的线性myc标签序列取代)。图9B显示了残余T细胞在过继转移给小鼠后，对所示肿瘤细胞系的体外细胞毒性功能。

图10A-10E显示了NSG小鼠体内ffLUC标记的BxPC3细胞的腹膜内(i.p.)生长，这是通过在用10×10⁶个所示CAR T细胞进行腹膜内处理之前和之后的生物发光成像(BLI)来确定的。在N1012的情况下，也使用该剂量(记为“hi”)或给予较低剂量(“lo”–4×10⁶个细胞)。各组小鼠的BLI发射汇总如图10A所示。单个小鼠的连续生物发光发射如图10B所示。小鼠的体重如图10C所示。第88天腹膜内ffLUC BxPC3肿瘤再激发后，单个小鼠的连续生物发光发射如图10D所示。145天实验结束后的存活曲线如图10E所示。

图11A-11B显示了另一项实验的结果，该实验通过生物发光成像(BLI)证实了ffLUC标记的BxPC3细胞在NSG小鼠体内用指定的T细胞或PBS处理前后的生长情况。每个治疗组的BLI平均总通量(光子/秒)如图11A所示，每只小鼠的BLI总通量(光子/秒)如图11B所示。无肿瘤的小鼠在第41天(T细胞输注后29天)用ffLUC标记的BxPC3细胞再次腹膜内激发(如虚线所示)。

图12A-12B显示了用指定的T细胞或PBS治疗前后，ffLUC标记的H226恶性间皮瘤细胞在NSG小鼠体内经生物发光成像(BLI)测定的腹膜内生长情况。每个处理组的BLI平均总通量(光子/秒)如图12A所示，每只小鼠的BLI总通量(光子/秒)如图12B所示。为了证实T细胞的持久性和功能的维持，在首次肿瘤接种91天后，用额外的1×10⁶ffLUC标记的H226细胞腹膜内接种所有无肿瘤小鼠。肿瘤再激发的时间如N1012图中的第二条虚线所示。

图13显示了NKG2D、N1012和Cyad-01 CAR的复制体在CD4⁺T细胞中表达时，细胞表面表达的转导百分比(左图)和荧光强度的中位值(MFI)(右图)。

图14A-14B比较了当与BxPC3-LT(图14A)、Ren或Ju77细胞(图14B)共培养时，N1012⁺T细胞与NKG2D T细胞或表达Cyad-01复制体的NKG2D T细胞的再刺激(图14A)和最大扩增倍数(图14B)。

图15A显示了与N1012、Cyad-01复制体或未经转导的T细胞共培养3天或8天后，肿瘤球状体的存活率。肿瘤球状体由表达GFP的PaTU肿瘤细胞和表达mCherry的PS1细胞组成，在加入T细胞之前，以1:1的比率共培养3天。加入的T细胞数量反映了最终的T细胞:GFPPaTU:mCherry PS1的比例为2:1:1。图15B显示了与肿瘤球状体共培养期间T细胞的增殖水平。

图16A-16C为CAR构建体N1012、N1012_CXCR2和NKG2D(图16A)以及CYAD-01_10(图16B)的示意图。在CYAD-01_10中，CYAD-01的复制体已经与额外的DAP10共表达。图16C显示了用编码N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01_10、CYAD-01复制体或NKG2D的逆转录病毒载体转导活化的未分化人T细胞后，T细胞CD4⁺亚群中细胞表面NKG2D表达的转导百分比(左图)和荧光强度的中位值(MFI)(右图)。图中显示了未转导的T细胞的结果作为比较。

图17显示了两种卵巢癌细胞系Kuramochi_LT(左)和Ovsaho_LT(右)在与N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01_10和未转导的T细胞以不同的CAR T细胞:靶细胞比率共培养后的存活率。显示了两个独立供体的数据。72小时后通过MTT检测法评估肿瘤细胞存活率，并以在没有T细胞的情况下培养的存活细胞的百分比表示。

图18显示了与CYAD-01或CYAD-01_10T细胞的复制体相比，N1012和N1012_CXCR2 T细胞在重复几轮刺激后持续和增殖的能力有所提高。

图19A-19B为流式细胞图，显示了在Ren肿瘤细胞单层上经过16轮再刺激周期(图19A)和23轮再刺激周期(图19B)后，N1012和N1012_CXCR2 T细胞从CD4⁺群体几乎完全转移到CD8⁺群体。

图20显示了N1012 T细胞在Ren肿瘤细胞单层上受到28轮刺激后，CD45RO、CD62L和CD27表达的流式细胞术评估结果。

图21显示了在Ren肿瘤细胞单层上进行31、32和33轮刺激后，评估N1012 T细胞的CD45RO和CD62L表达的结果。

图22显示了在施加声力梯度时，CAR T细胞对Lo68_CD19细胞(左图)和SKOV-3细胞(右图)的的亲和力图。

图23A-23B显示了与四种不同的肿瘤细胞系共培养时，由N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体和未转导的T细胞分泌的细胞因子IFN-γ(图23A)和IL-2(图23B)的水平。从共培养的细胞中去除上清液，通过ELISA评估细胞因子的存在。

图24显示，未刺激的N1012和N1012_CXCR2 T细胞在12天内的扩增超过了NKG2D和未转导T细胞的扩增，而CYAD-01复制体和CYAD-01_10T细胞的扩增则基本上低于对照T细胞。

图25显示了在用PBS或CAR-T细胞(N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体或未转导的)处理的小鼠中表达萤火虫荧光素酶(ffLuc)的Ovsaho肿瘤异种移植物的生物荧光发射。肿瘤接种后第6天腹膜内和第7天静脉内给予T细胞(用垂直虚线表示)。肿瘤的发展以总通量(光子/秒)来衡量。

图26显示了生物发光成像的结果，显示了用N1012和N1012_CXCR2 T细胞处理的含ffLuc Ovsaho异种移植物的小鼠的抗肿瘤活性(左图和中图)以及与N1012 T细胞相比，N1012_CXCR2 T细胞向肿瘤部位的迁移得到改善(右图)。肿瘤的发展通过萤火虫荧光素酶表达作为总通量(光子/秒)来衡量。通过海肾萤光素酶的表达监测T细胞的迁移，并再次量化为总通量(光子/秒)。

图27显示了肿瘤接种后7天，用PBS或CAR-T细胞(N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01_10或对照NKG2D构建体)处理的小鼠中表达ffLuc的SKOV-3肿瘤异种移植物的发展情况。肿瘤的发展是通过萤火虫荧光素酶表达作为总通量(光子/秒)来衡量。

图28显示了用CAR T细胞(N1012、N1012_CXCR2或报告对照“海肾萤光素酶”)处理的含SKOV-3异种移植物的小鼠的肿瘤生长(左图)和T细胞迁移(右图)的评估结果。

图29显示了用腹膜内SKOV-3肿瘤异种移植物对NSG小鼠进行静脉输注后，所示表达海肾萤光素酶的CAR T细胞的生物发光成像结果。显示了在不同时间点单独表达rLucN1012、rLuc N1012_CXCR2或rLuc的T细胞的成像。

图30显示了输注PBS或CAR T细胞(N1012_CXCR2、CYAD-01复制体、N1012或NKG2D)后小鼠皮下(s.c.)CFPac-1胰腺肿瘤异种移植物的发展情况。

图31显示皮下CFPac-1肿瘤的CD3免疫组化图像，表明与N1012或NKG2D T细胞相比，N1012_CXCR2 T细胞的浸润得到了改善。

图32显示了肿瘤接种后28天，用PBS、高剂量(10×10⁶)CAR T细胞(N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体或未转导的)或低剂量(4×10⁶)CAR T细胞(N1012或N1012_CXCR2)处理的小鼠中皮下CFPac-1胰腺肿瘤异种移植物随时间的发展情况。

图33显示了肿瘤接种后14天，给予PBS或10×10⁶个CAR T细胞(CYAD-01复制体、N1012、N1012_CXCR2、或未转导的)后，小鼠皮下BxPC3胰腺肿瘤异种移植物的发展情况。

图34显示了用PBS或10×10⁶个CAR T细胞(CYAD-01复制体、N1012、N1012_CXCR2或未转导的)处理的含有皮下BxPC3肿瘤异种移植物的小鼠的生存曲线。

图35显示了在肿瘤植入后111天，给予PBS或10×10⁶个CAR T细胞(N1012_CXCR2，N1012，CYAD-01_10，或未转导的)后，小鼠(PDX PD_008)皮下间皮瘤患者来源的异种移植肿瘤的发展情况。

图36显示了对含有间皮瘤患者来源的异种移植肿瘤的NSG小鼠给予表达ffLuc/dsTomato(LT)的CAR T细胞后的生物发光成像结果。在给予T细胞后的不同时间点用10×10⁶CAR T细胞(N1012_LT、N1012_CXCR2_LT或LT)处理小鼠。

图37显示了在肿瘤接种后7天，用PBS或10×10⁶CAR-T细胞(N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01_10或对照NKG2D)腹膜内处理的含腹膜内SKOV-3肿瘤的NSG小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。

图38显示了用PBS或CAR-T细胞(N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体或未转导的)处理的NSG小鼠中腹膜内ffLuc Ovsaho肿瘤异种移植物的发展情况。在肿瘤接种后的第6天，腹膜内给予5×10⁶个T细胞，并在次日再静脉内给予5×10⁶个T细胞。小鼠在首次肿瘤接种后用ffLuc Ovsaho细胞再激发。

图39显示了用PBS或CAR-T细胞(N1012，N1012_CXCR2，或未转导的)处理的NSG小鼠中腹膜内ffLuc Kuramochi肿瘤异种移植物的发展情况。在肿瘤接种后的第17天，腹膜内给予5×10⁶个T细胞，并在次日再静脉内给予5×10⁶个T细胞。在首次肿瘤接种后86天，用ffLucKuramochi细胞再激发无肿瘤小鼠。

图40显示了如图39所述，在肿瘤接种后17天和18天，用PBS或CAR-T细胞(N1012，N1012_CXCR2，或未转导的)处理的含腹膜内ffLuc Kuramochi肿瘤的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。

图41显示了用PBS或CAR-T细胞(N1012，N1012_CXCR2，或未转导的)处理的NSG小鼠中腹膜内ffLuc Kuramochi肿瘤异种移植物的发展情况。肿瘤接种后的第17天，腹膜内给予5×10⁶个T细胞，并在次日再静脉内给予5×10⁶个T细胞。在首次肿瘤接种后86天，用ffLucKuramochi细胞再激发无肿瘤小鼠。

图42显示了用rLuc标记的CAR T细胞(N1012_rLuc，N1012_CXCR2_rLuc)处理的含有Kuramochi肿瘤异种移植物的NSG小鼠的生物发光成像结果。在施用腔肠素4天后，通过生物发光成像对T细胞浸润进行评估。

图43为用PBS或CAR-T细胞(N1012，N1012_CXCR2，Cyad-01复制体或未转导的T细胞)处理的含有Kuramochi肿瘤的NSG小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。肿瘤接种后的第17天，腹膜内给予5×10⁶个T细胞，并在次日再静脉内给予5×10⁶个T细胞。

图44显示了在肿瘤植入后111天，静脉内施用PBS或10×10⁶个CAR T细胞(N1012_CXCR2、N1012、CYAD-01_10或未转导的)T细胞后，在皮下含有间皮瘤患者来源的异种移植物的个体NSG小鼠中通过卡尺测量评估肿瘤体积。

图45是在肿瘤植入后111天，静脉内施用PBS或10×10⁶个CAR T细胞(N1012_CXCR2,N1012,CYAD-01_10或未转导的T细胞)后，皮下含有间皮瘤患者来源的异种移植物的NSG小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。

具体实施方式

定义

除非另有说明，权利要求书和说明书中使用的术语定义如下。

本文中使用的术语“哺乳动物”包括人类和非人类，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

术语“鼠”是指鼠亚科的啮齿动物。术语“鼠”包括大鼠和小鼠。

术语“嵌合NKG2D多肽”指由来自两种或多种不同生物体的结构域形成的NKG2D受体。嵌合NKG2D多肽在WO 2021/234163中有更详细的描述，其公开内容通过引用整体并入本文。

术语“同一性”百分比，在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，是指两个或多个序列或子序列中具有相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分比，使用下面描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可用的其他算法)或通过目测来测量的。根据应用,“同一性”百分比可以存在于被比较序列的一个区域上，例如，在一个功能域上，或者，存在于被比较的两个序列的全长上。

对于序列比对，通常将一个序列作为与测试序列进行比对的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法会基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

出于本文的目的，使用BLAST算法计算百分比同一性和序列相似性，该算法在Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有描述。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获取。

如本文所用，术语“受试者”泛指任何动物，包括但不限于人类和非人类动物(例如，狗、猫、牛、马、羊、猪、家禽、鱼、甲壳类动物等)。

如本文所用，术语“有效量”是指足以产生有益或预期结果的组合物(例如，合成肽)的量。有效量可以通过一种或多种给药、应用或剂量进行施用，并不限于特定的制剂或给药途径。

术语“治疗有效量”是指对改善疾病症状有效的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

如本文所用，术语“施用”和“给药”是指给予受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官药物、前体药物或其他制剂或治疗性处理(例如肽)的行为。对人体给药的示例性途径可以是通过脑或脊髓蛛网膜下空间(鞘内)、眼(眼科)、口(口腔)、皮肤(局部或透皮)、鼻(鼻腔)、肺(吸入)、口腔粘膜(颊或舌)、耳、直肠、阴道，通过注射(例如静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。

如本文所用，术语“治疗”是指获得有益或预期临床结果的方法。有益的或预期的临床结果可以包括减轻症状、降低疾病的严重程度、抑制疾病或病症的根本原因、将疾病稳定在非晚期状态、延缓疾病的进展和/或改善或减轻疾病的症状。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性成分与惰性或活性载体的组合，使得该组合物适用于体外、体内或离体的治疗或诊断用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当向受试者给药时，基本上不产生不良反应，例如毒性、过敏或免疫反应的组合物。

如本文所用，词语“包含”和“含有”以及这些词语的变体，例如，“包含”(“comprising”)和“包含”(“comprises”)意指“包括但不限于”，并且不排除其他成分、整体或步骤。此外，除非上下文另有要求，否则单数包含复数：特别是在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则本说明书应理解为既包含复数，也包含单数。

必须注意的是，在说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。

包含NKG2D、CXCR2和任选的DAP10、DAP12或DAP10/DAP12融合多肽的免疫应答细胞

本公开的免疫应答细胞包含NKG2D多肽、CXCR2多肽和任选的DNAX-活化蛋白10(DAP10)多肽或其功能性变体、DNAX-活化蛋白12(DAP12)多肽或其功能性变体和/或包含DAP10多肽或其功能性变体和DAP12多肽或其功能性变体的融合多肽。DAP10多肽及其功能性变体

DAP10多肽可以在某些生物体和某些细胞类型中内源性表达。在一个实施方案中，DAP10多肽或其变体是内源性的。或者，DAP10多肽或其变体可以是外源性的。

本公开的DAP10多肽可以是哺乳动物的，例如人。野生型人DAP10由UniProt登录号为Q9UBK5(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列编码。这是一个含有93个氨基酸的多肽。前18个氨基酸被认为是信号/前导序列，19-48位基酸为胞外结构域，49-69位氨基酸为跨膜结构域，70-93位氨基酸为胞质/胞内结构域。

在一个实施方案中，用于本公开的融合多肽的DAP10多肽包含与SEQ ID NO:1的DAP10多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，用于本公开的融合多肽的DAP10多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，用于本公开的融合多肽的功能性变体DAP10多肽可包含一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，其添加、删除或取代DAP10(如野生型人DAP10(SEQ ID NO:1))的任意氨基酸。

DAP10多肽的截短形式也可用于本公开的融合多肽中。例如，仅包含SEQ ID NO:1的19-93位氨基酸(即缺少1-18位氨基酸，即信号/前导序列)的DAP10的截短形式可用于本公开的融合多肽中。这个序列在本公开中为SEQ ID NO:2。其他截短形式可包含SEQ ID NO:1的19-69位氨基酸，这种序列仅包含DAP10的胞外和跨膜结构域，在本公开中为SEQ ID NO:3。用于本公开的DAP10的另一截短形式可包含SEQ ID NO:1的1-71位氨基酸(即信号/前导序列、胞外结构域、跨膜结构域和来自胞质/胞内结构域的2个氨基酸)，在本公开中为SEQID NO:4。用于本公开的DAP10的另一截短形式可包含SEQ ID NO:1的19-71位氨基酸(即胞外结构域、跨膜结构域和来自胞质/胞内结构域的2个氨基酸)，在本公开中为SEQ ID NO:5。用于本公开的DAP10的另一截短形式可包含SEQ ID NO:1的酸70-93位氨基酸(即胞内结构域)，在本公开中为SEQ ID NO:6。用于本公开的DAP10的又一截短形式可包含SEQ ID NO:1的49-93位氨基酸(即跨膜和胞质/胞内结构域)，在本公开中为SEQ ID NO:7。用于本公开的DAP10的又一截短形式可包含SEQ ID NO:1的49-69位氨基酸(即跨膜结构域)，在本公开中为SEQ ID NO:8。

DAP10多肽的其他突变形式或截短形式也适用于本公开。在一些实施方案中，在本公开中用作DAP10多肽的功能性变体的突变形式或截短形式保留了SEQ ID NO:1所示的野生型多肽的活性。

在一个实施方案中，本公开的DAP10多肽的功能性变体保留了SEQ ID NO:1所示的野生型多肽的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的活性。在一个实施方案中，可以通过评估DAP10的酪氨酸磷酸化和/或磷脂酰肌醇3-激酶的p85亚基和下游抗凋亡激酶AKT的募集和激活来测量活性。

如本领域技术人员所知，DAP10通常以同源二聚体的形式存在。因此，在一个实施方案中，免疫应答细胞包含DAP10同源二聚体，所述同源二聚体包含根据本公开的两种DAP10多肽。在一个实施方案中，免疫应答细胞包含DAP10异源二聚体，DAP10异源二聚体的每种肽包含本公开的不同的DAP10多肽。

DAP12多肽及其功能性变体

DAP12多肽可以在某些生物体和某些细胞类型中内源性表达。在一个实施方案中，DAP12多肽或其变体为内源性的。或者，DAP12多肽或其变体可以是外源性的。

本公开的DAP12多肽可以是哺乳动物的，例如人。野生型人DAP12由UniProt登录号为O43914(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列编码。前21个氨基酸被认为是信号/前导序列，22-40位基酸为胞外结构域，41-61位氨基酸为跨膜结构域，62-113位氨基酸为胞质/胞内结构域。

在一个实施方案中，用于本公开的融合多肽中的DAP12多肽包含与SEQ ID NO:9的DAP12多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，用于本公开的融合多肽中的DAP12多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，用于本公开的融合多肽中的功能性变体DAP12多肽可包含一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，其添加、删除或取代DAP12(如野生型人DAP12(SEQ ID NO:9))的任意氨基酸。

DAP12多肽的截短形式也可用于本公开的融合多肽中。例如，仅包含SEQ ID NO:9的22-113位氨基酸(即缺少1-21位氨基酸，即信号/前导序列)的DAP12的截短形式可用于本公开的融合多肽中。这个序列在本公开中为SEQ ID NO:10。其他截短形式可包含SEQ IDNO:9的62-113位氨基酸，这种序列仅包含DAP12的胞质/胞内结构域，在本公开中为SEQ IDNO:11。其他截短形式可以包含SEQ ID NO:9的41-61位氨基酸(即跨膜区)，在本公开中为SEQ ID NO:12。另一个截短形式可以包含SEQ ID NO:9的22-61位氨基酸(即胞外和跨膜结构域)，在本公开中为SEQ ID NO:13。

DAP12多肽的其他突变形式或截短形式也适用于本公开。在一些实施方案中，在本公开中用作DAP12多肽的功能性变体的突变形式或截短形式保留了SEQ ID NO:9所示的野生型多肽的活性。

在一个实施方案中，本公开的DAP12多肽的功能性变体保留了SEQ ID NO:9所示的野生型多肽的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的活性。在一个实施方案中，可以使用功能性测定法，例如MTT和通过ELISA测量细胞因子分泌来测量活性。

本领域技术人员将理解，DAP12通常以同源二聚体的形式存在。因此，在一个实施方案中，免疫应答细胞包含DAP12同源二聚体，所述同源二聚体包含根据本公开的两种DAP12多肽。在一个实施方案中，免疫应答细胞包含DAP12异源二聚体，所述DAP12异源二聚体的每种肽包含本公开的不同的DAP12多肽。

与DAP10/DAP12融合多肽相结合的多肽

本公开的融合多肽可以与其他多肽结合。这种结合可能是由于静电力，例如带互补电荷的氨基酸所提供的静电力。

可以与本公开的融合多肽结合的这种多肽的一个实例为NKG2D多肽(Wu et al.,2000,J.Exp.Med.,192(7):1059-1067和Rosen et al.,2004,J.Immunol.,173(4):2470-2478)。

在一个实施方案中，这些多肽可以被基因编码为与编码本公开的融合多肽的基因相连的嵌合构建体的一部分。融合多肽和其他多肽可在翻译过程中(例如使用核糖体跳跃肽)或通过翻译后切割(例如使用弗林蛋白酶切割位点)分离。因此，融合多肽和其他多肽可以通过任选的连接子连接。这种连接子可包含切割位点以便于切割。

NKG2D多肽及其功能性变体

本公开的NKG2D多肽可以是哺乳动物的，例如人。野生型人NKG2D由UniProt登录号为P26718(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列编码。该多肽被认为包含一个胞质结构域(1-51位氨基酸)、一个跨膜结构域(52-72位氨基酸)和一个胞外结构域(73-216位氨基酸)。

在一个实施方案中，用于本公开的NKG2D多肽包含与SEQ ID NO:14的NKG2D多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，用于本公开的NKG2D多肽包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，用于本公开的功能性变体NKG2D多肽可以包含一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，其添加、删除或取代NKG2D(例如野生型人NKG2D(SEQ ID NO:14))的氨基酸中的任意氨基酸。

NKG2D多肽的截短形式也可用于本公开的多肽中。例如，仅包含SEQ ID NO:14的73-216位氨基酸(即胞外结构域)的NKG2D的截短形式可用于本公开。这个序列在本公开中为SEQ ID NO:15。其他截短形式可以包含SEQ ID NO:14的82-216位氨基酸，这种序列包含NKG2D的部分胞外结构域，在本公开中为SEQ ID NO:16。另一个截短形式包含SEQ ID NO:14的52-216位氨基酸(即跨膜和胞外结构域)，在本公开中为SEQ ID NO:17。

NKG2D多肽的其他突变形式或截短形式也适用于本公开。当然，在本公开中用作NKG2D多肽的功能性变体的任何此类突变形式或截短形式都应优选保留SEQ ID NO:14所示的野生型多肽的活性。

在一个实施方案中，本公开的NKG2D多肽的功能性变体保留了SEQ ID NO:14所示的野生型多肽的至少10％(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的活性。在一个实施方案中，可以使用流式细胞术来测量活性，以确认与NKG2D配体的持续结合，并通过各种细胞培养试验(例如MTT和ELISA)来测量活性，目的在于确认靶细胞溶解、细胞因子分泌和共刺激。

在一些实施方案中，所述NKG2D多肽为嵌合多肽。在具体的实施方案中，所述NKG2D多肽为人-鼠嵌合多肽。在一个实施方案中，所述嵌合NKG2D多肽从N末端到C末端包含鼠NKG2D跨膜结构域或其变体和人NKG2D胞外结构域或其变体。嵌合NKG2D多肽在WO 2021/234163中有更详细的描述，其公开内容通过引用整体并入本公开。

CXCR2多肽及其功能性变体

本公开的CXCR2多肽可以是哺乳动物的，例如人。野生型人CXCR2由UniProt登录号为P25025(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列编码。

在一个实施方案中，本公开的CXCR2多肽包含与SEQ ID NO:87的CXCR2多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开的CXCR2多肽具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本公开的CXCR2多肽为SEQ ID NO:87的CXCR2多肽的功能性变体。在一个实施方案中，功能性变体CXCR2多肽包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)点突变，其添加、删除或取代CXCR2(例如，SEQ ID NO:87)的氨基酸。

在一个实施方案中，本公开的功能性变体CXCR2多肽保留了野生型人CXCR2(SEQID NO:87)的至少10％(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的活性。在一个实施方案中，使用流式细胞术测量多肽的活性，以确认CXCR2与配体(例如，IL-8)的结合。在一个实施方案中，通过本领域已知的细胞培养试验来测量多肽的活性。

连接子

本公开所述的DAP10/DAP12融合多肽的DAP10和DAP12部分可以在连续的多肽链中直接相互结合，或者可以通过合适的连接子间接相互结合。连接子可以是肽连接子。肽连接子常用于融合多肽，并且选择或设计连接子的方法是众所周知的(参见例如，Chen X etal.,2013,Adv.Drug Deliv.Rev.65(10):135701369和Wriggers W et al.,2005,Biopolymers 80:736-746.)。连接子也可用于将本公开的融合多肽连接到如上所述的嵌合构建体中的另一多肽(如NKG2D多肽)。

肽连接子通常分为i)柔性连接子、ii)螺旋形成连接子，和iii)可切割连接子，每种类型的实例都是本领域已知的。在一个实施例中，本公开所述的融合多肽中含有柔性连接子。柔性连接子可能含有大多数空间上不受阻碍的氨基酸，例如甘氨酸和丙氨酸。亲水性氨基酸丝氨酸也通常用于柔性连接子。柔性连接子的实例包括但不限于：聚甘氨酸(例如(Gly)₄和(Gly)₅)、聚丙氨酸聚(Gly-Ala)和聚(Gly-Ser)(例如(Glyn-Sern)_n或(Sern-Glyn)_n，其中每个n单独地为等于或大于1的整数)。

肽连接子可以有一个适当的长度。肽连接子序列的长度可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个氨基酸残基。例如，肽连接子可以是长度为约5至约50个氨基酸；长度为约10至约40个氨基酸；长度为约15至约30个氨基酸；或长度为约15至约20个氨基酸。肽连接子长度的变化可能会保留或增强活性，从而在活性研究中产生更好的效果。肽连接子序列可以由天然或非天然产生的氨基酸组成，或者由天然和非天然产生的氨基酸的混合物组成。

在某些方面，甘氨酸和丝氨酸包含连接子序列中的氨基酸。在某些方面，连接子区域包含一些甘氨酸重复序列(GSG3)_n(SEQ ID NO:18)，其中n为等于或大于1的正整数(例如1至约20)。更具体地，连接子序列可以是GSGGG(SEQ ID NO:19)。更具体地，连接子序列可以是GSGG(SEQ ID NO:20)。在某些其他方面，连接子区域方向包含一些甘氨酸重复序列(SerGly3)_n，其中n为等于或大于1的正整数(例如1至约20)(SEQ ID NO:21)。

在其他实施方案中，连接子可以以随机或重复的模式包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)。例如，连接子可以是(GGGGS)_n(SEQ ID NO:22)，其中n为1到20的整数，例如1到4。在一个具体的实施例中，n为4，并且连接子为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:23)。在另一个具体的实施例中，n为3，并且连接子为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:24)。

在其他实施方案中，连接子可以以随机或重复的模式包含甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和脯氨酸(P)。例如，连接子可以是(GPPGS)_n，其中n为范围1到20的整数，例如1到4。在一个具体的实施例中，n为1，并且连接子为GPPGS(SEQ ID NO:25)。

通常，当施用于患者(如人)时，该连接子不产生免疫原性。因此，可以选择具有低免疫原性或被认为具有低免疫原性的连接子。

本公开所述的连接子是示例性的，如果需要，连接子可以包括其他氨基酸，如Glu和Lys。如果需要，肽连接子可以包括例如(G₃S)(SEQ ID NO:26)、(G₄S)(SEQ ID NO:27)、(GYS)(SEQ ID NO:28)，和/或(GlySer)(SEQ ID NO:29)的多个重复。在某些方面，肽连接子可包括例如(SG₄)(SEQ ID NO:30)、(SG₃)(SEQ ID NO:31)、(SG₂)(SEQ ID NO:32)、(SG)₂(SEQ ID NO:33)或(SerGly)(SEQ ID NO:34)的多个重复。

在其他方面，肽连接子可包括重复氨基酸序列单元的组合和倍数，例如(G₃S)+(G₄S)+(GlySer)(SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:29)。在其他方面，Ser可以用Ala替代，例如(G₄A)(SEQ ID NO:35)或(G₃A)(SEQ ID NO:36)。在其他方面，连接子包含基序(EAAAK)_n，其中n为等于或大于1的正整数，例如1至约20(SEQ ID NO:37)。在某些方面，肽连接子也可以包括可切割连接子。

连接子可以包含另外的结构域和/或特征，例如弗林蛋白酶切割位点(RRKR)(SEQID NO:38)、P2A核糖体跳跃肽(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)(SEQ ID NO:39)和/或T2A核糖体跳跃肽(EGRGSLLTCGDVEENPGP)(SEQ ID NO:40)。包含这些结构域的连接子的实例包括SGSG+P2A核糖体跳跃肽(SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)(SEQ ID NO:41)、SGSG+T2A核糖体跳跃肽(SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP)(SEQ ID NO:42)，还包括弗林蛋白酶切割位点的形式，即弗林蛋白酶切割位点+SGSG+P2A核糖体跳跃肽(RRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)(SEQ ID NO:43)，和弗林蛋白酶切割位点+SGSG+T2A核糖体跳跃肽(RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP)(SEQID NO:44)。本公开中可用的替代核糖体跳跃肽包括F2A(VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)(SEQID NO:45)和E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPGP)(SEQ ID NO:46)。

N末端序列和C末端序列

各种序列可以连接到本公开的融合多肽的N末端或C末端，或者连接到本公开的NKG2D多肽。这些序列可以是功能性的，例如信号肽、纯化标签/序列或半衰期延长基团，或者可以简单地包含间隔区序列。或者，它们可能包含一种功能，例如T细胞刺激功能。

纯化标签和标记

多种标签或标记可以连接到本公开的融合多肽的N末端或C末端以帮助纯化。任何亲和标签都可与本公开的融合多肽结合，以帮助纯化。这类亲和标签的实例为His标签、FLAG标签、Arg标签、T7标签、Strep标签、S标签、适体标签、V5标签、AviTagTM、myc表位标签或这些标签的任意组合。在一个实施方案中，亲和标签为His标签(通常包含5-10个组氨酸残基)，例如6His标签(即HHHHHH)(SEQ ID NO:47)。在另一个实施方案中，亲和标签为FLAG标签(即DYKDDDDK)(SEQ ID NO:48)。在另一个实施方案中，亲和标签为AviTagTM(即GLNDIFEAQKIEWHE)(SEQ ID NO:49)。在另一个实施方案中，亲和标签为V5标签(GKPIPNPLLGLDST)(SEQ ID NO:50)或(IPNPLLGLD)(SEQ ID NO:51)。在另一个实施方案中，亲和标签为由9e10抗体识别的myc表位标签(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:52)。在公开中使用的各种其他标签在本领域中是公知。

也可以使用这些亲和标签的组合，或者在N末端包含一个或多个标签，在C末端包含一个或多个标签，或者在N末端和C末端各包含一个或多个标签。这种组合的实例包括His标签(H)与AviTag标签(A)的组合，或His标签(H)与AviTag标签(A)和FLAG标签(F)的组合。标签可以是任一方向，因此AviTag/His标签可以具有N-AH-C或N-HA-C方向，而Avi/His/FLAG标签可以具有N-AHF-C、N-FHA-C方向等。

在一个实施方案中，根据本公开的融合多肽包含具有序列“GLNDIFEAQKIEWHEGGHHHHHHDYKDDDDK”(SEQ ID NO:53)的“AHF”标签。在另一个实施方案中，根据本公开的融合多肽包含具有序列“DYKDDDDKHHHHHHGGGLNDIFEAQKIEWHE”(SEQ IDNO:54)的“FHA”标签。

CD8α前导序列(UniProt：P01732的1-21位氨基酸或包含1-18位氨基酸的截短衍生物)为常用的T细胞序列，在本公开中为SEQ ID NO:55。

共刺激序列

从之前工程CAR-T细胞的工作中已知各种T细胞共刺激激活序列。这些也可以添加到本公开的融合多肽中。

4-1BB胞内结构域(UniProt：Q07011的214-255位氨基酸)也可用作N末端或C末端序列。4-1BB胞内结构域在本公开中为SEQ ID NO:56。4-1BB内结构域可以作为共刺激结构域。

CD27胞内结构域(UniProt：P26842的213-260位氨基酸)也可用作N末端或C末端序列。CD27胞内结构域在本公开中为SEQ ID NO:57。CD27胞内结构域可以作为共刺激结构域。

人IgG1铰链(UniProt：P0DOX5的218-229或218-232位氨基酸)也可用作N末端或C末端序列。人IgG1铰链为SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:104。

截短的CD8α铰链(Uniprot：P01732的138-182位氨基酸)也可用作N末端或C末端序列。截短的CD8α铰链为SEQ ID NO:59。

示例性构建体

本公开在表1中提供了以下示例性融合多肽构建体：

表1示例性DAP10/DAP12融合多肽构建体

此外，如上所述，本公开的融合多肽可作为具有NKG2D多肽的单独嵌合构建体进行表达，用于翻译相关切割或翻译后切割。在这样的构建体中，表达后，翻译的多肽被切割以产生分离的多肽，然后该多肽自结合形成CAR。在一个实施方案中，本公开的融合多肽从NKG2D多肽上切割下来。这种构建体的实例如表2所示：

表2示例性嵌合构建体

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编码本公开的NKG2D、CXCR2、DAP10、DAP12和DAP10/DAP12融合多肽的核酸分子

本公开的另一方面涉及编码本公开的一种或多种多肽的核酸分子。所述核酸分子可能为DNA或RNA。除非本文特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知的类似物的核酸，所述已知类似物具有与参照核酸相似的性质，并以与天然产生的核苷酸相似的方式代谢。这种类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体来说，如下所述，简并密码子取代可以通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.,1991,Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka et al.,1985,J.Biol.Chem.260:2605-2608和Rossolini et al.,1994,Mol.Cell.Probes 8:91-98)。

因此，本公开还提供了一种核酸，其包含编码SEQ ID NO：60-69、87、90和102中任意一个或多个多肽序列的核苷酸序列。

本公开进一步提供了一种核酸，其包含与编码SEQ ID NO：60-69、87、90和102中任一序列的核酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的核苷酸序列。序列同一性通常以参考序列的全长进行衡量。

本公开进一步提供了一种核酸，其包含与SEQ ID NO：70-79、88、91和103中任一序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的核苷酸序列。

本公开还提供了包含SEQ ID NO:70-79、88、91和103中任一核苷酸序列的核酸。本公开还提供了由SEQ ID NO:70-79、91和103中任一核苷酸序列组成的核酸。

多核苷酸序列可以通过重新固相DNA合成或通过对现有序列(例如下文实施例中描述的序列)的PCR诱变产生。核酸的直接化学合成可通过本领域已知的方法完成，如Narang et al.,1979,Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown et al.,1979,Meth.Enzymol.68:109的磷酸二酯法；Beaucage et al.,1981,Tetra.Lett.,22:1859的二乙基磷酰胺法；和U.S.专利号4,458,066的固体支持法。通过PCR向多核苷酸序列中引入突变可以参考，例如PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,Innis etal.(Ed.),Academic Press,San Diego,Calif,1990；Mattila et al.,1991,Nucleic Acids Res.19:967和Eckertet al.,1991,PCR Methods and Applications 1:17。

载体

本公开还提供了包含一个或多个本公开的核酸分子的载体。

为了在宿主细胞中表达，编码本公开的一种或多种多肽的核酸可以存在于合适的载体中，并且在引入合适的宿主后，可以根据本领域已知的标准克隆和表达技术(例如,如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual2nd,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989中所述)来表达该序列以产生编码的多肽。本公开还涉及包含本公开的核酸序列的载体。

可以使用各种表达载体来表达编码本公开的多肽的多核苷酸。病毒表达载体和非病毒表达载体都可用于在宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中产生多肽。非病毒载体和系统包括质粒、游离型载体，通常带有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，以及人类人造染色体(参见，例如，Harrington et al.,1997,Nat Genet.15:345)。例如，可用于在哺乳动物(例如，人)细胞中表达本公开的多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen，San Diego，CA)、MPS V载体和本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒和塞姆利基森林病毒(SFV)的载体。参见Brent et al.,supra；Smith,1995,Annu.Rev.Microbiol.49:807；和Rosenfeld et al.,1992,Cell 68:143。特别地，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体通常用于在T细胞中表达。这类载体的实例包括SFG逆转录病毒表达载体(Riviere et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92:6733-6737)。在一个实施方案中，使用慢病毒载体，这些载体包括自失活的慢病毒载体(所谓的SIN载体)。

表达载体的选择取决于载体将在其中表达的预期宿主细胞。哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见，例如Queen,et al.,1986,Immunol.Rev.89:49-68)和必需的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、构成型MPS V启动子、四环素诱导的CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、构成型CMV启动子、EF1α启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。

转化生物体的培养物可以在非诱导条件下扩增，而不会使群体偏向于宿主细胞更能耐受其表达产物的编码序列。除了启动子之外，本公开的多肽的有效表达还可能需要或期望其他调控元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近的核糖体结合位点或其他序列。此外，表达效率可以通过包含适合于所用细胞系统的增强子来提高(参见，例如，Scharfet al.,1994,Results Probl.Cell Differ.20:125；和Bittner et al.,1987,Meth.Enzymol.,153:51)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。

本公开提供一种克隆或表达载体，其包含核酸，该核酸包含与编码SEQ ID NO:60-69、87、90和102中任一序列的核酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。此外，本公开提供了包含编码SEQ IDNO:60-69、87、90和102中一个或多个核酸的克隆或表达载体。本公开提供了包含SEQ IDNO:70-79、88、91和103中任一核酸序列的克隆或表达载体。

宿主细胞

提供了包含本公开的多肽、本公开的核酸、本公开的载体或其任一或两者的组合的宿主细胞。这种细胞通常用于表达本公开的多肽。

核酸或载体可通过标准技术转染到宿主细胞中。

术语“转染”的各种形式旨在包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染和类似技术。

或者，可以通过转导将核酸或载体递送到宿主细胞中。例如，如上所述，病毒载体可用于递送核酸或载体。

可以在原核或真核宿主细胞中表达本公开的多肽。代表性的宿主细胞包括许多大肠杆菌菌株，哺乳动物细胞系例如CHO、CHO-K1和HEK293；昆虫细胞例如Sf9细胞；以及酵母细胞如酿酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。在一个实施方案中，宿主细胞为免疫应答细胞，如NK细胞(原代NK细胞或NK细胞系)或T细胞(原代T细胞或T细胞系)。其他类型的宿主细胞包括巨噬细胞、诱导多能干细胞(iPSCs)、中性粒细胞和恒定NKT(iNKT)细胞。T细胞可以是CD4+或CD8+T细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为人细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为人T细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞为人原代T细胞。可以使用的细胞系包括NK细胞系NK-92。

用于表达本公开的多肽的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220，与DH FR选择性标记一起使用，例如，如RR.J.Kaufman and P.A.Sharp,1982,Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为CHO K1PD细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞为NSO1细胞。特别地，用于NSO骨髓瘤细胞的另一种表达系统为WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中所示的GS基因表达系统。当编码多肽的重组表达载体被导入哺乳动物宿主细胞时，可通过培养宿主细胞一段时间，使其足以允许多肽在宿主细胞中表达或将多肽分泌到培养宿主细胞的培养基中，从而产生多肽。可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收多肽。本公开制备免疫应答细胞的方法

本公开还提供了产生包含本公开的多肽的免疫应答细胞的方法。这种方法可以包括用编码本公开的多肽的核酸或载体转导细胞。该方法可进一步包括培养细胞，使多肽被表达并与NKG2D多肽结合以形成CAR。

在一个实施方案中，本公开提供了一种制备免疫应答细胞的方法，包括以下步骤：(i)将本公开的核酸分子或载体转导到免疫应答细胞中，和(ii)培养免疫应答细胞，使得转导的细胞表达NKG2D多肽、DAP10/DAP12融合多肽和CXCR2多肽，其中NKG2D多肽和DAP10/DAP12融合多肽在细胞膜中结合。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种方法，包括(i)从患者获得T细胞和/或NK细胞，(ii)将本公开的核酸或载体转导到T细胞和/或NK细胞中，和(iii)培养T细胞和/或NK细胞，使得转导的细胞表达NKG2D多肽、DAP10/DAP12融合多肽和CXCR2多肽，其中NKG2D多肽和DAP10/DAP12融合多肽在细胞膜中结合。

培养免疫应答细胞的各种方法在本领域是公知的。参见，例如Parente-PereiraAC etal.2014,J.Biol.Methods 1(2):e7,Ghassemi S et al.,2018,Cancer Immunol Res6(9):1100-1109和Denman CJ et al.,2012,PLoS One 7(1):e30264。

药物组合物

本公开还提供了包含如本文所述的多肽、核酸、载体或宿主细胞的药物组合物。这种药物组合物可以包含药学上或生理学上可接受的稀释剂和/或载体。通常选择适合预期的给药方式的载体，并且可以包括用于改变、维持或保持组合物的例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的试剂。通常，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和/或缓冲介质。

适合加入药物组合物中的制剂包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗菌剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、填充剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填料、单糖、双糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如游离血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐反离子(如钠)、防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如普朗罗尼(pluronics)；PEG；山梨醇酯；聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；Triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊)、稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)、张力增强剂(如碱金属卤化物，如氯化钠或氯化钾，或甘露醇山梨醇)、递送载体、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂。

胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏液。可以包括合适的生理学上可接受的增稠剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。静脉内载体包括液体和营养补充剂以及电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的静脉内载体。在某些情况下，可以在药物组合物中加入调节组合物张力的制剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。例如，在许多情况下，组合物最好是等渗的。还可能含有防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。确切的配方取决于给药途径。药物制剂的其他相关原理、方法和成分是公知的(参见，例如Allen,Loyd V.Ed,(2012)Remington′s Pharmaceutical Sciences,22nd Edition)。

本公开的药物组合物可以通过一种或多种给药途径使用本领域已知的多种方法中的一种或多种进行给药。如本领域技术人员所理解的，给药的途径和/或方式将根据所需的结果而变化。本公开的药物组合物的给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。本公开所用的短语“胃肠外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射给药，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，所述药物组合物在肿瘤内给药。当考虑胃肠外给药时，药物组合物通常是无菌的、无热原的、胃肠外可接受的组合物形式。特别适合用于胃肠外注射的载体是经过适当保存的无菌的、等渗的溶液。药物组合物可以是冻干物的形式，例如冻干饼。

或者，本公开所述的药物组合物可以通过非胃肠外途径给药，例如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给药。

在某些实施方案中，所述药物组合物用于皮下给药。用于皮下多肽治疗剂(如抗体、融合多肽等)给药的合适制剂组分和方法是本领域已知的，参见例如US2011/0044977、US8465739和US8476239。通常，用于皮下给药的药物组合物包含合适的稳定剂(例如，氨基酸，如甲硫氨酸，和/或糖类，如蔗糖)、缓冲剂和张力增强剂。

通常，在细胞治疗中，包含宿主细胞的组合物通过静脉输注施用于患者。

本公开的药学上有用的组合物的给药优选为“治疗有效量”或“预防有效量”(视情况而定，尽管预防也可以被认为是为治疗)，这足以显示对个体的益处。实际给药量、给药速率和给药时间取决于所治疗的蛋白质聚集性疾病的性质和严重程度。治疗的处方，例如剂量等的决定，是全科医师和其他医生的责任，通常要考虑到要治疗的疾病、患者个体的状况、给药部位、给药方法和医生已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed),1980中找到。

一种组合物可以单独给药或与其他治疗联合给药，根据所治疗的疾病同时或相继给药。

处理方法

在一些实施方案中，本公开的多肽、核酸、载体、细胞和/或药物组合物用于治疗疾病或病症、预防和/或用于延迟疾病症状的发生。这些方法包括施用治疗有效量的本公开的多肽、核酸、载体、细胞和/或药物组合物。

本公开提供了用于治疗或作为药物使用的本公开的多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物。本公开还提供了用于治疗或预防病理性障碍的本公开的多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物。本公开提供了用于治疗或预防癌症的本公开的多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物。还提供了用于治疗或预防癌症的本公开的免疫应答细胞。本公开还提供了本公开的多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于治疗病理性障碍的药物中的用途。还提供了本公开的多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物在治疗或预防病理性障碍中的用途。本公开还提供了一种治疗患有病理性障碍的患者的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本公开的多肽、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物。

如本文所用，术语“疾病”和“病理性障碍”包括癌症，包括但不限于实体瘤癌症、软组织肿瘤、转移性病变和血液肿瘤。例如，癌症可以是肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤，食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾和输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓细胞白血病-慢性期(CMLCP)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、肝细胞癌(HCC)、胃肠间质瘤(GIST)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)，环境诱发的癌症，包括那些由石棉诱发的癌症，以及上述癌症的组合。特别地，癌症可以是乳腺癌，例如雌激素受体阳性(ER pos)乳腺癌和/或乳腺癌的转移形式。

在一个实施方案中，癌症为实体瘤癌症。在一个实施方案中，病理性障碍的治疗涉及靶向非肿瘤细胞，例如肿瘤相关的基质细胞。这类肿瘤相关的基质细胞的实例类型包括胰腺基质细胞。其他可靶向的非肿瘤细胞类型包括巨噬细胞、调节性T细胞和髓源性抑制细胞。

在一个实施方案中，患者已接受过化疗药物的预处理。

在一个实施方案中，与未经治疗的肿瘤相比，向患者施用宿主细胞可使肿瘤体积缩小10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，甚至100％。

给予患者的宿主细胞的量应考虑给药途径、所治疗的癌症、患者的体重和/或患者的年龄。通常，对患者施用约1×10⁶至约1×10¹¹个细胞。在一个实施方案中，向患者施用约1×10⁷至约1×10¹⁰个细胞，或约1×10⁸至约1×10⁹个细胞。

试剂盒

在另一个方面，本文描述的系统的组件或实施例以试剂盒的形式提供。例如，可以提供任何质粒，以及哺乳动物细胞、相关缓冲液、培养基、触发剂或与细胞培养和病毒体生产相关的其他组分，任选的组分冷冻并包装成试剂盒，可单独提供或与任何其他试剂的单独容器和任选的使用说明一起提供。在一些实施方案中，试剂盒可以包括培养容器、小瓶、试管等。

实施例

以下为实施本公开的具体实施例。这些实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。已努力确保所使用的数字(例如，数量、温度等)的准确性，但当然也应允许一定的实验误差和偏差。

除非另有说明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。

方法

T细胞分离和逆转录病毒转导

通过密度介导离心法从健康志愿者的血液样本中分离出外周血单核细胞(PBMC)。用植物血凝素激活T细胞72小时，最后24小时加入100IU/mL IL-2。将1×10⁶个活化的PBMC接种到用3mL逆转录病毒上清液预处理过的包被有逆转录蛋白的平板上。随后用3mL新鲜病毒上清液和100IU/mL IL-2处理每孔。用稳定的长臂猿白血病病毒(GALV)-假型293TVec稳定包装细胞产生的病毒颗粒进行逆转录病毒转导。此后，在RPMI1640培养基+5％正常人AB血清中以100IU/mL培养T细胞，每周提供三次新鲜培养基和IL-2(100IU/mL)。

流式细胞术

通过流式细胞术评估293T细胞的T细胞转导和转染情况，并与适当的同型对照进行比较。为了评估基于NKG2D的构建体的表达，用小鼠抗人CD4-FITC、小鼠抗人NKG2D-PE和小鼠抗人CD8-APC对细胞进行染色，并进行适当补偿。由于CD8⁺T细胞中的内源性NKG2D表达水平较高，因此，将转导效率与未转导的CD4⁺T细胞中的NKG2D表达进行了比较。使用生物素化的山羊抗人EGF，然后使用PE偶联链霉亲和素对泛ErbB特异性T4和TMY CAR的表达进行评估。通过与使用相同试剂染色的N1012+T细胞进行比较来计算转导效率。使用前，通过添加必要比例的未转导T细胞，对构建体之间的转导效率进行归一化处理。这确保了所有条件下CAR⁺T细胞的总数和总T细胞浓度相同。

为了进行细胞内染色，将转染的293T细胞在室温下用4％的甲醛固定10分钟，然后用渗透液(PBS+0.5％ BSA+0.1％皂素)洗涤两次。随后，在100μL渗透液存在下，用500ng PE偶联的抗人NKG2D或适当的同型对照对细胞进行染色。在通过流式细胞仪分析之前，细胞在渗透液中进一步洗涤两次。

为了评估多轮刺激后的T细胞分化，从肿瘤细胞共培养物中取出T细胞，并用FITC偶联的抗人CD45RO、别藻蓝蛋白(APC)偶联的抗人CD62L、PE偶联的抗人CCR7、FITC偶联的抗人CD4、APCCy7偶联的抗人CD8α和藻红蛋白花青7(PECy7)偶联的抗人CD27抗体染色。在用2mL冰的PBS中洗涤后，将细胞重新悬浮在0.5mL冰的PBS中，并通过流式细胞仪进行评估。染色效率用相应的同种型染色的T细胞和荧光减一(FMO)对照进行评估。

剂量反应测定

将1×10⁴个肿瘤细胞每孔(100μL)接种到96孔板中，然后在37℃和5％ CO₂条件下孵育过夜。24小时后，以1:1至1:64的log₂ CAR T细胞:肿瘤细胞比率加入T细胞。72小时后，去除T细胞并加入100μL的MTT溶液(500μg/mL)，然后将平板在37℃和5％CO₂下孵育约1小时。去除MTT溶液后，将所得甲晶体溶解在DMSO(100μL/孔)中，并在560nm处测量吸光度。肿瘤细胞活力的计算方法如下：(含T细胞的单层的吸光度/不含T细胞的单层的吸光度)×100。

再次刺激试验

将1×10⁵肿瘤细胞接种在24孔板的一式三孔中，并在37℃和5％ CO₂下孵育24小时。24小时后，每孔加入1mL含1×10⁵CAR⁺T细胞。72小时后，轻轻移除T细胞，并用1mL PBS洗涤孔。去除PBS后，向每个孔中加入1mL MTT(终浓度为500μg/mL)，并将平板在37℃和5％CO₂下孵育约1小时。按照“剂量反应”部分的详细说明，在560nm波长下测量相应的孔中的吸光度，并计算肿瘤细胞活力。如果测得肿瘤细胞活性低于50％，则认为再次刺激是成功的。

从平板上取出的T细胞以400×g离心5分钟，并去除上清液。将沉淀重新悬浮在3.2mL R5培养基中，然后将1mL添加到新鲜肿瘤单层细胞的每个孔中(24孔板中每孔1×10⁵个肿瘤细胞)，一式三孔。通过对剩余的200μL样品中的一小部分采用台盼蓝拒染法，来评估T细胞总数。

结合亲和力

通过测量T细胞在不断增加的声力水平下与靶细胞结合的百分比，来评估CAR T细胞对靶细胞的结合亲和力。将经CD19工程改造的LO68或SKOV-3肿瘤细胞接种于聚-L-赖氨酸包被的z-Movi微流控芯片(Lumicks,Amsterdam,Netherlands)中，并培养16小时。第二天，将流式分选的CAR-T细胞按连续流入芯片中，并与靶细胞一起孵育5分钟，然后初始化3分钟的线性力梯度。在力梯度过程中，z-Movi设备(Lumicks)使用集成在平台中的明场显微镜捕获了一系列时间序列的图像。分离的细胞被悬浮在声学节点上，允许根据细胞的XY位置追踪细胞。Z位置的变化导致衍射图案的变化，从而可以区分粘附在基底上的细胞和悬浮在声学节点上的细胞。这些信息被用来将细胞脱落事件与特定的破裂力相关联。使用(z-Movi Tracking_v1.6.0)获取细胞脱落，并使用Cell Tracking offline analysis_v2.1进行试验后图像分析。

ELISA

分别使用Duo-set和Ready-Steady-Go ELISA试剂盒，在共培养开始24小时后取出的上清液等分样中评估T细胞分泌的IFN-γ和IL-2。

肿瘤球状体生成

为了产生肿瘤球状体，在超低亲和力96孔板的每孔中加入1×10³肿瘤细胞和1×10³PS1星状细胞，并在37℃和5％ CO₂下孵育72小时。通过标准光学显微镜观察证实球体的产生。

体内研究

生物发光成像

将1×10⁵个萤火虫荧光素酶(ffLUC)标记的BxPC3细胞注射到NSG小鼠的腹膜内。肿瘤接种后12天，用PBS、4×10⁶(N1012+(N1012(lo))、T4⁺或TMY⁺CAR T细胞)或1×10⁷(N1012(hi)或NKG2D)CAR⁺T细胞腹膜内处理小鼠(每组n＝5)。或者，NSG小鼠腹膜内接种1×10⁶ffLUC标记的H226恶性间皮瘤细胞。肿瘤接种八天后，小鼠接受PBS或4×10⁶N1012⁺T细胞处理。作为对照，一组小鼠只接受了4×10⁶个表达NKG2D的T细胞的处理。

在其他研究中，NSG小鼠腹膜内接种1×10⁵ffLuc表达的Ovsaho或5×10⁵ffLuc表达的SKOV-3细胞。通过腹膜内注射(肿瘤接种后6天)或静脉注射(接种后7天)PBS或5×10⁶CART细胞(N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体或未转导的)处理接种了Ovasho细胞的小鼠。接种SKOV-3细胞的小鼠在肿瘤接种14天后静脉注射PBS或1×10⁷CAR T细胞(N1012、N1012_CXCR2或CYAD-01_10)。

为了评估T细胞的迁移，对T细胞进行了双转导，以表达CAR构建体(N1012或N1012_CXCR2)和报告基因构建体，或单独的海肾荧光素酶(rLuc)或同时编码rLuc和GFP的双报告基因。接种Ovasho细胞的小鼠在肿瘤接种后7天通过静脉注射5×106 CAR T细胞(N1012_海肾萤光素酶或N1012_CXCR2_海肾萤光素酶)处理。接种SKOV-3细胞的小鼠在肿瘤接种14天后静脉注射PBS或1×10⁷CAR T细胞(N1012_CXCR2_rLuc、N1012_rLuc或CYAD-01_10)处理。接种Kuramochi细胞的小鼠在肿瘤接种后18天通过静脉注射2×10⁶CAR T细胞(N1012_CXCR2_rLuc或N1012_rLuc)处理。将海肾萤光素酶的底物腔肠素静脉注射给小鼠，以监测T细胞追踪。

通过BLI监测肿瘤生长，所有数据以每次治疗的总通量(光子/秒)或平均总通量(光子/秒)表示。对小鼠进行密切监测，每周称重三次，以发现健康状况不良的迹象。

肿瘤体积

将1×10⁵CFPac-1或BxPC3细胞与50μL基质胶(1:1PBS)一起皮下注射到NSG小鼠的左腹部。接种CFPac-1细胞29天后或接种BxPC3细胞14天后，用PBS或1×10⁷CAR T细胞(N1012_CXCR2、N1012、NKG2D、CYAD-01复制体，未转导的(UT))静脉内处理小鼠。

每周用卡尺测量肿瘤生长情况，并以肿瘤体积(mm³)表示。

免疫组化

将1×10⁵CFPac-1与50μL基质胶(1:1PBS)一起皮下注射到NSG小鼠的左腹部。接种后29天，用PBS或1x10⁷ CAR T细胞(N1012_CXCR2、N1012、NKG2D、CYAD-01复制体或未转导的(UT)T细胞)静脉内处理小鼠。T细胞注射后三天，处死来自N1012、N1012_CXCR2和NKG2D T细胞治疗组的每组三只小鼠，收获肿瘤用于免疫组化(IHC)分析。简言之，将组织用福尔马林固定，石蜡包埋，切片，装片，并用标准方法用抗人CD3抗体(Abcam)染色。

实施例1 NKG2D和DAP10/12融合蛋白在293T细胞中的表达

用含有DAP10/12融合蛋白N1012或NKG2D表达盒的SFG逆转录病毒质粒骨架转染293T细胞。N1012(SEQ ID NO:64)包含含有外源性人NKG2D蛋白和根据本公开的融合外源性DAP10/12同源二聚体的复合物。N1012质粒包含SEQ ID NO:74，其编码SEQ ID NO:64。72小时后通过流式细胞术评估NKG2D的表面表达。尽管在用N1012质粒转染的293T细胞表面容易检测到NKG2D表达，但在用编码对照NKG2D的质粒转染的细胞表面没有检测到NKG2D表达(图2，上图)。鉴于NKG2D的表面表达依赖于DAP10的表达，NKG2D缺乏表面表达可以通过NKG2D质粒中缺乏DAP10的共表达来解释。为了证实NKG2D转染的293T细胞表面缺乏NKG2D表达不是因为转染效果不佳，进行细胞内染色，以检测NKG2D的存在。关键的是，在用N1012或NKG2D质粒转染的293T细胞中观察到了NKG2D的细胞内表达(图2，下图)。这表明，这两种构建体都成功表达了NKG2D，也证实了DAP10共表达才能实现NKG2D的表面表达。

实施例2N1012和NKG2D在原代人T细胞中的表达

用抗人CD3和抗人CD28抗体包被的顺磁珠激活原代人T细胞。激活48小时后，通过逆转录病毒转导工程化T细胞表达N1012或NKG2D。通过流式细胞术评估了NKG2D的表面表达，并对CD4和CD8的表达进行了共染色。与未转导的T细胞相比，NKG2D的表达百分比(图3A)和中位值荧光强度(MFI，图3B)均有所下降。由于NKG2D在CD8⁺T细胞中的内源性表达，在CD4⁺T细胞数据上设门。如图所示，与UT T细胞或表达对照CAR的T细胞相比，NKG2D和N1012构建体在原代人T细胞表面均可高水平重复表达(图4)。

实施例3：N1012 T细胞对靶细胞的破坏和识别的评估

为了评估细胞溶解能力，将N1012⁺T细胞与代表5种不同肿瘤类型(间皮瘤、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌和乳腺癌)的11种不同的人类肿瘤细胞系或与不同的E:T比率的肿瘤相关基质细胞(PS1)共培养。72小时后，去除T细胞，进行MTT分析以评估肿瘤细胞的存活率。尽管当靶细胞与UT T细胞或表达NKG2D的T细胞共培养时，观察到肿瘤存活率的降低极少，但是N1012⁺T细胞显示了即使在低E:T比率下，对所有靶细胞系都能有效溶解(图5、7A和7B)。通过ELISA对共培养上清液的分析表明，N1012⁺T细胞大量分泌干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)，但UT T细胞或表达对照NKG2D构建体的T细胞均不分泌干扰素-γ和白细胞介素-2(图6A和6B)。这些数据证明了N1012⁺T细胞识别和溶解多种肿瘤类型的能力，包括肿瘤相关的基质细胞。

实施例5N1012 T细胞破坏肿瘤球状体的例证

为了评估N1012⁺T细胞在3D系统中介导靶细胞溶解的能力，将它们与肿瘤球状体共培养。球状体生成后，每孔加入6×10³个以CellTracker紫色标记的T细胞。在3天和8天后，使用荧光显微镜，通过分别测量GFP和RFP来评估肿瘤细胞和星状细胞的存活率。使用Image J软件对GFP和RFP信号进行量化，并以在不存在T细胞的情况下生长的球状体的荧光读数的百分比来表示。在N1012⁺T细胞中观察到球状体的有效溶解，但在NKG2D或UT T细胞中均未观察到(图7I-7J)。此外，只有N1012⁺T细胞显示IFN-γ的分泌(图7K)。

采用流式细胞术检测球状状细胞存活率和T细胞增殖情况。为此，在加入T细胞后3天或8天，将球状体从平板中取出，并放入流式细胞仪管中，将最多5个用相同CAR T细胞处理的球状体加入到相同的管中。使用Accutase溶液，并用移液器吸头剧烈的重悬浮实现球状体分解。将得到的单细胞悬液在RPMI1640培养基+5％正常人AB血清中洗涤，随后重新悬浮在含有计数珠的PBS中。每管获得相同数量的计数珠，并确定肿瘤细胞(通过GFP和RFP荧光评估)和T细胞(通过CellTracker紫色荧光评估)的数量。数据显示的是在不存在T细胞的情况下生长的球状体中存在的GFP和RFP细胞总数的百分比(图15)。

实施例6N1012 T细胞系列靶标识别的例证

为了评估N1012⁺T细胞连续溶解靶细胞(“再刺激”)的能力，每周两次将它们与新鲜的单层细胞共培养，直到观察不到单层破坏。尽管UT或NKG2D⁺T细胞介导的靶细胞破坏极小也没有显示出增殖的证据，但是N1012⁺T细胞通过多轮再刺激介导了有效的溶解(图8A-8B)。靶细胞破坏也与N1012+T细胞的大量增殖和最大倍数扩增相关(图8C-8D)。

当与CYAD-01复制体NKG2D CAR和对照T细胞相比时，N1012⁺T细胞在BxPC3_LT细胞上接受了明显更多轮的再刺激(图14A)。此外，N1012⁺T细胞也表现出明显大于CYAD-01T细胞或对照的增殖(图14B)。

实施例7N1012 T细胞在胰腺癌体内模型中的疗效

为了确定N1012⁺T细胞在体内靶向肿瘤细胞的能力，产生了表达N1012、NKG2D或靶向CAR的泛ErbB的两种不同迭代(T4和TMY)的T细胞。在体外以1:1的比例共培养72小时后，证明了各种构建体在原代人T细胞中的表达(图9A)和T细胞针对三种肿瘤细胞系的功效(图9B)。为评估体内功能，在NSG小鼠腹膜内建立了12天的萤火虫荧光素酶(ffLUC)标记的BxPC3肿瘤异种移植物。用PBS，4×10⁶(N1012(lo)，T4或TMY)T细胞，或1×10⁷(N1012(hi)或NKG2D)转导的T细胞对荷瘤小鼠进行腹膜内处理。每周通过生物发光成像测量肿瘤生长情况，每周给小鼠称重三次。数据以每个处理组的平均总通量(光子/秒)(图10A)或每个小鼠的总通量(光子/秒)(图10B)表示。接受NKG2D⁺、T4⁺或TMY⁺T细胞的小鼠的肿瘤负荷与接受PBS的小鼠相同，表明缺乏疗效。相反，分别用N1012(lo)或N1012(hi)处理的2/5小鼠和4/5小鼠的肿瘤被完全根除。这些小鼠在T细胞给药76天后保持没有肿瘤。通过测量体重变化的百分比进行评估时，未观察到毒性的证据(图10C)。

为了确定N1012⁺T细胞是否可以移植到NSG小鼠体内并提供免疫记忆，在首次肿瘤接种后88天(T细胞输注后76天)，将1×10⁵ffLUC标记的BxPC3细胞第二次接种到那些完全排斥肿瘤的小鼠腹腔中。虽然在肿瘤再激发后24小时，通过BLI观察到发光增加，但4/5的小鼠随后表现出肿瘤大小的显著减小，从而表明N1012⁺T细胞的再激活(图10D)。实验在145天后结束并生成了生存曲线，该曲线显示了N1012 T细胞有效的抗肿瘤功效(图10E)。

为了进一步证实N1012⁺T细胞在体内对胰腺癌模型的功效，进行了重复实验。在用1×10⁵ffLUC标记的BxPC3细胞接种后12天，将1×10⁷CAR⁺或对照未转导的T细胞腹膜内注射入NSG小鼠。通过生物发光成像每周监测肿瘤生长，数据显示为每个治疗组的平均总通量(光子/秒)(图11A)和每个小鼠的总通量(光子/秒)(图11B)。在用N1012⁺T细胞处理的小鼠中再次观察到显著且持续的肿瘤消退。事实上，5/6的小鼠在接受N1012⁺T细胞处理后，肿瘤被完全根除。相反，用UT T细胞处理的小鼠的肿瘤生长动力学与接受PBS的小鼠相同。这些数据证实，肿瘤根除是N1012⁺特异性的。

为了研究记忆性T细胞的潜在形成，在第41天(T细胞输注后29天)无肿瘤的小鼠用新鲜的1×10⁵ffLUC标记的BxPC3细胞进行腹腔内再激发。第42天对小鼠进行成像，以确认肿瘤是否存在。随后的成像结果表明，5/5的再激发小鼠将肿瘤负荷降低到检测水平以下，3/5的小鼠显示长期肿瘤控制(图11B)。这些数据表明，N1012 CAR T细胞可以形成记忆群，这些记忆群可以重新激活，在靶点再次出现时重新激活。

实施例8N1012 T细胞在恶性间皮瘤体内模型中的功效

为了证实N1012在另一种体内模型中的功效，通过腹膜内注射用1×10⁶ffLUC标记的H226恶性间皮瘤细胞接种NSG小鼠。肿瘤细胞接种后8天，用PBS或4×10⁶N1012⁺T细胞处理小鼠。作为对照，一组小鼠接受了4×10⁶个单独表达NKG2D的T细胞的处理。通过生物发光成像每周监测肿瘤生长数据，数据显示为以每次处理的平均总通量(光子/秒)(图12A)和每只个体小鼠的总通量(光子/秒)(图12B)。尽管在接受PBS的小鼠中观察到一致的肿瘤生长，但是在接受N1012⁺T细胞处理的小鼠中观察到100％的肿瘤根除。

为了证实T细胞的持久性和功能的维持性，在首次肿瘤接种91天后，用额外的1×10⁶ffLUC标记的H226细胞腹膜内接种所有无肿瘤小鼠。24小时后，通过生物发光成像证实了所有小鼠中的肿瘤存在。所有再次受激发的小鼠都排斥了肿瘤，这证实了N1012⁺T细胞的持久性以及这些T细胞介导长期肿瘤控制的能力。

实施例9N1012 T细胞与CYAD-01复制体T细胞的比较

将N1012 T细胞的再刺激和增殖潜力与CYAD-01复制体T细胞进行比较。如前所述，CYAD-01CAR由NKG2D与CD3ζ的融合体组成，并代表最初由Sentman et al描述的小鼠CAR的人类版本(Zhang et al,2005,Blood 106:1544-1551)。虽然名义上是第一代CAR，但它与T细胞中的内源性DAP10相关，这意味着信号1和信号2都被提供。CYAD-01CAR目前正由CelyadOncology公司进行临床开发，这些示例中提供了所述CAR的复制体，仅供比较。

通过流式细胞术评估，CYAD-01复制体在原代人T细胞中的表面表达得到了证实(图13)。

简而言之，每周两次将N1012或CYAD-01复制体T细胞与新鲜单层细胞共培养，直到观察不到单层破坏。为实现这一点，将1×10⁵肿瘤细胞接种在24孔板的一式三孔中，并在37℃和5％ CO₂下孵育24小时。24小时后，每孔加入1×10⁵个CAR⁺T细胞，最终浓度为1×10⁵CAR⁺/mL。72小时后，轻轻去除T细胞，并用1mL PBS洗涤孔。去除PBS后，向每个孔中加入1mL MTT(终浓度为500μg/mL),并将平板在37℃和5％ CO₂下孵育约1小时。读取平板，并如上所述计算肿瘤细胞存活率。如果测得肿瘤细胞存活率低于50％，则认为再次刺激是成功的。

为了研究响应靶细胞识别的T细胞增殖，将从平板中取出的T细胞以400×g离心5分钟，取出上清液。将沉淀重新悬浮在3.2mL的R5培养基中，并将其中1mL加入新鲜肿瘤单层的每个孔中，一式三孔。通过对剩余的200μL样品中的一小部分采用台盼蓝拒染法，来评估T细胞总数。

当与CYAD-01复制体、NKG2D CAR和对照T细胞相比时，N1012⁺T细胞在BxPC3_LT细胞上经历了明显更多轮的再刺激(图14A)。此外，N1012 T细胞也表现出明显大于CYAD-01复制体T细胞或对照的平均倍数扩增(图14B)。

当与肿瘤球状体共培养时，观察到N1012⁺T细胞显著降低了球状体的存活率，但在UT对照T细胞中和在表达功能性CYAD-01复制体CAR的T细胞中没有观察到(图15A)。与UT或CYAD-01复制体T细胞相比，N1012 T细胞也表现出显著的增殖(图15B)。

实施例10产生N1012 T细胞和N1012_CXCR2 T细胞

表达CAR构建体的T细胞(例如，N1012，N1012_CXCR2，CYAD-01_10)通过分离外周血单核细胞(PBMCs)，激活T细胞，并用含有编码CAR的核酸的病毒转导T细胞而产生(图16A-16B)。

简而言之，为了产生病毒，将1.65×10⁶HEK293T细胞接种在10cm²的组织培养皿中，在含有10％ FBS和2mM L-谷氨酰胺的10mL IMDM培养基(I10培养基)中，并在37℃、5％ CO₂下孵育24小时。第二天，根据表3中的方案为每个CAR构建体生成转染混合物。HEK293T细胞分别转染了以下质粒：N1012(编码DAP10/12融合蛋白和人NKG2D受体(SEQ ID NO:74))、N1012_CXCR2(编码DAP10/12融合蛋白、人NKG2D受体和CXCR2(SEQ ID NO:91))、CYAD-01复制体(编码与CD3ζ融合的NKG2D受体(SEQ ID NO:93))和CYAD-01_10(编码CYAD-01复制体和DAP10(SEQ ID NO:94))。

表3CAR构建体的转染方案(每10cm²培养皿的体积)

15分钟孵育完成后，将混合物B滴加到HEK293T细胞中，并轻轻旋转。然后将细胞放回培养箱。转染后48小时收获上清液，收集到预冷的50mL Falcon管中，并储存在4℃下。

HEK293T细胞加入10mL新鲜I10培养基，然后送回培养箱。再过24小时后，第二次从EK293T细胞中收集上清液，并将其与转染48小时后收集的上清液合并。将合并的上清液等分到预先标记的试管中，快速冷冻，并储存在-80℃下。

使用标准Ficoll Paque介导的密度离心分离PBMCs。在RPMI+5％正常人AB血清和2mM L-谷氨酰胺(“R5”培养基)中以3×10⁶个细胞/mL的浓度重新悬浮，使用包被有抗人CD3和抗人CD28抗体(细胞与珠的比例为1:2)或浓度为5μg/mL的植物血凝素(PHA)的顺磁珠激活T细胞。激活后48小时，将1×10⁶个T细胞接种到包被有RetroNectin的非组织培养物处理的平板上，并与从瞬时转染的HEK 293T细胞中收获的3mL病毒上清液混合。用在RPMI1640培养基+5％正常人AB血清中的100IU/mL的IL-2喂养T细胞，每周提供三次新鲜培养基和IL-2(100IU/mL)。

通过流式细胞术评估T细胞上N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01和CYAD-01_10CAR的表面表达。简言之，用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗人CD4、藻红蛋白(PE)偶联的抗人NKG2D、Alexafluor_647(AF_647)偶联的抗人CXCR2和别藻蓝蛋白花青7(APCCy7)偶联的抗人CD8α抗体在冰上对T细胞染色30分钟。作为背景CXCR2表达的对照，用FITC偶联的CD4、PE偶联的NKG2D、APCCy7偶联的CD8α和AF_647偶联的同型抗体对一个管进行染色。在2mL冰的PBS中洗涤后，将细胞重新悬浮在0.5mL冰的PBS中，并通过流式细胞术进行评估。由于NKG2D在CD8⁺T细胞中的内源性表达，在CD4⁺T细胞内计算基因转移效率，并将其与在未转导的(UT)T细胞中观察到的进行比较。图16C所示的结果表明，所有的构建体都实现了高水平的基因迁移(图16C，左图)，但是与包括N1012_CXCR2在内的其他CAR相比，N1012具有明显更高的表面表达(图16C，右图)。

实施例11评估N1012_CXCR2 T细胞对人卵巢癌细胞的疗效

为评估CAR T细胞在体外对卵巢癌细胞的抗肿瘤效果，进行了细胞毒性(MTT)测定。简而言之，两种代表高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的上皮卵巢癌细胞系-Kuramochi和Ovsaho-分别与CAR T细胞(N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体或CYAD-01_10)以效应物与靶细胞的对数比从1:1到1:64共培养。加入T细胞48小时后，如上所述，通过MTT检测评估肿瘤细胞的存活率。肿瘤细胞存活率表示为在不存在T细胞的情况下生长的肿瘤细胞的百分比(图17)。结果显示，N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体和CYAD-01_10T细胞在两种肿瘤细胞系中均表现出强大的细胞毒性(图17)。相反，未转导的T细胞介导的肿瘤细胞死亡可以忽略不计。

实施例12N1012和N1012_CXCR2 T细胞表现出优异的增殖能力

进行再刺激测定以评估CAR T细胞经历多轮靶细胞溶解的能力。简而言之，CAR-T细胞与Ren间皮瘤肿瘤细胞以1:1的效应物比例共培养。72小时后，轻轻去除T细胞，用1mLPBS轻轻清洗每孔。去除PBS后，向每孔中加入0.5mL MTT溶液，将平板在37℃和5％ CO2下孵育约1小时。去除MTT溶液后，将所得甲晶体溶解在DMSO(0.5mL/孔)中，并在560nm处测量吸光度。肿瘤细胞存活率的计算方法如下：(含T细胞的单层的吸光度/不含T细胞的单层的吸光度)×100。从单层中取出的T细胞以400×g离心5分钟，并去除上清液。将沉淀重新悬浮在3.2mL R5培养基中，并将其中1mL加入新鲜肿瘤单层的每孔中，一式三孔。该试验每周重复两次，直到T细胞不能介导超过40％的靶细胞溶解。通过对剩余的200μL样品中的一小部分采用台盼蓝拒染法，来评估T细胞数量。扩增倍数计算如下(再刺激期间获得的最高总T细胞数/接种的初始T细胞数)。

图18所示的结果表明，与CYAD-01复制体和CYAD-01_10T细胞相比，在再刺激试验期间，N1012和N1012_CXCR2 T细胞的增殖和持久性显著提高。尽管没有观察到未诱导的T细胞或表达NKG2D的T细胞的扩增，但所有CAR⁺T细胞从最初接种的数量开始增殖。N1012和N1012_CXCR2 T细胞的扩增水平显著高于用CYAD-01复制体或CYAD-01_10T细胞观察到的扩增水平。此外，虽然CYAD-01复制体和CYAD-01_10T细胞的数量在额外几轮刺激后迅速减少，但N1012和N1012_CXCR2 T细胞均表现出强劲的增殖。事实上，与首次接种的细胞数量相比，N1012和N1012_CXCR2 T细胞在T细胞数量上分别表现出59.7倍和58.1倍的最大扩增。同样显而易见的是，N1012和N1012_CXCR2 T细胞均表现出增殖爆发，随后T细胞数量减少，之后又出现新一轮增殖(图18)。这种增殖和收缩的模式反映了内源性免疫反应的模式。

实施例13评估T细胞分化、CD4:CD8比率和T细胞刺激后的共刺激分子的表达情况

在刺激16轮和刺激23轮后，从正在进行的再刺激试验中取出一小部分T细胞，并用FITC偶联的抗人CD4和APCCy7偶联的CD8α抗体对T细胞进行染色。使用pecy 7-偶联的抗体对T细胞分别进行CD27染色。通过流式细胞术评估T细胞。在这两个时间点，N1012和N1012_CXCR2 T细胞显示出几乎完全向CD8⁺亚群转移，检测到非常少的CD4⁺细胞(图19A-图19B)。与刺激16轮相比，刺激23轮后向CD8⁺的转移更为明显(比较图19B与图19A)。重要的是，即使在28轮再刺激后，N1012 T细胞仍保留了关键共刺激分子CD27的表达(图20，右图)。结果还表明，在28轮刺激后，N1012 T细胞还保持了一些记忆T细胞(CD45RO⁺CD62L⁺)(图20，左图)。

N1012 T细胞似乎还在中央记忆T细胞(CD45RO⁺CD62L⁺)和效应记忆T细胞(CD45RO⁺CD62L^-)之间循环。即使在再刺激的晚期，也观察到了最低限度的终末衰竭迹象(CD45RO^-CD62L^-)(图21)。

实施例14评估CAR T细胞的亲和力

为了评估NKG2D靶向的CAR T细胞对靶细胞的结合亲和力，测量了在增加的声力水平下T细胞与靶细胞结合的百分比。简而言之，将经CD19工程改造的LO68或SKOV-3肿瘤细胞(两者均表达NKG2D配体)接种于包被聚-L-赖氨酸的z-Movi微流控芯片(Lumicks，Amsterdam，Netherlands)中并培养16小时。第二天，将流式分选的CAR-T细胞连续流入芯片中，并与靶细胞一起孵育5分钟，然后初始化3分钟的线性力梯度。在梯度力过程中，z-Movi设备(Lumicks)使用集成在平台中的明场显微镜捕获了一系列时间序列的图像。分离的细胞被悬浮在声学节点上，允许根据细胞的XY位置追踪细胞。Z位置的变化导致衍射图案的变化，从而可以区分粘附在基底上的细胞和悬浮在声学节点上的细胞。这些信息被用来将细胞脱落事件与特定的破裂力相关联。使用(z-Movi Tracking_v1.6.0)获取细胞脱落，并使用Cell Tracking offline analysis_v2.1进行试验后图像分析。

图22所示的结果表明，CAR T细胞的亲和力似乎反映了CAR的细胞表面表达水平(图16C)。与N1012_CXCR2、CYAD-01复制体和CYAD-01_10CAR T细胞相比，N1012CAR T细胞对Lo68-19和SKOV3细胞表现出更高的亲和力(图22)。与CD19特异性T细胞(FMC63)相比，所有NKG2D CAR T细胞对Lo68_19细胞的结合亲和力都较低，这反映出NKG2D对其配体的亲和力低于FMC63。

实施例15评估N1012和N1012_CXCR2 T细胞的细胞因子分泌

CAR T细胞与各种肿瘤细胞系共培养后，其分泌的干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)通过ELISA进行了评估。CAR T细胞分别与来源于卵巢癌(Kuramochi，Ovsaho)和胰腺癌(CFPac-1)的细胞共培养24小时。随后去除上清液，按照之前的描述用ELISA方法进行评估。

结果表明，在所有测试的细胞系中，N1012_CXCR2 T细胞分泌的IFN-γ(图23A)和IL-2(图23B)明显少于N1012 T细胞。

实施例16与CYAD-01复制体或CYAD-01_10T细胞相比，未刺激的N1012和N1012_CXCR2 T细胞显示出改善的体外扩增

进行实验以评估N1012、N1012_CXCR2、CYAD-01复制体和CYAD-01_10T细胞的扩增和相应的放大潜力。简而言之，如前所述转导T细胞，并且每48-72小时用补充有100IU/mL重组人IL-2的100％体积R5培养基喂养一次。细胞扩增以12天培养期结束时的T细胞总数/最初转导的T细胞数计算。

结果显示，N1012和N1012_CXCR2 T细胞的扩增水平略高于未诱导的T细胞(图24)。相反，与对照T细胞相比，CYAD-01复制体和CYAD-01_10T细胞表现出明显较差的扩增(图24)。

实施例17在卵巢癌小鼠模型中评估N1012_CXCR2 T细胞的体内抗肿瘤疗效

为了评价CAR T细胞在体内对卵巢肿瘤的疗效，将CAR T细胞注射到带有表达萤火虫荧光素酶(ffLuc)的Ovsaho卵巢肿瘤异种移植物、表达ffLuc的SKOV-3卵巢肿瘤异种移植物或表达ffLuc的Kuramochi肿瘤异种移植物的小鼠中。卵巢肿瘤细胞表达低水平的IL-8；SKOV-3肿瘤细胞表达中等水平的IL-8。随后通过生物发光成像监测肿瘤生长。

简而言之，将1×10⁵个表达ffLuc的Ovsaho或Kuramochi或5×10⁵个表达ffLuc的SKOV-3细胞注射到NSG小鼠的腹腔内。用PBS[n＝5]或5×10⁶CAR T细胞(N1012[n＝7]，N1012_CXCR2[n＝7]，CYAD-01复制体[n＝4]，或未转化的T细胞)处理接种了Ovasho细胞的小鼠，通过腹腔注射(肿瘤接种后6天)或静脉注射(接种后7天)给药。接种SKOV-3细胞的小鼠在肿瘤接种后14天用PBS[n＝5]或1×10⁷CAR T细胞(N1012[n＝11]，N1012_CXCR2[n＝11]，或CYAD-01_10[n＝8])静脉内处理。在接种后的第17天，通过腹膜内注射PBS或2×10⁶CAR T细胞(N1012或N1012_CXCR2)或未转导的T细胞来处理接种了Kuramochi细胞的小鼠。在第18天，通过静脉注射PBS或2×10⁶CAR T细胞(N1012或N1012_CXCR2)或未转化的T细胞来处理接种了Kuramochi细胞的小鼠。

结果显示，在用N1012、N1012_CXCR2和CYAD_01复制体T细胞处理的小鼠中对Ovsaho细胞肿瘤的初步抗肿瘤作用(图25和图38)。在首次接种肿瘤后的第56天，通过腹膜内注射1×10⁵个表达ffLuc的Ovsaho细胞，用肿瘤再激发Ovsaho异种移植物小鼠。肿瘤再激发后，在用N1012或N1012_CXCR2 T细胞处理的小鼠中没有观察到肿瘤生长(图38)。相比之下，用CYAD-01复制体T细胞处理的小鼠在肿瘤再激发后显示出肿瘤生长的显著增加(图38)。结果表明，与CYAD-01复制体T细胞相比，N1012_CXCR2和N1012 T细胞具有更好的抗卵巢肿瘤活性。

与接受N1012或CYAD-01_10T细胞处理的小鼠相比，接受N1012_CXCR2 T细胞处理的含SKOV-3异种移植物小鼠显示出更强的抗肿瘤活性(图27)和存活率(图37)。

用N1012或N1012_CXCR2 T细胞处理也证明了在Kuramochi异种移植物小鼠中的抗肿瘤活性(图39和图41)。已经排斥肿瘤的N1012和N1012_CXCR2处理的小鼠在第86天通过腹膜内注射1×10⁵个表达ffLuc的Kuramochi细胞进行肿瘤再激发。一些再激发的小鼠的肿瘤生长受到了抑制，这表明小鼠体内仍有抗肿瘤活性(图39和图41)。图40和图43分别是在图39和图41中详细描述的试验中处理的Kuramochi异种移植物小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。单次实验中使用的T细胞来自同一供体。图41所示试验中使用的T细胞与图39所示试验中使用的T细胞来自不同的供体。

为了评估T细胞的迁移，对T细胞进行了双转导，以表达CAR构建体(N1012或N1012_CXCR2)和报告基因构建体(单独的rLuc或rLuc与GFP共表达)。

在肿瘤接种后7天，通过静脉注射用5×10⁶CAR T细胞(N1012_SW[n＝3]或N1012_CXCR2_rLuc/GFP[n＝3])处理如前所述接种了Ovasho细胞的小鼠。生物发光成像的结果(图26，右图)显示，在T细胞注射后的1-3天之间，N1012_CXCR2_rLuc/GFP T细胞比N1012_SW T细胞更有效地迁移到腹膜，同时在两个处理组中观察到相当的抗肿瘤活性(图26，左图和中图)。考虑到Ovsaho细胞表达中低水平的IL-8，N1012_CXCR2_rLuc/GFP T细胞的迁移增加可能是由于CXCR2配体而非IL-8的作用。

如前所述接种SKOV-3细胞的小鼠在肿瘤接种后14天通过静脉注射1×10⁷CAR T细胞(N1012_CXCR2_rLuc/GFP或N1012_rLuc/GFP)处理。图28和图29中显示的结果表明，在T细胞给药后的前四天，N1012_CXCR2 T细胞比N1012 T细胞的迁移效率更高(图28，右图和图29)。图28(左图)中显示的结果进一步表明，用N1012_rLuc/GFP和N1012_CXCR2_rLuc/GFP T细胞处理的小鼠在T细胞给药后保持抗肿瘤活性超过60天。

在肿瘤接种后第18天，用2×10⁶个与N1012或N1012_CXCR2和双报告基因rLuc/GFP共转导的CAR T细胞处理如前所述接种了Kuramochi细胞的小鼠。图42显示的结果表明，在T细胞给药后的前四天，N1012_CXCR2 T细胞比N1012 T细胞能更有效地进入腹膜。

实施例18评估N1012_CXCR2 T细胞在胰腺癌小鼠模型中的体内抗肿瘤效果

为了评价CAR T细胞在体内对胰腺肿瘤的功效，将CAR T细胞注射到含有CFPac-1或BxPC3肿瘤细胞的小鼠体内。

简言之，将1×10⁵CFPac-1或BxPC3细胞与50μL基质胶(1:1PBS)一起皮下注射到NSG小鼠的左腹部。接种CFPac-1细胞29天后或接种BxPC3细胞14天后，用PBS或1×10⁷CAR T细胞(N1012_CXCR2、N1012、NKG2D、CYAD-01复制体，未转导的(UT)T细胞)静脉内处理小鼠。T细胞注射后三天，处死来自N1012、N1012_CXCR2和UT T细胞处理组的三只小鼠，并采集肿瘤用于免疫组化(IHC)分析。每周用卡尺测量肿瘤生长情况，并以肿瘤体积(mm³)表示。

结果显示，用N1012_CXCR2 T细处理的CFPac-1异种移植物小鼠中的肿瘤在T细胞给药后被完全根除，并且没有观察到肿瘤复发(图30)。相反，用N1012和CYAD-01复制体T细胞处理CFPac-1异种移植物小鼠后，肿瘤生长最初会受到抑制，随后抗肿瘤活性消失和肿瘤复发(图30)。IHC分析显示，与N1012或NKG2D T细胞相比，N1012_CXCR2 T细胞对CFPac-1肿瘤的浸润有所改善(图31)。

与用N1012或CYAD-01复制体T细胞处理的小鼠相比，用N1012_CXCR2 T细胞处理的BxPC3异种移植物小鼠显示出改善的肿瘤抑制作用(图33)和存活率(图34),表明CXCR2的存在改善了CAR T细胞向产生IL-8的BxPC3肿瘤的归巢。

还进行了额外的研究来比较高剂量和低剂量CAR T细胞的治疗效果。简言之，将1×10⁵CFPac-1细胞注射到NSG小鼠的腹腔内。肿瘤接种后28天，用PBS[n＝5]、高剂量的10×10⁶CAR T细胞(N1012[n＝7]、N1012_CXCR2[n＝7]、CYAD-01复制体[n＝5])或低剂量的4×10⁶CAR T细胞(N1012[n＝6]、N1012_CXCR2[n＝7])处理小鼠。图32中显示的结果表明，低剂量N1012_CXCR2 T细胞的疗效与高剂量N1012 T细胞的疗效一致。

实施例19评估N1012_CXCR2 T细胞在间皮瘤患者来源的异种移植物(PDX)肿瘤模型中的抗肿瘤疗效

生成间皮瘤患者来源的异种移植物(PDX)小鼠肿瘤模型，以评估N1012和N1012_CXCR2 CAR T细胞在体内治疗间皮瘤的疗效。为了建立间皮瘤PDX模型，使用15G套管植入针将原发性患者间皮瘤肿瘤碎片(2×2mm)皮下移植到NSG小鼠的左腹部。肿瘤在六个月的时间内生长，并传代三次进入新的组群。在第4代，将PDX材料植入雄性NSG小鼠的试验组的左腹部。在肿瘤植入后的第111天，对小鼠静脉内施用PBS[n＝8]或1×10⁷CAR T细胞(未转导的(UT)，N1012_CXCR2[n＝8]，N1012[n＝9]或CYAD-01_10[n＝5])。在有或没有CAR的情况下，用荧光素酶和TD tomato(LT)转导的T细胞处理一组小鼠，以便通过生物发光成像跟踪T细胞(N1012_CXCR2_LT[n＝3]、N1012_LT或单独LT[n＝3])。每周用卡尺测量肿瘤生长情况，并以肿瘤体积(mm³)表示。

图35和图44中的结果显示，在用N1012和N1012_CXCR2 T细胞处理的小鼠中观察到抗肿瘤活性。相反，用CYAD-01_10T细胞处理的小鼠对治疗反应不佳。图36显示了T细胞的生物发光成像，表明N1012和N1012_CXCR2 T细胞定位于间皮瘤PDX小鼠的肿瘤部位，而仅用LT报告基因(无CAR)转导的T细胞没有定位于肿瘤。研究中小鼠的Kaplan-Meier生存曲线如图45所示。

等同物和通过引用并入

本文引用的所有参考文献均以引用方式并入，其并入程度等同于每份单独的出版物、数据库条目(如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被具体且单独地指明以引用方式并入其全部内容，用于所有目的。根据Applicants,pursuant to 37 C.F.R.§1.57(b)(1)，申请人希望本引用合并声明与每一份出版物、数据库条目(如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利相关，其中的每一份都根据37C.F.R.1.57(b)(2)进行了明确标识，即使此类引用并不与引用合并声明直接相关。在说明书中包含以引用方式并入的专门声明(如有)，并不以任何方式削弱以引用方式并入的一般声明。本文引用参考文献并不意味着承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

虽然已经参照优选实施例和各种替代实施例具体示出和描述了本公开，但是相关领域的技术人员应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

序列

SEQ ID NO:1(人DAP10全长序列)

SEQ ID NO:2(DAP10 aa19-93-缺少前导序列)

SEQ ID NO:3(DAP10 aa19-69-胞外/跨膜结构域)

SEQ ID NO:4(DAP10 aa1-71)

SEQ ID NO:5(DAP10 aa19-71)

SEQ ID NO:6(DAP10 aa70-93-胞内结构域)

SEQ ID NO:7(DAP10 aa49-93-跨膜和胞内结构域)

SEQ ID NO:8(DAP10 aa49-69-跨膜结构域)

SEQ ID NO:9(人DAP12全长序列)

SEQ ID NO:10(DAP12 aa22-113-缺少前导序列)

/>

SEQ ID NO:11(DAP12 aa62-113-胞质/胞内结构域)

SEQ ID NO:12(DAP12 aa41-61-跨膜结构域)

SEQ ID NO:13(DAP12 aa22-61-胞外/跨膜结构域)

SEQ ID NO:14(人NKG2D全长序列)

SEQ ID NO:15(人NKG2D aa73-216-胞内结构域)

SEQ ID NO:16(人NKG2D aa82-216-胞外结构域)

SEQ ID NO:17(人NKG2D aa52-216-跨膜和胞外结构域)

SEQ ID NO:18(连接子)

SEQ ID NO:19(连接子)

SEQ ID NO:20(连接子)

SEQ ID NO:21(连接子)

SEQ ID NO:22(连接子)

SEQ ID NO:23(连接子)

SEQ ID NO:24(连接子)

/>

SEQ ID NO:25(连接子)

SEQ ID NO:26(连接子)

SEQ ID NO:27(连接子)

SEQ ID NO:28(连接子)

SEQ ID NO:29(连接子)

SEQ ID NO:30(连接子)

SEQ ID NO:31(连接子)

SEQ ID NO:32(连接子)

SEQ ID NO:33(连接子)

SEQ ID NO:34(连接子)

SEQ ID NO:35(连接子)

SEQ ID NO:36(连接子)

SEQ ID NO:37(连接子)

SEQ ID NO:38(弗林蛋白酶切割位点)

SEQ ID NO:39(P2A跳跃肽)

SEQ ID NO:40(T2A跳跃肽)

SEQ ID NO:41(SGSG+P2A)

SEQ ID NO:42(SGSG+T2A)

SEQ ID NO:43(弗林蛋白酶+SGSG+P2A)

SEQ ID NO:44(弗林蛋白酶+SGSG+T2A)

SEQ ID NO:45(F2A跳跃肽)

SEQ ID NO:46(E2A跳跃肽)

SEQ ID NO:47(His标签)

SEQ ID NO:48(FLAG标签)

SEQ ID NO:49(Avi标签)

SEQ ID NO:50(V5标签)

SEQ ID NO:51(V5标签)

SEQ ID NO:52(Myc标签)

SEQ ID NO:53(AHF标签)

SEQ ID NO:54(FHA标签)

SEQ ID NO:55(CD8α前导序列)

SEQ ID NO:56(4-1BB胞内结构域)

SEQ ID NO:57(CD27胞内结构域)

SEQ ID NO:58(人IgG1铰链-UniProt:P0DOX5 aa 218-229)

SEQ ID NO:59(截短的CD8α铰链)

SEQ ID NO:60

SEQ ID NO:61

/>

SEQ ID NO:62

SEQ ID NO:63

SEQ ID NO:64(构建体1/N1012)

SEQ ID NO:65(构建体3)

SEQ ID NO:66(构建体8)

SEQ ID NO:67(构建体9)

SEQ ID NO:68(构建体10)

SEQ ID NO:69(构建体11)

SEQ ID NO:70(编码SEQ ID NO:60的多肽)

/>

SEQ ID NO:71(编码SEQ ID NO:61的多肽)

SEQ ID NO:72(编码SEQ ID NO:62的多肽)

SEQ ID NO:73(编码SEQ ID NO:63的多肽)

SEQ ID NO:74(编码SEQ ID NO:64的多肽/构建体1/N1012)

/>

SEQ ID NO:75(编码SEQ ID NO:65的多肽/构建体3)

/>

SEQ ID NO:76(编码SEQ ID NO:66的多肽/构建体8)

/>

SEQ ID NO:77(编码SEQ ID NO:67的多肽/构建体9)

SEQ ID NO:78(编码SEQ ID NO:68的多肽/构建体10)

SEQ ID NO:79(编码SEQ ID NO:69的多肽/构建体11)

SEQ ID NO:80(A20FMDV2肽)

SEQ ID NO:81(CD124信号肽)

SEQ ID NO:82(CD28 aa114-220)

SEQ ID NO:83(CD247 aa52-164)

/>

SEQ ID NO:84(WO 2019/182425的SEQ ID NO:1)

SEQ ID NO:85(WO 2019/182425的SEQ ID NO:9)

SEQ ID NO:86(WO 2019/182425的SEQ ID NO:11)

SEQ ID NO:87(在N1012_CXCR2中表达的人CXCR2多肽的序列)

SEQ ID NO:88(编码SEQ ID NO:87多肽的核酸序列)

SEQ ID NO:89(SFG N1012_CXCR2的核酸序列)

/>

/>

/>

SEQ ID NO:90(编码SEQ ID NO:89的蛋白(包括：(i)融合全长DAP10/DAP12细胞内结构域；(ii)弗林蛋白酶切割位点(RRKR)；(iii)SGSG连接子；(iv)P2A跳跃序列；(v)NKG2D；(vi)弗林蛋白酶切割位点(RRKR)；(vii)SGSG连接子；(viii)T2A跳跃序列；(ix)CXCR2)

SEQ ID NO:91(编码SEQ ID NO:90的多肽)

/>

SEQ ID NO:92(Cyad-01 CAR的复制体的氨基酸序列(NKG2D融合到CD3ζ的胞内结构域)

SEQ ID NO:93(编码SEQ ID NO:92的多肽的核酸序列)

SEQ ID NO:94(编码SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:1的CYAD-01_10-多肽的核酸序列)

/>

SEQ ID NO:95(人NKG2D胞外结构域)

SEQ ID NO:96(人NKG2D胞外结构域)

SEQ ID NO:97(SEQ ID NO:95去掉8个最N末端氨基酸)

SEQ ID NO:98(小鼠NKG2D TM结构域；UniProt登录号:054709)

SEQ ID NO:99(小鼠NKG2D TM结构域)

SEQ ID NO:100(大鼠NKG2D)

SEQ ID NO:101(大鼠NKG2D TM结构域；UniProt登录号：070215aa 52-74)

SEQ ID NO:102(N5多肽)

SEQ ID NO:103(编码SEQ ID NO:102多肽的核酸)

/>

SEQ ID NO:104(人IgG1铰链–UniProt:P0DOX5的aa 218-232)

SEQ ID NO:105(CYAD-01_10(NKG2D-CD3ζ+核糖体跳跃肽+DAP10))的氨基酸序列

/>

Claims (58)

1.一种免疫应答细胞，其包含：(a)NKG2D多肽；(b)融合多肽，其包含(i)DNAX活化蛋白10(DAP10)多肽或其功能性变体和(ii)DNAX活化蛋白12(DAP12)多肽或其功能性变体；以及(c)CXCR2多肽。

2.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其中各所述NKG2D多肽、DAP10多肽、DAP12多肽和CXCR2多肽都为哺乳动物多肽。

3.如权利要求2所述的免疫应答细胞，其中各所述NKG2D多肽、DAP10多肽、DAP12多肽和CXCR2多肽都为人多肽。

4.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述NKG2D多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:14的序列具有至少约85％的序列同一性。

5.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述NKG2D多肽为具有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的多肽的功能性变体。

6.如权利要求5所述的免疫应答细胞，其中所述功能性变体相对SEQ ID NO:14具有一个或多个添加、删除或取代至少一个氨基酸的点突变。

7.如权利要求5所述的免疫应答细胞，其中所述功能性变体为具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的多肽的截短形式。

8.如权利要求5所述的免疫应答细胞，其中所述功能性变体为嵌合NKG2D多肽。

9.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述融合多肽从N末端到C末端具有下式：A-B-C-D-E，其中A为任选的N末端序列；B为DAP10多肽或其功能性变体；C为任选的连接子序列；D为DAP12多肽或其功能性变体；和E为任选的C末端序列。

10.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP10多肽为DAP10的功能性变体，其包含与如SEQ ID NO:1所示的DAP10多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。

11.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP10多肽为SEQ ID NO:1的功能性变体，其具有一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，所述点突变添加、删除或取代SEQ ID NO:1的DAP10多肽的任意氨基酸。

12.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP10多肽为具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的多肽的截短形式的DAP10多肽的功能性变体。

13.如权利要求12所述的免疫应答细胞，其中所述截短形式的DAP10多肽包含SEQ IDNO:1的19-93、19-69、1-71、19-71、19-48、49-69、49-93或70-93位氨基酸或由它们组成。

14.如权利要求1-8中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP10多肽包含SEQ IDNO:1-8中的任一氨基酸序列或由它们组成。

15.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP12多肽为DAP12的功能性变体，其包含与SEQ ID NO:9的DAP12多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。

16.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP12多肽为SEQ ID NO:9的功能性变体，其具有一个或多个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)点突变，所述点突变添加、删除或取代SEQ ID NO:9的DAP12多肽的任意氨基酸。

17.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP12多肽为具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的多肽的截短形式的DAP12多肽的功能性变体。

18.如权利要求17所述的免疫应答细胞，其中所述截短形式的DAP12多肽包含SEQ IDNO:9的22-113、62-113、22-61或41-61位氨基酸或由它们组成。

19.如权利要求1-14中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP12多肽包含SEQ IDNO:9-13中的任一氨基酸序列或由它们组成。

20.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述DAP10多肽和DAP12多肽通过连接子连接。

21.如权利要求20所述的免疫应答细胞，其中所述连接子包含SEQ ID NO:18-46中的任一氨基酸序列或由它们组成。

22.如权利要求20或权利要求21所述的免疫应答细胞，其中所述连接子包含SEQ IDNO:33或38-44中的任一氨基酸序列或由它们组成。

23.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述融合多肽包含N末端序列。

24.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述融合多肽包含C末端序列。

25.如权利要求23或权利要求24所述的免疫应答细胞，其中所述N末端序列或C末端序列包含His标签、FLAG标签、Arg标签、T7标签、Strep标签、S标签、AviTag^TM、适体标签、myc标签、CD8α前导序列、4-1BB胞内结构域、V5标签或CD27胞内结构域中的一种或多种。

26.如权利要求25所述的免疫应答细胞，其中所述N末端序列或C末端序列包含CD8α前导序列、4-1BB胞内结构域或CD27胞内结构域中的一种或多种。

27.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述融合多肽包含SEQ IDNO:60-63中的任一氨基酸序列或由它们组成。

28.如权利要求1-8中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述融合多肽：

(a)不包含SEQ ID NO:84；和/或

(b)不包含抗EpCAM肽；和/或

(c)不包含SEQ ID NO:85；和/或

(d)不包含SEQ ID NO:86；和/或

(e)不包含SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86二者。

29.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述融合多肽包含在其C末端与人DAP12多肽的胞内结构域融合的全长人DAP10或由其组成，其中所述胞内结构域由人DAP12的62-113位氨基酸编码。

30.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述融合多肽具有SEQ IDNO:60的序列。

31.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述CXCR2多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:87的序列具有至少约85％的序列同一性。

32.如权利要求31所述的免疫应答细胞，其中所述CXCR2多肽具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列。

33.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞为T细胞或自然杀伤(NK)细胞。

34.如权利要求33所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞为αβT细胞、γδT细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或它们的任意组合。

35.一种核酸分子，其编码NKG2D多肽，CXCR2多肽和任选的DNAX活化(DAP10)多肽，DNAX活化(DAP12)多肽，和/或融合多肽。

36.如权利要求35所述的核酸分子，其中所述融合多肽包含(i)DNAX活化10(DAP10)多肽或其功能性变体，以及(ii)DNAX活化蛋白12(DAP12)多肽或其功能性变体。

37.如权利要求35或权利要求36所述的核酸分子，其中所述核酸分子为编码NKG2D多肽、融合多肽和CXCR2多肽的嵌合多核苷酸。

38.如权利要求37所述的核酸分子，其中所述核酸分子从5’到3’编码(i)与人DAP12的胞内结构域同框的人DAP10；(ii)第一蛋白酶切割位点；(iii)第一连接子；(iv)第一核糖体跳跃肽；(v)人NKG2D；(vi)第二蛋白酶切割位点；(viii)第二连接子；(viii)第二核糖体跳跃肽；和(ix)人CXCR2。

39.如权利要求35-38中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:88的核苷酸序列。

40.如权利要求35-39中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO:91的核苷酸序列。

41.一种包含如权利要求35-40中任一项所述的核酸序列的载体。

42.如权利要求41所述的载体，其中所述载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。

43.如权利要求42所述的载体，其中所述载体为SFG逆转录病毒载体。

44.一种制备如权利要求1-34中任一项所述的免疫应答细胞的方法，包括以下步骤：

(a)用如权利要求35-40中任一项所述的核酸分子或如权利要求41-43中任一项所述的载体转导T细胞或自然杀伤细胞；和

(b)培养T细胞或自然杀伤细胞，使得转导的细胞表达NKG2D多肽、DAP10/DAP12融合多肽和CXCR2多肽，其中NKG2D多肽和DAP10/DAP12融合多肽在细胞膜中结合。

45.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括：向受试者施用治疗有效量的如权利要求1-34中任一项所述的免疫应答细胞。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述免疫应答细胞由受试者自体的T细胞或NK细胞制造。

47.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述癌症为实体瘤癌症。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述实体瘤癌症为肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、甲状腺癌、食道癌、小肠癌或其任意组合。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述实体瘤癌症为卵巢癌。

50.如权利要求1-34中任一项所述的免疫应答细胞用于治疗或预防癌症。

51.一种免疫应答细胞，其包含：(a)嵌合NKG2D多肽，其包含人NKG2D胞外结构域或其变体和鼠NKG2D跨膜结构域或其变体；(b)CXCR2多肽。

52.如权利要求51所述的免疫应答细胞，其中所述人NKG2D胞外结构域具有如SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:97所示的序列。

53.如权利要求51或权利要求52所述的免疫应答细胞，其中所述鼠NKG2D跨膜结构域具有如SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101所示的序列。

54.如权利要求51所述的免疫应答细胞，其中所述嵌合NKG2D多肽包含人NKG2D胞外结构域的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:95、96或97中的任一序列具有至少80％的序列同一性。

55.如权利要求51-52或权利要求54中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述嵌合NKG2D多肽包含鼠NKG2D跨膜结构域的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:98、99、100或101中的任一序列具有至少80％的序列同一性。

56.如权利要求51-55中任一项所述的免疫应答细胞，其中细胞进一步包含至少一种DNAX活化蛋白12(DAP12)多肽或其变体。

57.如权利要求51-56中任一项所述的免疫应答细胞，其中细胞进一步包含至少一种DNAX活化蛋白10(DAP10)多肽或其变体。

58.如权利要求57所述的免疫应答细胞，其中细胞包含与如SEQ ID NO:102所示的序列具有至少90％序列同一性的多肽。