CN115960240A

CN115960240A - 一种同时靶向人bcma和人cd3的双特异性抗体

Info

Publication number: CN115960240A
Application number: CN202111180793.6A
Authority: CN
Inventors: 熊冬生; 卢杨; 熊梦裳; 王建祥; 张砚君; 范冬梅
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-10-11
Filing date: 2021-10-11
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明公开了同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体，其包含：a)特异性结合人BCMA的抗原结合部分；b)特异性结合人CD3的抗原结合部分；和c)所述抗原结合部分之间的连接体；其中，所述特异性结合人BCMA的抗原结合部分包含如SEQ ID No.1‑3所示的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，以及如SEQ ID No.4‑6所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％以上同源性的序列。本发明通过同时靶向人BCMA和CD3，介导PBMCs产生抗原特异性活化、增殖及对靶细胞特异性的杀伤。在小鼠皮下骨髓瘤模型中，对肿瘤有明显的抑制生长作用。

Description

一种同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别涉及一种同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体。

背景技术

近年来，免疫疗法因其特异靶向性收到了人们广泛的关注，而双特异性T细胞接合器(BiTE)作为一种新的免疫治疗方法取得了良好效果。BiTE是分别由靶向肿瘤细胞相关抗原和靶向T细胞表面CD3的两个scfv组成，中间由linker连接，通过BiTE可以将T细胞与肿瘤细胞招募至一起，活化T细胞，释放杀伤因子杀伤靶细胞。2014年博纳吐单抗(blinatumomab)为首个被FDA批准的BiTE药物，被用于治疗费城染色体阴性前体B细胞急性淋巴细胞白血病。为了减少副作用扩大治疗窗，BiTE需要靶抗原高特异性表达在靶细胞表面，而在其他正常细胞表面尽量低表达/不表达，高特异性表达于浆细胞和多发性骨髓瘤细胞表面的B细胞成熟抗原(BCMA)无疑是一个理想的靶点。BCMA主要在浆细胞和MM细胞表面表达，而在大部分B细胞和正常细胞表面均不表达，是多发性骨髓瘤和其他血液系统恶性肿瘤的热门治疗靶点。BI 836909(AMG 420)是第一个靶向BCMA的BiTE，在治疗复发性/难治性多发性骨髓瘤I/II期临床实验中取得了很好的效果，然而由于BiTE的分子量小，只有55kD，因此它较短的半衰期使它在临床用药中有一定的局限性。

多发性骨髓瘤是浆细胞恶性增殖疾病，它的疾病特征是骨髓中的浆细胞像肿瘤细胞一样无限增生，并伴有单克隆免疫球蛋白分泌，最终导致器官组织损伤。在过去的20多年中多发性骨髓瘤的治疗取得了极大进展，蛋白酶体抑制剂和免疫调节等药物的介入极大的增加了多发性骨髓瘤治疗的缓解率，延长了患者的生存期，然而对于大多数病人来说多发性骨髓瘤仍然难以治愈，微小残留病灶持续存在，病人在经过治疗得到缓解后往往会复发，并且每经历一次复发病人的疾病进展会更加严重，因此急切需要更有效的新疗法。

Tandab是基因工程双特异抗体的一种形式，这类抗体片段通常是由两条肽链反向配对而成，为具有两个抗原结合位点的四价双特异抗体片段，它的分子量相较55kD的BiTE大了一倍，因而半衰期较长，能够改善临床使用的局限性，具有良好的肿瘤免疫治疗的临床应用前景。它的基本原理是同一肽链中VH和VL因Linker太短(通常只有5-12个氨基酸)，产生空间位阻，不能配对，只能与另一肽链上的VH和VL配对，从而形成二聚体。

在现有技术中，缺少同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体，并且现有靶向人BCMA和人CD3的抗原结合物，其亲和能力弱，同时形成的Tandab也存在着结构不稳定的缺陷。为了解决上述问题，急需要寻找一种新的同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体，且现有靶向人BCMA和人CD3的抗原结合物，其亲和能力弱，同时形成的Tandab也存在着结构不稳定的缺陷，提供了一种新型的可以同时靶向人B细胞成熟抗原(B-cellmaturation antigen,BCMA)和人T细胞表面CD3的双特异性抗体及四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)，其可利用双重靶向性将表达有CD3抗原的T细胞募集至高表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞周围，重塑T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用。

本发明提供的技术方案为：

同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合人BCMA的抗原结合部分；

b)特异性结合人CD3的抗原结合部分；和

c)所述抗原结合部分之间的连接体；

其中，所述特异性结合人BCMA的抗原结合部分包含如SEQIDNo.1-3所示的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，以及如SEQIDNo.4-6所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％以上同源性的序列。

在本发明中，上述与其80％以上同源性的，是指与本发明中所述核苷酸、氨基酸序列具有80％以上同源性，其可以为具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性，可以以合适的方式对本发明中所述核苷酸、氨基酸序列进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的表达水平、亲和力和/或解离性质，而这些突变后的核苷酸或氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述特异性结合人BCMA的抗原结合部分包含如SEQIDNo.7所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQIDNo.8所示的重链可变区的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％以上同源性的序列。

在本发明的双特异性抗体中，上述特异性结合人BCMA的抗原结合部分可以与任意合适的特异性结合人CD3的抗原结合部分通过连接体/铰链区连接，特异性结合人CD3的抗原结合部分的一个作用可以为募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述特异性结合人CD3的抗原结合部分包含如SEQIDNo.9所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQIDNo.10所示的重链可变区的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％以上同源性的序列。

在本发明中，上述特异性结合人BCMA的抗原结合部分中的轻链可变区序列、重链可变区序列、特异性结合人CD3的抗原结合部分中的轻链可变区序列、重链可变区序列可以按照任意合适的一级结构顺序通过连接体/铰链区连接以形成二价或多价双特异性抗体。例如，二价双特异性抗体可以按照VL3-VH3-VHBCMA-VLBCMA的顺序连接。再例如，在本发明的一个实施方式中，上述序列所形成的同时靶向人BCMA和人CD3的四价双特异性抗体，其连接方式为：VL3-VHBCMA-VLBCMA-VH3(如图1所示)。

作为优选，在本发明的实施方式中，上述双特异性抗体是人、人源化或嵌合抗体。上述人源化或嵌合抗体可以通过现有技术中的方法制得。

在本发明的双特异性抗体中，还可以包含其他功能性肽链，例如，氨基酸序列为METDTLLLWVLLLWVPGSTGD的前导信号肽；氨基酸序列为HHHHHH的His标签，等。

在本发明的双特异性抗体中，上述连接体可以为任意合适的寡肽或多肽。作为优选，在本发明的实施方式中，上述连接体为(GGGGS)_n，其中n为整数且1≤n≤3。更优选地，在本发明的一个实施方式中，VL3与VHBCMA之间，以及VLBCMA与VH3之间的连接体氨基酸序列为GGGGS；VHBCMA与VLBCMA之间的连接体氨基酸序列为(GGGGS)₃。

在本发明中，包含上述特异性结合人BCMA和人CD3的抗原结合部分的双特异性抗体(BiTE)具有很强的肿瘤细胞表面抗原亲和力和细胞杀伤能力。为了进一步提高本发明双特异性抗体的半衰期，本发明人进一步设计构建了四价双特异性抗体(Tandab)。本发明中设计构建的双特异性四价抗体(Tandab)是一种微型双功能抗体，以单链形式表达，单链由两个抗体的VL和VH片段串联构成，具有两个抗原结合位点，两条肽链之间通过分子间力头尾相接形成二聚体，可选择性募集效应细胞到靶细胞周围，介导特异性杀伤作用。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述四价双特异性抗体的一级结构按照特异性结合人CD3的抗原结合部分中的轻链可变区序列-特异性结合人BCMA的抗原结合部分中的重链可变区序列-特异性结合人BCMA的抗原结合部分中的轻链可变区序列-特异性结合人CD3的抗原结合部分中的重链可变区序列的顺序由N端至C端排列。

在本发明中，发明人为了提高Tandab的稳定性，在抗人CD3亲本抗体的轻链NO.100处引入突变，由原来的丝氨酸突变为半胱氨酸，即碱基由原来的TCG突变为TGT，从而两条肽链之间可形成二硫键，不单是靠之前的分子间力形成二聚体，增加了Tandab的体内外稳定性。因此，作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述特异性结合人CD3的抗原结合部分的轻链可变区的氨基酸序列的第100位丝氨酸由半胱氨酸取代。其氨基酸序列为：ADIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLELKR。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述双体异性抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.11所示。

本发明的另一个方面，是提供了一种分离的核酸分子，上述核酸分子编码上述双特异性抗体；

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。

本发明的另一个方面，是提供了一种表达载体，上述表达载体包含上述核酸分子。

进一步地，本发明的多核苷酸序列可以以合适的方法插入到任意合适的表达载体中，例如，细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述表达载体为真核表达载体pcDNA^TM3.4。

本发明的另一个方面，是提供了一种宿主细胞，上述宿主细胞包含上述表达载体。

本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，上述药物组合物包含上述双特异性抗体或如上述分离的核酸分子，以及药学上可接受的载体。

本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。

同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，阿糖胞苷、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌等。

本发明的另一个方面，是提供了一种免疫缀合物，上述免疫缀合物包含上述双特异性抗体，其与治疗剂连接。

上述治疗剂可以选自细胞毒剂、免疫调节剂、治疗性蛋白、生物聚合物或寡核苷酸。作为优选，在本发明的实施方式中，上述治疗剂为细胞毒剂，包括但不限于蒽环类、阿里他汀(auristatin)、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、多卡米星(duocarmycin)、烯二炔、格尔德霉素、吲哚啉-苯二氮二聚体、美登素、嘌呤霉素、吡咯苯并二氮杂卓二聚体、紫杉烷、长春花生物碱、tubulysin、哈米特林(Hemiasterlin)、spliceostatin、普拉二烯内酯(pladienolide)以及它们的立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。

在本发明的实施方式中，上述与治疗剂连接的连接方式可以为：双特异性抗体-含有酰基供体谷氨酰胺的标签-连接体-细胞毒剂。

本发明的另一个方面，是提供了上述双特异性抗体、上述分离的核酸分子、上述表达载体、上述宿主细胞、上述药物组合物或上述免疫缀合物在制备治疗肿瘤的产品中的用途；

作为优选，在本发明的实施方式中，上述肿瘤为血液肿瘤；

更优选地，在本发明的一些实施方式中，上述血液肿瘤为多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小无核裂细胞淋巴瘤、地方性伯基特氏淋巴瘤、扩散性伯基特氏淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、结外粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、结单核B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤，肺B细胞血管中心性淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病或成胶质细胞瘤；

更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述血液肿瘤为多发性骨髓瘤。

本发明的另一个方面，是提供了一种治疗肿瘤的方法，上述方法包括向患者施用有效剂量的上述双特异性抗体、上述药物组合物或上述免疫缀合物。上述患者患有肿瘤。

作为优选，在本发明的实施方式中，上述肿瘤为血液肿瘤；

本发明的有益效果为：

本发明提供的靶向人BCMA和CD3的双特异性抗体与BCMA和CD3抗原均具有高亲和力，其BCMA结合端的亲和常数Kd值为1.963x10^-9M；CD3结合端的亲和常数为1.961x10^-9M。具有高特异性，能够特异性结合BCMA阳性细胞系H929和CD3阳性细胞系Jurkat，与BCMA和CD3阴性细胞系K562、HL-60均无交叉反应。本发明可以通过同时靶向人BCMA和CD3，介导PBMCs产生抗原特异性的活化、增殖以及对靶细胞特异性地杀伤。在小鼠皮下骨髓瘤模型中，对肿瘤有明显的抑制生长作用。

附图说明

图1为本发明实施例中四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)的构建示意图，其中，VHBCMA和VLBCMA分别代表抗人BCMA抗体的重链可变区和轻链可变区序列，VH3和VL3分别代表抗人CD3抗体HIT3a的重链可变区和轻链可变区序列，L1和L2为连接肽序列；

图2为本发明实施例中四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)的表达纯化鉴定图，其中，泳道1为未纯化上清，泳道2、3为流出液，泳道4为洗脱液，泳道5、6、7、8分别为1、2、3、4还原后条带，泳道M为蛋白Marker；

图3为本发明实施例中FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与人BCMA阳性细胞系H929、3T3-BCMA和人CD3阳性细胞系Jurkat的结合结果图；

图4为本发明实施例中FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与BCMA和CD3双阴细胞系K562和HL60的交叉反应结果图；

图5为本发明实施例中FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与人BCMA阳性细胞系H929和人CD3阳性细胞系Jurkat的亲和常数结果图；

图6为本发明实施例中FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与BCMA和CD3商品抗体结合H929细胞表面BCMA蛋白和Jurkat细胞表面CD3蛋白的竞争情况结果图；

图7为本发明实施例中FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)介导PBMCs表面活化marker CD25和CD69的表达上调结果图；

图8为本发明实施例中ElISA法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)介导PBMCs释放细胞因子结果图；

图9为本发明实施例中四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)介导PBMCs杀伤骨髓瘤细胞NCI-H929的剂量依赖性结果图；

图10为本发明实施例中FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)介导PBMCs增殖结果图；

图11为本发明实施例中四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)治疗皮下骨髓瘤模型NCI-H929的时间示意图；

图12为本发明实施例中四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)治疗皮下骨髓瘤模型肿瘤体积大小比较结果图。

序列说明

SEQIDNo.1为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分轻链可变区CDR1区域的氨基酸序列；

SEQIDNo.2为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分轻链可变区CDR2区域的氨基酸序列；

SEQIDNo.3为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分轻链可变区CDR3区域的氨基酸序列；

SEQIDNo.4为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分重链可变区CDR1区域的氨基酸序列；

SEQIDNo.5为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分重链可变区CDR2区域的氨基酸序列；

SEQIDNo.6为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分重链可变区CDR3区域的氨基酸序列；

SEQIDNo.7为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分轻链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.8为本发明中特异性结合人BCMA的抗原结合部分重链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.9为本发明中特异性结合人CD3的抗原结合部分轻链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.10为本发明中特异性结合人CD3的抗原结合部分重链可变区的氨基酸序列；

SEQIDNo.11为本发明中四价双特异性抗体的氨基酸序列；

SEQIDNo.12为本发明中四价双特异性抗体的核苷酸序列。

具体实施方式

本发明公开了一种同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

下面就本发明中出现的部分术语作以解释。

本发明中使用的术语“抗原结合部分”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合片段”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fd、Fv等。

本发明中使用的术语“双特异性”或“双重特异性”是具有两个不同抗原结合位点的杂交抗体。双特异性抗体的两个抗原结合位点结合两个不同表位，其可以位于相同或不同蛋白靶标上。

本发明中使用的术语“二价抗体”每分子包含两个抗原结合位点(例如，IgG)。在某些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。但是，二价抗体可以是双特异性的。同样，“四价抗体”每分子包含四个抗原结合位点。

本发明中使用的术语“特异性地结合”在本领域中有公知定义，例如是指，如果该分子与可选细胞或物质相比，其更频繁、更快速地以更大的持续时间和/或以更大的亲和力与特定分子或物质反应或相关，则说该分子表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果与抗体结合其他物质相比，其以更大的亲和力、亲和性，更快速地和/或以更大的持续时间结合，则抗体“特异性地结合”或“优先结合”至靶标。例如，特异性或优先结合BCMA表位或CD3表位的抗体是与其结合其他BCMA表位、非BCMA表位、CD3表位或非CD3表位相比，以更大的亲和力、亲和性，更快速地和/或以更大的持续时间结合这个表位的抗体。通过阅读这个定义，还应当理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体(或者部分或表位)可以或不可以特异性或优先结合第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不必要求(虽然其可以包括)专一结合。一般来说，但不是必需的，提到结合表示优先结合。

本发明中使用的术语抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独或组合。如本领域已知的，重链和轻链的可变区各自由通过也称作高变区的3个互补决定区(CDR)连接的4个框架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR紧紧保持在一起，以及与来自其他链的保持在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。有至少两种技术用于确定CDR：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest,(5th ed.,1991,National Institutes ofHealth,BethesdaMD))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani et al.,1997,J.Molec.Biol.273:927-948)。如本文所用，CDR可以指通过任一种方法或通过两种方法的组合定义的CDR。

本发明中使用的术语“人源化”是指非人(例如，小鼠)抗体的形式，其是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含这样的残基，在受体抗体或者引入的CDR或框架序列中均未发现，但是包括所述残基以进一步精制和优化抗体性能。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最优选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。优选具有如WO 99/58572所述修饰的Fc区的抗体。其他形式的人源化抗体具有对原抗体改变的一个或多个CDR(CDR L1、CDRL2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，其也称作“源自”来自原抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：四价双特异抗体Tandab(CD3/BCMA)的构建

首先以实验室通过杂交瘤技术筛选得到的靶向BCMA的单克隆抗体69G8以及靶向CD3的单克隆抗体HIT3a为模板，设计引物调取重轻链可变区基因，通过基因合成方法合成双特异性抗体基因片段并连接至真核表达载体pcDNA^TM3.4上，得到重组质粒pcDNA^TM3.4-Tandab(CD3/BCMA)。构建示意图见图1。热激法将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板，挑取阳性单克隆进行测序比对，选取测序结果正确的保菌进行扩增并保存。

上述靶向BCMA的单克隆抗体69G8和靶向CD3的单克隆抗体HIT3a均保存于中国医学科学院血液学研究所。

同样，由于已知双特异性抗体各个基因片段的核苷酸序列，利用更简便的化学合成的方式也可以获得上述基因片段，并按照顺序连接至真核表达载体以构建重组质粒。

实施例2：四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)的表达纯化与鉴定

首先将重组质粒pcDNA^TM3.4-Tandab(CD3/BCMA)通过瞬转试剂ExpiFectamine CHOTransfection Kit(Thermo)转染至ExpiCHO-STM细胞中，经过14天最大滴度培养后收集细胞培养液，0.45μm滤膜过滤样品后进行镍柱亲和层析纯化，最终大量获得目的蛋白。之后进行Western blotting鉴定其分子量，对目的蛋白进行初步验证。结果见图2，结果表明，Tandab(CD3/BCMA)成功表达。

实验例1：FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与BCMA+细胞系H929和CD3⁺细胞系Jurkat的结合实验

利用实施例2中得到的10nM双特异性抗体分别与1×10⁶H929和Jurkat细胞进行孵育，室温孵育30分钟，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入APC标记的抗his二抗0.2μl，室温避光孵育30分钟，PBS洗两次，同时设置同型对照管。细胞重悬于200μlPBS缓冲液中，FACS检测。结果见图3，结果表明，可见双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)能有效结合H929和Jurkat。

实验例2：四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与BCMA和CD3双阴细胞的交叉反应实验

利用实施例2中得到的10nM双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)分别与1x10⁶个K562和HL-60细胞(BCMACD3双阴性)进行孵育。室温孵育30min，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入APC标记抗his二抗0.2μl，室温避光孵育30分钟，PBS洗两次，同时设置二抗对照管。细胞重悬于200μl PBS缓冲液中，FACS检测。结果见图4，结果表明，双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与K562和HL-60细胞均无交叉反应。

实验例3：四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)的BCMA结合端、CD3结合端亲和常数检测实验

利用实施例2中得到的双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)以终浓度400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM、0.4nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM分别与1×10⁶H929或Jurkat进行孵育。室温孵育30min，PBS洗两次；100ul重悬细胞，加入APC标记抗his二抗0.2μl，室温避光孵育30分钟，PBS洗两次，同时设置同型对照管。细胞重悬于200μl PBS缓冲液中，FACS测定荧光强度，统计Mean值。用数据分析软件GraphPad Prism7计算双特异性抗体的Kd值。结果见图5，结果表明，双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与细胞膜表面的BCMA和CD3的亲和常数Kd值分别为1.963x10^-9M和1.961x10^-9M。

实验例4：FACS法检测四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)与BCMA商品抗体19F2和CD3商品抗体HIT3a的竞争关系实验

利用实施例2中得到的10nMTandab(CD3/BCMA)和10nMAPC偶联的抗人BCMA商品抗体19F2(品牌：Biolegend，货号：357506)同时与1×10⁶H929细胞室温避光孵育30min。1200rpm，6min离心，弃上清，PBS洗细胞，重复三次，将细胞重悬于200μl的PBS中，FACS测定荧光强度。以10nM商品抗体19F2单独与H929孵育结果为竞争前对照。结果见图6的左图，结果表明，可见Tandab(CD3/BCMA)可以与商品抗体19F2竞争结合靶细胞表面BCMA蛋白。

10nMTandab(CD3/BCMA)和10nMAPC偶联的抗人CD3商品抗体HIT3a(品牌：Biolegend，货号：300312)同时与1×10⁶Jurkat细胞室温避光共孵育30min。1200rpm，6min离心，弃上清，PBS洗细胞，重复三次，将细胞重悬于200μl的PBS中，FACS测定荧光强度。以10nM商品抗体HIT3a单独与Jurkat孵育结果为竞争前对照。结果见图6的右图，结果表明，可见Tandab(CD3/BCMA)可以与商品抗体HIT3a竞争结合靶细胞表面CD3蛋白。

实验例5：四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)介导PBMCs活化marker表达上调及细胞因子释放实验

PBMCs作为效应细胞，NCI-H929作为靶细胞，K562作为阴性细胞对照。在效靶比10:1条件下，浓度倍比稀释添加实施例2中得到的双特异性抗体(从10nM到0.001nM)，37度5％CO₂孵育24h后1800rpm离心8min收集细胞，每管加1μl FITC直标抗人CD8单抗，1μl PE-CY7直标抗人CD4单抗，1μl APC直标抗人CD69单抗，1μl PE直标抗人CD25单抗，室温孵育30min，PBS洗2遍，细胞重悬于200μl PBS中，FACS检测CD25和CD69在CD4和CD8亚群上的表达量。收集培养上清，Elisa定量PBMCs释放至上清的IL-2、TNF-α与IFN-γ。结果见图7与图8，结果表明，Tandab(CD3/BCMA)介导的PBMCs活化marker表达与细胞因子释放呈现浓度依赖性，且H929为靶细胞时介导的活化明显高于K562。

实验例6：LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测法检测由Tandab(CD3/BCMA)介导的PBMCs对H929和K562的杀伤作用实验

PBMCs作为效应细胞，NCI-H929作为靶细胞，K562作为阴性细胞对照。在效靶比10:1条件下，浓度倍比稀释添加实施例2中得到的Tandab(CD3/BCMA)(从10nM到0.001nM)，37度5％CO₂孵育24h后检测在不同浓度Tandab(CD3/BCMA)条件下，Tandab(CD3/BCMA)激活PBMCs中T细胞为主的免疫细胞对靶细胞的杀伤作用。其中设置靶细胞自发释放组：靶细胞+培养基；效应细胞自发释放组：效应细胞+培养基；背景空白对照组：无细胞的培养基；体积校正对照组：LDH裂解液+培养基；靶细胞最大释放组：靶细胞+培养基，培养时间结束前1h，向其中加入10％体积的LDH细胞裂解液，反复吹打混匀；每组设置三个平行副孔，37℃在5％CO₂培养箱中共孵育一段时间后，2500g离心3min，各孔吸取50μl培养上清至一新96孔板，配制LDH工作液，每孔加50μl工作液混匀，室温避光孵育30min，测OD490。测得的各组吸光度均应减去背景空白对照组吸光度(其中靶细胞最大释放组减去体积校正组吸光度)，计算杀伤率＝(实验组-效应细胞自发释放组-靶细胞自发释放组OD值)/(靶细胞最大释放组-靶细胞自发释放组OD值)×100％。结果见图9，结果表明，Tandab(CD3/BCMA)介导的对骨髓瘤细胞的杀伤作用呈现浓度依赖性，且介导的细胞毒性显著优于K562对照组。

实验例7：四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)介导PBMCs增殖实验

使用CFSE-Far Red染料对PBMCs进行染色，具体步骤如下：用PBS将PBMCs的密度调节至1x106/ml，每ml PBMCs加1μl CFSE染料，37度避光孵育20min后添加原染色液5倍体积的培养基孵育5min终止反应。1000rpm离心6min，用完全培养基重悬。

PBMCs作为效应细胞，NCI-H929作为靶细胞，K562作为阴性细胞对照。在效靶比10:1条件下，浓度倍比稀释添加实施例2中得到的Tandab(CD3/BCMA)(从10nM到0.001nM)，37度5％CO₂孵育24h后流式检测在不同浓度Tandab(CD3/BCMA)条件下，Tandab(CD3/BCMA)介导的PBMCs增殖情况。结果见图10，结果表明，Tandab(CD3/BCMA)介导PBMCs的增殖呈剂量依赖性，且H929为靶细胞时介导的增殖明显高于K562。

实验例8：四价双特异性抗体Tandab(CD3/BCMA)对皮下骨髓瘤模型的抑瘤作用实验

利用多发性骨髓瘤细胞株H929建立移植瘤模型。NOD/SCID雌鼠，周龄6－8周，体重16－18g，于右后肢根部背侧皮下接种5x10⁶/0.2ml细胞。移植瘤模型使用游标卡尺测量肿瘤直径，动态观察药物的抗肿瘤效应，肿瘤直径的测量每二天一次，肿瘤体积的计算公式为：V＝1/2×a×b²；a和b分别为肿瘤的长径和短径，每次测量瘤体积时称鼠重。大约5－7天肿瘤生长至50－100mm³，分五组：①PBS；②PBS+1x10⁷ PBMC；③1mg/kgTandab(CD3/BCMA)+1x10⁷PBMC；④0.5mg/kgTandab(CD3/BCMA)+1x10⁷PBMC；⑤0.25mg/kgTandab(CD3/BCMA)+1x10⁷PBMC；第八天开始治疗，一周两次，治疗两周。治疗流程示意图见图11，在接种肿瘤22天后，处死小鼠，治疗终点的瘤体积比较见图12，结果表明，相比于PBS对照组与PBMC对照组，1mg/kg与0.5mg/kg剂量的Tandab(CD3/BCMA)能明显延缓肿瘤生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)

<120> 一种同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体

<130> none

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 4

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 5

Val Ile Thr Pro Gly Arg Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Ala Lys Phe Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 6

Gly Thr Thr Ala Trp Phe Pro Tyr

1 5

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 7

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Thr Pro Gly Arg Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Ala Lys Phe

50 55 60

Ala Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 9

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 9

Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro

1 5 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr

20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 509

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 11

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

35 40 45

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

50 55 60

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu

130 135 140

Val Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

145 150 155 160

Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly

165 170 175

Gln Gly Pro Glu Trp Ile Gly Val Ile Thr Pro Gly Arg Gly Asp Thr

180 185 190

Lys Tyr Asn Ala Lys Phe Ala Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys

195 200 205

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Asp Asp

210 215 220

Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Thr Thr Ala Trp Phe Pro Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln

260 265 270

Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser

275 280 285

Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

290 295 300

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu

305 310 315 320

Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly

325 330 335

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp

340 345 350

Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Tyr Thr Phe

355 360 365

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

385 390 395 400

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

405 410 415

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

420 425 430

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

435 440 445

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

450 455 460

Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

465 470 475 480

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

485 490 495

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser His His His His His His

500 505

<210> 12

<211> 1527

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgctgaca tcgagctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120

gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag 180

tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 240

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cggcatggag 300

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc 360

tgtgggacca agctggagct gaaacggggt ggcggagggt cgcaggtcca gctgcagcag 420

tctggagctg aggtggtaag gcctgggact tcagtgaagg tgtcctgcaa ggcttctgga 480

tacgccttca ctaattactt gatagagtgg gtaaagcaga ggcctggaca gggccctgag 540

tggattggag tgattactcc tggacgtggt gatactaaat acaatgcgaa attcgcgggc 600

aaggcaacac tgactgcaga caaatcctcc agcactgcct acatgcagct cagcagcctg 660

acatttgatg actctgcggt ttatttctgt gcaagaggga ctacggcctg gtttccttac 720

tggggccaag ggactctggt cactgtctcc gcaggaggcg gcggtagcgg cggaggaggt 780

tcaggaggtg ggggcagtga cattgtgctg acacagtctc ctgcttcctt aactgtatct 840

ctggggcaga gggccaccat ctcatgcagg gccagcaaaa gtgtcagtac atctggctat 900

agttatatgc actggtacca acagaaacca agacagccac ccaaactcct catctatctt 960

gcatccaacc tagaatctgg ggtccctgcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac 1020

ttcaccctca acatccatcc tgtggaggag gaggatgctg caacctatta ctgtcagcac 1080

agtagggacc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa acgggctggt 1140

ggcggagggt cgcaggtgca gctgcagcag tctggggctg aactggcaag acctggggcc 1200

tcagtaaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacaccttta ctaggtacac gatgcactgg 1260

gtaaaacaga ggcctggaca gtgcctggaa tggattggat acattaatcc tagccgtggt 1320

tatactaatt acaatcagaa gttcaaggac aaggccacat tgactacaga caaatcctcc 1380

agcacagcct atatggagct cactaggctg acatctgagg actctgcagt ctattactgt 1440

gcaagatatt acgatgatca ttacagcctt gactactggg gccaaggcac cacggtcacc 1500

gtctcctcac atcatcacca tcaccat 1527

Claims

1.同时靶向人BCMA和人CD3的双特异性抗体，其特征在于，其包含：

a)特异性结合人BCMA的抗原结合部分；

b)特异性结合人CD3的抗原结合部分；和

c)所述抗原结合部分之间的连接体；

其中，所述特异性结合人BCMA的抗原结合部分包含如SEQ ID No.1-3所示的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，以及如SEQ ID No.4-6所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％以上同源性的序列。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合人BCMA的抗原结合部分包含如SEQ ID No.7所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID No.8所示的重链可变区的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％以上同源性的序列。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合人CD3的抗原结合部分包含如SEQ ID No.9所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID No.10所示的重链可变区的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％以上同源性的序列。

4.根据权利要求1～3任意一项中所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体是人、人源化或嵌合抗体。

5.根据权利要求1～3任意一项中所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接体为(GGGGS)_n，其中n为整数且1≤n≤3。

6.根据权利要求1～3任意一项中所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体为四价双特异性抗体。

7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述四价双特异性抗体的一级结构按照特异性结合人CD3的抗原结合部分中的轻链可变区序列-特异性结合人BCMA的抗原结合部分中的重链可变区序列-特异性结合人BCMA的抗原结合部分中的轻链可变区序列-特异性结合人CD3的抗原结合部分中的重链可变区序列的顺序由N端至C端排列。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合人CD3的抗原结合部分的轻链可变区的氨基酸序列的第100位丝氨酸由半胱氨酸取代。

9.根据权利要求7或8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双体异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。

10.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1～9任意一项中所述的双特异性抗体；

优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

11.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求10所述的核酸分子。

12.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求11所述的表达载体。

13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～9任意一项中所述的双特异性抗体或如权利要求10所述的分离的核酸分子，以及药学上可接受的载体。

14.一种免疫缀合物，其特征在于，所述免疫缀合物包含如权利要求1～9任意一项中所述的双特异性抗体，其与治疗剂连接。

15.如权利要求1～9任意一项中所述的双特异性抗体、如权利要求10所述的分离的核酸分子、如权利要求11所述的表达载体、如权利要求12所述的宿主细胞、如权利要求13所述的药物组合物或如权利要求14所述的免疫缀合物在制备治疗肿瘤的产品中的用途；

优选地，所述肿瘤为血液肿瘤；

更优选地，所述血液肿瘤为多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小无核裂细胞淋巴瘤、地方性伯基特氏淋巴瘤、扩散性伯基特氏淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、结外粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、结单核B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤，肺B细胞血管中心性淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病或成胶质细胞瘤；

更优选地，所述血液肿瘤为多发性骨髓瘤。