JP2023059873A - T細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのcd7発現およびキメラ抗原受容体の遮断 - Google Patents

T細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのcd7発現およびキメラ抗原受容体の遮断 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、T細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのCD7発現およびキメラ抗原受容体の遮断に関する。【解決手段】本発明は、抗CD7キメラ活性化受容体(CAR)および抗CD7タンパク質発現ブロッカーを含む組成物、ならびに癌治療においてそのような組成物を使用する方法を提供する。【選択図】なし

Description

(関連出願の相互参照)
本願は、2016年11月22日に出願された米国特許仮出願第62/425,398号、2017年8月10日に出願された同第62/543,696号の利益を主張するものであり、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる。
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2017年11月21日に作成された上記ASCIIコピーは、名称が119419-5002-WO_ST25.txtであり、サイズが20,928バイトである。
キメラ抗原受容体(CAR)は、腫瘍細胞を特異的に認識して殺傷するように免疫細胞を転換することができる。CARは、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達分子に連結された抗体の一本鎖可変領域(scFv)によって構成された人工多分子タンパク質である。scFvがその同種抗原と連結すると、シグナル伝達が引き起こされ、CAR発現細胞傷害性Tリンパ球による腫瘍細胞の殺傷をもたらす(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5)。CAR発現自己Tリンパ球を用いた臨床試験は、B細胞不応性白血病およびリンパ腫の患者において陽性反応を示した(例えば、非特許文献6、非特許文献7)。
Eshhar Z,Waks T,et al.PNAS USA.90(2):720-724,1993 Geiger TL,et al.J Immunol.162(10):5931-5939,1999 Brentjens RJ,et al.Nat Med.9(3):279-286,2003 Cooper LJ,et al.Blood 101(4):1637-1644,2003 Imai C,et al.Leukemia.18:676-684,2004 Till B.G.et al.Blood 119(17):3940-3950,2012 Maude SL,et al.N Engl J Med.371(16):1507-1517,2014
T細胞悪性腫瘍を標的とするためのCAR技術の開発は、それらのB細胞対応物についてなされた進歩にかなり遅れている。T細胞悪性腫瘍に対する新規治療法が必要とされているが、現在までの進歩は遅い。特に、有効な免疫療法の選択肢は欠如しており、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)の治療は、集中的な化学療法および造血幹細胞移植に依存している。これらのアプローチの罹患率および死亡率にもかかわらず、結果は満足できるものではない。
要するに、T細胞悪性腫瘍患者のための新規治療選択肢に対する未だ満たされていない大きな必要性がある。
一態様では、本発明は、(i)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、その標的結合分子は、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、核酸と、(ii)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、CARは、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に特異的に結合する第2の抗体と、を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、CD7に特異的に結合する第1の抗体は、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)である。特定の実施形態では、CD7に特異的に結合する第2の抗体は、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)である。
いくつかの実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。特定の実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FASまたはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む小胞体(ER)保持配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含むCD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、標的結合分子(例えば、scFv)のプロテアソーム局在化は、scFv配列を三要素モチーフ含有21(TRIM21)標的ドメイン配列に連結し、ヒトTRIM21 E3ユビキチンリガーゼタンパク質をコードする核酸配列を共発現することによって達成される。
いくつかの実施形態では、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列を含み、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。さらに他の実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。
別の態様では、本発明は、(i)局在化ドメインに連結された標的結合分子であって、その標的結合分子は、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、標的結合分子と、(ii)キメラ抗原受容体(CAR)であって、CARは、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびCD7に特異的に結合する第2の抗体を含む、CARと、を含む、遺伝子操作免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、CD7に特異的に結合する第1の抗体は、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)である。特定の実施形態では、CD7に特異的に結合する第2の抗体は、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)である。
いくつかの実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。特定の実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FASまたはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む小胞体(ER)保持配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含むCD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列を含み、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。さらに他の実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞を作製する方法を提供する。本方法は、(i)免疫細胞に、(a)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸であって、前記標的結合分子は、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、第1の核酸と、(b)CARをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸であって、CARは、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびCD7に特異的に結合する第2の抗体を含む、第2の核酸と、を導入することと、(ii)局在化ドメインに連結された標的結合分子およびCARを含む遺伝子操作免疫細胞を単離し、それによって遺伝子操作免疫細胞を作製することと、を含む。
さらに別の態様では、本発明は、治療を必要とする被験体(例えば、患者)における癌を治療する方法を提供し、その方法は、治療量の遺伝子操作免疫細胞を患者に投与することと、それによって治療を必要とする被験体の癌を治療することと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、(i)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、その標的結合分子は、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、核酸と、(ii)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、CARは、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびCD7に特異的に結合する第2の抗体を含む、核酸と、を含む。
いくつかの実施形態では、CD7に特異的に結合する第1の抗体は、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)である。特定の実施形態では、CD7に特異的に結合する第2の抗体は、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)である。
いくつかの実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。特定の実施形態では、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FASまたはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む小胞体(ER)保持配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含むCD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号3のアミノ酸配列を含み、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。さらに他の実施形態では、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)は、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、または髄腔内投与によってその被験体(例えば、患者)に投与される。
いくつかの実施形態では、癌は、T細胞悪性腫瘍である。一実施形態では、T細胞悪性腫瘍は、早期T細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)である。
本開示は、T細胞血液悪性腫瘍を治療するための遺伝子操作免疫細胞およびその使用方法を提供する。当業者は、CAR T細胞の自己殺傷または同族殺傷および正常T細胞の殺傷が、CAR-Tエフェクター細胞がT細胞白血病を治療するために使用されるときに起こり得ることを認識する。そのようにして、T細胞同族殺傷を最小化または排除する遺伝子操作免疫細胞および治療方法が必要とされている。
本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞および治療方法は、遺伝子操作された抗CD7 PEBL細胞および抗CD7 CAR-T細胞などの新規同族殺傷耐性CAR-T細胞を利用する。遺伝子操作免疫細胞は、再発性T細胞悪性腫瘍を含むT細胞悪性腫瘍患者において強力かつ持続的な治療効果を引き出すことができる。そのような細胞は、顕著なエフェクターT細胞同族殺傷なしで悪性T細胞の効率的な標的化および殺傷をもたらすことができる。
図1A~図1D。T-ALLにおけるCD7発現を例示する図である。診断時、再発時、および化学療法中(MRD)にCD7を発現するALL細胞の割合であり、それぞれの段階で試験した骨髄試料の数を示す(図1A)。同じ試料からのT-ALL細胞および残存正常T細胞におけるCD7平均蛍光強度(MFI)(n=19、対応のあるt検定によりP<0.0001)(図1B)。診断時または再発時のT-ALL細胞(「D/R」)およびMRDを有する追跡骨髄試料におけるCD7 MFIである(n=18)(図1C)。フローサイトメトリー等高線図は、代表的な1人の患者における診断時、MRDおよび再発時のT-ALL細胞(CD3陰性)および正常T細胞(CD3陽性)におけるCD7発現を示す(図1D)。 図2A~図2E。抗CD7 CARの設計、発現およびシグナル伝達を示す図である。抗CD7-41BB-CD3ζ構築物の模式図である(図2A)。GFP単独(「Mock」)またはGFPに加えて抗CD7 CARのいずれかで形質導入されたJurkat細胞のフローサイトメトリー分析である。ドットプロットは、GFP蛍光、ならびにビオチン結合ヤギ抗マウスF(ab’)2抗体およびストレプトアビジン-APC(Jackson ImmunoResearch)による染色後のCAR発現を示す(図2B)。Jurkat細胞におけるCAR発現のウェスタンブロット分析である(図2C)。mck形質導入およびCAR形質導入Jurkat細胞の細胞溶解物を、還元条件下または非還元条件下で10%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロットした膜を、マウス抗ヒトCD3ζ抗体(8D3,BD Biosciences)および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスIgG(R&D Systems)をプローブとして精査した。抗体結合は、Clarity Western EC基質(Bio-Rad)を用いて明らかにした。抗CD7 CARは、連結時に活性化マーカーの発現を誘導する。バーは、CD7+ MOLT-4細胞の存在下または非存在下で24時間後のCAR形質導入およびmock形質導入Jurkat細胞におけるCD25およびCD69 MFIの平均(±SD)を示す。t検定によるP値を有意差について示す(*=0.016、***<0.001)(図2D)。図2Eは、図2Dに示す実験の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを提示する。 図3A~図3I。ヒト末梢血T細胞における抗CD7 CARの発現が、CD7の下方制御によって防止される同族殺傷をもたらすことを示す図である。抗CD7 CAR mRNAの存在下または非存在下でのエレクトロポレーション後の24時間に回収した生存T細胞の割合である(n=7)(図3A)。生存細胞をフローサイトメトリーによって計数した。GFP単独で形質導入された同一ドナー由来の細胞(「Mock」)と比較して、レトロウイルスベクターによるCAR形質導入後の24時間に回収した生存T細胞の割合である(n=10)(図3B)。形質導入後の週の間に回収した、CAR形質導入またはmock形質導入した生存T細胞の割合である(図3C)。図3Bに示した10の実験のうち5つについての追跡結果を示す。抗CD7 CAR mRNAの存在下または非存在下でのエレクトロポレーション後のT細胞中のCD107aの割合である(図3D)。3回測定の平均(±SD)を示す。抗CD7タンパク質発現ブロッカー(PEBL)構築物の概略図(図3E)。代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、3種の抗CD7 PEBLのレトロウイルス形質導入後のTリンパ球、またはmock形質導入GFP単独(「Mock」)におけるCD7発現を示す(図3F)。 T細胞を抗CD7-PE(M-T701;BD Biosciences)で染色した。抗CD7 PEBL-1がレトロウイルスで形質導入された、またはmock形質導入されたT細胞におけるCD7発現の割合(n=5)である(図3G)。フローサイトメトリードットプロットは、CAR mRNAの存在下または非存在下でのエレクトロポレーション後の12時間の抗CD7-41BB-CD3ζ CARの発現と共に、PEBL形質導入によるT細胞におけるCD7発現の下方制御を示す(図3H)。細胞をビオチン結合ヤギ抗マウスF(ab’)2抗体およびストレプトアビジン-APC(Jackson ImmunoResearch)で染色した。抗CD7 CAR mRNAでエレクトロポレーションされたが抗CD7 PEBLを含まないベクターで形質導入された細胞と比較して、抗CD7 CAR mRNAのエレクトロポレーション後の24時間に回収した抗CD7 PEBLで形質導入された生存T細胞の割合である(n=6)(図3I)。生存細胞数をフローサイトメトリーにより測定した。**、P<0.01。***、P<0.001。 図4A~図4F。PEBLによるCD7下方制御がT細胞表現型、増殖および機能性を変化させなかったことを示す図である。抗CD7 PEBLまたはGFP単独(「Mock」)のいずれかによるレトロウイルス形質導入後の7~14日目のCD4およびCD8細胞の割合である(図4A)。それぞれの記号は、異なるT細胞ドナーに対応する。(3人のドナー由来の)PEBL形質導入およびmock形質導入T細胞の増殖速度は、200IU/mLのIL-2で14日間維持された(図4B)。記号は、3回測定の平均値(±SD)を表す。PEBL形質導入およびmock形質導入T細胞を抗CD19-41BB-CD3ζ CAR mRNAの存在下またはmRNAの非存在下のいずれかでエレクトロポレーションした(図4C)。フローサイトメトリードットプロットは、エレクトロポレーション後の12時間のGFPおよびCAR発現を示す。CARは、ビオチン結合ヤギ抗マウスF(ab’)2抗体およびストレプトアビジン-APC(Jackson ImmunoResearch)を用いて検出した。 抗CD19 CAR mRNAの存在下または非存在下でエレクトロポレーションしたPEBL形質導入またはmock形質導入T細胞のCD19+ ALL細胞(OP-1)に対する細胞傷害性である(図4D)。バーは、1:1 E:Tにおける4時間の細胞傷害性の平均(±SD)を示す。図4Eは、図4Dに記載された実験と同一の実験からのT細胞におけるCD107a発現を示す。図4Fは、抗CD19 CAR mRNAの存在下または非存在下でエレクトロポレーションし、E:T 1:1で6時間、OP-1と共培養した、PEBL形質導入またはmock形質導入T細胞におけるIFNγ産生を示す。バーは、3回の実験の平均(±SD)を表す。***、P<0.001。****、P<0.0001。 図5A~図5F。抗CD7 CARの発現後、PEBLによって下方制御されたCD7を有するT細胞がCD7+白血病細胞に対して強力な細胞傷害性を獲得することを示す図である。抗CD7 CAR mRNAの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした抗CD7 PEBL形質導入T細胞のCD7+細胞株に対する細胞傷害性である(図5A)。1:1 E:Tにおける4時間アッセイのデータを示す。記号は、MOLT-4、CCRF-CEMおよびJurkatについて4人のドナー由来、ならびにLoucyおよびKG1aについて5人のドナー由来のT細胞をそれぞれ用いた3回の測定の平均を示す(それぞれの比較についてP<0.001)。T-ALL患者由来の初代白血病細胞に対する、抗CD7 CAR mRNAの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした抗CD7 PEBL形質導入T細胞の細胞傷害性である(図5B)。示されたE:Tにおける4時間アッセイのデータを示す。記号は、3回の測定の平均(±SD)を指す。図5Cは、抗CD7 CAR mRNAによるエレクトロポレーション後、5つのCD7+細胞株に対する、抗CD7 PEBLまたはGFP単独(「Mock」)のいずれかで形質導入されたT細胞の全体的な特異的細胞傷害性を示す。3人のドナー由来のT細胞を1:1 E:Tにおいて4時間アッセイで試験した。それぞれの記号は、mRNA非存在下でエレクトロポレーションした同じT細胞で得られたパーセント細胞傷害性を差し引いた後の、CD7+細胞株に対する特異的パーセント細胞傷害性を表す。水平バーは、それぞれのグループの中央値を示す。3人のドナー由来の抗CD7 PEBL形質導入またはmock形質導入T細胞を、抗CD7 CAR mRNAの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした(図5D)。MOLT-4に対する細胞傷害性は、1:1 E:Tにおいて4時間アッセイで試験した。抗CD107a-PE(H4A3,BD Biosciences)の平均蛍光強度(MFI)を示す。バーは、3回の実験の平均(±SD)を表す。 抗CD7 PEBL形質導入T細胞を抗CD7 CAR形質導入またはmock形質導入のいずれかでレトロウイルス形質導入し、T-ALL患者由来の初代白血病細胞に対して試験した(図5E)。それぞれの記号は、3回の実験の平均(±SD)を表す。抗CD7 CARの存在下または非存在下で順次形質導入されたmock形質導入またはPEBL形質導入T細胞を、単独でまたはStreck処理MOLT-4細胞の存在下で培養し、120IU/mLのIL-2を毎週添加した(図5F)。記号は、3回の培養における投入細胞数に対する細胞回収率の平均(±SD)を示す。**、P<0.01、***、P<0.001、****、P<0.0001 図6A~図6D。抗CD7-41BB-CD3ζ CARを発現するPEBL形質導入T細胞が異種移植片に抗腫瘍活性を及ぼすことを示す図である。NOD-SCID-IL2RGnullマウスにルシフェラーゼで標識された1×10個のCCRF-CEM細胞を静脈内(i.v.)注入した。2×10個のPEBL-CAR T細胞を、白血病細胞注入後7日目(図6A)、または3日目および7日目(図6B)に、それぞれ3匹および5匹のマウスに静脈内投与した。残りのマウスは、mock形質導入T細胞、または細胞の代わりにRPMI-1640(「対照」)のいずれかを受けた。全てのマウスは、2日に1回、腹腔内(i.p.)に20,000IUのIL-2を受けた。D-ルシフェリン腹腔内注入後の白血病細胞増殖のインビボイメージングを示す。図6Bの3日目のマウスの腹部画像は、全てのマウスにおいてCCRF-CEM生着を明示するために感度を高めて示されている。発光画像の完全な組を図14に示す。図6Cは、図6Aおよび図6Bに示したマウスにおける、1秒当たりの光子数として表した白血病細胞増殖を示す。それぞれの記号は、それぞれのマウスにおける生物発光測定値に対応し、CAR-T細胞注入前の全てのマウスにおける腹側プラス背側シグナルの平均に対して正規化されている。カプラン-マイヤー曲線は、異なる群(それぞれの群において8匹)におけるマウスの全生存率を示す(図6D)。総生物発光シグナルが毎秒1×1010光子に達したときにマウスを安楽死させた。ログランク検定によって計算されたP値である。 図7A~図7E。患者由来異種移植片(PDX)モデルにおけるETP-ALLに対するPEBL-CAR-T細胞活性を示す図である。NOD-SCID-IL2RGnullマウスにおいて事前に増殖させた初代ETP-ALL細胞を、10匹のNOD-SCID-IL2RGnullマウスにマウス当たり2×10細胞で静脈内(i.v.)注入した(図7A)。5匹のマウス(「対照」)は未処置のままにした。残りの5匹のマウスは、示された時点(灰色の矢印)でPEBL-CAR T細胞の単回静脈内注入(PEBL-CAR#1では2×10個、残りの4匹のマウスでは2×10個)および2日ごとに20,000IUのIL-2を受け、5匹の対照マウスのうち2匹にIL-2もまた投与した。黒い記号(左y軸)は、末梢血中で計数されたETP-ALL細胞数/mLを示す。灰色の記号(右y軸)は、PEBL-CAR T細胞の数を示す。血液単核細胞中のETP-ALL細胞の割合が≧80%に到達したとき、マウスを安楽死させた。5匹の未処置マウスの様々な臓器におけるETP-ALL(分母、全ヒト+マウスCD45+細胞)の割合である(図7B)。T細胞注入後7日目の処置(PEBL-CAR#1)および未処置のETP-ALLの血液塗抹標本であり、汚れ細胞は、PEBL-CAR T細胞後の血中で顕著であった(図7C)。 フローサイトメトリードットプロットは、ETP-ALLを有する未処置対照マウスの組織におけるCD7+ CD3- ETP-ALL細胞の存在、およびPEBL-CAR-T細胞により処置したPEBL-CAR#1マウスにおけるCD7- CD3+ PEBL-CAR T細胞の存在を示す(図7D)。処置マウスではETP-ALL(<0.01%)が検出されなかった。示した事象は、対照マウスに示した対応するプロットについて得られた事象に対して正規化した。処置マウス(PEBL-CAR#1)および未処置マウスの脾臓である(図7E)。 図8A~図8C。抗CD7-41BB-CD3ζ CARの特異性および機能を示す図である。OP-1(CD7-)およびMOLT-4(CD7+)は、抗CD7 scFvで形質導入された、またはGFP単独を含有するベクターで形質導入された(「対照」)、Jurkat細胞から採取した上清と共にインキュベートした(図8A)。洗浄後、細胞をビオチン結合ヤギ抗マウスF(ab’)2抗体、続いてストレプトアビジン-APC(Jackson ImmunoResearch)と共にインキュベートした。フローサイトメトリーヒストグラムは、抗CD7 scFvのMOLT-4への結合を示すが、OP-1への結合は示さない。Jurkat細胞は、抗CD7-41BB-CD3ζ CAR、抗CD19-41BB-CD3ζ CAR、またはGFP単独を含有するベクターで形質導入された(図8B)。これらの細胞を1:1 E:TにおいてCD7+ MOLT-4またはCCRF-CEM細胞、またはCD7-細胞OP-1と共培養した。標的細胞をカルセイン赤橙色AM(Invitrogen)で標識した。30分のインキュベーション後、細胞ダブレットの百分率をフローサイトメトリーによって測定した。バーは、3回測定の平均(±SD)を示す。図8Cは、標的細胞を可溶性形態の抗CD7 scFvと共にプレインキュベートすることによって、CAR媒介細胞凝集が阻害されることを示す。*** P<0.001。 図9A~図9B。ヒト末梢血Tリンパ球における抗CD7-41BB-CD3ζ CARの発現を示す図である。図9Aは、DynabeadsヒトTアクチベーターCD3/CD28(ThermoFisher Scientific)およびIL-2で7日間活性化し、抗CD7 CARで形質導入されたTリンパ球の代表的なフローサイトメトリードットプロットを提示する。フローサイトメトリードットプロットは、GFP蛍光およびCAR発現を示し、後者では、ビオチン結合ヤギ抗マウスF(ab’)2抗体、続いてストレプトアビジン-APC(Jackson ImmunoResearch)で染色することにより明らかにされた。図9Bは、CAR発現のウェスタンブロット分析を示す。mock形質導入およびCAR形質導入T細胞の細胞溶解物を、還元条件下または非還元条件下で10%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロットした膜を、マウス抗ヒトCD3ζ抗体(8D3;BD Biosciences)、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスIgG(R&D Systems)をプローブとして精査した。抗体結合は、Clarity Western EC基質(Bio-Rad)を用いて明らかにした。 図10A~図10B。抗CD7 PEBLによるCD7タンパク質発現の下方制御を示す図である。フローサイトメトリードットプロットは、GFP発現(x軸)、CD7発現(y軸、上段)、および細胞内抗CD7 PEBL-1発現(y軸、下段)を示す(図10A)。Tリンパ球を抗CD7 PEBL-1またはGFP単独(「Mock」)を含むベクターによりレトロウイルス形質導入した。T細胞をフィコエリトリンに結合した抗CD7抗体(M-T701,BD Biociences)により染色した。PEBL-1の細胞内発現を、ER結合モチーフに組み込まれた配列EQKLISEEDL(配列番号40)に結合するPE結合抗Myc抗体(9B11;Cell Signaling Technology)を用いて試験した。抗体標識の前に、細胞を8E試薬(出願人の研究室で開発された透過処理試薬)で透過処理した。図10Bは、CD7 mRNA発現のRT-PCR分析を示す。PEBL1-3、GFP単独(「mock」)で形質導入された、または形質導入されていない(「WT」)Jurkat細胞から抽出した全mRNA由来のcDNAを鋳型として使用した。CD7 cDNA(723bp)を以下のプライマーを用いて増幅した。フォワードは、ATGGCCGGGCCTCCG(配列番号38)、リバースは、TCACTGGTACTGGTTGGG(配列番号39)である。SYBR Safe Gel Stain(ThermoFisher)を用いて1%アガロースゲル上で電気泳動を行った。テンプレート対照もまた示していない。対照として、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の87bp(676~762番目のヌクレオチド)領域を並行して増幅した。 図11A~図11B。抗CD7 CARシグナルが、抗CD7 PEBLによるCD7ノックダウン発現を伴うT細胞においてより高いサイトカイン分泌を誘発したことを示す図である。3人のドナー由来のTリンパ球を抗CD7 PEBLまたはGFP単独(「Mock」)で形質導入し、抗CD7-41BB-CD3ζ mRNA存在下またはmRNA非存在下のいずれかでエレクトロポレーションした。MOLT4と6時間共培養した後のT細胞における細胞内IFNγ(図11A)およびTNFα(図11B)の発現を測定した。バーは三重のMFI測定値の平均(±SD)を表す。**、P<0.01。***、P<0.001。****、P<0.0001。 抗CD7-41BB-CD3ζ CARを発現するCD7陰性T細胞がCD7+細胞株に対して抗腫瘍細胞傷害性を及ぼしたことを示す図である。抗CD7 PEBLで形質導入し、次いでCD7-41BB-CD3ζまたはGFP単独(「Mock」)のいずれかで形質導入されたT細胞により実施した4時間細胞傷害性アッセイの結果を示す。記号は、示されたE:T比における3回の実験の平均(±SD)を表す。全ての比較についてP<0.001である。 図13A~図13E。抗CD7-41BB-CD3ζおよび抗CD19-41BB-CD3ζ CARの機能比較を示す図である。図13Aは、予め抗CD7 PEBLで形質導入された末梢血T細胞における抗CD19および抗CD7 CAR(mCherry含有ベクター中)の発現を示す。フローサイトメトリードットプロットは、mCherry発現と、ビオチン結合ヤギ抗マウスF(ab’)2抗体、続いてアロフィコシアニンに結合されたストレプトアビジンによるT細胞の染色と、を示す(Jackson ImmunoResearch)。mCherry単独(「Mock」)を含むベクターで形質導入されたT細胞を用いた結果もまた示した。CD19およびGFPを含有するベクターで形質導入されたCCRF-CEM細胞およびJurkat細胞におけるCD19の発現である(図13B)。CD19を抗CD19 APC(Miltenyi Biotech)で検出した。異なるE:T比で抗CD19または抗CD7 PEBL-CAR-T細胞によりCD19+ CCRF-CEMまたはCD19+ Jurkat細胞を標的とする4時間細胞傷害性アッセイである(図13C)。記号は、3回測定の平均(±SD)を示す。全てのE:T比において、CAR対mock形質導入T細胞のいずれかを用いたデータについて、P<0.001である。 IncuCyte Zoom System(Essen Bioscience)を用いた生細胞画像分析によって測定された、異なるE:T比での抗CD19または抗CD7 PEBL-CAR-T細胞の長期細胞傷害性である(図13D)。記号は、CAR-T細胞、mock形質導入T細胞を含むか、またはT細胞を含まないウェル中のCD19+ CCRF-CEM(上)またはCD19+ Jurkat細胞(下)の3回の測定の平均値(±SD)を示す。測定を4時間間隔で行った。CD19+ Jurkat細胞との共培養を伴うか、また伴わない抗CD19および抗CD7 PEBL-CAR-T細胞の増殖能である(図13E)。抗CD19または抗CD7 CARまたはmCherry単独で順次形質導入した抗CD7 PEBL形質導入T細胞を、単独でまたは照射CD19+ Jurkat細胞の存在下で培養し、毎週120IU/mLのIL-2を添加した。記号は、3回の培養における投入細胞数に対する細胞回収の平均(±SD)百分率を示す。 図14A~図14C。マウスモデルにおいて抗CD7-41BB-CD3ζ CARを発現するPEBL形質導入T細胞が抗腫瘍活性を及ぼしたことを示す図である。NOD-SCID-IL2RGnullマウスにルシフェラーゼで標識された1×10個のCCRF-CEM細胞を静脈内注入した。2×10個のPEBL-CAR T細胞を、白血病細胞注入後7日目(図14A)または3日目および7日目(図14B)に、それぞれ3匹および5匹のマウスに静脈内投与した。残りのマウスは、mock形質導入T細胞、または細胞の代わりにRPMI-1640(「対照」)のいずれかを受けた。全てのマウスは、2日に1回、腹腔内(i.p.)に20,000IUのIL-2を受けた。白血病細胞増殖のインビボイメージングを、D-ルシフェリンの腹腔内注入後に行った。図14Bの3日目のマウスの腹部画像は、全てのマウスにおいて白血病細胞の生着を明示するために感度を高めて示されている。 白血病細胞増殖は、CAR-T細胞注入前の全てのマウスにおける腹側シグナルと背側シグナルとの加算の平均に対して正規化された、経時的な毎秒光子数として表された(図14C)。それぞれの記号は、それぞれのマウスの生物発光測定に対応する。 図15A~図15B。抗CD7-41BBCD3ζ CARを発現するPEBL形質導入T細胞が、マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を及ぼし、再発時に採集された細胞に対する活性を維持したことを示す図である。図15Aは、ルシフェラーゼで標識したCCRF-CEM細胞を静脈内注入し、次いで、図6Cについて記載したように、PEBL-CAR形質導入T細胞、mock形質導入T細胞、または細胞の代わりにRPMI-1640(「対照」)のいずれかで静脈内処置したNOD-SCID-IL2RGnullマウス由来の血液中の白血球中のCCRF-CEM細胞の割合を示す。「対照」および「Mock」については、白血病細胞注入後17~23日目の1010光子/秒の生物発光閾値に達した安楽死させたマウスから血液を得た。PEBL-CARマウスについては、CCRF-CEM注入後24日目に頬穿刺を介して血液を得た。PEBL-CARで処置したマウスの脾臓および肝臓から再発時に採集したCCRF-CEM細胞を2日間培養した(図15B)。次にそれらを注入に本来使用されたPEBL-CAR形質導入またはmock形質導入T細胞を使用するE:T 1:1での4時間細胞傷害性アッセイにおける標的として使用した。異種移植片を作製するために使用された同じバッチのCCRF-CEM発現ルシフェラーゼ細胞でもまた比較を行った。パーセント細胞傷害性は、BrightGloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を添加後、生物発光シグナルのプレート測定から決定した。バーは、3回測定値の平均(±SD)を示し、白および灰色のバーのそれぞれは、1匹のマウス由来の細胞に対応する。 診断時およびNOD-SCID-IL2RGnullマウスにおける増殖後のETP-ALLの免疫表現型の特徴を示す図である。フローサイトメトリー等高線図は、この研究においてPDXモデルを開発するために使用されたETP-ALLの免疫表現型診断骨髄試料、および図7に示した対照マウスのうちの1匹の脾臓から回収されたETP-ALL細胞の免疫表現型診断骨髄試料を示す。以下の抗体を使用した。全てBD Biosciences製のCD7-PE、CD45-APC-H7、CD34-PerCP、CD8-BV510、CD5-PE-Cy7、CD3-PerCP(細胞質染色用)、CD3-V450(表面染色用)、CD33-BV421(Biolegend)、CD1a-PE(Beckman Coulter)。象限は、同じ蛍光色素に結合されたアイソタイプ一致非反応性抗体による染色に基づいて描かれた。 本発明の例示的な実施形態の概略図である。
本発明の例示的な実施形態の説明は、以下の通りである。
本発明は、T細胞悪性腫瘍の一次マーカーであり、早期T細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)を含むT細胞ALLの全症例において高度に発現される、40kDaのI型膜貫通糖タンパク質である、CD7に対するキメラ抗原受容体(CAR)の設計に部分的に基づく。本明細書に記載されたように、抗CD7 CARは、T細胞がT細胞悪性腫瘍に対して特異的な細胞傷害性を及ぼすように誘導する。さらに、抗CD7 CARをエフェクターT細胞上のCD7発現の下方制御と組み合わせて使用したとき、T細胞の細胞傷害性が著しく増加することが示された。本明細書に明示されたように、CD7の下方制御(例えば、除去、減少、および/または再局在化)は、対応する抗CD7 CARによって及ぼされる同族殺傷効果を防ぎ、標的抗原(例えば、CD7)を保持した細胞と比較してCAR発現後のT細胞回収をより多くし、T白血病/リンパ腫細胞に対するより効果的な細胞傷害性をもたらす。
したがって、一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む遺伝子操作免疫細胞に関し、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群7(CD7)に特異的に結合する抗体と、を含む。本発明のCARは、本明細書において「抗CD7-41BB-CD3ζ」と称する場合がある。例示的な実施形態を図17に示す。
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作」免疫細胞は、天然に存在する免疫細胞と比較して遺伝的に改変されている免疫細胞を含む。例えば、本発明の方法に従って製造された遺伝子操作T細胞は、そのヌクレオチド配列が由来するT細胞中に天然には存在しないヌクレオチド配列を含む核酸を保有する。
特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、遺伝子操作T細胞である。本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、複数のヌクレオチドモノマー(例えば、リボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー)を含むポリマーを指す。「核酸」には、例えば、ゲノムDNA、cDNA、RNA、およびDNA-RNAハイブリッド分子が挙げられる。核酸分子は、天然に存在するもの、組換え型のもの、または合成のものであり得る。さらに、核酸分子は一本鎖、二本鎖または三本鎖であり得る。特定の実施形態では、核酸分子を修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子のいずれかの鎖または両方の鎖を指すことができる。
核酸に関して「ヌクレオチド配列」という用語は、リン結合(例えば、ホスホジエステル、アルキルホスホナートおよびアリールホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル結合)および/または非リン結合(例えば、ペプチド結合および/またはスルファマート結合)などの共有結合によって連結されている連続した一連のヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、例えば、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、非相同配列(例えば、異なる種または細胞型起源のものである遺伝子)である。
用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、ならびに天然に存在しないそれらの誘導体および類似体を指す。したがって、ヌクレオチドは、例えば、天然に存在する塩基(例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、またはデオキシシチジン)を含むヌクレオチドおよび当技術分野で公知の修飾塩基を含むヌクレオチドを含むことができる。
当業者に理解されるように、いくつかの態様では、核酸は、プラスミド配列をさらに含む。プラスミド配列は、例えば、プロモーター配列、選択マーカー配列、または遺伝子座標的化配列のうちの1つ以上の配列を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」とは、改変されているかもしくは遺伝子操作されている、またはヒト抗体である、インタクトな抗体または抗原結合フラグメントを含む、インタクトな抗体または抗体の抗原結合フラグメントを意味する。改変されたまたは遺伝子操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、多パラトピック抗体(例えば、バイパラトピック抗体)、および多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)である。抗原結合フラグメントの例には、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv、一本鎖抗体(例えば、scFv)、ミニボディおよびダイアボディが挙げられる。
「特異的に(または選択的に)結合する」または「特異的な(または選択的な)免疫反応性」という用語は、タンパク質またはペプチドを指すとき、多くの場合、タンパク質とその他の生物製剤との不均一集団において、タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より一般的にはバックグラウンドの10倍から100倍を超える量で特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対する抗体の特異性について選択された抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応し、かつ他のタンパク質とは免疫反応しないポリクローナル抗体のみを得るために選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成されてもよい。様々なイムノアッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択してもよい。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用されている(例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明について、Harlow&Lane、Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)を参照のこと)。
特定の実施形態では、CD7に結合する抗体は、一本鎖可変フラグメント抗体(「scFv抗体」)である。scFvは、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。全般的に、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの総説については、Pluckthun(1994)「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,New York,pp.269-315を参照されたい。また、国際出願PCT/WO88/01649号ならびに米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照されたい。当業者には理解されるように、様々な好適なリンカーを、当技術分野で提供されているように、また本明細書に開示されているように、最適な機能について設計かつ試験することができる。
特定の実施形態では、抗CD7 scFvは、それぞれ配列番号1および配列番号2に記載のVH配列およびVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性をそれぞれ有するアミノ酸配列を有する、可変重鎖(重鎖可変領域またはVH)および可変軽鎖(軽鎖可変領域またはVL)を含む。重鎖可変領域は、配列番号1のVH配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号2のVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含み得る。いくつかの場合では、重鎖可変領域は、配列番号1に記載の配列中に少なくとも1個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上)のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号1に記載の配列中に10個以下のアミノ酸(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個)の置換を含む。いくつかの場合では、軽鎖可変領域は、配列番号2に記載の配列中に少なくとも1個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上)のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、軽鎖可変領域は、配列番号2に記載の配列中に10個以下のアミノ酸(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個)の置換を含む。いくつかの実施形態では、VHをコードする核酸配列は、配列番号23に記載の核酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む。他の実施形態では、VLをコードする核酸配列は、配列番号24に記載の核酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む。
特定の実施形態では、抗CD7 scFvは、それぞれ配列番号14および配列番号15に記載のVH配列およびVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性をそれぞれ有する配列を有する、可変重鎖(重鎖可変領域またはVH)および可変軽鎖(軽鎖可変領域またはVL)を含む。重鎖可変領域は、配列番号14のVH配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号15のVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含み得る。
場合によっては、重鎖可変領域は、配列番号14に記載の配列中に少なくとも1個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上)のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号14に記載の配列中に10個以下のアミノ酸(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)の置換を含む。いくつかの場合では、軽鎖可変領域は、配列番号15に記載の配列中に少なくとも1個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9個、またはそれ以上)のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号15に記載の配列中に10個以下のアミノ酸(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)の置換を含む。
いくつかの実施形態では、VHをコードする核酸配列は、配列番号25に記載の核酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む。他の実施形態では、VLをコードする核酸配列は、配列番号26に記載の核酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む。
特定の実施形態では、抗CD7 scFvは、それぞれ配列番号16および配列番号17に記載のVH配列およびVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性をそれぞれ有する配列を有する、可変重鎖(重鎖可変領域またはVH)および可変軽鎖(軽鎖可変領域またはVL)を含む。重鎖可変領域は、配列番号16のVH配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号17のVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含み得る。
いくつかの場合では、重鎖可変領域は、配列番号16に記載の配列中に少なくとも1個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上)のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号16に記載の配列中に13個以下のアミノ酸(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13個)の置換を含む。いくつかの場合では、軽鎖可変領域は、配列番号17に記載の配列中に少なくとも1個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上)のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号17に記載の配列中に5個以下のアミノ酸(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個)の置換を含む。いくつかの実施形態では、VHをコードする核酸配列は、配列番号27に記載の核酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む。他の実施形態では、VLをコードする核酸配列は、配列番号28に記載の核酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のscFvは、抗CD7抗体の可変重鎖配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有する可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のscFvは、抗CD7抗体の可変軽鎖配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含む。例えば、抗CD7抗体は、当業者によって認識されている任意のそのような抗体であり得る。
Figure 2023059873000001

Figure 2023059873000002

Figure 2023059873000003

Figure 2023059873000004

「配列同一性」という用語は、デフォルトギャップ重みを使用するプログラムGAPまたはBESTFITなどによって最適に整列されたとき、2つのヌクレオチド配列または2つのアミノ酸配列が少なくとも70%の配列同一性、または少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%以上の配列同一性を共有することを意味する。配列比較のために、一般的には、一方の配列は、参照配列(例えば、親配列)の役割を果たし、その参照配列に対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、必要な場合、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列(複数可)のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith&Waterman、Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman&Wunsch、J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson & Lipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似性法の検索によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピューター化された実装、または目視検査(全般的には、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい)によって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムであり、このアルゴリズムは、Altschul et al,J.Mol.Biol.215:403(1990)に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である(国立衛生研究所NCBIインターネットサーバを通して公的にアクセス可能)。一般的に、デフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実行することができるが、カスタマイズされたパラメータもまた使用することができる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして3のワード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff & Henikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照されたい)。
当業者には理解されるように、特定の実施形態では、本明細書に開示されている様々な構成要素の任意の配列(例えば、scFv、細胞内シグナル伝達ドメイン、ヒンジ、リンカー、局在化配列、およびそれらの組み合わせ)は、本明細書に開示される特定の対応する配列に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有することができる。例えば、特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン4-1BBは、所望の機能を有する限り、配列番号3に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有することができる。特定の実施形態では、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号3に記載の配列(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)を含む。
別の例として、特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン4-1BBは、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LAF1、またはCD2などの共刺激分子由来の別の細胞内シグナル伝達ドメインで置換することができる。いくつかの実施形態では、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LAF1、またはCD2の細胞内シグナル伝達ドメインに対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有することができる。
別の例として、特定の場合では、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインはまた、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LAF1、またはCD2などの共刺激分子由来の別の細胞内シグナル伝達ドメイン(またはその一部)を含むことができる。いくつかの実施形態では、追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LAF1、またはCD2の細胞内シグナル伝達ドメインに対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有することができる。他の実施形態では、追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LAF1、またはCD2の細胞内シグナル伝達ドメインフラグメント(複数可)に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む。
別の例として、特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインCD3ζは、所望の機能を有する限り、配列番号4に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有することができる。特定の実施形態では、CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号4に記載の配列(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)を含む。
いくつかの事例では、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)またはその一部を含む。CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAMに対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含むことができる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、FcεRIγ、CD4、CD7、CD8、CD28、OX40またはH2-Kbに対して、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有することができる。
特定の実施形態では、抗CD7 CARは、ヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。本発明での使用に好適なヒンジおよび膜貫通配列は、当技術分野において公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第2016/126213号により提供されている。特定の実施形態では、ヒンジ配列は、配列番号5に記載の配列(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD)を含む。特定の実施形態では、膜貫通配列は、配列番号6に記載の配列(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC)を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7 CARのヒンジおよび膜貫通ドメインは、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、FGFR2B、または他の膜貫通タンパク質由来のシグナル伝達ドメイン(例えば、膜貫通ドメイン)を含むことができる。
特定の実施形態では、抗CD7 CARは、CD8αシグナルペプチド(MALPVTALLLPLLLHLAARP、配列番号7)をさらに含む。本明細書に記載の実施形態を含む抗CD7 CARの概略図を図17に示す。
本発明の特定の態様では、キメラ抗原受容体(CAR)は、糖タンパク質のCD1ファミリーのメンバー、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD30、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127、およびCD137が挙げられるが、これらに限定されない、細胞の表面に発現される分子に結合することができる。
本明細書に記載されたように、抗CD7 CARがエフェクターT細胞上のCD7発現の下方制御と組み合わせて使用されたとき、T細胞の細胞傷害性が顕著に増加することが示された。本明細書に明示されたように、CD7の下方制御(例えば、除去、減少、および/または再局在化)は、対応する抗CD7 CARによって及ぼされる同族殺傷効果を防ぎ、標的抗原(例えば、CD7)を保持した細胞と比較してCAR発現後のT細胞回収をより多くし、T白血病/リンパ腫細胞に対するより効果的な細胞傷害性をもたらす。当業者が理解するように、エフェクターT細胞上のCD7発現の下方制御は、例えば、(国際公開第2016/126213号に記載されているような)CD7に対する「細胞内発現抗体」、CD7に対するRNAi、または、例えば、メガヌクレアーゼ、TALEN、CRISPR/Cas9、およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどの遺伝子編集方法を含む様々な既知の方法に従って達成することができる。
特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。「局在化ドメインに連結された標的結合分子」は、本明細書においてタンパク質発現ブロッカー(PEBL)と称する場合もあれば、または場合によっては、その教示が参照によりその全体が組み込まれる国際公開第2016/126213号に記載されているように、「細胞内発現抗体」と称する。PEBLの例示的な実施形態を図3Eおよび図17に示す。
本明細書で使用される場合、タンパク質発現ブロッカーの文脈において「連結される」とは、1つ以上の局在化ドメインをコードする1つ以上の遺伝子に隣接して直接インフレームで(例えば、リンカーなしで)標的結合分子をコードする遺伝子を指す。あるいは、標的結合分子をコードする遺伝子は、例えば、国際公開第2016/126213号に記載されているように、リンカー配列を介して1つ以上の局在化ドメインをコードする1つ以上の遺伝子に接続されてもよい。当業者には理解されるように、そのようなリンカー配列およびそのようなリンカー配列の変異体は、当技術分野において公知である。リンカー配列を組み込んだ構築物を設計する方法および機能性を評価する方法は、当業者には容易に利用可能である。
特定の実施形態では、標的結合分子は、CD7に結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、scFvである。特定の実施形態では、scFvは、配列番号1に記載のVH配列と、配列番号2に記載のVL配列と、を含む。特定の実施形態では、scFvは、配列番号14に記載のVH配列と、配列番号15に記載のVL配列と、を含む。特定の実施形態では、scFvは、配列番号16に記載のVH配列と、配列番号17に記載のVL配列と、を含む。本明細書に記載のように、特定の実施形態では、scFvは、それぞれ配列番号1および配列番号2、それぞれ配列番号14および配列番号15、またはそれぞれ配列番号16および配列番号17に記載のVH配列およびVL配列に対して、それぞれ少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を有するVHおよびVLを含む。
いくつかの実施形態では、抗CD7 scFvの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列番号23の核酸配列および抗CD7 scFvの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列番号24の核酸配列を使用して、抗CD7タンパク質発現ブロッカーが作製される。他の実施形態では、抗CD7 scFvの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列番号25の核酸配列および抗CD7 scFvの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列番号26の核酸配列を使用して、抗CD7タンパク質発現ブロッカーが作製される。特定の実施形態では、抗CD7 scFvの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列番号27の核酸配列および抗CD7 scFvの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列番号28の核酸配列を使用して、抗CD7タンパク質発現ブロッカーが作製される。
特定の実施形態では、本明細書に記載したように、CARの文脈においてCD7に結合する抗体は、標的結合分子の文脈においてCD7に結合する抗体(PEBL)とは異なり得る。単なる例示として、CARの文脈においてCD7に結合する抗体は、配列番号1に記載のVH配列と、配列番号2に記載のVL配列、を含むことができるが、PEBLの文脈においてCD7に結合する抗体は、配列番号14に記載のVH配列と、配列番号15に記載のVL配列と、を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載したように、CARの文脈においてCD7に結合する抗体は、標的結合分子(PEBL)の文脈においてCD7に結合する抗体と同一であり得る。
特定の実施形態では、PEBLの局在化ドメインは、小胞体(ER)またはゴルジ体保持配列と、プロテオソーム局在化配列と、CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、CD16、OX40、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列と、を含む。特定の実施形態では、局在化ドメインは、本明細書に記載されたように、小胞体(ER)保持ペプチドEQKLISEEDLKDEL(配列番号8)、(GGGGS)AEKDEL(配列番号9)、またはKYKSRRSFIDEKKMP(配列番号11)が続くCD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY)(配列番号10)を含む。局在化ドメインは、用途に応じて、PEBLをゴルジ体または小胞体、プロテアソーム、または細胞膜などの特定の細胞区画に誘導することができる。ERまたはゴルジ体保持配列は、アミノ酸配列KDEL(配列番号18)、KKXX(配列中、Xは、任意のアミノ酸である)(配列番号19)、(KXDまたはKXEなどの)KXD/E(配列中、Xは、任意のアミノ酸である)(配列番号20)、またはYQRL(配列番号21)を含む。プロテアソーム局在化配列は、PEST(配列番号22)モチーフを含むことができる。
いくつかの実施形態では、プロテアソーム局在化は、scFv配列を三要素モチーフ含有21(TRIM21)標的ドメイン配列に連結し、ヒトTRIM21 E3ユビキチンリガーゼタンパク質をコードする配列を共発現することによって達成される。TRIM21は、抗体のFcドメインに高い親和性で結合し、ユビキチン-プロテオソーム複合体を動員して抗体に結合した分子(例えば、タンパク質およびペプチド)を分解することができる。TRIM21標的ドメイン配列は、IgG1、IgG2、またはIgG4などのヒト免疫グロブリンG(IgG)定常領域(Fc)遺伝子の群から選択されるアミノ酸配列をコードし、scFvドメインおよびFcドメインを含む融合タンパク質を形成するために使用される。この実施形態では、外因的に発現されたTRIM21タンパク質は、標的タンパク質(例えば、CD7)に結合したscFv-Fc融合タンパク質に結合し、複合体を分解のためにプロテアソームに誘導する。
ヒトTRIM21 E3リガーゼタンパク質のアミノ酸配列の詳細は、例えば、NCBI Ref.Seq.No.NP003132.2でNCBIタンパク質データベースに見出すことができる。ヒトTRIM21 E3リガーゼタンパク質をコードする核酸配列の詳細は、例えば、NCBI Ref.Seq.No.NM_003141.3でNCBIタンパク質データベースに見出すことができる。
特定の実施形態では、タンパク質発現ブロッカーは、国際公開第2016/126213号に開示されているような任意の1種以上の抗CD7 PEBLであり、その開示は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞は、国際公開第2016/126213号に記載されているように、CD7に結合するPEBL(局在化ドメインに連結された標的結合分子)を含むことができる。図2、ならびに国際公開第2016/126213号の表1および表2に記載されているような、抗CD7細胞内発現抗体の成分の配列である。抗CD7 PEBLの例示的な実施形態を図3Eおよび図17に図示する。
Figure 2023059873000005

いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1のアミノ酸配列と、配列番号2のアミノ酸配列と、VH-VLリンカーと、を含む。VH-VLリンカーは、(GGGGS)nリンカーであり得、nは、1~6の範囲、例えば、1、2、3、4、5、または6であり得る。一実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1のアミノ酸配列と、配列番号2のアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号2のアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1のアミノ酸配列と、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの事例では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、配列番号8、配列番号9、または配列番号13に記載のいずれか1つの配列から選択される局在化ドメインを含む。場合によっては、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号7に記載のCD8αシグナルペプチドなどのCD8αシグナルペプチドを含む。他の場合では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号10に記載のCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインなどのCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号14のアミノ酸配列と、配列番号15のアミノ酸配列と、VH-VLリンカーと、を含む。VH-VLリンカーは、(GGGGS)nリンカーであり得、nは、1~6の範囲、例えば、1、2、3、4、5、または6であり得る。一実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号14のアミノ酸配列と、配列番号15のアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号14に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号15のアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号14のアミノ酸配列と、配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号14に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの事例では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、配列番号8、配列番号9、または配列番号13に記載のいずれか1つの配列から選択される局在化ドメインを含む。場合によっては、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号7に記載のCD8αシグナルペプチドなどのCD8αシグナルペプチドを含む。他の場合では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号10に記載のCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインなどのCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号16のアミノ酸配列と、配列番号17のアミノ酸配列と、VH-VLリンカーと、を含む。VH-VLリンカーは、(GGGGS)nリンカーであり得、nは、1~5の範囲、例えば、1、2、3、4、5、または6(配列番号29)であり得る。一実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号16のアミノ酸配列と、配列番号17のアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号17のアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号16のアミノ酸配列と、配列番号17に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号16に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号17に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号12のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの事例では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、配列番号8、配列番号9、または配列番号13に記載のいずれか1つの配列から選択される局在化ドメインを含む。場合によっては、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号7に記載のCD8αシグナルペプチドなどのCD8αシグナルペプチドを含む。他の場合では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号10に記載のCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインなどのCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗CD7 PEBLをコードする核酸配列は、表4に記載の1つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、PEBLの抗CD7 scFvのVHドメインは、配列番号23のヌクレオチド配列を含み、PEBLの抗CD7 scFvのVLドメインは、配列番号24のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、PEBLの抗CD7 scFvのVHドメインは、配列番号23に対して、少なくとも90%の配列同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性)を有するヌクレオチド配列を含み、PEBLの抗CD7 scFvのVLドメインは、配列番号24に対して、少なくとも90%の配列同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性)を有するヌクレオチド配列を含む。
Figure 2023059873000006


Figure 2023059873000007
いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーの局在化ドメインをコードする核酸配列は、配列番号32、配列番号33、もしくは配列番号34から選択される配列、またはそれらのコドン最適化変異体を含む。
本発明の特定の態様では、タンパク質発現ブロッカーは、糖タンパク質のCD1ファミリーのメンバー、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD30、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127、およびCD137が挙げられるが、これらに限定されない、細胞の表面上に発現される分子に結合することができる。
本発明のいくつかの態様では、糖タンパク質のCD1ファミリーのメンバー、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD30、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127、またはCD137の発現は、これらに限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、TALEN、CRISPR/Cas9、またはジンクフィンガーヌクレアーゼなどの遺伝子編集技術を用いて下方制御することができる。例えば、いくつかの実施形態では、CD7発現は、Cas9/CRISPRによるゲノム編集を用いてノックアウトされる。他の実施形態では、CD5発現は、Cas9/CRISPRによるゲノム編集を用いてノックアウトされる。
上記のように、エフェクターT細胞上のCD7発現の下方制御は、例えば、メガヌクレアーゼ、TALEN、CRISPR/Cas9、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた遺伝子編集方法を含む様々な他の公知の方法に従って達成することができる。したがって、特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、改変CD7遺伝子をさらに含み、その改変は、CD7遺伝子またはタンパク質を非機能的にする。例として、本発明の遺伝子操作免疫細胞は、CD7の発現を妨げるかまたは減少させる、かつ/または別の方法で(例えば、構造的に)CD7タンパク質が抗CD7 CARによって認識されるのを妨げる、改変された(例えば、非機能的)CD7遺伝子(例えば、メガヌクレアーゼ、TALEN、CRISPR/Cas9、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて改変された)をさらに含む。そのような方法を用いて遺伝子発現を改変する方法は、容易に利用可能であり、当該分野において周知である。
CRISPR/Cas6技術を使用して免疫細胞中の標的遺伝子を不活性化する方法は、例えば、米国特許出願公開第2016/0272999号、同第2017/0204372号および同第2017/0119820号に記載されている。
CRISPR/Casシステムは、標的とした遺伝子操作(ゲノム改変)を誘導するためのシステムである。Cas9タンパク質による標的認識は、ガイドRNA(gRNA)内の「シード」配列およびgRNA結合領域の上流にある保存されたマルチヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を必要とする。それによってCRISPR/Casシステムは、細胞株、初代細胞、および遺伝子操作細胞中のgRNAを再設計することによって実質的に任意のDNA配列を切断するように遺伝子操作することができる。CRISPR/Casシステムは、単一のCas9タンパク質を2つ以上のgRNAと同時発現させることによって複数のゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができ、このシステムが複数遺伝子編集または標的遺伝子の相乗的活性化に特異的に好適であるようになる。遺伝子発現を阻害するために使用されるCRISPR/Casシステムの例は、米国特許出願公開第2014/0068797号ならびに米国特許第8,697,359号および同第8,771,945号に記載されている。このシステムは、RNA誘導Cas9エンドヌクレアーゼを利用してDNA二本鎖切断を導入する永久的な遺伝子破壊を誘導し、これがエラーを起こしやすい修復経路を引き起こしてフレームシフト変異を引き起こす。場合によっては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1およびCsx12としても既知)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsxX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、T7、Fok1、当技術分野において公知の他のヌクレアーゼ、それらの同族体、またはそれらの改変体を含む他のエンドヌクレアーゼもまた使用されてもよいが、これらに限定されない。
CRISPR/Cas遺伝子破壊は、標的遺伝子に特異的なgRNA配列およびCasエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、Casエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成するときに生じる。いくつかの事例では、CRISPRシステムは、Casエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列および標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列を含む、1つ以上の発現ベクターを含む。ガイド核酸配列は、遺伝子に特異的であり、その遺伝子をCasエンドヌクレアーゼ誘導二本鎖切断について標的化する。ガイド核酸配列の配列は、遺伝子の遺伝子座内にあってもよい。いくつかの実施形態では、ガイド核酸配列は、ヌクレオチド長が少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、またはそれ以上である。ガイド核酸配列には、RNA配列、DNA配列、それらの組み合わせ(RNA-DNA組み合わせ配列)、またはペプチド核酸(PNA)もしくはロックド核酸(LNA)などの合成ヌクレオチドを伴う配列が挙げられる。ガイド核酸配列は、単一分子または二重分子であり得る。一実施形態では、ガイド核酸配列は、単一のガイドRNAを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作免疫細胞は、CRISPR/Casシステムを介して改変され、ヒトCD7遺伝子を不活性化することができる。ヒトCD7遺伝子のゲノム構造および配列の詳細は、例えば、NCBI GeneデータベースのGeneID No.924に見出すことができる。
特定の標的遺伝子のノックアウトのための市販のキット、gRNAベクターおよびドナーベクターは、例えば、Origene(Rockville,MD)、GenScript(Atlanta,GA)、Applied Biological Materials(ABM;Richmond,British Colombia)、BioCat(Hedelberg,Germany)などから入手可能である。例えば、CRISPRによるCD7のノックアウトのための市販のキットまたはキット構成要素は、例えば、それぞれOrigeneから入手可能な、カタログ番号KN201231、KN201231G1、KN201231G2、およびKN201231Dとして入手可能なもの、ならびにSanta Cruz Biotechnologyから入手可能な、カタログ番号sc-4072847、sc-4072847-KO-2、sc-4072847-HDR-2、sc-4072847-NIC、sc-4072847HDR-2、およびsc-4072847-NIC-2として入手可能なものを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ抗原受容体は、CRISPR/Casシステムを用いてヒトCD7遺伝子座に導入することができる。
特定の実施形態では、i)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群7(CD7)に特異的に結合する抗体と、を含む、核酸と、ii)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、CD7に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体保持配列を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞が提供される。特定の実施形態では、CARの文脈においてかつ標的結合分子の文脈においてCD7に結合する抗体は、配列番号1に記載のVH配列および配列番号2に記載のVL配列、配列番号14に記載のVH配列および配列番号15に記載のVL配列、または配列番号16に記載のVH配列および配列番号17に記載のVL配列、を含む。本明細書に記載されたように、特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号1および配列番号2、それぞれ配列番号14および配列番号15、またはそれぞれ配列番号16および配列番号17に記載のVH配列およびVL配列に対して、それぞれ少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む配列を有するVHおよびVLを含む。特定の実施形態では、CARの文脈においてCD7に結合する抗体は、本明細書に記載されたように、標的結合分子(タンパク質発現ブロッカーまたはPEBL)の文脈においてCD7に結合する抗体とは異なり得る。特定の実施形態では、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号3に記載の配列を含む。特定の実施形態では、CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号4に記載の配列を含む。
別の態様では、本明細書に記載されたように、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に結合する抗体と、を含む。
特定の実施形態では、抗体は、scFvである。特定の実施形態では、scFvは、配列番号1に記載のVH配列および配列番号2に記載の可変軽鎖VL配列を含む。特定の実施形態では、scFvは、配列番号14に記載のVH配列および配列番号15に記載の可変軽鎖VL配列を含む。特定の実施形態では、scFvは、配列番号16に記載のVH配列および配列番号17に記載の可変軽鎖VL配列を含む。本明細書に記載されたように、特定の実施形態では、scFvは、それぞれ配列番号1および配列番号2、それぞれ配列番号14および配列番号15、またはそれぞれ配列番号16および配列番号17に記載のVH配列およびVL配列に対して、それぞれ少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%の配列同一性、少なくとも92%の配列同一性、少なくとも93%の配列同一性、少なくとも94%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、少なくとも99%の配列同一性、または100%の配列同一性を含む配列を有するVHおよびVLを含む。特定の実施形態では、CARは、ヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明の単離された核酸は、表5によるCARをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表5によるCARの構成成分をコードするヌクレオチド配列を含む。
Figure 2023059873000008

いくつかの実施形態では、抗CD7 CARは、配列番号1のアミノ酸配列と、配列番号2のアミノ酸配列と、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7CARはまた、これらに限定されるものではないが、(GGGGS)nリンカーなどのVH-VLリンカーであり得、nは、1~6の範囲、例えば、1、2、3、4、5、または6であり得る。
一実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1のアミノ酸配列と、配列番号2のアミノ酸配列、配列番号3のアミノ酸配列と、配列番号4のアミノ酸配列と、配列番号10のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号3のアミノ酸配列と、配列番号4のアミノ酸配列と、配列番号10のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号4のアミノ酸配列と、配列番号10のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号3のアミノ酸配列と、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号10のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号3のアミノ酸配列と、配列番号4のアミノ酸配列と、配列番号10に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7タンパク質発現ブロッカーは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号10に対して少なくとも90%の配列同一性または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、を含む。
特定の実施形態では、本発明の単離された核酸は、表6の1つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表6に記載のCARの成分のヌクレオチド配列を含む。
Figure 2023059873000009


Figure 2023059873000010
特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、核酸は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、標的結合分子は、CD7に結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、scFvである。いくつかの実施形態では、scFvは、配列番号1の配列に対して少なくとも90%の配列同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性)を有するVH配列と、配列番号2の配列に対して少なくとも90%の配列同一性(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上)を有するVL配列と、を含む。特定の実施形態では、scFvは、配列番号1に記載のVH配列と、配列番号2に記載のVL配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗CD7 scFvのVHドメインは、配列番号23のヌクレオチド配列を含み、抗CD7 scFvのVLドメインは、配列番号24のヌクレオチド配列を含む。
他の態様では、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する治療量の遺伝子操作免疫細胞を被験体に投与し、それによって治療を必要とする被験体において癌を治療することを含む、治療を必要とする被験体における癌の治療方法もまた提供される。
特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、方法は、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む治療量の遺伝子操作免疫細胞を投与することを含み、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に結合する抗体と、を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、方法は、局在化ドメインに連結された標的結合分子(例えば、抗CD7タンパク質発現ブロッカー)をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をさらに含む、治療量の遺伝子操作免疫細胞を投与することを含む。
特定の実施形態では、癌は、T細胞悪性腫瘍、例えば、T細胞急性リンパ芽球性白血病、T細胞前リンパ球性白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、腸症型T細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様T細胞リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚γδT細胞リンパ腫、他に特定されない末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫などの、T細胞白血病またはT細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、T細胞悪性腫瘍は、早期T細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)である。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、臨床的に許容できる基準に従って、病状が改善される程度まで病状(例えば、T細胞悪性腫瘍に関連する状態)を和らげることを指す。
本明細書で使用される場合、「被験体」とは、哺乳動物(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス)を指す。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。「治療を必要とする被験体」とは、悪性T細胞に対する特定の細胞傷害性を及ぼすようにT細胞を誘導することによって治療(例えば、向上、改善、予防)することができる疾患もしくは症状を有するか、または発症する危険がある被験体(例えば、患者)を指す。
本明細書で定義されるように、「治療量」は、被験体に投与されたときに、投与条件下で被験体において所望の治療効果を達成する(T細胞悪性腫瘍に関連する状態を治療する)のに十分な量を指す。投与されることとなる薬剤の有効量は、本明細書に提供される指針および当該分野で公知の他の方法を用いて当業者によって決定することができ、例えば、選択された特定の薬剤、被験体の年齢、感受性、薬物に対する耐性、および全般的健康を含むいくつかの要因に依存する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、治療、例えば癌治療を必要とする被験体にとって自己由来である。他の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、治療を必要とする被験体に対して同種である。
特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、手術後の腫瘍への直接注入および/または腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与、および眼内投与によって被験体に投与される。
特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、被験体への注入によって投与される。免疫細胞(例えば、同種免疫細胞または自己免疫細胞)を注入する方法は当技術分野において公知である。疾患の症状を改善するために十分な数の細胞がレシピエントに投与される。通常、10~1010細胞の用量は、単回設定、例えば、10細胞の用量で注入される。注入は、単回10細胞用量またはいくつかの10細胞用量への分割のいずれか一方で投与される。注入の頻度は、毎日、2~30日ごと、または必要に応じてもしくは指示がある場合にはさらに長い間隔であり得る。注入の量は、一般的に、許容されるように、または疾患症状が改善されるまで、被験体当たり少なくとも1回の注入、好ましくは、少なくとも3回の注入である。細胞は、50~250mL/時の速度で静脈内注入することができる。他の適切な投与様式としては、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与が挙げられる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者には容易に利用可能である。
特定の実施形態では、本発明による癌を治療する方法は、少なくとも1つの他の公知の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、または他の免疫療法と組み合わされる。
他の態様では、癌を治療するための本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する遺伝子操作免疫細胞の使用もまた提供され、それは治療量の遺伝子操作免疫細胞を治療を必要とする被験体に投与することを含む。特定の実施形態では、癌は、T細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、T細胞悪性腫瘍は、早期T細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)である。
特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、手術後の腫瘍への直接注入および/または腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、および髄腔内投与によって被験体に投与される。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する遺伝子操作免疫細胞の産生方法もまた提供され、その方法は、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することを含み、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に結合する抗体と、を含む。
特定の実施形態では、方法は、局在化ドメインに連結された標的結合分子(例えば、抗CD7タンパク質発現ブロッカーまたは抗CD7 PEBL)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。特定の実施形態では、CARをコードするヌクレオチド配列および抗CD7 PEBLをコードするヌクレオチド配列は、単一のプラスミドに導入される。
様々な態様では、本明細書に記載された遺伝子操作免疫細胞を産生するためのキットもまた提供される。現在のキットは、例えば、抗CD7 CAR媒介細胞傷害活性を有する同種または自己由来のT細胞を産生するために使用することができる。いくつかの実施形態では、キットは、抗CD7 CAR媒介細胞傷害活性を有する同種エフェクターT細胞を産生するために有用である。特定の実施形態では、キットは、抗CD7 CAR媒介細胞傷害活性を有する自己エフェクターT細胞を産生するために有用である。
したがって、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むキットが本明細書で提供され、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に結合する抗体と、を含む。抗CD7 CARをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従って設計することができる。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、図1Aの概略図に従って抗CD7 CARをコードする(「抗CD7-41BB-CD3ζ構築物」)。
特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、キットは、局在化ドメインに連結された標的結合分子(例えば、本明細書に記載の抗CD7 PEBL分子)をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をさらに含む。局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載された実施形態のいずれかに従って設計することができる。
特定の実施形態では、抗CD7 CARをコードするヌクレオチド配列および/または抗CD7 PEBLをコードするヌクレオチド配列は、例えば、クローニングおよび/または発現を可能にする配列(例えば、プラスミド配列またはベクター配列)をさらに含む。例えば、ヌクレオチド配列は、例えば、細胞(例えば、免疫細胞)へのトランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションのために他のプラスミドおよび/またはベクター(発現ベクターまたはウイルス発現ベクター)へのクローニングを容易にするためのプラスミドの一部として提供することができる。特定の実施形態では、抗CD7 CARをコードするヌクレオチド配列および抗CD7 PEBLをコードするヌクレオチド配列は、単一のプラスミドまたはベクター(例えば、抗CD7 CARおよび抗CD7 PEBLを含む単一の構築物)上に提供される。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、別々のプラスミドまたはベクター(発現ベクターまたはウイルス発現ベクター)上に提供される。
一般的には、キットは、使用を容易にするために区画化されており、試薬を伴う1つ以上の容器を含むことができる。特定の実施形態では、キット構成要素の全ては、一緒に包装されている。あるいは、キットの1つ以上の個々の構成要素は、他のキット構成要素とは別のパッケージで提供することができる。キットはまた、キット構成要素を使用するための説明書を含むことができる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む遺伝子操作免疫細胞が本明細書で提供され、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群7(CD7)に結合する抗体と、を含む。特定の実施形態では、抗体は、一本鎖可変フラグメント(scFv)である。いくつかの場合では、scFvは、配列番号1に記載の重鎖可変ドメイン(VH)配列と、配列番号2に記載の軽鎖可変ドメイン(VL)配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、CARは、これらに限定されるものではないが、配列番号10のアミノ酸配列を含むヒンジおよび膜貫通ドメインなどのヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。特定の実施形態では、標的結合分子は、CD7に結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、scFvである。いくつかの実施形態では、scFvは、配列番号1に記載のVH配列と、配列番号2に記載のVL配列と、を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体(ER)またはゴルジ体保持配列と、プロテオソーム局在化配列と、CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、(i)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群7(CD7)に結合する抗体と、を含む、核酸と、(ii)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、CD7に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体保持配列を含み、CD7に結合する抗体は、配列番号1に記載の可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に記載の可変軽鎖(VL)配列と、を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号3に記載の配列を含み、CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号4に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞の治療量を被験体に投与することと、それによって治療を必要とする被験体において癌を治療することと、を含む、治療を必要とする被験体における癌の治療方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は、T細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、T細胞悪性腫瘍は、早期T細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)である。特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与によって被験体に投与される。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書で提供され、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群7(CD7)に結合する抗体と、を含む。
他の実施形態では、治療を必要とする被験体に治療量の遺伝子操作免疫細胞を投与することを含む、癌を治療するための本明細書に記載された遺伝子操作免疫細胞のそれが、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は、T細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、T細胞悪性腫瘍は、早期T細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)である。特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与によって被験体に投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞を産生するための方法が、本明細書で提供される。方法は、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することであって、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に結合する抗体と、を含むことと、それによって遺伝子操作免疫細胞を産生することと、を含むことができる。方法は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することをさらに含むことができる。
本発明は、CD7に対するキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。本明細書に明示したように、エフェクターT細胞などの免疫細胞における抗CD7 CARの発現は、T細胞がT細胞悪性腫瘍に対して特異的な細胞傷害性を及ぼすように誘導する。この細胞傷害性効果は、下方制御のためにCD7を標的とする抗体ベースの分子(タンパク質発現ブロッカーまたはPEBL)を用いてエフェクターT細胞上のCD7の発現が下方制御されたときに増強されることが示された。したがって、本発明は、癌、例えば、T細胞悪性腫瘍を治療するための免疫療法的方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む遺伝子操作免疫細胞を提供し、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群7(CD7)に結合する抗体と、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説された遺伝子操作免疫細胞はまた、局在化ドメインに連結された標的結合分子(例えば、タンパク質発現ブロッカーまたはPEBL)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。そのような遺伝子操作免疫細胞を産生するための方法およびキットもまた、本明細書に概説されている。
いくつかの態様では、本発明は、(i)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に特異的に結合する抗体と、を含む、核酸と、(ii)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、CD7に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体保持配列を含み、CD7に結合する抗体は、配列番号1に記載の可変重鎖(VH)配列と、配列番号2に記載の可変軽鎖(VL)配列と、を含む、核酸と、を含む遺伝子操作免疫細胞(例えば、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、NK/T細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞)を提供する。
他の態様では、本発明は、治療を必要とする被験体において癌(例えば、T細胞悪性腫瘍)を治療する方法を提供する。方法は、治療量の本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞のいずれかを被験体に投与することと、それにより治療を必要とする被験体において癌を治療することと、を含む。本開示はまた、癌を治療するための本明細書に概説された遺伝子操作免疫細胞のうちのいずれかの使用を記載する。
他の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、CARは、4-1BBおよびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に特異的に結合する抗体と、を含む。
実施例1:T細胞悪性腫瘍の有効なキメラ抗原受容体標的化のためのT細胞におけるCD7発現の遮断
この実施例は、第二世代のCARと組み合わせた新規方法によるCD7発現の遮断を例示し、非常に強力な抗CD7 CAR-T細胞をもたらした。この実用的な戦略は、ETP-ALLを含む高リスクT細胞悪性腫瘍患者に新しい治療法の選択肢を提供する。
概要
T細胞悪性腫瘍に対する効果的な免疫療法が不足している。キメラ抗原受容体(CAR)転換Tリンパ球に基づく新規アプローチが考案された。CD7は、最も攻撃的なサブタイプである早期T細胞前駆体(ETP)-ALLを含むT細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)におけるその一貫した発現のため、標的として選択された。49個の診断用T-ALL試料(14個のETP-ALLを含む)では、CD7発現中央値は、>99%であり、CD7発現は、再発時(n=14)および化学療法中(n=54)に高いままであった。CD7は、第二世代のCAR(抗CD7-41BB-CD3ζ)により標的化されたが、T細胞自体にCD7が存在するために、Tリンパ球におけるCAR発現は、同族殺傷を引き起こした。CD7を下方制御し、同族殺傷を制御するために、細胞内保持ドメインと結合された抗CD7一本鎖可変フラグメントに基づく新規方法(タンパク質発現ブロッカー、PEBL)を適用した。抗CD7 PEBLの形質導入は、全ての形質導入T細胞において表面のCD7発現の実質的に即効性の抑制をもたらし、2.0%±1.7%は、mock形質導入T細胞の98.1%±1.5%に対してCD7+であった(n=5、P<0.0001)。PEBL発現は、T細胞増殖、IFNγおよびTNFα分泌、または細胞傷害性を損なわず、CAR媒介同族殺傷を排除しなかった。PEBL-CAR-T細胞は、インビトロでCD7+白血病細胞に対して非常に細胞傷害性であり、同族殺傷を免れるCD7+ T細胞よりも一貫してより強力であった。それらはまた、細胞株由来および患者由来のT-ALL異種移植片において強い抗白血病活性を示した。ここで説明する戦略は、既存の臨床グレードの細胞製造プロセスに良好に適合し、高リスクのT細胞悪性腫瘍患者の治療のために迅速に実行することができる。
序論
Tリンパ球は、キメラ抗原受容体(CAR)の発現を介して腫瘍細胞を特異的に認識し、殺傷するように誘導することができる1-5。この技術の効果的な応用の中心は、CARに適する標的の特定である。標的は、腫瘍細胞によって高度に発現されなければならず、かつ正常細胞には存在すべきではないか、または一時的な非存在が臨床的に管理可能である正常細胞によってのみ発現されるべきである。したがって、B細胞由来の白血病およびリンパ腫は、通常Bリンパ様細胞によってのみ発現される9,10、CD195,7またはCD22に対するCARで標的化することができる。B細胞不応性白血病およびリンパ腫の患者における抗CD19 CARを発現する自己T細胞の注入は、主要な臨床反応をもたらした11-18。これらの刺激的な結果は、この技術の力の明白な証拠を提供し、腫瘍学におけるより広い応用の可能性を示唆している。
T細胞悪性腫瘍に対するCAR-T細胞療法の開発は、それらのB細胞対応物の開発よりもはるかに遅れている。いくつかのT細胞白血病およびリンパ腫サブタイプに関連した予後不良のために、この分野における効果的な治療法の必要性は特に緊急性がある。例えば、初期のT細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)の小児および青年は、全てのALL患者の中で初期治療に対する反応が最も悪い19-21。集中化学療法および/または同種造血幹細胞移植は、治療抵抗性の再発を予防しない場合が多く、これらの患者、および成人年齢などの他の危険性の高い機能を持つ患者にとっては、治療の選択肢が不足している19,22-25
T細胞悪性腫瘍に対する有効なCAR-T細胞の開発に対する大きな障害は、(一般的にCD19またはCD22発現を欠く)悪性T細胞の表面マーカープロファイルが、活性化Tリンパ球の表面マーカープロファイルと大部分重複することである19-26。そのような標的に対するCARは、CAR-T細胞の自己排除を導く可能性が高い27,28。ETP-ALLおよび他のT-ALL細胞サブタイプのCAR-T細胞療法のための実用的な技術の開発および適用が、本明細書に記載されている。第一に、CD7に対するCARが作製された。認識されているように、CD7は、T細胞悪性腫瘍の一次マーカーである40kDaのI型膜貫通糖タンパク質であり29-32、ETP-ALLを含むT細胞ALLの全ての場合において高度に発現される19。第二に、T細胞におけるCD7発現を迅速かつ効果的に下方制御する方法が開発された。この方法は、CAR-T細胞療法の同族殺傷効果を回避し、遺伝子編集を伴わず、そして臨床応用に直ちに移行することができるため選択された。
材料および方法
細胞および培養条件
白血病細胞系Jurkat、CCRF-CEM、Loucy、MOLT4およびKG1aは、American Type Culture Collection(ATCC;Rockville,MD)から入手した。B系列ALL細胞株OP-1は、出願人の研究室で開発された33。CCRF-CEM細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するネズミ幹細胞ウイルス(MSCV)-内部リボソーム進入部位(IRES)-緑色蛍光タンパク質(GFP)レトロウイルスベクター(St.Jude Children’s Research HospitalのVector Development and Production Shared Resource(Memphis,TN)から入手)で形質導入された。同じベクターを使用して、RS4;11 B細胞株(ATCC)のcDNAからクローニングされたCD19遺伝子をCCRF-CEMおよびJurkat細胞に形質導入した。細胞株を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)中で維持した。
末梢血試料は、シンガポール国立大学病院血液銀行の健常成人ドナー由来の血小板提供の廃棄された匿名副産物から得られた。診断免疫表現型検査および治療反応のモニタリングのために、ALL患者の骨髄穿刺液を採取した19,26。いくつかの実験では、シンガポール国立大学のInstitutional Review Boardの承認を得て、保存された余剰材料を使用した。単核細胞を、Lymphoprep密度段階(Axis-Shield,Oslo,Norway)での遠心分離により分離し、RPMI-1640中で2回洗浄した。T細胞をDynabeadsヒトTアクチベーターCD3/CD28(ThermoFisher)で濃縮し、RPMI-1640、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、およびインターロイキン-2(IL-2;120IU/mL;Proleukin,Novartis,Basel,Switzerland)中で培養した。
遺伝子クローニングおよびレトロウイルス導入
抗CD7モノクローナル抗体TH69の一本鎖可変フラグメント(scFv)34は、CD8αシグナルペプチド、CD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびに以前に出願人の研究室で開発された抗CD19-41BB-CD3ζ CARの4-1BBおよびCD3ζの細胞内ドメインに結合された。同じscFvはまた、CD8αシグナルペプチドおよび小胞体(ER)/ゴルジ保持ペプチドEQKLISEEDLKDEL(配列番号8)、(GGGGS)AEKDEL(配列番号9)、または局在化配列(配列番号13)が続くCD8αヒンジおよび膜貫通ドメインをコードする配列にも結合された。これらをGFPまたはmCherryの存在下または非存在下でMSCVベクターにサブクローニングした。
レトロウイルス上清の調製および形質導入は、以前に記載されたように実施した5,35。簡単に説明すると、pMSCVレトロウイルスベクター馴化培地をRetroNectin(Takara,Otsu,Japan)でコーティングしたポリプロピレン製チューブに添加し、遠心分離および上清の除去後、T細胞をチューブに添加し、37℃で12時間放置し、新鮮なウイルス上清をその後2日間連続して添加した。Tリンパ球をFBS、抗生物質および200IU/mLのIL-2を含むRPMI-1640中で維持した。
一過性CAR発現のために、抗CD7および抗CD19 CAR構築物をpVAXIベクター(ThermoFisher Scientific)のEcoRIおよびXhol部位にサブクローニングし、T7 mScript(CellScript,Madison,WI)を用いてmRNAに転写した36。mRNAエレクトロポレーションのために、細胞を200μgのCAR mRNAを含むエレクトロポレーション緩衝液(Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V;Lonza,Basel,Switzerland)に懸濁し、プログラムX-001を用いてAmaxa Nucleofector 2b(Lonza)でエレクトロポレーションした36,37。mRNA不存在下でエレクトロポレーションした細胞を対照として使用した。
CAR、PEBL、表面マーカーの検出
CARをビオチン結合ヤギ抗マウスF(ab’)抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)、続いてアロフィコシアニン(APC)結合ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)により検出した。フィコエリトリン(PE)またはAPC結合抗CD7(M-T701)、CD4(RPA-T4)、CD8(RPA-T8)、CD3(SK7)、および非反応性アイソタイプ一致抗体は、BD Biosciences(San Jose,CA)から入手し、CD19(LT19)は、Miltenyi Biotechから入手した。細胞染色は、Diva(BD Biosciences)またはFlow Joソフトウェア(FlowJo,Ashland,OR)により、Accuri C6、FortessaまたはLSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて分析した。
ウェスタンブロッティングは、以前に記載されたように行った35。簡単に説明すると、Pierce BCAタンパク質アッセイキット(ThermoFisher)によるタンパク質定量の前に、CelLytic M細胞溶解試薬(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)を用いて細胞溶解物を抽出した。細胞溶解物を4×Laemmli試料緩衝液(Bio-rad,Hercules,CA)で希釈し、還元条件または非還元条件下での電気泳動によって10%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロットした膜を、マウス抗ヒトCO3抗体(8D3;BD Biosciences)、ヤギ抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体(R&D Systems,Minneapolis,MN)、およびClarityウェスタンECL基質(Bio-Rad)をプローブとして精査した。染色は、ChemiDoc Touch Imager(Bio-Rad)を用いて可視化した。
細胞凝集アッセイ、細胞傷害性アッセイおよびサイトカイン産生
細胞-細胞凝集を測定するために、Jurkat細胞をカルセインレッドオレンジAM(ThermoFisher)で標識したCD7+またはCD7-細胞と30分間共培養し、細胞ダブレットをフローサイトメトリーによって計数した。いくつかの実験では、膜貫通配列またはシグナル伝達配列を含まないscFvからなる構築物で形質導入されたJurkatまたは293T細胞の上清から得た可溶性抗CD7 scFvと共培養する前に、標的細胞を10分間プレインキュベートした。
細胞傷害性を試験するために、標的細胞をカルセイン赤橙色AMで標識し、96ウェル丸底プレート(Corning Costar,Corning,NY)に入れた。T細胞を標的細胞とは異なるエフェクター:標的(E:T)比で標的細胞と共に添加し、37℃および5%CO2で4時間培養した。生存可能な標的細胞をフローサイトメトリーで計数した。38溶解性顆粒のエキソサイトーシスを測定するために、抗ヒトCD107a-PE(H4A3;BD Biosciences)を共培養物に添加した。1時間後、モネンシン(BD GolgiStop)を添加し、フローサイトメトリー分析の前に更に3時間培養を続けた。
細胞増殖を評価するために、T細胞を単独で、または1:1 E:TのMOLT-4細胞の存在下で、FBSおよび120IU/mL IL-2を含むRPMI-1640中、37℃および5%COで培養した。増殖を阻害するために、照射したまたはStreck細胞保存剤(Streck Laboratories,Omaha,NE)で処理した標的細胞を7日ごとに培養物に添加した。生存GFP+またはmCherry+ T細胞をフローサイトメトリーにより計数した。IFNγおよびTNFα産生のために、標的細胞およびエフェクター細胞を1:1 E:Tで上記のようにプレート培養した。1時間後、ブレフェルジンA(BD GolgiPlug)を培養物に添加し、培養をさらに5時間継続した。続いて、フローサイトメトリー分析の前に、抗IFNγ-PE(クローン25723.11;BD Biosciences)または抗TNFα-PE(6401.1111;BD Biosciences)による細胞内染色を行った。
異種移植モデル
ルシフェラーゼで形質導入されたCCRF-CEM細胞をNOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)マウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)にマウス当たり1×10細胞で静脈内(i.v.)注入した。3日後および/または7日後、マウスは、マウス当たり2×10T細胞において下方制御されたCD7および抗CD7 CAR発現を有するT細胞を受けた。他のマウスには、T細胞の代わりにGFP単独、または10%FBSを含むRPMI-1640で形質導入されたT細胞を与えた。全てのマウスは、2日ごとに20,000IUのIL-2を腹腔内(i.p.)投与された。水性D-ルシフェリンカリウム塩(Perkin Elmer,Waltham,MA)を腹腔内注入した後(マウス当たり2mg)、Xenoge IVIS-200システム(Caliper Life Sciences,Waltham,MA)を用いて腫瘍負荷を決定した。発光をLiving Image 3.0ソフトウェアで分析した。発光が毎秒1×1010光子に達したとき、または安楽死を正当化する身体的徴候が現れた場合はそれ以前に、マウスを安楽死させた。
患者由来の異種移植片(PDX)モデルについては、初代ETP-ALL細胞をNOD/scid IL2RGnull中に静脈内注入し、次の7~8世代に渡って増殖させた。次いで、ETP-ALL細胞を、PEBL-CAR-T細胞で処理するかまたは未処理のままにしたNOD/scid IL2RGnullに再注入した。末梢血および組織をフローサイトメトリーによりALL細胞の存在についてモニターした19,26。赤血球を溶解緩衝液(Sigma-Aldrich)で溶解した後、細胞を抗マウスCD45-PE-シアニン7(30-F11、Biolegend)、および抗ヒトCD45-APC-H7(2D1)、CD7-PE(M-T701)、CD3-APC(SK7)、CD34-ペリジニンクロロフィルタンパク質(8G12)(全てBD Biosciencesから)、およびCD33-ブリリアントバイオレット421(WM53、Biolegend)で染色した。細胞は、DivaおよびFlowJoソフトウェアを使用して、Fortessaフローサイトメーターで分析した。
結果
白血病におけるCAR-T細胞療法の標的としてのCD7の検証
49人のT-ALL患者(ETP-ALLを持つ14人を含む)から得られた診断用骨髄試料由来の白血病細胞において、CD7発現の中央値パーセントは、>99%(範囲、79%~>99%)であった。わずか3事例(6.1%)で、CD7は、99%未満であり、2事例で98%、1事例で79%であった(図1A)。14人の再発T-ALL患者から採集された試料においてもまた、高いCD7発現が観察された(図1A)。診断時または再発時の白血病細胞中のCD7の平均蛍光強度(MFI)は、同じ試料中の残存正常T細胞において測定されたMFIを常に超えていた。中央値(範囲)MFIは、T-ALL細胞において20,617(4,105~66,674)であるのに対して、正常T細胞において3,032(1,301~9,582)であった(n=19、P<0.0001)(図1B)。
化学療法がCD7発現に影響を与えるかどうかを判断するために、治療中に採集された、最小残存病変(MRD)を含む骨髄試料を調べた。(21人の患者由来の)54個の試料全てにおいて、残存白血病細胞の>99%は、CD7+であった(図1A)。18人の患者において、CD7レベルは、疾患の経過中モニターされた。図1Cおよび図1Dに示すように、CD7は、治療中に高いままであった。これらの結果は、CD7がT-ALLにおけるCAR-T細胞療法の標的として有効であることを証明している。
抗CD7 CARの設計および発現
CD7を標的とするために、CD8αのヒンジおよび膜貫通ドメインを介して4-1BB(CD137)およびCD3ζのシグナル伝達ドメインに接合された抗CD7抗体TH69のscFvからなる抗CD7 CAR(図2A)を設計した。Jurkat細胞におけるこの構築物のレトロウイルス形質導入は、抗CD7 CARの高発現をもたらし(図2B)、ウェスタンブロッティングによりモノマー、ダイマーおよびオリゴマーとして現れた(図2C)。
TH69 scFvがCD7を結合し得ることを確認するために、それは可溶性形態で産生され、CD7+ MOLT-4細胞およびCD7-OP-1細胞上で試験され、MOLT-4細胞を標識したが、OP-1は、標識しなかった(図8A)。さらに、MOLT-4細胞を抗CD7 scFv上清とプレインキュベートした場合、抗CD7モノクローナル抗体による染色は、有意に減少し、CD7 MFI(±SD)は、31,730±1,144から5,987±241(n=3)に変化した。抗CD7 CARを発現するJurkat細胞は、CD7+ MOLT-4細胞と凝集体を形成したが、GFP単独または抗CD19 CARで形質導入された細胞は、形成せず、それとは逆に、抗CD19 CARは、CD19+ OP-1細胞との細胞凝集を誘導したが、抗CD7 CARは、誘導しなかった(図8B)。MOLT-4またはCCRF-CEMを可溶性抗CD7 scFvとプレインキュベートすると、凝集体の形成が妨げられた(図8C)。
抗CD7 CARが機能的であるかどうかを決定するために、活性化マーカーCD25およびCD69のレベルを、MOLT4と24時間共培養した後にJurkat細胞において測定した。抗CD7 CARを発現する細胞において、両方の活性化マーカーの明らかな上方制御があった(図2Dおよび図2E)。要するに、抗CD7-41BB-CD3ζ CARは、その同族抗原に結合することができ、連結の際に活性化シグナルを伝達する。
T細胞における抗CD7 CARの発現は、同族殺傷を引き起こす
末梢血Tリンパ球における抗CD7-41BB-CD3ζ CARの効果を決定するために、それを発現させるために2つの異なる方法、すなわちレトロウイルス形質導入(図9A)およびmRNAエレクトロポレーションを用いた。しかし、それはT細胞生存率を著しく低下させた。mRNAエレクトロポレーションの24時間後の平均(±SD)T細胞回収率は、mRNA不存在下のエレクトロポレーション後に39.8%±13.0(n=7)の回収率であり(図3A)、CARがウイルス形質導入によって導入された場合、細胞回収率は、mock形質導入T細胞の25.1%±16.2%(n=10)の回収率であり(図3B)、全体として、CAR発現は、24時間後に細胞回収率を31.1%±16.3%(n=17)まで減少させた。長期の細胞培養は、CAR形質導入細胞とmock形質導入細胞との間の数の差を全体的にさらに増大させた(図3C)。標的細胞の非存在下でのCAR発現は、CD107a発現によって明らかにされた溶解顆粒のエキソサイトーシスを誘導し(図3D)、これは細胞回復の障害が同族殺傷によって引き起こされたことを示唆する。
CD7の下方制御は、T細胞同族殺傷を防ぎ、T細胞機能に影響を及ぼさない
貧弱なT細胞回収率が、T細胞によって発現されたCD7へのCAR結合によって媒介される同族殺傷によって引き起こされた場合、それはCAR発現前にCD7を下方制御することによって改善されるはずである。この予測をテストするために、ER保持ドメインKDELまたはKKMPを含むアミノ酸配列に連結された抗CD7 scFvの発現に基づいて最近開発された迅速かつ実用的な方法[抗CD7タンパク質発現ブロッカー(PEBL)]を適用した。(図3E)。これらは、構築物をER/ゴルジ体に固定し、標的タンパク質の分泌または膜発現を妨げる39,40。3種の抗CD7 PEBL構築物を試験し、PEBL-1は、次の実験のための選択PEBL-1であった(図3Eおよび図3F)。CD7表面発現は、この構築物で形質導入された全てのT細胞において本質的に無効にされたが、CD7 mRNA発現は、保持され(図3F、図10Aおよび図10B)、5つの実験では、98.1%±1.5%のmock形質導入T細胞は、CD7+であったのに対して、抗2.0%±1.7%は、CD7 PEBLで形質導入されたT細胞であった(P<0.0001)(図3G)。下方制御されたCD7を有する細胞においてエレクトロポレーションによって抗CD7 CARが発現されたとき、その発現は、フローサイトメトリーによって明らかに検出可能であった(図3H)。CD7ノックダウンを有する細胞においてCARを発現させることによって、T細胞生存率は、著しく改善され(図3I)、6対の実験において、CAR mRNAエレクトロポレーション後の生存細胞回収率は、抗CD7 PEBLで予め形質導入されていたT細胞において一貫して優れていた(P=0.008)。
抗CD7 PEBL形質導入後、CD4細胞とCD8細胞との比率は、mock形質導入細胞の比率と類似していた(図4A)。表面膜上のCD7発現の不存在は、培地中のT細胞生存に影響を及ぼさなかった(図4B)。抗CD7 PEBLで形質導入されたT細胞の機能的能力をさらに精査するために、抗CD19-CARを発現するように細胞を遺伝子操作した(図CA)。細胞傷害性を及ぼし、細胞傷害性顆粒を放出し、そしてCD19+ ALL細胞の存在下でIFNγを分泌するそれらの能力を試験した。図4D、図4Eおよび図4Fに示すように、PEBL形質導入および表面CD7の欠如は、CAR媒介細胞機能を変化させなかった。
抗CD7-41BB-CD3ζ CARは、CD7+白血病細胞に対する強力な細胞傷害性を誘導する
抗CD7 PEBLを用いてCD7陰性T細胞を調製し、抗CD7-41BB-CD3ζ CAR mRNAを用いてエレクトロポレーションした。それらの抗白血病能力は、CD7+白血病細胞系MOLT-4、CCRF-CEM、Jurkat、LoucyまたはKG1aとの共培養において評価された。図5Aに示すように、細胞傷害性は、CAR発現によって劇的に増加した。PEBL-CAR T細胞はまた、患者から得られた初代T-ALL細胞に対しても非常に有効であった(図5B)。
PEBL-CAR T細胞の細胞傷害性を、PEBLで形質導入されていない細胞におけるCARエレクトロポレーション後に回収された残存T細胞の細胞傷害性と比較した。3人のドナー由来の細胞を用いた45回の実験では、PEBL-CAR細胞の細胞傷害性は、非PEBL T細胞の細胞傷害性を一貫して超えていた(図5C)。CD107a(図5D)、IFNγ(図11A)およびTNFα(図11B)の発現を比較すると、PEBL-CAR細胞の優れた活性もまた観察された。連続レトロウイルス形質導入によるPEBLおよびCARの発現もまた、患者由来のT-ALL細胞(図5E)および細胞株(図12)に対して強力な細胞傷害性をもたらした。CD7+標的細胞の存在下での抗CD7 PEBL-CAR-T細胞の増殖は、PEBLによるCD7下方制御なしのCAR-Tの増殖よりもはるかに高かった(P<0.01)(図5F)。最後に、抗CD7 PEBL-CAR T細胞によって及ぼされる細胞傷害性を、同じ標的細胞に対する抗CD19-41BB-CD3ζ CARを発現するT細胞の細胞傷害性と比較した。この目的のために、CCRF-CEM細胞およびJurkat細胞をCD19で形質導入し、抗CD7 PEBLで予め形質導入された細胞においていずれのCARもまた発現した(図13Aおよび図13B)。抗CD7および抗CD19 CAR T細胞は、同様の短期細胞傷害性および長期細胞傷害性を有し(図13Cおよび図13D)、CD19+ CD7+標的細胞の存在下における長期増殖能力は、抗CD7 CAR-T細胞についてわずかに低く(図13E)、これは、標的細胞上のCD7の発現がCD19に対してより低いことにより説明できるであろう(図13B)。
T-ALLのマウスモデルにおける抗CD7 PEBL-CAR T細胞の抗白血病活性
抗CD7 PEBL-CAR T細胞の抗腫瘍能力をさらに評価するために、NOD/scid IL2RGnullにCCRF-CEM細胞を移植した。抗CD7 PEBLおよび抗CD7 CARでレトロウイルス形質導入されたT細胞は、白血病細胞負荷の顕著な減少および白血病細胞増殖の減少を伴って、顕著な抗白血病効果を生じた(図6A~図6C、図14Aおよび図14B)。白血病細胞注入の3週間後、フローサイトメトリーによる末梢血中のCCRF-CEM細胞の中央値百分率は、対照マウスで68%(n=5)であり、GFP単独T細胞を受けたマウスでは67%(n=5)であったが、抗CD7 PEBL-CAR T細胞で処置したマウスでは検出されなかった(図15A)。抗CD7 PEBL-CAR T細胞治療後に生じる再発は、CD7を欠くCCRF-CEM細胞サブセットによるものではなく、白血病細胞は、高レベルのCD7を発現し続け、CCRF-CEM細胞が再発マウスの肝臓もしくは脾臓に由来するか、または元の細胞培養物に直接由来するかにかかわらず、抗CD7CAR細胞傷害性に対する感受性は、高いままであった(図15B)。
インビボで初代白血病細胞に対してPEBL-CAR T細胞を試験するために、ETP-ALLのPDXモデルを使用した。PDXモデルは、NOD/scid IL2RGnullマウスにおける診断時にETP-ALLの患者に由来する白血病細胞の増殖を可能にする。白血病細胞は、CD7、CD34、CD33を発現し、かつ表面CD3、CD1a、CD8およびCD5が非存在で、診断時に決定された免疫表現型一致を保持し(図16)、細胞は、エクスビボで生存することも増殖することもできず、増殖のためにマウスに注入する必要があった。全てのマウスは、CAR-T処置時に末梢血中にETP-ALLを有していた(図7A)。図7Bに示すように、ETP-ALL細胞は、骨髄、脾臓肝臓および肺における白血球の大部分を占めていた。PEBL-CAR T細胞投与後(1匹のマウスでは2×10個、残りの4匹では2×10個)、末梢血中の白血病細胞数は、劇的に減少した一方で、PEBL-CAR-T細胞は、全てのマウスにおいて検出可能になった(図7A)。血液塗抹標本では、汚れ細胞が顕著であり、これは白血病細胞溶解を示唆していた(図7C)。白血病は、5匹の対照マウス全てで進行し、対照マウスは、ETP-ALLが末梢血単核細胞の>80%となった時点で安楽死させた。2×10個のPEBL-CAR-T細胞で処置したマウスは、PEBL-CAR-T細胞注入の23日後に見かけの移植片対宿主病(GvHD)により死亡した。血液、骨髄、肝臓、脾臓、肺および脳ではETP-ALLが検出されなかったが、PEBL-CAR T細胞は、全ての組織で検出可能であった(図7Dおよび図7E)。2×10個のPEBL-CAR T細胞で処置したマウス4匹は、注入後25日目(n=1)~39日目(n=3)に生存しており、GvHDの徴候は見られない。
考察
B細胞白血病およびリンパ腫の患者の寛解は、CAR-T細胞により達成することができるが、T細胞悪性腫瘍患者については、効果的な選択肢が不足している。このギャップを埋めるために、臨床的介入に迅速に移行することができるであろうCAR-T細胞アプローチが開発され、本明細書に記載された。化学療法にさらされたT-ALL細胞においてさえ非常に安定である広く発現された表面T細胞マーカーのCD7が標的とされた。第二世代の抗CD7 CARが設計された。T細胞におけるCD7表面発現の抑制が必須であると判定され、その抑制がなければ、CARは、重度のT細胞減少を引き起こし、CAR-T細胞の完全な機能的可能性は達成できなかったであろう。抗CD7 PEBLの形質導入は、事実上即効性のCD7発現の抑制をもたらした。そのような細胞における抗CD7 CARの発現は、インビトロにおいて、ならびにT-ALLの異種移植片およびPDXモデルにおいて、強力な抗白血病活性を生じた。したがって、この戦略を使用することによって、多数のCAR-T細胞が迅速に作製され、最もアグレッシブな形態の1つであるETP-ALLを含む、T細胞悪性腫瘍に対して安定かつ特異的な細胞傷害性を及ぼすために使用された。
内在性CD7を下方制御するための本明細書に記載のPEBL技術は、ER/ゴルジ体保持モチーフと結合された標的抗原に対するscFvの使用に基づいている。このようにして、新たに合成されたCD7はいずれも、ERおよび/またはゴルジ体に固定されたままであり、その表面発現は、妨げられる。この方法は、CD7を下方制御し、CAR媒介同族殺傷を抑制するのに著しく有効であった。重要なことに、CD7の細胞内保持は、T細胞機能を変化させず、正常な増殖、サイトカイン分泌、および細胞傷害性を可能にした。これは、リンパ系組織において正常なリンパ球集団を示したCD7欠損マウスを用いた研究の結果と一致する41,42。CD7を下方制御するための別のアプローチは、メガヌクレアーゼ、TALEN、またはCRISPR/Cas9などの遺伝子編集方法を適用することであろう43。この目的のために、最近の研究は、CRISPR/CasによるCD7遺伝子欠失を有するT細胞において発現された抗CD7 CARを報告した9,44。臨床的影響を及ぼしてもよい共刺激分子(本明細書に記載されるCARは、CD28の代わりに4-1BBを有する)の違いに加えて45,46、PEBL戦略の高い特異性および実際的性質は、それを現在の臨床用途にとって特に魅力的なものにしている。この方法は、2つの連続形質導入または両方の構築物を担持するバイシストロン性ベクターによる単一の形質導入のいずれかとして、CARを担持する同じウイルスベクターによる単純な形質導入を必要とする。その形質導入は、確立された臨床グレードの細胞製造プロセスによく適合し、標的外活性に関連して起こりうる規制上の懸念を生じさせない47,48
CD7は、初期T細胞分化に特徴的な分子であり、T-ALLにおいてほぼ普遍的に発現され、正常細胞の中では、その発現は、T細胞に限定される19,29-32。T細胞リンパ腫患者における抗CD7-リシン-A鎖免疫毒素を用いた臨床試験では、用量制限毒性は、他の毒素複合体で見られた副作用の血管漏出症候群であり、抗CD7の結合は、様々な組織の内皮細胞において見られなかった49。それにもかかわらず、mRNAエレクトロポレーションによるCARの一過性発現は、抗CD7 PEBL-CAR T細胞の急性毒性の可能性を評価する初期の研究において考慮される場合もある。抗CD7CAR療法の懸念は、注入された細胞による正常T細胞の減少であり、これは免疫不全症につながる。高リスクT-ALL患者においてMRDを減少させるための手段として、この技術の最初の適用を想定することができ、それ故に同種造血幹細胞移植の成功を最大化することができる50。そのような場合、抗CD7 CAR T細胞は、移植馴化およびドナー幹細胞から再構成されたT細胞区画によって排除されるであろう。移植環境以外では、白血病根絶が達成されれば「自殺遺伝子」を活性化することができる51。最終的に、(それらの内因性CD3/TCR複合体を保持する)注入された抗CD7 T細胞は、十分に広いT細胞レパートリーを再構成する場合があるため、これを問題としなくてもよい。この目的のために、CD7を発現しないヒト血液リンパ球中のCD4記憶T細胞およびCD8エフェクターT細胞のサブセットが記載されていること52,53、T-ALL細胞が正常T細胞よりも高いレベルでCD7を発現することに留意されたい。したがって、CD7-dimサブセットは、CD7を標的とした治療後でさえもT細胞レパートリーの再構築に役立つ場合がある。
T-ALLの標準的な治療法は、高リスク疾患患者に対する集中化学療法に加えて造血幹細胞移植に主に依存する。結果は、満足できるものではなく、かなりの罹患率と死亡率を示す54,55。本明細書に提示された知見は、抗CD7 PEBL-CAR T細胞の注入が既存の化学療法および移植に基づく戦略を大幅に増強するか、またはおそらく置き換えることができることを示唆する。おそらく、T細胞における標的抗原の下方制御を伴うCAR発現は、T細胞リンパ増殖性新生物において発現が優勢であるCD3、CD2、およびCD5などの他のT細胞マーカーにもまた適用可能であるはずである。高リスクの急性骨髄性白血病の一部がCD7を発現するため19,30,56、この白血病サブタイプについて抗CD7 CAR-T細胞の可能性をテストすることも求められる。
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本明細書に引用された全ての特許、公開された出願および参考文献の教示は、その全体が参照によって組み込まれる。
本発明をその例示的な実施形態を参照して具体的に図示し、かつ説明したが、特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細を様々に変更できることが当業者には理解されよう。

Claims (53)

  1. i)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記標的結合分子が、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、核酸と、
    ii)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記CARが、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に特異的に結合する第2の抗体と、を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞。
  2. CD7に特異的に結合する前記第1の抗体が、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項1に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  3. CD7に特異的に結合する前記第2の抗体が、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項1または2に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  4. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  5. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  6. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  7. 前記局在化ドメインが、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  8. 前記局在化ドメインが、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む小胞体(ER)保持配列を含む、請求項7に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  9. 前記局在化ドメインが、配列番号13のアミノ酸配列を含むCD8αのヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む、請求項7に記載の遺伝子操作細胞。
  10. 前記4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列を含み、前記CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  11. 前記CARが、ヒンジおよび膜貫通ドメインをさらに含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  12. 前記ヒンジおよび膜貫通ドメインが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  13. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  14. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  15. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  16. 前記遺伝子操作細胞が、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である、請求項1~15のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  17. i)局在化ドメインに連結された標的結合分子であって、前記標的結合分子が、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、標的結合分子と、
    ii)キメラ抗原受容体(CAR)であって、前記CARが、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に特異的に結合する第2の抗体と、を含む、CARと、を含む、遺伝子操作免疫細胞。
  18. CD7に特異的に結合する前記第1の抗体が、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項17に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  19. CD7に特異的に結合する前記第2の抗体が、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項17または18に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  20. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項17~19のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  21. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項17~19のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  22. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項17~19のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  23. 前記局在化ドメインが、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項17~19のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  24. 前記局在化ドメインが、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む小胞体(ER)保持配列を含む、請求項23に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  25. 前記局在化ドメインが、配列番号13のアミノ酸配列を含むCD8αのヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む、請求項23に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  26. 前記4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列を含み、前記CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項17~25のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  27. 前記CARが、ヒンジおよび膜貫通ドメインをさらに含む、請求項17~26のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  28. 前記ヒンジおよび膜貫通ドメインが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  29. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項17~28のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  30. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項17~28のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  31. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項17~28のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  32. 前記遺伝子操作細胞が、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である、請求項17~31のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。
  33. 請求項1~32のいずれか一項に記載の前記遺伝子操作免疫細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  34. 請求項1~32のいずれか一項に記載の前記遺伝子操作免疫細胞を作製する方法であって、前記方法が、
    i)免疫細胞に、
    a)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸であって、前記標的結合分子が、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、第1の核酸と、
    b)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸であって、前記CARが、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に特異的に結合する第2の抗体と、を含む、第2の核酸と、を導入することと、
    ii)前記局在化ドメインに連結された前記標的結合分子および前記CARを含む遺伝子操作免疫細胞を単離することと、を含む、方法。
  35. 治療を必要とする被験体の癌を治療する方法であって、治療量の遺伝子操作免疫細胞を前記被験体に投与することと、それによって治療を必要とする被験体の癌を治療することと、を含み、
    前記遺伝子操作免疫細胞が、
    i)局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記標的結合分子が、CD7に特異的に結合する第1の抗体である、核酸と、
    ii)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記CARが、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、CD7に特異的に結合する第2の抗体と、を含む、核酸と、を含む、方法。
  36. CD7に特異的に結合する前記第1の抗体が、第1の単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項35に記載の方法。
  37. CD7に特異的に結合する前記第2の抗体が、第2の単鎖可変フラグメント(scFv)である、請求項35または36に記載の方法。
  38. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項35~37のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項35~37のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記第1の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項35~37のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記局在化ドメインが、小胞体(ER)保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびCD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS、またはFGFR2Bに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項35~38のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記局在化ドメインが、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む小胞体(ER)保持配列を含む、請求項41に記載の方法。
  43. 前記局在化ドメインが、配列番号13のアミノ酸配列を含むCD8αのヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む、請求項41に記載の方法。
  44. 前記4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列を含み、前記CD3ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項35~43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記CARが、ヒンジおよび膜貫通ドメインをさらに含む、請求項35~44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ヒンジおよび膜貫通ドメインが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項45に記載の方法。
  47. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項35~46のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項35~46のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記第2の単鎖可変フラグメント(scFv)が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項35~46のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記遺伝子操作細胞が、遺伝子操作T細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー(NK)細胞、遺伝子操作NK/T細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である、請求項35~49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記遺伝子操作免疫細胞が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および/または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、または髄腔内投与によって前記被験体に投与される、請求項35~50のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記癌が、T細胞悪性腫瘍である、請求項35~51のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記T細胞悪性腫瘍が、早期T細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病(ETP-ALL)である、請求項52に記載の方法。
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