KR101521224B1 - T 세포 특이적인 인간화 단일조각항체 전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 T 세포를 특이적으로 표적화하는 인간화된 scFv 전달체에 관한 것으로서, 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 인간화된 scFv와, 상기 인간화된 scFv를 포함하는 T 세포 특이적로 약물 또는 표지물 전달체를 제공한다. 본 발명의 상기 인간화된 scFv는 항원성이 최소화되어 인체에 적용 시에도 면역 반응을 일으키지 않은 효과가 있는 바, iRNA 유전자 또는 면역 반응 조절 단백질 등과 같은 목적 물질을 T 세포에 특이적으로 전달하는 전달체로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

T 세포 특이적인 인간화 단일조각항체 전달체{Humanized single chain fragment antibody(scFv) carrier specific for T cell}
본 발명은 T 세포 특이적인 scFv 전달체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 T 세포를 특이적으로 표적화하는 인간화된 scFv 전달체에 관한 것이다.
의학 기술의 발전과 함께 현대 사회가 점차 고령화되면서, 점점 발병률이 높아지고 있는 노인성 질환이 새로운 사회문제로 대두되고 있다. 이러한 노인성 질환 중에서 가장 많은 비율을 차지하는 것이 류마티스나 콜론병과 같은, 인체의 면역세포의 면역 조절능력에 이상이 생겨 발생하는 자가면역 질환이다. 상기 자가면역 질환을 치료하기 위한 한 가지 대안으로서 T 세포나 대식세포 같은 면역 세포들을 통하여 면역반응을 조절하는 방법이 새롭게 주목받고 있다. 상기 T 세포는 면역 반응에서 매우 중요한 역할을 하며, T세포의 사이토카인 분비에 따라 면역반응 조절이 가능하므로 siRNA 유전자 또는 면역 반응 조절 단백질을 전달하여 면역반응을 조절함으로써, 상기와 같은 질병을 치료할 수 있다. 상기와 같은 siRNA 유전자 또는 면역 반응 조절 단백질을 T 세포로 전달하기 위해, T 세포에 특이적인 전달체를 이용함으로써 T 세포의 면역 반응을 조절하고 상기와 같은 질병의 치료에 이용할 수 있다.
최근 세포 특이적으로 치료 단백질 또는 유전자를 전달하기 위한 방법으로 항체를 이용하는 연구가 진행 중인데, 이는 항체의 항원결정부위가 항원에 특이적으로 결합하는 특성을 이용한 것이다. 상기 항체는 토끼, 염소, 그리고 설치류에서 생산된 것을 사용하고 있으나, 대부분의 연구 단계에서 동물 실험은 설치류를 대상으로 진행되고 있는 바, 설치류 유래의 항체가 많이 이용되고 있다. 이러한 연구의 성과로서, T 세포 표면 단백질인 CD7에 특이적으로 결합하는 마우스 유래의 scFv(muscFvCD7)와 Oligo-9-Arginine(9R)이 결합된 muscFvCD7-9R 전달체가 제조되었다. 상기 scFvCD7-9R 전달체에 에이즈 바이러스의 감염과 복제를 막을 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 결합함으로써, 상기 항 바이러스 siRNA를 T 세포에 특이적으로 전달할 수 있었고, 에이즈 바이러스의 감염과 복제를 비롯하여 생체 내 이미 존재하던 바이러스의 복제까지도 억제하는 효과가 확인되었다(Kumar et al., Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586).
그럼에도 불구하고, 종래 Kumar et al.(2008)의 연구에 사용된 CD7 특이적 scFv(muscFvCD7)는 설치류(Mus musculus)에서 유래된 것으로서, 인간화된 마우스 혹은 인체에 적용 시에 체내에서 항원성을 나타낸다. 상기와 같이 항원성을 가진 전달체의 경우, siRNA 유전자 또는 면역 반응 조절 단백질의 세포 특이적 전달에 앞서 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 원인이 될 수 있기 때문에 siRNA 유전자 또는 면역 반응 조절 단백질 등과 같은 목적 물질을 T 세포로 전달하는 효율이 떨어지는 문제가 있다. 이에, 상기와 같은 설치류 유래의 scFv를 전달체로서 이용하기 위한 인간화 단일 사슬 항체의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 인체 내에서 항원성을 나타내지 않으면서도 인간 T 세포를 특이적으로 표적화하는 인간화된 scFv 및 이를 이용한 약물 또는 표지물의 전달체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 인간화된 scFv를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 측면은 상기 인간화된 scFv를 포함하고, T 세포를 표적으로 하여 T 세포에 특이적으로 약물 또는 표지물을 운반하기 위한 전달체를 제공한다.
본 발명의 인간화된 scFv는 항원성이 최소화되어 인체에 적용 시에도 면역 반응을 일으키지 않은 효과가 있는 바, siRNA 유전자 또는 면역 반응 조절 단백질 등과 같은 목적 물질을 T 세포에 특이적으로 전달하는 전달체로서 유용하게 이용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1의 (A) 및 (B)는 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체(CD7cys)와 인간의 중쇄 서열(A) 및 인간의 경쇄 서열(B)을 비교하여 인간화 항체의 중쇄가변영역 및 인간화 항체의 경쇄가변영역의 아미노산 서열을 설계한 그림이고, 도 1의 (C)는 마우스 유래 항체와 인간화된 항체를 도식화한 그림이다.
도 2는 본 발명의 인간화 항체의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 발현하는 pdCMV-dhfrC-HzCD7 벡터의 맵을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 HzscFvCD7을 발현하는 HzscfvCD7-pET21b 발현 벡터의 맵을 나타낸 그림이다.
도 4는 E.coli BL21에서 발현시키고 정제하여 수득한 HzscFvCD7의SDS-PAGE한 젤 사진이다.
도 5의 (A)는 HzscFvCD7의 C-말단에 폴리 올리고-9-아르기닌(9R)이 결합된 복합체의 구조를 나타낸 개략도이고, 도 5의 (B)는 HzscFvCD7와 폴리 올리고-9-아르기닌(9R)이 결합되었는지 여부를 확인한 MALDI-TOF 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 HzscFvCD7와 리포좀이 결합된 복합체의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 7의 (A)는 HzscFvCD7-9R/siFITC 복합체가 Jurkat 세포 내로 도입된 효율을 확인한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 7의 (B)는 HzscFvCD7-9R/siCD4 복합체에 의하여 Jurkat 세포에서 CD4의 발현이 억제된 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 HzscFvCD7-9R/siCD4 복합체에 의하여 인간 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 CD4의 발현이 억제된 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 HzscFvCD7-리포좀/siCD4 복합체에 의하여 Jurkat 세포에서 CD4의 발현이 억제된 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10의 (A)는 HzscFvCD7-GFP 복합체에 의하여 HSB2 세포 내로 GFP가 도입되는 결과를 타나내는 그래프이고, 도 10의 (B)는 HzscFvCD7-PLGA 복합체에 의하여 Jurkat 세포 내로 PLGA가 도입되는 결과를 타나내는 그래프이다.
도 11은 HzscFvCD7와 muscFvCD7을 대상으로 경쟁 분석(competition assay)을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 인간화된 마우스(Hu-HSC)의 조직에서 인간 세포의 존재 여부를 확인한 그래프로서, (A)는 혈액, 간, 흉선 및 뇌를 대상으로 인간 CD45+ 세포의 존부를 확인한 FACS 결과의 그래프이고; (B)는 6 마리의 마우스에서 각 조직별로 얻는 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간화된 마우스(Hu-HSC) 내의 인간 세포에 대한 HzscFvCD7의 특이성을 확인한 결과로서, (A)는 Hu-HSC의 혈액 내에 인간 CD45+ 세포가 존재함을 확인한 그래프이고; (B)는 HzscFvCD7가 마우스 CD45+ 세포에는 결합하지 않음을 확인한 그래프이며; (C)는 HzscFvCD7가 인간 CD45+ 세포에 특이적으로 결합함을 확인한 그래프이다.
도 14는 인간화된 마우스(Hu-HSC) 내의 인간 세포 중에서도 인간 T 세포에 대한 HzscFvCD7의 특이성을 확인한 결과로서, (A)는 Hu-HSC의 혈액 내에 인간 CD45+ 세포 중에서 CD3+ T 세포의 비율을 확인한 그래프이고; (B)는 CD3+ T 세포에 HzscFvCD7이 특이적으로 결합함을 확인한 그래프이며; (C)는 CD45+ 인간 세포 중에서 CD3이 발현되지 않는 CD3- 세포에는 HzscFvCD7이 결합하지 않음을 확인한 그래프이다.
도 15는 인간화된 마우스(Hu-PBL)에서 HzscFvCD7-9R/siFITC 복합체에 의해 siFITC가 T 세포에 특이적으로 전달되는지 여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 인간화된 마우스(Hu-PBL)에서 HzscFvCD7-PLGA 복합체에 의해 PLGA가 T 세포에 특이적으로 전달되는지 여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 인간화된 마우스(Hu-HSC)에서 약물동태학적 특성(pharmacokinetics, PK)을 분석한 그래프이다.
도 18은 인간 항 마우스 항체를 이용하여 HzscFvCD7의 인체 내에서의 항원성을 in vitro에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 인간화된 마우스(Hu-BLT)에 HzscFvCD7를 주입한 다음 췌장 세포의 분화(differentiation) 정도를 측정함으로써, HzscFvCD7의 인체 내에서의 항원성을 in vivo에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 인간화된 마우스(Hu-BLT)에 HzscFvCD7를 주입한 다음 췌장 세포의 증식(proliferation) 정도를 측정함으로써, HzscFvCD7의 인체 내에서의 항원성을 in vivo에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 인간 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7) 및 이를 발현하는 벡터
본 발명의 일 측면은 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 인간화된 scFv를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 T 세포 특이적 인간화 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 T 세포 특이적 인간화 항체의 경쇄가변영역(VL)을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 인간화된 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 상기 인간화된 scFv는 인간화된 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 인간화된 항체의 경쇄가변영역(VL)을 포함한다.
상기 인간화된 항체의 중쇄가변영역(VH) 및 경쇄가변영역(VL)은 3개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)(이하, CDR이라 한다.)과 4개의 프레임워크(framework)(이하, FR이라 한다.) 부분이 상기 중쇄가변영역(VH) 및 상기 경쇄가변영역(VL)의 N-말단에서부터 C-말단까지 'FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4'의 순서로 배열된다.
상기 인간화된 항체 중쇄가변영역(VH)은 FR 부분과 CDR의 아미노산 서열이 각각 인간 중쇄 서열, 특히 IGHV3-h*01(P)의 FR 부분 및 인간 CD7에 대한 비인간 유래 항체의 CDR과 높은 상동성을 가지도록 구성되는 것이 바람직하고, 상기 인간화된 항체 중쇄가변영역(VH)은 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 것이 더욱 바람직하고, 서열번호 33으로 기재되는 염기 서열에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 인간화된 항체 중쇄가변영역(VH)은 T 세포에 대한 특이적인 상보성과 인간의 면역 시스템에 대한 최소의 항원성을 동시에 가지면서 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래되는 다양한 변이체를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체(CD7cys)의 CDR 부분과 인간 중쇄 서열인 IGHV3-h*01(P)의 FR 부분을 조합하여 'FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4'의 순서로 배열시킴으로써, 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역(VH)을 설계하였다(도 1 참조).
상기 인간화된 항체 경쇄가변영역(VL)은 FR 부분과 CDR의 아미노산 서열이 각각 인간 경쇄 서열, 특히 IGKV1-27*01의 FR 부분 및 인간 CD7에 대한 비인간 유래 항체의 CDR과 높은 상동성을 가지도록 구성되는 것이 바람직하고, 상기 인간화된 항체 경쇄가변영역(VL)은 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 것이 더욱 바람직하고, 서열번호 35으로 기재되는 염기 서열에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 인간화된 항체 경쇄가변영역(VL)은 T 세포에 대한 특이적인 상보성과 인간의 면역 시스템에 대한 최소의 항원성을 동시에 가지면서 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래되는 다양한 변이체를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체(CD7cys)의 CDR 부분과 인간 경쇄 서열인 IGKV1-27*01의 FR 부분을 조합하여 'FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4'의 순서로 배열시킴으로써, 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역(VL)을 설계하였다(도 1 참조).
본 발명의 상기 인간화된 scFv는 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 중쇄가변영역(VH)은 서열번호 33으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의하여 코딩되고, 상기 경쇄가변영역(VL)은 서열번호 35으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의하여 코딩되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 인간화된 scFv는 T 세포에 대한 특이적인 상보성과 인간의 면역 시스템에 대한 최소의 항원성을 동시에 가지면서 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래되는 다양한 변이체이면 특별히 제한하지 아니하나, 상기 인간화된 scFv는 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 것이 바람직하고, 상기 인간화된 scFv는 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의하여 코딩되는 것이 더욱 바람직하며, 상기 인간화된 scFv는 서열번호 37로 기재되는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의하여 코딩되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 인간화된 scFv를 코딩하는 유전자 컨스트럭트, 더욱 바람직하게는 서열번호 37로 기재되는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 벡터를 이용하여 인간화된 scFv를 반복적으로 양산해 낼 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 인간화된 scFv와 외래 단백질이 융합된 재조합 단백질을 제조할 필요가 있는 경우에 상기 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site, MCS)에 상기 외래 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킴으로써, 인간화된 scFv와 상기 외래 단백질이 융합된 재조합 단백질을 양산할 수 있다.
상기 인간화된 scFv는 인간 CD7에 대한 비인간 유래 항체의 CDR과 높은 상동성을 갖도록 설계되어 있기 때문에, 상기 인간화된 scFv 또한 인간 CD7에 특이적으로 상보성을 갖는다. 상기 CD7은 인간 T 세포의 표면에서 특이적으로 발현되는 단백질인바, 본 발명의 상기 인간화된 scFv는 결국 인간 T 세포에 특이적으로 결합하게 된다.
또한, 상기 인간화된 scFv는 인간 유래의 중쇄 및 경쇄 서열의 FR과 높은 상동성을 갖도록 설계되어 있기 때문에, 인간의 면역 시스템에 대한 최소의 항원성을 나타낸다. 따라서, 상기 인간화된 scFv가 특별한 면역 거부 반응 없이 인체에 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 재조합 PCR 반응을 반복적으로 수행하여 최종적으로 서열번호 37로 기재되는 염기 서열이 포함된 HzscfvCD7-pET21b 발현 벡터를 제조하였고(도 3 참조), 이를 E.coli strain인 BL21에서 발현 및 정제시켜 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약 27kDa의 HzscFvCD7을 수득하였다(도 4 참조). (1)상기와 같이 제조된 HzscFvCD7과 종래의 muscFvCD7(Kumar et al., Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586)을 대상으로 경쟁 분석(competition assay)을 수행하여 HzscFvCD7가 muscFvCD7와 동일한 항원을 인지한다는 점을 in vitro에서 확인하였고(도 11 참조), (2)상기와 같이 제조된 HzscFvCD7을 인간화된 마우스(Hu-HSC)에 주입하여 CD45+/CD3+ 인간 T 세포, 보다 정확히는 인간 T 세포의 CD7 단백질에 특이적으로 결합함을 in vivo에서 확인하였으며(도 12 내지 도 14 참조), (3)상기와 같이 제조된 HzscFvCD7에 의하여 인간화된 마우스(Hu-PBL)에서 siFITC(CD4에 대한 siRNA에 FITC가 결합된 결합체) 또는 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))가 인간 T 세포에 특이적으로 전달됨을 in vivo에서 확인하였다(도 15 및 도 16 참조). 또한, 약물동태학적 분석을 통하여 상기 HzscFvCD7의 T 세포에 대한 특이성이 기 개발된 인간화된 항체/scFv에 비해 우수함을 확인하였다(도 17 및 표 1 참조). 아울러, 인간 항 마우스 항체(HAMA)를 이용하여 상기 HzscFvCD7의 인체 내 항원성 정도를 in vitro에서 측정한 결과, HAMA가 희석될수록 HAMA에 의한 면역 반응이 점점 줄어들고, HAMA가 1 : 100으로 희석된 경우에는 면역 반응이 70% 정도 감소하였다(도 18 참조). 상기와 같은 결과로부터, 종래 mAbCD7 및 muscFvCD7(Kumar et al., Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586)에 비하여 인체 내 항원성이 현저히 감소하였음을 in vitro에서 확인하였다. 또한, 상기와 같이 제조된 HzscFvCD7을 인간화된 마우스(Hu-BLT)에 주입하여 췌장 세포의 분화(differentiation) 및 증식(proliferation)을 유도 정도를 측정한 결과, HzscFvCD7에 의해서는 인간화된 마우스 내 췌장 세포의 분화 또는 증식이 그다지 유도되지 않음을 확인하였다(도 19 및 도 20 참조).
2. HzscFvCD7를 포함하는 전달체(carrier)
본 발명의 또 다른 측면은 상기 "1. 인간 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7) 및 이를 발현하는 벡터 " 항목에서 설명된 인간화된 scFv를 포함하고, T 세포를 표적으로 하여 T 세포에 특이적으로 T 세포 활성 조절제 또는 표지물을 운반하기 위한 전달체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 인간화된 scFv; 및 상기 scFv의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 표지물을 포함하는, T 세포 매개 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 인간화된 scFv; 및 상기 scFv의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 T 세포 활성 조절제를 포함하는, T 세포 매개 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 인간화된 scFv에 관해서는 상기 "1. 인간 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7) 및 이를 발현하는 벡터 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 인간 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7) 및 이를 발현하는 벡터 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 전달체 및 조성물에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.
상기 "1. 인간 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7) 및 이를 발현하는 벡터 " 항목에서 설명된 scFv는 인간 T 세포에 특이적으로 결합하는 상보성을 가지면서도 특별한 면역 거부 반응 없이 인체에 적용될 수 있는 특징이 있기 때문에, T 세포 활성 조절제 또는 표지물을 T 세포에 특이적으로 전달하는 전달체로서 이용될 수 있다.
(1')상기 scFv에 표지물이 결합되면, T 세포만을 특이적으로 표지할 수 있다. 따라서, 상기 scFv과 표지물의 융합물은 T 세포 매개 질환의 진단용 조성물로서 이용될 수 있다. 또한, (2')상기 scFv에 T 세포 활성 조절제가 결합되면, T 세포에 특이적으로 상기 T 세포 활성 조절제를 전달할 수 있게 되므로 상기 scFv과 T 세포 활성 조절제의 융합물은 T 세포 매개 질환의 치료용 약학적 조성물로서 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 T 세포 매개 질환 진단용 조성물은 상기 인간화된 scFv, 및 상기 scFv의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 표지물을 포함한다.
상기 인간화된 scFv에 관해서는 상기 "1. 인간 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7) 및 이를 발현하는 벡터 " 항목에서 설명한 바와 동일하므로, 상세한 설명은 생략하도록 한다.
상기 표지물은 T 세포를 검출 및 정량하기 위한 것으로서, 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 표지물이 상기 scFv에 융합되는 경우, 상기 표지물은 상기 scFv의 T 세포에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 융합되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 scFv에 직접적으로 링크(공유결합 또는 가교)되거나, 링커(9R3L, 18R6L 또는 리포좀 등)를 통하여 간접적으로 융합되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 표지물의 융합 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기 표지물이 융합된 scFv는 T 세포를 표적화하기 때문에 상기 조성물이 체내에 주입되면, scFv가 T 세포에 특이적으로 결합하게 되고, 상기 scFv에 융합된 표지물의 위치나 양을 측정함으로써, T 세포 매개 질환의 여부를 진단할 수 있는 것이다.
상기 T 세포 매개 질환은 후천성 면역 결핍증(AIDS), 이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질환, 원하지 않게 지연된 형태의 과민성 반응, T 세포 매개성 폐 질환 및 자가면역 질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 T 세포 매개 질환은 후천성 면역 결핍증(AIDS), 다발성 경화증, 신경염(neuritis), 다발근육염(polymyositis), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 1형 당뇨병, 자가면역성 췌장염(autoimmune pancreatitis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases), 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 복부질환(celiac disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 피부경화증(scleroderma), 사코이드종, 자가면역성 갑상선 질환, 하시모토 갑상선염, 그레이브스 질환, 중증근무력증(myasthenia gravis), 애디슨 병(Addison's disease), 자가면역성 유베오레티니티스(autoimmune uveoretinitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 악성 빈혈(pernicious anemia) 및 전신성 루푸스 홍반증(systemic lupus erythematosis)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 상기 T 세포 매개 질환 치료용 약학적 조성물은 인간화된 scFv, 및 상기 scFv의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 T 세포 활성 조절제를 포함한다.
상기 인간화된 scFv에 관해서는 상기 "1. 인간 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7) 및 이를 발현하는 벡터 " 항목에서 설명한 바와 동일하므로, 상세한 설명은 생략하도록 한다.
상기 T 세포 활성 조절제는 T 세포 활성 억제제 또는 T 세포 활성 증강제일 수 있다. 상기 T 세포 활성 조절제가 상기 scFv에 융합되는 경우, 상기 T 세포 활성 조절제는 상기 scFv의 T 세포에 대한 특이성 또는 선택성에 영향이 없도록 융합되는 것이 바람직하고, 이를 위하여 상기 scFv에 직접적으로 링크(공유결합 또는 가교)되거나, 링커(9R 또는 리포좀 등)를 통하여 간접적으로 융합되어 제공될 수 있다. 상기와 같은 T 세포 활성 조절제의 융합 위치는 당업자가 반복 실험을 통하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기 T 세포 활성 조절제가 T 세포 활성 억제제인 경우, 상기 T 세포 활성 억제제는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 등 일 수 있고, 상기 T 세포 활성 억제제를 포함하는 상기 약학적 조성물은 T 세포의 과분화 및 과증식에 의한 과활성으로 인해 발생하는 질환의 치료를 위하여 이용될 수 있다. 상기 T 세포의 과활성화로 인해 발생하는 질환은 이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질환, 원하지 않게 지연된 형태의 과민성 반응, T 세포 매개성 폐 질환 및 자가면역 질환 등이 있으며, 보다 구체적으로는 다발성 경화증, 신경염(neuritis), 다발근육염(polymyositis), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 1형 당뇨병, 자가면역성 췌장염(autoimmune pancreatitis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases), 크론 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 복부질환(celiac disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 피부경화증(scleroderma), 사코이드종, 자가면역성 갑상선 질환, 하시모토 갑상선염, 그레이브스 질환, 중증근무력증(myasthenia gravis), 애디슨 병(Addison's disease), 자가면역성 유베오레티니티스(autoimmune uveoretinitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 악성 빈혈(pernicious anemia) 및 전신성 루푸스 홍반증(systemic lupus erythematosis) 등 일 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 것이다. 상기 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 작은 간섭 RNA(siRNA)는 세포 내에서 표적 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합(혼성화)하여, 상기 표적 폴리펩티드의 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 것으로서, T 세포 내에서 발현되는 어느 하나의 유전자의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 nt 길이의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성된다. 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25 nt길이의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 50 내기 100 nt 길이를 가지는 단일 가닥의 RNA가 세포 내에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고, 5 내지 30 nt 길이의 뉴클레오티드의 루프(loop) 부위 양쪽으로 상보적으로 15 내지 50 nt 길이의 신 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템(stem)을 형성하며, 상기 스템 형성 가닥 각각의 이전과 이후에 1 내지 500 nt 길이의 뉴클레오티드를 추가로 더 포함하는 전체 길이의 RNA를 의미하는 것이다. 상기와 같은 shRNA는 세포 내에서 루프가 절단되고, 상기 siRNA와 같이 표적 폴리펩티드의 DNA에서 단백질로의 유전정보 흐름을 방해하는 작용을 한다. 상기 shRNA는 세포 내에서 절단된 후, T 세포 내에서 발현되는 어느 하나의 유전자의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30 nt 길이의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열을 가지게 되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 T 세포 활성 조절제가 T 세포 활성 증강제인 경우, 상기 T 세포 활성 증강제는 지도부딘(Zidovudine), 디다노신(Didanosine), 잘시타빈(Zalcitabine), 스타부딘(Stavudine), 라미부딘(Lamivudine), 네비라핀(Nevirapine), 델라비르딘(Delavirdine), 리토나비어(Ritonavir), 인디나비어(Indinavir), 넬피나비어(Nelfinavir) 등과 같은 항 바이러스제 등 일 수 있고, 상기 T 세포 활성 증강제를 포함하는 상기 약학적 조성물은 T 세포의 활성 저하로 인해 발생하는 질환의 치료를 위하여 이용될 수 있으며, 상기와 같은 T 세포의 활성 저하로 인해 발생하는 질환은 대표적으로 후천성 면역 결핍증(AIDS)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 HzscFvCD7에 9R 및 리포좀과 같은 링커를 이용하여 CD4에 대한 siRNA(siCD4) 또는 상기 siCD4에 FITC가 결합된 siFITC를 융합시켜 도 5 또는 도 6과 같은 구조의 복합체를 제조하였고(도 5 및 도 6 참조), 상기와 같이 제조된 복합체를 T 세포인 Jurkat 세포 또는 인간 말초 혈액 단핵세포에 처리하여, 세포 내부로의 siFITC 도입 효율 및 세포 표면에서 발현되는 CD4의 발현 억제율을 측정하였다. 그 결과, 상기 HzscFvCD7-9R에 의하여 siFITC가 높은 효율로 Jurkat 세포 내에 도입되고(도 7의 (A) 참조), 상기 HzscFvCD7-9R에 의하여 전달된 siCD4에 의하여 Jurkat 세포 및 인간 말초 혈액 단핵세포에서의 CD4 발현이 억제되었으며(도 7의 (B) 및 도 8 참조), 상기 HzscFvCD7-리포좀에 의하여 전달된 siCD4에 의하여 Jurkat 세포에서의 CD4 발현이 억제되었다(도 9 참조). 또한, 상기 HzscFvCD7에 결합된 단백질 GFP와 고분자 PLGA가 Jurkat 세포에 특이적으로 표적화됨을 확인하였다(도 10 참조). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 HzscFvCD7이 T 세포 특이적으로 siRNA와 같은 T 세포 활성 조절제를 전달하여 T 세포의 활성을 조절하는데 이용될 수 있음을 알 수 있다.
상기 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 scFv와 T 세포 활성 조절제의 융합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내, 뇌 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고, 중뇌에 직접 주사되어 투여되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 하루 1 내지 6회 분할 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
인간 CD7 에 대한 인간화된 scFv ( HzscFvCD7 )의 제조
<1-1> HzscFvCD7의 설계
IMGT(www.imgt.org) 사이트를 통하여 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체(CD7cys)와 가장 아미노산 서열의 상동성이 높은 인간 생식세포 라인을 검색한 결과, ①인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체(CD7cys)의 중쇄 서열은 인간 중쇄 서열 중 IGHV3-h*01(P)와 가장 유사하고, ②인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체(CD7cys)의 경쇄 서열은 인간 경쇄 서열 중 IGKV1-27*01과 가장 유사하였다. 상기와 같은 결과로부터, 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체(CD7cys)의 CDR 부분을 보존하면서, FR(framework) 부분(항체의 CDR중 가장 변화가 심한 부분을 HV(hyper variable region이라하고 상대적으로 아미노산 서열 변화가 적고 안정적인 부분을 FR이라 함)을 인간 중쇄 또는 경쇄 서열로 치환하여 CD7에 대한 인간화된 scFv(HzscFvCD7)을 설계하였다(도 1). 다만, 상기 HzscFvCD7를 설계함에 FR부분이라 하더라도 scFv의 구조나 친화도에 영향을 미치는 부위는 인간 중쇄 또는 경쇄 서열로 치환하지 않고, 마우스 유래 항체의 서열을 그대로 유지하였다.
그 결과, 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 HzscFvCD7의 중쇄 서열(도 1의 (A) 중 HzCD7cys)이 설계되었고, 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HzscFvCD7의 경쇄 서열(도 1의 (B) 중 HzCD7cys)이 설계되었다.
<1-2> 전체 IgG 벡터(whole IgG vector)를 이용한 인간화 중쇄 및 경쇄 가변영역의 제작
<1-2-1> 인간화 중쇄 가변영역의 염기서열 합성
먼저, 서열번호 38의 염기서열을 갖는 중쇄 유전자의 신호서열을 합성하기 위하여, pdCMV-dhfr-AKA/HzK(대한민국 등록특허 제10-0318761호)를 주형으로 하고 서열번호 1로 기재되는 LHS39 프라이머와 서열번호 2으로 기재되는 HCleaderBack 프라이머를 쌍으로 PCR을 수행하였다.
다음으로, 서열번호 39의 염기서열을 갖는 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체의 중쇄 가변영역을 합성하기 위하여, scfvCD7-pET21b(George Fey 박사로부터 입수한 pAK400scFvCD7-GFP 컨스트럭트(Matthias Peipp et al., CANCER RESEARCH 62, 2848??855, May 15, 2002)로부터 이후에 양전하 siRNA 결합 모이어티와 S-S(disulfide) 컨쥬게이션을 할 수 있도록 scFvCD7의 코딩서열의 프레임에 맞게 C-말단 시스테인 잔기가 도입된 프라이머를 이용하여 PCR-증폭한 후, PCR-증폭된 scFvCD7Cys를 pET21b 벡터(Cat# 69741-3, Novagen, 미국)에 클로닝함으로써 제작된 것임., 대한민국 공개특허 제10-2010-0050438호 참조)를 주형으로 서열번호 3으로 기재되는 CD7H-F 프라이머와 서열번호 4로 기재되는 CD7H-R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
상기와 같이 얻어진 서열번호 39의 염기서열을 갖는 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체의 중쇄 가변영역을 인간화하기 위해, (1)서열번호 3으로 기재되는 CD7H-F 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 CD7H1-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 40의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각1'을, (2)서열번호 5로 기재되는 CD7H1-F 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 CD7H2-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 41의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각2'를, (3)서열번호 7로 기재되는 CD7H2-F 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 CD7H3-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 42의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각3'을, (4)서열번호 9로 기재되는 CD7H3-F 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 CD7H4-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 43의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각4'를, (5)서열번호 11로 기재되는 CD7H4-F 프라이머 및 서열번호 14로 기재되는 CD7H5-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 44의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각5'를, (6)서열번호 13로 기재되는 CD7H5-F 프라이머 및 서열번호 15로 기재되는 CD7H6-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 45의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각6'을 각각 수득하였다.
상기와 같이 수득된 인간 CD7에 대한 인간화 중쇄 가변영역의 6개 염기서열 조각을 붙이기 위하여, '인간화 중쇄 가변영역 조각1', '인간화 중쇄 가변영역 조각2' 및 '인간화 중쇄 가변영역 조각3'을 주형으로 하고 서열번호 3로 기재되는 CD7H-F 프라이머와 서열번호 10로 기재되는 CD7H3-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여 서열번호 46의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각1-1(구체적인 염기 서열 기재 요망)'을 수득하였다. 또한, '인간화 중쇄 가변영역 조각4', '인간화 중쇄 가변영역 조각5' 및 '인간화 중쇄 가변영역 조각6'을 주형으로 하고 서열번호 9로 기재되는 CD7H3-F 프라이머와 서열번호 15로 기재되는 CD7H6-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여 서열번호 47의 염기서열을 갖는 '인간화 중쇄 가변영역 조각1-2'를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 인간화 중쇄 가변영역 조각1-1 및 1-2를 주형으로 하고, 다시 서열번호 3으로 기재되는 CD7H-F 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 CD7H-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여, 서열번호 33의 인간 CD7에 대한 인간화 중쇄 가변영역의 염기서열을 제조하였다.
상기와 같이 얻어진 서열번호 38의 신호서열과 서열번호 33의 인간 CD7에 대한 인간화 중쇄 가변영역을 주형으로 하고 서열번호 1로 기재되는 LHS39 프라이머와 서열번호 4로 기재되는 CD7H-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여, 상기 서열번호 38의 신호서열과 서열번호 33의 인간 CD7에 대한 인간화 중쇄 가변영역을 서로 연결(hzCD7(VH))한 다음, 상기와 같이 연결된 hzCD7(VH) 단편의 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후, pdCMV-dhfrC-AKA/HzK 벡터의 EcoRI-ApaI 위치에 삽입하여 pdCMV-dhfrC-hzCD7(VH)를 제조하였다.
상기와 같은 hzCD7(VH) 단편을 제작하는 과정에서 수행된 모든 PCR 반응은 95℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃, 52℃ 및 72℃의 온도에서 각각 50초, 50초 및 1분 동안 Taq DNA 중합효소로 30회 반복되었다.
<1-2-2> 인간화 경쇄 가변영역의 염기서열 합성
먼저, 서열번호 48의 염기서열을 갖는 경쇄 유전자의 신호서열을 합성하기 위하여, pdCMV-dhfr-AKA/HzK(대한민국 등록특허 제10-0318761호)를 주형으로 하고 서열번호 16로 기재되는 LHS42 프라이머와 서열번호 17로 기재되는 KCleaderback 프라이머를 쌍으로 PCR을 수행하였다.
다음으로, 서열번호 49의 염기서열을 갖는 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체의 경쇄 가변영역의 염기서열을 합성하기 위하여, 상기 실시예 <1-2-1>의 scfvCD7-pET21b를 주형으로 서열번호 18로 기재되는 CD7L-F 프라이머와 서열번호 19로 기재되는 CD7L-R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
상기와 같이 얻어진 서열번호 49의 염기서열을 갖는 인간 CD7에 대한 마우스 유래 항체의 경쇄 가변영역을 인간화하기 위해, (1')서열번호 18로 기재되는 CD7L-F 프라이머 및 서열번호 21로 기재되는 CD7L1-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 50의 염기서열을 갖는 '인간화 경쇄 가변영역 조각1'을, (2')서열번호 20으로 기재되는 CD7L1-F 프라이머 및 서열번호 23으로 기재되는 CD7L2-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 51의 염기서열을 갖는 '인간화 경쇄 가변영역 조각2'를, (3')서열번호 22로 기재되는 CD7L2-F 프라이머 및 서열번호 125로 기재되는 CD7L3-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 52의 염기서열을 갖는 '인간화 경쇄 가변영역 조각3'을, (4')서열번호 24로 기재되는 CD7L3-F 프라이머 및 서열번호 19로 기재되는 CD7L-R 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 서열번호 53의 염기서열을 갖는 '인간화 경쇄 가변영역 조각4'를 각각 수득하였다.
상기와 같이 수득된 인간 CD7에 대한 인간화 경쇄 가변영역의 4개 조각을 붙이기 위하여, '인간화 경쇄 가변영역 조각1' 및 '인간화 중쇄 가변영역 조각2'를 주형으로 하고 서열번호 18로 기재되는 CD7H-F 프라이머와 서열번호 23로 기재되는 CD7L2-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여 서열번호 54이 염기서열을 갖는 '인간화 경쇄 가변영역 조각1-1'을 수득하였다. 또한, '인간화 경쇄 가변영역 조각3', 및 '인간화 경쇄 가변영역 조각4'를 주형으로 하고 서열번호 22로 기재되는 CD7L2-F 프라이머와 서열번호 19로 기재되는 CD7L-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여 서열번호 55의 염기서열을 갖는 '인간화 경쇄 가변영역 조각1-2'를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 인간화 경쇄 가변영역 조각1-1 및 1-2를 주형으로 하고, 다시 서열번호 18로 기재되는 CD7L-F 프라이머 및 서열번호 19로 기재되는 CD7L-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여, 서열번호 35의 인간 CD7에 대한 인간화 경쇄 가변영역의 염기서열을 제조하였다.
상기와 같이 얻어진 서열번호 48의 신호서열과 서열번호 35의 인간 CD7에 대한 인간화 경쇄 가변영역의 염기서열을 주형으로 하고 서열번호 16로 기재되는 LHS42 프라이머와 서열번호 19로 기재되는 CD7L-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여, 상기 신호서열과 서열번호 35의 인간 CD7에 대한 인간화 경쇄 가변영역의 염기서열을 서로 연결(hzCD7(VK))한 다음, 상기와 같이 연결된 hzCD7(VK) 단편의 양끝을 제한효소 HindIII과 BsiWI으로 절단한 후, 상기 실시예 <1-2-1>에서 제조된 pdCMV-dhfrC-hzCD7(VH)의 HindIII-BsiWI 위치에 삽입하여 도 2와 같은 구조의 pdCMV-dhfrC-HzCD7 벡터를 제조하였다.
상기와 같은 hzCD7(VK) 단편을 제작하는 과정에서 수행된 모든 PCR 반응은 95℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃, 52℃ 및 72℃의 온도에서 각각 50초, 50초 및 1분 동안 Taq DNA 중합효소로 30회 반복되었다.
<1-3> 제조된 경쇄 및 중쇄 가변영역에 대한 염기서열 분석
상기 실시예 <1-2>에서 제조된 pdCMV-dhfrC-hzCD7 클론들의 경쇄 및 중쇄 가변영역에 대한 염기서열을 T7 시쿼네이즈(Sequenase) V2.0 DNA 시퀀싱 키트(Amersham)로 분석하였다.
그 결과, 인간 CD7에 대한 인간화 중쇄 및 경쇄 가변영역은 상기 실시예 <1-1>에서 설계한 바와 같이 각각 서열번호 33 및 서열번호 35의 염기 서열로 구성되어 있음을 확인하였다.
<1-4> 인간 CD7에 대한 인간화 scFv의 제작
인간 CD7에 대한 인간화 scFv를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서 제조된 pdCMV-dhfrC-hzCD7 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 26으로 기재되는 scFv L-ndeI-F 프라이머와 서열번호 27으로 기재되는 scFv L-R로 PCR을 수행하여 인간 CD7에 대한 인간화 항체의 경쇄 가변영역에 대한 염기서열(서열번호 35)을 수득하였다. pdCMV-dhfrC-hzCD7 벡터를 주형으로 하고, 다시 서열번호 30으로 기재되는 scfv H-F 프라이머와 서열번호 31로 기재되는 scfv H-XhoI-R 프라이머로 PCR을 수행하여 인간 CD7에 대한 인간화 항체의 중쇄 가변영역에 대한 염기서열(서열번호 33)을 수득하였다. 마지막으로, scfvCD7-pET21b를 주형으로 하고 서열번호 28로 기재되는 linker-F 프라이머와 서열번호 29로 기재되는 linker-R 프라이머로 PCR을 수행하여, scFv의 링커(linker)를 코딩하는 서열번호 56의 염기서열을 수득하였다.
상기와 같이 수득한 경쇄 가변영역, 링커 영역, 및 중쇄 가변영역을 주형으로 하고, 서열번호 26으로 기재되는 scFv L-ndeI-F 프라이머와 서열번호 31로 기재되는 scfv H-XhoI-R 프라이머로 재조합 PCR을 수행하여, 상기 경쇄 가변영역, 링커 영역, 및 중쇄 가변영역을 순차적으로 연결(hzscFvCD7)한 다음, 상기와 같이 연결된 hzscFvCD7 단편의 양끝을 제한효소 ndeI과 XhoI으로 절단한 후 scfvCD7-pET21b 벡터의 ndeI-XhoI 부분에 삽입하여 도 3과 같은 구조의 HzscfvCD7-pET21b 발현 벡터를 제조하였다.
상기와 같은 hzscFvCD7 단편을 제작하는 과정에서 수행된 모든 PCR 반응은 95℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃, 52℃ 및 72℃의 온도에서 각각 50초, 50초 및 1분 동안 Taq DNA 중합효소로 30회 반복되었다.
<1-5> 제조된 인간 CD7에 대한 인간화 scFv(HzscFvCD7)의 염기서열 분석
상기 실시예 <1-4>에서 제조된 HzscfvCD7-pET21b 클론들의 HzscFvCD7에 대한 염기서열을 T7 시쿼네이즈(Sequenase) V2.0 DNA 시퀀싱 키트(Amersham)로 분석하였다.
그 결과, 상기 HzscFvCD7의 경쇄 및 중쇄 가변영역은 pdCMV-dhfrC-HzCD7의 경쇄(HzCD7(VK)) 및 중쇄(HzCD7(VH)) 가변영역의 염기서열(서열번호 33 및 서열번호 35의 염기 서열)에서 유래하였음을 확인하였다.
인간 CD7에 대한 인간화 scFv(HzscFvCD7)의 발현 및 정제
E.coli strain인 BL21에 상기 실시예 <1-4>에서 제작된 HzscfvCD7-pET21b를 형질전환하고 BL21의 단일 콜로니를 얻었다. 앰피실린(ampicilin)이 함유된 LB 액체 배지에 상기 BL21 단일 콜로니를 접종한 후, 37℃의 진탕 배양기에서 배양하되, 스펙트로포토메터(spectrophotometer)를 이용하여 O.D. 600nm에서 흡광도를 측정하여 그 값이 0.6 내지 0.8이 될 때까지 배양 한 뒤, IPTG를 넣고 26℃에서 밤새(overnight) 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분간 원심분리하여 얻어진 박테리아 펠릿(bacteria pellet)에 라이시스 버퍼(lysis buffer)을 넣어 초음파발생장치(Sonicator)를 이용하여 파쇄(sonication)하고, 다시 4℃에서 25000xg로 40분간 원심분리하여 상층액을 분리한 후, FPLC를 이용하여 인간 CD7에 대한 인간화 scFv(HzscFvCD7)를 정제하였다.
정제된 HzscFvCD7을 pH 7.4의 DPBS에서 다이얼리시스(dialysis)한 뒤에 농축 컬럼(concentration column)으로 농축하였다. 상기 정제된 HzscFvCD7은 BCA kit(Pierce, 미국)를 사용하여 농도를 측정한 후, SDS-PAGE를 통해 크기(size)를 측정하였다.
그 결과, 정제된 HzscFvCD7이 약 27kDa 정도의 크기(size)임을 확인하였다(도 4).
HzscFvCD7의 특이성을 이용한 전달체의 제조
<3-1> HzscFvCD7와 폴리 올리고-9-아르기닌(poly oligo-9-Arginine)의 접합
HzscFvCD7을 siRNA의 전달체로 이용하기 위한 한 가지 방법으로서, siRNA가 결합(binding)할 수 있는 폴리 올리고-9-아르기닌(poly oligo-9-Arginine, 이하, 9R이라고 한다.)을 HzscFvCD7에 접합시켰다.
보다 구체적으로, HzscFvCD7의 N-말단 부분은 설포-NHS-아세테이트(sulfo-NHS-Acetate)로 불활성화시킨 다음, 다이얼리시스 멤브레인(dialysis membrane)을 이용하여 반응하지 않은 설포-NHS-아세테이트(sulfo-NHS-Acetate)를 제거하였다. 그런 다음, NHS-EDC 반응을 통하여 9R의 일차 아민 그룹(N-말단)을 HzscFvCD7의 C-말단 Cys에 이황화결합(disulfide bond) 시킴으로써, 도 5의 (A)와 같은 구조의 siRNA 전달체를 제조하였다.
그런 다음, MALDI-TOF를 통해 상기 HzscFvCD7와 9R의 결합 여부를 확인하였다. 그 결과, 상기 HzscFvCD7와 9R은 약 90 % 이상이 화학적으로 결합됨을 확인하였다(도 5의 (B)).
<3-2> HzscFvCD7와 리포좀(liposome)의 접합
리포좀을 다음과 같은 조성으로 만들어 siRNA을 전달하는데 사용하였다.
HSPC : HSPE : Chol : DCchol : DSPE-PEG-Mal = 6 : 1 : 1 : 1 : 0.14
클로로포름(chloroform)에 지질(lipid)을 5 ㎖ 플라스크(flask)에 녹이고 회전 중탕기(rotary evapor)로 건조 막(dry film)을 만든 뒤, 데시케이터(Desicator)로 남은 클로로포름을 제거 해 주었다. PBS에서 미리 반응시킨 9-Arginine과 siRNA(몰 비(molar ratio) 5 : 1)의 반응물을 지질 건조 필름(lipid dry film)에 넣고 수화(hydration)시킨 후, PC 막(PC　membrane)(100nm)을 사용하여 사출 가공(extrusion)하였다. 상기와 같이 만들어진 리포좀(liposome)을 1.5 ㎖ 튜브(tube)에 넣고, HzscFvCD7과 DSPE-PEG-Mal을 1 : 1의 몰 비(molar ratio)로 섞어 반응(Maleimid reaction 25℃ pH 7.4)시킨 후, 2시간 동안 볼텍싱(voltexing)하고, 4℃에서 80000xg로 40분간 초원심분리(Ultracentrifuge)하여 비결합(unbound)된 인간화된 HzscFvCD7를 제거함으로써 도 6과 같은 구조의 siRNA 전달체를 제조하였다.
전달체로서 HzscFvCD7의 In Vitro 효능 평가
HzscFvCD7의 전달체로서의 표적화 효능을 평가하기 위해, T세포 표면에 발현되는 CD4의 발현을 억제하는 siRNA(이하, siCD4라 한다.), FITC가 결합된 siCD4(이하, siFITC라 한다.), GFP(green fluorescent protein) 또는 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 고분자를 HzscFvCD7를 포함하는 전달체에 화학적으로 결합시켜 Jurkat 세포주 및 인간 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)의 1차 세포주에 처리하였다.
<4-1> 'HzscFvCD7-9R'을 이용한 T 세포 또는 Jurkat 세포로의 siRNA 전달 효능 평가
먼저, 상기 siFITC를 상기 실시예 <3-1>에서 제조된 HzscFvCD7-9R와 함께 섞어 복합체를 만든 후, Jurkat 세포에 처리하고, 유세포분석기를 통해 Jurkat 세포 내 siFITC의 도입 효율 및 CD4의 발현 억제율을 측정을 측정하였다.
그 결과, 80 % 이상의 siFITC가 Jurkat 세포 내로 도입됨을 확인하였고(도 7의 (A)), Jurkat 세포에서 CD4의 발현이 약 50 % 정도 억제됨을 확인하였다(도 7의 (B)). 상기와 같은 결과로부터, HzscFvCD7-9R이 siRNA를 T 세포 내로 도입시킬 수 있고, HzscFvCD7-18R6L이 T 세포에 특이적으로 siRNA를 전달하고, CD4의 발현을 억제(silencing)함을 알 수 있다.
다음으로, siCD4를 상기 실시예 <3-1>에서 제조된 HzscFvCD7-9R와 함께 섞어 복합체를 만든 후, 인간 말초 혈액 단핵세포에 처리하고, 유세포 분석기를 통해 CD4의 발현율을 측정하였다.
그 결과, 인간 말초 혈액 단핵세포에서 CD4의 발현이 50 % 이상 억제됨을 확인하였다(도 8). 상기와 같은 결과로부터, HzscFvCD7-18R6L이 T 세포에 특이적으로 siRNA를 전달하고, CD4의 발현을 억제(silencing)함을 알 수 있다.
<4-2> 'HzscFvCD7-리포좀'을 이용한 T 세포로의 siRNA 전달 효능 평가
HzscFvCD7-리포좀의 T 세포에 대한 표적화 효능을 평가하기 위하여, 상기 실시예 <3-2>에서 제조된 HzscFvCD7-리포좀을 siCD4와 함께 섞어 준 뒤, Jurkat 세포에 처리하고, 유세포분석기를 통해 CD4의 발현 억제율을 측정하였다.
그 결과, T 세포에서 CD4의 발현이 65 % 정도 억제됨을 확인하였다(도 9). 상기와 같은 결과로부터, HzscFvCD7-리포좀이 T 세포에 특이적으로 siRNA를 전달하고, CD4의 발현을 억제(silencing)함을 알 수 있다.
<4-3> 'HzscFvCD7'을 이용한 T 세포로의 단백질 또는 고분자 전달 효능 평가
HzscFvCD7의 T 세포에 대한 표적화 효능을 평가하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>의 9R을 결합시킨 방법과 동일한 방법으로, 상기 실시예 2에서 제조된 HzscFvCD7에 GFP 단백질 또는 PLGA를 화학 결합(chemical conjugation)시킨 다음, HSB2 세포 및 Jurkat 세포에 각각 처리하고, 유세포분석기를 통해 GFP 또는 PLGA의 T 세포 전달 정도를 측정하였다.
그 결과, GFP 단백질의 경우, 90 % 이상의 T 세포(HSB2 세포) 도입 효율을 나타내고(도 10의 (A)), PLGA 또한 80 % 이상의 T 세포(Jurkat 세포) 도입 효율을 나타냄(도 10의 (B))을 확인하였다. 상기와 같은 결과로부터, HzscFvCD7이 siRNA 뿐만 아니라, 단백질이나 고분자도 T 세포에 특이적으로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
HzscFvCD7의 특징 분석
<5-1> HzscFvCD7가 인간 CD7에 대한 마우스 유래 scFv와 동일한 항원을 인지하는지 여부
상기 실시예 2와 같이 제조된 HzscFvCD7가 기존의 인간 CD7에 대한 마우스 유래 scFv와 같은 항원(muscFvCD7(Kumar et al., Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586))을 인지하는지를 알기 위해서 경쟁 분석(competition assay)을 수행하였다. 먼저, HzscFvCD7에 Alexa 488을 결합시켜 Jurkat 세포에 처리함으로써, 상기 HzscFvCD7이 T세포인 Jurkat 세포에 결합함을 확인하였다. 그런 다음, HzscFvCD7과 T3A1e(muscFvCD7(Kumar et al., Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586)을 포함하는 전장의 항체)를 Jurkat 세포에 교차로 처리함으로써 Jurkat 세포에 대한 결합 여부를 측정하였다.
그 결과, Jurkat 세포에 HzscFvCD7을 먼저 처리한 다음, muscFvCD7를 나중에 처리하는 경우, muscFvCD7의 Jurkat 세포에 대한 결합이 억제됨을 확인하였다(도 11). 상기와 같은 결과로부터, HzscFvCD7과 muscFvCD7이 같은 항원을 인지함을 알 수 있다.
<5-2> 인간화된 마우스에서 HzscFvCD7의 T 세포 표적화 효능 확인
<5-2-1> 인간화된 마우스 Hu-HSC에서 HzscFvCD7의 T 세포 표적화 효능 확인
상기 실시예 2에서 제조된 HzscFvCD7의 T 세포 표적화 효능을 in vivo에서 평가하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.
먼저, Ishikawa et al.(Blood 2005; 106:1565-1573) 및 Kumar et al.(Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586)에 따라 인간화된 마우스인 Hu-HSC를 제작하고, 8주 후에 상기 Hu-HSC 마우스의 혈액, 간, 흉선, 뇌 등에서 인간의 세포가 존재하는지 여부를 유세포 분석기로 확인하였다.
그 결과, 약 8주가 경과한 후 70 %의 세포가 인간의 세포로 분화되었고, 혈액을 비롯하여 췌장 및 간에 다량의 인간 백혈구가 존재함을 확인하였고(도 12), 특히 Hu-HSC의 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서도 다향의 인간 백혈구가 존재함을 확인하였다(도 13의 (A)).
다음으로, HzscFvCD7에 Alexa 488을 결합시켜 상기 Hu-HSC 마우스에 1회 정맥 주사하고 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 수득하여, 상기 HzscFvCD7가 CD45+ 인간 세포로 전달되는지 그리고, 인간 세포 중에서도 CD3+ T 세포로 전달되는지 여부를 유세포 분석기로 확인하였다.
그 결과, HzscFvCD7이 마우스의 세포에는 전혀 결합하지 않는 반면(도 13의 (B)), 단 1회의 정맥 주사 만으로도 약 50%의 HzscFvCD7이 CD45+ 인간 세포에 결합함을 확인하였다(도 13의 (C)). 또한, CD45+ 인간 세포 중에서도 약 80% 정도가 CD3+ T 세포인 것으로 나타났고(도 14의 (A)), 약 40 % 내지 60 %의 CD3+ T 세포에 HzscFvCD7이 특이적으로 결합함을 확인하였다(도 14의 (B)). 아울러, CD45+ 인간 세포 중에서 CD3이 발현되지 않는 CD3- 세포에는 HzscFvCD7이 결합하지 않음을 확인하였다(도 14의 (C)). HzscFvCD7을 단 1회 정맥 주사 하는 것만으로 약 40 % 내지 60 %의 T 세포로 표적화할 수 있다는 상기 결과로부터, 상기 HzscFvCD7을 반복 투여함으로써 대부분의 T 세포를 표적화할 수 있다는 가능성을 확인하였다.
<5-2-2> 인간화된 마우스 Hu-PBL에서 HzscFvCD7의 T 세포 표적화 효능 확인
Nakata et al.(J Virol 2005; 79:2087-2096) 및 Kumar et al.(Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586)에 따라 인간화된 마우스인 Hu-PBL을 제작하였다.
상기 실시예 <4-1>에서 제작한 HzscFvCD7-9R와 siFITC의 복합체 또는 상기 실시예 <4-3>에서 제작한 HzscFvCD7과 PLGA 고분자의 복합체를 상기 Hu-PBL 마우스에 1회 정맥 주사하고 혈액을 채취하여, 인간 T 세포에 siFITC 또는 PLGA가 전달되는지 여부를 유세포 분석기로 확인하였다.
그 결과, HzscFvCD7-9R에 의하여, 인간 T 세포에 특이적으로 siFITC가 전달되고(도 15), 인간 T 세포에 특이적으로 PLGA가 전달됨(도 16)을 확인하였다.
<5-3> 인간화된 마우스에서 HzscFvCD7의 PK(Pharmacokinetics) 확인
HzscFvCD7에 Alexa 488을 결합(HzscFvCD7-AF488)시켜 상기 Hu-HSC 마우스의 꼬리에 정맥 주사하고, 혈액을 5분, 30분, 60분, 120분, 240분, 900분 후에 채취하여 AF488의 존재를 PKSolver로 분석하였다.
그 결과, 전달체로서 HzscFvCD7의 전달 반감기는 약 21분이고, 약 10시간 후에 완전히 분해되는 것으로 측정되었다(도 17). 상기와 같은 결과로부터 본 발명의 HzscFvCD7는 기존에 개발된 인간화 항체에 비해 우수한 PK 값을 갖는다는 것을 알 수 있다(표 1).
Figure 112012105880616-pat00001
HzscFvCD7의 인간화 여부 확인
<6-1> 인간 항 마우스 항체(HAMA, Human Anti-Mouse Serum)를 이용한 HzscFvCD7의 면역 반응 측정
정제된 mAbCD7, muscFvCD7(Kumar et al., Cell, 2008 August 22; 134(4):577-586)과 실시예 2에서 제조한 HzscFvCD7을 10μg/ml 농도로 적정하여 ELISA 플레이트(plate)에 각각 분주하고, HAMA를 처리하여 면역 반응이 일어나는지 여부를 확인하였다. HAMA에 대한 2차 항체로서는 HRP-conjugated goat anti-human Fc specific mAb를 이용하였다.
그 결과, 본 발명의 HzscFvCD7의 경우, HAMA가 희석될수록 HAMA에 의한 면역 반응이 점점 줄어들고, HAMA가 1 : 100으로 희석된 경우에는 면역 반응이 70% 정도 감소함을 확인하였다(도 18). 상기와 같은 결과로부터, HzscFvCD7의 경우 in vitro 상에서 인간 항체에 의한 면역 반응을 거의 유발하지 않음을 알 수 있다.
<6-2> 인간화된 마우스에서 HzscFvCD7의 면역 반응 측정
Hu-BLT 마우스 모델(Shimizu et al.(Blood, 2010; 115:1534-1544) 및 Melkus et al.(Nat Med. 2006;12(11):1316-1322))을 ①'HzscFvCD7 처리군' 및 ②'DNP-KLH(2,4-dinitrophenylated keyhole limpet protein) 처리군'으로 나누어 각각 200 μg의 HzscFvCD7과 100 μg의 DNP-KLH를 항원으로 하여 주입하였다. 2주 경과 후, 동량의 항원(200 μg의 HzscFvCD7과 100 μg의 DNP-KLH)을 각각의 항원 처리 군에 2차 주입하고, 췌장세포를 분리하였다. 분리된 췌장세포를 CFSE(Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester)으로 염색하고, 동일한 항원으로 처리하여 췌장 세포의 분화(differentiation) 및 증식(proliferation)을 유도하였다.
그 결과, DNP-KLH를 처리한 처리군의 마우스에서 유래한 췌장 세포에 비해 HzscFvCD7를 처리한 처리군의 마우스에서, 유래한 췌장 세포의 분화(도 19) 및 증식(도 20)이 훨씬 적게 유도되었다. 상기와 같은 결과로부터, in vitro 뿐만 아니라, in vivo 상에서도 HzscFvCD7는 면역반응을 거의 일으키지 않음을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Humanized single chain gragment antibody(scFv) carrier specific for T cell <130> HY110098NR <150> KR10-2011-0143849 <151> 2011-12-27 <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for LHS39 <400> 1 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for HCleaderback <400> 2 ggagtggaca cctgtag 17 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7H <400> 3 acaggtgtcc tctccgaggt gcaactggtg 30 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7H <400> 4 ccgatgggcc cttggtggag gccgaggaaa cggtgac 37 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7H1 <400> 5 tccctgagac tctcctgtgc agcc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7H1 <400> 6 ggagagtctc agggaccccc cagg 24 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7H2 <400> 7 gctccaggga aggggctgga gtgggtcgca 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7H2 <400> 8 ccccttccct ggagcctggc gaacccaaga 30 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7H3 <400> 9 tactatgcag acagtgtgaa gggc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7H3 <400> 10 actgtctgca tagtaggtga aacc 24 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7H4 <400> 11 gccaagaaca gcctgtatct gcaaatg 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7H4 <400> 12 caggctgttc ttggcattat ctctgga 27 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7H5 <400> 13 ctgagggctg aggacacggc cgtgtattac tgt 33 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7H5 <400> 14 gtcctcagcc ctcagactgt tcatttgcag atacag 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7H6 <400> 15 cgaggaaacg gtgaccaggg tcccttggcc ccagac 36 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for LHS42 <400> 16 tgcaaagctt cggcacgagc a 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for KCleaderback <400> 17 tccttcaaca ccagacaac 19 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7L <400> 18 tctggtgttg aaggagatat ccagatgaca cagagtccat cctcc 45 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7L <400> 19 agccaccgta cgttttattt ccaccttggt c 31 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7L1 <400> 20 ggagacagag tcaccatcac ttgcagtgca 30 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7L1 <400> 21 ggtgactctg tctcccacag aggc 24 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7L2 <400> 22 ccaggaaaag ttcctaaact cctgatctat 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7L2 <400> 23 tttaggaact tttcctggtt tctgctgata 30 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD7L3 <400> 24 agcagcctgc aacctgaaga tgttgccact tat 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD7L3 <400> 25 aggttgcagg ctgctgatgg tgagagtata atc 33 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for scfv L-ndeI <400> 26 caggatcgca tatggatatc cagatgacac agag 34 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for scfv L <400> 27 accaccacgt tttatttcca c 21 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for linker <400> 28 ataaaacgtg gtggtg 16 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for linker <400> 29 ttgcacctcg gatccacc 18 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for scfv H <400> 30 ggtggatccg aggtgcaact ggtg 24 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for scfv H-XhoI <400> 31 tagtgcctcg agaggtcaag cttacta 27 <210> 32 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> designed humanized VH <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Glu Val Arg Gly Tyr Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed humanized VH <400> 33 gaggtgcaac tggtggagtc tgggggtggc ttagtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtttcac ctactatgca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaagaacag cctgtatctg 240 caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag agacgaggta 300 cgggggtacc tcgatgtctg gggccaaggg accctggtca ccgtttcctc g 351 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> designed humanized VL <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed humanized VL <400> 35 gatatccaga tgacacagag tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 ggaaaagttc ctaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tatactctca ccatcagcag cctgcaacct 240 gaagatgttg ccacttatta ttgtcagcag tatagcaagc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa a 321 <210> 36 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> full length amino acid sequence of HzscfvCD7 <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 130 135 140 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr 145 150 155 160 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 165 170 175 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 180 185 190 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 195 200 205 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Asp Glu Val Arg Gly Tyr Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ala Asp His His His His His His 245 250 255 Cys <210> 37 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> full length nucleotide sequence coding for HzscfvCD7 <400> 37 gatatccaga tgacacagag tccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 ggaaaagttc ctaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tatactctca ccatcagcag cctgcaacct 240 gaagatgttg ccacttatta ttgtcagcag tatagcaagc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa acgtggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc 360 ggcggctccg gtggtggtgg atccgaggtg caactggtgg agtctggggg tggcttagtg 420 aagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gactcacttt cagtagctat 480 gccatgtctt gggttcgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtcgc atccattagt 540 agtggtggtt tcacctacta tgcagacagt gtgaagggcc gattcaccat ctccagagat 600 aatgccaaga acagcctgta tctgcaaatg aacagtctga gggctgagga cacggccgtg 660 tattactgtg caagagacga ggtacggggg tacctcgatg tctggggcca agggaccctg 720 gtcaccgttt cctcggcctc gggggccgat caccatcatc accatcattg c 771 <210> 38 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence of VH <400> 38 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt cctctcc 57 <210> 39 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of muscfvCD7 <400> 39 gaggtgcaac tggtggagtc tgggggtggc ttagtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtttcac ctactatgca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaagaacag cctgtatctg 240 caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag agacgaggta 300 cgggggtacc tcgatgtctg gggccaaggg accctggtca ccgtttcctc g 351 <210> 40 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 1 <400> 40 gaggtgcaac tggtggagtc tgggggtggc ttagtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcc 63 <210> 41 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 2 <400> 41 tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ctcactttca gtagctatgc catgtcttgg 60 gttcgccagg ctccagggaa gggg 84 <210> 42 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 3 <400> 42 gctccaggga aggggctgga gtgggtcgca tccattagta gtggtggttt cacctactat 60 gcagacagt 69 <210> 43 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 4 <400> 43 tactatgcag acagtgtgaa gggccgattc accatctcca gagataatgc caagaacagc 60 ctg 63 <210> 44 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 5 <400> 44 gccaagaaca gcctgtatct gcaaatgaac agtctgaggg ctgaggac 48 <210> 45 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 6 <400> 45 ctgagggctg aggacacggc cgtgtattac tgtgcaagag acgaggtacg ggggtacctc 60 gatgtctggg gccaagggac cctggtcacc gtttcctcg 99 <210> 46 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 1-1 <400> 46 gaggtgcaac tggtggagtc tgggggtggc ttagtgaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtttcac ctactatgca 180 gacagt 186 <210> 47 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VH fragment 1-2 <400> 47 tactatgcag acagtgtgaa gggccgattc accatctcca gagataatgc caagaacagc 60 ctgtatctgc aaatgaacag tctgagggct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 120 gacgaggtac gggggtacct cgatgtctgg ggccaaggga ccctggtcac cgtttcctcg 180 180 <210> 48 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence of VK <400> 48 atggagacac attctcaggt ctttgtatac atgttgctgt ggttgtctgg tgttgaagga 60 60 <210> 49 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK of muscfvCD7 <400> 49 gatatccaga tgacacagag tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 ggaaaagttc ctaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tatactctca ccatcagcag cctgcaacct 240 gaagatgttg ccacttatta ttgtcagcag tatagcaagc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa a 321 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VK fragment 1 <400> 50 gatatccaga tgacacagag tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 60 <210> 51 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VK fragment 2 <400> 51 ggagacagag tcaccatcac ttgcagtgca agtcagggca ttagcaatta tttaaactgg 60 tatcagcaga aaccaggaaa agttcctaaa 90 <210> 52 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VK fragment 3 <400> 52 ccaggaaaag ttcctaaact cctgatctat tacacatcaa gtttacactc aggagtccca 60 tcaaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gattatactc tcaccatcag cagcctgcaa 120 cctgaa 126 <210> 53 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VK fragment 4 <400> 53 agcagcctgc aacctgaaga tgttgccact tattattgtc agcagtatag caagcttccg 60 tacacgttcg gaggggggac caaggtggaa ataaaa 96 <210> 54 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VK fragment 1-1 <400> 54 gatatccaga tgacacagag tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 ggaaaagttc ctaaa 135 <210> 55 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized VK fragment 1-2 <400> 55 ccaggaaaag ttcctaaact cctgatctat tacacatcaa gtttacactc aggagtccca 60 tcaaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gattatactc tcaccatcag cagcctgcaa 120 cctgaagatg ttgccactta ttattgtcag cagtatagca agcttccgta cacgttcgga 180 ggggggacca aggtggaaat aaaa 204 <210> 56 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker of scFv <400> 56 cgtggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtgga 60 tcc 63

Claims (21)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 34로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 T 세포를 특이적으로 표적화하는 인간화된 scFv.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 중쇄가변영역(VH)은 서열번호 33으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 인간화된 scFv.
  8. 제5항에 있어서, 상기 경쇄가변영역(VL)은 서열번호 35으로 기재되는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 인간화된 scFv.
  9. 제5항에 있어서, 상기 인간화된 scFv는 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 인간화된 scFv.
  10. 제5항에 있어서, 상기 인간화된 scFv는 서열번호 37로 기재되는 염기 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 인간화된 scFv.
  11. 제5항의 인간화된 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 발현 벡터는 서열번호 37로 기재되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  13. 제5항의 인간화된 scFv를 포함하고, T 세포를 표적으로 하여 T 세포에 특이적으로 T 세포 활성 조절제 또는 표지물을 운반하기 위한 전달체.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
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