CN111247241A - T细胞受体缺陷型嵌合抗原受体t细胞和其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了组合物，其包括蛋白表达阻断剂或PEBL，所述PEBL包括靶结合分子和定位结构域；以及在癌症治疗中使用此类组合物的方法。PEBL可用于阻断免疫细胞中靶表面受体(肽或抗原)的表达。本文还提供了表达此类PEBL的CD3/TCRαβ缺陷型T细胞和CD3/TCRαβ缺陷型嵌合抗原受体T细胞。

Description

T细胞受体缺陷型嵌合抗原受体T细胞和其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年8月10日提交的美国临时申请第62/543,735号的权益，本公开以其整体通过引用在此并入。

序列表的引用

本即时申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且在此通过引用以其整体并入。创建于2018年8月9日的所述ASCII副本命名为“119419-5003-WO-SequenceListing_ST25.txt”，并且大小为24.0千字节。

背景技术

基因工程化免疫细胞是强有力的癌症新疗法。用表达嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞进行的最近临床试验的结果已经令人信服地证明了此方法的力量。嵌合抗原受体(CAR)可以使免疫细胞重定向，以特异性识别并杀死肿瘤细胞。CAR是由经由跨膜结构域连接到信号传导分子的抗体单链可变区(scFv)构成的人工多分子蛋白质。当scFv接合其同源抗原时，会触发信号转导，导致肿瘤细胞被表达CAR的细胞毒性T淋巴细胞杀死(Eshhar Z、Waks T等人,《美国科学院院刊(PNAS USA)》,90(2):720-724,1993；Geiger TL等人,《免疫学杂志(J Immunol.)》,162(10):5931-5939,1999；Brentjens RJ等人,《自然医学(NatMed.)》9(3):279-286,2003；Cooper LJ等人,《血液(Blood)》101(4):1637-1644,2003；ImaiC等人,《白血病(Leukemia)》,18:676-684,2004)。用表达CAR的自体T淋巴细胞进行的临床试验在患有B细胞难治性白血病和淋巴瘤的患者中显示出正面反应(参见，例如，Till BG等人,《血液》119(17):3940-3950,2012；Maude SL等人,《新英格兰医学杂志(N Engl JMed.)》371(16):1507-1517,2014)。

已经显示，对表面分子CD19具有特异性的CAR-T细胞在患有治疗难治性CD19阳性恶性肿瘤(如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤)的患者中诱导形态和分子缓解。其它恶性肿瘤可以受到针对不同抗原重定向的T细胞的攻击。因此，基因工程化细胞疗法在肿瘤学中的可能的应用是广泛的。

CAR-T细胞输注的最初临床经验也已经识别了可能会严重降低治疗效果并且阻碍发展的潜在的局限性。主要问题是从患有癌症的患者中收集的免疫细胞的、导致体内扩增和施加抗肿瘤作用的能力无法预测的可变适应性。这种可变性使最有效的细胞剂量的识别变得复杂，可能导致输注短寿命的且无效的细胞产品，并且最终可能阻止一致性“活性药物”的开发。使用来自健康供体的T淋巴细胞应提高有效性和一致性，但会带来移植物抗宿主病(GvHD)的风险，所述GvHD是供体淋巴细胞输注的严重且潜在致命的后果。在这种同种异体环境中，需要对所输注的T细胞进行另外的修饰，以抑制其识别由不可缺少的细胞表达的组织抗原的能力。¹³

实用的基因编辑方法学的出现已经为可适用于癌症的细胞疗法的治疗性细胞工程学开辟了新的机遇。锌指大范围核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas9可以用于使编码TCRαβ链的导致T细胞缺乏同种异体反应性的基因缺失，而其它基因可以靶向延迟排斥。使用TCRα和CD52基因座的TALEN缺失连同抗CD19 CAR表达的报告表明，将CAR表达与基因编辑结合在临床环境中是可行的，但是这在技术上具有挑战性。

总之，对于患有B细胞恶性肿瘤的患者来说，对新治疗选择的需求明显未得到满足。

发明内容

本文提供了用于阻断免疫细胞中的表面受体表达的简单且有效的方法。命名为蛋白表达阻断剂(PEBL)的特定构建体防止靶蛋白向细胞膜转运。PEBL构建体可以容易地与其它基因修饰结合，并且并入到用于离体细胞处理以优化免疫细胞的功能的现有大规模cGMP级方案中。

在一方面，本发明提供了允许快速且有效下调包含CAR-T细胞的T细胞中的表面分子的方法。在本发明的一个实施例中，提供了抗CD3εPEBL，其中抗CD3εPEBL的转导使CD3细胞内滞留，这进而防止了TCRαβ在T淋巴细胞表面上的表达。本文概述的PEBL构建体可以具有最小的细胞外泄漏或无细胞外泄漏，并且在阻断CD3/TCRαβ表达和信号传导时非常有效。这种PEBL构建体可以使用抗病毒TCR转导的T细胞不能对同源病毒肽作出反应，并且可以显著降低人T细胞引起移植物抗宿主病(GvHD)的能力。PEBL表达和CD3/TCRαβ阻断是持久的，并且不会影响其它表面分子的表达。表达PEBL的T细胞可以像可比较T细胞一样存活和增殖。重要的是，表达PEBL的T细胞对CAR信号传导作出正常反应，并且可以在体外有效杀死CAR靶向白血病细胞。对CD3/TCRαβ表达和信号传导的PEBL阻断是支持输注如CAR-T细胞等同种异体T细胞的简单且有效的工具。

在一方面，本发明提供包括多肽的工程化CD3/TCRαβ缺陷型T细胞，所述多肽包括连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化CD3/TCRαβ缺陷型T细胞分泌的。

在一些实施例中，所述抗体是结合CD3/TCRαβ复合蛋白的单链可变片段(scFv)，所述CD3/TCRαβ复合蛋白选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。在某些实施例中，所述scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(V_H)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(V_L)序列。

在一些实施例中，所述定位结构域进一步包括跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在一些实施例中，所述ER保留序列包括选自以下的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQ IDNO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。

在其它方面，本文提供了包括本文所描述的工程化T细胞中的任何一种工程化T细胞的药物组合物和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，本文还提供了降低或消除患者中的移植物抗宿主病的可能性的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的此类药物组合物。

在一些实施例中，本文所描述的所述工程化T细胞进一步包括嵌合抗原受体(CAR)，诸如但不限于结合CD3或CD19的CAR。本文公开了包括此类工程化T细胞的药物组合物和药学上可接受的载剂。在一些方面，本发明涉及治疗有需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的此类药物组合物。在一些情况下，所述癌症是造血癌症。在其它情况下，所述癌症是表达CD3的癌症(例如，表达CD3的癌症细胞)。在某些情况下，所述癌症是表达CD19的癌症(例如，表达CD19的癌症细胞)。

在各个方面，本发明提供了工程化CD3/TCRαβ缺陷型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其包括：(i)多肽，所述多肽包括连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化细胞分泌的；以及(ii)嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施例中，所述抗体是结合CD3/TCRαβ复合蛋白的单链可变片段(scFv)，所述CD3/TCRαβ复合蛋白选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。在某些实施例中，所述scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(V_H)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(V_L)序列。所述定位结构域也可以包含跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在一些实施例中，所述ER保留序列包括选自以下的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQ ID NO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。

在一些实施例中，所述工程化CD3/TCRαβ缺陷型CAR-T细胞的CAR结合CD3或CD19。在一些情况下，所述CAR包括抗CD19 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在其它情况下，所述CAR包括抗CD3 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在某些方面，本文提供了治疗有需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括工程化CD3/TCRαβ缺陷型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞包括(i)多肽，所述多肽包括连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化细胞分泌的；以及(ii)嵌合抗原受体(CAR)。所述抗体可以是结合到CD3/TCRαβ复合蛋白的单链可变片段(scFv)，所述CD3/TCRαβ复合蛋白选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。在一些实施例中，结合CD3ε的所述scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(V_H)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(V_L)序列。在一些实施例中，所述定位结构域进一步包括跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在一些实施例中，所述ER保留序列包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQ ID NO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。在其它实施例中，所述定位结构域包括选自SEQ ID NOS:11-31中的任一个的氨基酸序列。在一些情况下，所述工程化CAR-T细胞的CAR结合到CD3。在其它情况下，所述工程化CAR-T细胞的CAR结合到CD3。所述CAR可以包含抗CD19 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。或者所述CAR可以包含抗CD3 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施例中，所述工程化CAR-T细胞是同种异体T细胞(例如，同种异体工程化CAR-T细胞)。在其它实施例中，所述工程化CAR-T细胞是自体T细胞(例如，自体工程化CAR-T细胞)。此类工程化CAR-T细胞在施用所述细胞后可以引发患者中的移植物抗宿主反应减少。

在一些实施例中，所述患者患有如CD3阳性癌症等癌症。在其它实施例中，所述患者患有如CD19阳性癌症等癌症。

在其它方面，本文提供了治疗有需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括同种异体工程化CD3/TCRαβ缺陷型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞包括：i)多肽，所述多肽包括连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CDε的抗体，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化细胞分泌的；以及(ii)嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施例中，所述抗体是结合CD3ε的单链可变片段(scFv)。结合CD3ε的所述scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(V_H)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(V_L)序列。在一些实施例中，所述定位结构域进一步包括跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在一些实施例中，所述ER保留序列包括选自以下的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQ ID NO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。在一些实施例中，所述定位结构域包括选自SEQ ID NOS:11-31中的任一个的氨基酸序列。在一些情况下，所述CAR结合CD3或CD19。所述CAR可以包含抗CD3 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域，或抗CD19 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

本文提供了包括多肽的工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞，所述多肽包括连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化细胞分泌的。

本文还提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，并且其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列。

本文提供了工程化CD3/TCRαβ阴性嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其包括：(i)嵌合抗原受体(CAR)，和(ii)连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化CAR-T细胞分泌的。

本文提供了治疗有需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的所述患者施用治疗有效量的包括本文所描述的所述工程化免疫细胞中的任一种的药物组合物，从而治疗有需要的受试者中的癌症。

在其它方面，本文提供了治疗患者中的变恶性肿瘤前病症或表达CD3或CD19的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的所述患者施用治疗有效量的包括本文所描述的所述工程化免疫细胞中的任一种的药物组合物，从而治疗有需要的受试者中的癌症。

在另一方面，本文提供了削弱表达CD3或CD19的血液癌症的方法，所述方法包括使血液癌症细胞与本文所描述的所述工程化免疫细胞中的任一种接触。

在一些实施例中，本发明涉及用于将T细胞刺激到哺乳动物(例如，人类患者)中的靶细胞群或组织的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包括本文所描述的所述工程化免疫细胞中的任一种的药物组合物。

附图说明

图1A到图1D.抗CD3εPEBL阻断表面CD3表达。(图1A)流式细胞术点状图展示了与用GFP(“对照”)单独或SEKDEL(SEQ ID NO:50)转导的细胞相比Jurkat中的通过抗CD3εPEBL进行的表面CD3下调。(图1B)Jurkat中的用指示的构建体转导的表面CD3表达。条形图示出了2次到3次实验的KEDL、SEKDEL和PEBL 2、4、5、8、9、11的平均值，或剩余的单独结果。(图1C)Jurkat中PEBL衍生的抗CD3εscFv的细胞内表达或表面表达。条形图示出了2次到3次实验的PEBL 2、4、8、9、11的平均值，或剩余的单独结果。(图1D)流式细胞术直方图展示了在转导后8天到13天，相对于用GFP单独转导的淋巴细胞，用抗CD3εSEKDEL或PEBL转导的外周血T细胞中的CD3表达。

图2A到图2D.抗CD3εPEBL下调TCRαβ。(图2A)在PEBL转导后的5天到9天，GFP阳性T淋巴细胞中的TCRαβ表达。示出了仅用GFP(“对照”；n＝25)、PEBL2(n＝4)和PEBL5(n＝18)转导的细胞的平均值(±标准偏差[SD])；其它数据表示1次实验的结果或2次实验的平均值。(图2B)流式细胞术点状图展示了与仅用GFP转导的细胞相比，T淋巴细胞中的TCRαβ下调。(图2C)长期培养之后的用PEBL转导的Jurkat细胞中的CD3/TCRαβ表达；对照，用GFP单独转导的细胞。(图2D)在T淋巴细胞(具有200IU/mL的IL-2)或Jurkat细胞的长期培养物中CD3/TCRαβ表达的集体结果。符号表示在经过GFP+转导的细胞中表面CD3/TCRαβ持续减少90％以上。

图3A到图3F.通过PEBL进行的CD3/TCRαβ下调不影响细胞增殖，但消除CD3/TCRαβ的信号传导。(图3A)仅用抗CD3 PEBL或GFP(“对照”)转导的Jurkat的生长速率。符号表示三份测量的平均值(±SD)。(图3B)来自用IL-2(200IU/mL)培养的5个供体(7次实验)的PEBL转导的T淋巴细胞或对照T淋巴细胞的存活。符号指示三份测量的平均值。(图3C)在用OKT3或非反应性小鼠IgG2a 24小时后Jurkat中的CD25和CD69的平均荧光强度(MFI)。条形图表示三份测量的平均值(±SD)。(图3D)从具有OKT3的培养物中回收的活PEBL或对照T淋巴细胞与不具有OKT3的培养物相比，所述培养物均含有IL-2(200IU/mL)。符号表示用来自3个供体的细胞进行的9次测量的平均值(±SD)。由学生t测试的P值被示出存在显著差异(****P<0.0001)。(图3E)在选择新霉素后，仅用抗CD3 PEBL或mCherry(“对照”)对用对HBV s183具有特异性的TCR或仅含有新霉素抗性基因(“NeoR”)的载体转导的Jurkat细胞进行转导。示出了CD3、TCRαβ和TCRVβ3链(HBV s183TCR的一部分)的表达；在细胞表面上和在细胞透化后在细胞内对TCRVβ3表达进行了测试。(图3F)将小组E中所示的经过转导的Jurkat细胞与装载有HBV s183肽的T2细胞共同培养，持续24小时。示出了CD25和CD69的MFI减去用T2细胞养但未用肽培养之后测量的MFI。符号表示三份测量的平均值。

图4A到图4D.具有CD3/TCRαβ表达阻断的T细胞中的CAR表达和信号传导。(图4A)流式细胞术点状图展示了CD3下调和抗CD19-41BB-CD3ζCAR表达。用CAR构建体，然后用抗CD3εPEBL，或仅用GFP，然后仅用mCherry(“对照”)对细胞进行转导。(图4B)在CAR mRNA电穿孔之后24小时(n＝5)或在CAR病毒转导之后5天到6天(n＝4)，表达抗CD19-41BB-CD3ζCAR的用PEBL或用GFP(“对照”)单独转导的T淋巴细胞的百分比；P＝0.207。(图4C)PEBL或对照T细胞的IFNγ产生，所述T细胞用CAR mRNA或无mRNA电穿孔并且与CD19+RS4；11一起在E:T为1:2下培养，持续8小时。条形图表示用来自3个供体的细胞进行的9次测量的平均值(±SD)；****P<0.0001。(图4D)首先用CAR对T淋巴细胞进行转导，并且然后用mCherry单独或用抗CD3 PEBL对其进行转导。然后将细胞与经过辐照的CD19+OP–1一起进行培养，持续3周。将结果与仅用GFP并且然后仅用mCherry(“对照”)转导的细胞进行比较。符号表示相对于三份培养物中的输入细胞数的细胞回收百分比的平均值(±SD)。

图5A到图5D.CAR⁺PEBL T淋巴细胞的细胞毒性。(图5A)来自3个供体的在2:1的E:T下针对CD19⁺ALL细胞系用抗CD19-41BB-CD3ζCAR mRNA或不使用mRNA电穿孔的PEBL或对照(mCherry转导的)T细胞的四小时细胞毒性测定(另见补充图4)。符号表示每个供体的3次测量的平均值。(图5B)针对CD19⁺细胞系，对来自2个供体的用含有单独mCherry或抗CD3 PEBL的逆转录病毒载体依次转导的CAR转导的T淋巴细胞的细胞毒性进行测试。对照，仅用GFP，然后仅用mCherry转导的细胞。示出了在1:1的E:T下针对CD19⁺ALL细胞系进行的4小时测定的数据(图12A和图12B中的完整数据集)。每个符号表示每个供体的三次实验的平均值。(图5C到图5D)对于针对用mCherry转导的Nalm6的长期细胞毒性，对如在小组B中转导的T淋巴细胞进行了测试。用IncuCyte缩放系统(Essen BioScience)测量白血病细胞生长。图5C中示出了在80小时时，在E:T为1:8下三份培养物的全孔成像；图5D中为在所指示的E:T比率下白血病细胞生长的测量。***P<.001；****P<.0001。

图6A到图6E.通过PEBL进行的CD3/TCRαβ敲低防止了GVHD。(图6A)用2.5Gy辐照NSG小鼠，并且在1天之后IV注射用抗CD3 PEBL或仅用GFP(“对照”；每组n＝8)转导的1×10⁷个T淋巴细胞。身体重量表达为相对于辐照之后第3天的重量的变化。(图6B)外周血中的血红蛋白水平和(C)血小板计数。(图6D)Kaplan-Meier总体存活曲线和对数秩测试。当2次连续测量中的体重下降超过20％时，对小鼠实施安乐死(图14中的另外的数据)。(图6E)T细胞注射之后18天血液中的人CD45⁺细胞计数。*P＝0.0148；***P<0.001。

图7A到图7F.具有通过PEBL和CAR表达敲低CD3/TCRαβ的T细胞杀死小鼠中的白血病细胞。(图7A)对NSG小鼠IV注射5×10⁵个Nalm6荧光素酶细胞。三天后，小鼠接受用抗CD19-41BB-CD3ζCAR加上PEBL或mCherry单独转导的2×10⁷个T淋巴细胞；其它小鼠相反接受组织培养基(“无T细胞”)。第3天的生物发光图像被示出为具有增强的灵敏度，以展示Nalm6的移植。(图7B)符号对应于腹侧和背侧成像中的平均生物发光信号。(图7C)Kaplan-Meier曲线和对总体存活的对数秩测试。当腹侧和背侧生物发光平均信号达到每秒1×0¹⁰个光子时，对小鼠实施安乐死。****P<0.0001。(图7D)如小组A中所描述的，在第3天，向NSG小鼠IV注射5×0⁵个Nalm6荧光素酶细胞和2×10⁷个T淋巴细胞。在注射T淋巴细胞之前，小鼠接受2.5Gy全身辐照。第3天的生物发光图像被示出为具有增强的灵敏度，以展示Nalm6的移植。(图7E)符号对应于通过腹侧和背侧成像的生物发光平均数。(图7F)Kaplan-Meier曲线和对总体存活的对数秩测试。当腹侧和背侧生物发光平均信号达到每秒1×10¹⁰个光子时，或当GVHD的体征(2次连续测量中的体重下降超过>20％，活动性降低和/或皮毛损失)明显时，对小鼠实施安乐死。GVHD发生在5只CAR+mCherry小鼠中的3只和6只CAR+PEBL小鼠中的0只中；复发(“Rel.”)比率分别为0/5和2/6。**P＝0.0014；***P＝0.0006。

图8A.本文所描述的蛋白表达阻断剂(PEBL)构建体。

图8B.仅用PEBL或GFP(“对照”)转导的T淋巴细胞的免疫表型。示出了来自4个供体的经过转导的淋巴细胞中进行的3次到5次测量的平均值(±SD)。在转导之后6-8天对细胞标志物进行分析。在针对PEBL在GFP+细胞上对模拟细胞和CD3阴性细胞进行门控之后计算百分比。对于所有比较，P＞0.05。抗体来自BD生物科学公司(BD Biosciences)(CD4 PE-Cy7、CD8 PE、CD7 PE、CD25 PE-Cy7、CD62L APC、CD69 PE)、Biolegend公司(CD2 APC、CD137APC、CD279 PE、CD366 PE)和赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)(CD223APC)。

图8C.对免疫缺陷小鼠的病理特征注射用抗CD3 PEBL或GFP(“对照”)单独转导的T细胞。

图9.用于衍生PEBL的scFv的抗CD3抗体的特异性。用每个CD3亚基(δ、ε、γ、ζ)的cDNA、2个亚基的组合或仅含有GFP的载体(“对照”)对K562细胞进行转导。将经过转导的细胞透化并且用从PLU4杂交瘤细胞分泌的上清液进行孵育，并且然后用Alexa Fluor 647缀合山羊抗小鼠IgG抗体(SouthernBiotech，阿拉巴马州伯明翰)进行染色。使用Fortessa流式细胞术(BD生物科学公司)和FlowJo软件执行分析。

图10A到图10C.抗CD3εPEBL的细胞定位。(图10A)流式细胞术直方图展示了在用抗CD3 PEBL5或GFP(“模拟”)单独转导的Jurkat细胞中CD3的表面表达和细胞内表达。(图10B)抗CD3 PEBL5转导的Jurkat细胞的共聚焦显微镜成像。在细胞透化之后，用生物素缀合山羊抗小鼠F(ab')2抗体，然后用链霉亲和素PE对PEBL scFv进行检测，并且用抗CD3 APC对CD3进行检测。(图10C)PEBL不是由经过转导的细胞分泌的。PEBL可以定位于细胞内的亚细胞隔室中。例如，PEBL可以保留在ER或高尔基体中。将用抗CD3 PEBL、抗CD3 scFv单独或仅GFP(“模拟”)在48小时以上转导的Jurkat细胞的上清液用CD3+Loucy细胞在4℃下孵育45分钟。用生物素缀合的山羊抗小鼠F(ab')2抗体，然后用链霉亲和素APC使结合到Loucy的表面的分泌的scFv可视化。

图11.长期培养之后T淋巴细胞中CD3/TCRαβ的下调。流式细胞术点状图展示了在用200IU/mL的IL-2培养55天之后，用PEBL5加上GFP或GFP(“对照”)单独转导的T淋巴细胞中的CD3和TCRαβ表达。示出了残留的CD3+细胞耗竭之前和之后的结果。

图12A到图12B.PEBL-CAR T淋巴细胞的细胞毒性。图11A：用抗CD19-41BB-CD3ζCARmRNA或无mRNA电穿孔的PEBL转导的或模拟转导的T细胞的细胞毒性。示出了针对CD19+ALL细胞系进行的4小时测定的数据。每个符号表示在所指示的E:T比率下三次实验的平均值(±SD)。图11B：针对CD19+细胞系，用mCherry单独或抗CD3 PEBL依次转导的仅CAR或GFP转导的T淋巴细胞的细胞毒性进行测试。示出了针对CD19+ALL细胞系进行的4小时测定的数据。每个符号表示在所指示的E:T比率下三次实验的平均值(±SD)；每个小组对应于用来自一个供体的细胞进行的实验。

图13A到图13C.递送CAR和PEBL构建体的双顺反子载体的开发。(图13A)双顺反子构建体的示意性表示。图13A中提供了ATNFSLLKQAGDVEENPGP的说明性2A序列(SEQ ID NO:42)。(图13B)流式细胞术点状图展示了外周血T淋巴细胞中的CD3下调和抗CD19-41BB-CD3ζCAR表达。仅用GFP(“对照”)或双顺反子构建体(CAR-2A-PEBL)对细胞进行转导。对于后者，示出了残留的CD3+细胞耗竭之前和之后的结果。(图13C)与对照T淋巴细胞的细胞毒性相比，用CAR或CAR-2A-PEBL转导的T淋巴细胞的细胞毒性。示出了针对CD19+ALL细胞系OP-1、Nalm6和RS4；11进行的4小时测定的数据。每个符号表示在所示的E:T比率下三次实验的平均值(±SD)。

图14A到图14C.接受人T淋巴细胞但CD3/TCRαβ表达无PEBL下调的小鼠中的GvHD的体征。用2.5Gy对NOD-SCID-IL2RGnull小鼠进行辐照，并且然后在1天后i.v.注射仅用抗CD3PEBL或GFP(“模拟”；每组n＝8)转导的1×10⁷个T淋巴细胞。所有小鼠i.p.接受IL-2(20000IU)3次/周。通过面颊穿刺收集的血液中的(图14A)血红蛋白水平和(图14B)血小板计数。(图14C)苏木精-曙红染色，并且用来自模拟组中的小鼠中的一只小鼠的组织的抗人CD4和CD8抗体进行的免疫组织化学。在所有组织中看到CD4+或CD8+淋巴细胞的浸润以及纤维化，其中脾脏和骨髓中的造血细胞减少。

图15.来自双顺反子构建体的表达抗CD3εPEBL的非同种异体反应性T细胞和表达抗CD3εPEBL和CAR的非同种异体反应性CAR-T细胞的示意图。

具体实施方式

以下是对本发明的示例实施例的描述。

1.表达蛋白表达阻断剂(PEBL)的工程化细胞

本文所描述的方法实现了快速去除或灭活免疫细胞中的特异性靶TCR复合蛋白，如TCRα、TCRβ、CD3(例如，CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3ζ)。所述方法部分地依赖于多肽构建体，所述多肽构建体含有结合待去除或中和的靶(例如，蛋白质)的靶结合分子。靶结合分子连接到结构域(例如，定位结构域)，所述结构域根据应用将多肽引导到特定的细胞隔室，如高尔基体、内质网(ER)、蛋白酶体或细胞膜。为简单起见，连接到定位结构域的靶结合分子在本文中可以被称为“蛋白表达阻断剂”或“PEBL”。

已经显示，通过活化的免疫细胞进行的细胞因子的分泌触发细胞因子释放综合症和巨噬细胞活化综合征，呈现免疫细胞疗法的严重副作用(Lee DW等人,《血液学(Blood.)》,2014；124(2):188-195)。因此，本文所概述的PEBL可以用于阻断细胞因子，如IL-6、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27、IL-35、干扰素(IFN)-γ、IFN-β、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)-α和转化生长因子(TGF)-β，所述细胞因子可以有助于此类炎症级联。如此，靶结合分子可以是特异性结合到以下的分子：IL-6、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27、IL-35、IFN-γ、IFN-β、IFN-α、TNF-α或TGF-β。在一些实施例中，靶结合分子是特异性结合到TCR复合蛋白，如TCRα、TCRβ、CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3ζ的分子。

能够在结合到在T细胞上表达的配体(例如，肽或抗原)时使免疫应答活化或失活的所有此类适合的结合分子统称为“靶结合分子”。如本领域的技术人员所理解的，靶结合分子不需要专门地含有抗体或抗原结合片段(例如，scFv)；相反，结合到靶分子的靶结合分子的一部分可以衍生自例如，受体-配体对中的受体或受体-配体对中的配体。

在一些实施例中，定位结构域包括保留信号传导结构域。在某些实施例中，定位结构域包括保留信号传导结构域和跨膜结构域。在一些情况下，保留信号传导结构域包括内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列或蛋白酶体定位序列。保留信号传导结构域可以包含防止或阻碍蛋白质被细胞分泌的氨基酸序列。保留信号传导结构域可以包含将蛋白质保留在细胞内隔室中的氨基酸序列。在一些情况下，保留信号传导结构域可以包含将锚固蛋白保持在细胞膜(如ER或高尔基体的膜)中的氨基酸序列。例如，保留信号传导结构域可以含有KDEL序列(SEQ ID NO:32)、KKD或KKE序列KKMP序列(SEQ ID NO:33)、YQRL序列(SEQ IDNO:34)或KKXX序列，其中X是任何氨基酸序列(SEQ ID NO:35)。

在一些实施例中，蛋白表达阻断(PEBL)多肽不是由细胞分泌的。在一些实施例中，PEBL多肽不在细胞的细胞表面上表达。在一些实施例中，PEBL多肽不用作在T细胞的细胞表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)。

跨膜结构域可以包括衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在某些实施例中，定位结构域的跨膜结构域衍生自CD8α。跨膜结构域可以连接到保留信号传导结构域。在一些实施例中，跨膜结构域通过连接子连接到保留信号传导结构域。

连接子的非限制性实例包含(GS)_n、(GGS)_n、(Gly₃Ser)_n、(Gly₂SerGly)_n、(Gly₂SerGly₂)_n或((Gly₄Ser)_n,其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，连接子是(Gly₄Ser)₃或(Gly₄Ser)₄。连接子长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优越的功效。

在一些实施例中，本发明的定位结构域包括表1和图8A中提供的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ IDNO:28的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些情况下，定位结构域包括SEQID NO:31的氨基酸序列。

如此，定位结构域定位在PEBL的C端区，而靶结合结构域位于N端区。在一些实施例中，PEBL从N端到C端包括靶结合结构域、连接子和定位结构域。在其它实施例中，PEBL从N端到C端包括信号肽、靶结合结构域、连接子和定位结构域。在某些实施例中，PEBL从N端到C端包括信号肽、靶结合结构域和定位结构域。在其它实施例中，从PEBLN端到C端包括靶结合结构域和定位结构域。

本发明的工程化细胞不产生功能性T细胞受体。在一些实施例中，CD3/TCRαβ复合物的组分或亚基中一种或多种不在细胞表面上表达。换句话说，此类细胞是CD3/TCRαβ阴性或CD3/TCRαβ缺陷型。

2.表达蛋白表达阻断剂(PEBL)和嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞

因此，在一个实施例中，本发明涉及工程化免疫细胞(例如，工程化T细胞)，所述工程化免疫细胞包括：包括编码嵌合抗原受体(例如，CAR)的核苷酸序列的核酸和包括编码连接到定位结构域的靶结合分子(例如，PEBL)的核苷酸序列的核酸。

如本文所用，“工程化”免疫细胞包含与天然存在的免疫细胞相比已经被基因修饰的免疫细胞。例如，根据本方法产生的工程化T细胞携带核酸，所述核酸包括不天然存在于其衍生自的T细胞中的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明的工程化免疫细胞包含PEBL和嵌合抗原受体(CAR)。说明性CAR的非限制性实例包含结合CD3、CD19、CD22、CD30、CD123、B细胞成熟抗原(BCMA)、GD2、间皮素、EGVRvIII、HER2、c-Met、PD-L1、其它肿瘤相关的抗原。

说明性肿瘤相关的抗原包含但不限于间皮素、EGFRvIII、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、白细胞介素11受体a(IL-lRa)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)、SSEA-4、CD20、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、MUCl、表皮生长因子受体(EGFR)、NCAM、前列腺、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、O-乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白和端粒酶)、PCTA-l/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期素B l、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。

在一些实施例中，本发明的工程化免疫细胞包含连接到定位结构域的抗CD3 scFv和结合CD19的CAR。在特定实施例中，本发明的工程化免疫细胞包含连接到定位结构域的抗CD3 scFv和抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR。

在其它实施例中，本发明的工程化免疫细胞包含连接到定位结构域的抗CD3 scFv和结合CD3的CAR。在特定实施例中，本发明的工程化免疫细胞包含连接到定位结构域的抗CD3 scFv和抗CD3-4-1BB-CD3ζCAR。

在某些实施例中，工程化免疫细胞是工程化T细胞。在一些情况下，T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、天然杀伤T细胞、γ-δT细胞等。

本文所概述的PEBL防止将靶蛋白转运到细胞膜。例如，涉及本文所描述的CD3/TCR复合物的蛋白质的PEBL保留在ER中。涉及CD3ε的PEBL可以与内源性CD3在细胞内共同定位。因此，细胞表面上的内源性CD3表达被抑制。在一些实施例中，此类PEBL消除CD3。在其它实施例中，PEBL消除TCRαβ表达。涉及CD3的PEBL可以消除CD3/TCRαβ表达。在一些情况下，PEBL不会引起工程化免疫细胞中的免疫表型变化。同样，PEBL不影响工程化免疫细胞的增殖。在一些实施例中，PEBL与CAR(如抗CD 19-4-1BB-CD3ζCAR)共表达。

在某些方面，CAR结合到在肿瘤细胞的表面上表达的分子，所述分子包含但不限于CD20、CD22、CD33、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45、CD52、CD38、CS-1、TIM3、CD123、间皮素、叶酸受体、HER2-neu、表皮-生长因子受体和表皮生长因子受体。在一些实施例中，免疫活化受体是CAR(例如，抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR)。在某些实施例中，免疫活化受体包括抗体或其结合到在肿瘤细胞的表面上表达的分子的抗原结合片段(例如，scFv)，所述分子包含但不限于CD20、CD22、CD33、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45、CD52、CD38、CS-1、TIM3、CD123、间皮素、叶酸受体、HER2-neu、表皮-生长因子受体和表皮生长因子受体。

根据本发明的嵌合抗原受体(例如，CAR)的跨膜结构域可以衍生自单次穿膜蛋白，所述单次穿膜蛋白包含但不限于CD8α、CD8p、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcsRIγ、CD16(例如，CD16A或CD16B)、OX40、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD35、TCRα、CD32(例如，CD32A或CD32B)、CD64(例如，CD64A、CD64B或CD64C)、VEGFR2、FAS和FGFR2B。在一些实例中，膜蛋白不是CD8α。跨膜结构域也可以是非天然存在的疏水蛋白区段。

嵌合抗原受体(例如，CAR)的铰链结构域可以衍生自如CD8α的蛋白质或IgG。铰链结构域可以是CD8α的跨膜结构域或铰链结构域的片段或非天然存在的肽，所述非天然存在的肽如由不同长度的亲水残基组成的多肽或(GGGGS)_n(SEQ ID NO:36)多肽，其中n是例如2-12的整数，包含2和12。

嵌合抗原受体(例如，CAR)的信号传导结构域可以衍生自CD3ζ、FcεRIγ、DAP10、DAP12或已知用于递送免疫细胞中的活化信号的其它分子。受体的至少一个共刺激信号传导结构域可以是共刺激分子，如4-1BB(也称为CD137)、CD28变体、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM-1、TIM-3、LFA-1或CD2。此类分子易于获得并且是本领域已知的。

如本领域的技术人员所理解的，免疫活化受体的组分可以被工程化，以包括如本文所描述的用于产生期望的结果的许多功能性组合。使用特定的抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR作为实例，结合分子的抗体(例如，或其抗原结合片段，如scFv)可以用如本文所描述的结合不同分子的抗体(例如，抗CD20、抗CD33、抗CD123等，而非抗CD19)取代。在其它实施例中，共刺激分子(在此具体实例中为4-1BB)也可以随不同的共刺激分子(例如，CD28)而变化。在一些实施例中，刺激分子(在此具体实例中为CD3)可以用另一种已知的刺激分子取代。在各个实施例中，受体的跨膜结构域也可以根据需要而变化。本领域的技术人员可以容易地确定此类免疫活化受体的设计、生产和功能测试。类似地，编码此类免疫活化受体的核酸的设计、递送到细胞和表达是本领域中容易知道和获得的。

如本文所用，术语“核酸”是指包括多个核苷酸单体(例如，核糖核苷酸单体或脱氧核糖核苷酸单体)的聚合物。“核酸”包含例如基因组DNA、cDNA、RNA和DNA-RNA杂交分子。核酸分子可以是天然存在的、重组的或合成的。另外，核酸分子可以是单链的、双链的或三链的。在一些实施例中，核酸分子可以被修饰。在双链聚合物的情况下，“核酸”可以指代分子的任一条或两条链。

关于核酸的术语“核苷酸序列”是指通过共价连接，如磷连接(例如，磷酸二酯、烷基和芳基膦酸酯、硫代磷酸酯、磷酸三酯键)和/或非磷连接(例如，肽和/或氨基磺酸酯键)连接的连续核苷酸系列。在某些实施例中，编码例如连接到定位结构域的靶结合分子的核苷酸序列是异源序列(例如，具有不同物种或细胞类型起源的基因)。

术语“核苷酸”和“核苷酸单体”是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，以及其非天然存在的衍生物和类似物。因此，核苷酸可以包含例如包括天然存在的碱基的核苷酸(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷或脱氧胞苷)和包括本领域已知的经过修饰的碱基的核苷酸。

如本领域的技术人员应了解的，在一些方面，核酸进一步包括质粒序列。质粒序列可以包含例如，选自由以下组成的组的一种或多种序列：启动子序列、选择标记序列和基因座靶向序列。

如本文所用，编码连接到定位结构域的靶结合分子的基因有时被称为“编码PEBL的基因”。

在某些实施例中，靶结合分子是抗体或其抗原结合片段。如本文所用，“抗体”意指完整抗体或抗体的抗原结合片段，其包含已经被修饰或工程化完整的抗体或抗原结合片段，或者是人抗体。已经被修饰或工程化的抗体的实例是嵌合抗体、人源化抗体、多互补位抗体(例如，双互补位抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗原结合片段的实例包含Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、单链抗体(例如，scFv)、微抗体和双抗体。

“Fab片段”包括一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fc”区含有两个重链片段，所述重链片段包括抗体的CH2结构域和CH3结构域。两个重链片段由两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。

“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')₂分子，所述一条重链的一部分含有VH结构域和CHI结构域以及还含有位于CHI结构域与CH2结构域之间的区。

“F(ab')₂片段”含有两条轻链和两条重链，使得在两条重链之间形成链间二硫键，所述两条重链含有位于C_H1结构域与C_H ²结构域之间的恒定区的一部分。因此，F(ab')₂片段由两个Fab'片段构成，所述两个Fab'片段由位于两条重链之间的二硫键保持在一起。

“Fv区”包括来自重链和轻链两者的可变区，但是缺乏恒定区。

在特定实施例中，靶结合分子是单链Fv抗体(“scFv抗体”)。scFv是指包括抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括位于VH结构域与VL结构域之间的多肽连接子，所述多肽连接子使scFv能够形成用于抗原结合的所需的结构。对于scFv的综述，参见Pluckthun(1994),《单克隆抗体药理学(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,施普林格出版社(Springer Verlag),纽约,第269-315页。还参见PCT公开第WO 88/01649号以及美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。例如，本文所公开的位于scFv的VH结构域与VL结构域之间的连接子包括，例如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:38)。如本领域的技术人员将了解的，可以对各种适合的连接子进行设计和测试以实现最佳功能，如本领域所提供的并且如本文所公开的。

作为PEBL分子的一部分的scFv不一定与存在于例如嵌合抗原受体(CAR)或类似的抗体结合信号传导受体环境中的scFv相同。在一些实施例中，作为PEBL分子的一部分的scFv与存在于例如嵌合抗原受体(CAR)或类似的抗体结合信号传导受体环境中的scFv相同。

在一些实施例中，包括编码靶结合分子(例如，在PEBL分子的环境中的scFv)的核苷酸序列的核酸包括一个或多个氨基酸序列，所述一个或多个氨基酸序列与SEQ ID NO:1和2中的任何一个或多个具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

术语“序列同一性”意指两个核苷酸或氨基酸序列在如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT最佳对准时共享至少例如70％的序列同一性、或至少80％的序列同一性、或至少85％的序列同一性、或至少90％的序列同一性，或至少95％的序列同一性或更高。为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列(例如，亲本序列)。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机，指定子序列坐标(如有必要)，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于所指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

用于比较的序列的最佳对准可以通过以下来进行：例如，Smith&Waterman的局部同源算法,《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482(1981)；Needleman和Wunsch的同源对准算法,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443(1970)；Pearson&Lipman的相似性搜索法,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)》,85:2444(1988)；这些算法的计算机化实施方式(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或视觉检查(通常参见Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》)。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述BLAST算法描述于Altschul等人,《分子生物学杂志》,215:403(1990)。用于执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得(通过NCBI国立卫生研究院(National Institutes of HealthNCBI)的互联网服务器公开获得)。通常，可以使用默认程序参数来执行序列比较，但是也可以使用自定义参数。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用作为默认的字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,《美国国家科学院院刊》89:10915(1989))。

在某些实施例中，抗体(例如，scFv)包括分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中阐述的氨基酸序列的V_H和V_L。在一些实施例中，抗体(例如，scFv)包括V_H和V_L，所述V_H和V_L的序列各自与分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中阐述的V_H和V_L序列具有至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％序列同一性。

“双抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包括连接到同一多肽链(V_H-V_L或V_L-V_H)中的轻链可变区(V_L)的重链可变区(V_H)。通过使用太短以至于不允许在相同链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫使与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双抗体描述于例如专利文件EP 404,097；WO 93/11161；以及Holliger等人,(1993)《美国国家科学院院刊》90:6444-6448。

在某些实施例中，抗体是三抗体或四抗体。设计和产生三抗体和四抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Todorovska等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,248(l-2):47-66,2001。

“结构域抗体片段”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽连接子共价连接以产生二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。

在一些实施例中，抗体是经过修饰的或工程化的。经过修饰的或工程化的抗体的实例包含嵌合抗体、多互补位抗体(例如，双互补位抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。

如本文所用，“多互补位抗体”意指包括至少两种单结构域抗体的抗体，其中至少一种单结构域抗体针对抗原上的第一抗原决定簇，并且至少一种其它单结构域抗体针对同一抗原上的第二抗原决定簇。因此，例如，“双互补位”抗体包括针对抗原上的第一抗原决定簇的至少一种单结构域抗体和针对同一抗原上的第二抗原决定簇的至少一种另外的单结构域抗体。

如本文所用，“多特异性抗体”意指包括至少两种单结构域抗体的抗体，其中至少一种单结构域抗体针对第一抗原，并且至少一种其它单结构域抗体针对第二抗原(不同于第一抗原)。因此，例如，“双特异性”抗体是包括针对第一抗原的至少一种单结构域抗体和针对第二抗原(例如，不同于第一抗原)的至少一种另外的单结构域抗体的抗体。

在一些实施例中，本文所公开的抗体是单克隆抗体，例如，鼠单克隆抗体。产生单克隆抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Pluckthun(1994),《单克隆抗体药理学》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,施普林格出版社,第269-315页。

在各个实施例中，在PEBL分子的环境中的靶结合分子是结合靶分子的受体或配体。例如，所述靶结合分子可以是结合PD-1的配体(例如，PD-L1或PD-L2)。因此，如本领域的技术人员将了解的，靶结合分子可以是抗体或结合靶分子的配体/受体。

如本文所用，在PEBL基因的环境中“可操作地连接”是指在与编码一个或多个定位结构域的一个或多个基因相邻的框中(例如，没有连接子)直接编码靶结合分子的基因。可替代地，可以通过如本文所描述的连接子序列将编码靶结合分子的基因连接到编码一个或多个定位结构域的一个或多个基因。

如本文所用，在PEBL蛋白的环境中“连接”是指将第一结构域(例如，靶结合分子)连接到第二结构域(例如，定位结构域)。连接子可以是氨基酸序列。本领域已知的各种适合的连接子可以用于将靶结合分子拴系到定位结构域。例如，可以根据本发明使用非天然存在的肽，如由不同长度的亲水残基组成的多肽或(GGGGS)_n(SEQ ID NO:40)多肽，其中n是例如2-12的整数，包含2和12。在特定实施例中，连接子包括，例如，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:39)。在一些实施例中，连接子包括，例如，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)。在各个实施例中，长度为约5个到约100个氨基酸(包含5个和100个)的肽连接子可以用于本发明。在某些实施例中，长度为约20个到约40个氨基酸(包含20个和40个)的肽连接子可以用于本发明。在一些实施例中，长度为至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸或至少40个氨基酸的肽连接子可以用于本发明。如本领域的技术人员将了解的，此类连接子序列以及此类连接子序列的变体是本领域已知的。设计并入连接子序列的构建体的方法以及评估功能性的方法对于本领域的技术人员而言是容易获得的。

在某些实施例中，PEBL分子结合到在免疫细胞的表面上表达的靶。在一些实施例中，PEBL分子抑制靶分子的活性或功能。例如，如本文所公开的，PEBL分子可以被设计成结合到，例如，TCRα、TCRβ、CD3(例如，CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3ζ)、CD7、CD45、hB2MG、KIR2DL1、KIR2DL2/DL3、NKG2A或NKG2D，从而下调此类分子的细胞表面表达。此类分子的下调可以通过例如对分子进行定位/靶向以进行降解和/或内在化来实现。在其它实施例中，PEBL分子使靶失活(例如，靶不再与其同源配体或受体相互作用和/或结合到其同源配体或受体)。

在一些实施例中，本发明的工程化免疫细胞具有增强的治疗功效。如本文所用，“增强的治疗效果”是指以下中的一种或多种：宿主或受体中移植物抗宿主病(GVHD)减少、宿主排斥减少或消除、宿主中存活延长、宿主中肿瘤抑制减少、宿主中自杀减少、宿主中炎性级联减少或宿主中CAR介导的信号转导持续。

在本发明的某些实施例中，PEBL分子的环境中的靶结合分子结合到CD3/T细胞受体(TCR)复合物中的分子、细胞因子、人MHC I类分子、人MHC要求II分子或下调免疫应答的受体。

在某些实施例中，CD3/TCR复合物中的分子可以是TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。在特定实施例中，所述分子是CD3δ。在某些实施例中，所述分子是CD3γ。在一些实施例中，所述分子是CD3ε。在特定实施例中，所述分子是CD3ζ。

在另一个实施例中，MHC I类分子可以是β-2微球蛋白、αl微球蛋白、α2微球蛋白或α3微球蛋白。

在其它实施例中，下调免疫应答的受体选自，例如，PD-1、CTLA-4、TIM-1、TIM-3、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR，例如，KIR2DL1(也称为CD158a)、KIR2DL2/DL3(也称为CD158b))、CD94或NKG2A(也称为CD159a)、蛋白质酪氨酸磷酸酶，如含Src同源区2结构域的磷酸酶(SHP)-l和SHP-2。因此，此类受体可以被如本文所描述的PEBL分子的靶结合分子靶向。

在各个实施例中，可以用PEBL分子的靶结合分子靶向的细胞因子的实例包含，例如，白细胞介素(IL)-6、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27、IL-35、干扰素(IFN)-γ、IFN-β、IFN-α、TNF-α或TGF-β。在另一方面，PEBL分子结合到选自以下的分子：例如，CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD30、CD38、CD45、CD52或CD127。在本发明的某些方面，PEBL可以结合到在细胞的表面上表达的分子，所述分子包含但不限于以下的成员：糖蛋白的CD1家族、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD28、CD30、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD57、CD99、CD127和CD137。在一些实施例中，PEBL分子特异性结合到CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3ζ。

产生针对任何靶蛋白的抗体和其抗体片段的方法在本领域是众所周知且常规的。此外，针对各种靶，例如，CD3和CD7的可商购的抗体可以用于生成PEBL分子，如本文所例示的。如本文所例示的，本领域已知的抗体以及由此衍生的抗体片段(例如，scFv)可以用于本发明。

在其它方面，PEBL分子的定位结构域包括内质网(ER)保留序列KDEL(SEQ ID NO:32)，或其它ER或高尔基体保留序列，如KKXX(SEQ ID NO:35)、KXD或KXE(其中X可以是任何氨基酸，参见例如Gao C等人,《植物科学趋势(Trends in Plant Science)》19:508-515,2014)和YQRL(SEQ ID NO:34)(参见Zhan J等人,《癌症免疫学与免疫疗法(Cancer ImmunolImmunother)》46:55-60,1998)；蛋白酶体靶向序列，所述蛋白酶体靶向序列包括，例如，“PEST”基序-SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV(SEQ ID NO:41)；和/或如本文所描述的将靶结合分子靶向到细胞膜的序列，如CD8a跨膜结构域或另一个单次穿膜蛋白的跨膜(例如，CD8a、CD8p、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcsRIy、CD 16(如CD16A或CD16B)、OX40、CD3ζ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD35、TCRa、CD32(如CD32A或CD32B)、CD64(如CD64A、CD64B或CD64C)、VEGFR2、FAS或FGFR2B)。图8a中示出了本文所例示的特定定位结构域(序列)的实例。各种其它定位序列在本领域中，例如在WO2016/126213中，是已知的且可用的。

在一些实施例中，本发明的PEBL分子可以包括一个或多个定位结构域。例如，PEBL分子可以具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个定位结构域连接在一起。当在给定的PEBL分子中使用多于一个定位结构域时，每个定位结构域可以与任何间插连接子连接或不连接。在一些情况下，定位结构域，如CD8α跨膜结构域、KDEL基序和连接子可以用于单个PEBL分子中。尽管这种特定构建体显示了没有任何间插连接子的定位结构域，但是可以在定位结构域中的一些或所有定位结构域之间并入各个间插连接子。图8A中示出了其它实例。

如本领域的技术人员将了解的，嵌合抗原受体和/或PEBL分子可以被设计成结合到本文所公开的靶以及本文所公开的靶的变体。例如，嵌合抗原受体和/或PEBL分子可以被设计成结合到CD3/TCR复合物中的分子或其天然存在的变体分子。此类天然存在的变体可以具有与分子的野生型形式相同的功能。在其它实施例中，变体可以具有相对于分子的野生型形式而改变的功能(例如，赋予患病状态)。

如本领域的技术人员将了解的，PEBL分子构建体的各个组分可以以不同的组合被取代(例如，以含有不同的连接子、不同的定位序列、不同的scFv等)，只要组合产生功能性PEBL。如本文所公开的，评估特定构建体的功能性的方法在本领域的技术人员的范围内。

在另外的方面，本发明涉及包括以下的用于治疗癌症的工程化免疫细胞的用法：包括编码PEBL分子的核苷酸序列的核酸和包括编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸，所述用法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的工程化免疫细胞。

在另一方面，本发明涉及包括以下的用于治疗癌症的工程化免疫细胞的用法：包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的第一核酸和包括编码连接到定位结构域的单链可变片段(scFv)的核苷酸序列的第二核酸，所述用法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的工程化免疫细胞。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列是双顺反子的。

在其它方面，本发明涉及包括以下的用于治疗自身免疫性病症的工程化免疫细胞的用法：包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的核酸和包括编码连接到定位结构域的靶结合分子(例如，scFv)的核苷酸序列的核酸，所述用法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的工程化免疫细胞。

在其它方面，本发明还涉及包括以下的用于治疗感染性疾病的工程化免疫细胞的用法：包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的核酸和包括编码连接到定位结构域的靶结合分子(例如，scFv)的核苷酸序列的核酸，所述用法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的工程化免疫细胞。

在各个实施例中，嵌合抗原受体是CAR(例如，抗CD19-4-l-BB-CD3ζCAR)。在一些实施例中，PEBL分子或连接到定位结构域的单链可变片段(scFv)选自图8A所示的任何一种或多种构建体。

3.工程化免疫细胞的施用

本文提供了涉及通过施用治疗有效量的表达PEBL和/或CAR的工程化免疫细胞来减少或减轻疾病或病症的方法。在一个实施例中，施用工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞以减少癌症的症状、治疗或预防癌症。在一些实施例中，施用工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞以减少自身免疫性疾病的症状、治疗或预防自身免疫性疾病。在其它实施例中，施用工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞以治疗或预防移植物抗宿主病或在进行移植外科手术后的移植排斥。

术语“治疗有效量”是指本发明的工程化免疫细胞(例如，工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞)的在向患者施用时减轻疾病的体征和/或症状(例如，癌症、感染或GVHD)的量。可以基于在体外或体内进行的研究确定要施用的实际量，其中功能性CD3/TCRαβ阴性T细胞表现出抵抗疾病的药理活性。例如，可以对CD3/TCRαβ阴性T细胞的量进行测定，以抑制靶细胞增殖，并且CD3/TCRαβ阴性T细胞的证明了抑制的量可以表示治疗有效量。

“药物组合物”是指适用于向受试者(例如，人类受试者)施用的组合物。可以特别地调配此些组合物，以通过多种途径中的一种或多种途径进行施用，所述多种途径包含但不限于口腔、动脉内、心内、脑室内、皮内、肌内、眼内、腹膜内、脊柱内、鞘内、静脉内、口服、肠胃外、通过灌肠剂或栓剂的直肠、皮下、真皮下、舌下、经皮和经粘膜。另外，施用可以通过注射、液体、凝胶、滴剂的方式或其它施用方式发生。

可以用适当的载剂或稀释剂将根据本发明的工程化T细胞制成药物组合物或适用于体内施用的制成的植入物，所述载剂或稀释剂进一步可以是药学上可接受的。制成此类组合物或植入物的方式已经在本领域中进行了描述(参见，例如，Remington的《药物科学(Pharmaceutical Sciences)》,第16版,Mack编辑,(1980))。在适当的情况下，可以针对其相应的施用途径按常用方法将工程化T细胞调配成半固体或液体形式的制剂，如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气雾剂。在大多数情况下，药学上可接受的形式为使得不会使表达PEBL和/或CAR的细胞无法实现。在一些实施例中，可以将工程化T细胞制成含有平衡盐溶液，优选地，汉克氏(Hanks')平衡盐溶液或生理盐水的药物组合物。

在一些方面，工程化免疫细胞通过输注施用到受试者。输注免疫细胞(例如，同种异体免疫细胞或自体免疫细胞)的方法是本领域已知的。为了改善疾病的症状，向受体施用充足数量的细胞。通常，在单次设置中输注10⁷到10¹⁰个细胞的剂量，例如，10⁹个细胞的剂量。输注以单次10⁹个细胞剂量或被分成若干个10⁹个细胞剂量的形式施用。输注频率可以是每3天到30天或甚至更长的间隔(如果需要或指示)。输注的量通常是每位受试者至少1次输注，并且优选地，在耐受的情况下至少3次输注或者直到疾病症状已改善。细胞可以以50-250毫升/小时的速率静脉内注入。其它合适的施用方式包含动脉内输注、直接注射到肿瘤中和/或外科手术后肿瘤床灌注、在人工支架中在肿瘤部位植入、鞘内施用和眼内施用。使本发明适应此种递送方式的方法对于本领域的技术人员是容易获得的。

在某些方面，待治疗的癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。血液恶性肿瘤的实例包含急性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、脊髓发育不良、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。实体瘤的实例包含肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、肝细胞癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和脑瘤。

4.工程化免疫细胞的产生

在另一个实施例中，本发明涉及用于产生本发明的工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将以下引入到免疫细胞：包括编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸和包括编码连接到定位结构域的靶结合分子(例如，PEBL分子)的核苷酸序列的核酸，从而产生工程化免疫细胞。

在某些实施例中，包括核苷酸序列的核酸离体或体外引入到免疫细胞。在其它实施例中，包括核苷酸序列的核酸体内引入到免疫细胞。

在一些实施例中，本文所描述的核酸在放置到功能性关系中时与另一个核酸序列“可操作地连接”。例如，如果信号序列的DNA表达为参与多肽的分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。编码靶结合分子的核酸可以可操作地连接到编码定位结构域的核酸。通常，“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的情况下是连续的并且处于阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点接合或可替代地通过本领域的技术人员熟悉的PCR/重组方法来完成。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或连接子。

在一些实施例中，“免疫细胞”包含，例如，T细胞，所述T细胞如但不限于细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、天然杀伤T细胞、γ-δT细胞等。

包括待引入的核苷酸序列的核酸可以是单个双顺反子构建体，所述单个双顺反子构建体含有本文所描述的嵌合抗原受体和连接到定位结构域的靶标结合分子(例如，scFv)。如本文所描述的，可以通过在编码如本文所描述的嵌合抗原受体(例如，CAR)的两个cDNA与靶结合分子(例如，scFv)之间插入内部核糖体进入位点(IRES)或2A肽编码区位点来制备单个双顺反子构建体。在一些实施例中，双顺反子构建体包含PEBL的CAR上游，其间具有IRES或2A肽编码区。在一些情况下，图13A中表示了说明性双顺反子构建体。在其它实施例中，双顺反子构建体包含CAR上游的PEBL上游，其间具有IRES或2A肽编码区。用于使多于一个靶缺失的三顺反子递送系统的设计应当也是可行的。可替代地，可以执行对单独构建体(例如，CAR和PEBL)进行的单独转导(同时或顺序地)。引入外源核酸的方法在本文进行了例示，并且是本领域众所周知的。

可以使用逆转录病毒和慢病毒载体构建体将本文所描述的核酸引入(直接转导)到细胞。术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，所述载体包含尤其如Milone等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》,17(8):1453-1464(2009)中提供的自灭活慢病毒载体。可以用于临床的慢病毒载体的其它实例包含但不限于，例如，来自牛津生物医药公司(Oxford BioMedica)的

基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAX^TM载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的，并且将是本领域的技术人员已知的。在其它实施例中，核酸可以直接转染到细胞。在又其它实施例中，核酸可以电穿孔到细胞。电穿孔的详细方法描述于，例如，Roth等人,《自然(Nature)》,2018,559:405-409和Van Tendello等人,《基因疗法(Gene Therapy)》,2000,7,1431-1437。

如本文所用，除非明确地表示相反，不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应被理解为意指“至少一个/一种”。

本文所描述的工程化免疫细胞可以包括连接到如WO2016/126213中所描述的结合到CD3的定位结构域的靶结合分子。抗CD3 PEBL的组分的序列如WO2016/126213的图2以及表1和2以及下文的表1中所描述的。

表1.连接到定位结构域的抗CD3ε靶结合分子的组分的序列信息。

5.用于产生CD3/TCRαβ阴性免疫细胞的基因组编辑

如上所述，可以根据多种其它已知方法实现免疫分子在效应物T细胞上的表达的下调，所述方法包含，例如，使用大范围核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas9和锌指核酸酶的基因编辑方法。因此，在某些实施例中，工程化免疫细胞进一步包括经过修饰的基因，其中修饰使靶基因或蛋白质无功能。例如，本发明的工程化免疫细胞进一步包括防止或减少CD蛋白的表达，和/或以其它方式削弱(例如，在结构上)CD蛋白被CAR识别或干扰的经过修饰的(例如，无功能的)TCRα基因、TCRβ基因或CD3基因(使用，例如，大范围核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas9或锌指核酸酶进行修饰的)。使用此类方法修饰基因表达的方法是本领域容易获得和众所周知的。

例如，美国专利公开第US2016/0272999号、第US2017/0204372号和第US2017/0119820号中描述了使用CRISPR/Cas6技术使免疫细胞中靶基因失活的方法。

CRISPR/Cas系统是用于诱导靶向遗传改变(基因组修饰)的系统。由Cas9蛋白进行的靶识别需要引导RNA(gRNA)内的“种子”序列和含有gRNA结合区的原型间隔相邻基序(PAM)序列上游的保守多核苷酸。CRISPR/Cas系统从而可以被工程化，以通过重新设计细胞系、原代细胞和工程化细胞中的gRNA来基本上切割任何DNA序列。CRISPR/Cas系统可以通过将单个Cas9蛋白与两个或更多个gRNA共表达来同时靶向多个基因组基因座，从而使此系统独特地适合于靶基因的多次基因编辑或协同活化。用于抑制基因表达的CRISPR/Cas系统的实例描述于美国公开第2014/0068797号和美国专利第8,697,359号和第8,771,945号。所述系统诱导永久性基因破坏，所述永久性基因破坏利用RNA引导的Cas9核酸内切酶来引入DNA双链断裂，所述DNA双链断裂触发易于出错的修复途径，从而引起移码突变。在一些情况下，也可以使用其它核酸内切酶，所述其它核酸内切酶包含但不限于Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、T7、Fok1、本领域已知的其它核酸酶、其同源物或其经过修饰的版本。

CRISPR/Cas基因破坏发生在当将对靶基因具有特异性的gRNA序列和Cas核酸内切酶引入到细胞并且形成使Cas核酸内切酶能够在靶基因处引入双链断裂的复合物时。在一些情况下，CRISPR系统包括一种或多种表达载体，所述一种或多种表达载体包括编码Cas核酸内切酶的核酸序列和对靶基因具有特异性的引导核酸序列。引导核酸序列对基因具有特异性，并且靶向用于Cas核酸内切酶诱导的双链断裂的基因。引导核酸序列的序列可以处于基因的基因座内。在一些实施例中，引导核酸序列在长度上为至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。引导核酸序列包含RNA序列、DNA序列、其组合(RNA-DNA组合序列)或具有合成核苷酸的序列，如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。引导核酸序列可以是单分子或双分子。在一个实施例中，引导核酸序列包括单个导向RNA。

在一些实施例中，本发明的工程化免疫细胞可以通过CRISPR/Cas系统修饰以使人CD3基因失活。人CD3基因的基因组结构和序列的细节可以在例如NCBI基因数据库中在基因ID编号6955(TCRα)、6957(TCRβ)、915(CD3δ)、916(CD3ε)、917(CD3γ)和919(CD3ζ)下找到。

用于敲除特异性靶基因的可商购的试剂盒、gRNA载体和供体载体可例如从以下获得：奥杰公司(Origene)(马里兰州罗克维尔)、金斯瑞生物科技有限公司(GenScript)(佐治亚州亚特兰大)、应用生物材料公司(Applied Biological Materials)(ABM；不列颠哥伦比亚省列治文)、BioCat公司(德国海德堡)或其它。例如，用于通过CRISPR敲除CD3δ的可商购试剂盒或试剂盒组分包含，例如，以目录号KN210010、KN210010G1、KN210010G2和KN210010D获得的那些试剂盒或试剂盒组分，用于通过CRISPR敲除CD3εδ的试剂盒或试剂盒组分包含，例如，以目录号KN208276、KN208276G1、KN208276G2和KN208276D获得的那些试剂盒或试剂盒组分，用于通过CRISPR敲除CD3γ的试剂盒或试剂盒组分包含，例如，以目录号KN220512、KN220512G1、KN220512G2和KN220512D获得的那些试剂盒或试剂盒组分，每个试剂盒或试剂盒组分都可以从奥杰公司获得。而且，可从圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa CruzBiotechnology)获得的用于通过CRISPR敲除CD3ζ的可商购试剂盒或试剂盒组分包含，例如，以目录号sc-419554、sc-419554-HDR、sc-419554-NIC和sc-419554-NIC2获得的那些试剂盒或试剂盒组分。

在一些实施例中，CRISPR/Cas系统可用于将本文概述的核酸中的任何核酸引入到免疫细胞(例如，T细胞)的基因组中。

6.示例性实施例的详细说明

在某些实施例中，提供了工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包括：(i)核酸，所述核酸包括编码连接到定位结构域(例如，PEBL)的靶结合分子的核苷酸序列，其中所述靶结合分子是结合CD3的抗体，并且所述定位结构域包括保留信号结构域，所述保留信号结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)序列、高尔基体保留序列、蛋白酶体定位序列和跨膜结构域序列，所述跨膜结构域序列衍生自CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在一些情况下，另一种核酸包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列。在某些情况下，CAR包括4-1BB和CD3ζ的细胞内信号传导结构域以及结合分化簇19(CD19)的抗体。在某些实施例中，在靶结合分子的环境中结合CD3的抗体包括：SEQ ID NO:1中阐述的V_H序列和SEQ IDNO:2中阐述的V_L序列。如本文所描述的，在某些实施例中，抗体包括V_H和V_L，所述V_H和V_L的序列中的每个分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中阐述的VH和VL序列具有至少95％的序列同一性、至少96％的序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％的序列同一性、至少99％的序列同一性或100％的序列同一性。在一些情况下，抗体是单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，PEBL的定位结构域包括图8A或表1中阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CAR进一步包括铰链序列和跨膜序列。

在一些实施例中，工程化免疫细胞是工程化T细胞(例如，工程化细胞毒性T细胞、工程化辅助性T细胞、工程化调节性T细胞、工程化效应T细胞、工程化记忆T细胞、工程化天然杀伤T细胞和工程化γδT细胞)、工程化天然杀伤(NK)细胞、工程化NK/T细胞、工程化单核细胞、工程化巨噬细胞或工程化树突状细胞。在一些情况下，工程化免疫细胞是同种异体细胞。在其它情况下，工程化免疫细胞是自体细胞。

在一些实施例中，工程化免疫细胞缺乏至少6个月的CD3/TCRαβ表达，例如，6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月或更长。在其它实施例中，工程化免疫细胞缺乏至少12个月的CD3/TCRαβ表达，例如，12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、22个月、23个月、24个月或更长。在特定实施例中，工程化免疫细胞缺乏至少20个月的CD3/TCRαβ表达，例如，20个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月或更长。

在某些实施例中，工程化免疫细胞以与可比较免疫细胞相比基本上相等的速率增殖。

本发明的工程化细胞可以在培养基中在特定条件下扩增。在一些实施例中，工程化细胞在IL-2的存在下培养。工程化细胞可以根据本领域的技术人员识别的任何方法冷冻保存。在向患者施用之前，工程化细胞可以解冻和培养。在其它情况下，工程化细胞还可以在施用之前扩增。

在一些实施例中，在向受试者施用工程化免疫细胞时，受试者发展移植物抗宿主病的可能性降低，其中工程化免疫细胞对所述受试者是同种异体的。工程化免疫细胞可以诱导CD19+白血病细胞的细胞毒性。

在一些方面，还提供了基本上纯的工程化免疫细胞群，所述基本上纯的工程化免疫细胞群包括本文所描述的工程化免疫细胞中的任何一种，其中至少90％，例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的工程化免疫细胞缺乏CD3/TCRαβ表达。在一些情况下，基本上纯的群包括至少80％的缺乏CD3/TCRαβ表达的工程化免疫细胞，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。

在一些方面，还提供了核酸，所述核酸包括编码连接到定位结构域(例如，PEBL)的靶结合分子的核苷酸序列，其中所述靶结合分子是结合CD3的抗体，并且所述定位结构域包括保留信号结构域，所述保留信号结构域是选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)序列、高尔基体保留序列、蛋白酶体定位序列和跨膜结构域序列，所述跨膜结构域序列衍生自CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。在一些情况下，提供了包括本文所描述的核酸的表达载体。在一些情况下，提供了包括表达载体的宿主细胞。

在其它方面，还提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的具有本文所描述的实施例中的任何实施例的工程化免疫细胞，从而治疗有需要的受试者中的癌症。在一些方面，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的具有本文所描述的实施例中的任何实施例的基本上纯的工程化免疫细胞群，从而治疗有需要的受试者中的癌症。

在一些实施例中，还提供了治疗有需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的具有本文所描述的实施例中的任何实施例的工程化免疫细胞，从而治疗有需要的受试者中的自身免疫性疾病。在一些实施例中，提供了治疗有需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的具有本文所描述的实施例中的任何实施例的基本上纯的工程化免疫细胞群，从而治疗有需要的受试者中的自身免疫性疾病。

在某些实施例中，所述方法包括施用治疗有效量的工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包括具有如本文所描述的编码连接到定位结构域的靶结合分子的核苷酸序列的核酸。在一些情况下，第二核酸包括编码CAR的核苷酸序列。在一些实施例中，CAR包括4-1BB和CD3ζ的细胞内信号传导结构域，以及结合如CD19或CD3等细胞因子的抗体。

在某些实施例中，癌症包含但不限于，CD3阳性癌症、CD19阳性癌症、实体瘤癌症、血液癌症、B细胞恶性肿瘤，例如，B细胞急性淋巴细胞性白血病、成淋巴细胞性白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以根据临床上可接受的标准改进医疗病状的程度使医疗病症(例如，与恶性肿瘤、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、移植排斥、病毒性感染、传染病等有关的病症)产生反作用。

可互换使用的术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物(例如，人、非人的灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠)。在某些实施例中，所述受试者是人。“有需要的受试者”是指患有或可以通过诱导T细胞以针对靶细胞施加特异性细胞毒性来治疗(例如，改进、改善、预防)的疾病或病状或处于发展疾病或病症的风险的受试者(例如，患者)。

如本文所定义，“治疗有效量”是在当向受试者施用时足以在施用条件下在受试者中实现所期望的治疗效果(治疗与T细胞恶性肿瘤相关的病状)的量。待施用的药剂的有效量可以由本领域的普通临床医师使用本文提供的指导和本领域已知的其它方法来确定，并且取决于若干个因素，所述因素包含，例如，所选择的特定药剂、受试者的年龄、敏感性、对药物的耐受性和总体健康状况。

在一些实施例中，工程化免疫细胞对于需要治疗的受试者是自体的，例如，癌症治疗、自身免疫性疾病治疗、传染性疾病治疗，GVHD治疗和移植排斥治疗。在其它实施例中，工程化免疫细胞对需要治疗的受试者是同种异体的。本发明的经过分离的工程化免疫细胞可以是可以向多个受试者施用并且提供降低的GVHD风险的“现成的”免疫细胞。在一些实施例中，工程化免疫细胞在向多个受试者(例如，至少另外两个或更多个受试者)施用时不会引发GVHD反应。

在某些实施例中，工程化免疫细胞通过静脉内注射、静脉内输注、动脉内输注、皮下注射、肌内注射、胸骨内注射、肿瘤内注射、直接注射到肿瘤中和/或手术后肿瘤床灌注、在人工支架中在肿瘤部位植入、鞘内施用和眼内施用用到受试者用。

在某些实施例中，工程化免疫细胞通过输注施用到受试者。输注免疫细胞(例如，同种异体免疫细胞或自体免疫细胞)的方法是本领域已知的。为了改善疾病的症状，向受体施用充足数量的细胞。通常，在单次设置中输注10⁷到10¹⁰个细胞的剂量，例如，10⁹个细胞的剂量。输注以单次10⁹个细胞剂量或被分成若干个10⁹个细胞剂量的形式施用。输注频率可以是每天、每2天到30天一次或甚至更长的间隔(如果需要或指示)。输注的量通常是每位受试者至少1次输注，并且优选地，在耐受的情况下至少3次输注或者直到疾病症状已改善。细胞可以以50-250毫升/小时的速率静脉内注入。其它合适的施用方式包含动脉内输注、腹膜内输注、直接注射到肿瘤中和/或外科手术后肿瘤床灌注、在人工支架中在肿瘤部位植入、鞘内施用。使本发明适应此种递送方式的方法对于本领域的技术人员是容易获得的。

在某些实施例中，根据本发明的治疗癌症的方法与至少一种其它已知的癌症疗法(例如，化学疗法)相结合。

在其它方面，还提供了具有本文所描述的实施例中的任何实施例的用于治疗癌症的工程化免疫细胞的用法，所述用法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的工程化免疫细胞。在某些实施例中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在某些实施例中，B细胞恶性肿瘤是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病或非霍奇金淋巴瘤。

在某些实施例中，所述工程化免疫细胞通过以下方式施用到受试者：静脉内输注、动脉内输注、腹膜内输注、直接注射到肿瘤中和/或外科手术后肿瘤床灌注、在人工支架中在肿瘤部位植入或鞘内施用。

在一些实施例中，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列被顺序地引入。在其它实施例中，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列被同时引入。在某些情况下，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列是可操作地连接的，并且因此可以被引入单个表达载体或质粒上。

在某些方面，本文提供了核酸，所述核酸包括编码与定位结构域(例如，PEBL)相连的靶结合分子的核苷酸序列。在一些实施例中，所述靶结合分子是结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：ER序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列。CD3/TCRαβ复合蛋白可以选自TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体可以是scFv。在某种情况下，scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(VH)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(VL)序列。在某些情况下，scFv包括SEQ ID NO:1中阐述的可变重链(VH)序列和SEQ ID NO:2中阐述的可变轻链(VL)序列。如上所描述的，工程化免疫细胞可以是同种异体免疫细胞。例如，工程化免疫细胞可以用作“现成的”免疫细胞。在其它实施例中，工程化免疫细胞是自体免疫细胞。跨膜结构域可以包括衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。例如，跨膜结构域包括来自CD8α的跨膜结构域。在一些实施例中，保留信号传导结构域包括选自KDEL、KKMP、KKTN或KKXX的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸。定位结构域可以包括图8A或表1中阐述的氨基酸序列。在其它方面，提供了包括本文所概述的核酸的表达载体。在某些方面，提供了包括本文所描述的表达载体的宿主细胞。

在另一方面，提供了用于产生工程化免疫细胞的方法。所述方法包括将本文所概述的核酸引入到免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞。在一些情况下，免疫细胞是同种异体细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入到免疫细胞。在一些实施例中，PEBL的核酸可操作地连接到编码CAR的核酸。在其它实施例中，PEBL的核酸和编码CAR的核酸被布置成用于双顺反子表达(例如，两种核酸序列均从相同的RNA转录物表达)。

在又另一方面，提供了包括连接到定位结构域的靶结合分子的多肽，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列；以及衍生自CD8α的跨膜结构域，并且所述多肽不是由细胞分泌的并且不在细胞的细胞表面上表达。如此，多肽保持在细胞内并且不与相邻细胞(例如，癌细胞)相互作用或结合到相邻细胞。在一些情况下，靶结合分子的C端连接到定位结构域的N端。靶结合分子可以特异性结合检查点抑制剂、CD蛋白或T细胞抗原。靶结合分子可以是抗体，如单链可变片段或scFv。在一些情况下，scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(VH)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(VL)序列。在某些情况下，scFv包括SEQ ID NO:1中阐述的可变重链(VH)序列和SEQ ID NO:2中阐述的可变轻链(VL)序列。在一些实施例中，保留信号传导结构域包括选自KDEL、KKMP、KKTN或KKXX的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸。定位结构域可以包括图8A或表1中阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了编码此种多肽的多核苷酸。在其它实施例中，本文提供了包括本文所概述的此种多核苷酸的表达载体。在某些实施例中，提供了包括本文所描述的表达载体的宿主细胞。

在各个方面，还提供了用于产生本文所描述的工程化免疫细胞的试剂盒。本试剂盒可以用于产生，例如，同种异体或自体效应T细胞、同种异体或自体细胞毒性T细胞、同种异体或自体辅助性T细胞、同种异体或自体调节性T细胞等。

因此，本文提供了包括核酸的试剂盒，所述核酸包括编码PEBL(如抗CD3εPEBL)的核苷酸序列。在一些实施例中，试剂盒包括以下：包括编码PEBL(如抗CD3εPEBL)的核苷酸序列的核酸和包括编码CAR的核苷酸序列的核酸。可以根据本文所描述的实施例中的任何实施例设计试剂盒。

在某些实施例中，编码CAR的核苷酸序列和/或编码PEBL的核苷酸序列进一步包括允许，例如，克隆和/或表达的序列(例如，质粒或载体序列)。例如，核苷酸序列可以作为质粒的一部分提供，以便于克隆到其它质粒和/或载体，例如，转染到细胞(例如，免疫细胞)。在某些实施例中，编码CAR的核苷酸序列和编码PEBL的核苷酸序列提供在单个质粒或载体上。在某些实施例中，核苷酸序列提供在单独的质粒或载体上。

在一些实施例中，试剂盒进一步包括用于分离CD3/TCRαβ阴性免疫细胞的组分或试剂。在特定实施例中，试剂盒包括抗CD3抗体或抗TCRαβ抗体。通过去除CD3/TCRαβ阳性细胞，可以将CD3/TCRαβ阴性免疫细胞从细胞群分离。试剂盒也可以包含连接到结合CD3/TCRαβ阳性细胞的抗CD3抗体的固体载体。在各个实施例中，试剂盒可以包含连接到结合CD3/TCRαβ阳性细胞的抗TCRαβ抗体的固体载体。

通常，试剂盒被隔区化以便于使用，并且可以包含一个或多个装有试剂的容器。在某些实施例中，试剂盒组分中的所有试剂盒组分一起包装。可替代地，试剂盒的一个或多个单独组分可以提供在与其它试剂盒组分分开的包装中。试剂盒也可以包含使用试剂盒组件的说明。

出于所有目的，WO 2016/126213和Kamiya等人,《血液进展(Blood Advances)》,2018,2(8):517-528的公开内容通过引用整体并入本文。

本文提供了如下所阐述的示例性实施例。

实施例1.一种包括多肽的工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞，所述多肽包括连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化细胞分泌的。

实施例2.根据实施例1所述的工程化T细胞，其中所述CD3/TCRαβ复合蛋白选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。

实施例3.根据实施例1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述抗体是单链可变片段(scFv)。

实施例4.根据实施例3所述的工程化T细胞，其中所述scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(VH)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(VL)序列。

实施例5.根据实施例3所述的工程化T细胞，其中所述scFv包括SEQ ID NO:1中阐述的可变重链(VH)序列和SEQ ID NO:2中阐述的可变轻链(VL)序列。

实施例6.根据实施例1到5中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞。

实施例7.根据实施例1到5中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是工程化辅助性T细胞或工程化调节性T细胞。

实施例8.根据实施例1到5中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是工程化效应T细胞或工程化记忆T细胞。

实施例9.根据实施例1到8中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是同种异体T细胞。

实施例10.根据实施例1到8中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是自体T细胞。

实施例11.根据实施例1到10中任一项所述的工程化T细胞，其中所述定位结构域进一步包括跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。

实施例12.根据实施例11所述的工程化T细胞，其中所述跨膜结构域是衍生自CD8α的所述跨膜结构域。

实施例13.根据实施例1到12中任一项所述的工程化T细胞，其中所述ER保留序列包括选自以下的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQ IDNO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。

实施例14.根据实施例1到13中任一项所述的工程化T细胞，其中所述定位结构域包括选自图8A中任何一个或SEQ ID NOS:11-31中任何一个的氨基酸序列。

实施例15.根据实施例1到14中任一项所述的工程化T细胞，其中CD3/TCRαβ表达在工程化T细胞中被阻断。

实施例16.根据实施例15所述的工程化T细胞，其中所述CD3/TCRαβ表达的阻断持续至少6个月或至少12个月。

实施例17.根据实施例1到16中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞以与可比较T细胞基本上相等的速率增殖。

实施例18.根据实施例1到17中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞在施用所述细胞后引发受试者中的移植物抗宿主反应降低。

实施例19.根据实施例1到18中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞进一步包括嵌合抗原受体(CAR)。

实施例20.根据实施例19所述的工程化T细胞，其中所述CAR包括抗CD19 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

实施例21.根据实施例20所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞诱导CD19+癌细胞的细胞毒性。

实施例22.根据实施例19所述的工程化T细胞，其中所述CAR包括抗CD3 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

实施例23.根据实施例22所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞诱导CD3+癌细胞的细胞毒性。

实施例24.一种基本上纯的工程化T细胞群，其包括根据实施例1到23所述的工程化T细胞中的任何一种工程化T细胞，其中工程化T细胞中的至少90％表现出CD3/TCRαβ表达阻断。

实施例25.根据权利要求24所述的基本上纯的工程化T细胞群，其中工程化T细胞中的至少95％表现出CD3/TCRαβ表达阻断。

实施例26.一种治疗有需要的患者中的自身免疫性疾病或病毒性疾病的方法，其包括向患有自身免疫性疾病或病毒性疾病的所述患者施用治疗有效量的包括根据实施例1到18中任一项所述的工程化T细胞的药物组合物。

实施例27.一种降低或消除患者中的移植物抗宿主病可能性的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的包括根据实施例1到18中任一项所述的工程化T细胞的药物组合物。

实施例28.根据实施例26或27所述的方法，其中施用包括静脉内施用、肌内施用、皮下施用、动脉内施用、腹膜内施用或鞘内施用。

实施例29.一种治疗有需要的患者中的癌症的方法，其包括向患有癌症的所述患者施用治疗有效量的包括根据实施例19到23中任一项所述的工程化T细胞的药物组合物，从而治疗所述患者的癌症。

实施例30.根据实施例29所述的方法，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。

实施例31.根据实施例30所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤选自由以下组成的组：复发性或难治性急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和大B细胞淋巴瘤。

实施例32.根据实施例29到31中任一项所述的方法，其中施用包括静脉内输注、动脉内输注、腹膜内输注、直接注射到肿瘤中和/或外科手术后肿瘤床灌注、在人工支架中在肿瘤部位植入或鞘内施用。

实施例33.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，并且其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列。

实施例34.根据实施例33所述的多核苷酸，其中所述CD3/TCRαβ复合蛋白选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。

实施例35.根据实施例33或34所述的多核苷酸，其中所述抗体是scFv。

实施例36.根据实施例35所述的多核苷酸，其中所述scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(VH)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(VL)序列。

实施例37.根据实施例35所述的多核苷酸，其中所述scFv包括SEQ ID NO:1中阐述的可变重链(VH)序列和SEQ ID NO:2中阐述的可变轻链(VL)序列。

实施例38.根据实施例33到37中任一项所述的多核苷酸，其中所述定位结构域进一步包括跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。

实施例39.根据实施例38所述的多核苷酸，其中所述跨膜结构域是衍生自CD8α的跨膜。

实施例40.根据实施例33到39中任一项所述的多核苷酸，其中所述保留信号传导结构域包括选自以下的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQID NO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。

实施例41.根据实施例33到40中任一项所述的多核苷酸，其中所述定位结构域包括选自图8A中任何一个或SEQ ID NOS:11-31中任何一个的氨基酸序列。

实施例42.一种表达载体，其包括根据实施例33到41中任一项所述的多核苷酸。

实施例43.根据实施例42所述的表达载体，其进一步包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。

实施例44.根据实施例43所述的表达载体，其中编码连接到所述定位结构域的所述靶结合分子的所述多核苷酸和编码所述嵌合抗原受体的所述多核苷酸是双顺反子。

实施例45.一种宿主细胞，其包括根据实施例42到44中任一项所述的表达载体。

实施例46.实施例25或26中的用于治疗癌症的基本上纯的工程化T细胞群的用法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的基本上纯的工程化T细胞群。

实施例47.根据实施例46所述的用法，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。

实施例48.根据实施例47所述的用法，其中所述B细胞恶性肿瘤选自由以下组成的组：复发性或难治性急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和大B细胞淋巴瘤。

实施例49.根据实施例46到48所述的用法，其中所述基本上纯的工程化免疫细胞群通过以下方式施用到所述受试者：静脉内输注、动脉内输注、腹膜内输注、直接注射到肿瘤中和/或外科手术后肿瘤床灌注、在人工支架中在肿瘤部位植入或鞘内施用。

实施例50.一种用于产生工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞的方法，所述方法包括：(i)将编码连接到根据权利要求33到41中任一项所述的定位结构域的靶结合结构域的多核苷酸引入到T细胞，以及(ii)对得到的CD3/TCRαβ阴性T细胞进行分离。

实施例51.根据实施例50所述的方法，其中所述T细胞是同种异体T细胞。

实施例52.根据实施例50或51所述的方法，其中所述T细胞是工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞。

实施例53.根据实施例50或51所述的方法，其中所述工程化T细胞是工程化辅助性T细胞或工程化调节性T细胞。

实施例54.根据实施例50或51所述的方法，其中所述工程化T细胞是工程化效应T细胞或工程化记忆T细胞。

实施例55.根据实施例50到54中任一项所述的方法，其进一步包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸引入到所述T细胞。

实施例56.根据实施例55所述的方法，其中编码连接到所述定位结构域的所述靶结合结构域的所述多核苷酸和编码可操作地连接到编码所述CAR的所述核酸的嵌合抗原受体的所述多核苷酸是双顺反子。

实施例57.一种工程化CD3/TCRαβ阴性嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞，其包括：(i)嵌合抗原受体(CAR)，和(ii)连接到定位结构域的靶结合分子，其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化CAR-T细胞分泌的。

实施例58.根据实施例57所述的工程化CAR-T细胞，其中所述CD3/TCRαβ复合蛋白选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。

实施例59.根据实施例57或58所述的工程化CAR-T细胞，其中所述抗体是单链可变片段(scFv)。

实施例60.根据实施例59所述的工程化CAR-T细胞，其中所述scFv包括与SEQ IDNO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(VH)序列和与SEQ ID No:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(VL)序列。

实施例61.根据实施例59所述的工程化CAR-T细胞，其中所述scFv包括SEQ ID NO:1中阐述的可变重链(VH)序列和SEQ ID NO:2中阐述的可变轻链(VL)序列。

实施例62.根据实施例57到61中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述工程化CAR-T细胞是工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞。

实施例63.根据实施例57到61中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述工程化CAR-T T细胞是工程化辅助性T细胞或工程化调节性T细胞。

实施例64.根据实施例57到61中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述工程化CAR-T细胞是工程化效应T细胞或工程化记忆T细胞。

实施例65.根据实施例57到64中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述工程化CAR-T细胞是自体T细胞。

实施例66.根据实施例57到64中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述工程化CAR-T细胞是同种异体T细胞。

实施例67.根据实施例57到66中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述定位结构域进一步包括跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。

实施例68.根据实施例67所述的工程化CAR-T细胞，其中所述跨膜结构域是衍生自CD8α的所述跨膜结构域。

实施例69.根据实施例57到68中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述ER保留序列包括选自以下的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQID NO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。

实施例70.根据实施例57到69中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述定位结构域包括选自图8A中任何一个或SEQ ID NOS:11-31中任何一个的氨基酸序列。

实施例71.根据实施例57到70中任一项所述的工程化CAR-T细胞，其中所述CAR结合到CD3或CD19。

实施例72.根据实施例71所述的工程化CAR-T细胞，其中所述CAR包括抗CD3 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

实施例73.根据实施例71所述的工程化CAR-T细胞，其中所述CAR包括抗CD19 scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

实例

实例1：用于产生T细胞受体缺陷型嵌合抗原受体T细胞的新颖方法

摘要

需要用于改进嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的实用方法以扩大其适用性。同种异体CAR-T细胞而非自体CAR-T细胞的用法是有吸引力的，但是必须将内源性T细胞受体(TCR)敲低，以降低移植物抗宿主病(GVHD)的风险。为了去除表面TCRαβ，将对CD3ε具有特异性的抗体衍生的单链可变片段(scFv)与预计用于介导以将其保留在细胞内的21种不同氨基酸序列结合。在Jurkat细胞和外周血T细胞中转导之后，这些蛋白表达阻断剂(PEBL)的若干种蛋白表达阻断剂与CD3在细胞内共同定位，从而阻断表面CD3和TCRαβ表达。在25个实验中，T淋巴细胞中TCRαβ表达的中值从95.7％降低到25.0％；CD3/TCRαβ细胞耗竭得到几乎纯的TCRαβ阴性T细胞。抗CD3εPEBL在不影响免疫表型或增殖的情况下，消除了TCRαβ介导的信号传导。在抗CD3εPEBL-T细胞中，抗CD19-41BB-CD3ζ CAR的表达以满足或超过具有正常CD3/TCRαβ表达的CAR-T细胞的速率的速率诱导细胞因子分泌、长期增殖和CD19⁺白血病细胞杀伤。在免疫缺陷小鼠中，抗CD3εPEBL T细胞的GVHD潜能显著降低；在用抗CD19 CAR转导时，这些T细胞移植白血病细胞。表面CD3/TCRαβ表达的PEBL阻断是制备同种异体CAR-T细胞的有效工具。经过组合的PEBL和CAR表达可以在单个步骤程序中实现，可易于适应当前的细胞制造方案，并且可以用于靶向其它T细胞分子以增强CAR-T细胞疗法。

介绍

基因工程化免疫细胞是癌症强有力的新疗法。用表达嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞进行的最近临床试验的结果已经令人信服地证明了此方法的力量。因此，对表面分子CD19具有特异性的CAR-T细胞在患有治疗难治性CD19阳性恶性肿瘤，如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤的患者中诱导形态和分子缓解。^1-10其它恶性肿瘤可以受到针对不同抗原的T细胞的攻击。因此，基因工程化细胞疗法在肿瘤学中的可能的应用是广泛的。^10,11

CAR-T细胞的最初临床经验已经识别了可能降低治疗效果并阻碍发展的局限性。主要问题在于从患有癌症的患者收集的免疫细胞的、导致体内扩增和施加抗肿瘤作用的能力无法预测的可变适应性。^10,12这种可变性使最有效细胞剂量的识别变得复杂，并且可能导致输注短寿命的且无效的细胞。来自健康供体的T淋巴细胞应提供更好的一致性和有效性，但会带来移植物抗宿主病(GVHD)的风险，所述GvHD是供体淋巴细胞输注的潜在致命后果。^13,14在这种同种异体环境中，需要对所输注的T细胞进行另外的修饰，以抑制其识别宿主组织的能力；即，CD3/TCRαβ的下调。^15,16

用于基因编辑的当代方法学已经打开了与癌症的细胞疗法相关的新机遇。¹⁷锌指大范围核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas9可以使编码TCRαβ链的基因缺失，从而导致T细胞缺乏同种异体反应性^15,18,19，然而其它基因可以靶向延迟排斥¹⁵。使用TCRα和CD52基因座的TALEN缺失以及抗CD19 CAR表达的报告表明，将CAR表达与基因编辑结合在临床环境中是可行的²⁰，但是这可能仍然是具有技术挑战性的。

为了扩增用于增强基于细胞的癌症疗法的工具库，开发了允许简单有效地阻断免疫细胞中的表面受体表达的方法。命名为蛋白表达阻断剂(PEBL)的特定构建体防止靶蛋白向细胞膜转运。PEBL构建体可以容易地与其它基因修饰结合，并且并入到用于离体细胞处理以优化免疫细胞的功能的现有临床级方案中。测试了这种方法下调CAR-T细胞中CD3/TCRαβ表达的潜力。

材料和方法

肿瘤细胞系和T细胞

Kurkat、Loucy、Nalm6、RS4；11和K562来自美国菌种保藏中心(American TypeCulture Collection)(马里兰州罗克维尔)；在实验室中建立了OP-1。²¹使用了鼠干细胞病毒(MSCV)逆转录病毒载体表达Nalm6中的萤火虫荧光素酶基因加上绿色荧光蛋白(GFP)，以及K562中的CD19加上DsRed。²²

来自健康供体的外周血是从新加坡国立大学医院血库(National UniversityHospital Blood Bank,Singapore)的匿名血小板捐献副产品中获得的，具有根据Helsinki宣言的机构审查委员会(Institutional Review Board)(新加坡国立大学)的批准。通过在淋巴细胞分离剂(Axis-Shield公司，挪威奥斯陆)上进行离心对单核细胞进行分离。将富含免疫磁珠人T活化剂CD3/CD28(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆市)的T细胞在RPMI-1640(赛默飞世尔)、10％胎牛血清(通用电气医疗集团(GE-Healthcare)，伊利诺伊州芝加哥)和抗生素中进行培养，每2天添加白细胞介素2(IL-2；阿地白介素，诺华公司(Novartis)，瑞士巴塞尔；100IU/mL)。

PEBL构建体

从PLU4鼠杂交瘤的RNA中分泌抗人CD3单克隆抗体(免疫球蛋白G2a[IgG2a]同种型；Creative Diagnostics公司，纽约州Shirley)，通过莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和寡聚(dT)15引物(普洛麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊)合成了cDNA。用IgG文库引物组小鼠生物基因组学(US Biological公司，马塞诸塞州塞勒姆)扩增重链和轻链的可变区，并且通过柔性连接子序列编码(Gly₄Ser)₄将其组装到单链可变片段(scFv)。CD8α信号肽和跨膜结构域来自人活化T细胞cDNA。

为了产生PEBL构建体，通过PCR将每个保留信号传导结构域(图8A)添加到可变重链片段的3'端。将构建体亚克隆到含有内部核糖体进入位点和GFP或mCherry的MSCV逆转录病毒载体。如之前所描述的执行逆转录病毒上清液的制备和基因转导。23简要地说，将逆转录病毒载体条件培养基添加到涂有纤维连接蛋白(RetroNectin)(宝生物工程有限公司(Takara)，日本大津)的聚丙烯试管中；去除上清液之后，添加活化T细胞，并且在37℃下保持12小时；在其它连续2天添加新鲜的病毒上清液。将T淋巴细胞保持在具有胎牛血清、抗生素和200IU/mL IL-2的RPMI-1640中，直到实验时间为止。

为了在PEBL转导之后去除残留的CD3/TCRαβ阳性T细胞，使用了具有抗APC微珠和LD色谱柱(美天旎生物技术有限公司)的别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD3(BD生物科学公司，加利福尼亚州圣何塞；或美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec)，德国格拉德巴赫)和抗TCRαβ抗体(Biolegend公司，加利福尼亚州圣地亚哥)。

如针对PEBL所描述的，将由抗CD19 scFv、CD8α铰链和跨膜结构域以及41BB和CD3ζ(抗CD19-41BB-CD3ζ)²²的胞质结构域组成的CAR插入MSCV载体中。在一些实验中，通过与用CD19转导的100Gy辐照的K562细胞以1:1的E:T比率共培养来对CAR-T细胞进行扩增。还用含有由编码自切割2A肽的序列分离的CAR和PEBL构建体两者的MSCV载体对T细胞进行转导。²⁴如前所描述执行抗CD19-41BB-CD3ζmRNA的电穿孔。^25,26未使用mRNA电穿孔的细胞用作对照。

确定scFv特异性、PEBL和CAR表达以及细胞标志物谱

为了识别结合到衍生自PLU4杂交瘤的抗体的CD3亚基，将每个CD3亚基(奥杰公司，马里兰州罗克维尔市)的cDNA亚克隆到MSCV内核糖体进入位点GFP，并且转导到K562细胞。然后，将K562细胞用8E试剂(由诸位发明人开发的透化试剂)进行透化，用来自PLU4杂交瘤细胞的上清液、然后用Alexa Fluor 647缀合的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech，阿拉巴马州伯明翰)进行孵育。

通过生物素缀合的山羊抗小鼠IgG F(ab’)₂抗体(Jackson ImmunoResearch，宾夕法尼亚州西格罗夫)和藻红蛋白(PE)或APC缀合的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch)对CAR和PEBL表达进行检测。针对细胞内染色，将细胞用8E进行透化。为了确定PEBL是否分泌，将来自抗CD3εscFv或PEBL转导的Jurkat的上清液添加到Loucy，并且在4℃下孵育45分钟；用生物素缀合的山羊抗小鼠IgG F(ab')₂抗体和链霉亲和素APC对表面结合的scFv和PEBL进行检测。

用抗CD3 APC(SK7，BD生物科学公司)对CD3表达进行检测。PE或APC缀合的抗TCRαβ(IP26)、CD2 APC(RPA-2.10)、CD137 APC(4B4-1)、CD279 PE(EH12.2H7)和CD366 PE(F38-2E2)来自Biolegend公司(加利福尼亚州圣地亚哥)。抗CD4 PE-Cy7(SK3)、CD8 PE(RPA-T8)、CD7 PE(M-T701)、CD25 PE-Cy7或APC(2A3)、CD62L APC(DREG-56)和CD69PE或APC(L78)来自BD生物科学公司；CD223 APC(3DS223H)来自赛默飞世尔。使用Fortessa或Accuri C6流式细胞仪(BD生物科学公司)对细胞染色进行分析。

T细胞活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒性

将OKT3(10μg/mL，美天旎生物技术有限公司)或同种型匹配的对照(安迪生物科技公司(R&D)，明尼苏达州明尼阿波利斯)分配到96孔平底平板(康宁公司(Corning)，纽约州康宁)，并且在4℃下保持12小时。去除可溶性抗体之后，以每孔1到2×10⁵个Jurkat细胞进行接种，并且在37℃下在5％的CO₂下培养24小时。使用PE或APC缀合的抗CD25和抗CD69抗体确定T细胞活化，其中同种型匹配的非反应性抗体作为对照(均来自BD生物科学公司)。

用对HLA-A2(由新加坡杜克-新加坡国立大学(Duke-NUS)的A.Bertoletti提供)的环境中的乙型肝炎病毒(HBV)s183肽具有特异性的TCR对Jurkat细胞进行转导。²⁷将TCR插入到含有新霉素抗性基因的MSCV载体中，并且通过暴露于新霉素来选择经过转导的细胞。用缀合到异硫氰酸荧光素的抗TCR Vβ3抗体(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，加利福尼亚州布雷亚)对TCRβ在细胞表面上和细胞内(用8E进行细胞透化之后)的表达进行检测。将用具有或不具有抗CD3 PEBL的mCherry载体转导的HBV s183-Jurkat细胞与用1μg/mLHBV s183肽(金斯瑞生物科技有限公司，新泽西州皮斯卡塔韦)脉冲的T2细胞(也来自A.Bertoletti)以1:1的E:T比率共培养。24小时之后，用抗CD25 PE和抗CD69 APC对细胞进行染色。

为了测量干扰素γ(IFNγ)的产生，将1×10⁵个T细胞和2×10⁵个RS4；11细胞接种在96孔圆底板中。在0.1％布雷菲德菌素A(GolgiPlug，BD生物科学公司)存在的8小时之后，用细胞膜透化之后的APC或PE缀合的抗IFNγ(克隆25723.11，BD生物科学公司)对细胞进行标记。

为了测量细胞增殖，在RPMI-1640连同10％的胎牛血清、抗生素和200IU/mL的IL-2中，将仅用CAR或GFP转导的5×10⁴个T细胞放置在96孔圆底板。对OP-1细胞进行辐照(100Gy)，并且以1:1的E:T与T细胞混合。每2天添加200IU/mL的IL2。通过流式细胞仪对GFP+细胞进行计数；每7天以1:1的E:T添加新的一组经过辐照的OP-1细胞。²³

为了测试细胞毒性，将靶细胞用钙黄绿素橙红色AM(赛默飞世尔)进行标记，并且以每100μL 5×10⁴个细胞的浓度铺板到96孔圆底板中。以各种E:T比率添加T细胞，并且在37℃下载5％的CO₂下进行培养。4小时之后，通过流式细胞仪对存活靶细胞的数量进行计数。在一些测试中，荧光素酶标记的细胞被用作靶。在96孔平底板中执行测定，在4小时之后将BrightGlo(普洛麦格公司)添加到孔中，并且使用Flx 800板读取器(伯腾仪器有限公司(BioTek)，佛蒙特州威努斯基)对发光进行测量。²³

小鼠模型

对于对GVHD进行建模，NOD.Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory)，缅因州巴尔港)接受了2.5Gy全身辐照。一天后，IV输注用抗CD3PEBL加上GFP或GFP单独转导的1×10⁷个T细胞。所有小鼠腹膜内(IP)接受IL-2(20 000IU)，每周3次。监测体重和GVHD症状，每周3次；通过面颊穿刺收集血液，每周一次。在2次连续测量中，当体重减少超过基线的20％时，对小鼠实施安乐死。在分子与细胞生物学研究所(Institute of Molecular and Cell Biology)的高级分子病理学实验室(新加坡)执行GVHD的组织病理学评估。使用了抗人CD3多克隆抗体(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)，加利福尼亚州圣克拉拉)、抗人CD4(EPR6855)和抗人CD8(EP1150Y；两者均来自艾博抗公司(Abcam)，英国剑桥)，用于免疫组织化学。

对于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)模型，IV注射表达萤光素酶的Nalm6细胞(每只小鼠0.5×10⁶个细胞)，然后3天之后IV注射用抗CD19-41BB-CD3ζ和抗CD3 PEBL或mCherry转导的T细胞(每只小鼠IV 2×10⁷个T细胞)；对照小鼠接受RPMI-1640培养基。在第二个实验中，在输注T细胞或RPMI-1640之前的第3天，小鼠接受了2.5Gy的全身辐照。所有小鼠IP接受IL-2(20 000IU)，每周3次。在IP注射150μg/g体重的水性d-荧光素钾盐(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))后，用Xenogen IVIS-200系统(珀金埃尔默公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)确定白血病细胞负载。用Living Image 3.0软件对发光进行分析。当发光达到1×10¹⁰个光子每秒时，或如果在2次连续测量中体重减少超过其基线的20％，或存在实施安乐死的其它生理迹象之前，对小鼠实施安乐死。

结果

PEBL构建体的设计和功能性筛选

CD3/TCRαβ复合物组装在内质网(ER)中；对于其细胞表面表达，需要所有组分。为了确定PLU4抗体的CD3特异性，用CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3ζ单独或组合对K562细胞进行了转导，并且通过流式细胞仪对PLU4反应性进行了测试(图9)。染色模式表明，当与CD3γ或CD3δ相关联时，与最容易接近的CD3ε的表位的反应性。

从PLU4杂交瘤cDNA产生了scFv，并且将其连接到编码肽的序列，所述肽被预测将其锚定到ER和/或高尔基体设备(图8A)。对21种构建体针对其抑制CD3表面表达的能力进行了测试，并且将其与含有SEKDEL(SEQ ID NO:50)的构建体进行比较，所述构建体是一种被报道当连接到scFv时抑制表面蛋白的表达的序列。³¹在Jurkat细胞中，PEBL中的许多PEBL的逆转录病毒转导使表面CD3表达几乎完全消除(图1A-1B)，然而用SEKDEL构建体转导的大多数细胞仍为CD3阳性。

PEBL 1-8、11和19的表达被限制在细胞内；其它PEBL具有不同程度的表面表达(图1C、图10A-10C)。PEBL与C3在细胞内共定位；在用PEBL 1-5进行的测试中未检测到分泌(图10A-10C)。重要的是，PEBL还有效地下调了活化外周血T淋巴细胞中的CD3表达(图1D)。

用PEBL进行的CD3下调抑制TCRαβ表达

除CD3外，PEBL转导还下调外周血T淋巴细胞中的TCRαβ表达。在25个实验中，表达TCRαβ的T细胞的中值百分比从95.7％(范围为89.4％到99.0％)降低到25.0％(范围为3.5％到55.2％；图2A)。决定CD3/TCRαβ下调的程度的主要因素是逆转录病毒转导的效率，所述效率的范围介于58.5％与99.8％之间(中值GFP+细胞为94.2％)。磁性去除残留的CD3/TCRαβ阳性细胞得到几乎纯的CD3/TCRαβ阴性T细胞群(图2B)；在来自6个供体的11种T细胞制剂中，在仅1轮CD3/TCRαβ耗竭之后，表达正常水平的CD3/TCRαβ的T细胞为0.01％(<0.01％到0.15％)。

在连续培养中的外周血T淋巴细胞和Jurkat细胞中，CD3/TCRαβ下调持续，其中对T淋巴细胞的跟踪高达2个月，并且对Jurkat细胞的跟踪随访为21个月(图2C-2D；图11)。

具有由PEBL下调的CD3/TCRαβ的T细胞功能

除了缺乏表面CD3/TCRαβ外，在用PEBL转导的淋巴细胞中不存在明显的表型变化；CD4、CD8、CD2、CD7、CD25、CD62L、CD69、CD137(4-1BB)、CD223(LAG3)、CD279(PD-1)和CD366(TIM-3)的表达没有显著的改变(图8B)。T细胞增殖也未受到影响。在用Jurkat细胞进行的实验中，PEBL转导的细胞的增殖速率与用GFP单独转导的细胞的增殖速率相同(图3A)。同样地，具有IL-2(200IU/mL)的外周血T细胞的扩增和存活不受PEBL转导和CD3/TCRαβ下调的影响(图3B)。

如所预期的，表面CD3的敲低消除了CD3信号传导。因此，在用抗CD3抗体OKT3培养的Jurkat细胞中，如果已经用抗CD3 PEBL对细胞进行转导，则不对活化标志物CD25和CD69进行上调(图3C)。此外，如果用OKT3将外周血T细胞培养48小时，则用GFP单独转导的细胞的存活率快速降低，而PEBL转导的细胞的数量保持很高(图3D)。最后，用针对HBV s183肽的TCR对Jurkat细胞进行转导，所述肽在阻断CD3、抗HBV TCRαβ和其TCRVβ3链的表面表达的HLA-A2.27抗CD3εPEBL转导的环境中表达(图3E)；其消除了细胞对用HBV s183肽脉冲的表达HLA-A2的细胞(T2)作出反应的能力(图3F)。

抗CD19 CAR在用抗CD3εPEBL转导的T细胞中的功能

PEBL转导不影响T细胞免疫表型和增殖，这表明CAR在PEBL-T细胞以及CD3/TCRαβ阳性T细胞中的表达可以诱导靶特异性细胞毒性。为了对此观点进行测试，将抗CD19-41BB-CD3ζCAR和抗CD3 PEBL表达在T细胞，并且将其功能与不具有PEBL的CAR-T细胞的功能进行了比较。在9个配对实验中，无论CD3/TCRαβ表达如何，通过病毒转导(n＝4)或mRNA电穿孔(n＝5)的CAR表达都很高(图4A-4B)。PEBL表达和CD3/TCRαβ下调两者均不影响CAR功能，包含CAR介导的IFNγ分泌和T细胞增殖(图4C-4D)。

无论CAR是通过mRNA电穿孔还是病毒转导来表达的，PEBL转导的T细胞中的CAR表达均针对CD19+白血病细胞靶诱导强烈的细胞毒性(图5A-5B、图12a-12B)。还使用活细胞成像系统在长时间内以低的E:T比率确定CAR细胞毒性。CAR+PEBL-T细胞在施加抗白血病细胞杀伤方面至少与不具有PEBL的CAR-T细胞一样有效，其中在1:8和1:16的E:T下具有更高的细胞毒性(图5C-5D)。

用CAR表达进行的CD3的下调和功能也可以通过使用含有CAR和PEBL两者的双顺反子载体来有效地实现(图13A-13C)。²⁴

免疫缺陷小鼠中PEBL-T细胞的异种反应性和抗白血病效力

为了进一步测试通过PEBL敲除的CD3/TCRαβ的有效性，在已经接受了2.5Gy辐照的NSG小鼠中输注了抗CD3 PEBL T细胞，并且评估了T细胞引起GVHD的能力。注射了用GFP单独转导的人T细胞的所有8只小鼠均表现出体重损失、贫血和血小板减少，然而在注射了PEBL转导的T细胞的8只小鼠中的仅1只小鼠中看到这些GVHD体征(图6A-6D；存活对数秩测试中P＝0.0003)。在注射了GFP转导的T细胞的小鼠中，所测量的其外周血中的人T细胞数量总体上显著较高(图6E)，这表明PEBL通过异种抗原抑制了T细胞刺激。通过病理学发现证实了GVHD的存在(图14C和图8C)。

体外实验的结果表明表达抗CD19 CAR的PEBL转导的T细胞保留CAR介导的细胞毒性的能力。因此，在异种移植ALL模型中对其抗白血病能力进行了测试。如图7A-7C所示，白血病细胞生长存在于所有未经治疗的对照小鼠中，而CAR⁺PEBL-T细胞以与用mCherry而非抗CD3εPEBL转导的CAR-T细胞的速率重叠的速率有效地杀死Nalm6白血病细胞。在第三个模型中，结合了先前2个模型的条件。在用Nalm6细胞对小鼠进行注射并且评估移植之后，以2.5Gy对小鼠进行辐照，并且然后用CAR-T细胞对其进行治疗，所述CAR-T细胞是用PEBL或用mCherry单独转导的。如图7D-7E所示，无论辐照如何所有未经治疗的对照小鼠均出现白血病，而CAR-T细胞显著降低了白血病负担。值得注意的是，接受不具有PEBL的CAR-T细胞的5只小鼠中的3只小鼠出现了GVHD(>20％的体重损失、皮毛损失、活动性降低)，而接受CAR⁺PEBL T细胞的6只小鼠中均未出现(图7F)。CAR⁺mCherry组中的剩余2只小鼠和接受CAR⁺PEBLT细胞的6只小鼠中的4只小鼠在白血病细胞移植之后超过150天仍处于缓解状态(图7F)。

讨论

开发了允许快速且有效下调T细胞中的CD3/TCRαβ的方法。抗CD3εPEBL转导引起CD3ε的细胞内保留，进而防止TCRαβ在T淋巴细胞的表面上的表达。标识了具有最小细胞外渗漏或无细胞外渗漏并且在阻断TCRαβ信号传导时非常有效的PEBL构建体。用抗病毒TCR转导的PEBL-T细胞不能对同源病毒肽作出反应；PEBL转导显著降低了人T细胞在小鼠中引起GVHD的能力。PEBL表达和CD3/TCRαβ下调是持久的；其不影响其它表面分子的表达、T细胞存活或增殖。重要的是，PEBL-T细胞在体外和体内均正常对CAR信号传导作出反应并且杀死CAR靶向的ALL细胞。KDEL序列(SEQ ID NO:32)、KKD/E序列KKMP序列(SEQ ID NO:33)、YQRL序列(SEQ ID NO:34)或KKXX序列，其中X是任何氨基酸序列(SEQ ID NO:35)。

研究中最好的PEBL含有KDEL(SEQ ID NO:32)或KKXX[SEQ ID NO:35；诸如但不限于，KKMP(SEQ ID NO:33)或KKTN(SEQ ID NO:43)保留结构域，所述保留结构域锚定相关的腔ER蛋白，防止其分泌或膜表达。^32,33因此，抗CD3εPEBL阻断与CD3/TCRαβ复合物的其它组分的CD3ε组装和其表面表达。在主要用细胞系进行的实验中，KDEL肽(如SEKDEL，SEQ ID NO:50)先前已经与scFv相连，从而以不同的效率阻断蛋白表达。^31,34蛋白质运输研究发现，KDEL以外的5位和6位氨基酸对可溶性蛋白质的ER定位很重要。³⁵在PEBL的环境中，我们发现scFv与KDEL之间的插入序列对其功能至关重要，并且识别出与SEKDEL相比改进蛋白质保留的序列。蛋白质运输研究也已经表明，羧基端KKXX基序引导ER定位，并且相对于膜的KKXX定位对其有效功能至关重要。³⁶发现了连接到CD8α跨膜结构域的KKXX基序构成了PEBL的稳健的锚定平台，并且这2个组分之间的间隔子影响PEBL功能。

由于没有直接靶向TCRα或TCRβ链，因此潜在的担忧在于，流式细胞仪无法检测但足以诱导信号的低水平的TCRαβ可能仍然存在。然而，发现了用抗CD3εPEBL转导的T细胞通常对TCR介导的信号传导不反应。尽管CD3/TCR和/或PEBL的保留可能导致其积累和应激反应，但是已经无法检测任何有害作用。除了观察近2年PEBL转导的CD3/TCR阴性Jurkat细胞的正常生长外，PEBL转导的T细胞的增殖和细胞毒性潜力中没有缺陷。可以想象，PEBL的小鼠衍生的scFv可以加速输注的CAR-T细胞的排斥。然而，这一担忧可以通过使用人源的scFv解决，如针对CAR中所含有的scFv的所报道的。

当代的基因编辑方法在CAR-T细胞疗法中具有所关注的应用。^15,18,20例如，最近使用CRISPR/Cas9将抗CD19 CAR基因插入到TCRα恒定(TRAC)基因座，从而消除TCRαβ表达。^{19, 38}PEBL方法的优点之一在于，其不需要对用于临床级大规模细胞处理的现有方案进行重大修改。由于抗CD3 PEBL基因可以在单个双顺反子构建体中与CAR基因结合，因此在单个转导过程之后可以获得同种异体CAR-T细胞产物。制造具有PEBL和CAR表达的T细胞依赖于与当前临床试验中用于CAR表达的病毒载体和基因组分基本相同的病毒载体和基因组分。因此，这种方法不太可能引起与标准CAR表达有关的安全问题以外的安全问题；关于基因编辑方法学的应用的不确定性并不存在。尽管如此，PEBL方法也可以与基因编辑方法结合，以对抗排斥和具有较高效力的CAR-T细胞进行工程化。^15,39,40另一个应用是阻断正常T细胞和恶性T细胞共有的T细胞抗原的表达，从而在靶向T细胞白血病和淋巴瘤的同时避免CAR介导的自相毁灭(fratricide)。⁴¹

自体CAR-T细胞的临床结果已经证明了其非凡的潜力。^1-10此技术的关键的下一个步骤是改进其一致性和制造，使得患者可以利用统一稳健并且及时的产品。为此，可靠地产生同种异体CAR-T细胞的方法是重要的进步。无论患者免疫细胞状态以及他/她接受单采血液成分法的适应性如何，同种异体细胞均可使用。可以用最佳的细胞组合物、高CAR表达和最大功能性潜力制备CAR-T细胞。临床观察和实验数据表明，如果CAR依赖CD28共刺激并且在HLA匹配的受体中输注，则同种异体CAR-T细胞发生GVHD的风险可能低于预期。^42-45然而，这可能不会扩展到其它CAR和/或不同的移植环境。因此，II级GVHD被报道出现在接受CD137共刺激的供体CAR-T细胞输注的3名患者中的2名患者中，46并且II/III GVHD出现在接受用CD28、CD137和CD27共刺激的单倍同一性CAR-T细胞输注的6名患者中的3名患者中。⁴⁷在这些研究中，GVHD需要施用皮质类固醇，所述皮质类固醇可能会消除CAR-T细胞。无论不同共刺激分子在临床疗效和毒性方面的相对优势如何，⁴⁸据报道，缺乏TCRαβ表达可以增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性。¹⁹有趣的是，在长期细胞毒性体外测试中，用PEBL加上CAR转导的T细胞比用CAR单独转导的T细胞表现地更好，与此观察一致。总体而言，从同种异体CAR-T细胞产物中去除CD3/TCRαβ可能是有利的，特别是如果可以在对已建立的制造方案的破坏最小的情况下完成。

参考文献

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本文引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导均通过引用整体并入本文。

虽然通过参考这些示例实施例具体地示出和描述了本发明，但本领域的技术人员应当理解的是，在不脱离由所附权利要求涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出形式和细节方面的各种改变。

Claims (20)

1.一种工程化CD3/TCRαβ阴性T细胞，其包括多肽，所述多肽包括连接到定位结构域的靶结合分子，

其中所述靶结合分子包括结合CD3/TCRαβ复合蛋白的抗体，

其中所述定位结构域包括保留信号传导结构域，所述保留信号传导结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：内质网(ER)保留序列、高尔基体保留序列和蛋白酶体定位序列，并且

其中连接到所述定位结构域的所述靶结合分子不是由所述工程化细胞分泌的，并且不在所述工程化细胞的细胞表面上表达。

2.根据权利要求1所述的工程化T细胞，其中所述CD3/TCRαβ复合蛋白选自由以下组成的组：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。

3.根据权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述抗体是单链可变片段(scFv)。

4.根据权利要求3所述的工程化T细胞，其中所述scFv包括与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的可变重链(V_H)序列和与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的可变轻链(V_L)序列。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是同种异体T细胞。

6.根据权利要求1到4中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞是自体T细胞。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的工程化T细胞，其中所述定位结构域进一步包括跨膜结构域，所述跨膜结构域选自衍生自以下的跨膜结构域：CD8α、CD8β、4-1BB、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS或FGFR2B。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的工程化T细胞，其中所述ER保留序列包括选自以下的氨基酸序列：KDEL(SEQ ID NO:32)、KKMP(SEQ ID NO:33)、KKTN(SEQ ID NO:43)或KKXX，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:35)。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的工程化T细胞，其中CD3/TCRαβ表达在所述工程化T细胞中被阻断。

10.一种治疗有需要的患者中的自身免疫性疾病或病毒性疾病的方法，其包括向患有自身免疫性疾病或病毒性疾病的所述患者施用治疗有效量的包括根据权利要求1到9中任一项所述的工程化T细胞的药物组合物。

11.一种降低或消除患者中的移植物抗宿主病的可能性的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量包括根据权利要求1到9中任一项所述的工程化T细胞的药物组合物。

12.根据权利要求1到9中任一项所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞进一步包括嵌合抗原受体(CAR)。

13.根据权利要求12所述的工程化T细胞，其中所述CAR包括抗CD19scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

14.根据权利要求13所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞诱导CD19+癌症细胞的细胞毒性。

15.根据权利要求12所述的工程化T细胞，其中所述CAR包括抗CD3scFv结构域、4-1BB刺激性信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

16.根据权利要求15所述的工程化T细胞，其中所述工程化T细胞诱导CD3+癌症细胞的细胞毒性。

17.一种治疗有需要的患者中的癌症的方法，其包括向患有癌症的所述患者施用治疗有效量的包括根据权利要求12到16中任一项所述的工程化T细胞的药物组合物，从而治疗患者中的癌症。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述癌症是CD3+癌症、CD19+癌症或B细胞恶性肿瘤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤选自由以下组成的组：复发性或难治性急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和大B细胞淋巴瘤。

20.根据权利要求17到19中任一项所述的方法，其中施用包括静脉内输注、动脉内输注、腹膜内输注、直接注射到肿瘤中和/或外科手术后肿瘤床灌注、在人工支架中在肿瘤部位植入或鞘内施用。

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