CN112105723A - 用于治疗癌症和传染病的治疗性细胞系统和方法 - Google Patents

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T.J.威克姆
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Abstract

本公开涉及红系细胞，其已经被工程化改造成例如在细胞表面处包含一种或多种外源刺激性多肽，其中所呈现的外源刺激性多肽足以刺激免疫杀伤细胞。本公开的工程化去核细胞可用于在有此需要的受试者，如患有癌症或传染病，特别是以MHC I类呈递下调为特征的癌症或传染病的受试者中活化NK细胞和/或CD8+T细胞的方法。

Description

用于治疗癌症和传染病的治疗性细胞系统和方法
相关申请
本申请要求2018年3月8日提交的美国临时专利申请号62/640,530，2018年4月20日提交的美国临时专利申请号62/660,657，2018年6月4日提交的美国临时专利申请号62/680,490，2018年6月29日提交的美国临时专利申请号62/692,487，2018年9月17日提交的美国临时专利申请号62/732,050和2018年11月8日提交的美国临时专利申请号62/757,717的优先权，每篇的全部内容通过引用并入本文以用于所有目的。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于2019年3月5日，名为129267-00220_SL.txt，大小为127,920字节。
发明背景
CD8+T细胞和NK细胞是免疫系统的细胞毒性效应细胞。尽管CD8+T细胞和NK细胞具有不同的靶物识别机制和信号传导级联机制，但它们都是共享杀死被感染的和转化的细胞的相似目标的杀伤细胞类型。已经采用了几种策略来刺激CD8+T细胞和NK细胞对肿瘤的响应。CD8+T细胞在当前的癌症免疫治疗中起着至关重要的作用。细胞因子疗法用于治疗某些人类癌症，其中用诸如白介素(例如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21)或TNFα的细胞因子治疗增强局部CD8+T细胞和NK细胞活性(例如分化和激活)。在几项试验中已评估了IL-2施用对癌症患者中NK细胞活化和扩充的影响，混合的结果取决于肿瘤的类型和IL-2施用所使用的条件。此外，此类涉及细胞因子施用的疗法与潜在的毒性有关。
研究已经显示了CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的量与免疫疗法的无进展存活之间的正相关(参见，例如Sharma et al.,Science 2015,348:56-61)。CAR-T细胞利用CD8+T细胞的细胞毒性来根除癌症。但是，CAR-T疗法的挑战之一是CAR-T细胞不是肿瘤特异性的。CAR-T靶向的安全性引起了极大关注，尤其是在实体瘤中(Junghans,Cancer Gene Therapy(2017)24,89–99)。
当前，靶向NK细胞的一些最有前途的方法涉及过继性细胞转移，包括使用自体NK细胞、同种异体NK细胞、NK细胞系和CAR NK细胞。但是，这些方法与明显的缺陷有关，例如功效低，需要大量消耗T细胞以避免GVHD(对于同种异体细胞)、受试者的持久性低以及难以扩充和/或制造大量细胞。
因此，在本领域中仍然需要用于治疗目的的利用免疫杀伤细胞(例如NK细胞和CD8+T细胞)的替代方式。
发明概述
本公开涉及经工程化改造以刺激免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)的红系细胞(例如工程化红系细胞)。特别地，本发明提供了红系细胞，其已经如下经工程化改造以刺激免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)：在红系细胞的细胞表面上表达足以活化和/或扩充NK细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种外源刺激性多肽，诸如例如IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL或其组合。工程化红系细胞可以是有核的，例如红系前体细胞(例如，红细胞前体细胞)，或者可以是去核红系细胞，例如网织红细胞或红细胞。本发明进一步提供了这些工程化红系细胞在活化有此需要的受试者(例如患有癌症的受试者或患有传染病的受试者)中的NK细胞和/或CD8+T细胞中的用途。
与目前的免疫杀伤细胞靶向技术相比，本文提供的工程化红系细胞提供了显著的优势：是天然免疫特许的(immuno-privileged)并且直接在体内介导免疫杀伤细胞的刺激，因此避免了与免疫杀伤细胞的过继细胞转移相关的缺点。当体内暴露于这些细胞群体时，本发明的工程化红系细胞可以被工程化以同时刺激NK细胞和CD8+细胞两者。特别地，本发明的发现是包含IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL或其组合的工程化红系细胞驱动原代CD4+、CD8+、NK和NKT细胞的有效活化，并诱导NK细胞的细胞毒性。NK细胞和CD8+T细胞两者的体内刺激代表了相对于现有疗法的一项重要创新，在所述现有疗法中离体发生刺激，并且通常仅限于一次刺激一个免疫细胞(例如NK细胞或CD8+T细胞)群体。
工程化红系细胞提供了另外的优点，即在单一红系细胞上，且以相当高的数目呈现，例如在细胞表面上包含多种不同刺激分子，以及在整个循环系统中并且以长循环半衰期通过红系细胞直接递送和维持刺激信号，因此提供了更安全且更有效的用于刺激免疫杀伤细胞的方法。在具体的实施方案中，如本文所述，本发明的工程化红系细胞上的刺激分子协同一起发挥作用以活化免疫杀伤细胞。如本文所述，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞在一些实施方案中用于治疗癌症，包括转移性癌症。本发明的发现正是，包含IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL及其组合的工程化红系细胞可以在体内有效地减缓肿瘤生长并减轻肿瘤负荷。
因此，在第一方面，本公开提供了经工程化改造以刺激免疫杀伤细胞的去核细胞，其中所述去核细胞至少包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述外源刺激性多肽足以刺激所述免疫杀伤细胞。在一些实施方案中，免疫杀伤细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，免疫杀伤细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，去核细胞至少包含第一外源刺激性多肽、第二外源刺激性多肽和第三外源刺激性多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽的至少一种包括选自下组的多肽：IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IL-15/IL-15RA融合物，IL-18，IL-21，干扰素α(IFNα)，4-1BBL，脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)，CD48，人类白细胞抗原(HLA)-A，HLA-C，HLA-G，硫酸类肝素(HS)，HLA-E，CpG，免疫球蛋白G(IgG)，MHC I类链相关蛋白(MIC)，B7-H6，NkP44L，Nectin2，NK-T-B抗原(NTBA)，激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，外源刺激性多肽的至少一种包含IL-15/IL-15RA融合物。在一些实施方案中，外源刺激性多肽的至少一种包含IL-12。在一些实施方案中，外源刺激性的至少一种多肽包含4-1BBL。在一些实施方案中，MIC蛋白选自下组：MHC I类链相关蛋白A(MICA)，MHC I类链相关蛋白B(MICB)和UL16结合蛋白(ULBP)。在一些实施方案中，外源刺激性多肽的至少一种包含选自下组的多肽：IL-15/IL-15RA融合物，MICA，MICB和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA，并且第二外源刺激性多肽包含选自下组的多肽：IL-1，IL-2，IL-12，IL-18，IL-21、4-1BBL，IFNα，MICA，MICB，PVR和CD48。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA，并且第二外源刺激性多肽包含4-1BBL。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA，并且第二外源刺激性多肽包含IL-12。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-12，并且第二外源刺激性多肽包含4-1BBL。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽选自下组：IL-18和IL-12，IL-18和IL-21，IL-12和4-1BBL，IL-12和IL-15/IL-15RA融合物，以及4-1BBL和IL-15/IL-15RA融合物。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-12，第二外源刺激性多肽包含IL-18，并且第三外源刺激性多肽包含IL15/IL-15RA融合物。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-12，第二外源刺激性多肽包含IL-18，并且第三外源刺激性多肽包含IL-15。在一些实施方案中，至少一种外源多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。在一些实施方案中，所述第一外源刺激性多肽以比所述第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，所述第二外源刺激性多肽以比所述第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50或约100:1至1:100的丰度比。在一些实施方案中，第一和第二外源刺激性多肽以融合多肽存在。在一些实施方案中，第一，第二和第三外源刺激性多肽以融合多肽存在。在本文任何方面和实施方案的一些实施方案中，至少一种或多种外源刺激性多肽存在于工程化去核细胞的表面处。在本文任何方面和实施方案的一些实施方案中，至少一种或多种外源刺激性多肽还包含跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其跨膜部分。在一些实施方案中，跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分。在本文任何方面和实施方案的一些实施方案中，去核细胞能够活化NK细胞。在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，去核细胞能够扩充NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞是记忆样NK细胞。在本文任何方面和实施方案的任何实施方案中，去核细胞能够活化CD8+T细胞。在本文任何方面和实施方案的一些实施方案中，去核细胞能够扩充CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是记忆T细胞。在本文的任何方面和实施方案的一些实施方案中，去核细胞是红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，红系细胞是红细胞。
在另一方面，本公开提供了工程化去核细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段，以及白介素-15受体α(IL-15RA)多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含融合多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3接头(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.37至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，和IL-15受体αsushi(sushi)结合域。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体αsushi结合域以复合物形式存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体αsushi结合域以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15受体αsushi结合域连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.31至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程化去核细胞还包含第二外源刺激性多肽。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含4-1BBL。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含与SEQ ID NO.41至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含与SEQ ID NO.43至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二种外源刺激性多肽包含IL-12。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含含有IL-12的p40和p35亚基的融合多肽。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含与SEQ ID NO.37至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含与SEQ ID NO.55至少95％相同的氨基酸序列。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞还包含一种或多种选自下组的外源刺激性多肽：IL-1，IL-2，IL-12，IL-18，IL-21，干扰素α(IFNα)，脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)，CD48，人白细胞抗原(HLA)-A，HLA-C，HLA-G，硫酸类肝素(HS)，HLA-E，CpG，免疫球蛋白G(IgG)，UL16结合蛋白(ULBP)，MHC I类链相关蛋白(MIC)，B7-H6，NkP44L，Nectin2，NK-T-B抗原(NTBA)，激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，MIC蛋白是MHC I类链相关蛋白A(MICA)或MHC I类链相关蛋白B(MICB)。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，一种或多种外源刺激性多肽存在于工程化去核细胞的表面处。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，外源刺激性多肽足以刺激免疫杀伤细胞。在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，第一外源刺激性多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，所述第一外源刺激性多肽以比所述第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，所述第二外源刺激性多肽以比所述第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50或约100:1至1:100的丰度比。在一些实施方案中，工程化去核细胞还包含第二外源多肽和第三外源刺激性多肽。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞包含两个外源刺激性多肽，并且两个外源刺激性多肽以融合多肽存在。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞包含三种外源刺激性多肽，并且三种外源刺激性多肽以融合多肽存在。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，一种或多种外源刺激性多肽还包含跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其跨膜部分。在一些实施方案中，跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞能够刺激免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是杀伤免疫细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，NK细胞是记忆样NK细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，刺激免疫细胞包括活化免疫细胞。在一些实施方案中，刺激免疫细胞包括扩充免疫细胞。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞是红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，红系细胞是红细胞。
在另一个方面，本公开提供了工程化去核细胞，其至少包含第一外源刺激性多肽，其包括选自下组的多肽：MHC I类链相关蛋白A(MICA)，MHC I类链相关蛋白B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，去核细胞还包含第二外源多肽。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含选自下组的多肽：IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IL-15/IL-15RA融合物，IL-18，IL-21，干扰素α(IFNα)，4-1BBL，脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)，CD48，HLA-A，HLA-C，HLA-G，硫酸类肝素(HS)，HLA-E，CpG，IgG，UL16结合蛋白(ULBP)，MHC I类链相关多肽(MIC)，B7-H6，NkP44L，Nectin2，NK-T-B抗原(NTBA)，激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，一种或多种外源刺激性多肽存在于工程化去核细胞的表面处。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，外源刺激性多肽足以刺激免疫杀伤细胞。在一些实施方案中，外源刺激性多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。在一些实施方案中，所述第一外源刺激性多肽以比所述第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，所述第二外源刺激性多肽以比所述第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50或约100:1至1:100的丰度比。在一些实施方案中，去核细胞还包含第三外源刺激性多肽。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞包含两种外源刺激性多肽，并且两种外源刺激性多肽以融合多肽存在。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞包含三种外源刺激性多肽，并且三种外源刺激性多肽以融合多肽存在。在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，一种或多种外源刺激性多肽包含跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其跨膜部分。在一些实施方案中，跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分。在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，工程化去核细胞能够刺激免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是杀伤免疫细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，NK细胞是记忆样NK细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，刺激免疫细胞包括活化免疫细胞。在一些实施方案中，刺激免疫细胞包括扩充免疫细胞。
在另一方面，本公开提供了刺激免疫杀伤细胞的方法，其包括以有效刺激免疫杀伤细胞的量使免疫杀伤细胞与本文方面和实施方案中任一项的工程化去核细胞接触。在一些实施方案中，免疫杀伤细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫杀伤细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，刺激包括活化NK细胞。在一些实施方案中，刺激包括扩充NK细胞。在一些实施方案中，刺激包括活化CD8+T细胞。在一些实施方案中，刺激包括扩充CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是记忆T细胞。在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，接触在体内进行。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，接触离体进行。在本文方面和实施方案的一些实施方案中，接触在体外进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括将工程化去核细胞施用于需要免疫杀伤细胞活化的受试者。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症的特征在于低的MHC I类呈递。在一些实施方案中，所述癌症包括PD-1响应性肿瘤。在一些实施方案中，癌症包括具有高突变负荷的肿瘤。在一些实施方案中，正在用降低MHC I类呈递的化学治疗剂治疗受试者。在一些实施方案中，癌症选自肺癌、肝细胞癌、黑素瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症包括淋巴瘤，并且淋巴瘤包括何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者患有传染病。在一些实施方案中，传染病是由病毒感染引起的。在一些实施方案中，病毒感染的特征在于低的MHC I类呈递。在一些实施方案中，病毒感染由选自下组的病毒引起：腺病毒、埃巴病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、结核病、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒和巨细胞病毒。
在另一方面，本公开了治疗受试者中的癌症的方法，包括以有效治疗受试者中的癌症的量向受试者施用本文任何方面和实施方案的工程化去核细胞。在一些实施方案中，癌症包括低的MHC I类呈递。在一些实施方案中，癌症包括PD-1响应性肿瘤。在一些实施方案中，癌症包括具有高突变负荷的肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、肝细胞癌、黑素瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症包括淋巴瘤，并且淋巴瘤选自何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，包括以有效治疗受试者中的传染病的量向所述受试者施用本文任何方面和实施方案的工程化去核细胞。在一些实施方案中，传染病是由病毒感染引起的。在一些实施方案中，病毒感染的特征在于MHC I呈递的下调。在一些实施方案中，病毒感染由选自下组的病毒引起：腺病毒、埃巴病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、结核病、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒和巨细胞病毒。
在另一方面，本公开提供了经工程化改造以刺激免疫细胞的去核红系细胞，其中所述免疫细胞是杀伤细胞，其在所述工程化去核细胞的表面上包含两种或更多种外源刺激性多肽，其中所述两种或更多种外源刺激物多肽足以刺激免疫细胞，所述去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将两种或更多种各自编码外源刺激性多肽之一的外源核酸引入有核红系细胞中；并且在适合于去核有核红系细胞和适合于产生两种或更多种外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本公开提供了工程化去核红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接以形成IL-15/IL-15RA融合物的IL-15多肽或其片段，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将编码IL-15/IL-15RA融合物的外源核酸引入有核红系细胞中，并且在适合于去核有核红系细胞和适合于产生IL-15/IL-15RA融合物的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本公开提供了工程化去核红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接以形成IL-15/IL-15RA融合物的IL-15多肽或其片段；以及第二外源刺激性多肽，其中所述第二外源刺激性多肽包含4-1BBL或其片段，其中所述细胞通过包含以下项的方法产生，i.将编码第一外源刺激性多肽的第一外源核酸引入有核红系细胞中；ii.将编码第二外源刺激性多肽的第二外源核酸引入有核红系细胞中；iii.在适合于去核有核红系细胞并产生第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本公开提供了工程化去核红系细胞，其包括：i.第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接以形成IL-15/IL-15RA融合物的IL-15多肽或其片段；ii.第二外源刺激性多肽，其中所述第二外源刺激性多肽包含IL-12或其片段，其中所述细胞通过包含以下项的方法产生：i.将编码第一外源刺激性多肽的第一外源核酸引入有核红系细胞中；ii.将编码第二外源刺激性多肽的第二外源核酸引入有核红系细胞中；iii.在适合于去核有核红系细胞并产生第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本发明提供了工程化去核红系细胞，其包含：i.第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含4-1BBL或其片段；ii.第二种外源刺激性多肽，其中所述第二种外源刺激性多肽包含IL-12或其片段，其中所述细胞通过包含以下项的方法产生：i.将编码第一外源刺激性多肽的第一外源核酸引入有核红系细胞中；ii.将编码第二外源刺激性多肽的第二外源核酸引入有核红系细胞中；iii.在适合于去核有核红系细胞并产生第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，引入步骤包括用包含第一外源核酸和第二外源核酸两者的单个慢病毒载体转染有核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，引入步骤包括用包含第一外源核酸的第一慢病毒载体和包含第二外源核酸的第二慢病毒载体两者转染有核红系细胞。
在另一方面，本公开提供了工程化去核红系细胞，其在工程化去核细胞表面上包含至少一种选自下组的外源刺激性多肽：IL-15/IL-15RA融合物，MHC I类链相关蛋白A(MICA)，MHC I类链相关蛋白B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将编码至少一种外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；并且在适合于去核有核红系细胞和适合于产生至少一种外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，外源核酸包含DNA。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，外源核酸包含RNA。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，引入步骤包括病毒转导。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，引入步骤包括电穿孔。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，引入步骤包括利用以下中的一种或多种：脂质体介导的转移，基于腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，逆转录病毒的载体，脂质转染和慢病毒载体。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，引入步骤包括通过慢病毒载体的转染来引入外源核酸。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，慢病毒载体包含选自下组的启动子：β-球蛋白启动子，鼠干细胞病毒(MSCV)启动子，长臂猿白血病病毒(GALV)启动子，人延伸因子1alpha(EF1alpha)启动子，CAG CMV立即早期增强子和鸡β-肌动蛋白(CAG)和人磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
附图简述
图1A的图显示工程化改造为表达IL-15变体v3、v4和v5的红系细胞当与外周血单个核细胞(PBMC)一起培养并且未经刺激时诱导CD8+细胞总数增加。将来自3个供体的100,000个PBMC与300,000个工程化红系细胞一起培养。不与工程化红系细胞(无RBC)一起培养的PBMC和仅与在其表面上表达HA表位标签的红细胞一起培养的PBMC用作阴性对照。与可溶性IL-15比较使用与重组人IL-15(rh IL-15)一起培养的PBMC。在第5天计数CD8+细胞的总数。图1A中显示的结果代表4个独立实验，每个实验具有2-3个PBMC供体(总共测试6个不同的PBMC供体)。
图1B的图显示工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体v3、v4和v5的红系细胞当与外周血单个核细胞(PBMC)一起培养并用抗CD3抗体(aCD3)刺激时诱导CD8+细胞总数增加。将来自3个供体的100,000个PBMC与0.5μg/mL aCD3加300,000或100,000个工程化红系细胞一起培养。图1B中显示的图中的两个条形图代表使用的300,000(左)或100,000(右)个工程化红系细胞。不与工程化红系细胞(无RBC)一起培养的PBMC和与仅在其表面上表达HA表位标签的红细胞一起培养的PBMC用作阴性对照。与重组人IL-15(rh IL-15)一起培养的PBMC用作阳性对照。在第5天计数CD8+细胞的总数。图1B中显示的结果代表4个独立的实验，每个实验具有2-3个PBMC供体(总共测试6个不同的PBMC供体)。
图2A是一组图(i、ii和iii)，其显示经工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体v3、v4和v5的红系细胞在与纯化的NK细胞一起培养时可扩充NK细胞。(i)将来自一位供体的40,000个纯化的NK细胞一式两份铺板并以如下的滴定培养7天：工程化红系细胞(900,000、300,000、100,000)，rhIL-2(1000、100、10U/mL)，rhIL-15(10、1、0.1ng/mL)。不与工程化红系细胞(无RBC)一起培养的PBMC和与仅在其表面上表达HA表位标签的红细胞一起培养的PBMC用作阴性对照。在第7天进行分析。在图2A(ii)中，将NK细胞与900,000个工程化红细胞一起培养，并使用在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。在图2A(iii)中，将NK细胞与300,000个工程化红细胞一起培养，并使用在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。
图2B是一组图(i、ii和iii)，显示经工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体v3、v4和v5的红系细胞在与PBMC一起培养时可扩充NK细胞。在图2B(i)中，将来自两个供体的100,000个PBMC(一式两份铺板)与900,000、300,000或100,000个工程化红系细胞一起培养。不与工程化红系细胞(无RBC)一起培养的PBMC和与仅在其表面上表达HA表位标签的红细胞一起培养的PBMC用作阴性对照。在第7天进行流式细胞术分析，对活/死CD56+CD3-细胞进行门控。在图2B(ii)中将PBMC与900,000个工程化红细胞一起培养，并使用在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。在图2B(iii)中将PBMC细胞与300,000个工程化红细胞一起培养，并使用在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。
图3A是显示离体实验结果的图，其中离体观察到有效的NK细胞扩充。
图3B是显示体内实验结果的图，其中在用与IL-15/IL-15RA重组蛋白缀合的红系细胞(mRBC)处理的小鼠中观察到有效的淋巴细胞增殖。显示了如由作为增殖细胞标志物的百分比Ki67染色确定的NK细胞增殖。
图3C是显示体内实验结果的图，其中在用与IL-15/IL-15RA重组蛋白缀合的红系细胞(mRBC)处理的小鼠中观察到有效的淋巴细胞活化。显示了由作为活化细胞的标志物的粒酶B表达百分比确定的NK细胞活化。
图4A的图显示在工程化红系细胞表面上以其天然三聚体构象表达4-1BBL驱动高度有效的T细胞活化，如由在表达高水平的4-1BB受体以及NFκB/Luc的Jurkat细胞中的NFκB活化测量。
图4B的图显示通过表达4-1BBL的工程化红系细胞对NFκB的活化是可调节。
图5A的图显示工程化红系细胞表面上以其天然三聚体构象表达41BBL驱动高度有效的T细胞活化，如通过原代CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化来测量。
图5B的图显示工程化红系细胞表面上以其天然三聚体构象表达41BBL驱动高度有效的T细胞活化，如由通过ELISA测量的IFNγ和TNFα分泌测量。
图6是显示表达4-1BBL的红系细胞抑制MC38肿瘤模型中的肿瘤生长的图。
图7的图显示表达4-1BBL和IL-15/IL-15RA两者的工程化红系细胞有效在有或没有CD3刺激的情况下活化脾细胞。
图8的图显示与各200,000个细胞的200,000个表达4-1BB-L，IL-15/IL-15RA或4-1BBL和IL-15/IL-15RA两者的混合物的工程化红系细胞一起温育的NK细胞对K562人慢性骨髓性白血病(CML)细胞的体外杀伤。
图9的图显示通过制备为表达4-1BBL的鼠红系细胞对CD8+T细胞和子集(增殖的CD8+记忆细胞；CD8+效应记忆细胞，粒酶B+CD8细胞)的体内增殖。
图10的图显示与抗4-1BB mAb 3H3相比，制备成表达4-1BBL的鼠红系细胞在小鼠中不引起肝毒性。测量丙氨酸转氨酶(ALT；SGPT)和天冬氨酸转氨酶(AST；SGOT)的水平。
图11的图显示在工程化红系细胞细胞表面上IL-15/IL-15RA和4-1BBL一起表达以及工程化红系细胞的表面上单独4-1BBL的表达导致高度有效的T细胞活化，如通过Jurkat细胞中NFκB激活所测量。
图12的图显示了与表达单独的4-1BBL或IL-15/IL-15RA的工程化红系细胞相比，工程化红系细胞表面上IL-15/IL-15RA和4-1BBL的表达有效扩充CD8+T细胞，NK细胞和这些细胞的子集。
图13A和图13C的图显示制备为在红系细胞表面上一起呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞在鼠B16F10肺转移模型中的功效。
图13B的图显示在鼠B16F10肺转移模型中用制备为在红系细胞表面上一起呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞处理的小鼠肺中的NK细胞浸润。
图13D的图显示在鼠B16F10肺转移模型中用制备为在红系细胞表面上一起呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞处理的小鼠肿瘤中总NK细胞计数的增加。
图13E的图显示在鼠B16F10肺转移模型中用制备为在红系细胞表面上一起呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞处理的小鼠肿瘤中成熟NK细胞计数的增加。
图13F的图显示在鼠B16F10肺转移模型中用制备为在红系细胞表面上一起呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞处理的小鼠肿瘤中功能性NK细胞计数的增加。
图14是一组图，其显示了用表达IL-15/IL-15RA(v4)，4-1BBL或共表达IL-15/IL-15RA和4-1BBL(“co”)的红系细胞长期引发(8天)后对PBMC的表型分析。标志物Ki67、粒酶B、TRAIL、CD69、NKp44和41BB用作表型读数，以显示增强的NK细胞存活、扩充和活化。
图15的图显示用表达IL-15/IL-15RA(“IL-15TP”)或共表达IL-15/IL-15RA和41BBL(“IL-15TP+41BBL”)的红系细胞引发8天的NK细胞具有增强的针对K562靶物的细胞毒性。显示了K562细胞的杀伤百分比。
图16的图显示用表达IL-15/IL-15RA(“IL-15v4”)或共表达IL-15/IL-15RA和41BBL(“Co”)的红系细胞引发过夜的NK细胞具有增强的针对Raji人B淋巴细胞靶细胞的ADCC杀伤。显示了Raji细胞的特异性杀伤百分比。
图17A的图显示制备为在红系细胞表面上一起呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞在CT26结肠癌鼠模型中的功效。
图17B是一组2幅图，其显示了在CT26结肠癌小鼠模型中，增殖的(左)和功能性的(右)细胞毒性CD8T细胞浸润入用鼠红系细胞处理的小鼠的肿瘤中，所述鼠红系细胞制备为在红系细胞表面上一起呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL。
图18A-图18E是组图，显示制备成呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞与抗4-1BB mAb 3H3相反不在小鼠中引起肝毒性。测量血清中肝酶丙氨酸转氨酶(ALT/SGPT)(图18A)，肝巨噬细胞(图18B)，肝CD8+/Eomes+/KLRG1+细胞(图18C)和肝浸润T细胞(CD8+T细胞)(图18D)的水平。还测定肝染色和炎症评分(图18E)。图18F是一组图，其显示与可溶性IL-15相反，制备为呈现IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞不引起小鼠肝毒性。
图19是一组图，其显示工程化红系细胞的表面上IL-12和IL-15/IL-15RA的表达协同诱导INFg分泌，如通过ELISA测量的(图19A)，并经由CD8(图19B)，CD4(图19C)，NK(图19D)和NKT(图19E)细胞的增殖驱动高度有效的免疫应答。
图20A的图显示使用点击化学与IL-12，IL-15/IL-15RA，4-1BBL缀合或与IL-12和IL-15/IL-15RA,IL-12和4-1BBL,和IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者共缀合的鼠红系细胞的百分比。通过针对Cy5荧光的流式细胞术量化这些细胞。
图20B的图显示在鼠B16F10肺转移模型中，制备为在红系细胞表面上呈现IL-12，IL-15/IL-15RA，4-1BBL及其组合的鼠红系细胞的功效。
图20C是一组图，其显示制备为呈现IL-12，IL-15/IL-15RA，4-1BBL及其组合的鼠红系细胞处理的小鼠中，肺转移数目的减少与肺中增加的增殖和细胞毒性CD8 T细胞和NK细胞的浸润有关。
图21是一组图，显示包含IL-12的红系细胞在MC38(图21A)和B16F10(图21B)小鼠模型中抑制肿瘤生长。
图22是一组图，显示与重组IL-12(rIL-12)相反，制备为呈现IL-12和IL-15/IL-15RA，和IL-12和4-1BBL的鼠红系细胞不引起小鼠中的肝毒性。测量血清中肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)(图22A)，血清中干扰素gamma(IFNg)(图22B)，肝重量(图22C)和脾脏重量(图22D)的水平。
图23A的图显示单独或与抗PD1抗体组合的制备为呈现IL-12的鼠红系细胞抑制B16F10小鼠模型中的肿瘤生长。
图23B的图显示制备为呈现IL-12，IL-15/IL-15RA或其组合的鼠红系细胞抑制B16F10小鼠模型中的肿瘤生长。
图23C的图显示单独或与抗PD1抗体组合的制备为呈现IL-12/IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞抑制B16F10小鼠模型中的肿瘤生长。
图23D的图显示单独或与抗PD1抗体组合的制备为呈现IL-12的鼠红系细胞在B16F10小鼠模型中改善治疗小鼠的存活。
图23E的图显示单独或与抗PD1抗体组合的制备为呈现IL-12/IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞在B16F10小鼠模型中改善处理的小鼠的存活。
图23F的图显示在用IL-12/IL-15+a-PD1组处理的肿瘤中CD8 T细胞浸润增加，在IL-15/IL-15RA mRBC组中NK细胞浸润增加和在含有IL-12的组中增加的巨噬细胞向M1表型极化，即经典活化的巨噬细胞的抗肿瘤表型。
图24A的图显示单独或与抗PD1抗体组合用1e9个制备为呈现IL-12或IL-12/4-1BBL的鼠红系细胞处理在MC38小鼠模型中抑制肿瘤生长。
图24B的图显示单独或与抗PD1抗体组合用3e8个制备为呈现IL-12或IL-12/4-1BBL的鼠红系细胞处理在MC38小鼠模型中抑制肿瘤生长。
图24C的图显示单独或与抗PD1抗体组合的制备为呈现IL-12或IL-12/4-1BBL的鼠红系细胞在MC38小鼠模型中抑制肿瘤生长。数据代表研究中使用的个别小鼠。
图24D的图显示单独或与抗PD1抗体组合的制备为呈现IL-12或IL-12/4-1BBL的鼠红系细胞在MC38小鼠模型中诱导肿瘤缩小。数据代表研究中使用的个别小鼠。
图25A的图显示在MC38小鼠模型中，单独或与抗PD1抗体组合用制备为呈现IL-12或IL-12/4-1BBL的鼠红系细胞处理的肿瘤中CD4，CD8 T细胞的浸润增加以及对经典活化的巨噬细胞(M1表型)的极化增加。
图25B的图显示在MC38小鼠模型中，单独或与抗PD1抗体组合用制备为呈现IL-12或IL-12/4-1BBL的鼠红系细胞处理的肿瘤中相对于CD4 T细胞转向更多CD8 T细胞，以及调节性T细胞的损失。
图26A-图26D是组图，显示了与重组IL-12(rIL-12)相反，制备为呈现IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-12和4-1BBL的鼠红系细胞不在小鼠中引起毒性。测量体重(图26A)，肝重量(图26B)，脾脏重量(图26C)，WBC计数和血红蛋白水平(图26D)的变化。
图26E–图26F是组图，显示与重组IL-12(rIL-12)相反，缀合以呈现IL-12的鼠红系细胞在小鼠中不引起毒性。测量体重(图26E)，肝重量，脾脏重量，WBC，RBC计数和血红蛋白，ALT和IFNg水平(图26F)的变化。
图27是一组图，显示与重组IL-12(rIL-12)相反，制备为呈现IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-12和4-1BBL的鼠红系细胞不在小鼠中引起毒性。测量酶IFNg(图27A)，TNFa(图27B)水平的变化，并与肝酶ALT的水平进行比较。
图28是一组图，其显示了遗传工程化改造以表达IL-12，IL-15/IL-15RA，4-1BBL或其组合的人红系细胞通过增强的对K562靶物的杀伤(图28A)，和增强的对Raji细胞靶物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤(图28B)诱导NK细胞毒性。
图29A的图显示与抗CD3组合的包含IL-12的人去核工程化红系细胞诱导从PBMC产生大量IFNg，并且IL-12/4-1BBL诱导最高水平的IFNg。
图29B的图显示包含IL-12的人去核工程化红系细胞在没有抗CD3的情况下诱导从PBMC产生IFNg。
图29C的图显示与抗CD3组合的表达41BBL，IL-12/4-1BBL或IL-15/IL-15RA/4-1BBL的人工程化红系细胞诱导CD4细胞增殖。
图29D的图显示与抗CD3组合的表达IL-12/IL-15/IL-15RA，IL-12/4-1BBL或IL-15/IL-15RA/4-1BBL的人工程化红系细胞适度增强CD8细胞增殖。
图29E的图显示与抗CD3组合的表达IL-12/4-1BBL或IL-15/IL-15RA/4-1BBL的人工程化红系细胞诱导显著的NKT细胞增殖。
图29F的图显示在没有抗CD3的情况下表达IL-12/IL-15/IL-15RA的人工程化红系细胞诱导有限的CD4细胞增殖。
图29G的图显示表达IL-12/IL-15/IL-15RA，IL-12/4-1BBL或IL-15/IL-15RA/4-1BBL的人工程化红系细胞在没有抗CD3的情况下适度增强CD8细胞增殖。
图29H的图显示表达IL-12/IL-15/IL-15RA的人工程化红系细胞在没有抗CD3的情况下增强NK细胞的分裂，但不增加细胞计数，指示仅适度的NK细胞增殖。IL-12/4-1BBL和IL-15/4-1BBL诱导广泛的NK细胞增殖，用IL-12/4-1BBL导致细胞数量大大增加，并超过IL-15/IL-15RA/4-1BBL的效果。
图29I的图显示表达IL-12/IL-15/IL-15RA，IL-12/4-1BBL或IL-15/IL-15RA/4-1BBL的人工程化红系细胞在没有抗CD3的情况下对NKT细胞诱导适度的增殖影响。
图29J的图显示表达IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL或共表达IL-12/IL-15/IL-15RA、IL-12/4-1BBL和IL-15/IL-15RA/4-1BBL的RBC能够驱动人幼稚CD4细胞的Th1分化。
图30A的图显示单独或与4-1BBL组合，相对于IL-12 V1(与GPA连接的IL-12)，观察到IL-12 V2(与SMIM1连接的IL-12)在细胞表面处表现出显著更大的IL-12。
图30B的图显示当SMIM1用作膜域时，细胞表面上升高的IL-12水平提供增强的NFκB信号传导活性。
发明详述
本公开基于红系细胞的开发，所述红系细胞已经通过在红系细胞的细胞表面上表达一种或多种足以活化和/或扩充NK细胞和/或CD8+T细胞的外源刺激性多肽如刺激性细胞因子来工程化改造以刺激免疫杀伤细胞(例如，刺激NK细胞和/或CD8+T细胞的扩充、活化和/或细胞毒性活性)。在一些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含IL-12，IL-15/IL-15RA，4-1BBL或其组合，例如4-1BBL和IL-15/IL-15RA，4-1BBL和IL-12或IL-12和IL-15/IL-15RA，已发现它们驱动CD4+、CD8+和NK细胞的有效活化，并诱导NK细胞的细胞毒性。根据本公开的实施方案，工程化红系细胞是有核细胞或去核细胞。与目前的免疫杀伤细胞靶向技术相比，本文提供的工程化红系细胞提供了明显的优势，即天然免疫特许的并且直接在体内介导免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)的刺激，因此避免了与免疫杀伤细胞的过继细胞转移相关的缺点。工程化红系细胞提供了额外的优势，即在单一去核细胞上呈现，例如在细胞表面上包含几种不同刺激分子，且以相当高的数目呈现，例如4-1BBL和IL-12，4-1BBL和IL-15/IL-15RA，或IL-12和IL-15/IL-15RA，以及在整个循环系统中并且以长循环半衰期通过红系细胞直接递送和维持刺激信号，因此提供了更安全且更有效的用于刺激免疫杀伤细胞的方法。
受益于前述说明书和相关附图中呈现的教导，这些发明所属领域的技术人员容易想到本文阐述的本发明的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，并且修改和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文使用了特定术语，但是它们仅在一般和描述性意义上使用，而不是出于限制的目的。
定义
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数引用，除非内容另外明确指出。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案之一，两者或它们的任何组合。
如本文所用，术语“约”在指代诸如量，时间持续时间等的可测量值时，意图涵盖与规定数值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，还更优选±0.1％的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。
如本文所用，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。
如本文所用，“包括”和“包含”旨在与“含有”同义。并且是包含性或开放性的术语，其用于指定后续内容，例如“组件”的存在，并不排除或阻止本领域已知的或其中公开的其他未叙述的组件、特征、元件、成员、步骤的存在。
如本文所用，术语“诸如”，“例如”等旨在指代示例性实施方案，而不限制本公开的范围。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料来测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。
如本文所用，术语“活化CD8+T细胞”或“CD8+T细胞活化”是指引起或导致CD8+T细胞(CTL)的一种或多种细胞应答的过程(例如，信号传导事件)，所述细胞应答选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。如本文所用，“活化的CD8+T细胞”是指已接收活化信号并因此表明选自下组的一种或多种细胞应答的CD8+T细胞：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。用于测量CD8+T细胞活化的合适测定法是本领域已知的并且在本文中进行了描述。
如本文所用，术语“扩充CD8+T细胞”或“CD8+T细胞扩充”是指其中CD8+T细胞经历一系列细胞分裂，从而扩充细胞数目的过程。术语“扩充的CD8+T细胞”指通过CD8+T细胞扩充获得的CD8+T细胞。测量T细胞扩充的合适测定法是本领域已知的并且在本文中描述。
如本文所用，术语“活化NK细胞”或“NK细胞活化”是指引起或导致NK细胞能够杀死具有MHC I类表达缺陷的细胞的过程(例如，信号传导事件)。如本文所用，“活化的NK细胞”是指已接收到活化信号并因此能够杀死MHC I类表达缺陷的细胞的NK细胞。用于测量NK细胞活化的合适测定法是本领域已知的并且在本文中进行了描述。
如本文所用，术语“扩充NK细胞”或“NK细胞扩充”是指其中NK细胞经历一系列细胞分裂并由此扩充细胞数目的过程。术语“扩充的NK细胞”指通过NK细胞扩充获得的NK细胞。用于测量NK细胞扩充的合适测定法是本领域已知的并且在本文中描述。
如本文所用，“施用”及其变体是指将组合物或试剂引入受试者，并且包括同时或顺序引入组合物或试剂。“施用”可以指例如治疗、药动学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。“施用”还包括体外和离体治疗。通过任何合适的途径将组合物或试剂引入受试者，所述途径包括口服、肺、鼻内、胃肠外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内或局部。施用包括自我施用和他人施用。可以通过任何合适的途径进行施用。合适的施用途径允许组合物或试剂实施其预期功能。例如，若合适的途径是静脉内，则通过将组合物或试剂引入受试者的静脉中来施用组合物。
如本文所用，术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
如本文所用，术语“癌症”是指其中异常细胞不受控制地分裂的疾病。在一些实施方案中，癌症能够侵入其他组织。有100多种不同类型的癌症。大多数癌症都以其开始的器官或细胞类型来命名——例如，从结肠开始的癌症称为结肠癌；从皮肤黑素细胞开始的癌症称为黑素瘤。癌症类型可以分为更广泛的类别。癌症的主要类别包括：癌瘤(carcinoma)(意指始于皮肤或作为内部器官衬里或者覆盖内部器官的组织中的癌症及其亚型，包括腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)；肉瘤(意指始于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症)；白血病(意指从血液形成组织(例如骨髓)开始并导致大量异常血细胞产生并进入血液的癌症；淋巴瘤和骨髓瘤(意指从免疫系统细胞开始的癌症)；以及中枢神经系统(CNS)癌症(指始于脑和脊髓组织的癌症)。“骨髓增生异常综合症”是指其中骨髓不产生足够的健康血细胞(白细胞、红细胞和血小板)，并且血液和/或骨髓中存在异常细胞的癌症类型。骨髓增生异常综合症可成为急性髓样白血病(AML)。在某些实施方案中，癌症选自癌症，所述癌症包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑瘤、乳腺癌、原发性未知癌、癌症扩散到骨、癌症扩散到脑、癌症扩散到肝、癌症扩散到肺、类癌、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨样白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、妊娠滋养层肿瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、何杰金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、皮肤癌、间皮瘤、男性癌、葡萄胎妊娠、口腔或口咽癌，骨髓瘤、鼻和鼻窦癌、鼻咽癌、非何杰金淋巴瘤(NHL)、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌、直肠癌、唾液腺癌、继发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、未知原发性癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
如本文所用，术语“点击反应”是指用于共价连接第一和第二部分以方便产生连接产物的反应范围。它通常具有以下一个或多个特征：它是快速的，特异性的，高产率的，有效的，自发的，不显著改变连接实体的生物相容性，具有高反应速率，产生稳定的产物，有利于单一反应产物的生产，具有高原子经济性，是化学选择性的，模块的，立体选择性的，对氧不敏感的，对水不敏感的，高纯度的，仅生成无害或相对无毒的副产物，其可以通过非层析法(例如结晶或蒸馏)去除，不需要溶剂或可以在生理条件下良性或生理相容性(例如水)，稳定的溶剂中进行。实例包括炔/叠氮化物反应，二烯/亲双烯体反应或硫醇/烯反应。可以使用其他反应。在一些实施方案中，点击反应是快速，特异性和高产率的。
如本文所用，术语“点击柄”是指能够在点击反应中与第二点击柄反应以产生点击签名的化学部分。在实施方案中，偶联试剂包含点击柄，并且偶联试剂还可以包含底物反应性部分。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由细胞分泌的对其他细胞具有多种作用的小的可溶性蛋白质物质。细胞因子介导许多重要的生理功能，包括生长、发育、伤口愈合和免疫反应。它们通过与位于细胞膜中的其细胞特异性受体结合而起作用，这允许独特的信号转导级联在细胞中开始，最终将导致靶细胞的生化和表型改变。细胞因子可以在局部和远离释放部位起作用。它们包括I型细胞因子，其包括许多白介素以及几种造血生长因子；II型细胞因子，包括干扰素和白介素10；肿瘤坏死因子(“TNF”)相关分子，包括TNFα和淋巴毒素；免疫球蛋白超家族成员，包括白介素1(“IL-1”)；以及趋化因子，一种在极其多种免疫和炎症功能中起关键作用的分子家族。取决于细胞状态，相同的细胞因子对细胞可具有不同的作用。细胞因子经常调节其他细胞因子的表达并触发其级联。细胞因子的非限制性实例包括例如IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12/IL-23P40,IL13,IL-15,IL-15/IL-15-RA,IL-17,IL-18,IL-21,IL-23,TGF-β,IFNγ,GM-CSF,Groα,MCP-1和TNF-α。
如本文所用，术语“内源”是指化合物(例如，小分子)或过程的天然形式。例如，在一些实施方案中，术语“内源”是指在生物体或生物体基因组中其天然位置的核酸或多肽的天然形式。
如本文所用，术语“工程化细胞”是指遗传修饰的细胞或其后代。在一些实施方案中，工程化细胞(例如工程化去核细胞)可以使用偶联试剂将外源多肽连接至细胞表面来产生(例如使用点击化学)。
如本文所用，术语“去核的”是指缺乏细胞核的细胞，例如网织红细胞或成熟的红细胞(红细胞)。在一个实施方案中，去核细胞是通过从前体细胞，例如造血干细胞(例如CD34+细胞)，普通髓样祖细胞(common myeloid progenitor，CMP)，巨核细胞红细胞祖细胞(MEP)，爆发形成单位红细胞(BFU-E)，集落形成单位红细胞(CFU-E)，原红细胞，早期嗜碱性成红血细胞，晚期嗜碱性成红血细胞，多染性成红细胞或正嗜染性成红血细胞，或诱导的多能细胞分化成网织红细胞或成熟红细胞而丧失其细胞核的细胞。在一个实施方案中，去核细胞是通过从前体细胞，例如造血干细胞(例如CD34+细胞)，普通髓样祖细胞(CMP)，巨核细胞红细胞祖细胞(MEP)，爆发形成单位红细胞(BFU-E)，集落形成单位红细胞(CFU-E)，原红细胞，早期嗜碱性成红血细胞，晚期嗜碱性成红血细胞，多染性成红细胞或正嗜染性成红血细胞，或诱导的多能细胞体外分化成网织红细胞或成熟的红细胞而丧失其细胞核的细胞。在一个实施方案中，去核细胞缺乏DNA。在一个实施方案中，去核细胞不能表达多肽，例如不能将DNA转录和/或翻译成蛋白质，例如缺乏将DNA转录和/或翻译成蛋白质所必需的细胞机制。在一些实施方案中，去核细胞是红细胞、网织红细胞或血小板。
在一些实施方案中，去核细胞不是血小板，因此是“无血小板去核”细胞(“PFE”细胞)。应当理解，血小板不具有核，并且在该具体实施方案中，血小板不旨在被涵盖。
如本文所用，“红系细胞”包括有核红细胞、红细胞前体、去核成熟红细胞和网织红细胞。如本文所用，红系细胞可以包括红系前体细胞，其能够分化为网织红细胞或红细胞。例如，红系前体细胞包括脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干细胞(HSC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、普通髓样祖细胞(CMP)、胚细胞集落形成细胞、爆发形成单位红系(BFU-E)、巨核细胞-红系祖细胞(MEP)、红系集落形成单位(CFU-E)、网织红细胞、红细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、多色性正成红细胞，正染色正成红细胞的任一种。红系细胞的制剂可以包括这些细胞中的任一种或其组合。在一些实施方案中，红系前体细胞是永生或永生化的细胞。例如，可以通过逆转录病毒转导CD34+造血祖细胞以表达Oct4，Sox2，Klf4，cMyc并抑制TP53来产生永生化的成红血细胞细胞(例如，如Huang et al.,(2014)Mol.Ther.22(2):451-63中描述，其全部内容通过引用并入本文)。另外，细胞可以意图用于自体使用或提供异基因输血的来源。在一些实施方案中，培养红系细胞。在一个实施方案中，红系细胞是去核红细胞。
如本文所用，当在核酸的上下文中使用时，术语“外源”包括转基因和重组核酸。
如本文所用，术语“外源核酸”是指不是细胞天然的而是被引入细胞或细胞祖细胞中的核酸(例如，基因)。外源核酸可以包括与细胞天然的内源核酸同源或相同的区域或开放阅读框(例如，基因)。在一些实施方案中，外源核酸包含RNA。在一些实施方案中，外源核酸包含DNA。在一些实施方案中，外源核酸被整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，外源核酸通过细胞机器加工以产生外源多肽。在一些实施方案中，外源核酸不被细胞或不被作为引入有外源核酸的细胞的后代的细胞保留。
如本文所用，术语“外源多肽”是指不由该类型的野生型细胞产生，或者以比包含该外源多肽的细胞中更低的水平存在于野生型细胞中的多肽。在一些实施方案中，外源多肽是指被引入细胞内或细胞上，或通过将编码外源多肽的外源核酸引入细胞或细胞祖细胞而被细胞表达的多肽。在一些实施方案中，外源多肽是由引入细胞或细胞祖细胞中的外源核酸编码的多肽，该核酸任选地不被细胞保留。在一些实施方案中，外源多肽是通过化学或酶促手段缀合至细胞表面的多肽。
如本文所用，术语“外源刺激性多肽”包括由工程化红系细胞(例如，在细胞内或在细胞表面)包含的多肽，其特异性结合免疫细胞例如免疫杀伤细胞(例如NK细胞或CD8+T细胞)上的关联多肽(例如受体)，从而提供介导免疫细胞刺激，例如免疫细胞的增殖、活化、扩充等的信号。在一些实施方案中，一种或多种外源刺激性多肽足以离体或体内刺激免疫杀伤细胞。示例性的外源刺激性多肽在下面更详细地描述。
如本文所用，术语“表达”指产生多肽的过程，包括转录和翻译。表达可以例如通过多种方法来增加，包括：增加编码多肽的基因的数目，增加基因的转录(例如通过将基因置于组成型启动子的控制下)，增加基因的翻译，敲除竞争性基因或这些和/或其他方法的组合。
如本文所用，关于外源刺激性多肽，术语“第一”，“第二”和“第三”等用于方便区分何时存在一种以上类型的外源刺激性多肽。除非明确指出，否则使用这些术语无意赋予外源刺激性多肽特定的顺序或方向。
如本文所用，术语“片段”是指至少6个(连续的)核酸或至少4个(连续的)氨基酸的序列，该长度足以在核酸的情况下允许特异性杂交或在氨基酸的情况下特异性识别表位，并且最多是比全长序列少的一些部分。片段可以源自所选择的核酸或氨基酸序列的任何连续部分。
如本文所用，术语“基因”广泛地用于指与给定RNA或蛋白质的表达相关的核酸的任何区段。因此，基因包括编码表达的RNA的区域(其通常包括多肽编码序列)，并且常常包括其表达所需的调控序列。基因可以从多种来源获得，包括从目标来源进行克隆或从已知或预测的序列信息进行合成，并且可以包括设计成具有特定期望参数的序列。
如本文所用，术语“IL-15RA的胞外部分”是指IL-15RA多肽的部分，其在IL-15RA的跨膜域的氨基末端，并且存在于细胞的外表面上。IL-15RA的胞外部分可以包括IL-15RA信号肽。在某些实施方案中，IL-15RA的胞外部分由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
如本文所用，术语“IL-15RA的Sushi域”是指在包含四个半胱氨酸残基的成熟IL-15RA多肽的氨基末端的约60个氨基酸残基的区域。第一半胱氨酸残基与第三半胱氨酸形成二硫键，并且第二半胱氨酸与第四半胱氨酸形成二硫桥。IL-15RA的Sushi域参与IL-15的结合。在某些实施方案中，IL-15RA的Sushi域由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
如本文所用，术语“低MHC I呈递”是指细胞(例如肿瘤细胞)表面处的MHC I分子水平降低(例如，通过表达下调)。
如本文所用，术语“核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA和自我复制质粒，载体，mRNA，tRNA，siRNA等，它们可以是重组的，并且当将核酸引入细胞中时可以从它们表达外源多肽。
本文中使用以下术语来描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质同一性”。(a)术语“参考序列”是指用作序列比较基础的序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列的片段。(b)术语“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续且规定的片段，其中可以将多核苷酸序列与参考序列进行比较，并且其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸序列的一部分可以包含添加或删除(即缺口)。通常，比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，并且可以任选地长度可以为至少30个连续核苷酸，长度为至少40个连续核苷酸，长度为至少50个连续核苷酸，长度为至少100个连续核苷酸，或更长。本领域技术人员理解，为避免由于多核苷酸序列中包含缺口而导致与参考序列的高度相似性，通常引入缺口罚分并从匹配数中减去。用于比较的序列的比对方法是本领域公知的。可以通过Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needlemanand Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性寻找方法；通过这些算法的计算机化实现方式进行序列最佳比对以进行比较，所述计算机化实现方式包括但不限于：Intelligenetics,Mountain View,Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL；WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.,USA中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA；CLUSTAL程序完全由Higginsand Sharp,Gene 73:237-244(1988)；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)；Corpet,et al.,Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988)；Huang,et al.,ComputerApplications in the Biosciences,8:155-65(1992),和Pearson,et al.,Methods inMolecular Biology,24:307-331(1994)描述。BLAST程序家族(其可用于数据库相似性搜索)包括：BLASTN，用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTX，用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列；BLASTP，用于针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列；TBLASTN，用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列；和TBLASTX，用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列。参见Current Protocols in Molecular Biology,第19章,Ausubel,et al.编,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用BLAST 2.0程序组使用默认参数获得的值。Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)。用于进行BLAST分析的软件是可公开获得的，例如通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology-Information)。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度W的短单词来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短单词在与数据库序列中相同长度的单词比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻近单词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻近单词命中作用为启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。然后将单词命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的罚分得分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止词命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大达到值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用词长度(W)为11，期望(E)为10，截断为100，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用词长度(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。除了计算序列一致性百分比外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。BLAST搜索假定可以将蛋白质建模为随机序列。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列的区域，其可以是均聚物束、短期重复序列或富含一种或多种氨基酸的区域。此类低复杂度区域可以在不相关的蛋白质之间进行比对，即使蛋白质的其他区域完全不相似。可以采用许多低复杂度的滤器程序来减少此类低复杂度比对。例如，可以单独或组合采用SEG(Wooten and Federhen,Comput.Chem.,17:149-163(1993))和XNU(Claverie and States,Comput.Chem.,17:191-201(1993))低复杂度滤器。(c)在两个核酸或多肽序列的上下文中，术语“序列一致性”或“一致性”在本文中用于指两个序列中当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时相同的残基。当关于蛋白质使用序列一致性百分比时，应认识到不相同的残基位置通常仅相差保守的氨基酸取代，即其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能特性。在序列在保守取代中不同的情况下，可以向上调整序列一致性百分比以针对取代的保守性质进行校正。通过此类保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行该调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守取代打分为部分错配而不是全部错配，从而增加序列一致性百分比。因此，例如，在对相同氨基酸给予1评分且对非保守取代给予零评分的情况下，对保守取代给予零和1之间的评分。例如，根据Meyersand Miller,Computer Applic.Biol.Sci.,4:11-17(1988)的算法计算保守取代的得分，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA)中所实现的。(d)本文使用的术语“序列一致性百分比”意指通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸序列的一部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以产生序列一致性的百分比来计算百分比。(e)多核苷酸序列的术语“基本一致性”意指使用所述比对程序之一使用标准参数，多核苷酸包含与参考序列相比具有至少70％序列一致性、至少80％序列一致性、至少90％序列一致性和至少95％序列一致性的序列。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应身份。为了这些目的，氨基酸序列的基本一致性通常意指至少60％或至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列一致性。核苷酸序列基本相同的另一个指示是两个分子是否在严格条件下相互杂交。然而，如果严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽是基本相同的，则它们仍然是基本相同的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性创建核酸拷贝时，可能发生这种情况。两个核酸序列基本相同的一个指示是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性。还可以通过参考遗传密码，包括考虑密码子简并性，对本发明蛋白质的核苷酸序列进行突变。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水或水/油，以及各种类型的润湿剂。该术语还涵盖任何经美国联邦政府监管机构批准或在美国药典中列出的用于动物(包括人)中的药剂，以及不对受试者造成明显刺激且不消除所施用试剂的生物学活性和特性的任何载体或稀释剂。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的此类类似物的本质性质是，当掺入蛋白质中时，该蛋白质与针对相同的但完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质引发的抗体具有特异性反应性。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的gamma-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。应当理解，公知且如上所述，多肽可以不是完全线性的。例如，多肽可以由于泛素化而分支，并且它们可以是环状的，带有或不带有分支，通常是由于翻译后事件，包括自然加工事件和不自然发生的人为操纵而导致的事件所致。环状的、分支的和分支环状的多肽也可以通过非翻译天然过程合成并且也可以通过完全合成的方法来合成。在一些实施方案中，肽具有任何长度或大小。根据一些实施方案，肽具有任何长度或大小。
如本文所用，本文中称为“重组”的多肽是指已经通过重组DNA方法学产生的多肽，包括通过依赖于人工重组方法的规程如聚合酶链式反应(PCR)和/或使用限制酶克隆到载体中而生成的多肽。
如本文所用，术语“刺激免疫细胞”或“刺激免疫细胞”是指引起或导致免疫细胞，例如杀伤免疫细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)的细胞应答，例如活化和/或扩充的过程(例如，涉及信号传导事件或刺激)。在一些实施方案中，刺激免疫细胞(例如，NK细胞和/或CD8+T细胞)是指提供导致免疫细胞活化和/或扩充的刺激或信号(例如，刺激性多肽)。
如本文所用，术语“足以刺激免疫细胞”是指促进免疫细胞的细胞应答的信号传导事件或刺激的量或水平，例如外源刺激性多肽的。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文可互换使用，并且是指期望对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人类。本文描述的方法适用于人类疗法和兽医应用两者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，并且在特定实施方案中，受试者是人类。
如本文所用，短语“有需要的受试者”是指(i)将被施用根据所述发明的工程化红系细胞(或包含工程化红系细胞的药物组合物)，(ii)正在接受根据所述发明的工程化红系细胞(或包含工程化红系细胞的药物组合物)；或(iii)已接受根据所述发明的工程化红系细胞(或包含工程化红系细胞的药物组合物)的受试者，除非该短语的上下文和用法另有说明
如本文所用，术语“阻抑(suppress)”、“降低”、“干扰”、“抑制(inhibit)”和/或“减少”(以及类似术语)通常是指直接或间接减少相对于自然、预期或平均或相对于对照状况的浓度、水平、功能、活性或行为的动作。
如本文所用，术语“阻抑免疫细胞”或“抑制免疫细胞”是指引起或导致抑制或阻抑免疫细胞的一种或多种细胞应答或活性或导致免疫细胞无反应化或诱导免疫细胞凋亡的过程(例如，信号传导事件)，所述细胞反应或活性选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。用于测量免疫细胞抑制或阻抑的合适测定法是本领域已知的并且在本文中描述。
如本文所用，活性剂(例如如本文所述的工程化红系细胞)的术语“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“药学有效量”可互换使用以指足以提供预期的治疗益处的量。然而，剂量水平基于多种因素，包括损伤的类型，患者的年龄、体重、性别、医疗状况，状况的严重程度，施用途径以及所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以广泛变化，但是可以由医师使用标准方法常规确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药物有效量”包括所述发明的组合物的防范量或预防量。在所描述的发明的防范或预防性应用中，将药物组合物或药物以下述量对易患疾病、病症或状况，或者以其他方式有患疾病、病症或状况的风险的患者施用：所述量足以消除或降低疾病、病症或状况的风险、减轻疾病、病症或状况的严重程度或延缓疾病、病症或状况的发作(包括疾病、病症或状况的生化、组织学和/或行为症状，其并发症)以及在疾病、病症或状况的发展期间出现的中间病理表型。通常优选使用最大剂量，即根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂(dose)”和“剂量(dosage)”在本文可互换使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗后果，其结果被判断是期望的且有益的。治疗效果可以包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。治疗效果还可以包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现的进展。
对于本文所述的任何治疗剂，治疗有效量可以首先从初步的体外研究和/或动物模型中确定。治疗有效剂量也可以从人类数据确定。可以基于所施用试剂的相对生物利用度和效力来调整所施加的剂量。基于上述方法和其他公知的方法来调整剂量以达到最大功效在普通技术人员的能力范围内。确定治疗有效性的一般原理总结如下，其可以在Goodmanand Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill(NewYork)(2001)的第1章(通过引用并入本文)中找到。
药动学原理提供了改变剂量方案以获得所需程度的治疗功效且具有最小的不可接受的副作用的基础。在可以测量药物血浆浓度并与治疗窗口相关的情况下，可以获得剂量修改的其他指导。
若药物产品含有相同的活性成分，并且在强度或浓度、剂型和施用途径方面相同，则它们被视为药物等效物。当两种产品中活性成分的生物利用度的速率和程度在适当的测试条件下没有显著差异时，则认为两种药学上等效的药物产品是生物等效的。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转状况的进展，基本上改善状况的临床症状或基本上防止状况的临床症状的出现，获得有益或期望的临床结果。治疗进一步指完成以下一项或多项：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗病症特征性症状的发展；(c)限制所治疗的病症特征性症状的恶化；(d)限制先前患有病症的患者中该病症的复发；以及(e)限制以前对病症无症状的患者中症状的复发。
有益或期望的临床结果，如药理和/或生理作用，包括但不限于在可能易感疾病、病症或状况但尚未经历或表现出该疾病的症状的受试者中预防该疾病、病症或状况发生(防范性治疗)，减轻疾病、病症或状况的症状，减轻疾病、病症或状况的程度，稳定(即不恶化)疾病、病症或状况，预防疾病、病症或状况的传播，延迟或减缓疾病、病症或状况进展，改善或缓解疾病、病症或状况及其组合，以及与未接受治疗所预期的生存相比延长的生存。
如本文所用，术语“变体”是指通过一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或其他修饰与原始蛋白质不同的多肽。这些修饰不显著改变原始蛋白质的生物学活性。在许多情况下，变体保留了原始蛋白质的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的生物学活性。变体的生物学活性也可以高于原始蛋白质的生物学活性。变体可以是天然存在的，如通过等位基因变异或多态性，或者是经故意工程化改造的。
变体的氨基酸序列与原始蛋白质的氨基酸序列基本相同。在许多实施方案中，变体与原始蛋白质共享至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的全局序列一致性或相似性。可以使用本领域已知的各种方法来确定序列一致性或相似性，如基本局部比对工具(Basic Local AlignmentTool，BLAST)、点矩阵分析或动态编程方法。在一个实例中，序列一致性或相似性通过使用Genetics Computer Group(GCG)程序GAP(Needleman-Wunsch算法)确定。变体和原始蛋白质的氨基酸序列在一个或多个区域中可以基本相同，但是在其他区域中分歧。变体可以包括片段(例如，多肽的生物学活性片段)。在一些实施方案中，与全长多肽相比，片段可以在多肽的N端、C端或两个末端(各自独立地)上缺少多达约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50或100个氨基酸残基。
I.工程化的红系细胞
本公开的特征在于经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞和去核细胞。在一些实施方案中，去核细胞是红系细胞，其例如通过从红系前体细胞分化而丧失其核。然而，应当理解，不是所有去核细胞是红系细胞，因此，本文所涵盖的去核细胞还可包括例如血小板。在一些实施方案中，去核细胞不是血小板，因此是无血小板去核细胞。在本公开的某些方面，红系细胞是网织红细胞或红细胞(红细胞(RBC))。与其他细胞相比，红细胞具有许多优势，包括由于缺乏主要组织相容性复合物(MHC)而是非自体的，具有更长的循环时间以及易于大量生产。在本公开的某些方面，工程化红系细胞是有核的。
与目前的免疫杀伤细胞靶向技术相比，本文提供的工程化红系细胞提供了显著的优势：是天然免疫特许的并且直接在体内介导免疫杀伤细胞的刺激，因此避免了与免疫杀伤细胞的过继细胞转移相关的缺点。当体内暴露于这些细胞群体时，本发明的工程化红系细胞可以被工程化改造以刺激NK细胞和CD8+细胞两者。特别地，本发明的发现是包含IL-12，IL-15/IL-15RA，4-1BBL或其组合，例如4-1BBL和IL-15/IL-15RA，4-1BBL和IL-12或IL-12和IL-15/IL-15RA的工程化红系细胞驱动原代CD4+，CD8+，NK和NKT细胞的有效活化，并诱导NK细胞的细胞毒性。
在一些方面，本公开提供了经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞，其中所述免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽。免疫杀伤细胞包括天然杀伤(NK)细胞和CD8+T细胞。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段，以及白介素15受体α(IL-15RA)多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，遗传工程化红系细胞能够刺激免疫细胞，包括免疫杀伤细胞。在一些实施方案中，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段，以及白介素15受体α(IL-15RA)多肽的胞外部分或其片段，和第二外源刺激性多肽，其中第二外源刺激性多肽包含4-1BBL或其片段。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段，以及白介素15受体α(IL-15RA)多肽的胞外部分或其片段，和第二外源刺激性多肽，其中第二外源刺激性多肽包含白介素(IL-12)多肽或其片段。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素12(IL-12)多肽或其片段，和第二外源刺激性多肽，其中第二外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽或其片段。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含至少一种选自下组的外源刺激性多肽：MHC I类链相关蛋白A(MICA)，MHC I类链相关蛋白B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
工程化红系细胞提供了另外的优点：即在单一红系细胞上，且以相当高的数目呈现，例如在细胞表面上包含多种不同刺激分子，以及在整个循环系统中并且以长循环半衰期通过红系细胞直接递送和维持刺激信号，因此提供了更安全且更有效的用于刺激免疫杀伤细胞的方法。
包含外源刺激性多肽的工程化红系细胞
本发明的外源刺激性多肽是单独或与其他外源刺激性多肽组合地介导免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)的刺激的多肽。本发明的一个特征是，在一些实施方案中，红系细胞所包含的外源刺激性多肽能够刺激超过一种类型的免疫杀伤细胞，例如包含本发明的外源刺激性多肽的工程化红系细胞能够刺激NK细胞和CD8+T细胞两者。
在一些实施方案中，刺激免疫杀伤细胞是指免疫杀伤细胞的扩充。在一些实施方案中，刺激免疫杀伤细胞是指免疫杀伤细胞的活化。在一些实施方案中，刺激免疫杀伤细胞是指免疫杀伤细胞的细胞毒性增加。在某些实施方案中，刺激免疫杀伤细胞是指免疫杀伤细胞的扩充，活化和/或增加的细胞毒性中的一种或多种的组合。在具体的实施方案中，在工程化红系细胞的细胞表面上表达的一种或多种外源刺激性多肽足以离体活化和/或扩充免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)。在具体的实施方案中，在工程化红系细胞的细胞表面上表达的一种或多种外源刺激性多肽足以在体内活化和/或扩充免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)。本文描述了检测外源刺激性多肽是否足以刺激免疫杀伤细胞的测定法。因此，在一方面，本公开提供了工程化改造为刺激免疫细胞的红系细胞，其中所述免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽。
在一些实施方案中，多种外源刺激性多肽选自细胞因子、人白细胞抗原(HLA)、MHCI类链相关蛋白(MIC)、免疫球蛋白超家族(IgSF)的蛋白、NK细胞细胞毒性触发受体配体和胰岛素样生长因子。在一些实施方案中，在表1中显示了外源刺激性多肽。
表1：外源刺激性多肽
Figure BDA0002760528960000331
Figure BDA0002760528960000341
除非另有说明，否则本文指定的序列登录号(包括本文的任何表中)指截至2019年3月8日的当前数据库条目。当一个基因或蛋白质引用多个序列登录号时，将涵盖所有序列变体。
细胞因子
在一些实施方案中，本发明提供了经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞，其中所述免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽，包括一种或多种细胞因子。因此，本公开涵盖细胞因子，包括细胞因子的全长，片段，同源物，变体或突变体。细胞因子包括能够影响另一细胞的生物学功能的蛋白质。受细胞因子影响的生物学功能可以包括但不限于细胞生长，细胞分化或细胞死亡。优选地，本公开的细胞因子能够结合细胞表面上的特异性受体，从而刺激免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+T细胞)。
优选的细胞因子尤其包括白介素，干扰素，免疫球蛋白超家族分子，肿瘤坏死因子家族分子和/或趋化因子。本公开的更优选的细胞因子包括白介素-1(IL-1)，白介素-2(IL-2)，白介素12(IL-12)，白介素15(IL-15)，IL-15/IL-15RA融合物，白介素18(IL-18)，白介素21(IL-21)和干扰素α(IFNα)。在一些实施方案中，本公开的特别优选的细胞因子是IL-15/IL-15RA融合物。在一些实施方案中，本公开的特别优选的细胞因子是IL-12。一旦掌握了本文提供的教导，本领域技术人员将理解，本发明涵盖细胞因子，例如本领域公知的以及将来发现的任何细胞因子。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4、5或多种)细胞因子或其变体或片段。
人白细胞抗原(HLA)蛋白
在一些实施方案中，本发明提供了经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞，其中所述免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽，包括一种或多种人白细胞抗原蛋白。因此，本公开涵盖HLA蛋白，包括HLA蛋白的全长，片段，同源物，变体或突变体。HLA基因家族提供了制备称为人白细胞抗原(HLA)复合物的一组相关蛋白的说明。HLA是主要组织相容性复合体(MHC)(存在于许多物种中的基因家族)的人形式。在人类中，MHC复合体由超过200个一起紧密位于6号染色体上的基因组成。该复合体中的基因分为三个基本类别：I类，II类和III类。人类具有三个主要的MHC I类基因，分别为HLA-A，HLA-B和HLA-C。由这些基因产生的蛋白质几乎存在于所有细胞的表面。HLA基因具有许多可能的变异，并且某些HLA基因具有数百个已鉴定的形式(等位基因)，每个形式给予特定编号(例如HLA-B27)。密切相关的等位基因被归类在一起。例如，至少40个非常相似的等位基因是HLA-B27的亚型。
在一些实施方案中，HLA蛋白是人白细胞抗原(HLA)-A。在一些实施方案中，HLA蛋白是人白细胞抗原(HLA)-C。在一些实施方案中，HLA蛋白是人白细胞抗原(HLA)-E。在一些实施方案中，HLA蛋白是人白细胞抗原(HLA)-G。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4、5或多种)HLA蛋白或其变体或片段。
MHC I类链相关蛋白(MIC)
在一些实施方案中，本公开涵盖经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞，其中所述免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽，包括一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)I类链相关(MIC)蛋白。因此，本公开涵盖MIC蛋白，包括MIC蛋白的全长，片段，同源物，变体或突变体。MIC蛋白与经典的人类白细胞抗原(HLA)分子的同源性，但它们不与beta2微球蛋白组合，不结合肽，并且不在正常的循环淋巴细胞上表达。MIC蛋白与活化的天然杀伤细胞受体NKG2D结合。
UL16结合蛋白(ULBP)是MHC I类相关分子(MIC)的新家族，这些分子是根据其与人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白UL16结合的能力而鉴定的。UL16还与另一类MHC I类分子MICB的成员结合。ULBP和MIC是NKG2D/DAP10的配体，所述NKG2D/DAP10是由天然杀伤(NK)细胞和其他免疫效应细胞表达的活化受体，并且此种相互作用可以被UL16阻断。在靶细胞上表达的ULBP或MIC与NKG2D/DAP10的结合可克服MHC I类分子的NK细胞识别产生的抑制信号并触发NK细胞毒性。ULBP通过激活janus激酶2，信号转导子和转录激活剂5，细胞外信号调节的激酶促细胞分裂剂激活的蛋白激酶和Akt/蛋白激酶B信号转导通路，引起其对NK细胞的作用。尽管单独的ULBP激活多个信号传导途径并诱导适度的细胞因子产生，但ULBP与白细胞介素12强烈发挥协同作用，从而通过NK细胞产生干扰素-gamma。
在一些实施方案中，MIC蛋白是MHC I类链相关蛋白A(MICA)。在一些实施方案中，MIC蛋白是MHC I类链相关蛋白B(MICB)。在一些实施方案中，MIC蛋白是UL16结合蛋白(ULBP)。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4、5或多种)MIC蛋白或其变体或片段。
免疫球蛋白超家族(IgSF)
在一些实施方案中，本公开包括经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞，其中所述免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽，包括一个或多个IgS家族蛋白。因此，本公开涵盖了IgSF超家族成员，包括IgSF超家族成员的全长，片段，同源物，变体或突变体。免疫球蛋白超家族(IgSF)是一类与细胞粘附，结合和细胞识别过程相关的蛋白质。根据与免疫球蛋白共有的结构特征，分子被归类为该超家族的成员；它们都拥有称为免疫球蛋白域或折叠的域。IgSF的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体，共受体和共刺激分子，涉及抗原向淋巴细胞呈递的分子，细胞粘附分子，某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。IgSF的成员可以分类如下：抗原受体(例如抗体或免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG，IgM)；抗原呈递分子(例如MHC I类，IMHC I类)；共受体(例如CD4，CD8)；共刺激或抑制分子(例如CD28，CD80，CD86)；天然杀伤细胞上的受体(例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR))；白细胞上的受体(例如白细胞免疫球蛋白样受体(LILR))；IGSFCAM(例如NCAM，ICAM-1)；细胞因子受体；生长因子受体；受体酪氨酸激酶/磷酸酶；IgG结合受体。
脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。PVR/CD155介导NK细胞粘附并触发NK细胞效应子功能。PVR/CD155结合两种不同的NK细胞受体：CD96和CD226。这些相互作用在细胞-细胞接触部位积累，导致NK细胞与靶细胞之间形成成熟的免疫突触。这可以触发溶解性颗粒和IFN-gamma(IFNγ)的粘附和分泌，并激活活化的NK细胞的细胞毒性，并且还可以促进NK细胞-靶细胞的模块交换，以及PVR转移至NK细胞。
脊髓灰质炎病毒受体相关2(PVRL2)，也称为Nectin-2，是具有两个Ig样C2型域和1个Ig样V型域的单程I型膜糖蛋白。该蛋白质是粘附连接的质膜成分之一。
CD48抗原(分化簇48)，也称为B淋巴细胞活化标记物(BLAST-1)或信号传导淋巴细胞性活化分子2(SLAMF2)，是一种在人类中由CD48基因编码的蛋白质。CD48是IgSF的CD2亚家族的成员，其包括SLAM(信号传导淋巴细胞活化分子)蛋白，例如CD84，CD150，CD229和CD244。CD48存在于淋巴细胞和其他免疫细胞，树突细胞和内皮细胞的表面上，并参与这些细胞中的活化和分化途径。
NK-T-B抗原(NTBA)是在NK，T和B细胞上表达的表面分子。在人NK细胞中，NTBA已显示主要起共受体作用，因为它仅在表达高表面密度的天然细胞毒性受体(NCR)的细胞中才能触发溶细胞活性。分子克隆揭示，NTBA是Ig超家族的成员，其特征在于允许其分配给CD2家族的结构特征。
在一些实施方案中，IgSF蛋白是IgG。在一些实施方案中，IgSF蛋白是PVR/CD155。在一些实施方案中，IgSF蛋白是CD48。在一些实施方案中，IgSF蛋白是Nectin2。在一些实施方案中，IgSF蛋白是NK-T-B抗原。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4、5或多种)IgSF蛋白或其变体或片段。
硫酸类肝素/硫酸类肝素蛋白聚糖
在一些实施方案中，本发明提供了经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞，其中该免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激该免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽，包括一种或多种硫酸类肝素/硫酸肝素蛋白聚糖。硫酸类肝素(HS)是在所有动物组织中发现的线性多糖。它以蛋白聚糖(HSPG)的形式出现，其中两个或三个HS链紧密相邻附着到细胞表面或细胞外基质蛋白。硫酸类肝素蛋白聚糖(HSPG)是普遍存在于细胞表面和细胞外基质中的糖蛋白。它们的硫酸类肝素部分通常代表靶向特定受体的细胞外蛋白的替代附着点。因此，HSPG调节配体-受体的相遇并参与许多生物学过程。
基于分子和细胞的研究显示，硫酸类肝素在体外与淋巴细胞归巢中涉及的几种主要分子，包括L-选择蛋白，趋化因子和整联蛋白结合。大多数趋化因子(包括次级淋巴样趋化因子CCL21(也称为SLC)，对于淋巴细胞归巢而言它是必不可少的)在体外与硫酸类肝素或其高度硫酸化的类似肝素结合(Lortat-Jacob et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002；99:1229–1234)。硫酸类肝素结合的趋化因子被趋化因子受体(如CCR6和CCR7)识别，从而激活整联蛋白，导致淋巴细胞外渗(von Andrian and Mempel,Nat.Rev.Immunol.2003；3:867–878，其全部内容通过引用并入本文)。多条证据指示硫酸类肝素在趋化因子的转胞吞作用，呈递和梯度形成中起作用，以促进淋巴细胞迁移。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4、5或多种)HS多糖或其变体或片段。
天然杀伤细胞毒性触发受体配体
在一些实施方案中，本公开内容包括经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞，其中所述免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽，包括一种或多种天然杀伤细胞毒性触发性受体配体。NK细胞配备有活化受体，包括几种天然细胞毒性受体(即分别称为NKp46，NKp44和NKp30的NCR1，NCR2和NCR3)，它们直接参与杀死转化细胞。NKp44并非由静息的NK细胞表达，而仅由其活化的对应细胞表达。用于激活NK受体的配体的表达目前被认为是病理情况的指标。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4、5或更多)NK细胞毒性触发性受体配体或其变体或片段。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含选自下组的外源刺激性多肽：IL-1,IL-2,IL-12,IL-15,IL-15/IL-15RA融合物,IL-18,IL-21,干扰素alpha(IFNα),4-1BBL,脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155),CD48,人白细胞抗原(HLA)-A,HLA-C,HLA-G,硫酸类肝素(HS),HLA-E,CpG,免疫球蛋白G(IgG),UL16结合蛋白(ULBP),MHCI类链相关蛋白(MIC),B7-H6,NkP44L,Nectin2,NK-T-B抗原(NTBA),激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，MIC蛋白是MHC I类链相关蛋白A(MICA)或MHC I类链相关蛋白B(MICB)。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含外源刺激性多肽，其包含IL-12多肽或其片段或由IL-12多肽或其片段组成。在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含外源刺激性多肽，其包含4-1BBL多肽或其片段或由4-1BBL多肽或其片段组成。在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含外源刺激性多肽，其包含IL-15多肽或其片段或由IL-15多肽或其片段组成。在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含外源刺激性多肽，其包含IL-15/IL-15RA融合多肽或其片段或由IL-15/IL-15RA融合多肽或其片段组成。
在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含选自下组的外源刺激性多肽：IL-15/IL-15RA融合物，MHC I类链相关蛋白A(MICA)或MHC I类链相关蛋白B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
在某些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含至少两种外源多肽。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA或由IL-15/IL-15RA组成，第二外源刺激性多肽包含多肽或由多肽组成，所述多肽选自IL-1，IL-2，IL-12，IL-18，IL-21，干扰素alpha(IFNα)，MHC I类链相关蛋白A(MICA)或MHC I类链相关蛋白B(MICB)，脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)和CD48。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是IL-1。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是IL-2。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是IL-12。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是IL-18。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是IL-21。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是IFNα。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是MICA。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是MICB。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是PVR。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-15/IL-15RA，第二外源多肽是CD48。
在某些实施方案中，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽选自下组：4-1BBL和IL-15/IL-15R，4-1BBL和IL-12以及IL_12和IL-15/IL-15RA。在一些实施方案中，第一外源多肽是4-1BBL，并且第二外源多肽是IL-15/IL-15RA。在一些实施方案中，第一外源多肽是4-1BBL，并且第二外源多肽是IL-12。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-12，并且第二外源多肽是IL-15/IL-15RA。
在某些实施方案中，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽选自下组：IL-18和IL-12以及IL-18和IL-21。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-18，并且第二外源多肽是IL-12。在一些实施方案中，第一外源多肽是IL-18，并且第二外源多肽是IL-21。
在某些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含至少三种外源多肽。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽是IL-12，第二外源刺激性多肽是IL-18，并且第三外源刺激性多肽是IL-15/IL-15RA融合物。在进一步的实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含IL-12的第一外源刺激性多肽、IL-18的第二外源多肽和IL-15/IL-15RA融合物的第三外源刺激性多肽，其中红系细胞能够刺激记忆样NK细胞。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽是IL-12，第二外源刺激性多肽是IL-18，并且第三外源刺激性多肽是IL-15。在进一步的实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含IL-12的第一外源刺激性多肽，IL-18的第二外源多肽和IL-15的第三外源刺激性多肽，其中红系细胞能够刺激记忆样NK细胞。
在另一方面，本发明提供了工程化红系细胞，其包含至少一种选自下组的外源刺激性多肽：MHC I类链相关蛋白A(MICA)，MHC I类链相关蛋白B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少一种选自下组的外源刺激性多肽：MICA，MICB和IGF-1，并且还包含选自下组的外源刺激性多肽：IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IL-15/IL-15RA融合物，IL-18，IL-21，干扰素alpha(IFNα)，4-1BBL，脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)，CD48，HLA-A，HLA-C，HLA-G，硫酸类肝素(HS)，HLA-E，CpG，IgG，UL16结合蛋白(ULBP)，MHC I类链相关(MIC)，B7-H6，NkP44L，Nectin2，NK-T-B抗原(NTBA)，激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
在某些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含至少一种外源刺激性多肽，其中所述外源刺激性多肽是IL-12。在一些实施方案中，经工程化改造以刺激免疫细胞的红系细胞包含第一外源刺激性多肽，其中第一外源刺激性多肽是IL-12，和第二外源刺激性多肽。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽是IL-12，并且第二外源刺激性多肽是IL-15多肽。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽是IL-12，并且第二外源刺激性多肽是IL-15/IL-15RA。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽是IL-12，并且第二外源刺激性多肽是4-1BBL。在一些实施方案中，IL-12是IL-12 p40/IL-12p35融合多肽。
在实施方案中，本文所述的工程化红系细胞包括三种或更多种，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、500或1000种外源刺激性多肽。在实施方案中，本文所述的工程化红系细胞群体包含三种或更多种，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种外源刺激性多肽，例如，其中群体中不同的工程化红系细胞包含不同的外源刺激性多肽，或者其中群体中不同的工程化红系细胞包含不同的多个外源刺激性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，至少两种外源刺激性多肽以融合多肽存在。在另一个实施方案中，至少三种外源刺激性多肽以融合多肽存在。
锚定/跨膜域
在某些实施方案中，外源刺激性多肽不从红系细胞释放。在一些实施方案中，外源刺激性多肽呈现于遗传工程化红系细胞的表面，即，外源刺激性多肽附着于红系细胞膜。在一些实施方案中，外源刺激性多肽还包含将多肽锚定至红系细胞膜的跨膜域。在某些实施方案中，将外源刺激性多肽锚定至红系细胞膜上的多肽序列(例如跨膜域)与外源刺激性多肽中存在的多肽异源。例如，在一些实施方案中，将外源刺激性多肽锚定至红系细胞膜的多肽序列与IL-15多肽和/或IL-15RA多肽，4-1BBL多肽或IL-12多肽异源。
在一些实施方案中，跨膜域包含1型膜蛋白的跨膜域或由1型膜蛋白的跨膜域组成。在一些实施方案中，1型膜蛋白选自下组：血型糖蛋白A(GPA)；血型糖蛋白B(GPB)；Basigin(也称为CD147)；CD44；CD58(也称为LFA3)；细胞间粘附分子4(ICAM4)；基底细胞粘附分子(BCAM)；CR1；CD99；成红血细胞膜相关蛋白(ERMAP)；连接粘附分子A(JAM-A)；neuroplastin(NPTN)；AMIGO2；和DS细胞粘附分子样1(DSCAML1)。在一些实施方案中，跨膜域包含2型膜蛋白的跨膜域或由2型膜蛋白的跨膜域组成。在一些实施方案中，2型膜蛋白选自下组：小整合膜蛋白1(SMIM1)，转铁蛋白受体(CD71)；Fas配体(FasL)跨膜；和Kell。在一些实施方案中，将外源刺激性多肽锚定至红系细胞膜的多肽序列包含，组成为，或源自GPI连接的膜蛋白(例如，其片段)。在一些实施方案中，GPI连接的膜蛋白选自下组CD59；CD55；和Semaphorin7A(SEMA7A)。
在具体的实施方案中，跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其跨膜部分。不受理论的束缚，在某些实施方案中，GPA是优选的，因为其具有与网织红细胞细胞骨架相互作用的胞质域，所述细胞骨架在细胞分化和成熟时在保留GPA中具有作用。在一些实施方案中，跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分。在一些实施方案中，锚定选自表2中列出的氨基酸序列。
表2.锚定序列
Figure BDA0002760528960000421
在一些实施方案中，一种或多种外源刺激性多肽是融合蛋白，例如是与内源性红细胞蛋白或其片段，例如跨膜蛋白，例如GPA或其跨膜片段的融合物。在一些实施方案中，一种或多种外源刺激性多肽与促进二聚化或多聚化的域融合，例如与第二融合外源刺激性多肽融合，所述第二融合外源刺激性多肽任选地包含二聚化域。在一些实施方案中，二聚化域包含抗体分子的一部分，例如Fc域或CH3域。在一些实施方案中，第一和第二二聚化域包含旋钮-入-孔突变(例如，T366Y旋钮和Y407T孔)以促进异二聚化。
接头
本发明的外源刺激性多肽可包含一个或多个接头。例如，可以将接头置于外源刺激性多肽的两个多肽序列之间(例如，在细胞因子多肽序列和跨膜域序列之间，在外源刺激性多肽的两个亚基序列之间(例如，在IL-12的p40和p35亚基之间)或两个刺激性多肽(例如IL-15和IL-15RA)之间。
在一些实施方案中，接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸的长度或由该长度组成。在一些实施方案中，接头包含约5至约25个氨基酸的长度，约5至约20个氨基酸的长度，10至约25个氨基酸的长度或约10至约20个氨基酸的长度或由该长度组成。在一些实施方案中，可用于本发明的接头包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度或由该长度组成。在一个优选的实施方案中，接头是非免疫原性的。
在一些实施方案中，接头选自表3中呈现的氨基酸序列。
表3.接头序列
Figure BDA0002760528960000431
Figure BDA0002760528960000441
在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:75)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。接头由(GGGGS)n接头(SEQ ID NO:75)组成，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头包含SEQID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头包含氨基酸氨基酸序列SEQ ID NO:39。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，接头由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成。
可以使用本领域技术人员已知的其他合适的接头，例如，将外源刺激性多肽连接至跨膜域，以连接两个外源刺激性多肽(例如，IL-15和IL-15RA)或连接外源刺激性多肽的亚基(例如，IL12的p30和p40)。
前导序列
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含前导(信号)序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽是包含前导序列的融合多肽。在一些实施方案中，前导序列选自表4中列出的序列。
表4.前导序列
Figure BDA0002760528960000442
Figure BDA0002760528960000451
包含IL-15/IL-15RA的工程化红系细胞
在另一方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段，以及白介素15受体alpha(IL-15RA)多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在另一个实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽通过接头连接至IL-15RA多肽的胞外部分。
在某些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含外源刺激性多肽，所述外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段(例如，IL-15受体结合片段)。在一些实施方案中，IL-15多肽包含野生型人IL-15的未成熟形式，其包括信号肽(带下划线的)：
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:3).
在一些实施方案中，IL-15多肽包含野生型人IL-15的未成熟形式的变体，其与SEQID NO:3的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-15多肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-15多肽包含野生型人IL-15的成熟形式：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:4).
在一些实施方案中，IL-15多肽包含野生型人IL-15的成熟形式的变体，其与SEQID NO:4的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-15多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-15多肽的片段包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160个氨基酸。在一些实施方案中，IL-15多肽的片段包含小于20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160个氨基酸。在一些实施方案中，IL-15多肽的片段或变体保留野生型人IL-15多肽结合IL-15RA多肽的功能的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％，如通过本领域公知的测定法，例如ELISA，Biacore或共免疫沉淀测量。在一些实施方案中，IL-15多肽的片段或变体保留野生型人IL-15多肽诱导IL-15介导的信号转导的功能的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％，如通过本领域公知的测定法，例如电动性迁移率测定法，ELISA和其他免疫测定法所测量。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含白介素15受体α(IL-15RA)多肽或其片段。在一些实施方案中，IL-15RA包含野生型人IL-15RA的未成熟形式，其包含信号肽(带下划线)：
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO:5).
在一些实施方案中，IL-15RA多肽包含野生型人IL-15RA的未成熟形式的变体，其与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-15RA多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-15RA多肽包含野生型人IL-15RA的成熟形式：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO:6).
在一些实施方案中，IL-15RA多肽包含野生型人IL-15Ra的成熟形式的变体，其与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-15Ra多肽由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-15Ra多肽包含IL-15Ra多肽的胞外部分。例如，IL-15Ra多肽可以缺乏野生型IL-15Ra的跨膜域，和任选地野生型IL-15Ra的细胞内域。在一些实施方案中，IL-15Ra多肽包含细胞外野生型人IL-15Ra的未成熟形式，其包括信号肽(带下划线)：
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT(SEQ ID NO:7).
在一些实施方案中，IL-15Ra多肽包含细胞外野生型人IL-15Ra的未成熟形式的变体，其与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-15Ra多肽由SEQID NO:7的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-15Ra多肽包含细胞外野生型人IL-15Ra的成熟形式：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，IL-15Ra多肽包含细胞外野生型人IL-15Ra的成熟形式的变体，其与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体实施方案中，IL-15RA多肽由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
IL-15通过受体细胞外域的外显子2中的“sushi域”以高亲和力与IL-15RA多肽特异性结合(Wei et al.,J Immunol.2001；167:277-282)。在一些实施方案中，IL-15Ra多肽包含野生型人IL-15RA的sushi域：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQID NO:9)。
在一些实施方案中，IL-15RA多肽包含野生型人IL-15RA的sushi域的变体，其与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-15Ra多肽由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-15RA多肽包含野生型人IL-15Ra的sushi域或其变体和人IL-15RA的至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90或100个额外氨基酸。在一个具体的实施方案中，IL-15RA多肽包含野生型人IL-15RA的sushi域和人IL-15RA的13个额外氨基酸：
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，IL-15RA多肽包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，IL-15RA多肽由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-15RA多肽的片段包含至少10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或200个氨基酸。在一些实施方案中，IL-15RA多肽的片段包含至少10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或200个氨基酸，并包含sushi域。在一些实施方案中，IL-15RA片段或变体保留野生型人IL-15RA多肽结合IL-15多肽的功能的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％，如通过本领域公知的测定法，例如ELISA，Biacore，共免疫沉淀测量。在另一个优选的实施方案中，IL-15RA变体或片段保留野生型人IL-15RA多肽诱导IL-15介导的信号转导的功能的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％，如通过本领域公知的测定法，例如电动性迁移测定法，ELISA和其他免疫测定法测量。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽或其片段(例如IL-15结合片段)。本文所述的任何IL-15多肽可以与本文所述的任何IL-15RA多肽组合以形成外源刺激性多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽以复合物存在。可以使用非共价键或共价键(例如，通过肽键组合氨基酸序列)直接融合IL-15/IL-15RA复合物的组分。在一个具体的实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽以融合多肽存在。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含IL-15RA多肽和信号肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽是包含IL-15RA多肽和信号肽的融合多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含信号肽，该信号肽包含表4中列出的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，该外源刺激性多肽包含信号肽，其包含GPA信号肽或由该GPA信号肽组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含信号肽，该信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的前导序列，IL-15多肽，和IL-15RA多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的前导序列，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQID NO:4的氨基酸序列组成的成熟人IL-15多肽，以及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的IL-15RA多肽。在一些实施方案中，成熟的人IL-15多肽和IL-15RA多肽通过包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的柔性接头连接。
IL-15和IL-15RA多肽可以使用一种或多种接头组合。可以使用本文提供的任何接头。在一些实施方案中，接头是长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸的肽。在一个具体的实施方案中，接头足够长以保持IL-15结合IL-15RA的能力。在其他实施方案中，接头足够长以保持IL-15/IL-15RA复合物结合至βγIL-15受体复合物并充当激动剂以介导IL-15信号转导的能力。在一些实施方案中，接头包含表3中列出的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:75)，其中n为1、2、3，4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，接头由(GGGGS)n接头(SEQ ID NO:75)组成，其中n为1、2、3、4、5。6、7、8、9或10。在一个具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:12)。在另一个具体的实施方案中，接头由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。
本领域技术人员已知的其他合适的接头可以用于连接IL-15和IL-15RA多肽。在一些实施方案中，可用于本发明的接头长度为5至25个氨基酸，长度为5至20个氨基酸，长度为10至25个氨基酸，或长度为10至20个氨基酸。在一些实施方案中，可用于本发明的接头的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一个优选的实施方案中，接头是非免疫原性的。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽的胞外区。例如，在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含IL-15多肽和IL-15RA多肽的sushi域。例如，在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，IL-15多肽，IL-15RA多肽或IL-15/IL-15RA复合物或融合多肽不从红系细胞释放。例如，在一些实施方案中，IL-15多肽，IL-15Ra多肽或IL-15/IL-15RA复合物或融合多肽附着到红细胞膜。在一些实施方案中，外源刺激性多肽还包含将多肽锚定至红系细胞膜(在本文中称为锚定或跨膜域)的多肽序列(例如跨膜区)。在某些实施方案中，将多肽锚定至红系细胞膜的多肽序列与外源刺激性多肽中的另一种多肽异源。例如，在一些实施方案中，将多肽锚定至红系细胞细胞膜的多肽序列与IL-15多肽和/或IL-15RA多肽异源。在某些实施方案中，将多肽锚定至红系细胞膜的多肽序列是GPA序列。
可用于将外源多肽锚定到红系细胞膜上的其他多肽是技术人员已知的，并考虑包含在包含IL-15，IL-15RA或IL-15/IL-15RA融合物的外源多肽中。非限制性实例包括小整合膜蛋白1(SMIM1)，转铁蛋白受体，Fas配体(FasL)，Kell和Band 3。Band 3阴离子运输蛋白，截短的转铁蛋白受体和Fas配体(FasL)跨膜域。
在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含1型膜蛋白或其跨膜部分或由1型膜蛋白或其跨膜部分组成。例如，在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含选自下组的1型膜蛋白或其跨膜部分：血型糖蛋白A(GPA)；血型糖蛋白B(GPB)；Basigin(也称为CD147)；CD44；CD58(也称为LFA3)；细胞间粘附分子4(ICAM4)；基底细胞粘附分子(BCAM)；CR1；CD99；成红血细胞膜相关蛋白(ERMAP)；连接粘附分子A(JAM-A)；neuroplastin(NPTN)；AMIGO2；和DS细胞粘附分子样1(DSCAML1)。在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含2型膜蛋白或其跨膜部分或由2型膜蛋白或其跨膜部分组成。例如，在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含选自下组的2型膜蛋白或其跨膜部分：小整合膜蛋白1(SMIM1)，转铁蛋白受体(CD71)；Fas配体(FasL)跨膜；和Kell。在一些实施方案中，锚定是GPI连接的膜蛋白。在一些实施方案中，GPI连接的膜蛋白锚选自下组：CD59；CD55；和Semaphorin 7A(SEMA7A)。
在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分或由小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分组成。在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其片段(例如，其跨膜部分)或由血型糖蛋白A(GPA)或其片段(例如，其跨膜部分)组成。在一些实施方案中，锚或跨膜域包含表2中提供的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，接头位于锚定或跨膜域与IL-15多肽，IL-15RA多肽或IL-15/IL-15RA多肽之间。合适的接头包括但不限于表3中提供的任何接头氨基酸序列。在一些实施方案中，锚定或跨膜域，例如GPA与IL-15多肽，IL-15RA多肽或IL-15/IL-15RA多肽之间的接头包含HA接头或由HA接头组成。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的锚定，白介素15(IL-15)多肽和白介素15受体α(IL-15RA)的胞外部分。多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的锚定，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的成熟人IL-15和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的成熟人胞外IL-15RA，其中成熟人IL-15氨基酸序列和成熟人细胞外IL-15RA氨基酸序列通过柔性接头连接，所述柔性接头包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的信号肽(例如，GPA信号肽)；包含SEQ ID NO:4或由SEQID NO:4组成的成熟人IL-15，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的柔性接头(例如，连接成熟人IL-15和成熟人胞外IL-15RA)，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的成熟人胞外IL-15RA，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的接头和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的锚定。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含(例如，从N末端到C末端)：包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的成熟人IL-15，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的柔性接头(例如，连接成熟人IL-15和成熟IL-15人胞外IL-15RA)，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ IDNO:8的氨基酸序列组成的成熟人胞外IL-15RA，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由SEQID NO:33的氨基酸序列组成的接头，和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的锚定。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:37或由SEQID NO:37组成。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成。
IL-15/IL-15RA和4-1BBL
工程化红系细胞可以包含第一外源刺激性多肽，其包含如本文所述的IL-15多肽和/或IL-15RA多肽以及一种或多种其他外源刺激性多肽。例如，工程化红系细胞还包含第二外源刺激性多肽，其包含4-1BBL(4-1BB配体)多肽。因此，本发明还提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段(例如，IL-15受体结合片段)，以及白介素15受体alpha(IL-15RA)多肽的胞外部分，或其片段，和第二外源刺激性多肽，其中第二外源刺激性多肽包含4-1BBL或其刺激性片段。如本文全文所使用，在一个实施方案中，“IL-15多肽片段”或“IL-15片段”是与IL-15RA结合的IL-15片段，即IL-15的IL-15RA结合片段。如本文全文所使用，在一个实施方案中，“IL-15多肽片段”或“IL-15片段”是保留IL-15的生物学活性的IL-15片段。
如本文全文所使用，在一个实施方案中，“IL-15RA多肽片段”或“IL-15RA片段”是与IL-15结合的IL-15RA片段，即IL-15RA的IL-15结合片段。如本文全文所使用，在一个实施方案中，“IL-15RA多肽片段”或“IL-15RA片段”是保留IL-15RA的生物学活性的IL-15RA片段。
4-1BBL是4-1BB的配体(也称为肿瘤坏死因子配体超家族，成员9(TNFSF9)或CD137)，免疫系统细胞表面上找到的受体家族成员。参见Alderson et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:2219-2227。已显示与4-1BBL结合的4-1BB促进T细胞、NK细胞和树突细胞的细胞活化、存活和分化。已记录4-1BB与4-1BB配体(4-1BBL)的结合主要通过T细胞，NK细胞和树突细胞(DC)中的4-1BB信号传导活性来促进细胞活化，存活和分化。
在某些实施方案中，4-1BBL为其天然三聚体形式。在进一步的实施方案中，本文所述的工程化红系细胞以其天然三聚体形式表达4-1BBL，其中天然三聚体形式对于工程化红系细胞的功效和活性是重要的。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含或组成为，人4-1BBL，例如人4-1BBL的胞外部分。在一些实施方案中，4外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:41组成。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽和前导(信号)序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽是包含4-1BBL多肽和前导序列的融合多肽。在一些实施方案中，前导序列包含表4中列出的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，前导序列包含GPA信号肽。在一些实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽和前导序列，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包括包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的前导序列，和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的人胞外4-1BBL。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽，并附着至红系细胞膜。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽和将多肽锚定至红系细胞膜的锚定或跨膜域。在某些实施方案中，锚定或跨膜域与4-1BBL多肽异源。在某些实施方案中，锚定或跨膜域包含GPA或其跨膜部分或由GPA或其跨膜部分组成。在某些实施方案中，锚定或跨膜域包含SMIM1或其跨膜部分或由SMIM1或其跨膜部分组成。在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)，转铁蛋白受体，Fas配体(FasL)，Kellor Band 3或其跨膜部分(例如，跨膜域)或由它们组成。包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽可包含本文所述的任何锚定或跨膜域。在一些实施方案中，包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽包含表2中列出的锚定或跨膜域。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含锚定或4-1BBL多肽，所述锚定包含SEQID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的锚定和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的4-1BBL多肽。
包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽可包含一个或多个接头。例如，外源刺激性多肽可包含本文提供的任何接头(例如，包含表3中提供的氨基酸序列或由表3中提供的氨基酸序列组成的接头。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包括GPA(或其跨膜部分)，4-1BBL多肽，和位于GPA(或其跨膜部分)和4-1BBL多肽之间的接头。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含接头，该接头包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的接头。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含信号肽，4-1BBL多肽和锚定。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含信号肽，4-1BBL肽，接头和锚定。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含(例如，从N末端到C末端)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的信号肽，包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的4-1BBL多肽，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的接头(例如，位于4-1BBL多肽和锚定之间)，以及包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的锚定。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含4-1BBL肽，接头和锚定。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含(例如，从N末端到C末端)包含SEQID NO:41的氨基酸序列或由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的4-1BBL多肽，包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列或由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的接头(例如，位于4-1BBL多肽和锚定之间)，和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的锚定。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在某些实施方案中，包含IL-15/IL-15RA的第一外源刺激性多肽和包含4-1BBL的第二外源刺激性多肽的组合诱导协同应答(例如，在免疫杀伤细胞活化期间)。例如，当在红系细胞上表达时，与单独的任意刺激性多肽的作用相比，各包含IL-15/IL-15RA或4-1BBL的外源刺激性多肽可共同起作用，以产生更强大的免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+ T细胞)活化。在本文提供的实施例中证明了此类协同活性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含第一和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA的胞外部分，或其片段，其中第二外源刺激性多肽包含4-1BB，并且其中第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽离体或体内以协同活性刺激免疫杀伤细胞。在一个实施方案中，IL-15和IL-15RA以融合蛋白存在，并且例如在细胞表面处。
IL-15毒性
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含含有IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，其中所述细胞能够刺激免疫杀伤细胞，并且其中所述细胞在施用于受试者时与分离的IL-15多肽相比具有更高的治疗指数(TI)。在一些实施方案中，在施用于受试者时，与分离的细胞相比，与分离的IL-15多肽相比，细胞具有高至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的治疗指数。在一些实施方案中，在施用于受试者时，与分离的细胞相比，细胞具有高至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或10倍的治疗指数。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含含有IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，其中在施用于受试者时，与分离的细胞相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的多肽，例如IL-12多肽，IL-15多肽或4-1BB激动剂抗体，是指重组的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽，例如IL-12多肽，IL-15多肽或4-1BB激动剂多肽(例如4-1BB激动剂抗体)，是指不在细胞中、不在细胞膜中、不在细胞表面上包含和/或不与细胞缀合的多肽。
在一些实施方案中，与等同量的分离的IL-15多肽相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是数量上或功能上与细胞中包含的IL-15多肽的量相等的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量在数量上相同的量(例如，拷贝数或摩尔浓度)。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量具有相同生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与包含IL-15多肽的工程化红系细胞具有相同生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量具有相同治疗效力的分离的IL-15多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与包含IL-15多肽的工程化红系细胞具有相同治疗效力的分离的IL-15多肽的量。在一些实施方案中，第一外源多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分是融合多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3接头(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，和IL-15受体alphasushi结合域。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15受体alphasushi结合域连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)，任选地，其中接头包含(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，毒性包括肝毒性。在一些实施方案中，毒性包括血液毒性。在一些实施方案中，通过选自下组的肝毒性指标来测量肝毒性：IFNg的血清水平升高，ALT的血清水平升高，肝中浸润性巨噬细胞水平升高，肝中的浸润CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞水平升高，肝重量增加，肝炎症得分增加，嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低以及血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括血清干扰素gamma(IFNg)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示剂包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括肝或脾中浸润巨噬细胞水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示物包括肝中CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括增加的肝炎症得分。数值得分可用于提供组织学特征的半定量评估。组织学研究可以帮助定义分级和分期，以产生组织学活性的数字指标。分级用于描述坏死炎症活性的强度。分期是纤维化和结构改变(即疾病的结构进展)的量度。
在一些实施方案中，肝炎症得分是Ishak得分。Ishak得分利用组织学分级和分期以按0-6分(7个阶段)的量表进行评分，取决于坏死炎症特征的严重性(门静脉周或中隔周界面肝炎，融合性坏死，局灶性(点)溶解性坏死，凋亡和局灶性炎症和门炎症)。较高的Ishak得分意味着疾病进程或结果恶化或更严重，并且可以用作定义肝毒性的度量(参见例如Ishak K et al.,1995；Goodman ZD et al.,2007J Hepatol.；47(4):598-607，通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，肝毒性的指标是肝炎症增加，如由Ishak得分所定义。
在一些实施方案中，使用小鼠肝毒性模型来评估肝毒性。在一些实施方案中，小鼠毒性模型可用于评估本文所述的任何工程化红系细胞的潜在毒性(参见例如Niu et al JImmunology 2007 178:4194-4213，通过引用整体并入本文)。简而言之，肝毒性可以通过免疫异常的发展来确定，其可以包括但不限于丙氨酸转氨酶(ALT)肝酶水平升高，巨噬细胞的肝浸润，CD8+T细胞的肝浸润，淋巴细胞减少，血小板减少，贫血，血红蛋白水平降低，脾肿大，淋巴结病，肝肿大，多灶性肝炎，贫血，B细胞和CD8+T细胞的运输改变，NK细胞丧失以及带有造血干细胞表型的骨髓(BM)细胞的10倍增加。因此，在一些实施方案中，使用小鼠模型以通过在施用工程化红系细胞之前以及在施用本文所述的工程化红系细胞之后的时间点测定小鼠中的以下一项或多项评估肝毒性：ALT肝酶水平升高，巨噬细胞的肝浸润，CD8+T细胞的肝浸润，淋巴细胞减少，血小板减少，贫血，血红蛋白水平降低，脾肿大，淋巴结病，肝肿大，多灶性肝炎，贫血，B细胞和CD8+T细胞的运输改变，NK细胞丧失以及带有造血干细胞表型的骨髓(BM)细胞的10倍增加。
在一些实施方案中，通过选自下组的血液毒性指标来测量血液毒性：嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低和血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，在全血样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血清样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血浆样品中测量血液毒性的指标。
在一些实施方案中，通过减轻的体重来测量毒性。
在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指示剂水平与施用之前的毒性指标水平进行比较。在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指标水平与毒性指标的阈值或对照水平进行比较。
人正常肝功能的正常血液测试结果包括每升血清约7到55个单位的丙氨酸转氨酶(ALT)水平(例如参见www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/about/pac-20394595)。当肝受损时，例如由于毒性，ALT被释放到血流中，并且其水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标是血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中血清的ALT水平大于每升血液约55个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中血清的ALT水平大于每升血液约75个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中血清的ALT水平大于每升血液约100个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中血清的ALT水平大于每升血液约250个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中血清的ALT水平大于每升血液约500个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中血清的ALT水平大于每升血液约750个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中血清的ALT水平大于每升血液约1000个单位。
人正常肝功能的正常血液测试结果包括每升血清约8至48个单位的天冬氨酸转氨酶(AST)水平(例如，参见www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/about/pac-20394595)。像ALT一样，AST通常以低水平存在于血液中，并且AST水平升高表明肝受损。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约48个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约60个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约75个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约100个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约250个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约500个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约750个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约800个单位。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中AST的血清水平大于每升血液约1000个单位。
人正常肝功能的正常血液测试结果包括每升血清约45至115个单位的碱性磷酸酶(ALP)水平(例如，参见www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/about/pac-20394595)。高于正常水平的ALP可指示肝损伤或疾病。在一些实施方案中，肝毒性的指标是血清碱性磷酸酶(ALP)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标是每升血清大于约115个单位的血清ALP水平。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中每升血液中大于约150个单位的血清ALP水平。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中大于每升血液约250个单位的血清ALP水平。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中大于每升血液约500个单位的血清ALP水平。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中大于每升血液约750个单位的血清ALP水平。在一些实施方案中，肝毒性的指标是人受试者中大于每升血液约1000个单位的血清ALP水平。
成年人的正常血液测试结果包括1μL血液中的800至4,800个淋巴细胞(参见例如www.medicalnewstoday.com/articles/320987.php)。淋巴细胞减少是血液中淋巴细胞计数异常减少的情况。淋巴细胞减少是来自细胞毒剂施用的常见结果。在一些实施方案中，通过减少的淋巴细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约800个淋巴细胞的减少的淋巴细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约600个淋巴细胞的减少的淋巴细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约400个淋巴细胞的减少的淋巴细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约200个淋巴细胞的减少的淋巴细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约100个淋巴细胞的减少的淋巴细胞计数。
成年人的正常血液测试结果包括1μL血液中的390万至565万个细胞(参见例如，www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/about/pac-20384919)。当红细胞被某些化学物质或毒素过度损害时，可以发生红细胞计数减少。在一些实施方案中，通过减少的红细胞计数来鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约3.9X 106个红细胞的减少的红细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约1X106个红细胞的减少的红细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约3X 105个红细胞的减少的红细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约1X 105个红细胞的减少的红细胞计数。血液毒性的指标是每微升血液小于约3X 104个红细胞的减少的红细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约1X 104个红细胞的减少的红细胞计数。血液毒性的指标是每微升血液小于约3X 103个红细胞的减少的红细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约1X 103个红细胞的减少的红细胞计数。血液毒性的指标是每微升血液小于约3X 102个红细胞的减少的红细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约1X 102个红细胞的减少的红细胞计数。
成年人的正常血液测试结果包括1μL血液中的3,400至9,600个细胞(参见例如www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/about/pac-20384919)。白细胞减少是血液中白细胞(白血球)计数的减少，其可通过毒性诱导(参见例如Xu etal.,2008,Toxicological Sciences.103(2):278–284)。在一些实施方案中，通过减少的白细胞计数来鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约3,400个白细胞的减少的白细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约3,000个白细胞的减少的白细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约2,500个白细胞的减少的白细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约2,000个白细胞的减少的白细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约1,500个白细胞的减少的白细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约1,000个白细胞的减少的白细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约500个白细胞的减少的白细胞计数。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每微升血液小于约100个白细胞的减少的白细胞计数。
成年人的正常血液测试结果包括每升血液116至166克(参见例如www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/about/pac-20384919)。在一些实施方案中，通过降低的血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约116克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约110克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约100克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约90克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约80克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约70克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约60克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约50克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约40克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约30克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约20克的降低的血红蛋白水平。在一些实施方案中，血液毒性的指标是每升血液小于约10克的降低的血红蛋白水平。
在一些实施方案中，在施用于受试者后，细胞比分离的IL-15多肽表现出少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％的毒性。在一些实施方案中，在施用于受试者后，细胞比分离的IL-15多肽表现出少至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍的毒性。
在一些实施方案中，细胞能够刺激受试者中的免疫杀伤细胞。
4-1BBL毒性
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含含有4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽，其中所述细胞能够刺激免疫杀伤细胞，并且其中在施用于受试者后与分离的4-1BBL激动剂抗体相比细胞具有更高的治疗指数(TI)。在一些实施方案中，在施用于受试者后与分离的4-1BBL激动剂抗体相比，细胞具有高至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的治疗指数。在一些实施方案中，在施用于受试者后与分离的4-1BBL激动剂抗体相比，细胞具有高至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或10倍的治疗指数。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含含有4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽，其中所述细胞能够刺激免疫杀伤细胞，并且其中在施用于受试者后与分离的4-1BBL激动剂抗体相比，所述细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的多肽，例如IL-12多肽，IL-15多肽或4-1BB激动剂抗体，是指重组的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽，例如IL-12多肽，IL-15多肽或4-1BB激动剂多肽(例如4-1BB激动剂抗体)，是指不在细胞中、不在细胞表面中、不在细胞表面上和/或不与细胞缀合的多肽。在一些实施方案中，与等同量的分离的4-1BB激动剂抗体相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是与细胞中所包含的4-1BBL多肽的量等同的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量等同(例如，拷贝数，重量或摩尔浓度)的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与包含4-1BBL多肽的工程化红系细胞相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与包含4-1BBL多肽的工程化红系细胞相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的治疗效力的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与包含4-1BBL多肽的工程化红系细胞相同的治疗功效的分离的4-1BB激动剂抗体的量。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂抗体是抗体3H3或其抗原结合片段，或抗体utomilumab或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，毒性包括肝毒性。在一些实施方案中，毒性包括血液毒性。在一些实施方案中，通过选自下组的肝毒性指标来测量肝毒性：IFNg的血清水平升高，ALT的血清水平升高，肝中浸润性巨噬细胞水平升高，肝中的浸润CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞水平升高，肝重量增加，肝炎症得分增加，嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低以及血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括血清干扰素gamma(IFNg)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示剂包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括肝或脾中浸润巨噬细胞水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示物包括肝中CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括增加的肝炎症得分。
在一些实施方案中，肝炎症评分是Ishak得分，如本文所述。
在一些实施方案中，如本文所述，使用小鼠肝毒性模型评估肝毒性。
在一些实施方案中，通过选自下组的血液毒性指标来测量血液毒性：嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低和血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，在全血样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血清样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血浆样品中测量血液毒性的指标。
在一些实施方案中，通过减轻的体重来测量毒性。
在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指示剂水平与施用之前的毒性指示剂水平进行比较。在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指标的水平与毒性指标的阈值或对照水平进行比较。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALT水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是血清ALT水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清AST水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是AST的血清水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALP水平确定。在一些实施方案中，肝毒性的指标是ALP的血清水平升高，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由淋巴细胞计数确定。在一些实施方案中，通过减少的淋巴细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过白细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的白细胞计数来鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，通过降低的血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。
在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的4-1BB激动剂抗体相比，细胞表现出少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％的毒性。在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的4-1BB激动剂抗体相比，细胞表现出少至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍的毒性。
在一些实施方案中，细胞能够刺激受试者中的免疫杀伤细胞。
IL-15和4-1BBL毒性
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽，并且所述第二外源刺激性多肽包含IL-15多肽，其中所述细胞能够刺激免疫杀伤细胞，并且其中在施用于受试者后，所述细胞与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-15多肽或其组合相比具有更高的治疗指数(TI)。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞具有高至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的治疗指数。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞具有高至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或10倍的治疗指数。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽，并且所述第二外源刺激性多肽包含IL-15多肽，其中在施用于受试者后，与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞表现出更小的毒性。
在一些实施方案中，在施用于受试者时，与等同量的分离的4-1BB激动剂多肽，等同量的分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是与细胞中所包含的4-1BBL多肽的量等同的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量等同(例如，拷贝数，重量或摩尔浓度)的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的治疗效力的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，4-1BB激动剂抗体是抗体3H3或其抗原结合片段，或抗体utomilumab或其抗原结合片段。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与细胞中包含的IL-15多肽的量在数量上或功能上等同的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量在数量上相同的量(例如，拷贝数或摩尔浓度)。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-15多肽的量。
在一些实施方案中，第二外源多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分是融合多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3接头(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，和IL-15受体alphasushi结合域。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15受体alphasushi结合域连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)，任选地，其中接头包含(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，毒性包括肝毒性。在一些实施方案中，毒性包括血液毒性。在一些实施方案中，通过选自下组的肝毒性指标来测量肝毒性：IFNg的血清水平升高，ALT的血清水平升高，肝中浸润性巨噬细胞水平升高，肝中的浸润CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞水平升高，肝重量增加，肝炎症得分增加，嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低以及血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括血清干扰素gamma(IFNg)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示剂包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括肝或脾中浸润巨噬细胞水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示物包括肝中CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括增加的肝炎症得分。
在一些实施方案中，肝炎症评分是Ishak得分，如本文所述。
在一些实施方案中，如本文所述，使用小鼠肝毒性模型评估肝毒性。
在一些实施方案中，通过选自下组的血液毒性指标来测量血液毒性：嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低和血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，在全血样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血清样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血浆样品中测量血液毒性的指标。
在一些实施方案中，通过减轻的体重来测量毒性。
在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指示剂水平与施用之前的毒性指示剂水平进行比较。在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指标的水平与毒性指标的阈值或对照水平进行比较。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALT水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是血清ALT水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清AST水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是AST的血清水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALP水平确定。在一些实施方案中，肝毒性的指标是ALP的血清水平升高，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由淋巴细胞计数确定。在一些实施方案中，通过减少的淋巴细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过白细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的白细胞计数来鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，通过降低的血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。
在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的4-1BB激动剂抗体和分离的IL-15多肽相比，细胞表现出少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％的毒性。在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的4-1BB激动剂抗体和分离的IL-15多肽相比，细胞表现出少至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍的毒性。
在一些实施方案中，细胞能够刺激受试者中的免疫杀伤细胞。
在某些实施方案中，工程化红系细胞还包含一种或多种选自下组的外源刺激性多肽：IL-1，IL-2，IL-12，IL-18，IL-21，干扰素alpha(IFNα)，脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)，CD48，人白细胞抗原(HLA)-A，HLA-C，HLA-G，硫酸类肝素(HS)，HLA-E，CpG，免疫球蛋白G(IgG)，UL16结合蛋白(ULBP)，MHC I类链相关蛋白(MIC)，B7-H6，NkP44L，Nectin2，NK-T-B抗原(NTBA)，激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
在某些实施方案中，外源刺激性多肽不包含抗体或抗体片段，例如抗体的Fc部分。
核酸序列
在某些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞(例如工程化红系细胞前体细胞)，其包含编码如本文所述的外源刺激性多肽的核酸序列。在某些实施方案中，本发明提供了通过使用编码如本文所述的外源刺激性多肽的核酸序列制备的工程化红系细胞。例如，在一些实施方案中，红系细胞包含编码包含IL-15多肽，例如成熟人IL-15的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:13或SEQID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:13的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15多肽的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含IL-15RA多肽(例如成熟的细胞外人IL-15RA)的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15RA多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15Ra多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15RA多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:16的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15RA多肽的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的核酸序列组成。
在一个具体的实施方案中，编码外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的核酸序列。在一些实施方案中，编码外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:19的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:20的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码接头，例如(G4S)3接头(SEQ ID NO:12)的核酸序列。在一些实施方案中，编码接头的核酸序列包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的核酸序列。在一些实施方案中，编码接头的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:17的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码接头的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:18的序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含IL-15V3构建体的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15V3构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:28的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15V3构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15V3构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15V3构建体的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:28的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含IL-15/IL-15Ra V4构建体的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V4构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:30的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V4构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:30的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V4构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:30的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V4构建体的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:30的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含IL-15/IL-15Ra V5构建体的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V5构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:32的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V5构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:32的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V5构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:32的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15RaV5构建体的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:32的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含IL-15V3.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15V3.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:36的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15V3.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:36的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。编码包含IL-15V3.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:36的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。编码包含IL-15V3.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:36的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含IL-15/IL-15Ra V4.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V4.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:38的核酸序列。在一些实施方案中，编码IL-15/IL-15Ra V4.1构建体的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:38的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V4.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:38的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含IL-15/IL-15Ra V4.1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:38的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含4-1BBL多肽，例如人4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:42的核酸序列。在一些实施方案中，编码4-1BBL多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:42的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:42的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:42的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:44的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:44的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:44的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:44的核酸序列组成。
在一些实施方案中，编码外源刺激性多肽或其组分的核酸序列是密码子优化的(例如，为在人细胞中表达进行密码子优化的)。例如，在一些实施方案中，编码IL-15多肽，IL-15RA多肽，4-1BBL多肽和/或接头的核酸序列是密码子优化的。在其他实施方案中，编码外源刺激性多肽或其组分的核酸序列不是密码子优化的。例如，在一些实施方案中，编码IL-15多肽，IL-15RA多肽，4-1BBL多肽和/或接头的核酸序列不是密码子优化的。
包含IL-12的工程化红系细胞
在另一方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素12多肽或其片段(例如，IL-12受体结合片段)。在一些实施方案中，IL-12多肽是p40(IL-12 p40)多肽或其片段。在一些实施方案中，IL-12多肽是p35(IL-12p35)多肽或其片段。在一些实施方案中，IL-12多肽是p40-p35融合多肽(IL-12p40-p35)多肽或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
如本文全文所使用，在一个实施方案中，IL-12片段或IL-12多肽片段是指与IL-12受体结合的IL-12片段，即IL-12的IL-12受体结合片段。如本文全文所使用，在一个实施方案中，IL-12片段或IL-12多肽片段是指保留IL-12的生物学活性的IL-12片段。
在某些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含含有IL-12p40多肽或其片段的外源刺激性多肽：
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS(SEQ ID NO:45)。
在一些实施方案中，IL-12多肽包含IL-12 p40的变体，其与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-12 p40多肽由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中第一外源刺激性多肽包含白介素12 p35(IL-12 p35)多肽或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在某些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含含有IL-12p35多肽或其片段的外源刺激性多肽：
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ ID NO:47)。
在一些实施方案中，IL-12多肽包含IL-12 p35的变体，其与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-12 p40多肽由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素12 p40(IL-12 p40)多肽或其片段，以及白介素12 p35(IL-12 p35)多肽或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，IL-12 p40多肽和IL-12 p35多肽以复合物存在。在另一个实施方案中，IL-12 p40多肽和IL-12 p35多肽以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-12p40多肽通过接头与IL-12 p35多肽连接。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的成熟人IL-12p40多肽，以及包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成的IL-12p35多肽。在一些实施方案中，成熟的人IL-12p40多肽和IL-12p35多肽通过接头(例如，柔性接头)连接。可以使用本文所述的任何接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:75)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。接头由(GGGGS)n接头(SEQ ID NO:75)组成，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，接头包含氨基表3中列出的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:12)。在另一个具体的实施方案中，接头由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含通过柔性接头(SEQ ID NO:12)连接的成熟人IL-12p40(SEQ ID NO:45)和IL-12p35(SEQ ID NO:47)。
本领域技术人员已知的其他合适的接头可以用于连接IL-12 p40和IL-12p35多肽。在一些实施方案中，可用于本发明的接头长度为5至25个氨基酸，长度为5至20个氨基酸，长度为10至25个氨基酸，或长度为10至20个氨基酸。在一些实施方案中，可用于本发明的接头的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一个优选的实施方案中，接头是非免疫原性的。
在某些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含外源刺激性多肽，其包含通过接头与IL-12 p35多肽连接的IL-12 p40多肽或其片段：
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS(SEQ IDNO:57)。
在一些实施方案中，IL-12多肽包含IL-12 p40/IL-12 p35融合物的变体，其与SEQID NO:57的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，IL-12p40多肽由SEQ ID NO:57的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽的片段包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390，400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或510个氨基酸。在一些实施方案中，IL-12 p40/IL-12p35融合多肽的片段包含小于20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或510个氨基酸。在一些实施方案中，IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽的片段或变体保留野生型人IL-12结合IL-12受体的功能的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％，如通过本领域公知的测定法，例如ELISA，Biacore或共免疫沉淀测量。在一些实施方案中，IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽的片段或变体保留野生型人IL-12诱导IL-12介导的信号转导的功能的至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％，如通过本领域公知的测定法，例如电动性迁移测定法，ELISA和其他免疫测定法测量。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含IL-12多肽和信号肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽是包含IL-12多肽和信号肽的融合多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含信号肽，该信号肽包含表4所列的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。在一些实施方案中，该外源刺激性多肽包含信号肽，该信号肽包含GPA信号肽或由GPA信号肽组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含信号肽，该信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含包含SEQID NO:21的氨基酸序列的前导序列和白介素12(IL-12)多肽。
在一些实施方案中，包含IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽的外源刺激性多肽附着至红系细胞膜。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含IL-12p40/IL-12 p35融合多肽和将多肽锚定至红系细胞膜的锚定或跨膜域。在某些实施方案中，锚定或跨膜域与IL-12p40/IL-12 p35融合多肽异源。在某些实施方案中，锚定或跨膜域包含GPA或其跨膜部分或由GPA或其跨膜部分组成。在某些实施方案中，锚定或跨膜域包含SMIM1或其跨膜部分或由SMIM1或其跨膜部分组成。在一些实施方案中，锚定或跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)，转铁蛋白受体，Fas配体(FasL)，Kell或Band 3或其跨膜部分(例如，跨膜域)或由其组成。包含IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽的外源刺激性多肽可包含本文所述的任何锚定或跨膜域。
在一些实施方案中，包含IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽的外源刺激性多肽包含锚定或跨膜域，所述锚定或跨膜域包含如表2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的成熟人IL-12p40多肽，接头(例如，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的柔性接头)和锚定序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含(例如，从N末端到C末端)，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的锚定域，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的人IL-12 p40多肽，以及包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成的人IL-12 p35多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包括(例如，来自N-端至C端)，包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的锚域，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的接头(例如柔性接头)，包含由SEQID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的人IL-12 p40多肽，包含SEQID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的接头(例如，柔性接头)，和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成的人IL-12 p35多肽。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的锚定和IL-12多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的锚定和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的人IL-12 p40多肽和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成的人IL-12 p35多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含(例如，从N末端到C末端)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的锚定，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的人IL-12 p40多肽，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的接头(例如，柔性接头)，和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列或由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成的人IL-12 p35多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQID NO:55的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，相对于包含与包含GPA(或GPA跨膜部分(例如，GPA跨膜域))的锚定连接的IL-12多肽的外源刺激性多肽的细胞表面表达，包含与包含SMIM1(或SMIM1跨膜部分)的锚定连接的IL-12多肽的外源刺激性多肽表现出增加的细胞表面表达。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由SEQ ID NO:55的氨基酸序列组成。
IL-12和4-1BBL
工程化红系细胞可以包含第一外源刺激性多肽，其包含如本文所述的IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽和一种或多种其他外源刺激性多肽。例如，工程化红系细胞可以还包含第二外源刺激性多肽，其包含4-1BBL(4-1BB配体)多肽。因此，本发明还提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中第一外源刺激性多肽包含白介素12 p40(IL-12p40)多肽或其片段，以及白介素12 p35(IL-12p35)多肽或其片段(例如，IL-12 p40-p35融合多肽)，和第二外源刺激性多肽，其中第二外源刺激性多肽包含4-1BBL或其刺激性片段。
在某些实施方案中，4-1BBL为其天然三聚体形式。在进一步的实施方案中，本文所述的工程化红系细胞以其天然三聚体形式表达4-1BBL，其中天然三聚体形式对于工程化红系细胞的功效和活性是重要的。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含人4-1BBL，例如人4-1BBL的胞外部分。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽，该4-1BBL多肽包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含白介素12(IL-12)多肽，例如，包含SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的人IL-12 p40多肽和包含SEQ ID NO:47或由SEQ ID NO:47组成的人IL-12 p35多肽(例如，包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的IL-12 p40-p35融合多肽)。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含(例如，从N末端到C末端)包含SEQID NO:49的氨基酸序列或由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成的锚定(例如SMIL1锚定)，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的人IL-12 p40多肽，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的接头，和包含SEQ ID NO:47氨基酸序列或由SEQ ID NO:47氨基酸序列组成的人IL-12 p35多肽。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列或由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的人细胞外4-1BBL多肽，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的接头(例如4-1BBL接头)，和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的GPA锚定。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或由SEQ IDNO:55的氨基酸序列组成，并且第二外源刺激性多肽包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽由单个核酸分子编码，并最初表达为单个融合多肽，其中T2A跳跃肽(例如，SEQ ID NO:64)置于第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽之间。在一些实施方案中，包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的第二外源刺激性多肽由单个核酸分子编码，并最初表达为单个融合多肽，其中T2A跳跃肽(例如，SEQ ID NO:64)置于包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的外源刺激性多肽之间。2A跳跃肽或元件(例如T2A序列)的引入允许翻译后切割成两个单独的外源刺激性多肽(包含4-1BBL或IL-12多肽)(参见例如Liu et al.(2017)Sci.Rep.7(1):2193，通过引用整体并入本文)。根据某些实施方案，在翻译后切割之后，将包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的外源刺激性多肽锚定到红细胞表面。多个2A元件在本领域中是已知的，并且可以按本文所述使用，包括T2A，P2A，E2A和F2A(参见例如Liu等人，2017)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含含有GPA信号肽(SEQ ID NO:21)多肽，4-1BBL多肽(SEQ ID NO:41)，4-1BBL接头(SEQ ID NO:40)，GPA锚定(SEQ ID NO:25)，T2A跳跃肽(SEQ ID NO:64)，SMIM1锚定(SEQ ID NO:49)，接头(SEQ ID NO:12)，IL12 p40多肽(SEQID NO:45)，柔性接头(SEQ ID NO:12)和IL-12 p35多肽(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:62组成。在一些实施方案中，通过使用编码多肽的核酸来制备工程化红系细胞，所述核酸从5’至3’编码GPA信号肽(SEQ ID NO:21)，4-1BBL多肽(SEQ ID NO:41)，4-1BBL接头(SEQ ID NO:40)，GPA锚定(SEQID NO:25)，T2A跳跃肽(SEQ ID NO:64)，SMIM1锚定(SEQ ID NO:49)，接头(SEQ ID NO:12)，IL12 p40多肽(SEQ ID NO:45)，柔性接头(SEQ ID NO:12)和IL-12 p35多肽(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:62的多肽。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:63或由SEQ ID NO:63组成。
在某些实施方案中，包含IL-12的第一外源刺激性多肽和包含4-1BBL的第二外源刺激性多肽的组合产生协同应答(例如，在免疫杀伤细胞活化期间)。例如，当在红系细胞上表达时，与单独的任意刺激性多肽的作用相比，各包含IL-12或4-1BBL的外源刺激性多肽可共同起作用，以产生更强大的免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+ T细胞)活化。在本文提供的实施例中证明了此类协同活性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含第一和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12多肽或其片段，其中第二外源刺激性多肽包含4-1BB，并且其中第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽离体或体内以协同活性刺激免疫杀伤细胞。在一个实施方案中，第一外源刺激性多肽以融合蛋白，且例如在细胞表面处包含IL-12 p40/IL-12 p35。
在另一个实施方案中，工程化红系细胞可以包含第一外源刺激性多肽，其包含如本文所述的IL-12 p40/IL-12 p35融合多肽和一个或多个其他外源刺激性多肽。例如，工程化红系细胞可以还包含选自下组的第二外源刺激性多肽：IL-15多肽或其片段和IL-15RA的胞外部分或其片段。因此，本发明还提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中第一外源刺激性多肽包含白介素12 p40(IL-12 p40)多肽或其片段和白介素12 p35(IL-12 p35)多肽或其片段(例如，IL-12 p40-p35融合多肽)，和第二外源刺激性多肽，其中第二外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段和IL-15RA的胞外部分或其片段(例如，IL-15/IL-15RA融合多肽)。
在某些实施方案中，包含IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的组合产生协同应答(例如，在免疫杀伤细胞活化期间)。例如，当在红系细胞上表达时，与单独的任意刺激性多肽的作用相比，各包含IL-12或IL-15/IL-15RA的外源刺激性多肽可共同起作用，以产生更强大的免疫杀伤细胞(例如NK细胞和/或CD8+ T细胞)活化。在本文提供的实施例中证明了此类协同活性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含第一和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12多肽或其片段，其中第二外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA，并且其中第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽离体或体内以协同活性刺激免疫杀伤细胞。在一个实施方案中，第一外源刺激性多肽以融合蛋白，且例如在细胞表面处包含IL-12 p40/IL-12p35。
IL-12毒性
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含含有IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，其中所述细胞能够刺激免疫杀伤细胞，并且其中在施用于受试者后与分离的IL-12多肽相比细胞具有更高的治疗指数(TI)。在一些实施方案中，在施用于受试者后与分离的IL-12多肽相比，细胞具有高至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的治疗指数。在一些实施方案中，在施用于受试者后与分离的IL-12多肽相比，细胞具有高至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或10倍的治疗指数。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含含有IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，其中在施用于受试者后与分离的IL-12多肽相比，所述细胞表现出更小的毒性。
在一些实施方案中，分离的多肽，例如IL-12多肽，IL-15多肽或4-1BB激动剂抗体，是指重组的多肽。在一些实施方案中，分离的多肽，例如IL-12多肽，IL-15多肽或4-1BB激动剂多肽(例如4-1BB激动剂抗体)，是指不在细胞中、不在细胞表面中、不在细胞表面上和/或不与细胞缀合的多肽。
在一些实施方案中，与等同量的分离的IL-12多肽相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与细胞中所包含的IL-12多肽的量在数量上或功能上等同的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量在数量上相同的量(例如，拷贝数，重量或摩尔浓度)。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与包含IL-12多肽的工程化红系细胞相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与包含IL-12多肽的工程化红系细胞相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量
在一些实施方案中，IL-12多肽包含p40多肽和p35多肽。
在一些实施方案中，毒性包括肝毒性。在一些实施方案中，毒性包括血液毒性。在一些实施方案中，通过选自下组的肝毒性指标来测量肝毒性：IFNg的血清水平升高，ALT的血清水平升高，肝中浸润性巨噬细胞水平升高，肝中的浸润CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞水平升高，肝重量增加，肝炎症得分增加，嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低以及血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括血清干扰素gamma(IFNg)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示剂包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括肝或脾中浸润巨噬细胞水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示物包括肝中CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括增加的肝炎症得分。
在一些实施方案中，肝炎症评分是Ishak得分，如本文所述。
在一些实施方案中，如本文所述，使用小鼠肝毒性模型评估肝毒性。
在一些实施方案中，通过选自下组的血液毒性指标来测量血液毒性：嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低和血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，在全血样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血清样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血浆样品中测量血液毒性的指标。
在一些实施方案中，通过减轻的体重来测量毒性。
在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指示剂水平与施用之前的毒性指示剂水平进行比较。在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指标的水平与毒性指标的阈值或对照水平进行比较。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALT水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是血清ALT水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清AST水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是AST的血清水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALP水平确定。在一些实施方案中，肝毒性的指标是ALP的血清水平升高，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由淋巴细胞计数确定。在一些实施方案中，通过减少的淋巴细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过白细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的白细胞计数来鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，通过降低的血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。
在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的IL-12多肽相比，细胞表现出少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％的毒性。在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的IL-12多肽相比，细胞表现出少至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍的毒性。
在一些实施方案中，细胞能够刺激受试者中的免疫杀伤细胞。
IL-12和4-1BBL毒性
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽，并且所述第二外源刺激性多肽包含IL-12多肽，其中所述细胞能够刺激免疫杀伤细胞，并且其中在施用于受试者后，与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-12多肽或其组合相比，细胞具有更高的治疗指数(TI)。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-12多肽或其组合相比，细胞具有高至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的治疗指数。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-12多肽或其组合相比，细胞具有高至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或10倍的治疗指数。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽，并且所述第二外源刺激性多肽包含IL-12多肽，其中在施用于受试者后，与分离的4-1BBL激动剂抗体，分离的IL-12多肽或其组合相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与等同量的分离的4-1BBL激动剂抗体，等同量的分离的IL-12多肽或其组合相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是与细胞中所包含的4-1BBL多肽的量等同的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量等同(例如，拷贝数，重量或摩尔浓度)的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的治疗效力的分离的4-1BB激动剂抗体的量。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂抗体是抗体3H3或其抗原结合片段，或抗体utomilumab或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与细胞中所包含的IL-12多肽的量在数量上或功能上等同的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量在数量上相同的量(例如，拷贝数或摩尔浓度)。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量。在一些实施方案中，IL-12多肽包含p40多肽和p35多肽。
在一些实施方案中，毒性包括肝毒性。在一些实施方案中，毒性包括血液毒性。在一些实施方案中，通过选自下组的肝毒性指标来测量肝毒性：IFNg的血清水平升高，ALT的血清水平升高，肝中浸润性巨噬细胞水平升高，肝中的浸润CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞水平升高，肝重量增加，肝炎症得分增加，嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低以及血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括血清干扰素gamma(IFNg)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示剂包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括肝或脾中浸润巨噬细胞水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示物包括肝中CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括增加的肝炎症得分。
在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的4-1BBL多肽和分离的IL-12多肽相比，细胞表现出少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％的毒性。在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的4-1BBL多肽和分离的IL-12多肽相比，细胞表现出少至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍的毒性。
在一些实施方案中，细胞能够刺激受试者中的免疫杀伤细胞。
IL-12和IL-15毒性
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12多肽，并且所述第二外源刺激性多肽包含IL-15多肽，其中所述细胞能够刺激免疫杀伤细胞，并且其中在施用于受试者后，与分离的IL-12多肽，分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞具有更高的治疗指数(TI)。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与分离的IL-12多肽，分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞具有高至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的治疗指数。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与分离的IL-12多肽，分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞具有高至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍或10倍的治疗指数。
在一些方面，本公开提供了工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12多肽，并且所述第二外源刺激性多肽包含IL-15多肽，其中在施用于受试者后，与分离的IL-12多肽，分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，在施用于受试者后，与等同量的分离的IL-12多肽，等同量的分离的IL-15多肽或其组合相比，细胞表现出更小的毒性。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与细胞中所包含的IL-12多肽的量在数量或功能上等同的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量在数量上相同的量(例如，拷贝数或摩尔比)。在一些实施方案中，IL-12多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量。
在一些实施方案中，IL-12多肽包含p40多肽和p35多肽。
在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与细胞中包含的IL-15多肽的数量上或功能上等同的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量在数量上相同的量(例如，拷贝数或摩尔浓度)。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-15多肽的量。
在一些实施方案中，第二外源多肽包含IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分是融合多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3接头(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15受体alphasushi结合域连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)，任选地，其中接头包含(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，毒性包括肝毒性。在一些实施方案中，毒性包括血液毒性。在一些实施方案中，通过选自下组的肝毒性指标来测量肝毒性：IFNg的血清水平升高，ALT的血清水平升高，肝中浸润性巨噬细胞水平升高，肝中的浸润CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞水平升高，肝重量增加，肝炎症得分增加，嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低以及血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括血清干扰素gamma(IFNg)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示剂包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括肝或脾中浸润巨噬细胞水平升高。在一些实施方案中，肝毒性的指示物包括肝中CD8+T细胞或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的浸润增加。在一些实施方案中，肝毒性的指标包括增加的肝炎症得分。
在一些实施方案中，肝炎症评分是Ishak得分，如本文所述。
在一些实施方案中，如本文所述，使用小鼠肝毒性模型评估肝毒性。
在一些实施方案中，通过选自下组的血液毒性指标来测量血液毒性：嗜中性粒细胞计数降低，淋巴细胞计数降低，单核细胞计数降低和血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，在全血样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血清样品中测量血液毒性的指标。在一些实施方案中，在血浆样品中测量血液毒性的指标。
在一些实施方案中，通过减轻的体重来测量毒性。
在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指示剂水平与施用之前的毒性指示剂水平进行比较。在一些实施方案中，将施用细胞后在受试者中测量的毒性指标的水平与毒性指标的阈值或对照水平进行比较。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALT水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是血清ALT水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清AST水平确定。在一些实施方案中，如本文所述，肝毒性的指标是AST的血清水平升高。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由血清ALP水平确定。在一些实施方案中，肝毒性的指标是ALP的血清水平升高，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述，毒性指标由淋巴细胞计数确定。在一些实施方案中，通过减少的淋巴细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的红细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过白细胞计数鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过减少的白细胞计数来鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，如本文所述，通过血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。在一些实施方案中，通过降低的血红蛋白水平鉴定血液毒性的指标。
在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的IL-12多肽和分离的IL-15多肽相比，细胞表现出少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％的毒性。在一些实施方案中，施用于受试者后，与分离的IL-12多肽和分离的IL-15多肽相比，细胞表现出少至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍的毒性。
在一些实施方案中，细胞能够刺激受试者中的免疫杀伤细胞。
编码IL-12多肽的核酸序列
在某些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其包含编码包含如本文所述的IL-12多肽的外源刺激性多肽的核酸序列。在某些实施方案中，本发明提供了工程化红系细胞，其通过使用(例如，对红系前体细胞引入)编码包含如本文所述的IL-12的外源刺激性多肽的核酸序列制备。例如，在一些实施方案中，红系细胞包含编码包含IL-12 p40多肽的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-12 p40多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:46的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-12 p40多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:46的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。因此，编码包含IL-12 p40多肽的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:46的核酸序列组成。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含编码包含IL-12 p35多肽的外源刺激性多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-12 p35多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:48的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-12 p35多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:48的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。编码包含IL-12 p35多肽的外源刺激性多肽的核酸序列由SEQ ID NO:48的核酸序列组成。
在一个具体的实施方案中，编码包含IL-12多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:58的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-12多肽的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:58的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方案中，核酸序列编码包含IL-12 V1构建体的外源刺激性多肽。在一个具体的实施方案中，编码包含IL-12 V1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:54的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-12 V1构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:54的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方案中，核酸序列编码包含IL-12 V2构建体的外源刺激性多肽。在一个具体的实施方案中，编码包含IL-12 V2构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:56的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含IL-12 V2构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:56的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方案中，核酸序列编码包含4-1BBL-T2A-IL-12构建体的外源刺激性多肽。在一个具体的实施方案中，编码包含4-1BBL-T2A-IL-12构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:63的核酸序列。在一些实施方案中，编码包含4-1BBL-T2A-IL-12构建体的外源刺激性多肽的核酸序列包含核酸序列，其与SEQ ID NO:63的核酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。
各种方法和软件程序可用于确定两个或更多个肽或核酸之间的同源性，例如NCBIBLAST，Clustal W，MAFFT，Clustal Omega，AlignMe，Praline或另一种合适的方法或算法。在一些实施方案中，同一性百分比由FastDB基于以下参数计算：错配罚分1；缺口罚分1；缺口大小罚分0.33；和连接罚分30。
有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对，从一组相关序列中创建多序列比对。它还可以绘制树，其显示用于创建比对的聚类关系。有用的PILEUP参数包括默认缺口权重3.00，默认缺口长度权重0.10和加权末端缺口。
有用算法的另一个实例是BLAST算法。BLAST程序的一个有用实例是WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其中大多数设置为默认值。可调参数设置为以下值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和要搜索目标序列的特定数据库的组成来建立；但是，可以调整这些值以增加灵敏度。
另一个有用的算法是有缺口的BLAST。有缺口的BLAST使用BLOSUM-62替换得分；阈值T参数设置为9；触发有缺口的延伸的二命中方法，将缺口长度k要求10+k的代价；Xu设置为16，对于数据库搜索阶段，Xg设置为40，对于算法的输出阶段，Xg设置为67。有缺口的比对由对应于约22位的得分触发。
另一个有用的工具是Clustal，用于多重序列比对的一系列常用计算机程序。Clustal的最新版本包括ClustalW，ClustalX和Clustal Omega。使用Clustal方法进行配对比对和蛋白质序列同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5和保存的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2，缺口罚分＝5，窗口＝4和保存的对角线＝4。
多肽和核酸
一方面，本公开提供了本文所述的分离的外源刺激性多肽。在一些实施方案中，外源刺激性多肽包含氨基酸序列，其与本文所述的外源刺激性多肽的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，多肽包含信号序列。在一些实施方案中，多肽缺乏信号序列。在一些实施方案中，外源刺激性多肽是重组产生的。产生重组蛋白的方法是本领域已知的并且在本文中描述。
在另一方面，本公开提供了编码本文描述的外源多肽的核酸(例如，DNA或RNA(例如，mRNA))。在一些实施方案中，对核酸进行密码子优化以在期望细胞类型(例如细菌或哺乳动物细胞)中表达。
多肽拷贝数
本领域技术人员将理解，重组DNA技术的使用可通过操作例如宿主细胞内核酸分子的拷贝数来改善转染的核酸分子表达的控制。
如本文中所讨论的，在一方面，本公开特征为工程化改造为刺激免疫细胞的红系细胞，其中该免疫细胞是免疫杀伤细胞，其包含足以刺激该免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。在一些实施方案中，红系细胞包含第一外源刺激性多肽和第二外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞至少包含第一外源刺激性多肽，第二外源多肽和第三外源刺激性多肽。在一些实施方案中，至少一种外源多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽以比第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,21％,22％,23％,24％,25％,26％,27％,28％,29％,30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％，或大不超过2,5,10,20,50,100,200,500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽以比第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,21％,22％,23％,24％,25％,26％,27％,28％,29％,30％,31％,32％,33％,34％,35％,36％,37％,38％,39％,40％,41％,42％,43％,44％,45％,46％,47％,48％,49％,50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％，或大不超过2,5,10,20,50,100,200,500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，按重量计或按拷贝数计，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽的丰度比为约1:1，约2:1至1:2，约5:1至1:5，约10:1至1:10，约20:1至1:20，约50:1至1:50，或约100:1至1:100。在一些实施方案中，第一外源多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第一外源多肽，例如约50,000,60,000,60,000,80,000,90,000,100,000,110,000,120,000,130,000,140,000,150,000,155,000,160,000,165,000,170,000,175,000,180,000,185,000,190,000,195,000,200,000,205,000,210,000,215,000,220,000,225,000,230,000,235,000,240,000,245,000,250,000,255,000,260,000,265,000,270,000,275,000,280,000,285,000,290,000,295,000,300,000,305,000,310,000,315,000,320,000,325,000,330,000,335,000,340,000,345,000,350,000,355,000,360,000,365,000,370,000,375,000,380,000,385,000,390,000,395,000,400,000,450,000,500,000,550,000,600,000个拷贝的第一多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000之间，约100,000-600,000之间，约100,000-500,000之间，约100,000-400,000之间，约100,000-150,000之间，约150,000-300,000之间或150,000-200,000之间的第一外源多肽的拷贝。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，第二外源多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第二外源多肽，例如约50,000,60,000,60,000,80,000,90,000,100,000,110,000,120,000,130,000,140,000,150,000,155,000,160,000,165,000,170,000,175,000,180,000,185,000,190,000,195,000,200,000,205,000,210,000,215,000,220,000,225,000,230,000,235,000,240,000,245,000,250,000,255,000,260,000,265,000,270,000,275,000,280,000,285,000,290,000,295,000,300,000,305,000,310,000,315,000,320,000,325,000,330,000,335,000,340,000,345,000,350,000,355,000,360,000,365,000,370,000,375,000,380,000,385,000,390,000,395,000,400,000,450,000,500,000,550,000,600,000个拷贝的第二多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000之间，约100,000-600,000之间，约100,000-500,000之间，约100,000-400,000之间，约100,000-150,000之间，约150,000-300,000之间或150,000-200,000之间的第二外源多肽的拷贝。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第二外源多肽。
如本文所述，在另一方面，本公开的特征在于工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段，以及白介素15受体alpha(IL-15RA)多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在另一方面，本公开的特征在于工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含4-1BBL多肽或其片段。在另一方面，本公开的特征在于工程化红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12多肽或其片段。
在上述方面的一些实施方案中，工程化红系细胞还包含一种或多种另外的外源刺激性多肽(例如，4-1BBL和IL-15/IL-15RA，4-1BBL和IL-12或IL-12和IL-15/IL-15RA)。
在以上方面的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在以上方面和实施方案的一些实施方案中，第一外源刺激性多肽以大于104，105或106的拷贝数存在。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽以比第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽以比第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，按重量计或按拷贝数计，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽的丰度比为约1:1，约2:1至1:2，约5:1至1:5，约10:1至1:10，约20:1至1:20，约50:1至1:50，或约100:1至1:100。在一些实施方案中，第一外源多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第一外源多肽，例如约50,000,60,000,60,000,80,000,90,000,100,000,110,000,120,000,130,000,140,000,150,000,155,000,160,000,165,000,170,000,175,000,180,000,185,000,190,000,195,000,200,000,205,000,210,000,215,000,220,000,225,000,230,000,235,000,240,000,245,000,250,000,255,000,260,000,265,000,270,000,275,000,280,000,285,000,290,000,295,000,300,000,305,000,310,000,315,000,320,000,325,000,330,000,335,000,340,000,345,000,350,000,355,000,360,000,365,000,370,000,375,000,380,000,385,000,390,000,395,000,400,000,450,000,500,000,550,000,600,000个拷贝的第一多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000之间，约100,000-600,000之间，约100,000-500,000之间，约100,000-400,000之间，约150,000-300,000之间，约100,000-150,000之间或150,000-200,000之间第一外源多肽的拷贝。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，第二外源多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第二外源多肽，例如约50,000,60,000,60,000,80,000,90,000,100,000,110,000,120,000,130,000,140,000,150,000,155,000,160,000,165,000,170,000,175,000,180,000,185,000,190,000,195,000,200,000,205,000,210,000,215,000,220,000,225,000,230,000,235,000,240,000,245,000,250,000,255,000,260,000,265,000,270,000,275,000,280,000,285,000,290,000,295,000,300,000,305,000,310,000,315,000,320,000,325,000,330,000,335,000,340,000,345,000,350,000,355,000,360,000,365,000,370,000,375,000,380,000,385,000,390,000,395,000,400,000,450,000,500,000,550,000,600,000个拷贝的第二多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000之间，约100,000-600,000之间，约100,000-500,000之间，约100,000-400,000之间，约150,000-300,000之间，约100,000-150,000之间或150,000-200,000之间的第二外源多肽的拷贝数。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第二外源多肽。
如本文所述，在另一方面，本公开的特征在于工程化红系细胞，其包含至少一种选自下组的外源刺激性多肽：MHC I类链相关蛋白A(MICA)，MHC I类链相关蛋白B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。在一些实施方案中，红系细胞至少包括第一外源刺激性多肽和第二外源多肽。在一些实施方案中，外源多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽以比第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，第二外源刺激性多肽以比第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。在一些实施方案中，按重量计或按拷贝数计，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽的丰度比为约1:1，约2:1至1:2，约5:1至1:5，约10:1至1:10，约20:1至1:20，约50:1至1:50，或约100:1至1:100。在一些实施方案中，第一外源多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第一外源多肽，例如约50,000,60,000,60,000,80,000,90,000,100,000,110,000,120,000,130,000,140,000,150,000,155,000,160,000,165,000,170,000,175,000,180,000,185,000,190,000,195,000,200,000,205,000,210,000,215,000,220,000,225,000,230,000,235,000,240,000,245,000,250,000,255,000,260,000,265,000,270,000,275,000,280,000,285,000,290,000,295,000,300,000,305,000,310,000,315,000,320,000,325,000,330,000,335,000,340,000,345,000,350,000,355,000,360,000,365,000,370,000,375,000,380,000,385,000,390,000,395,000,400,000,450,000,500,000,550,000,600,000个拷贝的第一多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000之间，约100,000-600,000之间，约100,000-500,000之间，约100,000-400,000之间，约150,000-300,000之间，约100,000-150,000之间或150,000-200,000之间的第一外源多肽的拷贝。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，第二外源多肽包含约50,000至约600,000个拷贝的第二外源多肽，例如约50,000,60,000,60,000,80,000,90,000,100,000,110,000,120,000,130,000,140,000,150,000,155,000,160,000,165,000,170,000,175,000,180,000,185,000,190,000,195,000,200,000,205,000,210,000,215,000,220,000,225,000,230,000,235,000,240,000,245,000,250,000,255,000,260,000,265,000,270,000,275,000,280,000,285,000,290,000,295,000,300,000,305,000,310,000,315,000,320,000,325,000,330,000,335,000,340,000,345,000,350,000,355,000,360,000,365,000,370,000,375,000,380,000,385,000,390,000,395,000,400,000,450,000,500,000,550,000,600,000个拷贝的第二种多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000-600,000之间，约100,000-600,000之间，约100,000-500,000之间，约100,000-400,000之间，约150,000-300,000之间，约100,000-150,000之间或150,000-200,000之间第二外源多肽的拷贝数。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第二外源多肽。
体内半衰期
在一些实施方案中，本文所述的外源多肽当包含在工程化红系细胞或去核细胞之中或之上并施用于受试者时，与单独施用的相应外源多肽(例如，不在本文描述的细胞之上或之中)相比表现出延长的体内半衰期。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期长于单独施用的相应外源多肽的体内半衰期，或单独施用的外源多肽的相应聚乙二醇化形式的体内半衰期。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期为约24小时至240天(例如24小时、36小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32,天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天、100天、101天、102天、103天、104天、105天、106天、107天、108天、109天、110天、111天、112天、113天、114天、115天、116天、117天、118天、119天、120天、121天、122天、123天、124天、125天、126天、127天、128天、129天、130天、131天、132,天、133天、134天、135天、136天、137天、138天、139天、140天、141天、142天、143天、144天、145天、146天、147天、148天、149天、150天、151天、152天、153天、154天、155天、156天、157天、158天、159天、160天、161天、162天、163天、164天、165天、166天、167天、168天、169天、170天、171天、172天、173天、174天、175天、176天、177天、178天、179天、180天、181天、182天、183天、184天、185天、186天、187天、188天、189天、190天、191天、192天、193天、194天、195天、196天、197天、198天、919天、200天、201天、202天、203天、204天、205天、206天、207天、208天、209天、210天、211天、212天、213天、214天、215天、216天、217天、218天、219天、220天、221天、222天、223天、224天、225天、226天、227天、228天、229天、230天、231天、232,天、233天、234天、235天、236天、237天、238天、239天、或240天。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期大于1天、2天、3天、5天、10天、25天、50天、75天、100天、125天、150天、175天、200天、225天、235天或250天。在一些实施方案中，外源多肽的体内半衰期为1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长。
在一些实施方案中，本公开的去核细胞(例如网织红细胞，红细胞或血小板)在施用于受试者后在循环中驻留至少约1天至约240天(例如，至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天、100天、101天、102天、103天、104天、105天、106天、107天、108天、109天、110天、111天、112天、113天、114天、115天、116天、117天、118天、119天、120天、121天、122天、123天、124天、125天、126天、127天、128天、129天、130天、131天、132天、133天、134天、135天、136天、137天、138天、139天、140天、141天、142天、143天、144天、145天、146天、147天、148天、149天、150天、151天、152天、153天、154天、155天、156天、157天、158天、159天、160天、161天、162天、163天、164天、165天、166天、167天、168天、169天、170天、171天、172天、173天、174天、175天、176天、177天、178天、179天、180天、181天、182天、183天、184天、185天、186天、187天、188天、189天、190天、191天、192天、193天、194天、195天、196天、197天、198天、199天、200天、201天、202天、203天、204天、205天、206天、207天、208天、209天、210天、211天、212天、213天、214天、215天、216天、217天、218天、219天、220天、221天、222天、223天、224天、225天、226天、227天、228天、229天、230天、231天、232天、233天、234天、235天、236天、237天、238天、239天、或240天。
免疫杀伤细胞的刺激
如本文所述，本发明提供了能够刺激免疫细胞的工程化红系细胞，包括例如溶细胞性T细胞(CD8+细胞)，记忆性CD8+T细胞，T辅助细胞(CD4+细胞)和NK细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。免疫细胞的刺激可以增强正常的细胞功能，或在异常细胞中引发正常的细胞功能。在一个优选的实施方案中，本发明提供了能够刺激免疫杀伤细胞的工程化红系细胞。可以被刺激的免疫杀伤细胞包括例如溶细胞性T细胞(CD8+细胞)，记忆CD8+T细胞和NK细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，NK细胞是记忆样NK细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是记忆T细胞。因此，本发明还提供了源自用本文所述的工程化红系细胞刺激的细胞群体。
本发明的特征是，在一些实施方案中，工程化红系细胞能够同时刺激超过一种类型的免疫杀伤细胞，例如，超过一种溶细胞性T细胞(CD8+细胞)，记忆CD8+T细胞和NK细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞能够刺激CD8+T细胞和NK细胞两者。本发明的发现是包含外源刺激性多肽的工程化红系细胞诱导原代CD4+，CD8+，NK和NKT细胞的有效激活，并诱导NK细胞的细胞毒性，所述外源刺激性多肽包含IL-12,IL-15/IL-15RA,4-1BBL或其组合，例如4-1BBL和IL-15/IL-15RA,4-1BBL和IL-12或IL-12和IL-15/IL-15RA。
在一些实施方案中，刺激免疫杀伤细胞是指免疫杀伤细胞的扩充。在一些实施方案中，刺激免疫杀伤细胞是指免疫杀伤细胞的活化。在一些实施方案中，刺激免疫杀伤细胞是指免疫杀伤细胞的细胞毒性增加。
在某些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞足以离体刺激免疫杀伤细胞。在其他实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞足以在体内刺激免疫杀伤细胞。
NK细胞活化和扩充
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞能够活化NK细胞。
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞能够扩充NK细胞。
脱粒/细胞毒性
NK细胞的定义性功能特征仍然是其在没有事先敏化的情况下对细胞靶物进行“天然杀伤”的固有能力。
因此，在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞能够活化和扩充NK细胞，从而与对照NK细胞相比，被本文所述的工程化红系细胞活化和扩充的NK细胞表现出更高的脱粒活性。例如，脱粒活性可以通过确定CD107a表达来估计，例如通过流式细胞术。CD107a表面表达与脱粒和细胞毒性颗粒的释放密切相关。如通过CD107a表达测量的脱粒与效应细胞，例如NK细胞的细胞毒性活性相关。通过确定CD107a表达来确定脱粒活性的方法是本领域技术人员公知的。参见例如Alter G,Malenfant J M,Altfeld M.CD107a as afunctional marker for the identification of natural killer cell activity.JImmunol Methods.2004；294:15-22，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，与非扩充的NK细胞相比，通过使用本发明的工程化红系细胞获得的扩充和活化的NK细胞具有至少约50％，约60％，约70％，约80％或约90％的增加的细胞毒性，例如，如通过脱粒活性测量。在一些实施方案中，与非扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约100％增加的细胞毒性。在一些实施方案中，与非扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约200％增加的细胞毒性。在一些实施方案中，与非离体扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约300％增加的细胞毒性。在一些实施方案中，与非离体扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约400％的增加的细胞毒性。
在一些实施方案中，与非扩充的NK细胞相比，通过使用本发明的工程化红系细胞扩充和活化的NK细胞具有至少约50％，约60％，约70％，约80％或约90％的增加的脱粒活性。在一些实施方案中，与非扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约100％增加的脱粒活性。在一些实施方案中，与非扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约200％增加的脱粒活性。在一些实施方案中，与非离体扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约300％增加的脱粒活性。在一些实施方案中，与非离体扩充的NK细胞相比，扩充和活化的NK细胞具有至少约400％增加的脱粒活性。
NK细胞成熟和活化的标志物
人NK细胞在表型上以CD56的表达和不存在CD3为特征，并且可以进一步细分为CD56bright群体和CD56dim群体。CD56bright群体产生免疫调节细胞因子，包括干扰素-γ(IFNγ)，肿瘤坏死因子-beta(TNF-B)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，IL-10和IL-13(4)。CD56dim子集是CD56bright群体的终末分化后代，并且主要负责发挥溶细胞功能。然而，在通过NKp30活化受体的NKp46触发细胞后或用IL-2，IL-12和IL-15的组合刺激后，CD56dim NK细胞可以产生细胞因子，特别是IFNγ。
在一些实施方案中，可以使用例如流式细胞方法检测NK细胞成熟和/或活化的各种标志物。例如，NK细胞的经典标志物是活化受体FcγRIII，也称为CD16。
NK细胞的活化导致含有穿孔蛋白和各种粒酶的细胞毒性颗粒的释放，并导致细胞因子的产生，最主要是干扰素-γ(IFNγ)。此外，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族的死亡诱导配体，如Fas配体(FasL)和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)在细胞表面的表达也通过与靶细胞上的死亡受体(DR)，即Fas，DR4(TRAIL-RI)和DR5(TRAIL-RII)结合而驱动胱天蛋白酶酶促级联的激活。
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞活化受体(例如，表5中列出的活化受体)上调至少约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约100％，约150％，约200％，约300％或更多。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞活化受体上调至少约75％。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞活化受体上调至少约100％。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞活化受体上调至少约200％。
根据另一个实施方案，本文所述的工程化红系细胞下调至少一种NK细胞受体，例如抑制性受体或趋化因子受体(例如CCR7)的表达。例如，某些NK细胞抑制性受体被称为KIR(杀伤抑制受体或CD158)。抑制性受体的非限制性实例是抑制性杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)，GL183，KIR2DL 1，Lir-1，NKB1和NKG2A。
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞抑制性受体(例如，表5中列出的抑制性受体)下调至少约20％，约30％，约40％，约50％，约60％。％，约70％，约80％，约90％，约100％，约150％，约200％，约300％或更多。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞抑制受体下调至少约75％。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞抑制受体下调至少约100％。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞将至少一种NK细胞抑制受体下调至少约200％。
受体表达的变化可以通过平均荧光强度(MFI)比率来计算：
MFI第X天/MFI第0天
其中x是NK细胞扩充的天数。
当X天样品的MFI高于第0天时，MFI比率将高于1，这指示该受体的相对上调程度。因此，例如，MFI比率1.5将意味着特定受体的50％上调。MFI比率的计算是本领域技术人员公知的。
在下文表5中显示了各种NK细胞活化或抑制受体。
表5
Figure BDA0002760528960001091
Figure BDA0002760528960001101
表5中的缩写：ACT，活化；BAT-3，HLA-B相关的转录物3；H，人；HA，血凝素；HLA，人白细胞抗原；INHIB，抑制性；KIR，杀伤性免疫球蛋白样受体；KLRG1，杀伤细胞凝集素样受体G1；LILR，白细胞免疫球蛋白样受体；M，小鼠；MHC，主要组织相容性复合体；MULT-1，小鼠UL16结合样转录物1；NCR，天然细胞毒性受体；NK，天然杀伤；PVR，脊髓灰质炎病毒受体；RAE-1，视黄酸早期转录物-1。
CD8+T细胞活化和扩充
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞能够活化CD8+T细胞。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞能够扩充CD8+T细胞。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞能够活化和扩充CD8+T细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
T细胞的活化和扩充可以通过如本文所述的各种测定法进行测量。例如，可以测量的T细胞活性包括诱导T细胞增殖，诱导T细胞中的信号传导，诱导T细胞中活化标志物的表达，诱导T细胞分泌细胞因子，以及T细胞的细胞毒性活性。例如，在某些实施方案中，通过增殖测定法测量CD8+T细胞活化。
细胞因子分泌
可以通过确定诸如gamma干扰素(IFNγ)，肿瘤坏死因子alpha(TNFa)，白介素-12(IL-12)或白介素2(IL-2)的细胞因子的分泌评估或测量本发明的工程化红系细胞对CD8+T细胞的活化。在一些实施方案中，ELISA用于确定细胞因子的分泌，例如γ干扰素(IFNγ)，肿瘤坏死因子α(TNFa)，白介素12(IL-12)或白介素2(IL-2)的分泌。ELISPOT(酶联免疫斑点)技术可用于检测响应于本文所述的工程化红系细胞的刺激而分泌给定细胞因子(例如，gamma干扰素(IFNγ))的T细胞。将T细胞与工程化红系细胞一起培养在已用抗IFNγ抗体包被的孔中。分泌性IFNγ被包被的抗体捕获，然后用与发色底物偶联的二抗显示。因此，局部分泌性细胞因子分子形成斑点，每个斑点对应于1个分泌IFNγ的细胞。斑点的数量允许确定分析样品中分泌IFNγ的细胞的频率。还描述了ELISPOT测定法用于检测肿瘤坏死因子alpha，白介素4(IL-4)，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和分泌粒酶B的淋巴细胞(Klinman D,Nutman T.Current protocols in immunology.New York,N.Y:John Wiley&Sons,Inc.；1994.第6.19.1–6.19.8页，其通过引用完整并入本文)。
细胞内细胞因子的流式细胞术分析可用于测量培养物上清液中的细胞因子含量，但未提供有关实际分泌细胞因子的T细胞数量的信息。当用分泌抑制剂如莫能菌素或布雷菲德菌素A(brefeldin A)处理T细胞时，它们在(例如用本发明的工程化红系细胞)活化后在其细胞质内积聚细胞因子。淋巴细胞固定并透化后，可通过细胞计数法定量细胞内细胞因子。该技术允许确定产生的细胞因子，产生这些细胞因子的细胞类型以及每个细胞产生的细胞因子的数量。
细胞毒性
可通过测定CD8+T细胞的细胞毒性活性来评估本发明的工程化红系细胞对CD8+T细胞的活化。
T细胞的细胞毒性活性可以通过本领域技术人员已知的任何合适的技术来评估。例如，可以在标准的细胞毒性测定法中在适当的时间段之后测定包含已经暴露于根据本发明的工程化红系细胞的T细胞的样品的细胞毒性活性。此类测定法可以包括但不限于本领域已知的铬释放CTL测定法和Alamar BlueTM荧光测定法。
增殖/扩充
可以通过使用CFSE染色来评估本发明的工程化红系细胞扩充T细胞的能力。将工程化红系细胞与CD8+T细胞(例如来自患有疾病或病症(例如癌症)的受试者)混合。为了比较细胞扩充的初始速率，对细胞进行CFSE染色，以确定工程化红系细胞如何良好地诱导T细胞的增殖。CFSE染色提供了多得多的定量终点，并允许同时对扩充的细胞进行表型分析。刺激后每天，从每种培养物中取出细胞的等分试样，并通过流式细胞术进行分析。CFSE染色可使细胞变得高度荧光的。细胞分裂后，荧光减半，因此细胞分裂的次数越多，它变得越少荧光的。通过测量分裂一次，两次，三次等的细胞数量，可以定量工程化红系细胞诱导T细胞增殖的能力。在特定时间点诱导最大数量细胞分裂的工程化红系细胞被认为是最有效的扩充者。
为了确定这些工程化红系细胞多么好地促进T细胞长期生长的能力，可以生成细胞生长曲线。将这些实验设置为前述CFSE实验，但不使用CFSE。每2-3天培养，将T细胞从相应的培养物中取出，并使用Coulter计数器进行计数，该计数器测量存在多少细胞和细胞的平均体积。平均细胞体积是何时重新评估细胞的最佳预测器。通常，当适当刺激T细胞时，它们使其细胞体积增加三倍。当此体积减少到原始胚细胞的约一半以上时，可能有必要再刺激T细胞以维持对数线性扩充(Levine et al.,1996,Science 272:1939-1943；Levine etal.,1997,J.Immunol.159:5921-5930)。计算每个工程化红系细胞诱导20个群体倍增花费的时间。每个工程化红系细胞诱导该水平的T细胞扩充的相对差异是评估特定工程化红系细胞的重要标准。
另外，可以表征每个工程化红系细胞扩充的细胞表型，以确定特定的子集是否优先扩充。在每次再刺激之前，使用Appay等人(2002,Nature Med.8,379-385，通过引用整体并入本文)提出的CD27和CD28定义和Sallusto等人(1999,Nature 401:708-712，通过引用整体并入本文)提出的CCR7定义对扩充的T细胞群体进行表型分析，以定义扩充的T细胞的分化状态。穿孔蛋白和粒酶B细胞内染色可用于进行总体检测以评估溶细胞潜力。
凋亡标志物
在本发明的某些实施方案中，使用本文所述的工程化红系细胞刺激，活化和扩充T细胞增强T细胞中某些关键分子的表达，所述关键分子针对凋亡提供保护或以其它方式在体内或体外延长存活。凋亡通常源自T细胞中特定信号的诱导。因此，本发明的工程化红系细胞可以提供保护T细胞免于源自T细胞刺激的细胞死亡。因此，本发明中还包括通过防止过早死亡或防止公认的T细胞生长标志物如Bcl-xL，T细胞存活通常所必需的生长因子，细胞因子或淋巴因子的缺乏或消减以及防止Fas或肿瘤坏死因子受体(TNFR)交联或通过暴露于某些激素或应激增强的T细胞生长。
平铺(Tiling)
根据某些实施方案，第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽具有重叠的氨基酸序列。在某些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞包含多种外源刺激性多肽(例如一种或多种，两种或更多种，三种或更多种等)。在某些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，且其中第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽具有重叠至少2个氨基酸的氨基酸序列。根据某些实施方案，重叠是在2个氨基酸和23个氨基酸之间，例如，重叠是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸。根据一个实施方案，外源刺激性多肽的长度在8-10个氨基酸之间，并且重叠在6-8个氨基酸之间。根据另一个实施方案，外源刺激性多肽的长度在14-20个氨基酸之间，并且重叠在12-18个氨基酸之间。以此种方式平铺多肽提供了更广泛的抗原识别。
平铺多肽的方法是本领域已知的，并且记载于例如Harding等人，其描述了在基于人CD4+T细胞的增殖测定法中测试的重叠12个氨基酸的15聚体多肽的开发和测试(Molecular Cancer Therapeutics，2005年11月，第4卷，第11期，通过引用完整并入本文)。Sticker等描述了一种基于人细胞的方法，以鉴定任何蛋白质中的功能性CD4(+)T细胞表位(J Immunol Methods.2003Oct1；281(1-2):95-108，通过引用整体并入本文)。
修饰
一种或多种外源刺激蛋白可以具有真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞特征性的翻译后修饰。在一些实施方案中，一种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)外源刺激蛋白被糖基化，磷酸化或两者。糖蛋白的体外检测可以使用高碘酸-席夫(PAS)方法的修改在SDS-PAGE凝胶和Western印迹上完成。糖蛋白的细胞定位可以利用本领域已知的凝集素荧光缀合物来完成。磷酸化可以通过使用磷酸特异性抗体的蛋白质印迹来评估。
翻译后修饰还包括与疏水基团的缀合(例如肉豆蔻酰化，棕榈酰化，异戊二烯化，异戊烯化或糖基磷脂酰肌醇化(glypiation))，与辅因子的缀合(例如硫辛酰化(lipoylation)，黄素部分(例如，FMN或FAD)，血红素C附着，磷酸泛酰巯基乙胺基化(phosphopantetheinylation)或亚视黄基(retinylidene)希夫碱形成)，白喉酰胺形成、乙醇胺磷酸甘油附着、hypusine形成、酰化(例如O-酰化、N-酰化或S-酰化)、甲酰化、乙酰化、烷基化(例如甲基化或乙基化)、酰胺化、丁酰化、gamma-羧化、丙二酰化、羟基化、碘化、核苷酸添加(如ADP-核糖基化)、氧化、磷酸酯(O-连接)或氨基磷酸酯(phosphoramidate)(N-连接)形成(例如，磷酸化或腺苷酰化)、丙酰化(propionylation)、焦谷氨酸盐/酯(pyroglutamate)形成、S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化、琥珀酰化、硫酸化、ISG酰化、SUMO酰化、泛素化、Neddylation或氨基酸的化学修饰(例如，瓜氨酸化、脱酰胺、eliminylation或氨甲酰化)、二硫键的形成、外消旋化(例如脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸的)。在实施方案中，糖基化包括向精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟基赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸添加糖基基团，从而产生糖蛋白。在实施方案中，糖基化包括例如O-连接的糖基化或N-连接的糖基化。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
工程化红系细胞的群体
在一方面，本发明特征在于包含本发明的工程化红系细胞的细胞群体，例如多个工程化红系细胞或工程化红系细胞群体。在各种实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包括主要去核的细胞，主要有核的细胞或去核和有核细胞的混合物。在此类细胞群体中，去核细胞可以包括网织红细胞、红细胞或网织红细胞和红细胞的混合物。在一些实施方案中，去核细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，去核细胞是红细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体基本上由去核细胞组成。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含主要或基本上去核的细胞。例如，在一些实施方案中，工程化红系细胞样细胞群体包含至少约80％或更多的去核细胞。在一些实施方案中，本文提供的群体包含至少约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99或约100％的去核细胞。在一些实施方案中，本文提供的群体包含大于约80％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包括大于约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％的去核细胞。在一些实施方案中，本文提供的群体包括大于约80％去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含大于约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含约80％至约100％的去核细胞，例如约80％至约95％，约80％至约90％，约80％至约85％，约85％至约100％，约85％和约95％，约85％和约90％，约90％至约100％，约90％至约95％或约95％至约100％之间的去核细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含小于约20％的有核细胞。例如，在实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约1％，约2％，约3％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％或小于约20％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含小于约1％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含小于约2％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含小于约3％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含小于约4％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含小于约5％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含小于约10％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含小于约15％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞细胞群体包含0％至20％之间的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含约0％至20％之间的有核细胞，例如约0％至19％之间，约0％至15％之间，约0％至10％之间，约0％至5％之间，约0％至4％之间，约0％至3％之间，约0％至2％之间的有核细胞，或约5％至20％之间，约10％至20％之间，或约15％和20％之间的有核细胞。
在一些实施方案中，本公开特征在于本发明的工程化红系细胞的群体，其中工程化红系细胞的群体包含小于20％的有核细胞和至少80％的去核细胞，或包含小于15％的有核细胞和至少85％的有核细胞，或包含小于10％的有核细胞和至少90％的去核细胞，或包含小于5％的有核细胞和至少95％的有核细胞。在一些实施方案中，本公开特征在于本发明的工程化红系细胞的群体，其中工程化红系细胞的群体包括约0％有核细胞和约100％去核细胞，约1％有核细胞和约99％去核细胞，2％的有核细胞和约98％的去核细胞，约3％的有核细胞和约97％的有核细胞，约4％的有核细胞和约96％的去核细胞，约5％的有核细胞和约95％的去核细胞，约6％有核细胞和约94％的去核细胞，约7％有核细胞和约93％的去核细胞，约8％有核细胞和约92％的去核细胞，约9％的有核细胞和约91％的去核细胞，约10％的有核细胞约90％的去核细胞，约11％的有核细胞和约89％的去核细胞，约12％的有核细胞和约88％的去核细胞，约13％的有核细胞和约87％的去核细胞，约14％的有核细胞和约86％的去核细胞，约85％的有核细胞和约85％的去核细胞，约16％的有核细胞和约84％的去核细胞，约17％的有核细胞和约83％的去核细胞，约18％的有核细胞和约82％的去核细胞，约19％的有核细胞和约81％的去核细胞，或约20％的有核细胞和约80％的去核细胞。
在另一个实施方案中，工程化红系细胞群体包含主要或基本上有核的细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体基本上由有核细胞组成。在各个实施方案中，工程化红系细胞群体中的有核细胞是红细胞(或完全成熟的红细胞)前体细胞。在实施方案中，红系细胞前体细胞选自下组：多能造血干细胞(HSC)，多能髓样祖细胞，CFU-S细胞，BFU-E细胞，CFU-E细胞，原始红细胞，嗜碱性正成红细胞，多染性正成红细胞和正嗜染性正成红细胞。
在某些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约98％，至少约99％或100％的有核细胞。
应当理解的是，在本发明的工程化红系细胞的制备过程中，某种分数的细胞可以不与外源多肽缀合或被转导以表达外源多肽。因此，在一些实施方案中，本文提供的工程化红系细胞群体包含工程化红系细胞和未修饰的红系细胞的混合物，即，群体中的某种分数的细胞将不包含，不呈现或不表达外源多肽。例如，在各种实施方案中，工程化红系细胞细胞群体可包含至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的工程化红系细胞，其中群体中剩余的红系细胞未被工程化改造。在实施方案中，工程化红系细胞的单一单位剂量可包含至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的工程红系细胞，其中剂量中剩余的红系细胞未被工程化改造。
II.制备工程化红系细胞的方法
本公开考虑制造工程化红系细胞，例如去核细胞的各种方法。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一方面，本公开特征在于经工程化改造以刺激免疫细胞的去核细胞，其中所述免疫细胞是杀伤细胞，其在所述经工程化去核细胞的表面上包含多个外源刺激性多肽，其中所述多个外源刺激性多肽足以刺激免疫细胞，所述去核细胞通过包括以下项的方法产生：将一种或多种外源核酸(其各自编码多种外源刺激性多肽中的一种或多种)引入有核红系细胞中；并且在适合于有核红系细胞去核和适合于产生多种外源刺激性多肽中一种或多种的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本公开特征在于工程化去核红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA融合物，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将编码包含IL-15/IL-15RA融合物的外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；并且在适合于有核红系细胞去核和适合于产生包含IL-15/IL-15RA融合物的外源刺激性多肽的条件下培养有核红细胞。
在另一方面，本公开提供了工程化去核红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包括4-1BBL多肽，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将编码包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；并且在适合于有核红系细胞去核和适合于产生包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本公开特征在于工程化去核红系细胞，其包含至少一种外源刺激性多肽，其在工程化去核细胞的表面上包含IL-15/IL-15RA融合物，MHC I类链相关蛋白A(MICA)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，CD48或CD155，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将编码至少一种外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；在适合于有核红系细胞去核和适合于产生至少一种外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本公开特征在于工程化去核红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中第一外源刺激性多肽包含IL-12 p40/IL-12 p35融合物，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将编码包含IL-12p40/IL-12 p35融合物的外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；并且在适合于有核红系细胞去核和适合于产生包含IL-12p40/IL-12 p35融合物的外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
在另一方面，本公开特征在于工程化去核红系细胞，其在工程化有核细胞表面上包含至少一个外源刺激性多肽，所述外源刺激性多肽包含IL-12p40/IL-12 p35融合物，IL-15/IL-15RA融合物，4-1BBL，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：将编码至少一种外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；并且在适合于有核红系细胞去核和适合于产生至少一种外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞在工程化去核细胞的表面上包含超过一种(例如，2、3或更多)外源刺激性多肽，并且如下产生细胞：将至少一种(例如，1、2、3或更多)编码超过一种外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；并且在适合于有核红系细胞去核和适合于产生超过一种外源刺激性多肽的条件下培养有核红系细胞。
工程化红系细胞的物理特征
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞具有本文所述的一种或多种(例如2、3、4种或更多种)物理特性，例如渗透脆性、细胞大小、血红蛋白浓度或磷脂酰丝氨酸含量。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。尽管不希望受理论束缚，但在一些实施方案中，表达外源蛋白质的工程化红系细胞，例如去核细胞具有与野生型未处理的红细胞类似的物理特征。相反，低渗负荷的红系细胞有时表现出异常的物理特性，例如渗透脆性增加、细胞大小改变、血红蛋白浓度降低或细胞膜外叶上的磷脂酰丝氨酸水平增加。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含由外源核酸编码的外源蛋白质，所述外源核酸未被细胞保留、尚未纯化或尚未完全存在于红系细胞外。在一些实施方案中，红系细胞在缺乏稳定剂的组合物中。
渗透脆性
在一些实施方案中，工程化红系细胞表现出与不包含外源多肽的分离的未培养的红系细胞基本上相同的渗透膜脆性。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。可以使用WO2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例59的方法测定渗透脆性。
细胞大小
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如去核细胞)具有与野生型未处理的红系细胞近似的直径或体积。在一些实施方案中，红系细胞群体具有约4、5、6、7或8微米的平均直径，并且任选地，群体的标准差小于1、2或3微米。在一些实施方案中，一种或多种红系细胞具有约4-8、5-7或约6微米的直径。在一些实施方案中，红系细胞的直径小于约1微米，大于约20微米，在约1微米和约20微米之间、在约2微米和约20微米之间、在约3微米和约20微米之间、在约4微米和约20微米之间、在约5微米和约20微米之间、在约6微米和约20微米之间、在约5微米和约15微米之间、或在约10微米和约30微米之间。在一些实施方案中，使用Advia 120血液系统测量细胞直径。
在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积的体积大于10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、或大于150fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积小于30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL、或小于200fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积在80-100、100-200、200-300、300-400或400-500飞升(fL)之间。在一些实施方案中，红系细胞群体具有此段落所列出的平均红细胞体积，并且群体的标准差小于50fL、40fL、30fL、20fL、10fL、5fL或2fL。在一些实施方案中，使用血液学分析仪(例如，Coulter计数器)测量平均红细胞体积。
血红蛋白浓度
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如去核细胞)具有与野生型未经处理的红系细胞类似的血红蛋白含量。在一些实施方案中，红系细胞包含超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或超过10％的胎儿血红蛋白。在一些实施方案中，红系细胞包含至少约20、22、24、26、28或30pg，且任选地高达约30pg的总血红蛋白。在一些实施方案中，使用WO2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例33的德拉布坎(Drabkin’s)试剂方法测定血红蛋白水平。
磷脂酰丝氨酸含量
在一些实施方案中，工程化红系细胞，例如去核细胞在其细胞膜的外叶上具有与野生型未处理的红系细胞大致相同的磷脂酰丝氨酸含量。磷脂酰丝氨酸主要位于野生型未处理的红系细胞细胞膜的内叶上，并且低渗负荷可以导致磷脂酰丝氨酸分布至它可以引发免疫应答的外叶中。在一些实施方案中，红系细胞的群体包含对膜联蛋白V染色呈阳性的少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞。在一些实施方案中，通过染色优先结合PS的膜联蛋白-V-FITC和通过流式细胞术测量FITC荧光，例如使用WO 2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例54的方法，来评估磷脂酰丝氨酸暴露。
其它特征
在一些实施方案中，红系细胞群体包含至少约50％，60％，70％，80％，90％或95％(并且任选地高达90或100％)的对GPA呈阳性的细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测GPA的存在。
在一些实施方案中，包含红系细胞的细胞群体包含小于约10、5、4、3、2或1％的棘红细胞。
在一些实施方案中，红系细胞是去核的，例如，包含用作本文所述的治疗制剂的红系细胞的细胞群体是大于50％，60％，70％，80％，90％去核的。在一些实施方案中，细胞，例如红系细胞，含有无功能的核，例如已经失活的核。
分离红细胞
可以使用各种方法来分离成熟的红细胞，如例如，细胞洗涤器、连续流动细胞分离器、密度梯度分离、荧光激活细胞分选(FACS)、Miltenyi免疫磁性耗竭(MACS)或这些方法的组合(参见例如，van der Berg et al.,Clin.Chem.33:1081-1082(1987)；Bar-Zvi etal.,J.Biol.Chem.262:17719-17723(1987)；Goodman et al.,Exp.Biol.Med.232:1470-1476(2007))。
可以通过简单的离心从全血中分离出红细胞(参见例如，van der Berg et al.,Clin.Chem.33:1081-1082(1987))。例如，可以将EDTA抗凝全血在4℃下以800xg离心10分钟。去除富含血小板的血浆和血沉棕黄层，并用等渗盐溶液(NaCl，9g/L)将红细胞洗涤三次。
或者，可以使用密度梯度离心和各种分离介质，如例如Ficoll、Hypaque、Histopaque、Percoll、Sigmacell或其组合，来分离红细胞。例如，一定体积的Histopaque-1077放置在等体积的Histopaque-1119的顶部。将等体积的等渗盐溶液(NaCl，9g/L)中1:1稀释的EDTA抗凝全血分层放置在Histopaque的顶部，并将样品在室温下以700xg离心30分钟。在这些条件下，粒细胞迁移到1077/1119界面，淋巴细胞、其他单核细胞和血小板保留在血浆/1077界面，并且红细胞沉淀。用等渗盐溶液将红细胞洗涤两次。
或者，可以通过使用Percoll阶梯梯度离心分离红细胞(参见例如，Bar-Zvi etal.,J.Biol.Chem.262:17719-17723(1987))。例如，将新鲜血液与含有75mM柠檬酸钠和38mM柠檬酸的抗凝溶液混合，并且在Hepes缓冲盐水中短暂洗涤细胞。通过用α-纤维素和Sigmacell(1：1)的混合物吸附来去除白细胞和血小板。通过在Sorvall SS34转子中通过45/75％Percoll阶梯梯度以2500rpm离心10分钟，进一步从网织红细胞和残留的白细胞中分离出红细胞。红细胞在沉淀中回收，而网织红细胞带在45/75％界面处，其余白细胞带在0/45％界面处。通过在Hepes缓冲盐水中进行几次洗涤将Percoll从红细胞中去除。其他可以用于产生密度梯度以分离红细胞的材料包括OPTIPREP，一种60％的碘克沙醇水溶液(来自Axis-Shield,Dundee,Scotland)。
例如，可以使用流式细胞术将红细胞与网织红细胞分开(参见例如，Goodman elal.,Exp.Biol.Med.232:1470-1476(2007))。在这种情况下，将全血离心(550xg，20分钟，25℃)以从血浆中分离细胞。将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水溶液中，并进一步在Ficoll-Paque(1.077密度)上进行分级分离，例如，通过离心(400xg，30分钟，25℃)将红细胞与白细胞分离。将得到的细胞沉淀重悬于补充有10％胎牛血清的RPMI中，并基于大小和粒度在FACS仪器，如例如Becton Dickinson FACSCalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.,USA)上分类。
可以通过免疫磁性耗竭分离红细胞(参见例如，Goodman,el al.,(2007)Exp.Biol.Med.232:1470-1476)。在这种情况下，具有细胞类型特异性抗体的磁珠用于消除非红细胞。例如，使用本文所述的密度梯度将红细胞与大多数其他血液组分分离，然后对任何残留的网织红细胞进行免疫磁性耗竭。在25℃下用人抗体血清将细胞预处理20分钟，然后用针对网织红细胞特异性抗原(如CD71和CD36)的抗体进行处理。抗体可以直接附着于磁珠或与PE缀合，其与例如带有抗PE抗体的磁珠反应。抗体-磁珠复合物能够选择性地从例如红细胞群体中提取残留的网织红细胞。
还可以使用单采血液分离术(apheresis)分离红细胞。单采血液分离术的过程涉及从患者或供体中取出全血，使用离心或细胞分选术分离血液组分，去除一个或多个分离部分，并将剩余组分输回患者或供体中。当前有许多仪器用于此目的，如例如来自Baxter的Amicus和Alyx仪器(Deerfield,Ill.,USA)、来自Gambro BCT的Trima Accel仪器(Lakewood,Colo.,USA)以及来自Haemonetics的MCS+9000仪器(Braintree,Mass.,USA)。为了达到适当的细胞纯度，可能需要另外的纯化方法。
网织红细胞是未成熟的红细胞，并占人体中红细胞的约1％。网织红细胞在骨髓中发育并成熟。一旦释放到循环中，网织红细胞迅速经历终末分化为成熟的红细胞。像成熟的红细胞一样，网织红细胞也没有细胞核。
基于网织红细胞成熟时细胞密度的差异，可以从外周血中分离出不同龄的网织红细胞。网织红细胞可以通过使用各种密度梯度的差异离心从外周血中分离出来。例如，Percoll梯度可以用于分离网织红细胞(参见例如，Noble el al.,Blood 74:475-481(1989))。通过将Percoll(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)稀释至10mM三乙醇胺、117mM NaCl、5mM葡萄糖和1.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的最终浓度制备密度为1.096和1.058g/ml的无菌等渗Percoll溶液。这些溶液的渗透压在295至310mOsm之间。例如，将5毫升的第一Percoll溶液(密度1.096)添加到无菌的15ml锥形离心管中。例如，将2毫升的第二Percoll溶液(密度1.058)放置在较高密度的第一Percoll溶液上。2至4毫升的全血放置在试管顶部。将试管在带有外摆试管架(swing-out tube holder)的冷冻离心机中以250xg离心30分钟。网织红细胞和一些白细胞迁移到两个Percoll层之间的界面。将界面处的细胞转移至新试管中，并用具有5mM葡萄糖、0.03mM叠氮化钠和1mg/ml BSA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次。在尺寸排阻柱上的PBS中通过色谱法去除残留的白细胞。
或者，可以使用免疫磁分离方法通过阳性选择来分离网织红细胞(参见例如，Brunet al.,Blood 76:2397-2403(1990))。该方法利用了成熟前网织红细胞表面相对于红细胞表达的大量转铁蛋白受体。包被有针对转铁蛋白受体的抗体的磁珠可以用于从混合的血细胞群体中选择性分离网织红细胞。针对多种哺乳动物物种(包括人)的转铁蛋白受体的抗体可从商业来源获得(例如，Affinity BioReagents,Golden,Colo.,USA；Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)。转铁蛋白抗体可以直接与磁珠连接。或者，转铁蛋白抗体可以经由第二抗体间接与磁珠连接。例如，可以将针对人转铁蛋白的小鼠单克隆抗体10D2(AffinityBioReagents,Golden,Colo.,USA)与包被有绵羊抗小鼠免疫球蛋白G(Dynal/Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)的免疫磁珠混合。然后将免疫磁珠与白细胞耗竭的红细胞级分温育。将珠子和红细胞在22℃下温和混合温育60-90分钟，然后使用磁场将附着有网织红细胞的珠子分离。可以使用例如DETACHaBEAD溶液(来自Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)从磁珠中去除分离的网织红细胞。或者，可以使用本文所述的方法从CD34+造血干细胞的体外生长和成熟中分离网织红细胞。
终末分化的去核红细胞可以基于其DNA含量与其他细胞分离。在非限制性实例中，首先用重要的DNA染料如Hoechst 33342(Invitrogen Corp.)标记细胞。Hoechst 33342是与双链DNA结合时发出蓝色荧光的渗透细胞的核复染物。培养物中未分化的前体细胞、巨噬细胞或其他有核细胞通过Hoechst33342染色，而去核红细胞则为Hoechst阴性。可以通过使用荧光激活的细胞分选仪或其他细胞分选技术从去核红细胞中分离出Hoechst阳性细胞。可以通过透析或其他合适的方法从分离的红细胞中去除Hoechst染料。
本文所述多肽的媒介物
尽管在本文的许多实施方案中，一种或多种(例如，两种或更多种)外源多肽位于去核红系细胞上或去核红系细胞中，但应理解，本文所述的任何多肽或外源多肽的组合也可以位于另一个媒介物上或另一个媒介物中。媒介物可以包含例如细胞、红系细胞、小体(corpuscle)、纳米颗粒、微团(micelle)、脂质体或外泌体。例如，在一些方面，本公开提供了媒介物(例如细胞、红系细胞、小体、纳米颗粒、微团、脂质体或外泌体)，其在其表面上包含本文所述的一种或多种试剂。在一些实施方案中，一种或多种试剂包含选自表1或8-16中任一个的多肽，或其片段或变体，或其抗体分子的试剂。在一些实施方案中，媒介物包含本文所述的两种或更多种试剂，例如本文所述的任何一对试剂。
在一方面，本文所述的一种或多种多肽加载、附着(例如固定化或缀合)在非细胞递送媒介物的表面上和/或包封在非细胞递送媒介物中。非细胞递送媒介物可以是例如纳米脂质凝胶、聚合物颗粒、琼脂糖颗粒、乳胶颗粒、二氧化硅颗粒、脂质体或多层囊泡。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含直径为约1nm至约900nm的纳米颗粒或由其组成。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含平均直径为约0.1至约20微米(如约0.5微米至约10微米，例如约5微米或更小(例如约2.5至约5微米))。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含平均直径为约1μm至约10μm。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含天然聚合物。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含合成聚合物。代表性的聚合物包括但不限于聚(羟基酸)、聚羟基链烷酸酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯酰胺、聚(丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(氰基丙烯酸烷基酯)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)及其组合。在一些实施方案中，非细胞递送媒介物包含琼脂糖、乳胶或聚苯乙烯。可以使用本领域已知的标准方法将本文所述的一种或多种多肽缀合至非细胞递送媒介物(参见例如，Ulbrich etal.(2016)Chem Rev.116(9):5338-431)。缀合可以是共价的或非共价的。例如，在其中非细胞递送媒介物是脂质体的实施方案中，本文所述的多肽可以经由聚乙二醇(PEG)链附接至脂质体。多肽与脂质体的缀合也可以涉及硫酯键，例如通过硫醇和马来酰亚胺基团的反应。交联剂可以用于产生巯基基团以使多肽附接至非细胞递送媒介物(参见例如Paszko andSenge(2012)Curr.Med.Chem.19(31):5239-77)。在一些实施方案中，包含一种或多种本文所述的多肽的非细胞递送媒介物可以用于本文提供的任何治疗方法中。
细胞的异质群体
尽管在本文的许多实施方案中，一种或多种(例如，两种或更多种)外源多肽位于单个细胞上或单个细胞中，但应理解，本文所述的任何多肽或多肽的组合也可以位于多个细胞上。例如，在一些方面，本公开提供了多个红系细胞，其中多个的第一细胞包含第一外源多肽，而多个的第二细胞包含第二外源多肽。在一些实施方案中，多个细胞包含本文所述的两种或更多种多肽，例如，本文所述的任何一对多肽。在一些实施方案中，群体中少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的细胞包含第一外源多肽和第二外源多肽两者。
包封在膜中的细胞
在一些实施方案中，本文所述的去核红系细胞或其他媒介物被包封在膜例如半透膜中。在一些实施方案中，膜包含多糖，例如阴离子海藻多糖。在一些实施方案中，半透膜不允许细胞通过，但允许小分子或大分子例如代谢物、蛋白质或DNA通过。在一些实施方案中，膜是描述于Lienert et al.,“Synthetic biology in mammalian cells:nextgeneration research tools and therapeutics”Nature Reviews Molecular CellBiology 15,95–107(2014)(以其整体通过引用并入本文)中的膜。尽管不希望受到理论的束缚，但在一些实施方案中，膜使细胞免受免疫系统的影响和/或使多个细胞保持邻近，从而促进彼此之间或彼此的产物之间的相互作用。
红系前体细胞
本文提供了工程化红系细胞前体细胞，以及制备工程化红系细胞前体细胞，网织红细胞和红细胞的方法。
多能干细胞通过红细胞生成过程产生红细胞。干细胞看起来像小淋巴细胞并缺乏红细胞的功能性能力。干细胞具有无限分裂的能力，这是成熟细胞所缺乏的。干细胞产生的一些子细胞随世代和时间获得红系特征。骨髓中大多数红系细胞具有独特的形态，但即使在尚未获得红系谱系独特的形态特征的细胞中也可见到红系细胞成熟的定型。这些细胞通过它们在体外形成的集落类型所识别。识别出两种此类细胞。爆发形成单位红系(BFU-E)来自干细胞，并产生集落形成单位红系(CFU-E)。CFU-E产生了原正成红细胞(具有独特形态的最不成熟的红系细胞)。BFU-E和CFU-E形成骨髓细胞的很小一级分。从形态上讲，在用罗曼诺夫斯基(Romanovsky)染色剂染色的骨髓中可鉴定出五种红系细胞前体。从最不成熟到最成熟的五个阶段是原成红细胞、嗜碱性正成红细胞(早期成红细胞)、多染性正成红细胞(中间成红细胞)、正嗜染性正成红细胞(晚期成红细胞)和网织红细胞。BFU-E(爆发形成单位-红系)、CFU-E(红系集落形成单位)、原正成红细胞(原成红细胞)、嗜碱性原正成红细胞、多染性正成红细胞和正嗜染性正成红细胞受谱系限制。
下表6总结了红系前体细胞和红细胞的形态特征。
表6
Figure BDA0002760528960001251
Figure BDA0002760528960001261
正常人红细胞表达CD36，单核细胞、血小板和内皮细胞的粘附分子(vanSchravendijk MR et al.,Blood.1992Oct 15；80(8):2105-14)。因此，在一些实施方案中，抗CD36抗体可用于鉴定人红细胞。
可以根据本文所述的方法修饰本领域已知的能够分化为红细胞的任何类型的细胞，即任何红系细胞前体细胞，以产生工程化红系前体细胞。在某些实施方案中，根据本文描述的方法修饰的红系前体细胞是在分化为红细胞的过程中的细胞，即，细胞是已知在哺乳动物红细胞生成期间存在的类型的细胞。例如，细胞可以是多能造血干细胞(HSC)或CD34+细胞，多能髓样祖细胞，CFU-S细胞，BFU-E细胞，CFU-E细胞，原正成红细胞(原成红细胞)，嗜碱性正成红细胞，多染性正成红细胞和正嗜染性正成红细胞。可以使用本领域已知的方法，即使用下文描述的已知促进红细胞生成的分子，例如SCF，促红细胞生成素，IL-3和/或GM-CSF，在体外将本文提供的修饰的红系前体细胞分化为工程化网织红细胞或红细胞。或者，在本发明的组合物中提供了修饰的红系前体细胞，并且在体内施用于受试者后能够分化成红细胞。
在一些实施方案中，红系前体细胞，例如造血干细胞来自O-阴性供体。在一些实施方案中，红系前体细胞缺乏(例如，不表达或编码)A和/或B抗原。
培养
本文所述用于产生工程化红系细胞的来源包括循环红系细胞。合适的细胞来源可以如本文所述从患者衍生的造血或红系祖细胞分离，衍生自永生化的红系细胞系或衍生自诱导多能干细胞，任选地进行培养和分化。用于使用细胞培养技术产生红细胞的方法在本领域中是众所周知的，例如，Giarratana et al.,Blood 2011,118:5071,Huang et al.,Mol Ther 2013,epub ahead of print September 3或Kurita et al.,PLOS One 2013,8:e59890。方案随生长因子、起始细胞系、培养期和所得细胞被表征的形态性状变化。还建立了用于血液生产的培养系统，该系统可以替代供体输血(Fibach et al.1989Blood 73:100)。近来，CD34+细胞分化为网织红细胞阶段，随后成功输到人类受试者中(Giarratanaet al.,Blood 2011,118:5071)。
本文提供了用于红系细胞和工程化红系细胞的培养方法。可以从造血祖细胞中培养红系细胞，所述造血祖细胞包括例如CD34+造血祖细胞(Giarratana et al.,Blood2011,118:5071)、诱导多能干细胞(Kurita et al.,PLOS One 2013,8:e59890)和胚胎干细胞(Hirose et al.2013Stem Cell Reports1:499)。适合于扩充和分化祖细胞的生长和分化因子的混合物是本领域已知的。合适的扩充和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(SCF)、白介素(IL)如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、CSF、G-CSF、血小板生成素(TPO)、GM-CSF、促红细胞生成素(EPO)、Flt3、Flt2、PIXY 321和白血病抑制因子(LIF)。
通过使祖细胞与限定的因子在多步培养过程中接触，可以从造血祖细胞(如CD34+细胞)培养红系细胞。例如，可以在三步过程种从造血祖细胞培养红系细胞。
第一步可以包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)和0.1-100ng/mL的白介素3(IL-3)接触。第一步任选地包括使培养物中的细胞与结合并激活下述核激素受体的配体接触，所述受体如例如是糖皮质激素受体、雌激素受体、孕激素受体、雄激素受体或孕烷x受体。这些受体的配体包括，例如，皮质类固醇，如例如10nM-100μM的地塞米松或10nM-100μM的氢化可的松；雌激素，如例如10nM-100μM的beta-雌二醇；孕激素，如例如10nM-100μM的孕酮、10nM-100μM的羟基孕酮、10nM-100μM的5a-二氢孕酮、10nM-100μM的11-脱氧皮质酮，或合成的孕激素(progestin)，如例如10nM-100μM的醋酸氯地孕酮；雄激素，如例如10nM-100μM的睾酮、10nM-100μM的二氢睾酮或10nM-100μM的雄烯二酮；或孕烷x受体配体，如例如10nM-100μM的利福平、10nM-100的贯叶金丝桃素(hyperforin)、10nM-100μM的St.John's Wort(金丝桃素)或维生素E样分子，如例如，10nM-100的生育酚。第一步还可以任选地包括使培养物中细胞与下述胰岛素样分子接触，所述胰岛素样分子如例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第一步可以进一步任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。
第一步可以任选地包括使培养物中的细胞与下述一种或多种白介素(IL)或生长因子接触，如例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子beta(TGF-B)、肿瘤坏死因子alpha(TNF-A)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、白血病抑制因子(LIF)和Flt3配体。每种白介素或生长因子通常可以以0.1-100ng/mL的浓度提供。第一步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述血清蛋白或非蛋白质分子接触，如例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、人血浆蛋白粉(plasmanate)(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
第二步可以包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)和1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第二步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述胰岛素样分子接触，如例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第二步可以进一步任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第二步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述血清蛋白或非蛋白质分子接触，如例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
第三步可以包括使培养物中的细胞与1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第三步可以任选地包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)接触。第三步可以进一步任选地包括使培养物中的细胞与下述胰岛素样分子接触，如例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第三步还可以任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第三步还可以任选地包括使培养物中的细胞与下述血清蛋白或非蛋白质分子接触，如例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
在一些实施方案中，扩充和分化包含呈现一种或多种外源多肽的去核细胞的工程化红系细胞的方法不包括在包含骨髓增殖性受体(mpl)配体的培养基中培养工程化红系细胞。
培养过程可以任选地包括通过本领域已知的方法使细胞与下述分子接触，例如DNA分子、RNA分子、mRNA、siRNA、微小RNA、lncRNA、shRNA、激素或小分子(其激活或敲低一种或多种基因)。靶基因可以包括例如编码转录因子、生长因子或生长因子受体的基因，其包括但不限于，例如，GATA1、GATA2、CMyc、hTERT、p53、EPO、SCF、胰岛素、EPO-R、SCF-R、转铁蛋白-R、胰岛素-R。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白(holotransferrin)、胰岛素、地塞米松、beta-雌二醇、IL-3、SCF和促红细胞生成素的培养物中，三个单独的分化阶段中共22天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、beta-雌二醇、IL-3、SCF和血小板生成素的培养物中，三个单独的分化阶段中共14天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、beta-雌二醇、IL-3、SCF和GCSF的培养物中，三个单独的分化阶段中共15天。
在一些实施方案中，红系细胞扩充至少100、1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000或100,000倍(以及任选地高达100,000、200,000或500,000倍)。在一些实施方案中，使用自动细胞计数器测量细胞数。在一些实施方案中，红系细胞的群体包含至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或98％(以及任选地高达约80、90或100％)的工程化红系细胞。在一些实施方案中，使用核染色通过FACS测量去核。在一些实施方案中，群体中至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％(以及任选地高达约70、80、90或100％)的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4或更多种)的外源多肽。在一些实施方案中，使用针对多肽的标记抗体通过红系细胞来测量多肽的表达。在一些实施方案中，群体中至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％(以及任选地高达约70、80、90或100％)的红系细胞是去核的并且包含一种或多种(例如2、3、4或更多种)的外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞的群体包含约1x109–2x109、2x109–5x109、5x109–1x1010、1x1010–2x1010、2x1010–5x1010、5x1010–1x1011、1x1011–2x1011、2x1011–5x1011、5x1011–1x1012、1x1012–2x1012、2x1012–5x1012或5x1012–1x1013个细胞。
在一些实施方案中，可能期望在培养过程中在体外仅部分分化红系祖细胞，例如造血干细胞，从而允许进一步分化(例如分化为网织红细胞或完全成熟的红细胞)在体内引入受试者时发生(参见例如，Neildez-Nguyen et al.,Nature Biotech.20:467-472(2002))。将理解的是，在本发明的各种实施方案中，体外成熟和/或分化可以在期望的任何阶段被阻止。例如，分离的CD34+造血干细胞可以如本文其他地方所述在体外扩充，例如在含有各种因子的培养基中扩充以达到期望的分化阶段，所述因子包括例如白介素3、Flt3配体、干细胞因子、血小板生成素、促红细胞生成素、转铁蛋白和胰岛素生长因子。所得工程化红系细胞的特征可以在于CD36和GPA的表面表达，以及特定于特定所期望细胞类型的其他特征，并且可以输注至允许终末分化为成熟红细胞的受试者中。
在一些实施方案中，工程化红系细胞从红系祖细胞部分扩充至去核之前(但不包括去核)的成熟的任何阶段，因此保留有核细胞，例如红系前体细胞。在某些实施方案中，所得细胞是有核的，并且限制红系谱系。在某些实施方案中，所得细胞选自多能髓样祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原正成红细胞(原成红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞和正染性正成红细胞。最终的分化步骤，包括去核，仅在将工程化红系细胞施用于受试者后才发生，也就是说，在此类实施方案中，去核步骤在体内发生。在另一个实施方案中，工程化红系细胞在体外通过去核阶段扩充和分化成为例如网织红细胞。在工程化红系细胞分化为网织红细胞阶段的此类实施方案中，变成红细胞的最终分化步骤仅在将工程化红系细胞施用于受试者后才发生，也就是说，终末分化步骤在体内发生。在另一个实施方案中，工程化红系细胞在体外通过终末分化阶段进行扩充和分化以成为红细胞。
将进一步认识到，在一些实施方案中，工程化红系细胞可以从红系祖细胞例如造血干细胞扩充和分化，以变成不同谱系的造血细胞，诸如例如变成血小板。用于成熟和分化各种谱系的造血细胞如血小板的方法是本领域技术人员众所周知的。如本文所述的表达外源多肽的此类工程化血小板被认为涵盖在本发明中。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
将进一步认识到，在一些实施方案中，工程化红系细胞可以从红系祖细胞例如造血干细胞扩充和分化，以变成不同谱系的造血细胞，例如变成血小板。用于成熟和分化各种谱系的造血细胞如血小板的方法是本领域技术人员众所周知的。在一些实施方案中，如本文所述的表达外源多肽的此类工程化血小板被认为涵盖在本发明中。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，本文提供的去核细胞是血小板。体外制备血小板的方法是本领域已知的(参见例如Wang and Zheng(2016)Springerplus 5(1):787,和美国专利号9,574,178)。制备包括外源多肽的血小板的方法描述于例如国际专利申请公开号WO2015/073587和WO2015/153102，其每一篇均以其整体通过引用并入。血小板生成部分受血小板生成素(TPO)及其细胞受体TPOR/MPUc-MPL之间相互作用诱导的信号传导机制调节。另外，多种细胞因子(例如，干细胞因子(SCF)、IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、促红细胞生成素(EPO)、kit配体和干扰素)已显示具有血小板生成活性。
在一些实施方案中，血小板从造血祖细胞，例如CD34+造血干细胞、诱导多能干细胞或胚胎干细胞产生。在一些实施方案中，通过在多步培养过程中使祖细胞与确定的因子接触来产生血小板。在一些实施方案中，多步培养过程包括：在适合于产生巨核细胞祖细胞群体的条件下培养造血祖细胞群体，以及在适合于产生血小板的条件下培养巨核细胞祖细胞群体。适合于扩充和分化祖细胞并产生血小板的生长和分化因子的混合物是本领域已知的。合适的扩充和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(SCF)、Flt-3/Flk-2配体(FL)、TPO、IL-11、IL-3、IL-6和IL-9。例如，在一些实施方案中，可以通过将CD34+HSC以2-4x 104个细胞/mL接种在无血清培养基中，并在培养第4天加入等体积的培养基更新培养基来生产血小板。在培养第6天，对细胞进行计数和分析：洗涤1.5x 105个细胞，并将其置于1mL的补充有包含TPO(30ng/mL)、SCF(1ng/mL)、IL-6(7.5ng/mL)和IL-9(13.5ng/mL)的细胞因子混合物的相同的培养基中以诱导巨核细胞分化。在培养第10天，用新鲜培养基替换约有四分之一到一半的悬浮培养物。在最初的6个培养日中在39℃，并且在最后8个培养日中在37℃，在湿润气氛(10％CO2)中培养细胞。台盼蓝染色后，用血细胞计数器对有核细胞进行计数。如国际专利申请公开号WO2015/073587(通过引用并入本文)的实施例44和45中所述，可以通过流式细胞术或定量PCR来评估培养物中血小板的分化状态。
其他特征
在一些实施方案中，工程化红系细胞(例如，工程化去核红系细胞)或工程化的去核细胞，或工程化红系细胞或工程化去核细胞的群体包含下列一种或多种(例如全部)：内源性GPA(C235a)，转铁蛋白受体(CD71)，Band 3(CD233)或整联蛋白alpha4(C49d)。可以例如如国际申请公开号WO2018/009838(其通过引用整体并入本文)的实施例10中所述测量这些蛋白质。GPA阳性细胞和Band 3阳性细胞的百分比通常在红系细胞成熟期间增加，并且整联蛋白alpha4阳性的百分比通常在整个成熟期间保持较高。
在一些实施方案中，红系细胞群体包含至少约50％，60％，70％，80％，90％或95％(并且任选地高达90或100％)的对GPA呈阳性的细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测GPA的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％GPA+(即CD235a+)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约50％至约100％之间(例如，约60％至约100％，约65％至约100％，约70％至约100％，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)的GPA+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测GPA的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％CD71+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％至约100％之间(例如，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)的CD71+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD71(转铁蛋白受体)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％至约100％之间(例如，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)的CD233+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD233(Band 3)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％CD47+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％至约100％之间(例如，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)的CD47+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD47(整合蛋白相关蛋白)的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％CD36-(CD36阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％至约100％之间(例如，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)的CD36-(CD36阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD36的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％CD34-(CD34阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％至约100％之间(例如，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)的CD34-(CD34阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD34的存在。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％CD235a+/CD47+/CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％至约100％之间(例如，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)CD235a+/CD47+/CD233+细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含至少约50％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％。，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含约70％至约100％之间(例如，约75％至约100％，约80％至约100％，约85％至约100％，约90％至约100％，约95％至约100％，约75％至约99％，约80％至约99％，约85％至约99％，约90％至约99％，约95％至约99％，约75％至约95％，约80％至约95％，约85％至约95％，约90％至约95％，约95％至约98％)CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或包含红系细胞的工程化去核细胞群体包含小于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的棘红细胞。
在一些实施方案中，包含红系细胞的工程化红系细胞(例如如本文所述的人工抗原呈递细胞)群体包含小于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的棘红细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(工程化去核红系细胞)或工程化去核细胞的群体包含小于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的pyrenocyte。
在一些实施方案中，红系细胞是去核的，例如，包括用作本文所述的治疗制剂的红系细胞的细胞群体是大于50％，60％，70％，80％，90％去核的。在一些实施方案中，细胞，例如红系细胞，含有无功能的核，例如已经失活的核。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
外源刺激性多肽的表达
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞，例如去核细胞通过使合适的分离的细胞，例如红系细胞，网织红细胞，红系前体细胞，血小板或血小板前体与编码本公开的刺激性多肽(例如IL-1,IL-2,IL-12,IL-15,IL-15/IL-15RA融合物,IL-18,IL-21,IFNα,4-1BBL,MICA,MICB,PVR/CD155,CD48,HLA-A,HLA-C,HLA-G,HS,HLA-E,CpG,IgG,ULBP,MIC,B7-H6,NkP44L,Nectin2,NTBA,AICL和IGF-1)的外源核酸接触来产生。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，外源刺激性多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源多肽由RNA编码，该RNA与血小板、有核红系细胞、有核血小板前体细胞或网织红细胞接触。在一些实施方案中，外源多肽与原代血小板、有核红系细胞、有核血小板前体细胞、网织红细胞或红细胞接触。
外源刺激性多肽可以通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破坏或其他方法从引入红系细胞中的转基因表达；由通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破坏或其他方法引入细胞中的mRNA表达的外源多肽；通过引入外部因子例如转录激活物、转录阻遏物或分泌途径增强物而从天然基因座过表达的外源多肽；和/或从生产细胞或其他外部系统合成、提取或生产并掺入红系细胞中的多肽。
可以通过转染单拷贝或多拷贝基因、用病毒转导或在存在DNA或RNA的情况下进行电穿孔引入外源刺激性多肽(例如IL-1,IL-2,IL-12,IL-15,IL-15/IL-15RA融合物,IL-18,IL-21,IFNα,4-1BBL,MICA,MICB,PVR/CD155,CD48,HLA-A,HLA-C,HLA-G,HS,HLA-E,CpG,IgG,ULBP,MIC,B7-H6,NkP44L,Nectin2,NTBA,AICL和IGF-1)。在哺乳动物细胞中表达外源蛋白的方法是本领域公知的。例如，通过CD34+祖细胞的病毒转导来诱导造血细胞中外源因子IX的表达，参见Chang et al.,Nat Biotechnol 2006,24:1017。
在一些实施方案中，当存在超过一种刺激性多肽(例如，两种或更多种)时，该刺激性多肽被编码在单个核酸中，例如单个载体中。在实施方案中，单个载体对于每个基因具有单独的启动子，具有最初转录成在中间具有蛋白酶切割位点的单个多肽的两个蛋白质，使得随后的蛋白水解加工产生两个蛋白质或任何其他合适的构型。在一些实施方案中，两个或更多个多肽在两个或更多个核酸中编码，例如，每个载体编码多肽之一。
可以将核酸，例如用于产生外源多肽的DNA表达载体或mRNA引入适合于产生本文所述外源多肽的祖细胞(例如红系细胞祖细胞或血小板祖细胞等)中。可以经由如本文提供的常规重组技术从原始来源分离祖细胞或从扩充的祖细胞群体获得祖细胞。在一些情况下，可以设计表达载体，使得它们可以通过本领域已知的方法通过同源或非同源重组掺入细胞基因组中。
在一些实施方案中，使造血祖细胞，例如CD34+造血祖细胞与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并使细胞在培养物中扩充和分化。
根据一些实施方案，可以将一种或多种外源刺激性多肽克隆到质粒构建体中以进行转染。用于将表达载体转移到适合产生本文所述的工程化红系细胞的细胞中的方法包括但不限于病毒介导的基因转移、脂质体介导的转移、转化、基因枪、转染和转导，例如病毒介导的基因转移，如基于DNA病毒(如腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒)的载体以及基于逆转录病毒的载体的使用。基因转移模式的实例包括例如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔，原生质体融合、脂质转染和细胞显微注射。
根据一些实施方案，可以将编码每种外源刺激性多肽的重组DNA克隆到慢病毒载体质粒中，以整合到红系细胞中。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码单个外源刺激性多肽以整合到红系细胞中的DNA。在其他实施方案中，慢病毒载体包含两种、三种、四种或更多种本文所述的外源刺激性多肽，以整合到红系细胞中。根据一些实施方案，可以将编码一种或多种外源刺激性多肽的重组DNA克隆到编码可选择性状如抗生素抗性基因的质粒DNA构建体中。根据一些实施方案，可将编码外源刺激性多肽的重组DNA克隆到适于在红系细胞中稳定表达每种重组蛋白质的质粒构建体中。
根据一些实施方案，可以采用慢病毒系统，其中将具有外源刺激性多肽序列(例如，一个、两个、三个、四个或更多个外源多肽序列)的转移载体、包膜载体和包装载体各自转染到宿主细胞中以用于病毒生产。根据一些实施方案，可以通过磷酸钙沉淀转染、基于脂质的转染或电穿孔中的任一种将慢病毒载体转染到宿主细胞中，并温育过夜。对于其中外源刺激性多肽序列可以伴有荧光报道物的实施方案，可以在过夜温育后检查宿主细胞的荧光检查。可以每8-12小时收获包含病毒颗粒的宿主细胞的培养基2或3次，并离心以沉淀分离的细胞和碎片。然后可以根据需要直接使用、冷冻或浓缩培养基。
可以在允许分化为成熟去核红细胞的合适条件下培养经受编码外源刺激性多肽的外源核酸转移的祖细胞，例如本文所述的体外培养方法。所得红细胞展示与成熟红细胞相关的蛋白质，例如血红蛋白、血型糖蛋白A以及可以通过标准方法(例如Western印迹或FACS分析)进行验证和定量的外源刺激性多肽。包含多种外源刺激性多肽的分离的成熟红细胞，包含IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的分离的成熟红细胞，以及包含至少一种选自MICA，MICB和IGF-1的外源刺激性多肽的分离的成熟去核红细胞是本公开的工程化红系细胞的非限制性实例。
在一些实施方案中，通过使红系前体细胞与编码外源刺激性多肽的外源核酸接触来产生工程化红系细胞。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由与红系前体细胞接触的RNA编码。
可以用编码一种或多种外源刺激性多肽的mRNA转染分离的红系前体细胞以产生工程化红系细胞。信使RNA可以衍生自含有对应于一种或多种外源刺激性多肽的编码序列的cDNA质粒构建体的体外转录。例如，可以将对应于外源刺激性多肽的cDNA序列插入含有与特定RNA聚合酶相容的启动子序列的克隆载体中。例如，克隆载体ZAP EXPRESS pBK-CMV(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)含有分别与T3和T7 RNA聚合酶相容的T3和T7启动子序列。对于有义mRNA的体外转录，将质粒在对应于外源多肽编码序列末端的终止密码子下游的限制性位点处线性化。使用可商购的试剂盒，如例如RNAMAXX高产率转录试剂盒(来自Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)，从线性DNA模板转录mRNA。在一些情况下，可以期望产生5'-m7GpppG-帽的mRNA。这样，可以使用例如来自Ambion(Austin,Tex.,USA)的mMESSAGEmMACHINE高产率带帽RNA转录试剂盒进行线性化cDNA模板的转录。转录可以在37℃下以20-100μl的反应体积进行30分钟至4小时。通过用DNase I短暂处理以消除线性化的DNA模板，然后在存在氯化锂、乙酸钠或乙酸铵的情况下于70％乙醇中沉淀，从反应混合物中纯化转录的mRNA。可以使用琼脂糖甲醛凝胶或可商购的Novex预制TBE凝胶(例如Novex,Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)进行电泳来评估转录的mRNA的完整性。
可以使用多种方法，包括例如脂质转染和电穿孔将编码一种或多种外源刺激性多肽的信使RNA引入网织红细胞中(van Tandeloo et al.,Blood98:49-56(2001))。为了进行脂质转染，例如，将5μg的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中体外转录的mRNA与阳离子脂质DMRIE-C(Invitrogen)以1:4的比率温育5-15分钟。或者，多种其他阳离子脂质或阳离子聚合物可以用于用mRNA转染细胞，包括例如DOTAP、各种形式的聚乙烯亚胺和聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)，和Superfect(Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.,USA；参见例如，Bettinger et al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891(2001))。将得到的mRNA/脂质复合物与细胞(1-2×106个细胞/ml)在37℃下温育2小时，洗涤并返回培养。对于电穿孔，例如，将500μl的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中的约5至20x106个细胞与约20μg的体外转录的mRNA混合，并在0.4厘米的比色杯中使用例如Easyject Plus设备(EquiBio,Kent,United Kingdom)进行电穿孔。在一些情况下，可能有必要测试各种电压、电容和电穿孔体积，以确定将特定mRNA转染到网织红细胞中的有用条件。通常，有效地用mRNA转染细胞所需的电穿孔参数似乎比DNA电穿孔所需的电穿孔参数对细胞的危害小(van Tandeloo et al.,Blood98:49-56(2001))。
或者，可以使用肽介导的RNA递送策略将mRNA转染到红系前体细胞中(参见例如，Bettinger et al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891(2001))。例如，可以将阳离子脂质聚乙烯亚胺2kDA(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)与蜂毒肽(mellitin peptide)(Alta Biosciences,Birmingham,UK)组合以提高mRNA转染的效率，特别是在有丝分裂后原代细胞中。可以使用二硫化物交联剂，如例如，异双功能交联剂琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，将蜂毒肽与PEI缀合。将体外转录的mRNA与蜂毒肽-PEI预温育5至15分钟，以形成RNA/肽/脂质复合物。然后在37℃，5％CO2湿润的环境中，将此复合物添加到无血清培养基中的细胞2至4小时，然后将其除去，并允许转染的细胞继续在培养物中生长。
在一些实施方案中，通过使合适的分离的红系前体细胞或血小板前体细胞与编码一种或多种外源刺激性多肽的外源核酸接触来产生工程化红系细胞。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源刺激性多肽由RNA编码，该RNA与血小板、有核红系细胞或有核血小板前体细胞接触。
可以使用各种DNA技术(包括瞬时或稳定转染和基因治疗方法)将一种或多种外源刺激性多肽遗传引入终末分化之前的红系前体细胞、血小板前体或有核红系细胞中。外源刺激性多肽可以在成熟红细胞或血小板的表面上和/或细胞质中表达。
病毒基因转移可以用于用编码一种或多种外源刺激性多肽的DNA转染细胞。许多病毒可以用作基因转移媒介物，包括例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人免疫缺陷病毒1(HIV 1)和泡沫病毒(spumavirus)如泡沫病毒(foamy virus)(参见例如，Osten et al.,HEP 178:177-202(2007))。例如，逆转录病毒可以有效地转导包括人类细胞在内的哺乳动物细胞并整合到染色体中，从而赋予稳定的基因转移。
可以将一种或多种外源刺激性多肽转染到红系前体细胞、血小板前体细胞或有核红系细胞中，表达并随后在成熟的红细胞或血小板中保留并且展示。合适的载体是莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)载体主链(Malik et al.,Blood 91:2664-2671(1998))。基于MMLV(致癌逆转录病毒)的载体目前用于基因疗法临床试验中(Hossle et al.,NewsPhysiol.Sci.17:87-92(2002))。例如，可以使用标准分子生物学技术在MMLV载体主链中产生含有编码外源刺激性多肽的cDNA的DNA构建体。将构建体转染到包装细胞系(如例如PA317细胞)中，并且将病毒上清液用于转染生产细胞(如例如PG13细胞)。PG13病毒上清液与已经如本文所述分离并培养或新鲜分离的红系前体细胞、血小板前体或有核红系细胞一起温育。可以使用FACS分析(荧光激活的细胞分选)，例如用针对外源多肽的荧光标记抗体来监测外源刺激性多肽的表达(如果其位于工程化红系细胞的表面上)。可以使用类似的方法来表达位于工程化红系细胞内部的外源多肽。
任选地，可以使用基于病毒的方法转染荧光跟踪分子，如例如绿色荧光蛋白(GFP)(Tao et al.,Stem Cells 25:670-678(2007))。使用包装细胞如例如Phoenix-Eco细胞系(由Orbigen,San Diego,Calif.配销)包装含有编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(例如，DsRed-Express)的DNA的异位逆转录病毒载体。包装细胞系稳定地表达适当的病毒包装所需的病毒蛋白，包括例如gag、pol和env。来自已经沉积了病毒颗粒的Phoenix-Eco细胞的上清液用于转导例如红系前体细胞、血小板前体或有核红系细胞。在一些情况下，可以在特定包被的表面上进行转导，如例如重组纤连蛋白的片段，以提高逆转录病毒介导的基因转移的效率(例如，RetroNectin,Takara Bio USA,Madison,Wis.)。将细胞与逆转录病毒Phoenix-Eco上清液加合适的辅因子一起在RetroNectin包被的板中温育。第二天可以重复进行转导。在这种情况下，可以通过FACS评估表达EGFP或DsRed-Express的细胞的百分比。其他可以用于评估转导效率的报告物基因包括，例如，beta-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和萤光素酶以及低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)，和人细胞表面CD24抗原(Bierhuizen et al.,Leukemia 13:605-613(1999))。
非病毒载体可以用于将遗传物质引入合适的红系细胞、血小板或其前体中以产生本文所述的工程化红系细胞。非病毒介导的基因转移与病毒介导的基因转移的不同之处在于，质粒载体不含蛋白质、毒性较小、易于扩大规模并且没有宿主细胞的偏好。质粒载体的“裸DNA”本身不能有效地将编码多肽的遗传物质递送至细胞，因此与能够进入细胞的基因递送方法相组合。可以使用多种递送方法将非病毒载体转移到合适的红系细胞、血小板或其前体中，包括化学和物理方法。
可以使用合成的大分子，如阳离子脂质和聚合物将编码一种或多种外源刺激性多肽的非病毒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou et al.,GeneTherapy 12:S118-S130(2005))。阳离子脂质体例如通过电荷相互作用与DNA形成复合物。带正电的DNA/脂质复合物与负细胞表面结合，并通过内吞作用被细胞吸收。该方法可以用于例如转染造血细胞(参见例如，Keller et al.,Gene Therapy 6:931-938(1999))。对于红系细胞、血小板或其前体，将质粒DNA(在25-100μL的无血清培养基如例如OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中大约0.5μg)与阳离子脂质体(在25μL的无血清培养基中约4μg)如可商购的转染试剂Lipofectamine.TM.(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)混合并允许温育至少20分钟以形成复合物。将DNA/脂质体复合物添加到合适的红系细胞、血小板或其前体中，并温育5-24小时，之后可以测定多肽的转基因表达。或者，可以使用其他可商购脂质体转染剂(例如，In vivo GeneSHUTTLE.,Qbiogene,Carlsbad,Calif.)。
任选地，阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)可以用于有效转染红系细胞祖细胞，例如造血和脐带血来源的CD34+细胞(参见例如，Shin et al.,Biochim.Biophys.Acta1725:377-384(2005))。从人脐带血中分离出人CD34+细胞，并在补充有200ng/ml干细胞因子和20％热失活的胎牛血清的Iscove改良的Dulbecco培养基中培养。将编码外源刺激性多肽的质粒DNA与大小在0.8K至750K之间的支链或线性PEI(Sigma Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA；Fermetas,Hanover,Md.,USA)温育。将PEI制备为4.2mg/ml蒸馏水的储备溶液，并使用HCl轻微酸化至pH 5.0。可以在室温下以不同的氮/磷酸盐比率将DNA与PEI混合30分钟，基于以下计算：1μg的DNA含有3nmol磷酸盐，1μl的PEI储备液含有10nmol胺氮。用DNA/阳离子复合物接种分离的CD34+细胞，以280xg离心5分钟，并在培养基中温育4个或更多个小时直到评估多肽的基因表达。
可以使用物理方法如粒子介导的转染、“基因枪”、生物弹药(biolistics)或粒子轰击技术的将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou,et al.,(2005)Gene Therapy 12:S118-S130)。在这种情况下，编码多肽的DNA被吸收到金颗粒上，并通过粒子枪施用于细胞。该方法可以用于例如转染红系细胞祖细胞，例如衍生自脐带血的造血干细胞(参见例如，Verma et al.,Gene Therapy 5:692-699(1998))。这样，分离出脐带血并在磷酸盐缓冲盐水中稀释三倍。使用抗CD34单克隆抗体组合包被有第二抗体的磁性微珠和磁性分离系统(例如，Miltenyi MiniMac系统,Auburn,Calif.,USA)纯化CD34+细胞。可以如本文所述培养富含CD34+的细胞。为了转染，通过用氯化钙和亚精胺处理，将编码多肽的质粒DNA沉淀到颗粒例如金珠上。在用乙醇洗涤包被有DNA的珠子之后，可以使用例如Biolistic PDS-1000/He系统(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)将珠子递送到培养的细胞中。可以使用报告物基因，如例如beta-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白来评估转染效率。
任选地，可以使用电穿孔方法将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中。电穿孔在细胞膜上产生瞬时孔，从而允许将各种分子(包括例如DNA和RNA以及抗体和药物)引入细胞。这样，如本文所述分离并培养CD34+细胞。紧接在电穿孔之前，通过在室温下以250xg离心10分钟来分离细胞，并以0.2-10x106个活细胞/ml重悬于电穿孔缓冲液中，如例如补充有1.0％人血清白蛋白(HSA)的X-VIVO 10。将质粒DNA(1-50μg)与500μl细胞悬液一起添加到适当的电穿孔比色杯中。电穿孔可以使用例如ECM 600电穿孔仪(Genetronics,San Diego,Calif.,USA)以200V至280V的电压范围和25至70毫秒的脉冲长度来完成。许多可替代的电穿孔仪器是可商购的，并且可以用于该目的(例如，Gene Pulser XCELL,BioRad,Hercules,Calif.；Cellject Duo,Thermo Science,Milford,Mass.)。或者，也可以使用以下参数对分离的CD34+细胞进行有效的电穿孔：4mm比色杯、1600μF、550V/cm和以1x105个细胞/ml每500μl的细胞10μg的DNA(Oldak et al.,Acta Biochimica Polonica49:625-632(2002))。
核转染(电穿孔的一种形式)也可以用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，在细胞类型特异性溶液中使用能够使DNA(或其他试剂)直接转运至核从而降低在细胞质中可能降解的风险的电参数进行转染。例如，人CD34细胞核转染试剂盒(来自Amaxa Inc.)可以用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，将人CD34细胞核转染溶液中的1-5x106个细胞与1-5μg的DNA混合，并使用制造商确定的预编程设置在核转染仪器中进行转染。
可以用常规表达载体对红系细胞、血小板或其前体进行非病毒转染，所述常规表达载体除非整合到基因组中否则不能在哺乳动物细胞中自我复制。或者，可以用附加型载体转染红系细胞、血小板或其前体，所述附加型载体可以作为自主复制的遗传单位而保留在宿主核中而不整合到染色体中(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。这些载体利用了从在潜伏感染后通常在细胞中染色体外复制的病毒衍生的遗传元件，所述病毒如例如EBV、人多瘤病毒BK、牛乳头瘤病毒1(BPV-1)、单纯疱疹病毒1(HSV)和猿猴病毒40(SV40)。哺乳动物人工染色体也可以用于非病毒基因转移(Vanderbyl et al.,Exp.Hematol.33:1470-1476(2005))。
编码一种或多种外源刺激性多肽的外源核酸可以通过本领域已知的标准分子生物学方法组装成表达载体，例如限制性消化、重叠延伸PCR和Gibson组装。
外源核酸可以包含编码一种或多种外源刺激性多肽的基因，所述外源多肽通常不在例如红系细胞的细胞表面表达，与编码内源或天然膜蛋白的基因融合，使得外源刺激性多肽在细胞表面上表达。例如，可以将编码外源刺激性多肽的外源基因克隆在1型膜蛋白前导序列后的N端，2型膜蛋白的C端或GPI连接的膜蛋白的GPI附着位点的上游。
可以使用标准的克隆方法在两个融合基因之间引入柔性氨基酸接头。例如，柔性接头是聚甘氨酸聚丝氨酸接头，如[Gly4Ser]3，其通常用于从全长抗体中生成单链抗体片段(Antibody Engineering:Methods&Protocols,Lo2004)，或ala-gly-ser-thr多肽，如用于产生单链Arc阻遏物的多肽(Robinson&Sauer,PNAS 1998)。在一些实施方案中，与没有柔性接头的等同构建体相比，柔性接头为多肽提供了更大的柔性和空间自由度。
表位标签可以置于两个融合基因之间，如例如，编码HA表位标签的氨基酸序列-氨基酸YPYDVPDYA(SEQ ID NO:78)、CMyc标签-氨基酸EQKLISEEDL(SEQ ID NO:79)或Flag标签-氨基酸DYKDDDDK(SEQ ID NO:80)。表位标签可以用于通过流式细胞仪、western印迹或免疫沉淀使用针对表位标签的抗体，方便地检测和定量表达。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含一种或多种外源刺激性多肽和至少一种其他异源多肽。至少一种其他异源多肽可以是荧光蛋白。荧光蛋白可以用作报告物以评估转导效率。在一些实施方案中，如果以下两者均由相同的转录物制备，则将荧光蛋白用作报告物以评估外源刺激性多肽的表达水平。在一些实施方案中，至少一种其他多肽是异源的并且提供功能，如例如多种抗原、多种捕获靶物、酶级联。在一些实施方案中，重组核酸包含编码外源刺激性多肽的基因和第二基因，其中第二基因通过病毒来源的T2A序列(gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct(SEQ ID NO:81))与编码外源刺激性多肽的基因分开，其翻译后被切割成两个成熟蛋白质。
在一些实施方案中，将红系细胞群体与慢病毒载体一起温育，所述慢病毒载体包含编码一种或多种外源刺激性多肽的外源核酸，其特定质粒可以包括pLKO.1puro、PLKO.1--TRC克隆载体、pSico、FUGW、pLVTHM、pLJM1、pLion11、pMD2.G、pCMV-VSV-G、pCI-VSVG、pCMV-dR8.2 dvpr、psPAX2、pRSV-Rev和pMDLg/pRRE以生成工程化红系细胞。可以以10、100、1,000、10,000pfu施用载体，并温育12小时。
在某些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞，其呈现与第二外源刺激性多肽缀合的第一外源刺激性多肽。缀合可以化学或酶促实现。化学缀合可以在使用或不使用接头的情况下通过外源抗原呈递多肽和一种或多种外源刺激性多肽的共价键合来实现。化学缀合可以在使用或不使用接头的情况下通过共刺激性多肽和结合对成员的共价键合来实现。化学缀合可以在使用或不使用接头的情况下通过共抑制性多肽和结合对成员的共价键合来实现。此类缀合物的形成在本领域技术人员的技术范围内，并且已知各种技术可用于完成缀合，其中特定技术的选择由待缀合的材料指导。向多肽(C端或N端)添加氨基酸，所述氨基酸含有可离子化的侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸)且不包含在多肽序列的活性部分中，以其未质子化的状态用作有效力的亲核试剂以参与与附接到聚合物(如同双功能或异双功能的PEG)上的反应基团的各种生物缀合反应(例如，Lutolf and Hubbell,Biomacromolecules 2003；4:713-22,Hermanson,Bioconjugate Techniques,London.Academic Press Ltd；1996)。
其他分子融合物可以在外源刺激性多肽之间形成并且包括直接或间接缀合。外源多肽可以彼此直接缀合或通过接头间接缀合。接头可以是肽，聚合物，适体或核酸。聚合物可以是例如天然的，合成的，线性或支链的。外源刺激性多肽可包含异源融合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，该融合蛋白包含彼此直接连接或在一个或两个末端用中间接头序列和/或其他序列连接。与接头的缀合可以通过共价键或离子键进行。
在某些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞，其呈现与第二外源刺激性多肽复合的第一外源刺激性多肽。在其他实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在进一步的实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在其他进一步的实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽通过接头，例如GGGGS接头(SEQ ID NO:11)，特别是(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:12)与IL-15RA多肽的胞外部分连接。
还可以使用偶联试剂将外源刺激性多肽与细胞连接来产生本文所述的红系细胞。例如，可以使用点击化学。例如，当外源多肽是复杂的或难以表达的多肽，例如多肽，例如多聚体多肽；大多肽；体外衍生的多肽；对红系细胞可能具有毒性或无法在红系细胞中有效表达的外源多肽时，偶联试剂可以用于将外源多肽偶联至细胞。用于功能化红细胞的点击化学和其他缀合方法描述于国际申请号PCT/US2018/000042中，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文。
因此，在一些实施方案中，本文所述的红系细胞包含每细胞多达、至少、超过或约5,000、10,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000个偶联试剂。在一些实施方案中，红系细胞通过以下方法制备：a)将第一偶联试剂偶联至红系细胞，从而制备药物制剂、产物或中间体。在一个实施方案中，方法进一步包括：b)使细胞与偶联于第二偶联试剂的外源刺激性多肽接触，例如在适合于第一偶联试剂与第二偶联试剂反应的条件下。在实施方案中，将两种或更多种外源刺激性多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)。在实施方案中，将第一外源刺激性多肽偶联至细胞(例如使用点击化学)，并且第二外源刺激性多肽包含从外源核酸表达的多肽。
在一些实施方案中，偶联试剂包括叠氮化物偶联试剂。在一些实施方案中，叠氮化物偶联试剂包含叠氮烷基部分、叠氮芳基部分或叠氮杂芳基部分。示例性叠氮化物偶联试剂包括3-叠氮丙酸磺基-NHS酯、叠氮乙酸NHS酯、叠氮基-PEG-NHS酯、叠氮基丙胺、叠氮基-PEG-胺、叠氮基-PEG-马来酰亚胺、双砜-PEG-叠氮化物或其衍生物。偶联试剂还可以包含烯烃部分，例如反式环烯烃部分、氧杂降冰片二烯部分或四嗪部分。另外的偶联试剂可以在点击化学工具(https://clickchemistrytools.com/)或Lahann,J(ed)(2009)ClickChemistry for Biotechnology and Materials Science中找到，其每一篇均以其整体通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，外源刺激性多肽经由共价附接而附接到红系细胞，以产生工程化红系细胞，其包含呈现一种或多种外源刺激性多肽(例如第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽)的红系细胞。例如，可以使用含有亲电基团的偶联化合物将刺激性多肽衍生化并与红细胞或血小板结合，所述亲电基团将与红系细胞或血小板上的亲核试剂反应形成相互键合的关系。这些亲电基团的代表是αβ不饱和羰基、烷基卤化物和硫醇试剂，如取代的马来酰亚胺。另外，偶联化合物可以经由多肽中的一个或多个官能团，如氨基、羧基和酪氨酸基团与外源刺激性多肽偶联。为此目的，偶联化合物应包含游离羧基、游离氨基、芳族氨基和其他能够与酶官能团反应的基团。还可以制备高电荷的外源刺激性多肽以通过静电键合固定化在例如红系细胞或血小板上以产生工程化红系细胞。这些衍生物的实例包括聚赖氨酰和聚谷氨酰酶。
衍生物中包含的反应性基团的选择取决于用于使亲电子与红系细胞或血小板上的亲核基团偶联以进行固定化的反应条件。一个控制因素是期望在偶联通过与红系细胞或血小板的附着而固定化的外源刺激性多肽之前不使偶联试剂失活。此类偶联固定化反应可以以多种方式进行。通常，偶联试剂可以用于在外源多肽与红系细胞或血小板之间形成桥。在这种情况下，偶联试剂应具有可以使之与外源多肽反应的官能团，如羧基。制备用于缀合的外源刺激性多肽的一种方法包括利用偶联试剂中的羧基形成与外源多肽反应的混合酸酐，其中使用能够形成混合酸酐的激活物。此类激活物的代表是氯甲酸异丁酯或其他氯甲酸酯，其与偶联试剂如5,5'-(二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、对氯汞苯甲酸酯(CMB)或间马来酰亚胺基苯甲酸(MBA)产生混合酸酐。偶联试剂的混合酸酐与外源多肽反应以产生反应性衍生物，该反应性衍生物继而可以与红系细胞或血小板上的亲核基团反应以固定化外源刺激性多肽。
可以用碳二亚胺等激活物激活外源刺激性多肽上的官能团，如羧基。随后，桥接试剂上的官能团，如氨基，将与外源刺激性多肽上的激活基团反应形成反应性衍生物。另外，偶联试剂应具有第二反应性基团，其将与红系细胞或血小板上的适当亲核基团反应形成桥。此类反应性基团的典型代表是烷基化剂，如碘乙酸、αβ不饱和羰基化合物，如丙烯酸等，硫醇试剂，如汞、取代的马来酰亚胺等。
或者，可以激活外源刺激性多肽上的官能团，以便与例如红系细胞或血小板上的亲核试剂直接反应，从而消除了对形成桥的化合物的需要。为此目的，使用激活物如伍德沃德试剂K或类似的试剂，其使外源多肽中的羧基形成烯醇酯，与混合酸酐不同。随后，外源多肽的烯醇酯衍生物与例如红系细胞或血小板上的亲核基团反应以实现外源刺激性多肽的固定化，从而产生工程化红系细胞。
在一些实施方案中，通过使红系细胞与外源刺激性多肽和任选的有效负载(payload)接触来产生包含多种外源刺激性多肽的工程化红系细胞，其中接触不包括使用以下附接位点将外源刺激性多肽与红系细胞缀合，所述附接位点包含Band 3(CD233)、水通道蛋白-1、Glut-1、Kidd抗原、RhAg/R1i50(CD241)、Rli(CD240)、Rh30CE(CD240CE)、Rh30D(CD240D)、Kx、血型糖蛋白B(CD235b)、血型糖蛋白C(CD235c)、血型糖蛋白D(CD235d)、Kell(CD238)、Duffy/DARCi(CD234)、CR1(CD35)、DAF(CD55)、红细胞糖苷脂、CD44、ICAM-4(CD242)、Lu/B-CAM(CD239)、XG1/XG2(CD99)、EMMPRIN/neurothelin(CD147)、JMH、糖基转移酶、Cartwright、Dombrock、C4A/CAB、Scianna、MER2、stomatin、BA-1(CD24)、GPIV(CD36)、CD108、CD139或H抗原(CD173)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含呈现一种或多种外源刺激性多肽的红系细胞，其中一种或多种外源刺激性多肽以酶方式缀合到细胞上。
在具体的实施方案中，可以通过各种化学和酶促方法将外源刺激性多肽缀合至例如红系细胞或血小板的表面，包括但不限于与双功能交联剂如例如NHS酯-马来酰亚胺异双功能交联剂，以将伯胺基与还原的硫醇基连接。这些方法还包括酶促策略，如例如，由分选酶介导的转肽酶反应，以使包含受体序列LPXTG(SEQ ID NO:82)或LPXTA(SEQ ID NO:83)的一个多肽与包含N端供体序列GGG的多肽连接，参见例如Swee et al.,PNAS 2013。方法还包括组合方法，如例如分选酶介导的点击化学柄(叠氮化物和炔烃)分别在抗原和细胞上的缀合，然后通过环加成反应将抗原化学键合到细胞上，参见例如Neves et al.,BioconjugateChemistry,2013。分选酶介导的蛋白质修饰描述于国际申请号PCT/US2014/037545和国际申请号PCT/US2014/037554，两者以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，通过缀合包含氨基酸、肽、蛋白质、多核苷酸、碳水化合物、标签、金属原子、造影剂、催化剂、非多肽聚合物、识别元件、小分子、脂质、接头、标记、表位、抗原、治疗剂、毒素、放射性同位素、颗粒或包含反应性化学基团(例如点击化学柄)的部分的分选酶底物来修饰蛋白质。
如果需要，可以在细胞内或细胞外在例如红系细胞或血小板上或之内表达形成催化键的多肽结构域。存在许多形成催化键的多肽，包括转肽酶、分选酶和异肽酶，包括衍生自Spy0128(从酿脓链球菌分离的蛋白质)的多肽。
在一些实施方案中，使用分选酶不将本文所述的任何多肽缀合至细胞。
已经证明，分裂Spy0128的自催化异肽键形成亚基(CnaB2结构域)导致两个截然不同的多肽，其彼此保留特异性的催化活性。该系统中的多肽称为SpyTag和SpyCatcher。混合后，SpyTag和SpyCatcher在SpyTag上的Asp117和SpyCatcher上的Lys31之间进行异肽键形成(Zakeri and Howarth,JACS 2010,132:4526)。该反应与细胞环境兼容并且对蛋白质/肽结合具有高度特异性(Zakeri,B.；Fierer,J.O.；Celik,E.；Chittock,E.C.；Schwarz-Linek,U.；Moy,V.T.；Howarth,M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,E690-E697)。SpyTag和SpyCatcher已显示指导弹性蛋白样蛋白质的翻译后拓扑修饰。例如，将SpyTag放置在N端并将SpyCatcher放置在C端指导形成环状弹性蛋白样蛋白质(Zhang et al,Journal of the American Chemical Society,2013)。
可以互换组分SpyTag和SpyCatcher，使得其中分子A与SpyTag融合且分子B与SpyCatcher融合和分子A与SpyCatcher融合且分子B与SpyTag融合的系统在功能上等同。出于本文档的目的，当使用SpyTag和SpyCatcher时，应理解，互补分子可以代替其位置。
形成催化键的多肽，如SpyTag/SpyCatcher系统，可以用于将外源刺激性多肽附着到例如红系细胞的表面，以产生工程化红系细胞。SpyTag多肽序列可以在红系细胞的细胞外表面表达。可以例如将SpyTag多肽融合至1型或3型跨膜蛋白(例如血型糖蛋白A)的N端，融合至2型跨膜蛋白(例如Kell)的C端，并框内插入多通道跨膜蛋白的细胞外末端或细胞外环中，例如，Band 3与GPI受体多肽融合，例如，CD55或CD59与脂质链锚定的多肽融合，或与外周膜蛋白融合。编码SpyTag融合物的核酸序列可以在工程化红系细胞内表达。外源刺激性多肽可以与SpyCatcher融合。编码SpyCatcher融合蛋白的核酸序列可以从表达SpyTag融合蛋白的同一红系细胞中表达和分泌。或者，可以在例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或无细胞的生产系统中外源地产生编码SpyCatcher融合物的核酸序列。SpyTag和SpyCatcher多肽反应后，将形成共价键，该键将外源刺激性多肽附着在红系细胞的表面上以形成工程化红系细胞。
在一些实施方案中，可以在红系细胞中在Gatal启动子的控制下，将SpyTag多肽表达为与血型糖蛋白A的N端的融合物。可以在同一红系细胞中Gatal启动子的序列控制下表达与SpyCatcher多肽序列融合的外源刺激性多肽。当两种融合多肽均表达后，异肽键将在SpyTag和SpyCatcher多肽之间形成，从而在红系细胞表面和外源刺激性多肽之间形成共价键。
在另一个实施方案中，可以在红系细胞中在Gatal启动子的控制下，将SpyTag多肽表达为与血型糖蛋白A的N端的融合物。与SpyCatcher多肽序列融合的外源刺激性多肽可以在合适的哺乳动物细胞表达系统，例如HEK293细胞中表达。在红系细胞上表达SpyTag融合多肽后，可以使SpyCatcher融合多肽与细胞接触。在合适的反应条件下，异肽键将在SpyTag和SpyCatcher多肽之间形成，从而在红系细胞表面和外源刺激性多肽之间形成共价键。
在某些实施方案中，将外源刺激性多肽加载到工程化红系细胞中。在一些实施方案中，通过向例如红系细胞或血小板加载一种或多种外源刺激性多肽，从而使一种或多种外源刺激性多肽在红系细胞或血小板中内化来产生工程化红系细胞。任选地，红系细胞或血小板可以另外加载有效载荷，例如治疗剂。
可以使用多种方法来向例如红系细胞或血小板中加载外源刺激性多肽。合适的方法包括，例如低渗裂解、低渗透析、渗透、渗透脉冲、渗透休克、离子电泳、电穿孔、超声、显微注射、钙沉淀、膜插层、脂质介导的转染、去污剂处理、病毒感染、扩散、受体介导的内吞作用、蛋白质转导结构域的使用、粒子发射、膜融合、冻融、机械破坏和过滤。任何一种此类方法或其组合可以用于产生本文所述的工程化红系细胞。
对于低渗裂解，例如，将红系细胞暴露于低离子强度的缓冲液中使其破裂。外源刺激性多肽分布在细胞内。可以通过向分离的红细胞沉淀中添加30-50倍体积的5mM磷酸盐缓冲液(pH 8)来低渗裂解红系细胞，特别是红细胞。通过离心分离得到的裂解的细胞膜。将裂解的红细胞膜沉淀重悬并在外源多肽存在下在低离子强度缓冲液中温育例如30分钟。或者，可以将裂解的红细胞膜与外源多肽温育少至一分钟或长达几天，这取决于确定有效负载红系细胞的最佳条件。
或者，可以使用针对低渗溶液的受控透析来向红系细胞，特别是红细胞加载外源刺激性多肽，以使细胞溶胀并在细胞膜中形成孔(参见例如，美国专利号4,327,710；5,753,221；和6,495,351)。例如，将分离的红细胞沉淀重悬于10mM HEPES、140mM NaCl、5mM葡萄糖pH 7.4中，并在含有10mM NaH2PO4、10mM NaHCO3、20mM葡萄糖和4mM MgCl2，pH 7.4的低离子强度缓冲液进行透析。30-60分钟后，将红细胞进一步用含有外源多肽的16mM NaH2PO4，pH7.4溶液透析另外30-60分钟。所有这些程序都可以在4℃的温度下有利地进行。在一些情况下，通过透析方法加载大量的红系细胞，特别是红细胞可能是有益的，并且可以使用为此目的设计的特定设备(参见例如美国专利号4,327,710、6,139,836和6,495,351)。
可以在生理溶液如例如0.9％盐水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、细胞培养基、血浆或淋巴液的存在下，通过温和加热来重新密封加载的红系细胞，特别是红细胞。例如，可以通过在60℃的温度下例如100mM磷酸盐(pH 8.0)和150mM氯化钠的150mM盐溶液中处理破坏的红系细胞(特别是红细胞)1-2分钟来产生密封良好的膜。或者，可以将细胞在25-50℃的温度下温育30分钟至4小时(参见例如，美国专利申请2007/0243137A1)。或者，可以通过在37℃的温度下在5mM腺嘌呤、100mM肌苷、2mM ATP、100mM葡萄糖、100mM丙酮酸钠、4mMMgCl2、194mM NaCl、1.6M KCl和35mM NaH2PO4，pH 7.4中温育20-30分钟来重新密封破坏的红细胞(参见例如，美国专利号5,753,221)。
对于电穿孔，例如将红系细胞或血小板暴露于电场中，该电场在细胞膜上引起瞬时孔，从而允许一种或多种外源刺激性多肽扩散到细胞中(参见例如，美国专利号4,935,223)。红系细胞，特别是红细胞，例如悬浮在生理和导电介质，如向其中添加一种或多种外源刺激性多肽的无血小板血浆中。将体积为0.2至1.0ml的混合物放入电穿孔比色杯中，并在冰上冷却10分钟。将比色杯放置在电穿孔设备中，如例如，ECM 830(来自BTX InstrumentDivision,Harvard Apparatus,Holliston,Mass.)。用大约2.4毫秒长的单个脉冲和大约2.0kV/cm的场强对细胞进行电穿孔。或者，可以使用Bio-Rad Gene Pulsar设备(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)以0.25.mu.F递送2.2kV的双脉冲对红系细胞特别是红细胞进行电穿孔，以实现载量超过60％(Flynn et al.,Cancer Lett.82:225-229(1994))。将比色杯返回到冰浴中10-60分钟，然后置于37℃水浴中以诱导细胞膜的重新密封。任何合适的电穿孔方法均可以用于产生本文所述的工程化红系细胞。
对于超声处理，例如，将红系细胞暴露于高强度声波中，引起细胞膜的瞬时破坏，从而允许一种或多种外源刺激性多肽扩散到细胞中。任何合适的超声处理方法可以用于产生本文所述的工程化红系细胞。
对于去污剂处理，例如，用通过产生孔瞬时破坏细胞膜的温和去污剂处理红系细胞，一种或多种外源刺激性多肽可以扩散通过所述孔。加载细胞后，将去污剂从细胞中冲洗掉。例如，去污剂可以是皂苷。任何合适的去污剂处理方法均可以用于产生本文所述的工程化红系细胞。
对于受体介导的内吞作用，例如，红系细胞可以具有下述表面受体，该表面受体在结合一种或多种外源刺激性多肽时诱导受体和相关外源刺激性多肽的内化。任何合适的内吞方法可以用于产生本文所述的工程化红系细胞。
对于机械射击，可以用附着在重的或带电的粒子(例如金微载体)上并受到机械或电加速的一种或多种外源刺激性多肽轰击红系细胞，使得它们穿过细胞膜。可以使用例如Helios基因枪(来自，例如，Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)实现微粒轰击。任何合适的微粒轰击方法可以用于产生本文所述的工程化红系细胞。
对于过滤，可以迫使红系细胞或血小板和外源刺激性多肽通过孔径小于细胞的滤器，从而引起细胞膜的瞬时破坏并允许外源刺激性多肽进入细胞。可以使用任何合适的过滤方法来产生如本文所述的工程化红系细胞。
对于冻融，对红系细胞进行数次冻融循环，导致细胞膜破裂(参见例如，美国专利申请2007/0243137 A1)。在这种情况下，将堆积的红细胞(0.1-1.0ml)沉淀与等体积(0.1-1.0ml)的含有一种或多种外源刺激性多肽的等渗溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)混合。将含有细胞和一种或多种外源刺激性多肽的试管浸入液氮中将红细胞冷冻。或者，可以通过将试管置于-20℃或-80℃的冷冻室中来冷冻细胞。然后将细胞在例如23℃的水浴中解冻，并在必要时重复循环以增加加载。可以使用任何合适的冻融方法来产生如本文所述的工程化红系细胞。
可以在工程化红系细胞上检测外源刺激性多肽。外源刺激性多肽的存在可以使用标准分子生物学方法，例如Western印迹或FACS分析来验证和定量。细胞内环境中存在的外源刺激性多肽可以在细胞裂解或使用荧光检测时进行定量。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
III.使用方法
如本文所述，本发明提供了刺激免疫细胞，例如溶细胞性T细胞(CD8+细胞)，记忆CD8+T细胞，T辅助细胞(CD4+细胞)和NK细胞的方法。免疫细胞的刺激可以增强正常的细胞功能，或在异常细胞中引发正常的细胞功能。该方法涉及以有效刺激免疫细胞的量使待活化的免疫细胞与本文方面和实施方案中任一项的工程化红系细胞接触。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。刺激免疫细胞是指导致免疫细胞，例如杀伤免疫细胞，例如NK细胞和/或CD8+T细胞的细胞应答，例如活化和/或扩充的过程(例如，其涉及信号或刺激的提供)。在一些实施方案中，刺激免疫细胞，例如杀伤免疫细胞例如NK细胞和/或CD8+T细胞的方法是指提供导致免疫细胞活化/或扩充的刺激或信号，例如刺激性多肽。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了模拟免疫杀伤细胞，例如溶细胞性T细胞(CD8+细胞)，记忆CD8+T细胞和NK细胞的方法，包括使免疫杀伤细胞与有效刺激免疫杀伤细胞的量的本文方面和实施方案中任一项的工程化红系细胞(例如工程化去核细胞)接触。可以通过本发明的方法刺激的免疫杀伤细胞包括例如溶细胞性T细胞(CD8+细胞)，记忆CD8+T细胞和NK细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，NK细胞是记忆样NK细胞。在一些实施方案中，杀伤免疫细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是记忆T细胞。因此，本发明还提供了由本文所述的工程化红系细胞刺激方法产生的细胞群体。
在某些实施方案中，工程化红系细胞用于同时刺激超过一种类型的杀伤性免疫细胞，例如溶细胞性T细胞(CD8+细胞)，记忆CD8+T细胞和NK细胞中超过一种的方法。在示例性实施方案中，工程化红系细胞能够同时刺激CD8+T细胞和NK细胞两者。
在一些实施方案中，使免疫杀伤细胞与工程化红系细胞接触在体内进行。本发明的一个优点是，当在体内进行接触时，可以活化超过一种免疫杀伤细胞群体。例如，当在体内进行接触时，NK细胞和CD8+T细胞均可被活化和/或扩充。
在另一个实施方案中，使免疫杀伤细胞与工程化红系细胞接触离体进行。因此，在一些实施方案中，将一种或多种天然杀伤细胞与本发明的工程化红系细胞离体接触。
NK细胞可以从任何常规来源获得，并且优选衍生自外周血，骨髓，脐带血，细胞系或细胞因子刺激的外周血。NK细胞可以例如从外周血单个核细胞(PBMC)的样品中扩充。PBMC是单核细胞和淋巴细胞的混合物；分离出并去除粒细胞的血白细胞。在培养细胞(例如PBMC)之前，根据技术人员公知的方法纯化和分离它们。先前已经在来自健康个体的PBMC上优化了用于细胞毒性细胞扩充的培养条件(Carlens et al.,Hum.Immunol.2001；62:1092-1098)。在某些实施方案中，NK细胞扩充至约100至约1,000,000倍，或约1,000至约1,000,000倍，例如1,000至约100,000倍。
随后，可以将扩充的NK细胞施用于有此需要的受试者，例如，需要免疫细胞刺激的受试者。施用可以进行一次或重复几次。
在另一个实施方案中，一个或多个CD8+T细胞离体与本发明的工程化红系细胞重新接触。
离体T细胞的活化和扩充可以通过分离T细胞并随后刺激，然后进一步扩充来进行。在扩充之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单个核细胞，骨髓，淋巴结组织，脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以使用熟练技术人员已知的许多技术，例如ficoll分离，从从受试者收集的血液单位中获得T细胞。在一些实施方案中，通过单采血液成分术(apheresis)或白细胞单采术(leukapheresis)从个体的循环血液中获得细胞。单采血液成分术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞，单核细胞，粒细胞，B细胞，其他有核白细胞，红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于随后的处理步骤。在本发明的一些实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，例如通过使用半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器)根据制造商的说明进行。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，诸如例如无Ca，无Mg PBS。或者，可以除去白细胞单采术样品的不想要的成分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在另一个实施方案中，通过裂解红细胞并消减单核细胞，例如通过经由PERCOLL梯度的离心，从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或负选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD28+，CD4+，CD8+，CD45RA+和CD45RO+T细胞。通过负选择富集T细胞群体可以通过针对负选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。一种优选的方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，该流式细胞术使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。为了通过正或负选择分离期望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒如珠子)的浓度。在某些实施方案中，可以希望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用的细胞浓度为1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用浓度为7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量增加，细胞活化和细胞扩充。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可弱表达目标靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液，肿瘤组织等)捕获。此类细胞群体可以具有治疗价值并且将是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在某些实施方案中，T细胞扩充至约100至约1,000,000倍，或约1,000至约1,000,000倍，例如1,000至约100,000倍。
离体扩充后T细胞的适应性是它们在体内起作用的能力的极好的预测器。因此，在某些实施方案中，还测量工程化红系细胞诱导关键细胞存活基因Bcl-xL的能力。扩充过程中培养物中凋亡细胞的百分比用于确定任何工程化红系细胞是否赋予扩充的T细胞以特定的存活优势。另外，可以测量离体扩充后细胞的端粒长度，以确定特定的工程化红系细胞在保留其扩充的细胞的复制潜力方面是否更有效。
本公开涵盖使用本文所述的工程化红系细胞的各种方法。如本领域技术人员将理解的，基于本文提供的公开内容，可以针对本文所述的每种应用特别地定制工程化红系细胞的施用剂量和时机。
有利地，施用本发明的工程化红系细胞不导致肝毒性。在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用呈现本发明外源多肽的工程化红系细胞导致更小的毒性(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性)。
在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力)。
治疗指数(TI或治疗比率)是引起治疗效果的治疗剂量与引起毒性的量的比较(Trevor A et al.(2013)."Chapter 2:Pharmacodynamics".Pharmacology Examination&Board Review(第10版).New York:McGraw-Hill Medical.p.17，通过引用整体并入本文)。治疗指数(TI)用于比较药剂的治疗有效剂量与毒性剂量。TI是药物相对安全性的声明。它是产生毒性的剂量与产生期望治疗响应需要的剂量的比率。用于导出TI的常见方法是使用50％的剂量响应点，包括TD50(毒性剂量)和ED50(有效剂量)。
Figure BDA0002760528960001561
因此，具有较高TI的药物被认为比具有较低TI的药物更安全(例如，具有TI为10的药物被认为比具有TI为3的药物更安全)。
在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞导致更高的治疗指数(TI)(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞具有更高的TI；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞具有更高的TI；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞具有更高的TI)。在一些实施方案中，治疗响应是肿瘤负荷减少。
在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞导致较小的毒性，如通过肝毒性的小鼠模型确定(Niu et al J Immunology 2007 178:4194-4213，其全部内容通过引用并入本文)(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致较小的毒性；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致较小的毒性；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致较小的毒性)。
在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞导致更小的肝毒性和更大的治疗效力)。
在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞对丙氨酸转氨酶(ALT)肝酶的水平产生更小的影响或没有影响(即，与施用工程化红系细胞之前的水平相比没有明显影响)，其中与施用重组蛋白之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高ALT水平(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对ALT水平产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高ALT水平；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对ALT水平产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高ALT水平；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对ALT水平产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高ALT水平)。
在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞对干扰素gamma(IFNg)的水平产生更小的影响或没有影响(即，与施用工程化红系细胞之前的水平相比没有明显影响)，其中与施用重组蛋白之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高IFNg水平(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对IFNg水平产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高IFNg水平；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对IFNg水平产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高IFNg水平；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对IFNg水平产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高IFNg水平)。
巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的肝浸润被认为是肝毒性的重要因素。在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞对浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数目产生更小的影响或没有影响(即，与施用工程化红系细胞之前的水平相比没有明显影响)，其中与施用重组蛋白之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数目(例如与施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数；与施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数；或者与施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数产生更小的影响或没有影响，其中与施用之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高浸润的巨噬细胞，CD8+T细胞和/或CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞数)。尽管不希望受到理论的束缚，但认为与重组蛋白(例如抗体)不同，工程化红系细胞(例如去核工程化红系细胞)被隔离在血管中，所述重组蛋白认为通过从血管扩散到骨髓而引起肝毒性，在骨髓中它们活化并扩充髓样细胞，所述髓样细胞继而运输到肝而成为库普弗(Kupfer)细胞，并活化CD8细胞。
在某些实施方案中，可以通过ALT和Ishak得分测量炎症(Ishak K,Baptista A,Bianchi L,et al.Histological grading and staging of chronic hepatitis.JHepatol 1995；22:696，通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，与施用单独的相应的重组蛋白相比，或与施用单独的结合外源多肽的靶物(例如受体)的重组结合蛋白，如抗体相比，施用本发明的工程化红系细胞对肝炎症得分产生更小的影响或没有影响(即，与施用工程化红系细胞之前的得分相比没有明显影响)，其中与施用重组蛋白之前的水平相比，通过施用重组蛋白提高肝炎症得分(例如与导致相对于施用前的得分增加的肝炎症得分的施用单独的重组4-1BBL，单独的重组IL-15/IL-15RA，它们的组合或抗4-1BB抗体相比，相对于施用前的得分，施用包含含有4-1BBL的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对肝炎症得分产生更小的影响或没有影响；与导致相对于施用前得分增加的肝炎症得分的施用单独的重组IL-12，单独的重组IL-15/IL-15RA或它们的组合相比，相对于施用前的得分，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含IL-15/IL-15RA的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对肝炎症得分产生更小的影响或没有影响；或者与导致相对于施用前得分增加的肝炎症得分的施用单独的重组IL-12，单独的重组4-1BB或它们的组合或4-1BB抗体相比，相对于施用前的得分，施用包含含有IL-12的第一外源刺激性多肽和包含重组4-1BB的第二外源刺激性多肽的工程化红系细胞对肝炎症得分产生更小的影响或没有影响)。
在上述方面和实施方案中任一项的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案中任一项的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些方面，本公开提供了刺激受试者中的免疫杀伤细胞的方法，其包括向受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效刺激免疫杀伤细胞的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗癌症的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗传染病的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，与分离的4-1BB激动剂抗体的施用相比，有效量的施用在受试者中导致更小的毒性。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用等同量的分离的4-1BB激动剂抗体相比，施用有效量在受试者中导致更小的毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量等同(例如，拷贝数，重量或摩尔浓度)的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与包含4-1BBL多肽的工程化红系细胞相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与包含4-1BBL多肽的工程化红系细胞相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的治疗效力的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的包含4-1BBL多肽的工程化红系细胞相同的治疗功效的分离的4-1BB激动剂抗体的量。
在一些方面，本公开提供了刺激受试者中的免疫杀伤细胞的方法，其包括向受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效刺激免疫杀伤细胞的量的包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗癌症的量的包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗传染病的量的包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些实施方案中，所述施用在受试者中比施用与多个工程化红系细胞中包含的IL-15多肽量等同的分离的IL-15多肽量产生更小的毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，与分离的IL-15多肽的施用相比，有效量的施用在受试者中导致更小的毒性。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用等同量的分离的IL-15多肽相比，施用有效量在受试者中导致更小的毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量在数量上相同(例如，拷贝数或摩尔浓度)的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的包含IL-15多肽的工程化红系细胞相同的生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-15多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的包含IL-15多肽的工程化红系细胞相同的治疗效力的分离的IL-15多肽的量。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分是融合多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:12)接头。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，和IL-15受体alphasushi结合域。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15受体alphasushi结合域连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)，任选地，其中接头包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:12)接头。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了刺激受试者中的免疫杀伤细胞的方法，其包括向受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效刺激免疫杀伤细胞的量的包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗癌症的量的包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗传染病的量的包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，与分离的IL-12多肽的施用相比，有效量的施用在受试者中导致更小的毒性。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用等同量的分离的IL-12多肽相比，施用有效量在受试者中导致更小的毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量在数量上相同(例如，拷贝数或摩尔浓度)的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的包含IL-12多肽的工程化红系细胞相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的包含IL-12多肽的工程化红系细胞相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量。
在一些方面，本公开提供了刺激受试者中的免疫杀伤细胞的方法，其包括向受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效刺激免疫杀伤细胞的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗癌症的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗传染病的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，与分离的4-1BB激动剂抗体，分离的IL-15多肽或其组合的施用相比，有效量的施用在受试者中导致更小的毒性。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用等同量的分离的4-1BB激动剂抗体，等同量的分离的IL-15多肽或其组合相比，施用有效量在受试者中导致更小的毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量在数量上相同(例如，拷贝数或摩尔浓度)的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-15多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的治疗效力的分离的4-1BB激动剂抗体的量。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分是融合多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3接头(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，和IL-15受体alphasushi结合域。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15受体alphasushi结合域连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)，任选地，其中接头包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:12)接头。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了刺激受试者中的免疫杀伤细胞的方法，其包括向受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效刺激免疫杀伤细胞的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗癌症的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗传染病的量的包含4-1BBL多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，与分离的4-1BB激动剂抗体，分离的IL-12多肽或其组合的施用相比，有效量的施用在受试者中导致更小的毒性。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用等同量的分离的4-1BB激动剂抗体，等同量的分离的IL-12多肽或其组合相比，施用有效量在受试者中导致更小的毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量在数量上相同(例如，拷贝数或摩尔浓度)的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的激动剂活性的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的生物学效应的分离的4-1BB激动剂抗体的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的4-1BB激动剂抗体的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的4-1BBL多肽的量相同的治疗效力的分离的4-1BB激动剂抗体的量。
在一些方面，本公开提供了刺激受试者中的免疫杀伤细胞的方法，其包括向受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效刺激免疫杀伤细胞的量的包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗癌症的量的包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的传染病的方法，其包括向所述受试者施用多个工程化红系细胞，其中工程化红系细胞包含有效治疗传染病的量的包含IL-15多肽的第一外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的第一外源刺激性多肽，且其中有效量不在受试者中引起毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，与分离的IL-15多肽，分离的IL-12多肽或其组合的施用相比，有效量的施用在受试者中导致更小的毒性。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用等同量的分离的IL-15多肽，等同量的分离的IL-12多肽或其组合相比，施用有效量在受试者中导致更小的毒性。
在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量在数量上相同(例如，拷贝数或摩尔浓度)的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-12多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-12多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-12多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-12多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量具有相同量(例如，拷贝数或摩尔浓度)的分离的IL-15多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的生物学活性的分离的IL-15多肽的量。在本文公开的方法的一些实施方案中，分离的IL-15多肽的等同量是具有与有效量的工程化红系细胞中包含的IL-15多肽的量相同的治疗效力的分离的IL-15多肽的量。
在一些实施方案中，第一外源多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分是融合多肽。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)3接头(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.1至少95％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，和IL-15受体alphasushi结合域。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以复合物存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段和IL-15受体alphasushi结合域以融合多肽存在。在一些实施方案中，IL-15多肽或其片段通过接头与IL-15受体alphasushi结合域连接。在一些实施方案中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)，任选地，其中接头包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:12)接头。在一些实施方案中，融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。
治疗将从免疫杀伤细胞活化受益的病况
施用包含(例如呈现)外源试剂(例如多肽)的工程化红系细胞的方法描述于例如WO2015/073587和WO2015/153102中，每篇均通过引用整体并入本文。
在实施方案中，将本文所述的工程化红系细胞施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。可以治疗的示例性哺乳动物包括但不限于人类、家养动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)和实验动物(例如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。本文所述的方法适用于人类疗法和兽医应用两者。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，每1、2、3、4、5或6个月向患者施用工程化红系细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞的剂量包含约1x109-2x109、2x109-5x109、5x109-1x1010、1x1010-2x1010、2x1010-5x1010、5x1010-1x1011、1x1011-2x1011、2x1011-5x1011、5x1011-1x1012、1x1012-2x1012、2x1012-5x1012或5x1012-1x1013个细胞。
在一些实施方案中，以足以在2周至一年(例如，一个月至一年或更长时间，例如，至少2周、4周、6周、8周、3个月、6个月、1年、2年)的时间段内维持患者血液中所施用的红系细胞的功能的给药方案(施用的剂量和周期)向患者施用工程化红系细胞。
在一些方面，本公开提供了对需要免疫杀伤细胞活化的受试者刺激免疫杀伤细胞的方法，该方法包括以有效刺激免疫细胞的量使免疫杀伤细胞与本文所述的工程化红系细胞接触。
在一些实施方案中，受试者已被诊断出患有癌症。
在一些实施方案中，受试者患有传染病。
在一些方面，本公开提供了本文所述的工程化红系细胞用于治疗本文所述的疾病或病况，例如癌症或传染病的用途。在一些方面，本公开提供了本文所述的工程化红系细胞在制备用于治疗本文所述的疾病或病况，例如癌症或传染病的药物中的用途。
癌症
在一些方面，本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用经工程化改造以刺激免疫细胞，特别是杀伤性免疫细胞，例如NK细胞或CD8+T细胞的红系细胞，如本文所述。以有效治疗受试者中的癌症的量施用工程化红系细胞。在实施方案中，受试者患有癌症和/或已被诊断出患有癌症，因此需要治疗。
本公开不限于某种类型的癌症，而是任何癌症都被认为是由本文所述的工程化红系细胞治疗。在某些实施方案中，癌症包括但不限于选自下组的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑瘤、乳腺癌、原发性未知癌、癌症扩散到骨、癌症扩散到脑、癌症扩散到肝、癌症扩散到肺、类癌、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨样白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、妊娠滋养层肿瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、何杰金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、皮肤癌、间皮瘤、葡萄胎妊娠、口腔和口咽癌，骨髓瘤、鼻和鼻窦癌、鼻咽癌、非何杰金淋巴瘤(NHL)、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌、直肠癌、唾液腺癌、继发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、未知原发性癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
在某些实施方案中，待治疗的癌症选自肺癌、肝细胞癌、黑素瘤和淋巴瘤。在进一步的实施方案中，淋巴瘤选自何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，待治疗的癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在某些实施方案中，癌症是何杰金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是非何杰金氏淋巴瘤。
在一些实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。实体瘤包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞)癌、肺癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、口和口腔癌、神经母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、甲状腺癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤以及外阴癌。在某些实施方案中，待治疗的实体瘤是肺癌、肝细胞癌或黑素瘤。在一些实施方案中，实体瘤是肺癌。在一些实施方案中，实体瘤是肝细胞癌。在一些实施方案中，实体瘤是黑素瘤。
在某些实施方案中，待治疗的癌症是血液学癌症。血液学癌症是一种影响血液、骨髓或淋巴系统的癌症。血液学癌症代表第五大最常见的癌症，并且也是癌症死亡的第二大主要原因。血液学癌症的最常见形式包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。当骨髓过量产生异常白细胞时发生白血病，并按受影响的白细胞的类型进行分类：髓样或淋巴细胞性。淋巴瘤是淋巴系统的癌症，其导致恶性白细胞不受控制地生长，从而在淋巴结中形成肿瘤。淋巴瘤分为两种主要类型：何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤(HL和NHL)。当异常浆细胞(一种产生抗体的白细胞类型)积累在骨髓中时发生骨髓瘤。
根据白血病是急性还是慢性以及髓样或淋巴细胞性，可将其分为4种主要类型：急性髓样(或髓性)白血病(AML)；慢性髓样(或髓性)(CML)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。虽然许多患者在AML的初始治疗后实现消退(缺乏体征和症状)，但有些患者即使强化治疗后在其骨髓中仍有残留的白血病细胞。这被称为“难治性白血病”。一些患者实现消退，然后具有骨髓中白血病细胞的恢复和正常血细胞减少。这称为“复发性白血病”。
急性髓样白血病或AML的特征在于髓样母细胞的增殖。髓样母细胞替换骨髓，因此血小板、红细胞和嗜中性粒细胞的产生最少。它主要是老年人的疾病，诊断中位年龄为68岁。2017年，在美国，存在有超过20,000例新的AML病例和超过10,000例由AML引起的死亡。
标准的一线AML治疗已经超过40年未曾改变：一种强化诱导和巩固疗法的方案。尽管大多数患者响应，但大多数随时间复发。因此，许多年轻的AML患者接受造血干细胞移植物或HSCT，若移植成功，这可以是治愈的。2016年，在美国超过3500例AML患者经历allo-HSCT，且在欧洲，超过200例经历该程序。
响应疗法并且存活的AML患者通常会桥接造到血干细胞移植物，这对于三分之二的患者可以是治愈的。对于异基因移植物后复发的三分之一患者(2015年在美国针对AML患者进行了3235例异基因移植)，治疗选择是有限的，并且几乎所有患者在一年范围内死亡。在这些情况下，患者失去移植物抗肿瘤效果的益处，这主要是由于免疫检查点参与(CTLA4-B7和PD-1-PDL-1)，其抑制T细胞功能和抗肿瘤免疫。
最近，已经批准了其他疗法用于治疗AML，例如gemtuzumab ozogamicin，抗CD33抗体药物缀合物，CPX-351，联合化疗，以及对于具有特定突变的患者，米哚妥林(midostaurin)和恩西地平(enasidenib)。尽管这些疗法改善响应率并使更多的患者能够桥接移植，但总存活率仍然较低。
NK细胞和先天免疫系统的参与被认为是对AML和造血干细胞移植(HSCT)后潜在其他相关血液恶性进行有效免疫治疗的关键。骨髓消融和同种异体移植后，NK细胞是第一个恢复的淋巴细胞群体，但是与健康供体的NK细胞相比时，它们的杀伤和细胞因子分泌功能受到限制。NK细胞的恢复率和功能与HSCT后治疗结果相关，因此增加HSCT后NK细胞的数量和功能以刺激移植物抗白血病效果具有增加接受HSCT以治疗AML的患者的存活。
因此，在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞用于治疗AML，特别是在接受或计划接受同种异体HSCT的患者中，意图活化NK细胞，CD8+T细胞或NK和CD8+T细胞群体，从而改善移植物响应和/或总体存活。在一些实施方案中，如本文所述，包含IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的工程化红系细胞用于治疗接受或计划接受同种异体HSCT的患者中的AML。在一些实施方案中，如本文所述，包含IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段和4-1BBL多肽或其片段的工程化红系细胞用于治疗接受或计划接受同种异体HSCT的患者中的AML。在一些实施方案中，如本文所述，包含含有IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽和包含IL-12多肽或其片段的外源刺激性多肽的工程化红系细胞用于治疗接受或计划接受同种异体HSCT的患者中的AML。在一些实施方案中，如本文所述，包含含有IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽和包含IL-12多肽的外源刺激性多肽的工程化红系细胞用于治疗接受或计划接受同种异体HSCT的患者中的AML。在一些实施方案中，如本文所述，包含含有IL-12多肽或其片段的外源刺激性多肽和包含4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多肽的工程化红系细胞用于治疗接受或计划接受同种异体HSCT的患者中的AML。
在另一个实施方案中，本文所述的工程化红系细胞用于治疗复发性或难治性AML。在一个实施方案中，工程化红系细胞用于治疗接受或计划接受同种异体HSCT的患者中的复发性或难治性AML，意图活化NK细胞，CD8+T细胞或NK和CD8+T细胞群体，从而改善移植物响应和总体存活。在某些实施方案中，如本文所述，包含含有IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽的工程化红系细胞用于治疗复发性或难治性AML。在某些实施方案中，如本文所述，包含含有IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段和4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多的工程化红系细胞用于治疗复发性或难治性AML。在一些实施方案中，如本文所述，包含含有IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽和包含4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多肽的工程化红系细胞用于治疗复发性或难治性AML。在一些实施方案中，如本文所述，包含含有IL-12多肽或其片段的外源刺激性多肽和包含4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多肽的工程化红系细胞用于治疗复发性或难治性AML。
在实施方案中，待治疗的患者正在接受或计划接受同种异体HSCT，意图活化NK和CD8+T细胞群体两者以改善移植物响应和总体存活。
癌症基因组图谱(TCGA)数据集的最新分析已将肿瘤的基因组全景与肿瘤免疫力联系在一起，使新抗原负荷涉及驱动T细胞响应(Brown et al.,Genome Res.2014May；24(5):743-50,2014)并鉴定与免疫浸润物相关的体细胞突变(Rutledge et al.,ClinCancer Res.2013Sep 15；19(18):4951-60,2013)。Rooney et al.(2015Jan 15；160(1-2):48-61)提示了新抗原和病毒可能驱动溶细胞性活性，并揭示已知且新颖的突变，所述突变使肿瘤能够抵抗免疫攻击。因此，在某些实施方案中，要治疗的癌症是与致癌病毒有关的癌症。致癌病毒的非限制性实例包括例如埃巴病毒(EBV)，乙型和丙型肝炎病毒(HBV和HCV)，人乳头瘤病毒(HPV)，卡波西肉瘤病毒(KSV)和多瘤病毒。在其他某些实施方案中，癌症是其中鉴定出逆转录病毒表位的癌症。与病毒有关并且可以使用本发明的方法治疗的癌症包括但不限于宫颈癌，头颈癌，淋巴瘤和肾透明细胞癌。
具有低MHC I类表达的癌症
T细胞检测和破坏需要癌细胞上的MHC I表达。细胞毒性T淋巴细胞(CTL，CD8+)需要通过MHC I类分子将肿瘤抗原呈递到靶细胞上，以区分自我与非自我。肿瘤逃避宿主免疫应答的最常见方法之一是下调MHC I类分子表达，使得肿瘤具有较低的MHCI表达，从而使任何内源性或治疗性抗肿瘤T细胞应答均无效(Haworth et al.,Pediatr BloodCancer.2015Apr；62(4):571–576)。最常见的是，肿瘤细胞上MHC表达的丧失是由表观遗传事件和MHC基因座和/或抗原加工机制的转录下调介导的。加工的肽的缺乏导致MHC表达降低，因为空的MHC分子在细胞表面上不稳定。
在下表7中显示了各种成人肿瘤中的MHC I类表达。在下表8中显示了各种儿童癌症中的MHC I类表达。就MHC表达而言，研究最广泛的儿童肿瘤是神经母细胞瘤，其具有特别低的MHC I类表达，特别是在高风险患者中。
表7
Figure BDA0002760528960001731
Figure BDA0002760528960001741
表8
Figure BDA0002760528960001742
NK细胞是有助于先天免疫的淋巴细胞的子集，能够使用与CTL相同的杀伤机制在不事先致敏的情况下裂解肿瘤细胞。包括细胞因子分泌和细胞毒性在内的天然杀伤反应性受几种种系编码的抑制和活化受体，例如杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)和自然细胞毒性受体(NCR))的平衡控制。MHC I类分子在靶细胞上的存在充当NK细胞上MHC I类特异性受体，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的一种此类抑制性配体。KIR受体的参与阻止NK的活化，并且似非而可能是的保留它们通过触发失活信号来响应连续遭遇者的能力。因此，若KIR能够与MHC I类充分结合，则此种参与可以压倒杀死信号，并使目标细胞存活。相反，若NK细胞不能与靶细胞上的MHC I类充分结合，则可以继续杀死靶细胞。因此，取而代之，那些表达低MHC I类并且被认为能够逃避T细胞介导的攻击的肿瘤实际上可能更容易经受NK细胞介导的免疫应答。
因此，在某些实施方案中，本发明的工程化红系细胞用于治疗以低MHC I呈现为特征的癌症。例如，本发明的工程化红细胞用于治疗以低MHC I呈现为特征的癌症，如表7和表8中列出。在一些实施方案中，本发明的工程化红细胞用于治疗以低MHC I呈现为特征的癌症，如表7中列出。在另一个实施方案中，本发明的工程化红细胞用于治疗以低MHC I呈现为特征的癌症，如表85中列出。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是子宫内膜癌。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是宫颈癌。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是头颈癌。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是肺癌。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是神经母细胞瘤。在一些实施方案中，具有低MHC I呈现的癌症是尤因肉瘤/PNET。
具有应激配体调节的癌症
在其他实施方案中，将要用本发明的工程化红系细胞治疗的癌症的特征在于表现出细胞应激效应的肿瘤，所述细胞应激效应改变NK受体的结合(激活或抑制)。例如，由于缺氧、慢性增殖信号(即由于组成性激活的Ras突变)和持续的基因组不稳定，癌细胞通常以恒定的细胞应激状态存在。因此，许多癌细胞上调其表面上的杀伤活化受体(KAR)配体，使其易于受到NK细胞杀伤。但是，应激配体的调节是癌细胞用来减少NK细胞识别的重要逃逸机制。例如，可以通过在肿瘤细胞中经常过表达的RNA结合蛋白抑制应激配体ULBP2。通过将此致癌蛋白与ULBP2 mRNA结合，mRNA的稳定性降低，并且细胞表面上的ULBP2水平下调。因此，保护肿瘤细胞免于NK细胞识别(Schmiedel D,et al.Elife(2016)5:e13426)。如对神经母细胞瘤以及头颈癌所示，通过应激配体MICA的可溶形式阻断NKG2D也可以抑制NK细胞。因此，在一些实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，其中一种或多种应激配体或KAR配体的水平被上调。不希望受到理论的束缚，可以预期此类易于受到NK细胞杀伤的癌症将对NK细胞的数量和/或活性的增加特别有响应。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗应激配体的水平或活性被下调或抑制的癌症的方法，例如表达应激配体或KAR配体的阻遏物的癌症。不希望受到理论的束缚，可以预期由于阻遏物的存在而对NK细胞杀伤不太易感的此类癌症将受益于NK细胞数量和/或活性的增加。
以对4-1BB激动剂的非响应性为特征的癌症
在其他实施方案中，将要用本发明的工程化红系细胞，例如本文所述的工程化红系细胞治疗的癌症的特征在于对4-1BB激动剂的非响应性。在一些实施方案中，癌症对4-1BB激动剂的非响应性是由于较高剂量的毒性，例如肝毒性。因此，本公开包括治疗患有癌症的受试者的方法，其通过施用本文所述的工程化红系细胞进行，所述癌症由于例如4-1BB激动剂的毒性而对一种或多种4-1BB激动剂是非响应的。
在一些实施方案中，4-1BB激动抗体可以是如本领域已知的任何4-1BB激动性抗体。在一些实施方案中，4-1BB激动性抗体是utomilumab(参见例如国际专利申请公开号WO2012/032433；通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，4-1BB激动性抗体是INBRX-105(参见例如国际专利申请公开号WO2017/123650；通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，4-1BB激动性抗体是ADG106(参见例如国际专利申请公开号WO2019/036855；通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，4-1BB激动性抗体是urelumab(参见例如国际专利申请公开号WO2005/035584；通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含含有4-1BB多肽或其片段的外源刺激性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含含有IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽和包含4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含含有IL-12多肽或其片段的外源刺激性多肽，以及包含4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多肽。
以对检查点抑制的响应为特征的肿瘤
尽管检查点抑制剂已彻底改变了癌症治疗，但其局限性日益明显。响应仅限于某些肿瘤类型，并且只有少数患者被治愈。当前，免疫疗法中的挑战是将检查点抑制剂的功效扩展到更多类型的肿瘤，以及增加响应的速率、深度和持续时间。通过刺激免疫系统的两个臂，本文所述的工程化红系细胞与检查点抑制剂组合使用以改善和扩展响应。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含含有IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽以及包含4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含含有IL-12多肽或其片段的外源刺激性多肽，以及包含4-1BBL多肽或其片段的外源刺激性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含含有IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽和包含IL-12多肽或其片段的外源刺激性多肽。
在某些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞用于治疗以其对检查点抑制剂的响应性(例如，响应性或非响应性)为特征的癌症。
免疫检查点分子，例如PD-1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，LAG3，CCR4，OX40，OX40L，IDO和A2AR是细胞表面信号传导受体，其在调节肿瘤微环境中的T细胞响应中起重要作用。已显示肿瘤细胞利用这些检查点，通过上调其表达和活性，从而逃避抗肿瘤免疫应答来实现其益处。
但是，某些人肿瘤可以通过患者的免疫系统消除。例如，靶向检查点分子，例如CTLA-4和PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂已在几种类型的癌症中显示临床活性，并可导致完全响应和肿瘤消退。免疫检查点抑制剂通过破坏共抑制性T细胞信号传导来恢复抗肿瘤免疫应答。特别地，抗CTLA-4和抗PD-1抗体的作用模式分别是通过抑制CTLA-4和PD-1，肿瘤已经将它们选择作为免于抗肿瘤免疫应答的保护。通过抑制这些检查点分子(例如，用拮抗性抗体)，可以使患者的CD8+T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。但是，大多数接受检查点抑制剂治疗的癌症患者将在12个月内进展，取决于癌症和治疗干预。MHC复合体是免疫系统中的重要纽带；它是T细胞识别和杀死癌细胞的方式，但它也阻断NK细胞的杀伤功能。对检查点抑制剂的抗性的一种常见手段是MHC表达的丧失，从而使T细胞看不到癌症，但因此它变得易于经受NK细胞依赖性杀伤。肿瘤细胞上MHC呈现的下调和周围区域中T细胞的衰竭促成此种免疫疗法抗性。
因此，在一些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞用于治疗已经响应检查点抑制剂，响应检查点抑制剂或已知响应检查点抑制剂的癌症(例如实体瘤或血液学癌症)。例如，靶向免疫系统检查点的许多免疫调节剂，例如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，程序性死亡1(PD-1)或其配体(PD-L1)已受到监管批准用于治疗多种癌症，包括恶性黑素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌，经典何杰金氏淋巴瘤以及复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌。因此，在一些实施方案中，工程化红系细胞用于治疗以PD-1响应性肿瘤为特征的癌症。在实施方案中，将工程化红系细胞与用于治疗此类癌症的检查点抑制剂联合施用或使用以进行治疗。本文描述了此类方法中合适的检查点抑制剂。
在其他实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞用于治疗不再响应检查点抑制剂的患者中的实体瘤。在一些实施方案中，工程化红系细胞作为单一疗法单独使用以治疗不再响应检查点抑制剂的患者中的实体瘤。在一些实施方案中，工程化红系细胞与检查点抑制剂组合使用以治疗不再响应检查点抑制剂的患者中的实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤选自黑素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌，膀胱癌和头颈癌。
如上文讨论，MHC复合体是免疫系统的重要纽带；其是T细胞识别和杀死癌细胞的方式，但它也阻断NK细胞的杀伤功能。对检查点抑制剂的抗性的一种常见手段是MHC表达的丧失，从而使T细胞看不到癌症，但因此它变得易于经受NK细胞依赖性杀伤。在一些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞用于治疗在检查点抑制剂疗法上由于MHC表达丧失而进展的患者群体。
例如，在一些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞可以与阻断，减少和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或阻断，减少和/或抑制PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的试剂(作为非限制性实例，下列一种或多种：纳武单抗(nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558,MDX1106,OPDIVO,BRISTOL MYERS SQUIBB),派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA,Merck),pidilizumab(CT-011,CURE TECH),MK-3475(MERCK),BMS 936559(BRISTOL MYERSSQUIBB),和MPDL328OA(ROCHE))。在一些实施方案中，如本文所述的工程化红系细胞可以与阻断，降低和/或抑制CTLA-4的活性和/或CTLA-4与其一种或多种受体(例如CD80，CD86，AP2M1，SHP-2和PPP2R5A)的结合的试剂组合使用。例如，在一些实施方案中，抑制CTLA-4活性的试剂是抗体，例如但不限于伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-010，MDX-101，Yervoy，BMS)和/或替西木单抗(tremelimumab)(Pfizer)。此外，本文提供的工程化红系细胞可以与一种或多种靶向免疫检查点分子的阻断抗体组合使用，所述免疫检查点分子诸如例如BTLA,HVEM,TIM3,GALS,LAG3,VISTA,KIR,2B4,CD160(也称为BY55)，CGEN-15049,CHK 1和CHK2激酶,A2aR,CEACAM(例如CEACAM-1,CEACAM-3和/或CEACAM-5),GITR,GITRL,半乳凝素-9,CD244,CD160,TIGIT,SIRPα,ICOS,CD172a,TMIGD2和各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1,B7-2,B7-DC,B7-H1,B7-H2,B7-H3,B7-H4,B7-H5,B7-H6和B7-H7)。
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞与抗PD-1抗体组合施用。
用如本文所述的工程化红系细胞治疗可以发挥功能以加强不仅T细胞，而且还有NK细胞的活化，从而再激活局部适应性免疫应答，使癌症对检查点抑制重新敏感，并通过先天免疫应答的激活叠加或协同地增强肿瘤杀伤。
在前述治疗方法的具体实施方案中，工程化红系细胞包含外源刺激性多肽，其包含IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在具体的实施方案中，工程化红系细胞包含含有IL-15多肽或其片段以及包含IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽以及包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽。
在前述治疗方法的具体实施方案中，工程化红系细胞包含外源刺激性多肽，其包含白介素12 p40(IL-12 p40)多肽或其片段，以及白介素12 p35(IL-12 p35)多肽或其片段。在具体的实施方案中，工程化红系细胞包含含有白介素12 p40(IL-12 p40)多肽或其片段和白介素12 p35(IL-12 p35)多肽或其片段的外源刺激性多肽以及包含IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的外源刺激性多肽。
在前述治疗方法的具体实施方案中，工程化红系细胞包含含有白介素12 p40(IL-12 p40)多肽或其片段和白介素12 p35(IL-12 p35)多肽或其片段的外源刺激性多肽。在具体的实施方案中，工程化红系细胞包含含有白介素12 p40(IL-12 p40)多肽或其片段和白介素12 p35(IL-12 p35)多肽或其片段的外源刺激性多肽以及包含4-1BBL多肽的外源刺激性多肽。
具有高肿瘤突变负荷的癌症
肿瘤在其生长时可以在其遗传物质中积累突变。这些体细胞突变可以在细胞分裂过程中传递给新的癌细胞。肿瘤细胞中获得性突变可改变蛋白质的表达，从而导致新抗原的形成。肿瘤突变负荷(TMB)是肿瘤细胞携带的突变的度量。TMB是一种新的临床标志物，其预测一系列晚期癌症中对免疫疗法的响应。与基于蛋白质的生物标志物不同，TMB是肿瘤基因组的每个编码区的突变总数的定量测量。认为具有较高TMB水平的肿瘤表达更多的新抗原，这可以允许更强力的免疫应答，因此更持久的对免疫疗法的响应。因此，在一些实施方案中，工程化红系细胞用于治疗以具有高突变负荷的肿瘤为特征的癌症。
血管化肿瘤/具有血管渗漏的肿瘤
在某些实施方案中，本公开的工程化红系细胞用于治疗高度血管化的肿瘤。不受理论的束缚，更大的血管化使肿瘤更易于本公开的工程化红系细胞进入。可以例如通过毛细血管间距离(认为反映肿瘤的氧合作用)和微血管密度(提供肿瘤血管生成的组织学评估)来测量肿瘤血管性。高血管肿瘤可以是任何血管起源的肿瘤，例如血管瘤、淋巴管瘤、血管内皮瘤、卡波西肉瘤、血管肉瘤、血管母细胞瘤。
在其他实施方案中，本公开的工程化红系细胞用于治疗具有渗漏的血管系统的肿瘤。普遍认为肿瘤中的血管是异常的。此种异常的一种表现是内皮的缺陷和渗漏。血管渗漏性不仅影响肿瘤的内部环境，并且可能影响血管生成的速度，而且其还控制治疗剂的进入。不受理论的束缚，渗漏的血管将提供本公开的工程化红系细胞的更多进入。传染病
在一些方面，本发明提供了治疗受试者中的传染病的方法，其包括向所述受试者施用经工程化改造以刺激免疫细胞，例如免疫杀伤细胞的红系细胞。以有效治疗受试者中的传染病的量施用工程化红系细胞。
在某些实施方案中，传染病是由病毒感染引起的。
要用本发明的工程化红系细胞治疗的病毒感染包括腺病毒、柯萨奇病毒、甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒、埃巴病毒、单纯疱疹1型、单纯疱疹2型、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、水痘-带状疱疹病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、狂犬病病毒和风疹病毒。其他病毒靶物包括副粘病毒科(例如，肺炎病毒、麻疹病毒、变性肺病毒(metapneumovirus)、呼吸道病毒或风疹病毒)、腺病毒科(例如，腺病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如沙粒病毒，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus))、动脉病毒科(例如，猪呼吸道或生殖综合征病毒或马动脉炎病毒)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，白蛉病毒或汉坦病毒)、嵌杯病毒科(例如，诺沃克病毒)、冠状病毒科(例如，冠状病毒或环曲病毒(torovirus))、纤丝病毒科(例如，埃博拉样病毒(Ebola-like viruses))、黄病毒科(例如，肝炎病毒或黄病毒)、疱疹病毒科(例如单纯病毒、水痘病毒、巨细胞病毒、蔷薇疹病毒或淋巴细胞隐病毒)、正粘病毒科(例如流感病毒或索戈托病毒(thogotovirus))、痘病毒科(例如细小病毒)、微RNA病毒科(Picomaviridae)(例如肠道病毒或嗜肝病毒)、痘病毒科(例如正痘病毒、禽痘病毒、或兔病毒)，逆转录病毒科(例如慢病毒或泡沫病毒(spumavirus))、呼肠孤病毒科(例如轮状病毒)，弹状病毒科(例如狂犬病病毒、弹状病毒或水疱病毒)和披膜病毒科(例如甲病毒或风疹病毒)。这些病毒的具体实例包括人呼吸道冠状病毒、流感病毒A-C、肝炎病毒A至G和单纯疱疹病毒1-9。
在某些实施方案中，病毒感染由选自下组的病毒引起：腺病毒，埃巴病毒(EBV)，乙型肝炎病毒(HBV)，结核病，人免疫缺陷病毒(HIV)，单纯疱疹病毒(HSV)，乳头瘤病毒和巨细胞病毒。
在其他实施方案中，病毒感染的特征在于MHC I呈现的下调。人病毒采用多种机制抑制MHC I类途径，以逃避CTL裂解。干扰MHC I类途径的蛋白质的实例由腺病毒和逆转录病毒编码(Tortorella et al.,Annu Rev Immunol.2000；18():861-926)。这些包括腺病毒E3/19K和人免疫缺陷病毒1(HIV-1)Nef基因产物。疱疹病毒在具有免疫能力的宿主中建立持续的终生感染，大多数(若不是全部)疱疹病毒编码抑制MHC I类抗原呈现的蛋白质，并且这些蛋白质在使病毒逃避CTL检测中起着重要作用。这以人巨细胞病毒(HCMV)为例，其中病毒基因组的独特短区编码至少五种抑制MHC I类途径的蛋白质(US2，US3，US6，US10和US11)。
MICB是天然杀伤(NK)细胞活化受体NKG2D的应激诱导的配体，并且对于NK细胞对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤至关重要。在逃避NK细胞杀伤的另一个例子中，MICB表达在病毒感染期间被下调，导致NKG2D结合减少和NK细胞的杀伤减少。因此，在一些实施方案中，本发明提供了治疗与下调的MICB有关的病毒性疾病的方法，其中增加NK细胞对病毒感染细胞的杀伤。
在某些实施方案中，传染病是由细菌感染引起的。
要用本发明的工程化红系细胞治疗的细菌感染包括但不限于分枝杆菌(Mycobacteria)、立克次体属(Rickettsia)、支原体、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、军团菌(Legionella)、霍乱弧菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白喉杆菌、梭菌种(Clostridium spp.)、肠毒性大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌、立克次体属、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、伯内特考克斯体(Coxiella burnetii)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、沙门氏菌(Salmonella)；志贺氏菌(Shigella)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)；假结核病耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)；支原体(Mycoplasma spp.)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；霍乱弧菌(Vibriocholerae)；嗜血杆菌流感(Haemophilus influenzae)；炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)；苍白密螺旋体；钩端螺旋体；疏螺旋体属(Borrelia)；白喉棒杆菌；弗朗西丝菌属；马尔他布鲁杆菌(Brucella melitensis)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；肠杆菌属(Enterobacter)；奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；变形杆菌属(Proteus)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。
受试者
本文所述的方法旨在与可以体验到这些方法的益处的任何受试者一起使用。因此，“受试者”、“患者”和“个体”(可互换使用)包括人类以及非人类受试者，尤其是家养动物。
在一些实施方案中，受试者和/或动物是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊或非人灵长类，例如猴、黑猩猩或狒狒。在其他实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物。在一些实施方案中，受试者和/或动物是人。在一些实施方案中，人是儿科人。在其他实施方案中，人是成年人。在其他实施方案中，人是老年人。在其他实施方案中，人可以被称为患者。
在某些实施方案中，人的年龄范围为从约0个月至约6个月大、从约6至约12个月龄、从约6至约18个月龄、从约18至约36个月龄、从约1至约5岁龄、从约5至约10岁龄、从约10至约15岁龄、从约15至约20岁龄、从约20至约25岁龄、从约25至约30岁龄、从约30至约35岁龄、从约35至约40岁龄、从约40至约45岁龄、从约45至约50岁龄、从约50至约55岁龄、从约55至约60岁龄、从约60至约65岁龄、从约65至约70岁龄、从约70至约75岁龄、从约75至约80岁龄、从约80至约85岁龄、从约85至约90岁龄、从约90至约95岁龄或从约95至约100岁龄。
在其他实施方案中，受试者是非人类动物，因此本公开涉及兽医用途。在一个具体的实施方案中，非人类动物是家养宠物。在另一个具体的实施方案中，非人类动物是家畜动物。在某些实施方案中，受试者是不能接受化学疗法的人类癌症患者，例如患者对化学疗法无反应或病情严重以不具有合适的化学疗法的治疗窗口(例如，经历太多的剂量或方案限制的副作用)。在某些实施方案中，受试者是患有晚期和/或转移性疾病的人类癌症患者。
在一些实施方案中，选择受试者以用工程化改造以刺激免疫杀伤细胞的红系细胞治疗，所述红细胞包含本公开的足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽。在一些实施方案中，选择受试者以工程化改造以刺激免疫杀伤细胞的红系细胞治疗癌症，所述红细胞包含本公开的足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽。在一些实施方案中，选择受试者以工程化改造以刺激免疫杀伤细胞的红系细胞治疗传染病，所述红细胞包含本公开的足以刺激免疫杀伤细胞的多种外源刺激性多肽。
在一些实施方案中，选择受试者以用包含本公开的第一外源刺激性多肽的工程化红系细胞治疗，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞还包含第二外源刺激性多肽，例如，包含4-1BBL。在一些实施方案中，选择受试者以用包含本公开的第一外源刺激性多肽的工程化红系细胞治疗癌症，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞还包含第二外源刺激性多肽，例如，包含4-1BBL。在一些实施方案中，选择受试者以用包含本公开的第一外源刺激性多肽的工程化红系细胞治疗传染病，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段以及IL-15RA多肽的胞外部分或其片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞还包含第二外源刺激性多肽，例如，包含4-1BBL。
在一些实施方案中，选择受试者以用工程化红系细胞治疗，所述工程化红系细胞包含本公开的的至少一种选自MICA，MICB和IGF-1的外源刺激性多肽。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
IV.药物组合物
本公开涵盖包含本公开的工程化红系细胞作为活性成分的药物组合物的制备和用途。在一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。此类药物组合物可以由单独的活性成分组成，作为至少一种活性成分(例如，有效剂量的工程化红系细胞)的组合以适合于施用于受试者的形式，或者药物组合物可以包含活性成分以及一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种另外的(活性和/或非活性)成分或这些的一些组合。
本公开的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定。
药物组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本公开的组合物可以皮下、皮内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹腔内施用于患者。可以将药物组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可以与活性成分组合，并且在组合后可以用于向受试者施用活性成分的化学组合物。
本文所述的药物组合物的配制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分缔合，然后，如果必要或期望，将产品成型或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人类进行伦理施用的药物组合物，但是本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合于施用于所有种类的动物。为了使组合物适合于向各种动物施用，适合于对人给药的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的(若有任何)实验来设计和进行此类修饰。预期施用本公开的药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类，哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗、鸟类，包括商业相关的鸟类，如鸡、鸭、鹅和火鸡；鱼类，包括农场饲养的鱼和观赏鱼以及甲壳类动物，例如农场饲养的贝类。
可用于本公开的方法的药物组合物可以以适合于口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、病灶内、口腔、眼、静脉内、器官内或另一施用途径的配制剂制备、包装或出售。其他预期的配制剂包括预计的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的配制剂。
本公开的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单个单位剂量散装制备、包装或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便的分数，例如该剂量的一半或三分之一。
本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、大小和状况而变化并进一步取决于组合物施用的途径。举例来说，组合物可以包含0.1％和100％(w/w)之间的活性成分。
除活性成分外，本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种另外的药物活性剂。特别考虑的另外的试剂包括止吐药和清除剂，如氰化物和氰酸盐清除剂和AZT、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、白介素-2、干扰素、细胞因子等。
可以使用常规技术来制备本公开的药物组合物的控释或缓释配制剂。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于对受试者的组织进行物理破坏并通过组织中的破坏进行药物组合物的施用的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物，通过手术切口施用组合物，通过穿透组织的非手术伤口施用组合物等来施用药物组合物。特别地，肠胃外给药预期包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
适用于肠胃外施用的药物组合物的配制剂包含与药学上可接受的载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类配制剂可以以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射配制剂可以以单位剂型(如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中)制备、包装或出售。肠胃外施用的配制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性媒介物中的乳液、糊剂和可植入的缓释或可生物降解配制剂。此类配制剂可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂，稳定剂或分散剂。
药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或出售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术进行配制，并且除了活性成分外，还可以包含另外的成分，如本文所述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，如水或1,3-丁二醇，来制备此类无菌可注射配制剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发性油，如合成的甘油单酯或甘油二酯。其他有用的可胃肠外施用的配制剂包括那些以微晶形式，在脂质体制剂中或作为可生物降解的聚合物系统的组分包含活性成分的配制剂。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可以将本公开的工程化红系细胞施用于动物，优选人。在施用工程化红系细胞的情况下，无论是否在其中扩充T细胞或NK细胞，可以以约100,000至约十亿个细胞的量施用它们，其中将细胞输注到动物，优选地，有此需要的人类患者中。尽管精确施用的剂量取决于许多因素，包括但不限于动物的类型和所治疗疾病状态的类型、动物的年龄和施用途径。
可以每天多次对动物施用工程化红系细胞，或者可以较不频繁地施用工程化红系细胞，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更不频繁，如每几个月一次，或甚至一年一次或更少。剂量的频率对技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、动物的类型和年龄等。
可以将工程化红系细胞(或由此扩充的T细胞或NK细胞)与各种其他化合物(细胞因子、化学治疗药物、检查点抑制剂和/或抗病毒药物等)共同施用。或者可以在工程化红系细胞(或由此扩充的T细胞或NK细胞)之前的一小时、一天、一周、一个月或甚至更长时间或其任何排列施用化合物。此外，可以在施用工程化红系细胞(或由此扩充的T细胞或NK细胞)之后的一小时、一天、一周或甚至更长时间或其任何排列施用化合物。频率和施用方案对本领域技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、动物的年龄和健康状态、待施用的一种或多种化合物的身份、各种化合物和工程化红系细胞(或由此扩充的T细胞或NK细胞)的施用途径等。
此外，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，在将工程化红系细胞施用于哺乳动物的情况下，对细胞进行处理，以使其处于“无生长状态”；也就是说，当施用于哺乳动物细胞时，细胞不能分裂。如本文其他地方所公开的，一旦施用于哺乳动物，可以对细胞进行辐照以使其不能生长或分裂。在本领域中已知其他方法，包括半抗原化(例如，使用二硝基苯基和其他化合物)，以使待施用的细胞，特别是对人施用的细胞不能生长，并且这些方法在本文中不再进一步讨论。而且，已经致使不能体内分裂的工程化红系细胞的施用的安全性已经在I期临床试验中确定，该临床试验使用用编码本文讨论的一些分子的质粒载体转染的工程化红系细胞。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是去核细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，工程化红系细胞是有核细胞。
在一些实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含多个本文所述的工程化红系细胞和药物载体。在其他实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含如本文所述的工程化红系细胞的群体以及药物载体。应当理解，如本文其他地方所述，任何单个工程化红系细胞，多个工程化红系细胞或工程化红系细胞的群体可以存在于本发明的药物组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化(即，修饰的)红系细胞和未修饰的红系细胞。例如，在各种实施方案中，单个单位剂量的红系细胞(例如，修饰的和未修饰的红系细胞)可以包含约，至少或不超过10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％的工程化红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞未被工程化改造。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化去核红系细胞和有核红系细胞。例如，在各种实施方案中，单个单位剂量的工程化红系细胞(例如去核和有核红系细胞)可以包含约或至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％去核红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是有核的。
联合疗法
根据一些实施方案，本公开提供了进一步包括向受试者施用另外的试剂的方法。在一些实施方案中，本公开涉及共同施用和/或共同配制。
在一些实施方案中，本文描述的工程化红系细胞与单克隆抗体组合使用，所述单克隆抗体通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)杀死肿瘤。在一些实施方案中，如本文所述，包含IL-15多肽或其片段和IL-15RA多肽的胞外部分或其片段的工程化红系细胞与单克隆抗体组合使用，所述单克隆抗体通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)杀死肿瘤。在一些实施方案中，如本文所述，包含IL-15多肽或其片段，IL-15RA多肽的胞外部分或其片段和4-1BBL的工程化红系细胞与单克隆抗体组合使用，所述单克隆抗体通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)杀死肿瘤。
识别肿瘤细胞表面上的肿瘤选择性抗原的肿瘤特异性mAb通过多种机制靶向并攻击肿瘤细胞，包括将毒性分子引导至靶细胞，抑制靶细胞增殖，阻断针对免疫细胞的抑制信号以及将免疫细胞引导至通过ADCC杀死靶物。通过ADCC起作用的靶向肿瘤抗原的单克隆抗体的实例包括但不限于利妥昔单抗，obinutuzumab，dinituximab，曲妥珠单抗和西妥昔单抗。例如，曲妥珠单抗(Roche)与乳腺癌细胞表面上表达的HER-2抗原结合。局部NK细胞识别抗体的Fc部分，并且一旦结合，释放的细胞毒素驱动编程性细胞死亡(凋亡)信号进入靶物。本发明的方法涵盖包含此类肿瘤特异性mAb的组合疗法。
在一些实施方案中，当与另一种试剂共同施用时，工程化红系细胞的施用协同起作用，并且以比当将此类试剂用作单一疗法时通常使用的剂量低的剂量来施用。
在一些实施方案中，包括但不限于癌症应用，本公开内容涉及作为另外的试剂的化学治疗剂。化学治疗剂的实例包含(但不限于)烷基化剂，例如噻替哌(thiotepa)及CYTOXAN环磷酰胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及乌得哌(uredopa)；乙撑亚胺及甲基密胺，包含六甲密胺(altretamine)、三乙撑密胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫化磷酰胺及三羟甲基密胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenin)(例如布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包含合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包含其合成类似物阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin)(例如念珠藻素1及念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包含合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素gammall及卡奇霉素omegall；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；双膦酸盐类，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包含吗啉基-多柔比星、氰吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如胺甲蝶呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯酮(testolactone)；抗肾上腺素，例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百思布什(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美坦辛(maytansinoid)，例如美坦辛(maytansine)及柄型菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼群克林(nitraerine)；喷托他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2',2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecene)(例如T-2毒素、疣疱菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶萨托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如TAXOL太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE无克列莫佛(Cremophor-free)、白蛋白工程化太平洋紫杉醇纳米颗粒制剂及TAXOTERE多西紫杉醇(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；GEMZAR；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)及卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE.长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸钙(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸钙(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB)；降低细胞增殖的PKC-α.,Raf,H-Ras,EGFR(例如厄洛替尼(Tarceva))和VEGF-A抑制剂以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，治疗方法还可包括使用放射。
一些人类肿瘤可以通过患者的免疫系统消除。例如，施用靶向免疫“检查点”分子的单克隆抗体可以导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用方式是通过抑制已被肿瘤选作抗肿瘤免疫应答的保护的免疫调节分子。通过抑制这些“检查点”分子(例如，用拮抗性抗体)，可以允许患者的CD8+ T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。
例如，靶向，例如但不限于，CTLA-4或PD-1的单克隆抗体的施用可以导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用方式是通过抑制已被肿瘤选作抗肿瘤免疫应答的保护的CTLA-4或PD-1。通过抑制这些“检查点”分子(例如，用拮抗性抗体)，可以允许患者的CD8+ T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。
因此，本文所述的工程化红系细胞可以与靶向免疫“检查点”分子的一种或多种封闭抗体组合使用。例如，在一些实施方案中，本文提供的组合物可以与靶向分子如CTLA-4或PD-1的一种或多种封闭抗体组合使用。例如，本文提供的组合物可以与阻断、减少和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的试剂组合使用(作为非限制性实例，以下的一种或多种：尼武单抗(nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558,MDX1106,OPDIVO,BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA,Merck)、pidilizumab(CT-011,CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL328OA(ROCHE))。在一个实施方案中，本文提供的组合物可以与阻断、减少和/或抑制CTLA-4的活性和/或CTLA-4与一种或多种受体(例如CD80、CD86、AP2M1、SHP-2和PPP2R5A)的结合的试剂组合使用。例如，在一些实施方案中，免疫调节剂是抗体，如但不限于伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-010,MDX-101,Yervoy,BMS)和/或曲美单抗(tremelimumab)(Pfizer)。可以从例如Bristol Myers Squibb(New York,N.Y.)、Merck(Kenilworth,N.J.)、Medlmmune(Gaithersburg,Md.)和Pfizer(New York,N.Y.)获得针对这些分子的封闭抗体。
此外，本文提供的工程化红系细胞组合物可以与一种或多种靶向免疫“检查点”分子的封闭抗体组合使用，所述免疫“检查点”分子例如BTLA、HVEM、TIM3、GALS、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、GITR、GITRL、半乳凝素-9、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2以及各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7)。
VI.试剂盒
尽管下面描述了示例性试剂盒，但是根据本公开，其他有用的试剂盒的内容对于本领域技术人员将是显而易见的。这些试剂盒中的每一个都包括在本公开内。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于将工程化红系细胞施用于NK细胞或T细胞的施加器。试剂盒中包括的特定施加器将取决于例如用于施用工程化红系细胞的方法，并且此类施加器是本领域众所周知的，并且特别可以包括：移液器、注射器、滴管等。此外，在实施方案中，试剂盒还包含说明材料，其描述了进行本文所述的方法的试剂盒的用途。这些说明仅使本文提供的公开具体化。
在一些实施方案中，试剂盒包括药学上可接受的载体。以如本文其他地方所述的适当量提供组合物。此外，施用途径和施用频率如本文先前其他地方所述。
试剂盒涵盖包含大量分子的工程化红系细胞，如但不限于本文所述的外源刺激性多肽。然而，掌握了本文提供的教导的技术人员将容易理解，本公开绝不限于这些或任何其他分子组合。而是，本文阐述的组合是出于说明性目的，并且它们绝不限制本公开涵盖的组合。此外，试剂盒包含下述试剂盒，其中待转导到工程化红系细胞中的每个分子作为编码分子的分离核酸的、包含编码分子的核酸的载体及其任意组合提供，包括其中至少两个分子由连续的核酸编码和/或由相同的载体编码的情况。
出于所有目的，在本说明书中引用的所有出版物和专利申请以其整体通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请均被明确地和单独地指出出于所有目的通过引用并入。本文讨论的出版物仅针对其在本申请的提交日期之前的公开而提供。本文中的任何内容均不得解释为承认本文所述的发明人由于先前的公开或由于任何其他原因而无权先于此类公开。
表9.序列
Figure BDA0002760528960001921
Figure BDA0002760528960001931
Figure BDA0002760528960001941
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Figure BDA0002760528960001961
表10.用于小鼠研究的蛋白质构建体序列
Figure BDA0002760528960001962
实施例
实施例1.经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15-RA融合蛋白的红系细胞的产生。
IL-15和IL-15/IL-15RA融合构建体
制备各种编码融合多肽的DNA构建体以在红系细胞中表达，如下表11所示：
表11.IL-15和IL-15/IL-15RA融合构建体和多肽。SEQ ID NO.指氨基酸序列。
Figure BDA0002760528960001971
Figure BDA0002760528960001981
如下所述，将DNA构建体(V3、V4、V5、V3.1或V4.1)克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，用于在红系细胞中表达。
慢病毒载体的产生
将IL-15/IL-15-RA融合蛋白基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有IL-15/IL-15-RA融合基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
IL-15/IL-15RA融合蛋白在本文中也称为IL-15TP。
红系细胞的扩充和分化
从来自正常人供体的动员的外周血细胞衍生的人CD34+细胞是从AllCells Inc.以冷冻方式购买的。扩充/分化程序包括3个阶段。在第一阶段中，将解冻的CD34+红系前体在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人重组人干细胞因子和重组人白介素3的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第二阶段中，将红系细胞在补充有重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组促红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第三阶段中，在补充有人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove的MDM培养基中培养红系细胞。将培养物在5％CO2培养箱中在37℃维持。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺(polybrene)混合。通过旋转接种(spinoculation)实现感染，在室温下以2000rpm旋转平板90分钟。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用经PE标记的抗IL-15-RA抗体(例如抗IL-15RA抗体(JM7A4)(ab91270)，AbCam)的结合来验证工程化红系细胞中IL-15/IL-15-RA的表达。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门。
实施例2.经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15RA的红系细胞在体外诱导总CD8+细胞增加。
一般如实施例1所述制备包含IL-15/IL-15RA变体IL-15v3(SEQ ID NO:27)、IL-15v4(SEQ ID NO:29)和IL-15v5(SEQ ID NO:31)的红系细胞。
将来自3个供体的100,000个外周血单个核细胞(PBMC)与300,000个工程化红系细胞一起培养。未与工程化红系细胞(无RBC)一起培养的PBMC和与仅在其表面上表达HA表位标签的红系细胞一起培养的PBMC用作阴性对照。图1A是显示经工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体v3、v4和v5的红系细胞当与外周血单个核细胞(PBMC)一起培养并且不受刺激时诱导CD8+细胞总数的增加的图。用重组人IL-15(rh IL-15)培养的PBMC用作与可溶性IL-15的比较。在第5天计数CD8+细胞的总数。图1A中所示的结果代表4个独立实验，每个实验有2-3个PBMC供体(总共测试了6个不同的PBMC供体)。
在下一组实验中，将表达IL-15/IL-15-RA变体v3、v4和v5的工程化红系细胞与PBMC一起培养并用抗CD3抗体(aCD3)刺激。将来自3个供体的100,000个PBMC与0.5μg/mLaCD3加300,000或100,000个红系细胞一起培养。未与工程化红系细胞(无RBC)一起培养的PBMC和与仅在其表面上表达HA表位标签的红系细胞一起培养的PBMC用作阴性对照。用重组人IL-15(rh IL-15)培养的PBMC用作阳性对照。图1B是显示当将经工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体v3、v4和v5的红系细胞与PBMC一起培养并用aCD3刺激时，诱导CD8+细胞总数的增加的图。图1B中所示的图中的两个条形图代表使用的300,000(左)或100,000(右)个工程化红系细胞。在第5天计数CD8+细胞的总数。图1B中显示的结果代表4个独立的实验，每个实验有2-3个PBMC供体(总共测试了6个不同的PBMC供体)。
来自本实施例的结果显示经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15RA的红系细胞在存在或不存在刺激的情况下诱导总CD8+细胞增加。与包含HA的对照红细胞相比，在存在和不存在刺激的两种情况下，包含IL-15/IL-15RA的红系细胞都导致较高的CD8+细胞诱导。
实施例3.经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体的红系细胞在体外扩充NK细胞。
一般如实施例1所述制备包含IL-15/IL-15RA变体IL-15v3、IL-15v4和IL-15v5的红系细胞。
检查了IL-15/IL-15RA变体对NK细胞扩充的影响。图2A是一组图(i、ii和iii)，其显示经工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体v3、v4和v5的红系细胞在与纯化的NK细胞一起培养时可扩充NK细胞。在图2A(i)中，在没有工程化红系细胞(无RBC)的情况下培养NK细胞。与在其表面上仅表达HA表位标签的红系细胞一起培养的NK细胞用作对照。将来自一位供体的40,000个纯化的NK细胞一式两份铺板并以如下的滴定培养7天：工程化红系细胞(900,000、300,000、100,000)，rhIL-2(1000、100、10U/mL)，rhIL-15(10、1、0.1ng/mL)。在第7天进行分析。在图2A(ii)中，将NK细胞与900,000个工程化红细胞一起培养，并考虑在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。在图2A(iii)中，将NK细胞与300,000个工程化红细胞一起培养，并考虑在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。
图2B是一组图(i、ii和iii)，其显示表达IL-15/IL-15RA变体v3、v4和v5的工程化红系细胞在与PBMC一起培养时可扩充NK细胞。在图2B(i)中，从两个供体获得100,000个PBMC，并一式两份铺板。将细胞在没有工程化红系细胞(无RBC)的情况下或在具有仅在其表面上表达HA表位标签的红系细胞的情况下培养，作为阴性对照。从两个供体获得100,000个PBMC，并一式两份铺板。将细胞与900,000、300,000或100,000个工程化红系细胞一起培养。在第7天进行流式细胞术分析，对活/死CD56+CD3-细胞进行门控。在图2B(ii)中将PBMC与900,000个工程化红细胞一起培养，并考虑在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。在图2B(iii)中将PBMC细胞与300,000个工程化红细胞一起培养，并考虑在这些细胞上表达的拷贝数，以计算呈递给细胞的总IL-15拷贝数(在X轴上显示)。
来自本实施例的结果显示经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15RA变体的红系细胞可以从纯化的NK细胞群体或PBMC中扩充NK细胞。比较v3和v4的活性，显示了相同拷贝数的v3和v4显示不同的活性。与包含HA的对照红细胞相比，包含IL-15/IL-15RA的红系细胞在高浓度和低浓度下均导致更高的NK细胞扩充。此外，对于变体v4和v5看到剂量响应。
实施例4.制备为表达IL-15/IL-15RA的红系细胞在体内活化NK细胞。
检查制备为在细胞表面上呈现人IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞对离体NK细胞扩充的影响。使用点击方法(国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文)将鼠红系细胞与IL-15-RA-Fc缀合。IL-15/IL-15RA融合蛋白包括与IL-15链融合的受体的sushi域(参见本文表10中所示的蛋白构建体)。
首先，将来自一个供体的40,000个纯化的NK细胞(Astsrte Biologics)一式两份铺板，并在RBC滴定(900 000、300 000、100 000)的情况下培养7天。7天后，通过流式细胞术分析样品，以通过观察CD56+/CD3-的活细胞来估计培养物中NK细胞的相对量。如图3A所示，制备为在其表面处呈现IL-15/IL-15R的红系细胞离体促进有效的NK细胞扩充。
接下来，检查了制备为在其表面处呈现IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞对体内NK细胞活化的影响。将IL-15-RA-Fc红系细胞和对照红系细胞静脉内注射至C57/B6小鼠。注射后3天收集脾脏，加工以得到单细胞悬浮液，并使用流式细胞术针对Ki67和粒酶B染色。
如图3B所示，在用制备为表达IL-15/IL-15RA的红系细胞(mRBC)处理的小鼠中观察到有效的淋巴细胞增殖。显示了NK细胞增殖，如由作为增殖细胞的标志物的百分比Ki67染色确定的。此外，如图3C中所示，在用制备为呈现IL-15/IL-15RA的红系细胞(mRBC)处理的小鼠中发现有效的淋巴细胞活化。显示了NK细胞活化，如由作为活化细胞的标志物的百分比粒酶B表达确定的。
在本实施例中呈现的结果显示了制备为呈现IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞在体内诱导NK细胞的增殖和活化。
实施例5.包含IL-15/IL-15RA的红系细胞在体内减慢肿瘤生长。
用于黑素瘤的B16F10小鼠模型系统用于测试包含人IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞(IL-15RBC)对肿瘤生长的影响。皮下注射后，B16将在5至10天之内形成可触知的肿瘤，并在14至21天之内生长为1×1×1cm的肿瘤。B16小鼠模型系统由Overwijk和Restifo(CurrProtoc Immunol.2001May；CHAPTER:Unit–20.1，其明确通过引用完整并入本文)描述。
使用点击方法(国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文)将鼠红系细胞与人IL-15/IL-15RA缀合。IL-15/IL-15RA融合蛋白在本文表10中呈现的构建体中表达为与IL-15链融合的受体的sushi域。使用流式细胞术定量IL-15/IL-15RA。
最初，对6至12周龄的雌性C57BL/6小鼠皮下接种1×105个B16细胞/小鼠。当肿瘤达到约100mm3的体积时，给动物给药呈现IL-15/IL-15RA的红系细胞，或没有IL-15/IL-15RA的红系细胞或生理盐水，作为对照。为了对动物给药，每剂施用1e9 IL-15RBC的平均值，每细胞50,000个IL-15/RA分子的平均值对应于每剂2ug或0.1mg/kg IL-15/IL-15RA。
每天记录动物的体重和状况，并且每周测量肿瘤3次。通过在2个维度上测量每个肿瘤每周三次测量肿瘤。使用标准公式(L x W2)/2计算肿瘤体积。计算每个时间点各组的平均肿瘤重量和平均值的标准误。
此外，每天记录体重。计算每只小鼠相对于第1天记录的体重的体重变化。
通过评估肿瘤体积和/或肿瘤重量随时间的变化来确定与盐水和未处理的对照相比，包含IL-15/IL-15RA的制备的红系细胞的抗肿瘤活性。
实施例6.经遗传工程化改造以表达4-1BBL的红系细胞的产生。
4-1BBL构建体
制备DNA构建体以在红系细胞中表达，如下表12所示：
表12. 4-1BBL构建体。SEQ ID NO.指氨基酸序列。
Figure BDA0002760528960002031
慢病毒载体的产生
如表12所示构建4-1BBL基因构建体。将基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中。通过用pPACKH1(SystemBiosciences)和含有4-1BBL基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
红系细胞的扩充和分化
从来自正常人供体的动员的外周血细胞衍生的人CD34+细胞是从AllCells Inc.以冷冻方式购买的。扩充/分化程序包括3个阶段。在第一阶段中，将解冻的CD34+红系前体在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人重组人干细胞因子和重组人白介素3的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第二阶段中，将红系细胞在补充有重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组促红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第三阶段中，在补充有人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove的MDM培养基中培养红系细胞。将培养物在5％CO2培养箱中在37℃维持。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种实现感染，在室温下以2000rpm旋转平板90分钟。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用经PE标记的抗4-1BBL抗体(例如纯化的抗人4-1BB配体(CD137L)抗体,BioLegend)的结合来验证工程化红系细胞中4-1BBL的表达。通过针对PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门。
实施例7.在工程化红系细胞表面上的4-1BBL表达在体外驱动T细胞活化。
如实施例6所述制备包含4-1BBL的红系细胞。
在标准的体外测定法中检查工程化红系细胞表面上4-1BBL表达对T细胞活化的影响，其中使用人T细胞系Jurkat细胞测量细胞内NFκB信号传导。未转导的RBC(UTR RBC)代表对照RBC，因为尚未对这些进行工程化改造以表达活性蛋白。如图4A所示，RBC-4-1BBL驱动有效的T细胞活化，刺激NFκB途径的80-100倍活化，如通过过表达4-1BB/NFκB/Luc的Jurkat细胞的萤光素酶活性所测量的。相反，当与二抗交联时，4-1BB激动性mAb(α-4-1BBAb)刺激有限的6倍NFκB活化。当将单独的α-4-1BB Ab或单独的二抗与Jurkat细胞一起温育时，没有NFκB活化的诱导。当将对照RBC与Jurkat细胞一起温育时，获得了相似的结果。该实验显示了与激动性4-1BB单克隆抗体α-4-1BB Ab和未处理的对照相比，包含4-1BB-L的工程化红系细胞诱导高大于15倍的NFκB活化。
在另一个实验中，用增加量的4-1BB-L mRNA转染红系细胞，并测量4-1BB-L的表达(图4B)。在x轴上显示每个细胞的4-1BBL分子拷贝数。将50,000个包含4-1BBL的工程化红系细胞与Jurkat细胞共培养。6小时后收集细胞，并测定萤光素酶活性。图4B显示了由包含4-1BBL的工程化红系细胞对NFκB的活化是可调的。
因此，如图4A和图4B所示，增加在经工程化改造以在表面上表达4-1BBL的工程化红系细胞上4-1BBL蛋白的拷贝数导致活化的剂量响应。因此，红系细胞可以被工程化以表达4-1BBL以确保最大的T细胞活化。
接下来，测量原代CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化。用CTFR标记来自3个供体的100,000个PBMC，并与包含4-1BB-L的工程化红系细(“RBC-4-1BBL”)、对照RBC(“RBC-CTL”)、单独的α-4-1BB Ab或与二抗一起温育。RBC以50,000、25,000或12,500个细胞存在。α-4-1BBAb的浓度范围为100nM，10nM，1nM。在第5天，使用CTFR稀释液评估CD8+和CD4+T细胞的相对量。收集上清液，并使用ELISA评估IFNγ和TNFα的量。如在图5A和图5B中显示，RBC-4-1BBL刺激原代CD4+和CD8+T细胞有效增殖并被活化，如通过IFNγ和TNFα(被对于人免疫应答而言重要的活化的T细胞释放的两种细胞因子)的产生所测量的。RBC-41BBL分别刺激CD8+和CD4+T细胞增加4-6倍和2-3倍，并且刺激显著的T细胞活化，如通过IFNγ和TNFα生成的高达3倍增加来测量。相反，4-1BB激动性mAb(α-4-1BB Ab)不刺激任何可测量的增殖，并且仅刺激T细胞的最小活化。不受理论的束缚，认为RBC-4-1BBL的有效的T细胞刺激活性是由于4-1BBL以其天然的三聚体构象在细胞表面上高表达，模拟了抗原呈递细胞和T细胞之间形成的免疫突触。
本实施例中呈现的结果共同显示了，4-1BBL以其天然三聚体构象在RBC表面上表达驱动高度有效的T细胞活化，如通过在4-1BB/NKfB/Luc Jurkat细胞中的NFκB活化以及原代CD4+和CD8+T细胞的有效增殖和活化测量的。
实施例8.包含4-1BBL的红系细胞刺激转移性黑素瘤小鼠模型中的CD8+T细胞。
B16F10肺转移小鼠模型用于测试包含鼠4-1BBL的鼠红系细胞对刺激CD8+T细胞和CD8+T细胞亚群，例如增殖CD8+记忆T细胞、CD8+效应T细胞和粒酶B+CD8+T细胞的影响，所述CD8+T细胞亚群对于癌症患者中改善的和持续的临床响应率是重要的。
使用点击方法(国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文)将鼠红系细胞与鼠4-1BBL缀合。鼠4-1BBL蛋白在本文表10中呈现的构建体中表达。
与天然三聚体构象的4-1BBL缀合的鼠红系细胞(RBC-4-1BBL)在其细胞表面上含有约150,000个4-1BBL拷贝，这比制备为表达4-1BBL的人红系细胞低2倍，但足以刺激强烈的T细胞活化和增殖。图9中显示的结果指示mRBC-4-1BBL足以刺激有效的T细胞活化和增殖，因为mRBC-4-1BBL在体内驱动的CD8+T细胞的活化和增殖水平与高15倍剂量的3H3，抗小鼠4-1BB激动性单克隆抗体(a4-1BB mAb)相似，指示三聚体4-1BBL的细胞呈现更有效。阴性对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)和不表达活性蛋白的鼠对照RBC(mRBC-CTRL)不刺激CD8+T细胞的体内增殖。
实施例9.包含4-1BBL的红系细胞在体内减缓肿瘤生长。
使用用于结肠癌的MC38同基因小鼠模型系统测试包含鼠4-1BBL的鼠红系细胞对肿瘤生长的影响。MC38是可商购的结肠癌小鼠模型(参见例如Selby et al.(2016)PLoSONE 11(9):e0161779；Altogen Labs；Charles River Laboratories)。
使用点击方法(国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文)将鼠红系细胞与重组鼠4-1BBL蛋白缀合。鼠4-1BBL蛋白在本文表10中呈现的构建体中表达。
当肿瘤达到约100mm3的体积时，对动物给药呈现4-1BBL的红系细胞，或不含4-1BBL的红系细胞，或盐水，作为对照。为了对动物给药，每剂施用1e9 4-1BBL RBC的平均值，每个细胞20,000-65,000个4-1BBL分子的平均值对应于1-3μg 4-1BB-L或者每只小鼠每剂约0.05-0.15mg/kg。
每天记录动物的体重和状况，并且通过在2个维度上测量每个肿瘤每周三次测量肿瘤。使用标准公式(L x W2)/2计算肿瘤体积。计算每个时间点各组的平均肿瘤重量和平均值的标准误。
此外，每天记录体重。计算每只小鼠相对于第1天记录的体重的体重变化。
通过评估肿瘤体积和/或肿瘤重量随时间的变化来确定与未处理的对照相比包含4-1BBL的制备的红系细胞的抗肿瘤活性。结果在图6中显示，并且证明了包含4-1BBL的制备的红系细胞与未处理的对照相比随时间降低肿瘤体积的增加。
实施例10.鼠RBC-4-1BBL的毒性缺乏
肝毒性的小鼠模型用于评估鼠RBC-4-1-BBL的毒性的缺乏或可耐受性(参见例如Niu et al(2007)J.Immunology 178:4194-4213)。如图10所示，遵循与实施例8中描述的临床前研究中所用的相同给药日程表，观察到鼠RBC-4-1BBL的有利的可耐受性。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)肝酶的水平在施用鼠RBC-4-1BBL之后没有显著升高。相反，在施用4-1BB激动剂单克隆抗体3H3后，观察到这些肝酶显著升高。这指示在体内用鼠RBC-4-1BBL观察到的CD8阳性T细胞的有效刺激并不伴随着已经与其他4-1BB激动剂的施用相关的肝毒性。
实施例11.经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15-RA融合蛋白和4-1BBL的红系细胞的产生。
慢病毒载体的产生
构建IL-15/IL-15-RA融合蛋白和4-1BBL基因。将每个基因克隆到MSCV启动子序列控制下的慢病毒载体pCDH(System Biosciences)的多克隆位点中，使得1个载体包含IL-15/IL-15RA的基因，并且另一个载体包含4-1BBL的基因。通过用pPACKH1(SystemBiosciences)和含有IL-15/IL-15-RA基因的pCDH慢病毒载体和含有4-1BBL基因的pCDH慢病毒载体共转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
或者，构建IL-15/IL-15-RA融合蛋白和4-1BBL基因，并克隆到在MSCV启动子序列控制下的慢病毒载体pCDH(System Biosciences)的多克隆位点中，使得单个载体包含IL-15/IL-15RA的基因和4-1BBL的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有IL-15/IL-15-RA基因和4-1BBL基因两者的pCDH慢病毒载体共转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
红系细胞的扩充和分化
从来自正常人供体的动员的外周血细胞衍生的人CD34+细胞是从AllCells Inc.以冷冻方式购买的。扩充/分化程序包括3个阶段。在第一阶段中，将解冻的CD34+红系前体在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人重组人干细胞因子和重组人白介素3的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第二阶段中，将红系细胞在补充有重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组促红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第三阶段中，在补充有人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove的MDM培养基中培养红系细胞。将培养物在5％CO2培养箱中在37℃维持。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种实现感染，在室温下以2000rpm旋转平板90分钟。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用经PE标记的抗IL-15-RA抗体(例如抗IL-15RA抗体(JM7A4)(ab91270),AbCam)的结合来验证工程化红系细胞中IL-15/IL-15-RA的表达。使用经PE标记的抗4-1BBL抗体(例如纯化的抗人4-1BB配体(CD137L)抗体，BioLegend)的结合来验证工程化红系细胞中4-1BBL的表达。通过针对PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门。
实施例12.工程化红系细胞表面上的IL-15/IL-15RA和4-1BBL的表达在体外驱动T细胞活化。
如实施例11所述制备包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的人红系细胞。
在标准体外测定法中检测工程化红系细胞表面上IL-15/IL-15RA和4-1BBL表达对T细胞活化的影响，其中使用Jurkat细胞(人T细胞系)测量细胞内NFκB信号传导。未转导的RBC(UTR RBC)代表对照RBC，因为尚未对这些进行工程化改造以表达活性蛋白。如图11所示，RBC-IL-15/IL-15RA-4-1BBL驱动有效的T细胞活化，类似于针对RBC-4-1BBL观察到的T细胞活化水平(图4A)。当4-1BB激动性mAb(α-4-1BB Ab)与二抗交联时，看到有限的NFκB活化。当将单独的α-4-1BB Ab或单独的二抗与Jurkat细胞一起温育时，没有NFκB活化的诱导。本实验显示了，与激动性4-1BB单克隆抗体α-4-1BB Ab和未处理的对照相比，包含IL-15/IL-15RA和4-1BB-L的工程化红系细胞诱导有效的NFκB活化。如也在图11中显示，用增加量的IL-15/IL-15RA和4-1BB-L转染红系细胞，并测量IL-15/IL-15RA和4-1BBL的表达。在x轴上显示每个细胞的IL-15/IL-15RA和4-1BB-L拷贝数。图11显示了由包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的工程化红系细胞对NFκB的活化是可调的。
实施例13.经工程化改造以表达IL-15/IL-15-RA融合蛋白和4-1BBL的红系细胞在有或没有CD3刺激的情况下有效活化脾细胞。
使用点击方法(国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文)将鼠红系细胞与IL-15/IL-15-RA融合蛋白和4-1BBL缀合。
脾细胞由具有免疫功能的多种细胞群体组成，包括CD8+T细胞和NK细胞。从3只幼稚
Figure BDA0002760528960002091
小鼠中分离出脾细胞。将150,000个脾细胞与1e7个包含单独的4-1BBL、单独的IL-15/IL-15RA、IL-15/IL-15RA和41BBL两者或无蛋白质的经点击的细胞；小鼠4-1BB激动剂抗体3H3(1ug/mL)或重组人IL-15(10ng/mL)在37度下共温育2天。用或不用抗CD3(aCD3)处理脾细胞。用aCD3刺激脾细胞T细胞群体。在没有aCD3刺激的情况下，活性可以归因于NK细胞活化。通过ELISA测量上清液中产生的IFNγ。干扰素gamma(IFNγ)细胞因子分泌用作脾细胞活化的量度。
如图7中显示，当用aCD3刺激时，与单独或组合的重组人IL-15或小鼠4-1BB激动剂抗体3H3相比，经工程化改造以呈现IL-15/IL-15-RA融合蛋白和4-1BBL的红系细胞显示优异的响应。如也在图7中显示，当不使用aCD3刺激时，IL-15/IL-15RA和4-1BBL之间具有高的协同作用，并且经过工程化改造以呈现IL-15/IL-15-RA融合蛋白和4-1BBL的红系细胞显示与重组人IL-15相比优异的响应。在没有CD3刺激的情况下，可以得出结论，观察到的效果是NK细胞活化的结果。
为了确认活化的NK细胞的存在，进行IFNγ染色。分离脾细胞，并在布雷菲德菌素A(brefeldin A)存在下，于37℃用PMA/离子霉素(2ug/mL)刺激4小时。温育后，将细胞瞬时离心(spin down)并在PBS中洗涤，然后在室温(RT)下进行细胞表面染色15分钟。然后洗涤细胞，固定15分钟，在室温下在透化缓冲液中针对IFNγ染色30分钟。IFNγ的存在证实了NK细胞的活化。
实施例14.经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞诱导总CD8+细胞的增加。
通常如实施例11所述制备包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的人红系细胞。
测定在细胞表面上包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的工程化去核细胞对CD8+T细胞、NK细胞和这些细胞的关键子集的扩充的影响。具体而言，将细胞表面上包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者的工程化红系细胞对细胞扩充的影响与包含单一激动剂4-1BBL(RBC-4-1-BBL)或IL-15/IL-15RA融合蛋白(RBC-IL-15/IL-15RA)的工程化红系细胞的影响比较。如图12所示，在存在T细胞受体刺激(+aCD3刺激)的情况下，共培养5天后观察到CD8+记忆T细胞的大于6倍扩充，其与α-4-1BB Ab，重组人IL-15(rhIL-15)，α-4-1BB Ab和rh1L-15的组合，和RBC-CTRL有利地比较。在没有用抗CD3抗体刺激T细胞(无aCD3刺激)的情况下，培养8天后4-1BBL和IL-15/IL-15RA的组合在扩充CD8+记忆T细胞和NK细胞两者上协同作用达约9倍，其显著高于α-4-1BB Ab，rhIL-15，α-4-1BB Ab和rh1L-15的组合，RBC-IL-15/IL-15RA和RBC-4-1BB。
本实施例中呈现的结果共同显示了，表面上包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的工程化去核细胞驱动高度有效的T细胞活化(如通过NFκB活化测量)以及CD8+记忆T细胞和NK细胞的扩充。此外，与包含单独的4-1-BBL或单独的IL-15/IL-15RA融合蛋白的工程化红系细胞相比，IL-15/IL-15RA和4-1BBL的组合在扩充CD8+记忆T细胞和NK细胞中导致协同作用。
实施例15.包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞在体内减少肺转移。
用于黑素瘤的B16F10转移性小鼠模型系统(Kubo et al.(2017)CancerImmunology Research 5(9):1–9，其通过引用完整并入本文)用于测试包含人IL-15/IL-15RA和鼠4-1BBL的鼠红系细胞(IL-15/RA 4-1BBL RBC)对转移性生长的影响。在该模型中，将肿瘤细胞静脉内注射以在肺中建立转移，然后单独或与抗PD1抗体联合用鼠红系细胞处理小鼠，该鼠红系细胞制备为呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL。皮下注射后，B16在5至10天内形成可触知的肿瘤，并在14至21天内长成1×1×1cm的肿瘤。
使用点击方法(国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文)将鼠红系细胞与人IL-15/IL-15RA，鼠4-1BBL缀合，或与人IL-15/IL-15RA和鼠4-1BBL两者共缀合。使用流式细胞术定量IL-15/IL-15RA和4-1BBL。IL-15/IL-15RA融合蛋白在本文表10中呈现的构建体中表达为与IL-15链融合的受体的sushi域。鼠4-1BBL蛋白在本文表10呈现的构建体中表达。
最初，对7周龄的雌性C57BL/6小鼠静脉内接种1×105个B16F10细胞/小鼠。然后在各种实验中，对动物静脉内(IV)给药以下项：呈现4-1BBL，IL-15/IL-15RA或呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA两者的红系细胞；单独的抗PD1单克隆抗体(αPD-1mAb)；与αPD-1(IP)组合IV施用的呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的红系细胞；腹膜内(IP)施用的呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的红系细胞；小鼠4-1BB激动剂抗体(3H3)；或没有4-1BBL和IL-15/IL-15RA的红系细胞(mRBC-CTL)作为对照。为了对动物给药，以单独的41BBL的每个细胞的100,000个分子的平均值(对应于0.2mg/kg 4-1BBL)，和单独的IL-15-RA的每个细胞的60,000个分子的平均值(对应于每剂0.12mg/kg IL-15/IL-15RA)，或对于包含4-1BBL和IL-15/IL-15RA的红系细胞，50,000-60,000个41BBL分子和30,000-40,000个IL-15-RA分子(分别对应于0.1-0.12mg/kg和0.06-0.08mg/kg)，每剂施用1e9个红系细胞的平均值。激动性41BB抗体(3H3)以2.5mg/kg给药。在接种后第1、5和8天对动物给药mRBC或3H3。
每天记录动物的体重和状况。接种后第14天，处死动物并收集肺。使用立体镜评估肺转移。
2周后测定转移的数目。此外，每天记录体重。计算每只小鼠相对于第1天记录的体重的体重变化。通过流式细胞术测量经处理的小鼠的灌注肺内的免疫浸润物。NK细胞(NK1.1+)浸润报告为CD45+免疫细胞内总细胞的百分比。
如图13A所示，作为单一疗法i.v.施用的制备为在其表面上呈现IL-15/IL-15RA+4-1BBL两者的鼠红系细胞与个别使用mRBC CTRL、mRBC4-1BBL和mRBC IL-15/IL-15RA处理的小鼠相比降低小鼠的肿瘤负荷，从而指示通过在红系细胞的细胞表面上包含4-1BBL和IL-15/IL-15RA两者可以实现的潜在的协同。使用mRBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA所实现的肿瘤负荷的减少不显著不同于使用41BB激动剂单克隆抗体3H3所实现的。此外，肺转移数目的此种减少还与NK细胞向肺的浸润的显著增加相关(p＝0.02)，如图13B中显示。
在图13C中显示了单独的类似研究的结果。如上所述进行此研究，只是对于对动物给药，以4-1BBL的每个细胞的25,000个分子的平均值，和IL-15/IL-15RA的每个细胞的45,000个分子的平均值，每剂施用1e9个红系细胞的平均值。从图13C中可以看出，当与抗PD1抗体联合i.v.施用时，制备成呈现IL-15/IL-15RA+4-1BBL的鼠红系细胞与用阴性对照PBS和mRBC CTRL以及单独的抗PD1抗体处理的小鼠相比显著降低小鼠的肿瘤负荷。小鼠4-1BB激动剂抗体3H3作为单一疗法没有活性。在此项研究中，制备为呈现IL-15/IL-15RA+4-1BBL的鼠红系细胞作为单一疗法没有活性，因为i.v.施用的呈现IL-15/IL-15RA+4-1BBL的鼠红系细胞的暴露比先前的单一疗法研究(上文描述和图13A)中低约三倍。然而，当在腹膜内或i.p.施用时，制备为呈现IL-15/IL-15RA +4-1BBL的鼠红系细胞作为单一疗法在减少肺转移中在本研究中是高度有效的，推测因为获得更大的血液中的暴露和/或对其他器官(例如淋巴结)的分布。
在另外的实验中，在B16F10模型中通过量化NK细胞向肿瘤中的浸润来评估制备为呈现IL-15/IL-15RA+4-1BBL的红系细胞的药效学作用。用B16F10细胞皮下接种C57BL/6小鼠。当肿瘤达到约50立方毫米的体积时，将动物随机化，并在第1、4和8天静脉内给药1x109mRBC-m4-1BBL,mRBC-IL-15/IL-15RA或mRBC IL-15/IL-15RA +4-1BBL。另外的组接受200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其充当阴性对照。在这里，如以上在本实施例中所述，IL-15/IL-15RA融合蛋白表达为与IL-15链融合的受体的sushi域(在表10中呈现的构建体中)。
每个细胞的分子的评估显示，mRBC-m4-1BBL表达每个细胞的150,000个分子，IL-15/IL-15RA表达每个细胞的90,000个分子，并且mRBC IL-15/IL-15RA+4-1BBL表达每个细胞的70,000个m4-1BBL分子和50,000个IL-15/IL-15RA分子。在第11天，收集肿瘤，进行消化，并通过流式细胞术分析肿瘤细胞悬浮液的NK细胞的量以及NK成熟和分化标志物。
如图13D-F中所示，与PBS处理的对照小鼠相比，mRBC IL-15/IL-15RA+4-1BBL导致肿瘤中总NK细胞计数增加(p＝0.013，图13D)。进一步的分析证明了mRBC IL-15/IL-15RA+4-1BBL处理的小鼠中的NK细胞是更成熟的(p＝0.013；图13E)且高度功能的(p＝0.008；图13F)，如与对照小鼠相比时终末分化和粒酶B+NK细胞总数增加证明的。mRBC IL-15/IL-15RA+4-1BBL的作用比mRBC-m41BBL和mRBC-IL-15/IL-15RA的作用更明显。这些发现指示包含m4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠替代产品在小鼠中是高度功能的，并且可以导致NK细胞浸润到肿瘤中
实施例16.包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞在体外调节指示NK细胞扩充和活化的表型标志物。
一般如实施例1中所述制备包含IL-15/IL-15RA(v4，包含成熟的细胞外IL-15RA)的红系细胞。一般如实施例6中所述制备包含4-1BBL的红系细胞。
解冻冷冻的外周血单个核细胞(PBMC；Astarte)，重悬于含10％FBS的RPMI中，并以100,000个细胞/孔在96孔圆底平板中分配。以不同量(对于IL-15/IL-15RA为250,000或500,000个细胞和对于4-1BBL为500,000个细胞)添加包含IL-15/IL-15RA(v4；表达成熟的细胞外IL-15RA)，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞。将培养物温育8天(长期引发)，然后使用以下抗体染色以通过流式细胞术分析：来自BioLegend的CD69(FN50)，TRAIL(RIK-2)，41BB(4B4-1)，NKp44(P44-8)，以及KLRG1(14C2A07)和来自Invitrogen的Aqua Dye以标记死细胞。对于细胞内染色，将细胞固定并用Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒(eBioscience)进行透化，并对Ki67(B56，BD Biosciences)和GZMB(GB11 BioLegend)进行染色。通过流式细胞术(Novocyte)分析细胞。
该实验的结果在图14中显示。NK细胞的长期(8天)引发后，发现与用包含HA的对照红系细胞培养的NK细胞相比，包含IL-15/IL-15RA(v4)，41BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL(“co”)的红系细胞增强培养8天后的NK细胞回收。在图14中也显示来自用作NK细胞存活、扩充和活化的表型读数的一组标志物的分析的结果。下文描述了每个标志物获得的结果。
Ki67：与用包含HA的对照红系细胞培养的NK细胞相比，如通过Ki67染色测量，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞增强NK细胞增殖。
粒酶B：与用对照HA观察的情况(参见最右上图，其显示了GZMB阳性的NK细胞中GZMB的流式细胞术染色的相对强度)相比，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致NK细胞中NK细胞毒性标志物粒酶B表达的比例和水平增加。
TRAIL：与用对照HA观察到的情况相比，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致含有TRAIL的NK细胞(NK细胞活化的标志物和含有TRAIL-配体的细胞的死亡诱导配体)的比例增加。据报道TRAIL表达随IL-15刺激而增加，提示这些工程化红系细胞重演IL-15转呈现(transpresentation)的作用。
CD69：与用对照HA观察到的情况相比，包含IL-15/IL-15RA的红系细胞导致包含CD69的NK细胞比例增加。CD69是淋巴细胞早期活化的标志物。
NKp44：与用对照HA观察到的情况相比，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL IL-15/IL-15RA的红系细胞导致包含NKp44的细胞比例增加。NKp44仅在活化的NK细胞上表达，并且可以促进杀死某些病毒感染的细胞和肿瘤细胞。
41BB：与用对照HA观察到的情况相比，包含4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致NK细胞上41BB表达增加。41BB是NK和T细胞上的活化标志物。
总之，来自一组表型标志物的分析的结果表明，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者的红系细胞在体外增强NK细胞的存活、扩充和活化。
实施例17.经遗传工程化改造以表达4-1BBL和IL-15/IL-15RA的红系细胞在体外诱导肿瘤细胞杀伤。
包含IL-15/IL-15RA(v5，IL-15RAsushi域)的红系细胞
一般如实施例1所述制备包含IL-15/IL-15RA(v5，包含IL-15RAsushi域)的红系细胞。一般如实施例6所述制备包含4-1BBL的红系细胞。对于(i)包含4-1BBL的红系细胞，(ii)包含IL-15/IL-15RA的红系细胞；和(iii)包含IL-15/IL-15RA的红系细胞和包含4-1BBL的红系细胞的混合物检查NK细胞对K562人慢性髓性白血病(CML)的体外杀伤。简而言之，将20,000个纯化的NK细胞(Astarte Biologics)与200,000个包含4-1BBL或IL-15/IL-15RA或4-1BBL和IL-15/IL-15RA两者的混合物的RBC温育16小时，各以200,000。另外，在一个处理组中，将20,000个NK细胞与5ng/mL的重组IL-15一起温育。温育16小时后，将20,000个K562细胞加入培养物达4小时。这些细胞充当NK细胞的靶细胞群体。通过流式细胞术测量活K562细胞的计数。根据与对照相比的存活百分比计算杀伤百分比。图8中显示了结果。如图8所示，包含IL-15/IL-15RA+4-1BBL的红系细胞显示出最高的被NK细胞的杀伤百分比。包含IL-15/IL-15RA(v4，成熟的细胞外IL-15RA)和4-1BBL的红系细胞
对上述者进行了其他研究，但其中(i)使用不同的IL-15/IL-15RA融合蛋白，特别是包含成熟的细胞外IL-15RA而不是sushi域的IL-15/IL-15RA v4，和(ii)红细胞被工程化改造成共表达IL-15/IL-15RA和4-1BBL。检查了用含有IL-15/IL-15RA(v4)，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA的红系细胞长期(8小时)引发和短期(过夜)引发NK细胞对体外杀伤K562人CML细胞的影响。对于这些实验，通常分别如实施例1，实施例6和实施例11所述制备包含IL-15/IL-15RA(v4)，4-1BBL和包含4-1BBL和IL-15/IL-15RA(v4)的红系细胞。
(i)长期引发
对于长期引发，使用Ficoll从新鲜血液中分离PBMC，并使用Miltenyi的人NK负选择试剂盒进一步富集NK细胞。然后，将5e5个NK细胞与3e6个包含IL-15/IL-15RA(v4)，4-1BBL或包含IL-15/IL-15-RA和4-1BBL的红系细胞在24孔板中培养8天。对于对照，将NK细胞与0.1、1或10ng/mL的rhIL-15(Peprotech)培养。
8天后，使用以下抗体将细胞染色以通过流式细胞术进行分析：来自BioLegend的CD56(5.1H11)，CD3(UCHT1)，CD8(RPA-T8)，CD69(FN50)，TRAIL(RIK-2)，41BB(4B4-1)，和NKp44(P44-8)和Invitrogen的Aqua Dye以标记死细胞。对于细胞内染色，将细胞固定并用Foxp3/转录因子固定/透化试剂盒(eBioscience)进行透化，并对Ki67(B56，BDBiosciences)和GZMB(GB11 BioLegend)进行染色。通过流式细胞术(Novocyte)分析细胞。来自用作NK细胞存活、扩充和活化的表型读数的一组标志物的分析的结果与实施例16中的结果相似(数据未显示)。简而言之，与用包含HA的对照红系细胞培养的NK细胞相比，如通过Ki67染色测量，包含4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞增强NK细胞增殖。与用对照HA观察的情况相比，包含IL-15/IL-15RA或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致NK细胞中NK细胞毒性标志物粒酶B表达的比例和水平增加。与用对照HA观察到的情况相比，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致含有TRAIL的NK细胞(NK细胞活化的标志物和含有TRAIL-配体的细胞的死亡诱导配体)的比例增加。与用对照HA观察到的情况相比，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致包含CD69的NK细胞比例增加。CD69是淋巴细胞早期活化的标志物。与用对照HA观察到的情况相比，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致包含NKp44的细胞比例增加。NKp44仅在活化的NK细胞上表达，并且可以促进杀死某些病毒感染的细胞和肿瘤细胞。与用对照HA观察到的情况相比，包含4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致NK细胞上41BB表达增加。41BB是NK和T细胞上的活化标志物。因此，来自表型标志物分析的结果证明，包含IL-15/IL-15RA，4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者的红系细胞增强NK细胞的存活、扩充和活化。
使用人NK负选择试剂盒再纯化来自NK和含有IL-15/IL-15-RA，4-1BBL或包含IL-15/IL-15-RA和4-1BBL的红系细胞的共培养物的NK细胞。为了用K562细胞进行杀伤测定法，将K562靶细胞用CellTrace Far Red标记，并将20,000个细胞与纯化的NK以不同比例(红系:靶物1:1或5:1)一起分配并温育4小时。然后将细胞在冰上用CD56(克隆)，CD3(克隆)，活/死(Invitrogen)染色，用2％多聚甲醛固定，并通过流式细胞术(Novocyte)进行分析以确定活靶物的数量。特异性杀伤计算为(“K562+NK”条件下的死亡K562靶细胞％)–(“仅K562”条件下的死亡K562靶细胞％)以考虑自发性靶细胞死亡。
图15中显示了结果。图15显示了两个PBMC供体的平均百分比杀伤，绘制为特异性杀伤，其中E:T(效应器(NK):靶物(肿瘤))细胞比例为5:1。如图15所示，与对照HA相比，用包含IL-15/IL-15RA或包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞引发的NK细胞具有针对K562靶细胞的增强的细胞毒性。与图8中所示的结果相似，包含IL-15/IL-15RA(v4)+4-1BBL的红系细胞显示出最高的被NK细胞的百分比杀伤，与用可溶性IL-15或IL-2引发的NK细胞观察到的情况相当。当E:T细胞比例为1:1时获得的结果类似地显示，尽管观察到更小的总体杀伤，并且靶物杀伤不与用可溶性IL-15或IL-2引发的NK细胞所见的情况(数据未显示)一样好，与对照HA相比，用包含IL-15/IL-15RA或包含IL-15/IL-15RA(v4)和4-1BBL的红系细胞引发的NK细胞具有增加的针对K562细胞的细胞毒性。
(ii)短期引发
对于短期引发，将冷冻、纯化的NK细胞(Astarte)解冻，重悬于培养基(含10％FBS，1％Pen-Step的RPMI)中，并与2e5个包含IL-15/IL-15RA(v4)，4-1BBL或包含IL-15/IL-15-RA和4-1BBL的红系细胞一起以每孔2e4或1e5分配于96孔U底板中。对于对照，将NK细胞单独分配，或与rhIL-15(0.1、1或10ng/mL，取决于实验；Peprotech)一起分配。另外，仅用红系细胞建立对照孔。将细胞在湿润的培养箱中于37℃下培养过夜(16-20小时之间)。
为了用K562细胞进行杀伤测定法，将K562细胞用CellTrace Far Red标记，并以5：1E：T的比例将20,000个靶细胞添加到含有NK细胞，NK和包含IL-15/IL-15RA(v4)，4-1BBL或包含IL-15/IL-15-RA和4-1BBL的红系细胞，或作为对照的仅红系细胞的过夜培养物的孔，并且温育4小时。然后将细胞在冰上用CD56(克隆)，CD3(克隆)，活/死(Invitrogen)染色，用2％多聚甲醛固定，并通过流式细胞术(Novocyte)进行分析以确定活靶物的数量。特异性杀伤计算为(“K562+NK”条件下的死亡K562靶细胞％)–(“仅K562”条件下的死亡K562靶细胞％)以考虑自发性靶细胞死亡。结果(数据未显示)显示，与对照或包含4-1BBL的红系细胞(各约40％杀伤)相比，用包含IL-15/IL-15RA或包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞过夜引发的NK细胞具有增强的针对K562靶物的细胞毒性(约60％杀伤)，但小于用rhIL-15引发的NK细胞(至少90％杀伤)。
本实施例中的结果共同证明包含单独或与4-1BBL一起的IL-15/IL-15RA的红系细胞以每个细胞为基础增强NK细胞的细胞毒性，也就是说，NK细胞不仅得到更好地扩充，而且所得的个别NK细胞自身也更具活性。
实施例18.经遗传工程化改造以表达4-1BBL和IL-15/IL-15RA v4的红系细胞体外诱导ADCC杀伤
如上文实施例17中所述，用包含IL-15/IL-15RA(v4)，4-1BBL或包含IL-15/IL-15RA(v4)和4-1BBL的红系细胞对NK细胞进行短期(过夜)引发。
对于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定法，将Raji细胞用CellTraceFar Red标记，然后在37℃下与5μg/mL抗CD20 IgG1(Invivogen)或IgG1同种型对照抗体(“iso”，BioLegend)温育15分钟。然后洗涤Raji细胞，并将20,000个细胞添加到含有NK细胞，NK细胞和包含4-1BBL，IL-15/IL-15RA或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞，或仅工程化红系细胞的过夜培养物的孔，并温育4小时。然后将细胞在冰上用CD56(克隆)，CD3(克隆)，活/死(Invitrogen)染色，用2％多聚甲醛固定，并通过流式细胞术(Novocyte)进行分析以确定活靶物的数量。特异性杀伤计算为(“Raji+NK”条件下的死亡Raji靶靶物％)–(“仅Raji”条件下的死亡Raji靶物％)以考虑自发性靶细胞死亡。
如图16所示，与用包含4-1BBL的红系细胞或对照引发过夜的NK细胞相比，用包含IL-15/IL-15RA或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞引发过夜的NK细胞表明对Raji细胞的杀伤百分比增加。因此，这些结果证明，包含IL-15/IL-15RA或包含IL-15/IL-15RA和41BBL的红系细胞导致对Raji细胞靶物的ADCC杀伤增强，指示这些红系细胞在每个细胞基础上增强NK细胞的细胞毒性，也就是说，NK细胞不仅得到更好地扩充，而且所得的个别NK细胞自身也更具活性。
实施例19.包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞在体内降低结肠癌小鼠模型中的肿瘤负荷。
用于结肠癌的CT26同基因小鼠模型系统用于测试包含人IL-15/IL-15RA和鼠4-1BBL的鼠红系细胞对肿瘤负荷的影响。CT26是可商购的小鼠结肠癌模型(Zhang et al.,Clin Exp Metastasis.2013Oct；30(7):10.1007/s10585-013-9591-8，通过引用整体并入本文)。
使用点击方法(国际申请号PCT/US2018/000042中描述了用于功能化红系细胞的点击化学，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其通过引用完整并入本文)将鼠红系细胞与IL-15/IL-15RA(“IL-15TP”)和4-1BBL共缀合(即IL-15TP和4-1BBL都缀合在同一细胞上)。IL-15/IL-15RA融合蛋白在本文表10中呈现的构建体中以与IL-15链融合的受体的sushi域表达。鼠4-1BBL蛋白在本文表10中呈现的构建体中表达。
当肿瘤达到约50mm3的体积时，给动物给药静脉内(IV)施用的呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA(“IL-15TP”)的鼠红系细胞，给药腹膜内(IP)施用的单独的抗PD1单克隆抗体(αPD-1mAb；150μg)，或给药与IP施用的αPD-1组合的IV施用的呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA(“IL-15TP”)的鼠红系细胞。没有4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞用作对照(“mRBC-CTRL”)。为了对动物给药，以每个细胞的m4-1BBL的30,000个分子的平均值和每个细胞的IL-15TP的35,000个分子的平均值每剂施用1e9个红系细胞的平均值。
每天记录动物的体重和状况，并通过在2个维度上测量每个肿瘤，每周测量3次肿瘤。使用标准公式：(L x W2)/2计算肿瘤体积。计算各组在每个时间点的平均肿瘤重量和平均值的标准误。每天记录体重。相对于第1天记录的体重计算每只小鼠的体重变化(指示的治疗日从观察到期望肿瘤体积的日期开始)。在第11天，收获来自荷瘤小鼠的脾脏和肿瘤，并从这两个组织中产生细胞悬浮液用于流式细胞术分析。分析增殖性CD8 T细胞(Ki67+)和功能性CD8 T细胞(粒酶B+)的总数。
通过评估肿瘤体积和/或肿瘤重量随时间的变化测定与对照相比呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的制备的鼠红系细胞的抗肿瘤活性。如图17A所示(显示的数据是在第13天，并且每个点代表1只小鼠中的肿瘤)，作为单一疗法或与抗PD1抗体组合i.v.施用的制备为呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞降低CT26结肠癌小鼠模型的肿瘤负荷。与单独的制备的红系细胞或抗PD1相比，用呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞和抗PD1抗体的组合处理导致更高的具有稳定疾病或肿瘤消退的小鼠的数目。此外，4-1BBL和IL-15/IL-15RA对肿瘤生长的抑制伴随着增殖的和细胞毒性CD8 T细胞的肿瘤浸润的1.7倍增加(图17B)。
实施例20.包含IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞在体内缺乏毒性。
使用小鼠肝毒性模型来评估鼠RBC-4-1-BBL和IL-15/IL-15RA的毒性缺乏或可耐受性(Niu et al J Immunology 2007 178:4194-4213，其全部内容通过引用并入本文)。简而言之，对6至12周龄的雌性C57BL/6小鼠给药以下项：呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞(1E9个细胞)，不含4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞，150μg的抗PD1抗体，呈现4-1BBL和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞(1E9个细胞)和150ug的抗PD1抗体，或50ug或200ug的3H3抗体，或生理盐水作为对照。每天记录动物体重和状况。在第1、4、8和11天进行给药，并且在第18天进行最后的处死。收集肝和血清，并且在肝消化并处理为单细胞悬浮液后，对肝进行巨噬细胞和CD8浸润分析。另外，定量血清中肝转氨酶ALT的水平。
如图18所示，观察到鼠RBC-4-1BBL+IL/15/IL-15RA的有利的可耐受性。施用鼠RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA后，丙氨酸转氨酶(ALT)肝酶水平未显著升高。相反，在施用4-1BB激动剂单克隆抗体3H3后观察到此肝酶的显著升高。巨噬细胞、CD8+T细胞、和特别是CD8+/Eomes+/KLGR1+T细胞的肝浸润被认为对4-1BBL诱导的肝毒性至关重要。如所预期的，在用4-1BB激动剂抗体3H3处理后，观察到所有这些群体的肝浸润增加。重要的是，在施用鼠RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA后，任何这些群体的肝浸润均没有增加。这些结果指示用鼠RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA在体内观察到的CD8阳性T细胞的强烈刺激并不伴随着已经与其他4-1BB激动剂的施用相关的肝毒性。尽管不希望受到理论的束缚，但据信RBC-41BBL+IL-15/IL-15RA被隔离在血管中，这与4-1BB激动剂抗体不同，所述4-1BB激动剂抗体被认为通过从血液扩散到骨髓而引起肝毒性，在骨髓中它们活化并扩充髓样细胞，其继而运输到肝以成为库普弗细胞(Kupfer cell)并活化CD8细胞。本文呈现的数据提示，RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA不刺激骨髓衍生的单核细胞，这与活化发生在骨髓中的假设相一致，所述骨髓具有有限的对RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA的暴露。因此，本文提供的呈现4-1BBL的RBC提供了比其他4-1BB激动剂显著的治疗优势。
例如，在实施例15中，以与在小鼠中产生肝毒性的剂量相等的剂量水平施用4-1BB激动剂单克隆抗体后实现的肿瘤负荷减少与用鼠RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA所实现的肿瘤负荷减少没有显著差异。类似地，在实施例19中，以与在小鼠中产生肝毒性的剂量相等的剂量水平施用4-1BB激动剂单克隆抗体后实现的抗肿瘤活性与用鼠RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA实现的肿瘤负荷减少没有显著差异。由于鼠RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA在小鼠中不产生肝毒性，因此该观察结果支持RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA可在癌症患者中相对于激动性4-1BB抗体具有改善的治疗指数或改善的风险收益。
除上述分析外，病理学家还评估了肝H&E染色切片并指定炎症评分。这些结果揭示3H3组的肝病理学显著增加，如通过炎症评分增加可看到(图18E)。重要的是，与mRBC-CTRL或PBS对照组相比，RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA组没有显示炎症或毒性增加的体征。对于3H3组，病理学报告描述了明显的血管周浸润，其本质上似乎主要是淋巴细胞。
呈现的数据总共显示了，RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA是耐受良好的，并且不引起任何安全担忧。尽管使用41BBL和IL-15TP，但缺乏毒性的机制可以是限于循环的RBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA的生物分布，因此细胞不能与骨髓中的髓样细胞相互作用(提示启动肝毒性级联反应的过程)，并且相对于其他4-1BB激动剂提供明显的治疗优势。
实施例21.遗传工程化改造以表达IL-12的红系细胞的产生。
IL-12构建体
制备DNA构建体以在红系细胞中表达，如下表13所示：
表13.IL-12构建体和多肽。SEQ ID NO.指氨基酸序列。
Figure BDA0002760528960002211
慢病毒载体的产生
构建IL-12基因构建体(如表13中显示的V1或V2)。将基因克隆到来自SystemBiosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有IL-12基因的pCDH慢病毒载体转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
红系细胞的扩充和分化
从来自正常人供体的动员的外周血细胞衍生的人CD34+细胞是从AllCells Inc.以冷冻方式购买的。扩充/分化程序包括3个阶段。在第一阶段中，将解冻的CD34+红系前体在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人重组人干细胞因子和重组人白介素3的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第二阶段中，将红系细胞在补充有重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组促红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove的MDM培养基中进行培养。在第三阶段中，在补充有人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove的MDM培养基中培养红系细胞。将培养物在5％CO2培养箱中在37℃维持。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种实现感染，在室温下以2000rpm旋转平板90分钟。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用经PE标记的抗IL-12抗体(例如纯化的抗人IL-12-p70(克隆20C2)的结合来验证工程化红系细胞中IL-12的表达。通过针对PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门。
实施例22.经遗传工程化改造以表达IL-12和4-1BBL的红系细胞的产生。
慢病毒载体的产生
构建IL-12(如表13中显示的V1或V2)和4-1BBL基因。将基因克隆到来自SystemBiosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得1个载体包含IL-12的基因，并且一个载体包含4-1BBL的基因。通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有IL-12基因的pCDH慢病毒载体和含有4-1BBL基因的pCDH慢病毒载体共转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
应当理解，或者，可以构建IL-12和4-1BBL基因，并克隆到来自SystemBiosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得单个载体包含IL-12的基因和4-1BBL的基因。在该情况下，通过用pPACKH1(System Biosciences)和含有IL-12基因和4-1BBL基因两者的pCDH慢病毒载体共转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
红系细胞的扩充和分化
如实施例21所述，扩充和分化源自来自正常人供体的动员外周血细胞的人CD34+细胞。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种实现感染，在室温下以2000rpm旋转平板90分钟。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用经PE标记的抗IL-12抗体(例如抗IL-2抗体(IL-12-p70(克隆20C2)的结合来验证工程化红系细胞中的IL-12表达。使用经PE标记的抗4-1BBL抗体(例如纯化的抗人4-1BBL配体(CD137L)抗体，BioLegend)的结合来验证工程化红系细胞中4-1BBL的表达。通过针对PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门。
如图30A所示，单独或与4-1BBL组合，观察到IL-12 V2(与SMIM1连接的IL-12)相对于IL-12 V1(与GPA连接的IL-12)在细胞表面处表现出明显更大的IL-12。当SMIM1用作膜域时，细胞表面上IL-12的此种增加的水平提供了意想不到的优势，即红系细胞表面上4-1BBL的拷贝数增加，因此，也预期增强的活性(图30B)。
实施例23.经遗传工程化改造以表达IL-15/IL-15-RA融合蛋白和IL-12的红系细胞的产生。
慢病毒载体的产生
构建IL-15/IL-15-RA (V4.1)融合蛋白和IL-12基因。将基因克隆到来自SystemBiosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得1个载体包含IL-15/IL-15RA的基因，并且一个载体包含IL-12的基因。通过用pPACKH1(SystemBiosciences)和含有IL-15/IL-15-RA基因的pCDH慢病毒载体和含有IL-12基因的pCDH慢病毒载体共转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
应当理解，或者，可以构建IL-15/IL-15-RA融合蛋白和IL-12基因，并克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中，使得单个载体包含IL-15/IL-15RA的基因和IL-12的基因。在该情况下，通过用pPACKH1(SystemBiosciences)和含有IL-15/IL-15-RA基因和IL-12基因两者的pCDH慢病毒载体共转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。将细胞置于新鲜的培养基中。培养基更换后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟来收集病毒上清液。收集上清液，过滤，并在等分试样中于-80℃冷冻。
红系细胞的扩充和分化
如实施例21所述，扩充和分化源自来自正常人供体的动员外周血细胞的人CD34+细胞。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种实现感染，在室温下以2000rpm旋转平板90分钟。旋转接种后，将细胞在37℃下温育过夜。
抗体结合
使用经PE标记的抗IL-15-RA抗体(例如抗IL-15RA抗体(JM7A4)(ab91270),AbCam)的结合来验证工程化红系细胞中IL-15/IL-15-RA的表达。使用经PE标记的抗IL-12抗体(例如纯化的抗人IL-12抗体(IL-12-p70(克隆20C2))的结合来验证工程化红系细胞中IL-12的表达。通过针对PE荧光的流式细胞术测量抗体的结合。基于染色的未转导的细胞设置门。
实施例24.包含IL-12和IL-15/IL-15RA的组合的工程化红系细胞引起IFNγ应答和CD4、CD8、NK和NKT细胞的增殖的协同诱导。
分别如实施例21、1和23中所述制备包含IL-12、IL-15/IL-15RA (V4.1)和IL-12+IL-15/IL-15RA(V4.1)的红系细胞。
测量原代CD4+、CD8+、NK和NKT细胞的增殖和活化。用CTFR标记来自3个供体的100,000个PBMC，并与包含IL-12(“RBC-IL-12”)、IL-15/IL-15RA(“RBC-IL-15/IL-15RA”)和IL-12+IL-15/IL-15RA (“RBC-IL-12+IL-15/IL-15RA”)的工程化红系细胞，对照RBC(“RBC-CTRL”)和培养基对照(“培养基CTRL”)一起温育。红细胞以400,000、200,000或100,000个细胞存在。在第8天，使用CTFR稀释液评估活跃分裂的CD8、CD4、NK和NKT的百分比。收集上清液，并使用ELISA评估IFNγ的量。如图19A-E所示，RBC-IL-12+IL-15/IL-15RA刺激原代CD4+、CD8+、NK和NKT细胞有效增殖并被活化，如通过由活化细胞释放的IFNγ细胞因子的产生所测量。RBC-IL-12和RBC-IL-15/IL-15RA刺激这些细胞的某种可测量的增殖和活化。然而，RBC-IL-12+IL-15/IL-15RA表现出显著更大的，并且在某些情况下协同的CD8+、CD4+、NK和NKT细胞增殖刺激以及IFNγ的产生的显著增加。本实施例中给出的结果共同显示在RBC表面上的RBC-IL-12+IL-15/IL-15RA的表达驱动原代CD4+、CD8+、NK和NKT细胞的高度协同且有效的活化。
实施例25.包含IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL及其组合的红系细胞在体内减少肺转移。
用于黑素瘤的B16F10转移性小鼠模型系统(参见例如Kubo et al.(2017))用于测试单独或组合在细胞表面上呈现鼠IL-12、人IL-15/IL-15RA融合蛋白和鼠4-1BBL的鼠红系细胞对转移性生长的影响。在该模型中，将肿瘤细胞静脉内注射以在肺中建立转移，然后用制备为呈现单独的IL-12、IL-15/IL-15RA或4-1BBL，或者呈现以下组合：IL-12和IL-15/IL-15RA (IL-12/IL-15RBC),IL-12和4-1BBL(IL-12/4-1BBL RBC)，以及IL-15/IL-15RA和4-1BBL(IL-15/4-1BBL RBC)的鼠红系细胞处理小鼠。
使用点击方法将鼠红系细胞与IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL缀合，或与IL-12和IL-15/IL-15RA、IL-12和4-1BBL以及IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者共缀合。通过针对Cy5荧光的流式细胞术量化这些细胞(图20A)。本文的表10中提供了IL-15/IL-15RA融合蛋白、鼠4-1BBL蛋白和鼠Il-12蛋白的氨基酸序列。
最初，对7周龄的雌性C57BL/6小鼠静脉内接种1×105个B16F10细胞/小鼠。然后，对动物静脉内(IV)给药以下项：呈现IL-12的红系细胞；呈现IL-15/IL-15RA的红系细胞；呈现4-1BBL的红系细胞；呈现IL-12和IL-15/IL-15RA两者的红系细胞；呈现IL-12和4-1BBL的红系细胞；呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL的红系细胞；腹膜内(IP)施用的重组IL-12(rIL-12)；腹膜内(IP)施用的重组IL-15/IL-15RA融合蛋白；腹膜内(IP)施用的小鼠4-1BB激动剂抗体(3H3)；或没有IL-12、IL-15/IL-15RA或4-1BBL的红系细胞(mRBC-CTRL)作为对照。为了对动物给药，以单独的IL-12的每个细胞的30,000个分子的平均值(对应于每剂0.14mg/kgIL-12)，单独的4-1BBL的每个细胞的120,000个分子的平均值(对应于每剂0.22mg/kg 4-1BBL)和单独的IL-15/IL-15RA的每个细胞的60,000个分子的平均值(对应于每剂0.1mg/kgIL-15/IL-15RA)；或者对于包含IL-12和IL-15/IL-15RA的红系细胞，20,000个IL-12分子和20,000个IL-15-RA分子(分别对应于0.1mg/kg和0.03mg/kg)；对于包含IL-12和4-1BBL的红系细胞，20,000个IL-12分子和40,000个4-1BBL分子(对应于0.1mg/kg这两者)；或者对于包含4-1BBL和IL-15/IL-15RA的红系细胞，60,000个4-1BBL分子和40,000个IL-15/IL-15RA分子(分别对应于0.11mg/kg和0.07mg/kg)，每剂施用1e9个红系细胞的平均值。以2.5mg/kg给药激动性41BB抗体(3H3)。在接种后的第1天、第4天和第8天对动物给药红系细胞。
每天记录动物的体重和状况。对于每只小鼠相对于第1天记录的体重计算体重变化。接种后第14天，处死动物并收集肺。使用立体镜评估肺转移的数量。另外，将肺组织加工成单细胞悬浮液，并且针对Ki67和粒酶B染色，并且使用流式细胞术检查。
如在图20B中所示，作为单一疗法i.v.施用的制备为在其表面上呈现IL-12和IL-15/IL-15RA，或IL-12和4-1BBL，或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的组合的鼠红系细胞与mRBCCTRL相比显著降低小鼠的肿瘤负荷，并且与个别呈递分子的红系细胞，即mRBC IL-12、mRBCIL-15/IL-15RA和mRBC 4-1BBL相比，显示出更大的功效。该数据显示可以通过施用在细胞表面上包含这些蛋白质组合的红系细胞来实现治疗益处。用IL-12和4-1BBL组合实现的肿瘤负荷减少显著好于单独用IL-12或4-1BBL实现的，并且用4-1BBL和IL-15/IL-15RA的组合实现的肿瘤负荷减少显著好于单独用4-1BBL或IL-15/IL-15RA实现的。
此外，如图20C所示，肺转移数量的减少与肺中增殖的细胞毒性CD8+T细胞和NK细胞浸润的增加有关(p＝0.0002)。
实施例26.包含IL-12的红系细胞在体内减缓肿瘤生长。
用于结肠癌的MC38同基因小鼠模型系统以及用于黑素瘤的B16F10肿瘤模型用于测试细胞表面上呈现鼠IL-12的鼠红系细胞对肿瘤生长(例如实体瘤生长)的影响。
使用点击方法将鼠红系细胞与人IL-15/IL-15RA和鼠4-1BBL，鼠IL-12和鼠4-1BBL或鼠IL-12和人IL-15/IL-15RA共缀合。在本文表10中提供IL-15/IL-15RA融合蛋白、鼠4-1BBL蛋白和鼠II-12蛋白的氨基酸序列。
当肿瘤达到约100mm3的体积(约7-10天)时，给动物给药呈现IL-15/IL-15RA和4-1BBL(mRBC IL-15/IL-15RA+4-1BBL)，IL-12和4-1BBL(mRBC IL-12+4-1BBL)，IL-12和IL-15/IL-15RA(mRBC IL-12+IL-15/IL-15RA)的红系细胞；没有这些蛋白质的红系细胞(mRBCCTRL)；或4-1BB激动剂单克隆抗体3H3，作为对照。在第1、4和8天进行给药(指示的治疗日从观察到期望肿瘤体积的日期开始)。为了对动物给药，每只小鼠每剂如下以每个细胞的平均分子数每剂施用1e9个RBC的平均值：对于包含IL-12和IL-15/IL-15RA的红系细胞，20,000个IL-12分子和20,000个IL-15-RA分子，分别各对应于0.1mg/kg和0.03mg/kg；对于包含IL-12和4-1BBL的红系细胞，30,000个IL-12分子和80,000个4-1BBL分子，分别对应于0.14mg/kg和0.15mg/kg；和对于包含4-1BBL和IL-15/IL-15RA的红系细胞，80,000个4-1BBL分子和50,000个IL-15/IL-15RA分子，分别对应于0.15mg/kg 4-BBL和0.09mg/kg。
每天记录动物的体重和状况。相对于第1天记录的体重，计算每只小鼠的体重变化。通过在2个维度中测量每个肿瘤，每周测量3次肿瘤。使用标准公式：(L x W2)/2计算肿瘤体积。计算每组在每个时间点的平均肿瘤重量和平均值的标准误。
与未处理的对照相比，通过评估肿瘤体积和/或肿瘤重量随时间的变化来确定所制备的包含IL-12的红系细胞(即，呈现IL-12和4-1BBL或IL-12和IL-15/IL-15RA组合的红系细胞)的抗肿瘤活性。如图21A和21B显示的结果证明，与未处理的对照相比，制备的包含IL-12的红系细胞随时间显著降低肿瘤进展。此外，在MC38小鼠模型系统中，相对于3H3，所制备的包含IL-12和4-1BBL的红系细胞显著降低肿瘤体积的进展。
实施例27.包含IL-12的鼠红系细胞在体内缺乏毒性。
用于黑素瘤的B16F10转移性小鼠模型系统(Kubo et al.,2017；其全部内容通过引用并入本文)用于评估鼠RBC-IL-12+IL-15/IL-15RA和RBC-IL-12+4-1BBL的毒性缺乏或可耐受性。在评估肝毒性的该实验中，各种RBC、小鼠模型和RBC给药日程表如实施例25中所述。
如实施例25所述，向6至12周龄的雌性C57BL/6小鼠静脉内接种B16F10黑素瘤细胞以在肺中建立转移，然后给小鼠给药以下项：呈现IL-12和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞(mRBC IL12+L-15/IL-15RA)(1E9个细胞)，呈现IL-12和4-1BBL的鼠红系细胞(mRBC IL-12+4-1BBL)(1E9个细胞)，没有IL-12,IL-15/IL-15RA和4-1BBL的鼠红系细胞(mRBC CTRL)(1E9个细胞)或3μg rIL-12，作为对照。
每天记录动物体重和状况。在第1、4和8天进行给药，并在第10天进行最后的处死。收集肝、脾脏和血清，并对血清中丙氨酸转氨酶(ALT)肝酶和干扰素gamma(IFNg)的水平进行定量。
如图22所示，与重组IL12相比，观察到与IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-12和4-1BBL共缀合的鼠红系细胞的有利的可耐受性。施用制备的鼠红系细胞后，脾脏和肝的重量以及ALT和IFNg的水平并未显著升高。相反，施用rIL-12后，脾脏和肝的重量以及ALT和IFNg的水平显著升高。与实施例25和26的结果一起考虑，数据指示包含IL-12的鼠红系细胞有效减少实体瘤的生长和转移，而没有施用rIL-12时观察到的毒性。
尽管不希望受到理论的束缚，但推测包括IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-12和4-1BBL的红系细胞缺乏毒性是由于血管中隔离细胞，即局限于循环。这种限制使细胞无法与骨髓中的髓样细胞相互作用，这一过程已被提示引发肝毒性级联。本文呈现的数据提示呈现IL-12的红系细胞不刺激骨髓衍生的单核细胞，因此相对于rIL-12，该细胞提供明显的治疗优势。
实施例28.单独或与抗PD1抗体组合的包含IL-12或IL-12/IL-15的红系细胞在体内抑制肿瘤生长。
用于黑素瘤的B16F10肿瘤模型系统用于测试包含单独或与人IL-15/IL-15RA组合的鼠IL-12的鼠红系细胞对肿瘤生长的影响。在该模型中，将B16F10细胞皮下注射到小鼠中，以在约7天之内形成可触知的肿瘤，并在没有抗PD1抗体的情况下或与抗PD1抗体组合的情况下用鼠红系细胞处理，所述鼠红系细胞制备为呈现IL-12，IL-15/IL-15RA或IL-12和IL-15/IL-15RA融合物(IL-12/IL-15/IL-15RA)。皮下注射后，B16F10细胞在5至10天内形成可触知的肿瘤，并在14至21天内长成1×1×1cm的肿瘤。
使用点击方法将鼠红系细胞与单独的人IL-15/IL-15RA，单独的鼠IL-12缀合或与人IL-15/IL-15RA和鼠IL-12两者共缀合。使用流式细胞术定量与细胞缀合的IL-15/IL-15RA和IL-12的量。在本文表10中提供IL-15/IL-15RA融合蛋白，鼠4-1BBL蛋白和鼠II-12蛋白的氨基酸序列。
当肿瘤达到约100mm3的体积(约7-10天)时，给动物给药呈现单独的IL-12(mRBCIL-12)，单独的IL-15/IL-15RA融合物(mRBC IL-15)，和IL-12和IL-15/IL-15RA两者(mRBCIL-12+IL-15/IL-15RA)的红系细胞，在具有或没有抗PD1单克隆抗体(αPD-1mAb)的情况下；或给药没有这些蛋白质的红系细胞(mRBC CTRL)，给药4μg重组IL-12，5μg重组IL-15/IL-15RA融合物，和给药重组IL-12和重组IL-15/IL-15RA融合物两者，作为对照。在第1、4和8天进行给药(指示的治疗日从观察到期望肿瘤体积的日期开始)。为了对动物给药，每只小鼠每剂如下每个细胞包含分子平均数的每剂施用3e8或1e9个红系细胞的平均值：对于包含IL-12和IL-15/IL-15RA的红系细胞，70,000个IL-12分子和80,000个IL-15/IL-15-RA分子，分别对应于0.3mg/kg和0.15mg/kg；对于包含IL-12的红系细胞，35,000个IL-12分子，对应于0.17mg/kg；和对于包含IL-15/IL-15RA的红系细胞，40,000个IL-15/IL-15RA分子，对应于0.07mg/kg。
每天记录动物的体重和状况。相对于第1天记录的体重，计算每只小鼠的体重变化。通过在2个维度中测量每个肿瘤，每周测量3次肿瘤。使用标准公式：(L x W2)/2计算肿瘤体积。计算每组在每个时间点的平均肿瘤重量和平均值的标准误。在第11-12天收集肿瘤，并使用组织解离器酶消化组织以获得均质的细胞悬浮液。然后将细胞染色，并使用一系列不同的抗体通过流式细胞术分析，以进行免疫概况分析。M1细胞(活化的巨噬细胞)定义为CD45+，CD8-，CD11b+，Ly6C低/-和MHC II类+的活细胞群体。M2细胞定义为Ly6C+，MHC II类阴性的活细胞群体。M1细胞是抗肿瘤细胞，并且M2细胞(免疫抑制)是促肿瘤细胞。在治疗后长达30天也监测小鼠的存活。
通过评估肿瘤体积和/或肿瘤重量随时间的变化测定与未处理的对照相比制备的包含IL-12的红系细胞(即呈现IL-12或IL-12和IL-15/IL-15RA的组合的红系细胞)的抗肿瘤活性。如图23A-C中显示的结果证明，与未处理的对照相比，所制备的包含IL-12的红系细胞随时间显著降低肿瘤进展。制备的包含单独的IL-12或包含IL-12与IL-15的红系细胞显著降低肿瘤体积的进展，这在与α-PD1联合时得到进一步改善。观察到用1e9个细胞的处理比用3e8个细胞的处理对肿瘤抑制更有效。此外，图23D-E证明，与未处理的对照相比，与a-PD1组合的包含单独的IL-12或包含IL-12与IL-15的制备的红系细胞表现出改善的小鼠存活，直至处理后30天。与接受对照mRBC的小鼠相比，在缺乏a-PD1处理的情况下，观察到改善的存活。令人感兴趣的是，用包含IL-12与IL-15的红系细胞处理可以在3e8个细胞剂量时显著改善小鼠的存活。与在rIL-12和r-IL-12+rIL-15处理组中观察到的体重急剧下降相反，用mRBC处理的任何组均未观察到体重变化(数据未显示)。
此外，图23F证明了在用IL-12/IL-15+a-PD1组处理的肿瘤中CD8 T细胞的浸润增加，以及在IL-15/IL-15RA mRBC组中NK细胞的浸润增加。还观察到含有IL-12的组使巨噬细胞朝着M1表型极化，即经典活化的巨噬细胞的抗肿瘤表型。与rIL-12相反，含IL-12的组不诱导高水平的免疫抑制性IL-10(数据未显示)。
实施例29.单独的或与抗PD1抗体组合的包含IL-12或IL-12/4-1BBL或IL-12/IL-15/IL-15RA的红系细胞在体内抑制肿瘤生长。
用于结肠癌的MC38同基因小鼠模型系统用于测试单独或与抗PD1抗体组合的制备为呈现IL-12或IL-12/4-1BBL的鼠红系细胞对肿瘤生长的影响。
使用点击方法将鼠红系细胞与鼠4-1BBL，IL-12缀合，或与4-1BBL和IL-12两者共缀合。使用流式细胞术定量与细胞缀合的4-1BBL和IL-12的量。在本文表10中提供IL-15/IL-15RA融合蛋白，鼠4-1BBL蛋白和鼠II-12蛋白的氨基酸序列。
当肿瘤达到约100mm3的体积(约7-10天)时，给动物给药呈现单独的IL-12(mRBCIL-12)，单独的4-1BBL(mRBC 4-1BBL)或IL-12和4-1BBL两者(mRBC IL-12+4-1BBL)的红系细胞，在具有或没有抗PD1单克隆抗体(αPD-1mAb)的情况下；或给药没有这些蛋白质的红系细胞(mRBC CTRL)，或给药4μg重组IL-12、50μg激动剂41BB抗体(克隆3H3)，或给药重组IL-12和41BB激动剂抗体(3H3)两者，作为对照。在第1、4和8天进行给药(指示的治疗日从观察到期望肿瘤体积的日期开始)。为了对动物给药，每只小鼠每剂如下以每个细胞的平均分子数，每剂施用3e8或1e9个红系细胞的平均值：对于包含IL-12和4-1BBL的红系细胞，100,000个IL-12分子和180,000个4-1BBL分子，分别对应于0.5mg/kg和0.3mg/kg；对于包含IL-12的红系细胞，70,000个IL-12分子，对应于0.3mg/kg；和对于包含4-1BBL的红系细胞，70,000个4-1BBL分子，对应于0.13mg/kg。
每天记录动物的体重和状况。相对于第1天记录的体重，计算每只小鼠的体重变化。通过在2个维度中测量每个肿瘤，每周测量3次肿瘤。使用标准公式：(L x W2)/2计算肿瘤体积。计算各组在每个时间点的平均肿瘤重量和平均值的标准误。在第11-12天收集肿瘤，并使用组织解离器酶消化组织以获得均质的细胞悬浮液。然后将细胞染色，并使用一系列不同的抗体通过流式细胞术进行分析，以查看免疫概况分析。M1和M2细胞如上面的实施例28中所述进行定义。通过计算肿瘤大小相对于起始点的肿瘤大小的百分比变化来确定肿瘤消退。
通过评估肿瘤体积和/或肿瘤重量随时间的变化测定包含IL-12的制备的红系细胞(即呈现单独的IL-12或呈现IL-12和4-1BBL组合的红系细胞)与未治疗对照组相比的抗肿瘤活性。如图24A-D所示的结果证明与未处理的对照相比，包含IL-12的红系细胞随时间显著降低肿瘤进展。此外，制备的包含IL-12和4-1BBL的红系细胞显著降低肿瘤体积的进展。图24D进一步证明，与未处理的对照相比，用包含单独的IL-12或包含IL-12和4-1BBL两者的红系细胞处理的小鼠表现出肿瘤缩小。当小鼠也用αPD-1mAb处理时，肿瘤大小的减小加剧。总体上，制备的包含IL-12和4-1BBL两者的红系细胞有效抑制该结肠癌小鼠模型中的肿瘤，这当与αPD-1mAb联合施用时进一步加剧。
此外，图25A的结果证明不同免疫细胞浸润到肿瘤中。在用mRBC-IL12和αPD-1m Ab或用IL12和4-1BBL a-PD1处理的小鼠的肿瘤中观察到CD4+T细胞的浸润。在用所有IL-12组(即IL-12或IL-12/4-1BBL或IL-12/IL-15/IL-15RA)处理的小鼠的肿瘤中观察到CD8+细胞的浸润，在mRBC IL-12+4-1BBL和αPD-1mAb中观察到浸润增加。在用mRBC IL-12+4-1BBL处理的小鼠和用mRBC-IL-12处理的小鼠中观察到经典活化的巨噬细胞(M1表型)的极化。值得注意的是，施用αPD-1mAb减弱该M1极化。图25B进一步证明了相对于CD4+T细胞转向更多的CD8+T细胞，以及相对于效应CD8+T细胞在所有用IL-12处理的小鼠组中调节性T细胞的损失。观察到用mRBC处理的小鼠的存活与肿瘤抑制的有效性直接关联，直至处理后20天(数据未显示)。
在本实施例中使用如上所述的方法进行另外的实验，以测定单独或与抗PD1抗体组合的包含单独的IL-12，或包含IL-12和IL-15/IL-15RA两者的红系细胞在体内对肿瘤生长的影响。结果证明了，与缺乏缀合蛋白的对照红系细胞(即，mRBC CTRL)的施用相比，包含IL-12的红系细胞的施用随时间显著降低肿瘤进展。此外，制备的包含IL-12和IL-15/IL-15RA的红系细胞显著降低肿瘤体积的进展。结果进一步证明，与未处理的对照相比，制备的包含单独的IL-12或包含IL-12和IL-15/IL-15RA的红系细胞表现出肿瘤缩小(当用抗-PD1抗体处理小鼠时进一步增加的效应)。总体而言，所制备的包含IL-12和IL-15/IL-15RA的红系细胞表现出有效的肿瘤抑制，其当与αPD-1mAb组合施用时进一步改善(数据未显示)。
实施例30.包含IL-12+IL-15/IL-15RA或IL-12+4-1BBL的鼠红系细胞在体内缺乏毒性。
使用小鼠毒性模型评估与IL-12和IL-15/IL-15RA(mRBC-IL-12+IL-15/IL-15RA)或IL12和3-1BBL(mRBC-IL-12+4-1BBL)缀合的鼠红系细胞的毒性缺乏或可耐受性。在评估毒性的该实验中，各种mRBC和mRBC的给药日程表如实施例20中所述。一般如实施例20中所述进行毒性的评估。
通常，如实施例20中所述，给6至12周龄的雌性C57BL/6小鼠给药以下项：呈现IL-12和IL-15/IL-15RA的鼠红系细胞(mRBC IL12+L-15/IL-15RA)(1E9、3e8和1e8个细胞)，呈现IL-12和4-1BBL的鼠红系细胞(mRBC IL-12+4-1BBL)(1E9、3e8和1e8个细胞)；或给药没有IL-12，IL-15/IL-15RA或4-1BBL的鼠红系细胞(mRBC CTRL)(1E9、3e8和1e8个细胞)，给药重组IL-12(rIL-12)，重组IL-15)(rIL-15)，激动剂4-1BB抗体(3H3)或rIL-12和3H3的组合，作为对照。
每天记录动物体重和状况。在第1、4、8和11天进行给药，并在第18天进行最后的处死。收集肝、脾脏、血液和血清。在血清中定量丙氨酸转氨酶(ALT)肝酶的水平。使用细胞因子珠测定法(CBA)对血清中的细胞因子干扰素gamma(IFNg)，TNFa，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13的水平进行定量。将珠与分析物特异性抗体(包括IFNg，TNFa，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13)缀合，并与血清一起温育。添加检测抗体，并定量荧光并通过流式细胞术分析。还进行了完全细胞计数。
如图26A-26C所示，与对照相比，对与IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-12和4-1BBL共缀合的鼠红系细胞观察到有利的可耐受性。在任何测试的mRBC组合中，体重、脾脏或肝的重量均未观察到变化。然而，在接受rIL-12的所有组中均观察到体重减轻。类似地，在rIL-12处理组中观察到脾脏和肝的重量急剧增加。图26D证明了用rIL-12处理的小鼠表现出贫血伴有低水平的血红蛋白，以淋巴细胞减少，嗜中性白血球减少症和嗜曙红细胞损失为特征的白细胞(WBC)计数损失。相反，在接受mRBC处理的组中，未观察到细胞计数的重大变化。此外，相对于施用包含IL-12的mRBC的小鼠(数据未显示)相比，rIL-12处理的小鼠表现出低水平的淋巴细胞和红细胞，以及高水平的ALT(如在第14天和第18天检测到的)。
此外，图27A中的结果证明接受与IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-12和4-1BBL两者共缀合的mRBC的小鼠在第3天和第10天时血清中的IFNg水平升高，这在每次给药后2天迅速降低。因此，mRBC处理诱导受控的IFNg应答，该应答能够撤消后处理。相反，早在第3天，用rIL-12处理的小鼠显示出明显更高的ALT和IFNg水平，其在整个研究过程中并未下降。在第18天观察到相似的ALT和IFNg水平(数据未显示)。如图27B所示，与IFNg水平相反，TNFa水平随着每次剂量而持续升高。然而，与用rIL-12处理的小鼠相比，用mRBC处理的小鼠具有更低的TNFa水平增加。此外，虽然在用mRBC处理的小鼠中未观察到对IL-10生成的重大影响，但在用rIL-12处理的动物的血清中检测到IL-10(数据未显示)。
进行了额外的实验，以检查并确认与单独的IL12缀合的鼠红系细胞的毒性缺乏。如在图26E-F中所示，与rIL-12相比，在用与IL-12缀合的鼠红系细胞处理的小鼠中观察到相似的有利的可耐受性。在用与IL-12缀合的红系细胞处理的任何小鼠中，均未观察到体重、脾脏或肝重量的变化。然而，在接受rIL-12的所有小鼠组中均观察到体重减轻。类似地，在用rIL-12处理的小鼠中观察到脾脏和肝重量的急剧增加。图26F进一步证明，相对于用与IL-12缀合的鼠红系细胞处理的小鼠，经rIL-12处理的小鼠表现出贫血伴有低水平的血红蛋白，WBC计数损失，低的淋巴细胞和红细胞水平，高的ALT水平(如在第14天和第18天检测到)和高的IFNg水平(如在第10天检测到)。
这些结果证明包含单独或与IL-15/IL-15RA或4-1BBL组合的IL-12的鼠红系细胞在减少实体瘤生长和转移方面有效，而没有与施用rIL-12，rIL-15或3H3有关的毒性。
实施例31.遗传上包含IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL或其组合的遗传工程化去核红系细胞诱导NK细胞的细胞毒性。
如先前在实施例17中所述进行用包含单独的IL-12、单独的IL-15/IL-15RA(V4.1)、单独的4-1BBL或IL-12和IL-15/IL-15RA(V4.1)、IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的组合的人去核红系细胞短期(过夜)引发人NK细胞。简而言之，将冷冻的NK供体细胞与去核红系细胞(RBC)以5:1的比例(100,000个NK细胞+500,000个RBC细胞，40,000个NK细胞+200,000个RBC细胞)温育过夜。次日，将20,000个经CTFR标记的K562靶细胞与NK和RBC细胞以5:1和2:1的E:T比例接触4小时。使用GPA PE，CD56 PE-Cy7，可固定活力染料(fixable viability dye)(AmCyan)，CellTrace Far Red(靶物)进行染色，并使用流式细胞术分析样品。使用GzmB，PacBlue和CD69 BV605以2:1E:T的比例进行其他表型分析。
如实施例18中所述进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定法。简而言之，以5:1和2:1的E:T比例使100,000或40,000个NK细胞与Raji靶细胞接触。将Raji细胞进行CTFR标记，并用抗CD20或同种型抗体预处理，并温育4小时。然后将细胞再针对CD16染色。
如图28A中所示的结果证明用包含单独的IL-12，单独的IL-15/IL-15RA或IL-12和IL-15/IL-15RA，IL-12和4-1BBL，或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的组合的人去核红系细胞过夜引发的NK细胞对K562靶细胞表现出增强的细胞毒性(约80％-90％的杀伤)，这与以5:1NK:靶物比例用rhIL-15引发的NK细胞(至少90％的杀伤)相当。因此，包含这些分子的去核红系细胞以每个细胞为基础增强NK细胞的细胞毒性，即，NK细胞不仅得到更好扩充，而且所得个别NK细胞群体更具活性(例如，更具细胞毒性)。
如图28B所示，与用包含单独的IL-12，单独的4-1BBL或无蛋白质的去核红系细胞引发过夜的NK细胞(对照)相比，用包含单独的IL-15/IL-15RA，或包含IL-12和IL-15/IL-15RA两者，或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者的去核红系细胞引发过夜的NK细胞证明增加的针对Raji细胞的细胞毒性。细胞毒性在5:1E:T比例时最为突出，并且与包含单独的4-1BBL或包含单独的IL-12的细胞相比，包含IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-15/IL-15RA和4-1BBL组合的去核红系细胞未表现出增强的细胞毒性。因此，ADCC的增强似乎是由IL-15/IL-15RA驱动的。因此，这些结果证明了包含单独的IL-15/IL-15RA或包含IL-12和IL-15/IL-15RA或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者的去核红系细胞增强Raji细胞靶物的以每个细胞为基础的NK细胞的ADCC活性。
实施例32.包含IL-12、IL-15/IL-15RA、4-1BBL或其组合的工程化人红系细胞在含有或不含抗CD3抗体刺激的情况下诱导IFNg应答以及CD4+和CD8+T细胞、NK和NKT细胞的增殖。
在含有或不含抗CD3抗体刺激的情况下评估包含单独的IL-12、单独的IL-15/IL-15RA(V4.1)，单独的4-1BBL或IL-12和IL-15/IL-15RA(V4.1)、IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者的人去核红系细胞对原代CD4+T细胞，CD8+T细胞，NK细胞和NKT细胞增殖和活化的影响。简而言之，用CTFR标记来自3个供体的100,000个PBMC，并与去核红系细胞一起温育，所述红系细胞包含单独的IL-12，单独的IL-15/IL-15RA，单独的4-1BBL或IL-12和IL-15/IL-15RA、IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的组合；或作为对照，将PBMC与缺乏外源蛋白的去核红系细胞(UNT)温育，或与培养基(培养基)接触。使用400,000、200,000或100,000个去核红系细胞。在第5天或第8天，使用CTFR稀释液评估活跃分裂的CD8+T细胞，CD4+T细胞，NK细胞和NKT细胞的百分比。收集上清液，并使用ELISA评估IFNγ的量。实验以0.5ug/mL与抗CD3处理组合以5天测定法进行，或在未进行抗CD3抗体处理的情况下以8天测定法进行。
如图29A所示，与抗CD3抗体刺激组合的用包含IL-12的去核红系细胞处理诱导PBMC产生大量的IFNg，而与抗CD3抗体刺激组合的用包含IL-12和4-1BBL两者的去核红系细胞处理诱导PBMC产生最高水平的IFNg。在没有抗CD3抗体刺激的情况下，仅包含IL-12的去核红系细胞诱导PBMC的IFNg产生(见图29B)。此外，在用抗CD3抗体刺激的PBMC中，用包含单独41BBL，IL-12和4-1BBL两者或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者的去核红系细胞处理诱导CD4+T细胞增殖(见图29C)。因此，CD4+T细胞增殖似乎是由4-1BBL驱动的。
图29D显示了用抗CD3抗体和包含IL-12和IL-15/IL-15RA，IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的去核红系细胞组合处理的PBMC表现出适度增强的CD8+T细胞增殖(细胞计数增加约5倍)。此CD8+T细胞倍数变化在在用包含IL-12和IL-15/IL-15RA的去核红系细胞处理的PBMC中比用其他去核红系细胞处理的PBMC中更可变。此外，用抗CD3抗体和包含IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的去核红系细胞处理的PBMC表现出明显的NKT细胞增殖，其可能也是由4-1BBL驱动的(参见图29E)。用包含IL-12和IL-15/IL-15RA的去核红系细胞处理PBMC诱导适度的NKT细胞增殖，其不超过用包含单独的IL-12的去核红系细胞处理PBMC时观察到的NKT细胞增殖。
如图29F所示，在未用抗CD3抗体刺激的PBMC中，仅包含IL-12和IL-15/IL-15RA两者的去核红系细胞诱导有限的CD4+T细胞增殖。此外，如图29G所示，在也未用抗CD3抗体刺激的PBMC中，包含IL-12和IL-15/IL-15RA，IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的去核红系细胞适度增强CD8+T细胞增殖(约10-20％分裂)。用包含IL-12和IL-15/IL-15RA两者的去核红系细胞处理PBMC增强NK细胞的分裂(约50-60％)，但不增加细胞计数，这指示NK细胞仅适度增殖(参见图29H)。但是，用包含IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的去核红系细胞处理PBMC诱导NK细胞大量增殖。最后，在未用抗CD3抗体刺激的PBMC中，包含IL-12和IL-15/IL-15RA，IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的去核红系细胞对NKT细胞诱导适度增殖作用。
在该实施例中呈现的结果共同证明，包含IL-12和IL-15/IL-15RA，IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL的去核红系细胞诱导原代CD4+T细胞，CD8+T细胞，NK细胞和NKT细胞的有效激活。当用抗CD3抗体刺激PBMC时，CD4+T细胞，CD8+T细胞和NKT细胞的活化进一步增强。
在其他实验中，使用Miltenyi微珠根据制造商的方案使用负选择从PBMC中分离人幼稚CD4+T细胞。将纯化的幼稚CD4+T细胞与去核红系细胞一起温育，该红系细胞包含单独的IL-12，单独的IL-15/IL-15RA，单独的4-1BBL或IL-12和IL-15/IL-15RA，IL-12和4-1BBL或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者；或作为对照，将CD4+T细胞与(UNT)接触，或与培养基(培养基)接触。还用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激CD4+T细胞，并且以1:5的比率(CD4+T细胞:工程化红系细胞)进行接触5天。使用ELISA分析培养基上清液中的IFNg水平。在图29J中以来自3个不同PBMC供体的平均值呈现的数据证明去核红系细胞能够诱导人幼稚CD4+T细胞的Th1分化，所述去核红系细胞包含单独的IL-12，单独的IL-15/IL-15RA，单独的4-1BBL或IL-12和IL-15/IL-15RA，IL-12和4-1BBL，或IL-15/IL-15RA和4-1BBL两者。
序列:
SEQ ID NO:1,IL-15/IL-15受体α融合物
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
SEQ ID NO:2,IL-15/IL-15受体αsushi域+13aa
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS
SEQ ID NO:3,未成熟的人IL-15
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
SEQ ID NO:4,未成熟的人IL-15
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
SEQ ID NO:5,未成熟的全长人IL-15受体α
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
SEQ ID NO:6,成熟的全长人IL-15受体α
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
SEQ ID NO:7,未成熟的细胞外人IL-15受体α
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
SEQ ID NO:8,成熟的细胞外人IL-15受体α
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
SEQ ID NO:9,人IL-15受体αsushi域
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
SEQ ID NO:10,人IL-15受体αsushi域+IL-15受体α的13额外氨基酸
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS
SEQ ID NO:11,G4S接头
GGGGS
SEQ ID NO:12,(G4S)3接头
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:13(编码SEQ ID NO:4,成熟的人IL-15)
AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGC
SEQ ID NO:14(编码SEQ ID NO:4,成熟的人IL-15)
AACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGT
SEQ ID NO:15(编码SEQ ID NO:8,成熟的细胞外人IL-15受体α)
ATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACT
SEQ ID NO:16(编码SEQ ID NO:10,人IL-15受体αsushi域+IL-15受体α的13个额外的氨基酸)
ATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCC
SEQ ID NO:17(编码SEQ ID NO:12,(G4S)3接头)
GGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCA
SEQ ID NO:18(编码SEQ ID NO:12,(G4S)3接头)
GGCGGGGGGGGAAGCGGTGGTGGAGGGAGCGGGGGTGGTGGATCC
SEQ ID NO:19(编码SEQ ID NO:1,IL-15/IL-15受体α融合物)
AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACT
SEQ ID NO:20(编码SEQ ID NO:2,IL-15/IL-15受体αsushi域+13aa)
AACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGTGGTGGAGGGAGCGGGGGTGGTGGATCCATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCC
SEQ ID NO:21,GPA信号肽:
MYGKIIFVLLLSEIVSISA
SEQ ID NO:22,编码GPA信号肽:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCA
SEQ ID NO:23,接头-HA-接头:
GGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGS
SEQ ID NO:24,编码接头-HA-接头:
GGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCC
SEQ ID NO:25,GPA:
LSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:26,编码GPA:
TTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:27,IL-15 V3:
MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:28,编码SEQ ID NO:27,IL-15 V3:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCA
AACTGGGTAAATGTGATTTCAGACCTGAAAAAAATCGAAGACCTTATTCAATCCATGCACATCGACGCGACACTTTATACTGAATCAGACGTACACCCGTCCTGTAAGGTTACTGCGATGAAGTGCTTTCTGTTGGAATTGCAAGTGATCTCCCTCGAATCAGGGGATGCATCCATTCATGATACCGTCGAGAATTTGATCATTCTGGCAAATAACTCCCTCAGTAGTAACGGGAATGTGACCGAGTCTGGGTGTAAGGAGTGCGAAGAGTTGGAGGAAAAGAATATCAAAGAATTCCTTCAGTCCTTTGTTCACATCGTGCAAATGTTTATTAATACATCTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:29,IL-15-V4:
MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:30,编码SEQ ID NO:29,IL-15-V4:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCA
AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:31,IL-15-V5:
MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGSGGYPYDVPDYAGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:32,编码SEQ ID NO:31,IL-15V5:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCA
AACTGGGTAAACGTCATAAGCGACCTCAAAAAGATCGAGGACCTTATACAGTCTATGCACATAGATGCGACACTTTACACGGAATCAGACGTGCACCCGTCCTGCAAAGTCACAGCCATGAAGTGCTTTCTTCTCGAACTGCAGGTAATTTCTCTCGAATCAGGTGACGCATCTATCCACGACACAGTTGAAAATCTTATTATCCTGGCTAATAACTCCCTTAGCTCAAACGGCAATGTCACCGAGAGTGGATGTAAAGAATGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATAAAGGAATTCTTGCAGAGTTTCGTTCATATTGTGCAAATGTTCATCAATACTAGTGGCGGGGGGGGAAGCGGTGGTGGAGGGAGCGGGGGTGGTGGATCCATCACCTGCCCGCCTCCCATGAGCGTGGAACACGCGGACATTTGGGTTAAGAGCTACAGTCTTTACAGCCGGGAGCGCTATATCTGCAACTCAGGGTTTAAGCGGAAAGCAGGGACATCAAGTTTGACAGAATGTGTGTTGAACAAGGCTACAAATGTTGCTCACTGGACCACGCCATCTTTGAAGTGTATCCGAGATCCCGCGCTTGTCCATCAGCGCCCAGCGCCTCCCTCCGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCTACCCCTATGACGTGCCCGACTATGCCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:33,IL-15接头(GPA和IL-15/IL-15RA之间):
GGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:34,编码IL-15接头(GPA和IL-15/IL-15RA之间):
GGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCC
SEQ ID NO:35,IL-15V3.1:
MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:36,编码SEQ ID NO:35,IL-15V3.1:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCA
AACTGGGTAAATGTGATTTCAGACCTGAAAAAAATCGAAGACCTTATTCAATCCATGCACATCGACGCGACACTTTATACTGAATCAGACGTACACCCGTCCTGTAAGGTTACTGCGATGAAGTGCTTTCTGTTGGAATTGCAAGTGATCTCCCTCGAATCAGGGGATGCATCCATTCATGATACCGTCGAGAATTTGATCATTCTGGCAAATAACTCCCTCAGTAGTAACGGGAATGTGACCGAGTCTGGGTGTAAGGAGTGCGAAGAGTTGGAGGAAAAGAATATCAAAGAATTCCTTCAGTCCTTTGTTCACATCGTGCAAATGTTTATTAATACATCTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:37,IL-15-V4.1:
MYGKIIFVLLLSEIVSISANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:38,编码SEQ ID NO:37,IL-15-V4.1:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCA
AACTGGGTGAACGTTATTAGTGACCTTAAAAAGATCGAAGATTTGATACAGTCAATGCACATAGACGCGACGCTTTATACAGAATCTGATGTACATCCTTCATGCAAGGTTACTGCTATGAAGTGTTTTCTTCTCGAACTCCAAGTAATAAGTCTTGAGAGCGGAGATGCGAGCATTCATGACACCGTTGAGAATCTTATTATATTGGCTAACAACTCTCTGTCCAGCAATGGTAATGTGACAGAAAGCGGGTGTAAGGAGTGCGAGGAACTCGAGGAGAAGAACATCAAAGAGTTCTTGCAGTCTTTCGTCCATATTGTCCAGATGTTCATAAATACTAGCGGGGGAGGTGGCTCTGGTGGAGGCGGGAGTGGCGGGGGCGGCTCAATCACATGCCCACCGCCCATGTCTGTTGAACACGCAGACATTTGGGTTAAAAGTTACTCACTTTACTCACGCGAGAGATATATATGCAACAGCGGCTTCAAGCGCAAAGCAGGCACTAGTAGTCTTACAGAGTGCGTGCTCAATAAAGCTACAAATGTAGCTCATTGGACTACTCCTAGTCTCAAATGCATTCGGGACCCCGCGCTTGTGCACCAGAGACCTGCGCCGCCGTCCACAGTGACGACAGCTGGTGTAACCCCCCAACCTGAATCCCTTAGTCCGTCTGGTAAAGAACCGGCGGCGTCTTCACCTTCCAGCAATAATACTGCGGCGACAACAGCCGCGATAGTTCCTGGATCCCAACTCATGCCGTCAAAGTCTCCTTCAACGGGAACGACAGAGATCTCTTCACATGAAAGTTCTCATGGAACACCGAGCCAAACTACGGCAAAGAACTGGGAACTGACTGCCTCAGCAAGCCACCAGCCGCCAGGGGTGTACCCGCAAGGGCACTCAGATACTACTGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:39,4-1BBL接头(GPA和4-1BBL之间):
GGSGGSGGGPEDEPGSGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:40,编码SEQ ID NO:39 4-1BBL接头(GPA和4-1BBL之间):
GGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCCCCGAGGACGAGCCCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCC
SEQ ID NO:41,细胞外4-1BBL:
ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
SEQ ID NO:42,编码SEQ ID NO:41细胞外4-1BBL:
GCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
SEQ ID NO:43,4-1BBL构建体:
MYGKIIFVLLLSEIVSISAACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGSGGGPEDEPGSGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:44,编码SEQ ID NO:43,4-1BBL构建体:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAAGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCCCCGAGGACGAGCCCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:45,IL-12 p40:
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
SEQ ID NO:46,编码SEQ ID NO:45IL-12 p40:
ATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCTGATGCCCCAGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCTGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGACGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGAGGAGAGGTGCTGAGCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCTACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATAGCGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGACCCTCAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGTCCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGATAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGACTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGAGCCTGCCAATCGAAGTGATGGTGGATGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCCGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACAGCCGGCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCCGACACCTGGAGCACACCTCACTCCTATTTCTCTCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACATCTGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCTATCAGCGTGCGGGCCCAGGATAGATACTATTCTAGCTCCTGGAGCGAGTGGGCCTCCGTGCCATGTTCT
SEQ ID NO:47,IL-12 p35:
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
SEQ ID NO:48,编码SEQ ID NO:47IL-12 p35:
CGGAATCTGCCAGTGGCAACCCCAGACCCCGGAATGTTCCCATGCCTGCACCACTCTCAGAACCTGCTGAGGGCCGTGAGCAATATGCTGCAGAAGGCCCGCCAGACACTGGAGTTTTACCCTTGTACCAGCGAGGAGATCGACCACGAGGACATCACAAAGGATAAGACCTCCACAGTGGAGGCCTGCCTGCCACTGGAGCTGACCAAGAACGAGAGCTGTCTGAACAGCCGGGAGACCAGCTTCATCACCAACGGCAGCTGCCTGGCCTCCAGAAAGACATCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTGTCTAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGAGGCAGATTTTCCTGGACCAGAATATGCTGGCCGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTTAATTCCGAGACAGTGCCTCAGAAGTCCTCTCTGGAGGAGCCAGATTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCCGGATCAGAGCCGTGACCATCGACCGCGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCC
SEQ ID NO:49,SMIM1:
MQPQESHVHYSRWEDGSRDGVSLGAVSSTEEASRCRRISQRLCTGKLGIAMKVLGGVALFWIIFILGYLTGYYVHKCK
SEQ ID NO:50,编码SMIM1:
ATGCAACCGCAAGAGAGTCACGTACATTATTCAAGATGGGAAGATGGAAGTCGGGACGGTGTGTCTCTCGGCGCTGTTAGTTCAACGGAGGAAGCGTCTCGCTGTCGCCGGATAAGTCAACGCCTTTGTACGGGAAAACTGGGTATAGCTATGAAGGTCCTCGGCGGGGTGGCGTTGTTTTGGATTATCTTTATACTTGGGTATCTGACCGGTTACTATGTTCACAAGTGTAAA
SEQ ID NO:51,IL-12接头(IL-12 p35和GPA之间):
GGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:52,编码IL-12接头(IL-12 p35和GPA之间):
GGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCC
SEQ ID NO:53,IL-12 V1构建体:
MYGKIIFVLLLSEIVSISAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGSGGSGGGGGSGGGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
SEQ ID NO:54,编码SEQ ID NO:53 IL-12 V1构建体:
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCTGATGCCCCAGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCTGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGACGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGAGGAGAGGTGCTGAGCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCTACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATAGCGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGACCCTCAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGTCCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGATAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGACTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGAGCCTGCCAATCGAAGTGATGGTGGATGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCCGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACAGCCGGCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCCGACACCTGGAGCACACCTCACTCCTATTTCTCTCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACATCTGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCTATCAGCGTGCGGGCCCAGGATAGATACTATTCTAGCTCCTGGAGCGAGTGGGCCTCCGTGCCATGTTCTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCCGGAATCTGCCAGTGGCAACCCCAGACCCCGGAATGTTCCCATGCCTGCACCACTCTCAGAACCTGCTGAGGGCCGTGAGCAATATGCTGCAGAAGGCCCGCCAGACACTGGAGTTTTACCCTTGTACCAGCGAGGAGATCGACCACGAGGACATCACAAAGGATAAGACCTCCACAGTGGAGGCCTGCCTGCCACTGGAGCTGACCAAGAACGAGAGCTGTCTGAACAGCCGGGAGACCAGCTTCATCACCAACGGCAGCTGCCTGGCCTCCAGAAAGACATCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTGTCTAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGAGGCAGATTTTCCTGGACCAGAATATGCTGGCCGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTTAATTCCGAGACAGTGCCTCAGAAGTCCTCTCTGGAGGAGCCAGATTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCCGGATCAGAGCCGTGACCATCGACCGCGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCCGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAA
SEQ ID NO:55,IL-12 V2构建体:
MQPQESHVHYSRWEDGSRDGVSLGAVSSTEEASRCRRISQRLCTGKLGIAMKVLGGVALFWIIFILGYLTGYYVHKCKGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
SEQ ID NO:56,编码SEQ ID NO:55 IL-12 V2构建体:
ATGCAACCGCAAGAGAGTCACGTACATTATTCAAGATGGGAAGATGGAAGTCGGGACGGTGTGTCTCTCGGCGCTGTTAGTTCAACGGAGGAAGCGTCTCGCTGTCGCCGGATAAGTCAACGCCTTTGTACGGGAAAACTGGGTATAGCTATGAAGGTCCTCGGCGGGGTGGCGTTGTTTTGGATTATCTTTATACTTGGGTATCTGACCGGTTACTATGTTCACAAGTGTAAAGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGTGGTTCAGGTGGAGGAGGTAGCATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCTGATGCCCCAGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCTGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGACGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGAGGAGAGGTGCTGAGCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCTACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATAGCGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGACCCTCAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGTCCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGATAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGACTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGAGCCTGCCAATCGAAGTGATGGTGGATGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCCGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACAGCCGGCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCCGACACCTGGAGCACACCTCACTCCTATTTCTCTCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACATCTGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCTATCAGCGTGCGGGCCCAGGATAGATACTATTCTAGCTCCTGGAGCGAGTGGGCCTCCGTGCCATGTTCTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCCGGAATCTGCCAGTGGCAACCCCAGACCCCGGAATGTTCCCATGCCTGCACCACTCTCAGAACCTGCTGAGGGCCGTGAGCAATATGCTGCAGAAGGCCCGCCAGACACTGGAGTTTTACCCTTGTACCAGCGAGGAGATCGACCACGAGGACATCACAAAGGATAAGACCTCCACAGTGGAGGCCTGCCTGCCACTGGAGCTGACCAAGAACGAGAGCTGTCTGAACAGCCGGGAGACCAGCTTCATCACCAACGGCAGCTGCCTGGCCTCCAGAAAGACATCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTGTCTAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGAGGCAGATTTTCCTGGACCAGAATATGCTGGCCGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTTAATTCCGAGACAGTGCCTCAGAAGTCCTCTCTGGAGGAGCCAGATTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCCGGATCAGAGCCGTGACCATCGACCGCGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCC
SEQ ID NO:57,IL-12 p40/IL-12 p35融合物:
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
SEQ ID NO:58,编码SEQ ID NO:57,IL-12 p40/IL-12 p35融合物:
ATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCTGATGCCCCAGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCTGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGACGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGAGGAGAGGTGCTGAGCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCTACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATAGCGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGACCCTCAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGTCCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGATAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGACTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGAGCCTGCCAATCGAAGTGATGGTGGATGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCCGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACAGCCGGCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCCGACACCTGGAGCACACCTCACTCCTATTTCTCTCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACATCTGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCTATCAGCGTGCGGGCCCAGGATAGATACTATTCTAGCTCCTGGAGCGAGTGGGCCTCCGTGCCATGTTCTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCCGGAATCTGCCAGTGGCAACCCCAGACCCCGGAATGTTCCCATGCCTGCACCACTCTCAGAACCTGCTGAGGGCCGTGAGCAATATGCTGCAGAAGGCCCGCCAGACACTGGAGTTTTACCCTTGTACCAGCGAGGAGATCGACCACGAGGACATCACAAAGGATAAGACCTCCACAGTGGAGGCCTGCCTGCCACTGGAGCTGACCAAGAACGAGAGCTGTCTGAACAGCCGGGAGACCAGCTTCATCACCAACGGCAGCTGCCTGGCCTCCAGAAAGACATCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTGTCTAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGAGGCAGATTTTCCTGGACCAGAATATGCTGGCCGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTTAATTCCGAGACAGTGCCTCAGAAGTCCTCTCTGGAGGAGCCAGATTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCCGGATCAGAGCCGTGACCATCGACCGCGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCC
SEQ ID NO:59,Ig重链V区3信号序列(aa 1-19)+His6(aa 20-25)+TEV切割位点(zz 26-32)+鼠4-1BBL胞外域(aa 33-238)
MGWSCIILFLVATATGVHSHHHHHHENLYFQGRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLCNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWE
SEQ ID NO:60,人轻链前导物(aa 1-20)+小鼠铰链–CH2–CH3(aa 21-258)+TEV切割位点(aa 259-265)+人IL-15Ra Sushi域*(aa 266-333)+接头(aa 334-361)+人IL15**(aa362-475)
*来自PDB:4GS7链D的Sushi域；Sushi域是aa 31-95,使用的序列是aa30-97。
**来自PDB:4GS7链D的人IL15,aa 49-162。
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGKENLYFQGGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPGSGSGSGSGSEDEDEDEDGSGSGSGSGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
SEQ ID NO:61,人轻链前导物(aa 1-20)+小鼠铰链–CH2–CH3–(aa 21-258)+接头(aa259-273)+鼠IL-12亚基beta(p40)(274-586)+接头(aa 587-601)+人IL-12亚基alpha(p35)(aa 602-794)
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGKGGGGSGGGGSGGGGSMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
SEQ ID NO:62,41BBL-T2A-IL-12构建体,GPA信号肽(SEQ ID NO:21)-41BBL(SEQID NO:41)-4-1BBL接头(SEQ ID NO:39)-GPA(SEQ ID NO:25)-(T2A滑动肽)-SMIM1 SEQ IDNO:49)-接头(SEQ ID NO:12)-IL12 p40(SEQ ID NO:45)–柔性接头(SEQ ID NO:12)–IL-12p35(SEQ ID NO:47)
MYGKIIFVLLLSEIVSISAACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGSGGGPEDEPGSGSGGGSGGGSLSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQAAAEGRGSLLTCGDVEENPGPSGMQPQESHVHYSRWEDGSRDGVSLGAVSSTEEASRCRRISQRLCTGKLGIAMKVLGGVALFWIIFILGYLTGYYVHKCKGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS*
SEQ ID NO:63,编码SEQ ID NO:59,41BBL-T2A-IL-12构建体
ATGTATGGAAAAATAATCTTTGTATTACTATTGTCAGAAATTGTGAGCATATCAGCAGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAAGGAGGATCTGGCGGGTCTGGAGGCGGCCCCGAGGACGAGCCCGGCAGCGGCAGCGGCGGAGGGTCTGGAGGCGGTTCCTTAAGTACCACTGAGGTGGCAATGCACACTTCAACCTCTTCTTCAGTCACAAAGAGTTACATCTCATCACAGACAAATGATACGCACAAACGGGACACATATGCAGCCACTCCTAGAGCTCATGAAGTTTCAGAAATTTCTGTTAGAACTGTTTACCCTCCAGAAGAGGAAACCGGAGAAAGGGTACAACTTGCCCATCATTTCTCTGAACCAGAGATAACACTCATTATTTTTGGGGTGATGGCTGGTGTTATTGGAACGATCCTCTTAATTTCTTACGGTATTCGCCGACTGATAAAGAAAAGCCCATCTGATGTAAAACCTCTCCCCTCACCTGACACAGACGTGCCTTTAAGTTCTGTTGAAATAGAAAATCCAGAGACAAGTGATCAAGCGGCCGCTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTTCCGGAATGCAACCGCAAGAGAGTCACGTACATTATTCAAGATGGGAAGATGGAAGTCGGGACGGTGTGTCTCTCGGCGCTGTTAGTTCAACGGAGGAAGCGTCTCGCTGTCGCCGGATAAGTCAACGCCTTTGTACGGGAAAACTGGGTATAGCTATGAAGGTCCTCGGCGGGGTGGCGTTGTTTTGGATTATCTTTATACTTGGGTATCTGACCGGTTACTATGTTCACAAGTGTAAAGGAGGTGGAGGATCAGGTGGAGGTGGTTCAGGTGGAGGAGGTAGCATCTGGGAGCTGAAGAAGGACGTGTACGTGGTGGAGCTGGACTGGTATCCTGATGCCCCAGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGACACACCTGAGGAGGATGGCATCACCTGGACACTGGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGCAAGACCCTGACAATCCAGGTGAAGGAGTTCGGCGACGCCGGCCAGTACACATGTCACAAGGGAGGAGAGGTGCTGAGCCACTCCCTGCTGCTGCTGCACAAGAAGGAGGACGGCATCTGGTCTACAGACATCCTGAAGGATCAGAAGGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGCGGTGCGAGGCCAAGAATTATAGCGGCCGGTTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCTCTACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCTAGCCGGGGCTCCTCTGACCCTCAGGGAGTGACATGCGGAGCAGCCACCCTGTCCGCCGAGCGGGTGAGAGGCGATAACAAGGAGTACGAGTATAGCGTGGAGTGCCAGGAGGACTCCGCCTGTCCAGCAGCAGAGGAGAGCCTGCCAATCGAAGTGATGGTGGATGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAATTATACAAGCTCCTTCTTTATCAGGGACATCATCAAGCCCGATCCCCCTAAGAACCTGCAGCTGAAGCCCCTGAAGAACAGCCGGCAGGTGGAGGTGTCTTGGGAGTACCCCGACACCTGGAGCACACCTCACTCCTATTTCTCTCTGACCTTTTGCGTGCAGGTGCAGGGCAAGTCCAAGAGGGAGAAGAAGGACCGCGTGTTCACCGATAAGACATCTGCCACCGTGATCTGTCGGAAGAACGCCTCTATCAGCGTGCGGGCCCAGGATAGATACTATTCTAGCTCCTGGAGCGAGTGGGCCTCCGTGCCATGTTCTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCCGGAATCTGCCAGTGGCAACCCCAGACCCCGGAATGTTCCCATGCCTGCACCACTCTCAGAACCTGCTGAGGGCCGTGAGCAATATGCTGCAGAAGGCCCGCCAGACACTGGAGTTTTACCCTTGTACCAGCGAGGAGATCGACCACGAGGACATCACAAAGGATAAGACCTCCACAGTGGAGGCCTGCCTGCCACTGGAGCTGACCAAGAACGAGAGCTGTCTGAACAGCCGGGAGACCAGCTTCATCACCAACGGCAGCTGCCTGGCCTCCAGAAAGACATCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTGTCTAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTATCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGAGGCAGATTTTCCTGGACCAGAATATGCTGGCCGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTTAATTCCGAGACAGTGCCTCAGAAGTCCTCTCTGGAGGAGCCAGATTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCCGGATCAGAGCCGTGACCATCGACCGCGTGATGAGCTATCTGAATGCCTCCTAG
SEQ ID NO:64,T2A滑动肽
AAAEGRGSLLTCGDVEENPGPSG
SEQ ID NO:65,编码SEQ ID NO:64,T2A滑动肽
GCGGCCGCTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTTCCGGA
序列表
<110> 鲁比厄斯治疗法股份有限公司
<120> 用于治疗癌症和传染病的治疗性细胞系统和方法
<130> 129267-00220
<140>
<141>
<150> 62/757,717
<151> 2018-11-08
<150> 62/732,050
<151> 2018-09-17
<150> 62/692,487
<151> 2018-06-29
<150> 62/680,490
<151> 2018-06-04
<150> 62/660,657
<151> 2018-04-20
<150> 62/640,530
<151> 2018-03-08
<160> 83
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 1
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
130 135 140
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
145 150 155 160
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
165 170 175
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
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Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
195 200 205
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
210 215 220
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
225 230 235 240
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
245 250 255
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
260 265 270
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
275 280 285
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
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<210> 2
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 2
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
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Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
130 135 140
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
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Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
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Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
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<212> PRT
<213> 智人
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Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
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Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
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Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
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Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
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Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
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Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
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<212> PRT
<213> 智人
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Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
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Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
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Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
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Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
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Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
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Thr Ser
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
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Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
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Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
100 105 110
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
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Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
130 135 140
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
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Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
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Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
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Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
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Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
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Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
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Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
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Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
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Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
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Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
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Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
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Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
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100 105 110
Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
100 105 110
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
115 120 125
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
130 135 140
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
145 150 155 160
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
165 170 175
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
180 185 190
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
195 200 205
<210> 8
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro
115 120 125
Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr
130 135 140
Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser
145 150 155 160
His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
165 170 175
<210> 9
<211> 65
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 10
<211> 78
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser
65 70 75
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
肽"
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
肽"
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
aactgggtga acgttattag tgaccttaaa aagatcgaag atttgataca gtcaatgcac 60
atagacgcga cgctttatac agaatctgat gtacatcctt catgcaaggt tactgctatg 120
aagtgttttc ttctcgaact ccaagtaata agtcttgaga gcggagatgc gagcattcat 180
gacaccgttg agaatcttat tatattggct aacaactctc tgtccagcaa tggtaatgtg 240
acagaaagcg ggtgtaagga gtgcgaggaa ctcgaggaga agaacatcaa agagttcttg 300
cagtctttcg tccatattgt ccagatgttc ataaatacta gc 342
<210> 14
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
aactgggtaa acgtcataag cgacctcaaa aagatcgagg accttataca gtctatgcac 60
atagatgcga cactttacac ggaatcagac gtgcacccgt cctgcaaagt cacagccatg 120
aagtgctttc ttctcgaact gcaggtaatt tctctcgaat caggtgacgc atctatccac 180
gacacagttg aaaatcttat tatcctggct aataactccc ttagctcaaa cggcaatgtc 240
accgagagtg gatgtaaaga atgtgaggaa cttgaagaga aaaacataaa ggaattcttg 300
cagagtttcg ttcatattgt gcaaatgttc atcaatacta gt 342
<210> 15
<211> 525
<212> DNA
<213> 智人
<400> 15
atcacatgcc caccgcccat gtctgttgaa cacgcagaca tttgggttaa aagttactca 60
ctttactcac gcgagagata tatatgcaac agcggcttca agcgcaaagc aggcactagt 120
agtcttacag agtgcgtgct caataaagct acaaatgtag ctcattggac tactcctagt 180
ctcaaatgca ttcgggaccc cgcgcttgtg caccagagac ctgcgccgcc gtccacagtg 240
acgacagctg gtgtaacccc ccaacctgaa tcccttagtc cgtctggtaa agaaccggcg 300
gcgtcttcac cttccagcaa taatactgcg gcgacaacag ccgcgatagt tcctggatcc 360
caactcatgc cgtcaaagtc tccttcaacg ggaacgacag agatctcttc acatgaaagt 420
tctcatggaa caccgagcca aactacggca aagaactggg aactgactgc ctcagcaagc 480
caccagccgc caggggtgta cccgcaaggg cactcagata ctact 525
<210> 16
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 16
atcacctgcc cgcctcccat gagcgtggaa cacgcggaca tttgggttaa gagctacagt 60
ctttacagcc gggagcgcta tatctgcaac tcagggttta agcggaaagc agggacatca 120
agtttgacag aatgtgtgtt gaacaaggct acaaatgttg ctcactggac cacgccatct 180
ttgaagtgta tccgagatcc cgcgcttgtc catcagcgcc cagcgcctcc ctcc 234
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 17
gggggaggtg gctctggtgg aggcgggagt ggcgggggcg gctca 45
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 18
ggcggggggg gaagcggtgg tggagggagc gggggtggtg gatcc 45
<210> 19
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 19
aactgggtga acgttattag tgaccttaaa aagatcgaag atttgataca gtcaatgcac 60
atagacgcga cgctttatac agaatctgat gtacatcctt catgcaaggt tactgctatg 120
aagtgttttc ttctcgaact ccaagtaata agtcttgaga gcggagatgc gagcattcat 180
gacaccgttg agaatcttat tatattggct aacaactctc tgtccagcaa tggtaatgtg 240
acagaaagcg ggtgtaagga gtgcgaggaa ctcgaggaga agaacatcaa agagttcttg 300
cagtctttcg tccatattgt ccagatgttc ataaatacta gcgggggagg tggctctggt 360
ggaggcggga gtggcggggg cggctcaatc acatgcccac cgcccatgtc tgttgaacac 420
gcagacattt gggttaaaag ttactcactt tactcacgcg agagatatat atgcaacagc 480
ggcttcaagc gcaaagcagg cactagtagt cttacagagt gcgtgctcaa taaagctaca 540
aatgtagctc attggactac tcctagtctc aaatgcattc gggaccccgc gcttgtgcac 600
cagagacctg cgccgccgtc cacagtgacg acagctggtg taacccccca acctgaatcc 660
cttagtccgt ctggtaaaga accggcggcg tcttcacctt ccagcaataa tactgcggcg 720
acaacagccg cgatagttcc tggatcccaa ctcatgccgt caaagtctcc ttcaacggga 780
acgacagaga tctcttcaca tgaaagttct catggaacac cgagccaaac tacggcaaag 840
aactgggaac tgactgcctc agcaagccac cagccgccag gggtgtaccc gcaagggcac 900
tcagatacta ct 912
<210> 20
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 20
aactgggtaa acgtcataag cgacctcaaa aagatcgagg accttataca gtctatgcac 60
atagatgcga cactttacac ggaatcagac gtgcacccgt cctgcaaagt cacagccatg 120
aagtgctttc ttctcgaact gcaggtaatt tctctcgaat caggtgacgc atctatccac 180
gacacagttg aaaatcttat tatcctggct aataactccc ttagctcaaa cggcaatgtc 240
accgagagtg gatgtaaaga atgtgaggaa cttgaagaga aaaacataaa ggaattcttg 300
cagagtttcg ttcatattgt gcaaatgttc atcaatacta gtggcggggg gggaagcggt 360
ggtggaggga gcgggggtgg tggatccatc acctgcccgc ctcccatgag cgtggaacac 420
gcggacattt gggttaagag ctacagtctt tacagccggg agcgctatat ctgcaactca 480
gggtttaagc ggaaagcagg gacatcaagt ttgacagaat gtgtgttgaa caaggctaca 540
aatgttgctc actggaccac gccatctttg aagtgtatcc gagatcccgc gcttgtccat 600
cagcgcccag cgcctccctc c 621
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
肽"
<400> 21
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala
<210> 22
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 22
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagca 57
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
肽"
<400> 23
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 24
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 24
ggaggatctg gcgggtctgg aggctacccc tatgacgtgc ccgactatgc cggcggaggg 60
tctggaggcg gttcc 75
<210> 25
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 25
Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val
1 5 10 15
Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp
20 25 30
Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val
35 40 45
Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu
50 55 60
Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val
65 70 75 80
Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg
85 90 95
Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro
100 105 110
Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr
115 120 125
Ser Asp Gln
130
<210> 26
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 26
ttaagtacca ctgaggtggc aatgcacact tcaacctctt cttcagtcac aaagagttac 60
atctcatcac agacaaatga tacgcacaaa cgggacacat atgcagccac tcctagagct 120
catgaagttt cagaaatttc tgttagaact gtttaccctc cagaagagga aaccggagaa 180
agggtacaac ttgcccatca tttctctgaa ccagagataa cactcattat ttttggggtg 240
atggctggtg ttattggaac gatcctctta atttcttacg gtattcgccg actgataaag 300
aaaagcccat ctgatgtaaa acctctcccc tcacctgaca cagacgtgcc tttaagttct 360
gttgaaatag aaaatccaga gacaagtgat caa 393
<210> 27
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 27
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
35 40 45
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
50 55 60
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
100 105 110
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
115 120 125
Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Pro Tyr
130 135 140
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser
145 150 155 160
Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys
165 170 175
Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr
180 185 190
Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr
195 200 205
Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His
210 215 220
His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala
225 230 235 240
Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu
245 250 255
Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr
260 265 270
Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp
275 280 285
Gln
<210> 28
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 28
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcaaac 60
tgggtaaatg tgatttcaga cctgaaaaaa atcgaagacc ttattcaatc catgcacatc 120
gacgcgacac tttatactga atcagacgta cacccgtcct gtaaggttac tgcgatgaag 180
tgctttctgt tggaattgca agtgatctcc ctcgaatcag gggatgcatc cattcatgat 240
accgtcgaga atttgatcat tctggcaaat aactccctca gtagtaacgg gaatgtgacc 300
gagtctgggt gtaaggagtg cgaagagttg gaggaaaaga atatcaaaga attccttcag 360
tcctttgttc acatcgtgca aatgtttatt aatacatctg gaggatctgg cgggtctgga 420
ggctacccct atgacgtgcc cgactatgcc ggcggagggt ctggaggcgg ttccttaagt 480
accactgagg tggcaatgca cacttcaacc tcttcttcag tcacaaagag ttacatctca 540
tcacagacaa atgatacgca caaacgggac acatatgcag ccactcctag agctcatgaa 600
gtttcagaaa tttctgttag aactgtttac cctccagaag aggaaaccgg agaaagggta 660
caacttgccc atcatttctc tgaaccagag ataacactca ttatttttgg ggtgatggct 720
ggtgttattg gaacgatcct cttaatttct tacggtattc gccgactgat aaagaaaagc 780
ccatctgatg taaaacctct cccctcacct gacacagacg tgcctttaag ttctgttgaa 840
atagaaaatc cagagacaag tgatcaa 867
<210> 29
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 29
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
35 40 45
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
50 55 60
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
100 105 110
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
115 120 125
Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala
145 150 155 160
Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile
165 170 175
Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu
180 185 190
Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser
195 200 205
Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro
210 215 220
Pro Ser Thr Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu
225 230 235 240
Ser Pro Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn
245 250 255
Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro
260 265 270
Ser Lys Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser
275 280 285
Ser His Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr
290 295 300
Ala Ser Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser
305 310 315 320
Asp Thr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val
325 330 335
Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr
340 345 350
Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr
355 360 365
Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala
370 375 380
Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr
385 390 395 400
Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His Phe
405 410 415
Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val
420 425 430
Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys
435 440 445
Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val
450 455 460
Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
465 470 475
<210> 30
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 30
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcaaac 60
tgggtgaacg ttattagtga ccttaaaaag atcgaagatt tgatacagtc aatgcacata 120
gacgcgacgc tttatacaga atctgatgta catccttcat gcaaggttac tgctatgaag 180
tgttttcttc tcgaactcca agtaataagt cttgagagcg gagatgcgag cattcatgac 240
accgttgaga atcttattat attggctaac aactctctgt ccagcaatgg taatgtgaca 300
gaaagcgggt gtaaggagtg cgaggaactc gaggagaaga acatcaaaga gttcttgcag 360
tctttcgtcc atattgtcca gatgttcata aatactagcg ggggaggtgg ctctggtgga 420
ggcgggagtg gcgggggcgg ctcaatcaca tgcccaccgc ccatgtctgt tgaacacgca 480
gacatttggg ttaaaagtta ctcactttac tcacgcgaga gatatatatg caacagcggc 540
ttcaagcgca aagcaggcac tagtagtctt acagagtgcg tgctcaataa agctacaaat 600
gtagctcatt ggactactcc tagtctcaaa tgcattcggg accccgcgct tgtgcaccag 660
agacctgcgc cgccgtccac agtgacgaca gctggtgtaa ccccccaacc tgaatccctt 720
agtccgtctg gtaaagaacc ggcggcgtct tcaccttcca gcaataatac tgcggcgaca 780
acagccgcga tagttcctgg atcccaactc atgccgtcaa agtctccttc aacgggaacg 840
acagagatct cttcacatga aagttctcat ggaacaccga gccaaactac ggcaaagaac 900
tgggaactga ctgcctcagc aagccaccag ccgccagggg tgtacccgca agggcactca 960
gatactactg gaggatctgg cgggtctgga ggctacccct atgacgtgcc cgactatgcc 1020
ggcggagggt ctggaggcgg ttccttaagt accactgagg tggcaatgca cacttcaacc 1080
tcttcttcag tcacaaagag ttacatctca tcacagacaa atgatacgca caaacgggac 1140
acatatgcag ccactcctag agctcatgaa gtttcagaaa tttctgttag aactgtttac 1200
cctccagaag aggaaaccgg agaaagggta caacttgccc atcatttctc tgaaccagag 1260
ataacactca ttatttttgg ggtgatggct ggtgttattg gaacgatcct cttaatttct 1320
tacggtattc gccgactgat aaagaaaagc ccatctgatg taaaacctct cccctcacct 1380
gacacagacg tgcctttaag ttctgttgaa atagaaaatc cagagacaag tgatcaa 1437
<210> 31
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 31
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
35 40 45
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
50 55 60
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
100 105 110
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
115 120 125
Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala
145 150 155 160
Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile
165 170 175
Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu
180 185 190
Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser
195 200 205
Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro
210 215 220
Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
225 230 235 240
Asp Tyr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu
245 250 255
Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile
260 265 270
Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr
275 280 285
Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro
290 295 300
Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His Phe Ser
305 310 315 320
Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile
325 330 335
Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys
340 345 350
Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro
355 360 365
Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
370 375 380
<210> 32
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 32
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcaaac 60
tgggtaaacg tcataagcga cctcaaaaag atcgaggacc ttatacagtc tatgcacata 120
gatgcgacac tttacacgga atcagacgtg cacccgtcct gcaaagtcac agccatgaag 180
tgctttcttc tcgaactgca ggtaatttct ctcgaatcag gtgacgcatc tatccacgac 240
acagttgaaa atcttattat cctggctaat aactccctta gctcaaacgg caatgtcacc 300
gagagtggat gtaaagaatg tgaggaactt gaagagaaaa acataaagga attcttgcag 360
agtttcgttc atattgtgca aatgttcatc aatactagtg gcgggggggg aagcggtggt 420
ggagggagcg ggggtggtgg atccatcacc tgcccgcctc ccatgagcgt ggaacacgcg 480
gacatttggg ttaagagcta cagtctttac agccgggagc gctatatctg caactcaggg 540
tttaagcgga aagcagggac atcaagtttg acagaatgtg tgttgaacaa ggctacaaat 600
gttgctcact ggaccacgcc atctttgaag tgtatccgag atcccgcgct tgtccatcag 660
cgcccagcgc ctccctccgg aggatctggc gggtctggag gctaccccta tgacgtgccc 720
gactatgccg gcggagggtc tggaggcggt tccttaagta ccactgaggt ggcaatgcac 780
acttcaacct cttcttcagt cacaaagagt tacatctcat cacagacaaa tgatacgcac 840
aaacgggaca catatgcagc cactcctaga gctcatgaag tttcagaaat ttctgttaga 900
actgtttacc ctccagaaga ggaaaccgga gaaagggtac aacttgccca tcatttctct 960
gaaccagaga taacactcat tatttttggg gtgatggctg gtgttattgg aacgatcctc 1020
ttaatttctt acggtattcg ccgactgata aagaaaagcc catctgatgt aaaacctctc 1080
ccctcacctg acacagacgt gcctttaagt tctgttgaaa tagaaaatcc agagacaagt 1140
gatcaa 1146
<210> 33
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
肽"
<400> 33
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20
<210> 34
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 34
ggaggatctg gcgggtctgg aggcggcggc ggcagcggcg gcggcagcgg cggagggtct 60
ggaggcggtt cc 72
<210> 35
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 35
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
35 40 45
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
50 55 60
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
100 105 110
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
115 120 125
Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr
145 150 155 160
Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser
165 170 175
Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala
180 185 190
Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val
195 200 205
Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His
210 215 220
Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly
225 230 235 240
Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile
245 250 255
Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp
260 265 270
Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
275 280 285
<210> 36
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 36
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcaaac 60
tgggtaaatg tgatttcaga cctgaaaaaa atcgaagacc ttattcaatc catgcacatc 120
gacgcgacac tttatactga atcagacgta cacccgtcct gtaaggttac tgcgatgaag 180
tgctttctgt tggaattgca agtgatctcc ctcgaatcag gggatgcatc cattcatgat 240
accgtcgaga atttgatcat tctggcaaat aactccctca gtagtaacgg gaatgtgacc 300
gagtctgggt gtaaggagtg cgaagagttg gaggaaaaga atatcaaaga attccttcag 360
tcctttgttc acatcgtgca aatgtttatt aatacatctg gaggatctgg cgggtctgga 420
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcagcggc ggagggtctg gaggcggttc cttaagtacc 480
actgaggtgg caatgcacac ttcaacctct tcttcagtca caaagagtta catctcatca 540
cagacaaatg atacgcacaa acgggacaca tatgcagcca ctcctagagc tcatgaagtt 600
tcagaaattt ctgttagaac tgtttaccct ccagaagagg aaaccggaga aagggtacaa 660
cttgcccatc atttctctga accagagata acactcatta tttttggggt gatggctggt 720
gttattggaa cgatcctctt aatttcttac ggtattcgcc gactgataaa gaaaagccca 780
tctgatgtaa aacctctccc ctcacctgac acagacgtgc ctttaagttc tgttgaaata 840
gaaaatccag agacaagtga tcaa 864
<210> 37
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 37
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
35 40 45
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
50 55 60
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
100 105 110
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
115 120 125
Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala
145 150 155 160
Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile
165 170 175
Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu
180 185 190
Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser
195 200 205
Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro
210 215 220
Pro Ser Thr Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu
225 230 235 240
Ser Pro Ser Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn
245 250 255
Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro
260 265 270
Ser Lys Ser Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser
275 280 285
Ser His Gly Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr
290 295 300
Ala Ser Ala Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser
305 310 315 320
Asp Thr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu
340 345 350
Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile
355 360 365
Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr
370 375 380
Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His Phe Ser
405 410 415
Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile
420 425 430
Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys
435 440 445
Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro
450 455 460
Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
465 470 475
<210> 38
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 38
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcaaac 60
tgggtgaacg ttattagtga ccttaaaaag atcgaagatt tgatacagtc aatgcacata 120
gacgcgacgc tttatacaga atctgatgta catccttcat gcaaggttac tgctatgaag 180
tgttttcttc tcgaactcca agtaataagt cttgagagcg gagatgcgag cattcatgac 240
accgttgaga atcttattat attggctaac aactctctgt ccagcaatgg taatgtgaca 300
gaaagcgggt gtaaggagtg cgaggaactc gaggagaaga acatcaaaga gttcttgcag 360
tctttcgtcc atattgtcca gatgttcata aatactagcg ggggaggtgg ctctggtgga 420
ggcgggagtg gcgggggcgg ctcaatcaca tgcccaccgc ccatgtctgt tgaacacgca 480
gacatttggg ttaaaagtta ctcactttac tcacgcgaga gatatatatg caacagcggc 540
ttcaagcgca aagcaggcac tagtagtctt acagagtgcg tgctcaataa agctacaaat 600
gtagctcatt ggactactcc tagtctcaaa tgcattcggg accccgcgct tgtgcaccag 660
agacctgcgc cgccgtccac agtgacgaca gctggtgtaa ccccccaacc tgaatccctt 720
agtccgtctg gtaaagaacc ggcggcgtct tcaccttcca gcaataatac tgcggcgaca 780
acagccgcga tagttcctgg atcccaactc atgccgtcaa agtctccttc aacgggaacg 840
acagagatct cttcacatga aagttctcat ggaacaccga gccaaactac ggcaaagaac 900
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ggagggtctg gaggcggttc cttaagtacc actgaggtgg caatgcacac ttcaacctct 1080
tcttcagtca caaagagtta catctcatca cagacaaatg atacgcacaa acgggacaca 1140
tatgcagcca ctcctagagc tcatgaagtt tcagaaattt ctgttagaac tgtttaccct 1200
ccagaagagg aaaccggaga aagggtacaa cttgcccatc atttctctga accagagata 1260
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acagacgtgc ctttaagttc tgttgaaata gaaaatccag agacaagtga tcaa 1434
<210> 39
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
肽"
<400> 39
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Glu Asp Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 40
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 40
ggaggatctg gcgggtctgg aggcggcccc gaggacgagc ccggcagcgg cagcggcgga 60
gggtctggag gcggttcc 78
<210> 41
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 42
<211> 615
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
gcctgcccct gggccgtgtc cggggctcgc gcctcgcccg gctccgcggc cagcccgaga 60
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<210> 43
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 43
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro
20 25 30
Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
35 40 45
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
50 55 60
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
65 70 75 80
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
85 90 95
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
130 135 140
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
145 150 155 160
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
165 170 175
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
180 185 190
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
195 200 205
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Glu Asp Glu Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val
245 250 255
Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser
260 265 270
Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro
275 280 285
Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro
290 295 300
Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu
305 310 315 320
Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly
325 330 335
Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser
340 345 350
Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu
355 360 365
Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu Thr Ser Asp Gln
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<211> 1143
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcagcc 60
tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc 120
cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc 180
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gaggctcgga actcggcctt cggtttccag ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag 540
cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc agggcacgcc atgcctggca gcttacccag 600
ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg acccccgaaa tcccagccgg actcccttca 660
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ggcagcggcg gagggtctgg aggcggttcc ttaagtacca ctgaggtggc aatgcacact 780
tcaacctctt cttcagtcac aaagagttac atctcatcac agacaaatga tacgcacaaa 840
cgggacacat atgcagccac tcctagagct catgaagttt cagaaatttc tgttagaact 900
gtttaccctc cagaagagga aaccggagaa agggtacaac ttgcccatca tttctctgaa 960
ccagagataa cactcattat ttttggggtg atggctggtg ttattggaac gatcctctta 1020
atttcttacg gtattcgccg actgataaag aaaagcccat ctgatgtaaa acctctcccc 1080
tcacctgaca cagacgtgcc tttaagttct gttgaaatag aaaatccaga gacaagtgat 1140
caa 1143
<210> 45
<211> 306
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 46
<211> 918
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
atctgggagc tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtatcc tgatgcccca 60
ggcgagatgg tggtgctgac ctgcgacaca cctgaggagg atggcatcac ctggacactg 120
gatcagagca gcgaggtgct gggctccggc aagaccctga caatccaggt gaaggagttc 180
ggcgacgccg gccagtacac atgtcacaag ggaggagagg tgctgagcca ctccctgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga cggcatctgg tctacagaca tcctgaagga tcagaaggag 300
cccaagaaca agaccttcct gcggtgcgag gccaagaatt atagcggccg gttcacctgt 360
tggtggctga ccacaatctc taccgacctg accttcagcg tgaagtctag ccggggctcc 420
tctgaccctc agggagtgac atgcggagca gccaccctgt ccgccgagcg ggtgagaggc 480
gataacaagg agtacgagta tagcgtggag tgccaggagg actccgcctg tccagcagca 540
gaggagagcc tgccaatcga agtgatggtg gatgccgtgc acaagctgaa gtacgagaat 600
tatacaagct ccttctttat cagggacatc atcaagcccg atccccctaa gaacctgcag 660
ctgaagcccc tgaagaacag ccggcaggtg gaggtgtctt gggagtaccc cgacacctgg 720
agcacacctc actcctattt ctctctgacc ttttgcgtgc aggtgcaggg caagtccaag 780
agggagaaga aggaccgcgt gttcaccgat aagacatctg ccaccgtgat ctgtcggaag 840
aacgcctcta tcagcgtgcg ggcccaggat agatactatt ctagctcctg gagcgagtgg 900
gcctccgtgc catgttct 918
<210> 47
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 48
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 48
cggaatctgc cagtggcaac cccagacccc ggaatgttcc catgcctgca ccactctcag 60
aacctgctga gggccgtgag caatatgctg cagaaggccc gccagacact ggagttttac 120
ccttgtacca gcgaggagat cgaccacgag gacatcacaa aggataagac ctccacagtg 180
gaggcctgcc tgccactgga gctgaccaag aacgagagct gtctgaacag ccgggagacc 240
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc tccagaaaga catcttttat gatggccctg 300
tgcctgtcta gcatctacga ggacctgaag atgtatcagg tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caagaggcag attttcctgg accagaatat gctggccgtg 420
atcgacgagc tgatgcaggc cctgaacttt aattccgaga cagtgcctca gaagtcctct 480
ctggaggagc cagatttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 540
cggatcagag ccgtgaccat cgaccgcgtg atgagctatc tgaatgcctc c 591
<210> 49
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 49
Met Gln Pro Gln Glu Ser His Val His Tyr Ser Arg Trp Glu Asp Gly
1 5 10 15
Ser Arg Asp Gly Val Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Thr Glu Glu Ala
20 25 30
Ser Arg Cys Arg Arg Ile Ser Gln Arg Leu Cys Thr Gly Lys Leu Gly
35 40 45
Ile Ala Met Lys Val Leu Gly Gly Val Ala Leu Phe Trp Ile Ile Phe
50 55 60
Ile Leu Gly Tyr Leu Thr Gly Tyr Tyr Val His Lys Cys Lys
65 70 75
<210> 50
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 50
atgcaaccgc aagagagtca cgtacattat tcaagatggg aagatggaag tcgggacggt 60
gtgtctctcg gcgctgttag ttcaacggag gaagcgtctc gctgtcgccg gataagtcaa 120
cgcctttgta cgggaaaact gggtatagct atgaaggtcc tcggcggggt ggcgttgttt 180
tggattatct ttatacttgg gtatctgacc ggttactatg ttcacaagtg taaa 234
<210> 51
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
肽"
<400> 51
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20
<210> 52
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 52
ggaggatctg gcgggtctgg aggcggcggc ggcagcggcg gcggcagcgg cggagggtct 60
ggaggcggtt cc 72
<210> 53
<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 53
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu
20 25 30
Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp
35 40 45
Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu
50 55 60
Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly
65 70 75 80
Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His
85 90 95
Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp
100 105 110
Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys
115 120 125
Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr
130 135 140
Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg
165 170 175
Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu
180 185 190
Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met
195 200 205
Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe
210 215 220
Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu
225 230 235 240
Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val
260 265 270
Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr
275 280 285
Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser
290 295 300
Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala
305 310 315 320
Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met
340 345 350
Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn
355 360 365
Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser
370 375 380
Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val
385 390 395 400
Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn
405 410 415
Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg
420 425 430
Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp
435 440 445
Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu
450 455 460
Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val
465 470 475 480
Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro
485 490 495
Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys
500 505 510
Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp
515 520 525
Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
530 535 540
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
545 550 555 560
Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser
565 570 575
Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg
580 585 590
Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser
595 600 605
Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln
610 615 620
Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly
625 630 635 640
Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
645 650 655
Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser
660 665 670
Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn Pro Glu
675 680 685
Thr Ser Asp Gln
690
<210> 54
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 54
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcaatc 60
tgggagctga agaaggacgt gtacgtggtg gagctggact ggtatcctga tgccccaggc 120
gagatggtgg tgctgacctg cgacacacct gaggaggatg gcatcacctg gacactggat 180
cagagcagcg aggtgctggg ctccggcaag accctgacaa tccaggtgaa ggagttcggc 240
gacgccggcc agtacacatg tcacaaggga ggagaggtgc tgagccactc cctgctgctg 300
ctgcacaaga aggaggacgg catctggtct acagacatcc tgaaggatca gaaggagccc 360
aagaacaaga ccttcctgcg gtgcgaggcc aagaattata gcggccggtt cacctgttgg 420
tggctgacca caatctctac cgacctgacc ttcagcgtga agtctagccg gggctcctct 480
gaccctcagg gagtgacatg cggagcagcc accctgtccg ccgagcgggt gagaggcgat 540
aacaaggagt acgagtatag cgtggagtgc caggaggact ccgcctgtcc agcagcagag 600
gagagcctgc caatcgaagt gatggtggat gccgtgcaca agctgaagta cgagaattat 660
acaagctcct tctttatcag ggacatcatc aagcccgatc cccctaagaa cctgcagctg 720
aagcccctga agaacagccg gcaggtggag gtgtcttggg agtaccccga cacctggagc 780
acacctcact cctatttctc tctgaccttt tgcgtgcagg tgcagggcaa gtccaagagg 840
gagaagaagg accgcgtgtt caccgataag acatctgcca ccgtgatctg tcggaagaac 900
gcctctatca gcgtgcgggc ccaggataga tactattcta gctcctggag cgagtgggcc 960
tccgtgccat gttctggagg aggaggcagc ggcggaggag gctccggcgg cggcggcagc 1020
cggaatctgc cagtggcaac cccagacccc ggaatgttcc catgcctgca ccactctcag 1080
aacctgctga gggccgtgag caatatgctg cagaaggccc gccagacact ggagttttac 1140
ccttgtacca gcgaggagat cgaccacgag gacatcacaa aggataagac ctccacagtg 1200
gaggcctgcc tgccactgga gctgaccaag aacgagagct gtctgaacag ccgggagacc 1260
agcttcatca ccaacggcag ctgcctggcc tccagaaaga catcttttat gatggccctg 1320
tgcctgtcta gcatctacga ggacctgaag atgtatcagg tggagttcaa gaccatgaac 1380
gccaagctgc tgatggaccc caagaggcag attttcctgg accagaatat gctggccgtg 1440
atcgacgagc tgatgcaggc cctgaacttt aattccgaga cagtgcctca gaagtcctct 1500
ctggaggagc cagatttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttc 1560
cggatcagag ccgtgaccat cgaccgcgtg atgagctatc tgaatgcctc cggaggatct 1620
ggcgggtctg gaggcggcgg cggcagcggc ggcggcagcg gcggagggtc tggaggcggt 1680
tccttaagta ccactgaggt ggcaatgcac acttcaacct cttcttcagt cacaaagagt 1740
tacatctcat cacagacaaa tgatacgcac aaacgggaca catatgcagc cactcctaga 1800
gctcatgaag tttcagaaat ttctgttaga actgtttacc ctccagaaga ggaaaccgga 1860
gaaagggtac aacttgccca tcatttctct gaaccagaga taacactcat tatttttggg 1920
gtgatggctg gtgttattgg aacgatcctc ttaatttctt acggtattcg ccgactgata 1980
aagaaaagcc catctgatgt aaaacctctc ccctcacctg acacagacgt gcctttaagt 2040
tctgttgaaa tagaaaatcc agagacaagt gatcaa 2076
<210> 55
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 55
Met Gln Pro Gln Glu Ser His Val His Tyr Ser Arg Trp Glu Asp Gly
1 5 10 15
Ser Arg Asp Gly Val Ser Leu Gly Ala Val Ser Ser Thr Glu Glu Ala
20 25 30
Ser Arg Cys Arg Arg Ile Ser Gln Arg Leu Cys Thr Gly Lys Leu Gly
35 40 45
Ile Ala Met Lys Val Leu Gly Gly Val Ala Leu Phe Trp Ile Ile Phe
50 55 60
Ile Leu Gly Tyr Leu Thr Gly Tyr Tyr Val His Lys Cys Lys Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu
85 90 95
Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala
100 105 110
Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly
115 120 125
Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys
130 135 140
Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr
145 150 155 160
Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His
165 170 175
Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys
180 185 190
Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser
195 200 205
Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr
210 215 220
Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr
225 230 235 240
Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys
245 250 255
Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala
260 265 270
Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys
275 280 285
Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile
290 295 300
Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser
305 310 315 320
Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro
325 330 335
His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser
340 345 350
Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr
355 360 365
Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg
370 375 380
Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn
405 410 415
Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His
420 425 430
Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg
435 440 445
Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu
450 455 460
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
485 490 495
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met
500 505 510
Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val
515 520 525
Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln
530 535 540
Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln
545 550 555 560
Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu
565 570 575
Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His
580 585 590
Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu
595 600 605
Asn Ala Ser
610
<210> 56
<211> 1833
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 56
atgcaaccgc aagagagtca cgtacattat tcaagatggg aagatggaag tcgggacggt 60
gtgtctctcg gcgctgttag ttcaacggag gaagcgtctc gctgtcgccg gataagtcaa 120
cgcctttgta cgggaaaact gggtatagct atgaaggtcc tcggcggggt ggcgttgttt 180
tggattatct ttatacttgg gtatctgacc ggttactatg ttcacaagtg taaaggaggt 240
ggaggatcag gtggaggtgg ttcaggtgga ggaggtagca tctgggagct gaagaaggac 300
gtgtacgtgg tggagctgga ctggtatcct gatgccccag gcgagatggt ggtgctgacc 360
tgcgacacac ctgaggagga tggcatcacc tggacactgg atcagagcag cgaggtgctg 420
ggctccggca agaccctgac aatccaggtg aaggagttcg gcgacgccgg ccagtacaca 480
tgtcacaagg gaggagaggt gctgagccac tccctgctgc tgctgcacaa gaaggaggac 540
ggcatctggt ctacagacat cctgaaggat cagaaggagc ccaagaacaa gaccttcctg 600
cggtgcgagg ccaagaatta tagcggccgg ttcacctgtt ggtggctgac cacaatctct 660
accgacctga ccttcagcgt gaagtctagc cggggctcct ctgaccctca gggagtgaca 720
tgcggagcag ccaccctgtc cgccgagcgg gtgagaggcg ataacaagga gtacgagtat 780
agcgtggagt gccaggagga ctccgcctgt ccagcagcag aggagagcct gccaatcgaa 840
gtgatggtgg atgccgtgca caagctgaag tacgagaatt atacaagctc cttctttatc 900
agggacatca tcaagcccga tccccctaag aacctgcagc tgaagcccct gaagaacagc 960
cggcaggtgg aggtgtcttg ggagtacccc gacacctgga gcacacctca ctcctatttc 1020
tctctgacct tttgcgtgca ggtgcagggc aagtccaaga gggagaagaa ggaccgcgtg 1080
ttcaccgata agacatctgc caccgtgatc tgtcggaaga acgcctctat cagcgtgcgg 1140
gcccaggata gatactattc tagctcctgg agcgagtggg cctccgtgcc atgttctgga 1200
ggaggaggca gcggcggagg aggctccggc ggcggcggca gccggaatct gccagtggca 1260
accccagacc ccggaatgtt cccatgcctg caccactctc agaacctgct gagggccgtg 1320
agcaatatgc tgcagaaggc ccgccagaca ctggagtttt acccttgtac cagcgaggag 1380
atcgaccacg aggacatcac aaaggataag acctccacag tggaggcctg cctgccactg 1440
gagctgacca agaacgagag ctgtctgaac agccgggaga ccagcttcat caccaacggc 1500
agctgcctgg cctccagaaa gacatctttt atgatggccc tgtgcctgtc tagcatctac 1560
gaggacctga agatgtatca ggtggagttc aagaccatga acgccaagct gctgatggac 1620
cccaagaggc agattttcct ggaccagaat atgctggccg tgatcgacga gctgatgcag 1680
gccctgaact ttaattccga gacagtgcct cagaagtcct ctctggagga gccagatttc 1740
tacaagacca agatcaagct gtgcatcctg ctgcacgcct tccggatcag agccgtgacc 1800
atcgaccgcg tgatgagcta tctgaatgcc tcc 1833
<210> 57
<211> 518
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 57
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys
325 330 335
Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln
340 345 350
Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile
355 360 365
Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys
370 375 380
Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu
385 390 395 400
Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser
405 410 415
Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met
420 425 430
Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro
435 440 445
Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu
450 455 460
Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser
465 470 475 480
Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile
485 490 495
Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met
500 505 510
Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
515
<210> 58
<211> 1554
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 58
atctgggagc tgaagaagga cgtgtacgtg gtggagctgg actggtatcc tgatgcccca 60
ggcgagatgg tggtgctgac ctgcgacaca cctgaggagg atggcatcac ctggacactg 120
gatcagagca gcgaggtgct gggctccggc aagaccctga caatccaggt gaaggagttc 180
ggcgacgccg gccagtacac atgtcacaag ggaggagagg tgctgagcca ctccctgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga cggcatctgg tctacagaca tcctgaagga tcagaaggag 300
cccaagaaca agaccttcct gcggtgcgag gccaagaatt atagcggccg gttcacctgt 360
tggtggctga ccacaatctc taccgacctg accttcagcg tgaagtctag ccggggctcc 420
tctgaccctc agggagtgac atgcggagca gccaccctgt ccgccgagcg ggtgagaggc 480
gataacaagg agtacgagta tagcgtggag tgccaggagg actccgcctg tccagcagca 540
gaggagagcc tgccaatcga agtgatggtg gatgccgtgc acaagctgaa gtacgagaat 600
tatacaagct ccttctttat cagggacatc atcaagcccg atccccctaa gaacctgcag 660
ctgaagcccc tgaagaacag ccggcaggtg gaggtgtctt gggagtaccc cgacacctgg 720
agcacacctc actcctattt ctctctgacc ttttgcgtgc aggtgcaggg caagtccaag 780
agggagaaga aggaccgcgt gttcaccgat aagacatctg ccaccgtgat ctgtcggaag 840
aacgcctcta tcagcgtgcg ggcccaggat agatactatt ctagctcctg gagcgagtgg 900
gcctccgtgc catgttctgg aggaggaggc agcggcggag gaggctccgg cggcggcggc 960
agccggaatc tgccagtggc aaccccagac cccggaatgt tcccatgcct gcaccactct 1020
cagaacctgc tgagggccgt gagcaatatg ctgcagaagg cccgccagac actggagttt 1080
tacccttgta ccagcgagga gatcgaccac gaggacatca caaaggataa gacctccaca 1140
gtggaggcct gcctgccact ggagctgacc aagaacgaga gctgtctgaa cagccgggag 1200
accagcttca tcaccaacgg cagctgcctg gcctccagaa agacatcttt tatgatggcc 1260
ctgtgcctgt ctagcatcta cgaggacctg aagatgtatc aggtggagtt caagaccatg 1320
aacgccaagc tgctgatgga ccccaagagg cagattttcc tggaccagaa tatgctggcc 1380
gtgatcgacg agctgatgca ggccctgaac tttaattccg agacagtgcc tcagaagtcc 1440
tctctggagg agccagattt ctacaagacc aagatcaagc tgtgcatcct gctgcacgcc 1500
ttccggatca gagccgtgac catcgaccgc gtgatgagct atctgaatgc ctcc 1554
<210> 59
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 59
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
20 25 30
Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu
35 40 45
Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
50 55 60
Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
65 70 75 80
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
85 90 95
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
100 105 110
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
115 120 125
Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
130 135 140
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
145 150 155 160
Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser
165 170 175
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
180 185 190
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
195 200 205
Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr
210 215 220
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu
225 230 235
<210> 60
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 60
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Pro Cys Pro
20 25 30
Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly
35 40 45
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
50 55 60
Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp
65 70 75 80
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
85 90 95
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg
100 105 110
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
115 120 125
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu
130 135 140
Lys Thr Ile Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
145 150 155 160
Val Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu
165 170 175
Thr Cys Met Ile Thr Gly Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp
180 185 190
Thr Ser Asn Gly Arg Thr Glu Gln Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val
195 200 205
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln
210 215 220
Lys Ser Thr Trp Glu Arg Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His
225 230 235 240
Glu Gly Leu His Asn His Leu Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu
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Gly Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ile Thr Cys Pro Pro Pro
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Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr
275 280 285
Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly
290 295 300
Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala
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His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Gly Ser Gly
325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Gly
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser
355 360 365
Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala
370 375 380
Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala
385 390 395 400
Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly
405 410 415
Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn
420 425 430
Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu
435 440 445
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe
450 455 460
Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
465 470 475
<210> 61
<211> 794
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 61
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
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Gly Ala Arg Cys Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Pro Cys Pro
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35 40 45
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
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Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp
275 280 285
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Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala
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Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His
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Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu
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Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu
385 390 395 400
Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val
405 410 415
Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln
420 425 430
Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys
435 440 445
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450 455 460
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Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn
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Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys
565 570 575
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580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile Pro Val Ser Gly
595 600 605
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Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
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<210> 62
<211> 1015
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 62
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
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Ile Ser Ala Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro
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Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
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Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
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Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
165 170 175
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser Thr Thr Glu Val
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Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala
545 550 555 560
Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu
565 570 575
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Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
725 730 735
Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val
740 745 750
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Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu
835 840 845
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu
850 855 860
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
865 870 875 880
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg
885 890 895
Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr
900 905 910
Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
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Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
930 935 940
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp
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965 970 975
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Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val
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1010 1015
<210> 63
<211> 3048
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 63
atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcagcc 60
tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc 120
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tcaacctctt cttcagtcac aaagagttac atctcatcac agacaaatga tacgcacaaa 840
cgggacacat atgcagccac tcctagagct catgaagttt cagaaatttc tgttagaact 900
gtttaccctc cagaagagga aaccggagaa agggtacaac ttgcccatca tttctctgaa 960
ccagagataa cactcattat ttttggggtg atggctggtg ttattggaac gatcctctta 1020
atttcttacg gtattcgccg actgataaag aaaagcccat ctgatgtaaa acctctcccc 1080
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cggataagtc aacgcctttg tacgggaaaa ctgggtatag ctatgaaggt cctcggcggg 1380
gtggcgttgt tttggattat ctttatactt gggtatctga ccggttacta tgttcacaag 1440
tgtaaaggag gtggaggatc aggtggaggt ggttcaggtg gaggaggtag catctgggag 1500
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ggccagtaca catgtcacaa gggaggagag gtgctgagcc actccctgct gctgctgcac 1740
aagaaggagg acggcatctg gtctacagac atcctgaagg atcagaagga gcccaagaac 1800
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accacaatct ctaccgacct gaccttcagc gtgaagtcta gccggggctc ctctgaccct 1920
cagggagtga catgcggagc agccaccctg tccgccgagc gggtgagagg cgataacaag 1980
gagtacgagt atagcgtgga gtgccaggag gactccgcct gtccagcagc agaggagagc 2040
ctgccaatcg aagtgatggt ggatgccgtg cacaagctga agtacgagaa ttatacaagc 2100
tccttcttta tcagggacat catcaagccc gatcccccta agaacctgca gctgaagccc 2160
ctgaagaaca gccggcaggt ggaggtgtct tgggagtacc ccgacacctg gagcacacct 2220
cactcctatt tctctctgac cttttgcgtg caggtgcagg gcaagtccaa gagggagaag 2280
aaggaccgcg tgttcaccga taagacatct gccaccgtga tctgtcggaa gaacgcctct 2340
atcagcgtgc gggcccagga tagatactat tctagctcct ggagcgagtg ggcctccgtg 2400
ccatgttctg gaggaggagg cagcggcgga ggaggctccg gcggcggcgg cagccggaat 2460
ctgccagtgg caaccccaga ccccggaatg ttcccatgcc tgcaccactc tcagaacctg 2520
ctgagggccg tgagcaatat gctgcagaag gcccgccaga cactggagtt ttacccttgt 2580
accagcgagg agatcgacca cgaggacatc acaaaggata agacctccac agtggaggcc 2640
tgcctgccac tggagctgac caagaacgag agctgtctga acagccggga gaccagcttc 2700
atcaccaacg gcagctgcct ggcctccaga aagacatctt ttatgatggc cctgtgcctg 2760
tctagcatct acgaggacct gaagatgtat caggtggagt tcaagaccat gaacgccaag 2820
ctgctgatgg accccaagag gcagattttc ctggaccaga atatgctggc cgtgatcgac 2880
gagctgatgc aggccctgaa ctttaattcc gagacagtgc ctcagaagtc ctctctggag 2940
gagccagatt tctacaagac caagatcaag ctgtgcatcc tgctgcacgc cttccggatc 3000
agagccgtga ccatcgaccg cgtgatgagc tatctgaatg cctcctag 3048
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肽"
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Ala Ala Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
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20
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<221> 来源
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寡核苷酸"
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gcggccgctg agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
ccttccgga 69
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<220>
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<223> /记录=“人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 66
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Ala Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His
35 40 45
Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu
50 55 60
Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile
85 90 95
Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr
100 105 110
Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu
115 120 125
Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn
130 135 140
Pro Glu Thr Ser Asp Gln
145 150
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肽"
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Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Glu Asp Glu Asp
1 5 10 15
Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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肽"
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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肽"
<400> 69
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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肽"
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Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser
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肽"
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Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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肽"
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Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Ala
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肽"
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20
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多肽"
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Ser Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Lys
1 5 10 15
Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile
20 25 30
Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Val Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met
35 40 45
Leu Trp Gly Ser Gly Met Gln Ser Pro Ala
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多肽"
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"Gly-Gly-Gly-Gly-Ser" repeating units"
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
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肽"
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Val His Ser
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肽"
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Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys
20
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肽"
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肽"
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<220>
<221> 来源
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肽"
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Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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<221> 来源
<223> /记录=“人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
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gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg sgsstcccgg ccct 54
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<213> 人工序列
<220>
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肽"
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Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
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<220>
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肽"
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<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<400> 83
Leu Pro Xaa Thr Ala
1 5

Claims (156)

1.去核细胞，所述去核细胞经工程化改造以刺激免疫杀伤细胞，其中所述去核细胞至少包含第一外源刺激性多肽和第二外源刺激性多肽，其中所述外源刺激性多肽足以刺激所述免疫杀伤细胞。
2.权利要求1的去核细胞，其中所述免疫杀伤细胞是天然杀伤(NK)细胞。
3.权利要求1的去核细胞，其中所述免疫杀伤细胞是CD8+T细胞。
4.权利要求1的去核细胞，其中所述去核细胞至少包含第一外源刺激性多肽、第二外源刺激性多肽和第三外源刺激性多肽。
5.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述外源刺激性多肽中的至少一种包含选自下组的多肽：IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-15/IL-15RA融合物、IL-18、IL-21、干扰素α(IFNα)、4-1BBL、脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)、CD48、人白细胞抗原(HLA)-A、HLA-C、HLA-G、硫酸类肝素(HS)、HLA-E、CpG、免疫球蛋白G(IgG)、MHC I类链相关蛋白(MIC)、B7-H6、NkP44L、Nectin2、NK-T-B抗原(NTBA)、激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
6.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述外源刺激性多肽中的至少一种包含IL-15/IL-15RA融合物。
7.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述外源刺激性多肽中的至少一种包含IL-12。
8.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述外源刺激性多肽中的至少一种包含4-1BBL。
9.权利要求5的去核细胞，其中所述MIC蛋白选自下组：MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)和UL16结合蛋白(ULBP)。
10.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述外源刺激性多肽中的至少一种包含选自下组的多肽：IL-15/IL-15RA融合物、MICA、MICB和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
11.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA，并且所述第二外源刺激性多肽包含选自下组的多肽：IL-1、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、4-1BBL、IFNα、MICA、MICB、PVR和CD48。
12.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA，并且所述第二外源刺激性多肽包含4-1BBL。
13.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15/IL-15RA，并且所述第二外源刺激性多肽包含IL-12。
14.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12，并且所述第二外源刺激性多肽包含4-1BBL。
15.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽选自下组：IL-18和IL-12、IL-18和IL-21、IL-12和4-1BBL、IL-12和IL-15/IL-15RA融合物以及4-1BBL和IL-15/IL-15RA融合物。
16.权利要求4的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12，所述第二外源刺激性多肽包含IL-18，并且所述第三外源刺激性多肽包含IL15/IL-15RA融合物。
17.权利要求4的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-12，所述第二外源刺激性多肽包含IL-18，并且所述第三外源刺激性多肽包含IL-15。
18.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中至少一种外源多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。
19.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽以比所述第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。
20.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽以比所述第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。
21.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50或约100:1至1:100的丰度比。
22.权利要求1-4中任一项的去核细胞，其中所述第一和所述第二外源刺激性多肽以融合多肽存在。
23.权利要求4的去核细胞，其中所述第一、所述第二和所述第三外源刺激性多肽以融合多肽存在。
24.权利要求1-23中任一项的去核细胞，其中至少一种或多种外源刺激性多肽存在于工程化去核细胞的表面处。
25.权利要求1-24中任一项的去核细胞，其中至少一种或多种外源刺激性多肽还包含跨膜域。
26.权利要求25的去核细胞，其中所述跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其跨膜部分。
27.权利要求25的去核细胞，其中所述跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分。
28.权利要求1-27中任一项的去核细胞，其中所述去核细胞能够活化NK细胞。
29.权利要求1-27中任一项的去核细胞，其中所述去核细胞能够扩充NK细胞。
30.权利要求28或29的去核细胞，其中所述NK细胞是记忆样NK细胞。
31.权利要求1-27中任一项的去核细胞，其中所述去核细胞能够活化CD8+T细胞。
32.权利要求1-27中任一项的去核细胞，其中所述去核细胞能够扩充CD8+T细胞。
33.权利要求31或32的去核细胞，其中所述CD8+T细胞是记忆T细胞。
34.权利要求1-32中任一项的去核细胞，其是红系细胞。
35.权利要求34的去核细胞，其中所述红系细胞是网织红细胞。
36.权利要求34的去核细胞，其中所述红系细胞是红细胞。
37.工程化去核细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含白介素15(IL-15)多肽或其片段，以及白介素15受体α(IL-15RA)多肽的胞外部分或其片段。
38.权利要求37的工程化去核细胞，其中所述IL-15多肽和IL-15RA多肽的胞外部分以复合物存在。
39.权利要求37或38的工程化去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包括融合多肽。
40.权利要求37-39中任一项的工程化去核细胞，其中所述IL-15多肽或其片段通过接头与所述IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接。
41.权利要求40的工程化去核细胞，其中所述接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。
42.权利要求40或41的工程化去核细胞，其中所述接头包含(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:12)。
43.权利要求39-42中任一项的工程化去核细胞，其中所述融合多肽包含与SEQ IDNO.1至少95％相同的氨基酸序列。
44.权利要求39-42中任一项的工程化去核细胞，其中所述融合多肽包含与SEQ IDNO.29或SEQ ID NO.37至少95％相同的氨基酸序列。
45.权利要求37的工程化去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽包含IL-15多肽或其片段，以及IL-15受体αsushi结合域。
46.权利要求45的工程化去核细胞，其中所述IL-15多肽或其片段和所述IL-15受体αsushi结合域以复合物存在。
47.权利要求45或46的工程化去核细胞，其中所述IL-15多肽或其片段和所述IL-15受体αsushi结合域以融合多肽存在。
48.权利要求45-47中任一项的工程化去核细胞，其中所述IL-15多肽或其片段通过接头与所述IL-15受体αsushi结合域连接。
49.权利要求48的工程化去核细胞，其中所述接头包含GGGGS(SEQ ID NO:11)。
50.权利要求48或49的工程化去核细胞，其中所述接头包含(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:12)。
51.权利要求47的工程化去核细胞，其中所述融合多肽包含与SEQ ID NO.2至少95％相同的氨基酸序列。
52.权利要求47的工程化去核细胞，其中所述融合多肽包含与SEQ ID NO.31至少95％相同的氨基酸序列。
53.权利要求37的工程化去核细胞，其还包含第二外源刺激性多肽。
54.权利要求53的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含4-1BBL。
55.权利要求54的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含与SEQ IDNO.41至少95％相同的氨基酸序列。
56.权利要求54的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含与SEQ IDNO.43至少95％相同的氨基酸序列。
57.权利要求53的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含IL-12。
58.权利要求57的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含融合多肽，所述融合多肽包含IL-12的p40和p35亚基。
59.权利要求57或58的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含与SEQ IDNO.37至少95％相同的氨基酸序列。
60.权利要求57或58的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含与SEQ IDNO.55至少95％相同的氨基酸序列。
61.权利要求37-60中任一项的工程化去核细胞，其还包含一种或多种选自下组的外源刺激性多肽：IL-1、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素α(IFNα)、脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)、CD48、人白细胞抗原(HLA)-A、HLA-C、HLA-G、硫酸类肝素(HS)、HLA-E、CpG、免疫球蛋白G(IgG)、UL16结合蛋白(ULBP)、MHC I类链相关蛋白(MIC)、B7-H6、NkP44L、Nectin2、NK-T-B抗原(NTBA)、激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
62.权利要求61的工程化去核细胞，其中所述MIC蛋白是MHC I类链相关蛋白A(MICA)或MHC I类链相关蛋白B(MICB)。
63.权利要求37-62中任一项的工程化去核细胞，其中所述外源刺激性多肽的一种或多种存在于所述工程化去核细胞的表面处。
64.权利要求37-63中任一项的工程化去核细胞，其中所述外源刺激性多肽足以刺激免疫杀伤细胞。
65.权利要求37-64中任一项的工程化去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。
66.权利要求53-60中任一项的工程化去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽以比所述第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。
67.权利要求53-60中任一项的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽以比所述第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。
68.权利要求53-60中任一项的工程化去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50或约100:1至1:100的丰度比。
69.权利要求37的工程化去核细胞，其还包含第二外源多肽和第三外源刺激性多肽。
70.权利要求53-69中任一项的工程化去核细胞，其中所述工程化去核细胞包含两种外源刺激性多肽，并且所述两种外源刺激性多肽以融合多肽存在。
71.权利要求53-69中任一项的工程化去核细胞，其中所述工程化去核细胞包含三种外源刺激性多肽，并且所述三种外源刺激性多肽以融合多肽存在。
72.权利要求37-71中任一项的工程化去核细胞，其中所述外源刺激性多肽的一种或多种还包含跨膜域。
73.权利要求72的工程化去核细胞，其中所述跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其跨膜部分。
74.权利要求72的去核细胞，其中所述跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分。
75.权利要求37-74中任一项的工程化去核细胞，其中所述工程化去核细胞能够刺激免疫细胞。
76.权利要求75的工程化去核细胞，其中所述免疫细胞是杀伤免疫细胞。
77.权利要求76的工程化去核细胞，其中所述杀伤免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。
78.权利要求77的工程化去核细胞，其中所述NK细胞是记忆样NK细胞。
79.权利要求76的工程化去核细胞，其中所述杀伤免疫细胞是CD8+T细胞。
80.权利要求79的工程化去核细胞，其中所述CD8+T细胞是记忆T细胞。
81.权利要求75的工程化去核细胞，其中刺激所述免疫细胞包括活化所述免疫细胞。
82.权利要求75的工程化去核细胞，其中刺激所述免疫细胞包括扩充所述免疫细胞。
83.权利要求37-82中任一项的工程化去核细胞，其是红系细胞。
84.权利要求83的工程化去核细胞，其中所述红系细胞是网织红细胞。
85.权利要求83的工程化去核细胞，其中所述红系细胞是红细胞。
86.工程化去核细胞，其至少包含第一外源刺激性多肽，其包含选自下组的多肽：MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
87.权利要求86的工程化去核细胞，其中所述去核细胞还包含第二外源多肽。
88.权利要求87的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽包含选自下组的多肽：IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-15/IL-15RA融合物、IL-18、IL-21、干扰素α(IFNα)、4-1BBL、脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)、CD48、HLA-A、HLA-C、HLA-G、硫酸类肝素(HS)、HLA-E、CpG、IgG、UL16结合蛋白(ULBP)、MHC I类链相关多肽(MIC)、B7-H6、NkP44L、Nectin2、NK-T-B抗原(NTBA)、激活诱导的C型凝集素(AICL)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
89.权利要求86-88中任一项的工程化去核细胞，其中所述外源刺激性多肽的一种或多种存在于所述工程化去核细胞的表面处。
90.权利要求86-89中任一项的工程化去核细胞，其中所述外源刺激性多肽足以刺激免疫杀伤细胞。
91.权利要求86的工程化去核细胞，其中所述外源刺激性多肽以大于104、105或106的拷贝数存在。
92.权利要求87或88的工程化去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽以比所述第二外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。
93.权利要求87或88的工程化去核细胞，其中所述第二外源刺激性多肽以比所述第一外源刺激性多肽的拷贝数大不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或大不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍的拷贝数存在。
94.权利要求87或88的工程化去核细胞，其中所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽具有按重量计或按拷贝数计约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50或约100:1至1:100的丰度比。
95.权利要求87的工程化去核细胞，其中所述去核细胞还包含第三外源刺激性多肽。
96.权利要求87-94中任一项的工程化去核细胞，其中所述工程化去核细胞包含两种外源刺激性多肽，并且所述两种外源刺激性多肽以融合多肽存在。
97.权利要求87-95中任一项的工程化去核细胞，其中所述工程化去核细胞包含三种外源刺激性多肽，并且所述三种外源刺激性多肽以融合多肽存在。
98.权利要求86-97中任一项的工程化去核细胞，其中所述外源刺激性多肽的一种或多种包含跨膜域。
99.权利要求98的工程化去核细胞，其中所述跨膜域包含血型糖蛋白A(GPA)或其跨膜部分。
100.权利要求98的工程化去核细胞，其中所述跨膜域包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜部分。
101.权利要求86-100中任一项的工程化去核细胞，其中所述工程化去核细胞能够刺激免疫细胞。
102.权利要求101的工程化去核细胞，其中所述免疫细胞是杀伤免疫细胞。
103.权利要求102的工程化去核细胞，其中所述杀伤免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。
104.权利要求103的工程化去核细胞，其中所述NK细胞是记忆样NK细胞。
105.权利要求102的工程化去核细胞，其中所述杀伤免疫细胞是CD8+T细胞。
106.权利要求105的工程化去核细胞，其中所述CD8+T细胞是记忆T细胞。
107.权利要求101的工程化去核细胞，其中刺激所述免疫细胞包括活化所述免疫细胞。
108.权利要求101的工程化去核细胞，其中刺激所述免疫细胞包括扩充所述免疫细胞。
109.刺激免疫杀伤细胞的方法，包括使所述免疫杀伤细胞与有效刺激所述免疫杀伤细胞的量的权利要求1-108中任一项的工程化去核细胞接触。
110.权利要求109的方法，其中所述免疫杀伤细胞是NK细胞。
111.权利要求109的方法，其中所述免疫杀伤细胞是CD8+T细胞。
112.权利要求110的方法，其中所述刺激包括活化所述NK细胞。
113.权利要求110的方法，其中所述刺激包括扩充所述NK细胞。
114.权利要求111的方法，其中所述刺激包括活化所述CD8+T细胞。
115.权利要求111的方法，其中所述刺激包括扩充所述CD8+T细胞。
116.权利要求111的方法，其中所述CD8+T细胞是记忆T细胞。
117.权利要求109-116中任一项的方法，其中所述接触在体内进行。
118.权利要求109-116中任一项的方法，其中所述接触离体进行。
119.权利要求109-116中任一项的方法，其中所述接触在体外进行。
120.权利要求109的方法，其中所述方法还包括将所述工程化去核细胞施用于需要免疫杀伤细胞活化的受试者。
121.权利要求120的方法，其中所述受试者患有癌症。
122.权利要求121的方法，其中所述癌症的特征在于低MHCI类呈递。
123.权利要求121的方法，其中所述癌症包括PD-1响应性肿瘤。
124.权利要求121的方法，其中所述癌症包括具有高突变负荷的肿瘤。
125.权利要求122的方法，其中所述受试者正在用降低MHC I类呈递的化学治疗剂治疗。
126.权利要求121的方法，其中所述癌症选自肺癌、肝细胞癌、黑素瘤和淋巴瘤。
127.权利要求121的方法，其中所述癌症包括淋巴瘤，并且所述淋巴瘤包括何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤。
128.权利要求120的方法，其中所述受试者患有传染病。
129.权利要求128的方法，其中所述传染病是由病毒感染引起的。
130.权利要求129的方法，其中所述病毒感染的特征在于低MHC I类呈递。
131.权利要求129的方法，其中所述病毒感染由选自下组的病毒引起：腺病毒、埃巴病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、结核病、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒和巨细胞病毒。
132.治疗受试者中的癌症的方法，包括以有效治疗所述受试者中的所述癌症的量向所述受试者施用权利要求1-108中任一项的工程化去核细胞。
133.权利要求132的方法，其中所述癌症包括低MHC I类呈递。
134.权利要求132的方法，其中所述癌症包括PD-1响应性肿瘤。
135.权利要求132的方法，其中所述癌症包括具有高突变负荷的肿瘤。
136.权利要求132的方法，其中所述癌症选自肺癌、肝细胞癌、黑素瘤和淋巴瘤。
137.权利要求132的方法，其中所述癌症包括淋巴瘤，并且所述淋巴瘤选自何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤。
138.治疗受试者中的传染病的方法，包括以有效治疗所述受试者中的所述传染病的量向所述受试者施用权利要求1-108中任一项的工程化去核细胞。
139.权利要求138的方法，其中所述传染病是由病毒感染引起的。
140.权利要求139的方法，其中所述病毒感染的特征在于MHC I呈递的下调。
141.权利要求139的方法，其中所述病毒感染由选自下组的病毒引起：腺病毒、埃巴病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、结核病、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒和巨细胞病毒。
142.经工程化改造以刺激免疫细胞的去核红系细胞，其中所述免疫细胞是杀伤细胞，其在所述工程化去核细胞的表面处包含两种或更多种外源刺激性多肽，其中所述两种或更多种外源刺激性多肽足以刺激所述免疫细胞，所述去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：
将两种或更多种各自编码所述外源刺激性多肽之一的外源核酸引入有核红系细胞中；和
在适合于所述有核红系细胞去核并且产生所述两种或更多种外源刺激性多肽的条件下培养所述有核红系细胞。
143.工程化去核红系细胞，其包含第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接以形成IL-15/IL-15RA融合物的IL-15多肽或其片段，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：
将编码所述IL-15/IL-15RA融合物的外源核酸引入有核红系细胞中；和
在适合于所述有核红系细胞的去核和产生所述IL-15/IL-15RA融合物的条件下培养所述有核红系细胞。
144.工程化去核红系细胞，其包含：
i.第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接以形成IL-15/IL-15RA融合物的IL-15多肽或其片段；和
ii.第二外源刺激性多肽，其中所述第二外源刺激性多肽包含4-1BBL或其片段，
其中所述细胞是通过包括以下项的方法产生的：
i.将编码所述第一外源刺激性多肽的第一外源核酸引入有核红系细胞中；
ii.将编码所述第二外源刺激性多肽的第二外源核酸引入所述有核红系细胞中；和
iii.在适合于所述有核红系细胞的去核并产生所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽的条件下培养所述有核红系细胞。
145.工程化去核红系细胞，其包含：
i.第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含通过接头与IL-15RA多肽的胞外部分或其片段连接以形成IL-15/IL-15RA融合物的IL-15多肽或其片段；和
ii.第二外源刺激性多肽，其中所述第二外源刺激性多肽包含IL-12或其片段，
其中所述细胞是通过包括以下项的方法产生的：
i.将编码所述第一外源刺激性多肽的第一外源核酸引入有核红系细胞中；
ii.将编码所述第二外源刺激性多肽的第二外源核酸引入所述有核红系细胞中；和
iii.在适合于所述有核红系细胞的去核并产生所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽的条件下培养所述有核红系细胞。
146.工程化去核红系细胞，其包含：
i.第一外源刺激性多肽，其中所述第一外源刺激性多肽包含4-1BBL或其片段；和
ii.第二外源刺激性多肽，其中所述第二外源刺激性多肽包含IL-12或其片段，
其中所述细胞是通过包括以下项的方法产生的：
i.将编码所述第一外源刺激性多肽的第一外源核酸引入有核红系细胞中；
ii.将编码所述第二外源刺激性多肽的第二外源核酸引入所述有核红系细胞中；和
iii.在适合于所述有核红系细胞的去核并产生所述第一外源刺激性多肽和所述第二外源刺激性多肽的条件下培养所述有核红系细胞。
147.权利要求143-146中任一项的工程化去核红系细胞，其中所述引入步骤包括用包含所述第一外源核酸和所述第二外源核酸两者的单一慢病毒载体转染所述有核细胞。
148.权利要求143-146中任一项的工程化去核红系细胞，其中所述引入步骤包括用包含所述第一外源核酸的第一慢病毒载体和包含所述第二外源核酸的第二慢病毒载体两者转染所述有核红系细胞。
149.工程化去核红系细胞，其在所述工程化去核细胞表面处包含至少一种选自下组的外源刺激性多肽：IL-15/IL-15RA融合物、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白的B(MICB)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)，所述工程化去核红系细胞通过包括以下项的方法产生：
将编码所述至少一种外源刺激性多肽的外源核酸引入有核红系细胞中；和
在适合于所述有核红系细胞的去核并产生所述至少一种外源刺激性多肽的条件下培养所述有核红系细胞。
150.权利要求142-149中任一项的方法，其中所述外源核酸包含DNA。
151.权利要求142-149中任一项的方法，其中所述外源核酸包含RNA。
152.权利要求142-149中任一项的方法，其中所述引入步骤包括病毒转导。
153.权利要求142-149中任一项的方法，其中所述引入步骤包括电穿孔。
154.权利要求142-149中任一项的方法，其中所述引入步骤包括利用以下中的一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
155.权利要求142-149中任一项的方法，其中所述引入步骤包括通过慢病毒载体的转染来引入所述外源核酸。
156.权利要求154或155的方法，其中所述慢病毒载体包含选自下组的启动子：β-球蛋白启动子、鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、长臂猿白血病病毒(GALV)启动子、人延伸因子1alpha(EF1alpha)启动子、CAG CMV立即早期增强子和鸡β-肌动蛋白(CAG)和人磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
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