KR20230098629A - 항-il5 나노 항체 및 이의 응용 - Google Patents

항-il5 나노 항체 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL5 나노 항체 및 이의 응용을 제공한다. 본 발명은 구체적으로 IL5 나노 항체를 제공하고, 또한 상기 나노 항체를 코딩하는 코딩 서열, 상응한 발현 벡터 및 상기 나노 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 나노 항체의 생성 방법을 제공한다. 상기 나노 항체는 인간과 게잡이 원숭이의 IL5를 특이적으로 인식할 수 있지만 마우스의 IL5를 인식하지 않고, 우수한 결합 활성을 가지며; IL5/IL5R 차단 활성이 우수하고, 차단 활성이 대조군 항체 Nucala보다 유의하게 우수하며; IL5에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고, 억제 활성이 대조군 항체 Nucala보다 우수하며; 피치아 파스토리스에서의 발현 수율은 13g/L에 달할 수 있고, 표적 단백질 발현 상층액의 순도가 높다.

Description

항-IL5 나노 항체 및 이의 응용
본 발명은 생물의학 또는 생물제약 기술분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로 항-IL5 나노 항체 및 이의 응용에 관한 것이다.
호산구는 유기체를 감염으로부터 보호하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나 일부 개체에서 호산구 수치가 높아지면 염증이 생길 수 있으며, 특정 염증성 질환의 발달에서 작용할 수 있다. IL5는 알려진 사이토카인 중 호산구에 대한 선택성이 가장 높으며, 호산구의 성장, 분화, 모집, 활성화 및 생존을 조절할 수 있다. 이의 수용체 IL5Rα는 호산구에서 고도로 발현되며, 호산구가 혈액 및 조직에서 알레르겐을 제거하는 데 중요한 역할을 한다. IL5는 현재 Th2 경로의 주요 구동 인자 중 하나로 간주되며, IL5가 이의 수용체에 결합한 후 다운스트림 JAK-STAT 신호 경로를 더욱 활성화시킨다.
최근 면역 조절 약물 연구 개발 분야의 중요한 표적으로서, IL5는 면역 치료 분야에서 중요한 역할을 하고 있고, 전 세계적으로 IL5/IL5Rα를 표적으로 하는 세 가지 단클론 항체 약물이 시판 승인을 받았으며, 그 중 두 개는 IL5 항체(GSK사의 Mepolizumab 및 Teva사의 Reslizumab)이고, 한 개는 IL5Rα 항체(AstraZeneca사의 Benralizumab)이며, 환자에게 새로운 치료 옵션을 제공한다. 중국 현지 제약회사인 Sunshine Guojian Pharmaceutical (Shanghai)Co.,Ltd의 IL5 인간화 단클론 항체 주사액(610), Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co.,Ltd.의 IL5 항체(SHR-1703)도 중국 국가약품감독관리국의 임상 시험 승인을 받았다. 세계 최초로 시판 승인된 IL5 단클론 항체 약물, 즉 GSK사의 Mepolizumab은 이미 중등도 천식, 호산구성 육아종증 다발혈관염(EGPA), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 비용종 동반 만성 비부비동염(CRSwNP), 중증 호산구증가증후군, 중증 아토피성 피부염, 중증 양측 비용종 등 적응증에 대한 여러 임상 연구를 승인받았다.
현재까지, IL5 표적에 대한 나노 항체 약물은 시중에 출시되지 않았으며, 나노 항체(nanobody, Nb), 즉, 중쇄 나노 항체 VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)―낙타 체내에 존재하는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체(heavy-chain antibody, HCAb), 이의 가변 영역을 클로닝하여 얻은 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 나노 항체는 현재 입수 가능한 완전한 기능을 가지고 안정적이며 항원에 결합할 수 있는 최소 단위이다. 나노 항체는 안정성이 높고, 수용성이 좋으며, 인간화가 간단하고, 표적화가 높으며, 침투성이 강한 특성을 가지고 있으며, 면역 실험, 진단 및 치료에서 상상을 초월하는 거대한 기능을 발휘하고 있다. 나노 항체는 점차 차세대 항체 진단 및 치료의 새로운 힘으로 떠오르고 있다.
따라서, 새로운 항-IL5 나노 항체 개발은 임상 응용 전망이 좋으며, IL5 나노 항체 약물의 시장 격차를 메워 환자에게 도움이 될 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 항-IL5 나노 항체 및 이의 응용을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 항-IL5 나노 항체를 제공하며, 상기 나노 항체는 IL5에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 나노 항체 중 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
(1)서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3;
(2)서열번호 10으로 표시되는 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 12로 표시되는 CDR3;
(3)서열번호 19로 표시되는 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 21로 표시되는 CDR3; 및
(4)서열번호 28로 표시되는 CDR1, 서열번호 29로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 30으로 표시되는 CDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열은 선택적으로 적어도 하나의(예를 들어, 1~3개, 바람직하게 1~2개, 보다 바람직하게 1개) 아미노산의 첨가, 결실, 변형 및/또는 치환을 거치고 IL5에 결합하는 능력을 유지할 수 있는 유도체 서열을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 나노 항체의 VHH 사슬은 프레임워크 영역(FR)을 더 포함하고, 상기 프레임워크 영역(FR)은,
(1)서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3, 및 서열번호 7로 표시되는 FR4;
(2)서열번호 13으로 표시되는 FR1, 서열번호 14로 표시되는 FR2, 서열번호 15로 표시되는 FR3, 및 서열번호 16으로 표시되는 FR4;
(3)서열번호 22로 표시되는 FR1, 서열번호 23으로 표시되는 FR2, 서열번호 24로 표시되는 FR3, 및 서열번호 25로 표시되는 FR4;
(4)서열번호 31로 표시되는 FR1, 서열번호 32로 표시되는 FR2, 서열번호 33으로 표시되는 FR3, 및 서열번호 34로 표시되는 FR4;
(5)서열번호 37로 표시되는 FR1, 서열번호 38로 표시되는 FR2, 서열번호 39로 표시되는 FR3, 및 서열번호 40으로 표시되는 FR4; 및
(6)서열번호 43으로 표시되는 FR1, 서열번호 44로 표시되는 FR2, 서열번호 45로 표시되는 FR3, 및 서열번호 46으로 표시되는 FR4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4에 의해 분리된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 나노 항체의 VHH 사슬의 아미노산 서열은, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 26, 서열번호 35, 서열번호 41, 서열번호 47, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 나노 항체는 단량체, 2가(2가 항체), 4가(4가 항체), 및/또는 다가(다가 항체)를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 나노 항체는 서열번호 41 및/또는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 두 개의 VHH 사슬을 포함하고, 바람직하게, 상기 VHH 사슬 사이는 연결 펩티드에 의해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드는 (GaSb)x―(GmSn)y 서열로부터 선택되고, 여기서, a, b, m, n, x, y=0 또는 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10(바람직하게, a=4 및 b=1, m=3 및 n=1)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드의 서열은 (G4S)4이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 나노 항체는 두 개의 서로 다른 IL5 에피토프를 인식할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 나노 항체는 인간화 항체, 낙타 유래 항체, 키메라 항체를 포함한다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 항-IL5 항체를 제공하며, 이는 인터루킨 5(IL5) 에피토프에 대한 항체이고, 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체를 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 항체는 단량체, 2가(2가 항체), 4가(4가 항체), 및/또는 다가(다가 항체)를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 항체는 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 26, 서열번호 35, 서열번호 41 또는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 항체는 서열번호 41 및/또는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 두 개의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 항체의 N-말단에서 C-말단까지의 구조는 식 I로 표시되고,
A1-A2-L-B (I);
상기 식에서,
“-"는 펩티드 결합 또는 연결 펩티드이며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 중 어느 하나이고;
B는 IgG의 Fc 단편이며; 및
L은 없거나 플렉서블 링커이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 A1 및 A2는 각각 독립적으로 서열번호 41 또는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 사슬이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 A1은 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 사슬이고, 상기 A2는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 사슬이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 A1은 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 사슬이고, 상기 A2는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 사슬이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 플렉서블 링커는 연결 펩티드이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬 사이는 연결 펩티드에 의해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 링커는 (GaSb)x―(GmSn)y 서열로부터 선택되고, 여기서, a, b, m, n, x, y=0 또는 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10(바람직하게, a=4 및 b=1, m=3 및 n=1)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드의 서열은 (G4S)4이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체의 아미노산 서열은 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 또는 서열번호 59로 표시된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 정확한 공간 구조를 갖는 IL5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 IL5와 IL5R의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 인간 및 게잡이 원숭이의 IL5를 인식할 수 있지만 마우스의 IL5를 인식하지 않는다.
다른 바람직한 예에서, IL5에 대한 상기 항체의 친화도는 1nM 미만이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 IL5/IL5R 차단 활성이 우수하고, 차단 활성이 대조군 항체 Nucala보다 유의하게 우수하다. 여기서, 대조군 항체 Nucala는 글락소스미스클라인(GSK Plc)사의 시판 의약품인 Mepolizumab, 즉 메폴리주맙이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 IL5에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고, 억제 활성이 대조군 항체 Nucala보다 우수하다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 나노 항체이다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질을 제공하며, 상기 융합 단백질의 N-말단에서 C-말단까지의 구조는 식 Ia 또는 Ib로 표시되고,
A-L-B (Ia);
B-L-A (Ib);
상기 식에서,
“-"는 펩티드 결합이며;
A는 하나 이상의 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체이고;
B는 IgG의 Fc 단편이며; 및
L은 없거나 플렉서블 링커이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 플렉서블 링커는 연결 펩티드이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 IgG의 Fc 단편은 인간의 IgG의 Fc 단편을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 IgG의 Fc 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 Fc 단편, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 IgG의 Fc 단편은 IgG4이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 Fc 단편의 아미노산 서열은 서열번호 63으로 표시된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 또는 서열번호 59로 표시된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 융합 단백질은 IL5 에피토프에 대한 나노 항체 Fc 융합 단백질이다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 조합 형태이고, 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 9, 서열번호 18, 서열번호 27, 서열번호 36, 서열번호 42, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60 또는 서열번호 62 중 하나 이상을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA을 포함한다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 발현 벡터를 제공하며, 상기 발현 벡터는 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 발현 벡터는 DNA, RNA, 바이러스 벡터, 플라스미드, 트랜스포존, 기타 유전자 전달 시스템, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, AAV 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이들의 조합과 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 제6 양태에 따르면, 숙주 세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제5 양태에 따른 발현 벡터를 포함하거나 이의 게놈에 본 발명의 제4 양태에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 대장균, 효모 세포, 포유류 세포, 박테리오파지, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균, 유산균, 스트렙토마이세스, 프로테우스 미라빌리스, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 진핵 세포는 피치아 파스토리스, 출아형효모, 분열효모, 트리코더마, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 피치아 파스토리스이다.
본 발명의 제7 양태에 따르면, 본 발명은 항-IL5 나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질의 생성 밥법을 제공하며, 상기 방법은,
(a)나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질의 생성에 적합한 조건에서, 본 발명의 제6 양태에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 항-IL5 나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질을 포함하는 배양물을 얻는 단계;
(b)상기 배양물로부터 상기 항-IL5 나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질을 분리 또는 회수하는 단계; 및
(c)선택적으로, 단계(b)에서 얻은 항-IL5 나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질을 정제 및/또는 변형하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제8 양태에 따르면, 본 발명은 면역접합체를 제공하며, 상기 면역접합체는,
(a)본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질; 및
(b)검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성핵종, 효소, 금 나노입자/나노로드, 자성 나노입자, 바이러스 코트 단백질 또는 VLP, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 접합 부분을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 방사성핵종은,
(i)Tc-99m, Ga-68, F-18, I-123, I-125, I-131, In-111, Ga-67, Cu-64, Zr-89, C-11, Lu-177, Re-188, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 진단용 동위원소; 및/ 또는
(ii)Lu-177, Y-90, Ac-225, As-211, Bi-212, Bi-213, Cs-137, Cr-51, Co-60, Dy-165, Er-169, Fm-255, Au-198, Ho-166, I-125, I-131, Ir-192, Fe-59, Pb-212, Mo-99, Pd-103, P-32, K-42, Re-186, Re-188, Sm-153, Ra223, Ru-106, Na24, Sr89, Tb-149, Th-227, Xe-133, Yb-169, Yb-177, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료용 동위원소를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 약물 또는 독소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약물은 세포 독성 약물이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 세포 독성 약물은, 항튜불린제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제, 항생제, 엽산 길항제, 항대사제, 화학증감제, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 특히 유용한 세포 독성 약물의 예로는 예를 들어, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 알킬화제, 및 튜불린 억제제를 포함하고, 전형적인 세포 독성 약물은 예를 들어, 아우리스타틴(auristatins), 캄프토테신(camptothecins), 듀오카르마이신/듀오카마이신(duocarmycins), 에토포사이드(etoposides), 메이탄신(maytansines)및 메이탄시노이드(maytansinoids)(예를 들어, DM1 및 DM4), 탁산(taxanes), 벤조디아제핀(benzodiazepines) 또는 벤조디아제핀을 포함한 약물(benzodiazepine containing drugs)(예를 들어, 피롤로[1,4] 벤조디아제핀(PBDs), 인돌리노벤조디아제핀(indolinobenzodiazepines)및 옥사졸리디노벤조디아제핀(oxazolidinobenzodiazepines)), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 독소는, 아우리스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, MMAE 및 MMAF), 오레오마이신(aureomycin), 메이탄시놀(maytansinol), 리신(ricin), 리신 A-사슬, 콤브레타스타틴(combretastatin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 돌라스타틴(dolastatin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), cc1065, 브롬화에티듐(ethidium bromide), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicine), 디히드록시안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 악티노마이신(actinomycin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 외독소(PE) A, PE40, 아브린(abrine), 아브린 A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, α-사르시니아(α-sarcina), 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(retstrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 큐리신(curicin), 크로틴(crotin), 칼리키아마이신(calicheamicin), 비누풀(Sapaonaria officinalis) 억제제, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 검출 가능한 마커이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은, 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기공명영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 산물을 생성할 수 있는 효소, 방사성핵종, 생물독소, 사이토카인(예를 들어, IL-2 등), 항체, 항체 Fc 단편, 항체 scFv 단편, 금 나노입자/나노로드, 바이러스 입자, 리포솜, 자성 나노입자, 전구약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아포라아제(DTD) 또는 비페닐 가수분해효소 유사 단백질(BPHL))또는 임의의 형태의 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제9 양태에 따르면, 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은,
(i)본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역접합체; 및
(ii)약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역접합체의 접합 부분은 약물, 독소, 및/또는 치료용 동위원소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 코르티코스테로이드(TCS), 네도크로밀 나트륨(nedocromil sodium), 크로몰린 나트륨(cromolyn sodium), 테오필린(theophylline), 류코트리엔(leukotriene) 수용체 길항제, 또는 이들의 조합과 같은 천식, 아토피성 피부염, 관절염, 알레르기성 비염 및/또는 습진의 치료를 위한 다른 약물을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 IL5/IL5R 신호 전달과 관련된 질환 또는 병증의 예방 및/또는 치료를 위한 약물 제조에 사용된다.
본 발명의 제10 양태에 따르면, 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역접합체의 용도를 제공하며, (a)IL5/IL5R 신호 전달과 관련된 질환 또는 병증의 예방 및/또는 치료용 약물을 제조하기 위해 사용되고; (b)IL5 검출을 위한 시약, 검출 플레이트 또는 키트를 제조하기 위해 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 질환 또는 병증은 천식, 아토피성 피부염, 관절염, 알레르기성 비염, 습진, 부비동염, 비용종, 만성 폐쇄성 폐질환, 호산구성 육아종증 다발혈관염, 호산구증가증후군, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 IL5은 인간 IL5이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시약은 진단 시약이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 진단 시약은 조영제이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시약은 샘플 중의 IL5 단백질 또는 이의 단편을 검출하기 위해 사용된다.
본 발명의 제11 양태에 따르면, 다중특이적 항체를 제공하며, 상기 다중특이적 항체는 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 다중특이적 항체는 IL-4R, IL-4Rα, IL-13, IL-13R, IL-11, IL-11R, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적을 표적으로 하는 제2 항원 결합 영역을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제2 항원 결합 영역는 나노 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 다중특이적 항체는 하나 이상의 제2 항원 결합 영역을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 다중특이적 항체는 항체의 Fc 단편을 더 포함한다.
본 발명의 제12 양태에 따르면, 재조합 단백질을 제공하며, 상기 재조합 단백질은,
(i)본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질; 및
(ii)발현 및/또는 정제를 보조하는 임의의 태그 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 태그 서열은 Fc 태그, HA 태그 및 6His 태그를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 재조합 단백질은 IL5 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 제13 양태에 따르면, 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역접합체의 용도를 제공하며, 샘플 중의 IL5 단백질을 검출하기 위해 사용되거나, 또는 IL5/IL5R 신호 전달과 관련된 질환 또는 병증을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 질환 또는 병증은 천식, 아토피성 피부염, 관절염, 알레르기성 비염, 습진, 부비동염, 비용종, 만성폐쇄성폐질환, 호산구성 육아종증 다발혈관염, 호산구증가증후군, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 유세포 분석, 세포 면역 형광 검출을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 용도는 진단적 및/또는 비진단적, 및/또는 치료적 및/또는 비치료적이다.
본 발명의 제14 양태에 따르면, 검출 샘플 중의 IL5 단백질의 검출 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(1)샘플을 본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질, 또는 본 발명의 제8 양태에 다른 면역접합체와 접촉시키는 단계;
(2)항원-항체 복합체가 형성되는지 여부를 검출하며, 복합체가 형성되면 샘플 중 IL5 단백질이 존재함을 나타내는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 비진단적 및 비치료적인 방법이다.
본 발명의 제15 양태에 따르면, IL5 단백질 검출 시약을 제공하며, 상기 검출 시약은,
(i)본 발명의 제1 양태에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-IL5 항체, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역접합체; 및
(ii)검출학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역접합체의 접합 부분은 진단용 동위원소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출학적으로 허용 가능한 담체는 무독성, 불활성 수성 담체 매질이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약은, 동위원소 추적자, 조영제, 유세포 분석 시약, 세포 면역 형광 검출 시약, 자성 나노입자 및 현상제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약은 체내 검출에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약의 제형은 액체 형태 또는 분말 형태(예를 들어, 물 제제, 주사제, 동결 건조 분말, 정제, 구강 제제, 에어로졸제)이다.
본 발명의 제16 양태에 따르면, IL5 단백질 검출용 키트를 제공하며, 상기 키트는 본 발명의 제8 양태에 따른 면역접합체 또는 본 발명의 제15 양태에 따른 검출 시약 및 설명서를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 설명서에 의하면 상기 키트는 피시험 대상의 IL5 발현을 비침습적으로 검출하하기 위해 사용된다.
본 발명의 제17 양태에 따르면, 본 발명의 제8 양태에 따른 면역접합체의 용도를 제공하며, 체내 IL5 단백질 검출용 조영제의 제조에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 천식, 아토피성 피부염, 관절염, 알레르기성 비염, 습진, 부비동염, 비용종, 만성 폐쇄성 폐질환, 호산구성 육아종증 다발혈관염, 호산구증가증후군 등의 진단 또는 예후에 사용된다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술적 특징과 하기(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명된 각 기술적 특징은 서로 결합하여 새롭거나 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있음을 이해해야 한다. 편폭에 한하여 여기서 반복하여 설명하지 않기로 한다.
도 1은 IL5 나노 항체 스크리닝 및 농축 과정을 나타낸다. 5회 패닝 후, 두 라이브러리에서 IL5 특이적 나노 항체 박테리오파지는 각각 120배 및 14.6배로 농축되었다.
도 2는 IL5와 IL5R의 상호작용을 차단하는 나노 항체를 유세포 분석에 의해 1차 스크리닝한 결과를 나타낸다. 그 결과 96개의 나노 항체 중 11개의 항체가 차단 활성을 갖는 것으로 나타났다.
도 3은 ELISA에 의해 검출된 11개의 차단형 IL5 나노 항체의 종 교차 활성 결과를 나타낸다. 그 결과 11개의 나노 항체는 모두 인간과 게잡이 원숭이 IL5를 인식할 수 있지만 마우스 IL5를 인식할 수 없는 것으로 나타났다.
도 4는 생물층 간섭 기술인 Fortebio를 이용하여 나노 항체의 친화도를 검출한 결과를 나타낸다. 그 결과 IL5에 대한 11개의 나노 항체의 친화도는 모두 1nM 미만인 것으로 나타났다.
도 5는 ELISA에 의해 검출된 나노 항체의 결합 활성 결과를 나타낸다. 그 결과 4개의 나노 항체의 결합 활성이 대조군 항체 Nucala보다 우수한 것으로 나타났다.
도 6은 유세포 분석에 의해 동정된 후보 IL5 나노 항체의 차단 활성을 나타낸다. 그 결과 4개의 나노 항체는 모두 IL5/IL5R 차단 활성이 우수하고, 그 중 Nb21, Nb66의 차단 활성이 대조군 항체 Nucala보다 유의하게 우수한 것으로 나타났다.
도 7은 ELISA에 의해 검출된 차단형 나노 항체의 항원 인식 에피토프 균일성 결과를 나타낸다. 그 결과 Nb21와 Nb66는 서로 다른 항원 인식 에피토프인 것으로 나타났다.
도 8은 유세포 분석에 의해 검출된 인간화 2가 나노 항체의 차단 활성을 타나낸다. 그 결과 인간화 2가 항체의 활성이 1가 항체보다 유의하게 높았으며, 그 중 HuNb21-HuNb66-Fc 및 HuNb66-HuNb21-Fc 2가 이중 에피토프 항체의 차단 활성이 가장 우수하고, 대조군 항체 Nucala보다 유의하게 우수한 것으로 나타났다.
도 9는 Fortebio에 의해 피치아 파스토리스 발효 상층액에서 이중 에피토프 2가 IL5 나노 항체의 함량을 검출한 결과를 나타낸다. 그 결과 상기 발효 조건에서 2가 이중 에피토프 항체의 발현량은 배양 시간에 따라 지속적으로 증가하고, 202시간 동안 발효 배양한 항체 수율은 13g/L에 달할 수 있는 것으로 나타났다.
도 10은 피치아 파스토리스 발효 상층액에서 이중 에피토프 2가 IL5 나노 항체의 SDS-PAGE 검출 결과를 나타낸다. 그 결과 피치아 파스토리스에서 이중 에피토프 IL5 나노 항체 HuNb66-HuNb21의 발현 수율은 13g/L에 달할 수 있고, 표적 단백질 발현 상층액의 순도가 높은 것으로 나타났다.
도 11은 유세포 분석에 의해 2가 이중 에피토프 IL5 나노 항체의 차단 활성을 검출한 결과를 나타낸다. 그 결과 효모에 의해 발현된 2가 이중 에피토프 항체 HuNb66-HuNb21의 차단 활성(IC50=0.841μg/mL)은 대조군 항체 Nucala(IC50=2.035μg/mL)보다 우수한 것으로 나타났다.
도 12는 TF1 세포에 대한 2가 이중 에피토프 IL5 나노 항체의 증식 및 억제 효과를 검출한 결과를 나타낸다. 그 결과 효모에 의해 발현된 2가 이중 에피토프 항체는 IL5에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고, 억제 활성(IC50 HuNb66-HuNb21=0.0512 nM)은 TF-1 세포에 대한 대조군 항체의 증식 및 억제 효과(IC50 Nucala=0.1782 nM)보다 우수한 것으로 나타났다.
광범위하고 심층적인 연구 끝에, 본 발명자는 대량의 스크리닝을 거쳐, 처음으로 IL5 나노 항체를 예기치 않게 발견하였고, 실험 결과, 본 발명의 나노 항체는 인간 및 게잡이 원숭이의 IL5를 특이적으로 인식할 수 있지만 마우스의 IL5를 인식하지 않고, 우수한 특이성과 결합 활성을 가지며; 본 발명의 나노 항체는 우수한 IL5/IL5R 차단 활성을 가지고, 차단 활성이 대조군 항체 Nucala보다 유의하게 우수하며; 본 발명의 나노 항체는 IL5에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고, 억제 활성이 대조군 항체 Nucala보다 우수하며; 본 발명의 나노 항체는 피치아 파스토리스에서의 발현 수율은 13g/L에 달할 수 있고, 표적 단백질 발현 상층액의 순도가 높다.
용어
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 나노 항체”, "본 발명에 따른 나노 항체”, "본 발명에 따른 항-IL5 나노 항체”, "본 발명의 IL5 나노 항체”, "항-IL5 나노 항체”, "IL5 나노 항체”는 동일한 의미를 가지고, 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 모두 IL5(인간 IL5 포함)를 특이적으로 인식하고 결합하는 나노 항체를 의미한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "항체” 또는 "면역글로불린”은 동일한 구조적 특징을 갖는 약 150000달톤의 헤테로테트라머 당단백질로, 두 개의 동일한 경쇄(L) 및 두 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되며, 서로 다른 면역글로불린 이소타입의 중쇄 간의 이황화 결합의 수는 서로 다르다. 각 중쇄 및 경쇄에는 규칙적인 간격의 사슬 내 이황화 결합도 있다. 각 중쇄의 일단에는 가변 영역(VH)이 있고, 그 뒤에는 복수의 불변 영역이 있다. 각 경쇄의 일단에는 가변 영역(VL)이 있고, 다른 일단에는 불변 영역이 있으며; 경쇄의 불변 영역은 중쇄의 첫 번째 불변 영역과 대향하고, 경쇄의 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 대향한다. 특수한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 사이에서 계면을 형성한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 도메인”, "VHH", "나노 항체(nanobody)", "중쇄 항체”(single domain antibody, sdAb, 또는 나노바디 nanobody)는 동일한 의미를 가지고 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여, 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 나노 항체(VHH)를 구축하는 것을 의미하고, 이는 완전한 기능을 갖는 가장 작은 항원 결합 단편이다. 일반적으로, 먼저 경쇄 및 중쇄 불변 영역 1(CH1)이 자연적으로 결여된 항체를 얻은 다음, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여, 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 나노 항체(VHH)를 구축한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "가변”은 항체 중 가변 영역의 특정 부분의 서열이 다르다는 것을 나타내고, 이는 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합 및 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 항체 가변 영역 전체에 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 하는 세 개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역의 비교적 보존적인 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에는 각각 네 개의 FR 영역이 포함되어 있고, 이들은 대략적으로 b-시트 배열이며, 연결 고리를 형성하는 세 개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우에 부분적인 b-시트 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬의 CDR은 FR영역에 의해 긴밀히 근접하고 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat 등, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, 647-669페이지(1991) 참조바람). 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체의 항체 의존적 세포 독성에 관여하는 것과 같은 다른 이펙터 기능을 나타낸다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 면역접합체 및 융합 발현 산물은 약물, 독소, 사이토카인(cytokine), 방사성핵종, 효소 및 기타 진단 또는 치료 분자가 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 결합하여 형성된 접합체를 포함한다. 본 발명은 상기 항-IL5 항체 또는 이의 단편에 결합된 세포 표면 마커 또는 항원을 더 포함한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 가변 영역”과 "VH"는 서로 교환하여 사용할 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "가변 영역”과 "상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)"은 서로 교환하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 세 개의 상보적 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄는 상기 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "본 발명의 항체”, "본 발명의 단백질” 또는 "본 발명의 폴리펩티드”는 서로 교환하여 사용할 수 있고, 모두 중쇄 가변 영역이 있는 단백질 또는 폴리펩티드와 같이 IL5 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 의미한다. 이들은 시작 메티오닌을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 갖는 기타 단백질 또는 융합 발현 산물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 가변 영역이 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역과 동일하거나 또는 적어도 90% 상동성, 바람직하게, 적어도 95% 상동성을 갖는다면 가변 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 임의의 단백질 또는 단백질 접합체 및 융합 발현 산물(즉, 면역접합체 및 융합 발현 산물)을 포함한다.
일반적으로, 항체의 항원 결합 특성은 가변 영역(CDR)이라고 하는 중쇄 가변 영역에 위치한 세 개의 특정 영역으로 설명할 수 있으며, 상기 세그먼트는 네 개의 프레임워크 영역(FR)으로 분리되고, 네 개의 FR의 아미노산 서열은 상대적으로 보존적이며, 결합 반응에 직접 관여하지 않는다. 이들 CDR은 고리형 구조를 형성하고, 그 사이의 FR에 의해 형성된 β-시트는 공간 구조적으로 서로 근접하고, 중쇄의 CDR과 상응한 경쇄의 CDR은 항체의 항원 결합 부위를 구성한다. FR 또는 CDR 영역을 구성하는 아미노산은 동일한 유형의 항체의 아미노산 서열을 비교하여 결정할 수 있다.
본 발명의 항체의 중쇄의 가변 영역은 적어도 일부가 항원 결합에 관련되기 때문에 특히 흥미롭다. 따라서, 본 발명은 CDR이 본원에서 동정된 CDR과 90% 이상(바람직하게 95% 이상, 가장 바람직하게 98% 이상)의 상동성을 갖는 한, CDR을 갖는 항체 중쇄 가변 영역을 갖는 분자를 포함한다.
본 발명은 완전한 항체뿐만 아니라, 면역 활성을 갖는 항체의 단편 또는 항체와 기타 서열에 의해 형성된 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사체를 더 포함한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "단편”, "유도체” 및 "유사체”는 기본적으로 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 단편, 유도체 또는 유사체는 (i)하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드일 수 있고, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있거나, 또는 (ii)하나 이상의 아미노산 잔기에 치환기가 있는 폴리펩티드, 또는 (iii)성숙한 폴리펩티드가 다른 화합물(폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리펩티드의 반감기를 연장시키는 화합물)과 융합하여 형성된 폴리펩티드, 또는 (iv)해당 폴리펩티드 서열에 부가적인 아미노산 서열이 융합되어 형성된 폴리펩티드(예를 들어, 리더 서열 또는 분비 서열 또는 해당 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용되는 서열 또는 전구단백질 서열, 또는 6His 태그에 의해 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본문의 교시에 따르면, 이들 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에게 공지된 범위 내에 속한다.
본 발명의 항체는 IL5 결합 활성을 갖는 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 또한 본 발명의 항체와 동일한 기능을 갖는 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이체 형태를 포함한다. 이들 변이체 형태는 하나 이상(일반적으로 1-50개, 바람직하게 1-30개, 보다 바람직하게 1-20개, 보다 더 바람직하게 1-10개)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C-말단 및/또는N-말단에서 하나 이상(일반적으로 20개 이내, 바람직하게 10개 이내, 보다 바람직하게 5개 이내)의 아미노산의 첨가를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 분야에서, 성능이 비슷하거나 유사한 아미노산으로 치환할 경우, 일반적으로 단백질의 기능은 변경되지 않는다. 또 다른 예로, C-말단 및/또는 N-말단에 하나 이상의 아미노산을 첨가하더라도 일반적으로 단백질의 기능은 변경되지 않는다. 상기 용어는 본 발명의 항체의 활성 단편 및 활성 유도체를 더 포함한다.
상기 폴리펩티드의 변이체 형태는 상동 서열, 보존적 변이체, 대립형질 변이체, 천연 돌연변이체, 유도된 돌연변이체, 엄격도가 높거나 낮은 조건에서 본 발명의 항체의 코딩 DNA와 혼성화 가능한 DNA에 의해 코딩된 단백질 및 본 발명의 항체에 대한 항혈청을 이용하여 얻은 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.
본 발명은 또한 나노 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질과 같은 기타 폴리펩티드를 제공한다. 대략 전장의 폴리펩티드 외에도, 본 발명은 본 발명의 나노 항체의 단편을 더 포함한다. 일반적으로, 상기 단편은 본 발명의 항체의 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 바람직하게 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 약 80개의 연속 아미노산, 보다 더 바람직하게 적어도 약 100개의 연속 아미노산을 갖는다.
본 발명에서, "본 발명의 항체의 보존적 변이체”는 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 10개, 바람직하게 최대 8개, 보다 바람직하게 최대 5개, 보다 더 바람직하게 최대 3 개 아미노산이 유사하거나 비슷한 성질의 아미노산으로 치환되어 폴리펩티드를 형성하는 것을 의미한다. 이들 보존적 변이체 폴리펩티드는 바람직하게 표 A에 따른 아미노산 치환에 의해 생성된다.
표 A
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본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성된 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 가닥 또는 비코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 성숙한 폴리펩티드만을 코딩하는 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열 및 다양한 부가 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열(및 임의의 부가 코딩 서열) 및 비코딩 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드”는 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 부가 코딩 및/또는 비코딩 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 서열과 혼성화하고 두 서열 사이에 적어도 50%, 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에서 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "엄격한 조건”은, (1)0.2ХSSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 낮은 이온 강도와 높은 온도에서의 혼성화 및 용출; 또는 (2)50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 송아지 혈청/0.1% Ficoll, 42℃와 같이 혼성화 시 변성제의 첨가; 또는 (3)두 서열 사이의 상동성이 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상일 때만 혼성화하는 것을 의미한다. 또한, 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 및 활성을 갖는다.
본 발명의 항체의 뉴클레오티드 전장 서열 또는 이의 단편은 일반적으로 PCR 증폭법, 재조합법 또는 인공 합성 방법에 의해 얻을 수 있다. 실행 가능한 방법은 특히 단편 길이가 짧은 경우 인공 합성 방법에 의해 관련 서열을 합성한다. 일반적으로, 먼저 복수의 작은 단편을 합성한 다음 연결함으로써 매우 긴 서열의 단편을 얻을 수 있다. 이 밖에, 중쇄에 대한 코딩 서열과 발현 태그(예를 들어, 6His)를 융합하여, 융합 단백질을 형성할 수 있다.
일단 관련 서열을 얻으면, 재조합법으로 관련 서열을 대량으로 얻을 수 있다. 이는 일반적으로 이를 클로닝하여 벡터에 넣고, 세포로 형질전환한 다음, 일반적인 방법을 통해 증식한 숙주 세포에서 관련 서열을 분리한다. 본 발명에 관한 생체분자(핵산, 단백질 등)는 분리된 형태로 존재하는 생체분자를 포함한다.
현재, 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열은 화학적 합성에 의해 완전히 얻어질 수 있다. 다음으로 상기 DNA 서열은 당업계에 알려진 다양한 기존 DNA 분자(또는 예를 들어, 벡터) 및 세포에 도입될 수 있다. 이 밖에, 돌연변이는 또한 화학적 합성을 통해 본 발명의 단백질 서열에 도입될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 단백질을 발현할 수 있도록 적절한 숙주 세포를 형질전환할 수 있다.
숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로는, 대장균, 스트렙토마이세스; 살모넬라 티피무리움의 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 초파리 S2 또는 Sf9의 곤충 세포; CHO, COS7, 293 세포의 동물 세포 등이 있다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트 세포는 지수발육기 후에 수확될 수 있고, CaCl2 방법으로 처리할 수 있으며, 사용된 단계는 당업계에 잘 알려져 있다. 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 형질전환은 필요한 경우 전기천공 방법에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 진핵생물인 경우, 인산칼슘 공침법, 미세주입, 전기 천공법과 같은 기존의 기계적 방법, 리포솜 패키징과 같은 DNA 형질감염 방법을 사용할 수 있다.
얻은 형질전환체는 통상적인 방법으로 배양하여, 본 발명의 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 배양에 사용되는 배지는 다양한 일반적인 배지로부터 선택할 수 있다. 숙주 세포 성장에 적합한 조건에서 배양한다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적합한 방법(예를 들어, 온도 전환 또는 화학적 유도)을 사용하여 선택된 프로모터를 유도하고, 세포를 일정 시간 동안 더 배양한다.
위의 방법에서 재조합 폴리펩티드는 세포내, 또는 세포막에서 발현되거나, 세포외로 분비될 수 있다. 필요한 경우, 물리적, 화학적 및 기타 특성을 이용하여 다양한 분리 방법으로 재조합된 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 이들 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 방법의 예는, 통상적인 복원 처리, 단백질 침전제 처리(염석 방법), 원심분리, 삼투압 살균, 초처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 기타 다양한 액체 크로마토그래피 기술 및 이들 방법의 결합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단독으로 사용할 수 있거나, 검출 가능한 마커(진단 목적을 위해), 치료제, PK(단백질 키나아제) 변형 부분 또는 임의의 상기 물질의 조합과 결합 또는 접합할 수도 있다.
진단 목적으로 사용되는 검출 가능한 마커는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기공명영상)또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 산물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체와 결합 또는 접합할 수 있는 치료제는, 1. 방사성핵종; 2. 생물독소; 3. IL-2와 같은 사이토카인; 4. 금 나노입자/나노로드; 5. 바이러스 입자; 6. 리포솜; 7. 자성 나노입자; 8. 전구약물 활성화 효소(예를 들어, DT-DIAPHORASE(DTD) 또는 비페닐 가수분해효소 유사 단백질(BPHL)) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
인터루킨-5(IL5)
인터루킨-5(IL5)는 알려진 사이토카인 중 호산구에 대한 선택성이 가장 높으며, 호산구의 성장, 활성화, 생존 및 이동을 조절할 수 있다. 인터루킨-5는 인터루킨-5 특이적 α와 공통 β-소단위를 포함하는 수용체를 통해 증식 및 분화 효과를 나타낸다. IL5는 호산구가 골수에서 폐 및 기타 기관으로 이동할 때 중요한 역할을 한다. IL5 신호는 JAK-STAT, Btk 및 Ras/Raf-ERK 신호 전달을 통해, B 세포 및 호산구의 생존 및 기능을 유지한다. 체내에서 IL5의 과발현은 호산구 및 B 세포의 수를 유의하게 증가시킬 수 있는 반면, IL5 또는 IL5 수용체 기능성 유전자가 결여된 마우스는 B 세포 및 호산구 계통에서 많은 발육 및 기능 장애를 나타낸다. 인간에서, IL5의 생물학적 효과는 호산구의 가장 좋은 특징이다. IL5는 현재 Th2 경로의 주요 구동 인자 중 하나로 간주된다.
인터루킨-5 수용체 α(IL5Rα)
IL5의 수용체 IL5Rα는 호산구에서 고도로 발현되며, 호산구가 혈액 및 조직에서 알레르겐을 제거하는데 중요한 역할을 한다. IL5 수용체는 α 및 βc 사슬로 구성되고, α 소단위는 IL5 분자에 특이적이며, βc 소단위도 인터루킨 3(IL3) 및 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)에 의해 인식된다. 활성화된 B 세포에서 IL5Rα의 발현은 E12, E47, Sp1, c/EBPβ 및 Oct2를 포함한 다양한 전사 인자에 의해 조절된다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 조성물을 제공한다. 바람직하게, 상기 조성물은 상기 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 일반적으로, 이들 물질은 무독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질에서 조제될 수 있으며, 여기서 pH는 일반적으로 약 5-8이고, 바람직하게 pH는 약 6-8이지만, pH 값은 조제된 물질의 특성과 치료할 병증에 따라 달라질 수 있다. 조제된 약학적 조성물은 복막내, 정맥내, 또는 국소 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않는 통상적인 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 IL5 단백질 분자에 결합하는데 직접 사용될 수 있으므로, 천식, 아토피성 피부염, 관절염, 알레르기성 비염, 습진 등의 치료에 사용될 수 있다. 이 밖에, 다른 치료제와 동시에 사용될 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 안전 유효량(예를 들어, 0.001-99wt%, 바람직하게 0.01-90wt%, 보다 바람직하게 0.1-80wt%)의 본 발명의 상기 나노 항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 반드시 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어 생리 식염수 또는 포도당 및 기타 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 주사제, 용액과 같은 약학적 조성물은 무균 조건에서 제조해야 한다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량으로, 예를 들어 매일 약 10μg/kg 체중-약 50mg/kg 체중이다. 이 밖에, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 치료제와 함께 사용될 수도 있다.
약학적 조성물을 사용하는 경우, 안전 유효량의 면역접합체를 포유동물에게 투여하는데, 여기서 상기 안전 유효량은 일반적으로 적어도 약 10μg/kg 체중이고, 대부분의 경우 약 50mg/kg 체중을 초과하지 않으며, 바람직하게 상기 용량은 약 10μg/kg 체중-약 10mg/kg 체중이다. 물론, 구체적인 용량은 숙련된 의사의 기술 범위 내에서 투여 경로, 환자의 건강 상태와 같은 요인도 고려해야 한다.
항-IL5 나노 항체
본 발명에서, 상기 항-IL5 나노 항체의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 26, 서열번호 35, 서열번호 41, 서열번호 47 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 항-IL5 나노 항체는 단량체, 2가(2가 항체), 4가(4가 항체), 및/또는 다가(다가 항체)를 포함한다.
전형적으로, 상기 항-IL5 나노 항체는 서열번호 41 및/또는 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 두 개의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬 사이는 연결 펩티드에 의해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드는 (GaSb)x―(GmSn)y 서열로부터 선택되고, 여기서 a, b, m, n, x, y=0 또는 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10(바람직하게, a=4 및 b=1, m=3 및 n=1)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드의 서열은 (G4S)4이다.
표지된 나노 항체
본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 나노 항체는 검출 가능한 마커를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 마커는 동위원소, 콜로이드 금 마커, 컬러 마커 또는 형광 마커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
콜로이드 금 표지는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 바람직한 해결수단에서, IL5의 나노 항체는 콜로이드 금으로 표지하여, 콜로이드 금으로 표지된 나노 항체를 얻는다.
검출 방법
본 발명은 또한 IL5 단백질의 검출 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 단계는 대략 다음과 같다. 세포 및/또는 조직 샘플을 얻고; 샘플을 매질에 용해시키며; 상기 용해된 샘플에서 IL5 단백질의 수준을 검출한다.
본 발명의 검출 방법에서, 사용되는 샘플은 특별히 한정하지 않으며, 대표적인 예는 세포보존액에 존재하는 세포를 포함하는 샘플이다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항체(또는 이의 단편) 또는 검출 플레이트를 포함하는 키트를 제공하고, 본 발명의 일 바람직한 예에서, 상기 키트는 용기, 사용 설명서, 완충제 등을 더 포함한다.
본 발명은 또한 IL5 수준을 검출하기 위한 검출 키트를 제공하고, 상기 키트는 IL5 단백질을 인식하기 위한 항체, 샘플을 용해하기 위한 용해 매질, 다양한 완충액, 검출 표지, 검출 기질과 같은 검출에 필요한 일반 시약 및 완충액을 포함한다. 상기 검출 키트는 체외 진단 장치일 수 있다.
응용
상술한 바와 같이, 본 발명의 나노 항체는 광범위한 생물학적 응용 가치와 임상적 응용 가치를 가지며, 이의 응용은 IL5와 관련된 질환의 진단 및 치료, 기초 의학 연구, 생물학적 연구 등 다양한 분야에 걸쳐있다. 일 바람직한 응용은 IL5에 대한 임상 진단 및 표적 치료에 사용된다.
본 발명의 주요 장점은 다음과 같다.
(a)본 발명의 나노 항체는 IL5와 IL5R의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
(b)본 발명의 나노 항체는 인간 및 게잡이 원숭이의 IL5를 인식할 수 있지만 마우스의 IL5는 인식하지 않는다.
(c)본 발명의 나노 항체는 대조군 항체 Nucala에 비해 더 강한 결합 활성 및 차단 활성을 갖는다.
(d)본 발명의 나노 항체는 피치아 파스토리스에서 발현될 수 있고, 발현 수율은 13g/L에 달할 수 있으며, 표적 단백질 발현 상층액의 순도가 높다.
(e)본 발명의 나노 항체는 IL5에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고, 억제 효과는 대조군 항체 Nucala보다 우수하다.
아래 구체적인 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 아래 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은, 일반적으로 통상적인 조건에 따르며, 예를 들어 (Sambrook 및 Russell 등, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(제3판)(2001)CSHL출판사)에 명시된 조건, 또는 제조업체가 권장하는 조건이다. 달리 명시되지 않은 한 백분율과 분량은 중량에 따라 계산한다.
실시예1: 박테리오파지 디스플레이 기술에 의한 IL5 특이적 나노 항체 스크리닝
초기에는 고순도의 인간 IL5 단백질을 면역 보조제와 혼합하여, 신장 쌍봉낙타 2마리를 면역화하고, 7회 면역화 후 말초혈액을 채취한 다음 림프구를 추출하여 RNA를 분리하였다. RNA를 역전사한 후 중첩 PCR 증폭을 통해 VHH 유전자를 분리한 다음, VHH 단편을 pMECS 벡터에 클로닝한 다음, TG1 컴피턴트 세포로 전기형질전환하여 항-IL5 나노 항체 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 측정 결과, 두 라이브러리의 저장 용량은 각각 6.4Х108 CFU 및 1.3Х108 CFU이고, 라이브러리의 목적 단편 VHH의 삽입률은 각각 91.7% 및 100%에 달했다. 그런 다음 박테리오파지 디스플레이 기술을 이용하여 IL5 특이적 나노 항체를 스크리닝하였으며, 구체적인 스크리닝 방법은 특허 CN110144011B 실시예 3의 해결수단을 참조하였다. 다섯 번의 "결합-세척-용출” 농축 과정을 거쳐, 최종적으로 각각 120배 및 14.6배 특이적 박테리오파지 농축(도 1)을 얻었다. PE-ELISA 동정 및 시퀀싱 분석을 거쳐, 서열이 다른 96개의 IL5 특이적 나노 항체를 최종적으로 얻었다.
실시예2: 차단형 IL5 나노 항체 스크리닝
서로 다른 서열의 IL5 나노 항체 클론 균주를 적절한 농도의 암피실린을 포함하는 TB 배지 1 mL에 접종하고, 37℃ 항온 진탕기에서 대수증식기까지 배양한 후 IPTG 유도제를 첨가하여, 28℃에서 16시간 동안 유도하며; 16시간 후 삼투압 충격법을 이용하여 균체를 파쇄하여 나노 항체 조추출물을 얻고; 각 샘플에 대해 1E6개의 HEK293F/IL5Ra 세포를 취하여 0.5% BSA-PBS buffer에 재현탁하며, 각각 상기 IL5 나노 항체 조추출물을 200μL 첨가하고, 동시에 음성 대조군(용해액)을 설정하며, 모든 샘플에 적절한 농도의 IL5-Biotin을 첨가하고, 4℃에서 20분 동안 배양하며; 다시 1ХPBS로 2회 세척하고, SA-PE를 첨가하여 4℃의 암실에서 20분 동안 배양한 후, PBS로 세포를 2회 세척하고 유세포 분석기(BD Caliber)로 검출하며, 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다. 차단 효과가 우수한 IL5 나노 항체 11개를 1차 스크리닝하였고, 양성세포의 백분율이 낮을수록 항체 차단효과가 우수하며, 여기서 11개의 나노 항체의 번호는 각각 Nb6, Nb13, Nb20, Nb21, Nb25, Nb26, Nb50, Nb66, Nb71, Nb85, Nb92이다. 서열 분석을 거쳐 11개의 차단형 IL5 나노 항체 서열은 각각 네 개의 패밀리로 나눌 수 있으며, 후속의 핵심 연구 대상은 표 1에 나타낸 바와 같다.
네 개의 차단형 나노 항체 아미노산 및 염기 서열 목록
항체번호 가변 영역 아미노산 서열 프레임워크 아미노산 서열 전장 아미노산 서열 전장 염기 서열
CDR1 CDR2 CDR3 FR1 FR2 FR3 FR4
Nb21 서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 4 서열번호 5 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8 서열번호 9
Nb25 서열번호 10 서열번호 11 서열번호 12 서열번호 13 서열번호 14 서열번호 15 서열번호 16 서열번호 17 서열번호 18
Nb66 서열번호 19 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
Nb92 서열번호 28 서열번호 29 서열번호 30 서열번호 31 서열번호 32 서열번호 33 서열번호 34 서열번호 35 서열번호 36
실시예3: IL5 나노 항체의 종 특이성 검출
ELISA를 이용하여 실시예2에서 얻은 11개의 나노 항체가 다른 종 IL5와 교차 반응할 수 있는지 여부를 검출하였다. 1μg/mL의 인간 IL5, 마우스 IL5, 게잡이 원숭이 IL5 및 IgG1 단백질을 각각 ELISA 플레이트에 첨가하여 4℃, 100uL/웰로 밤새 코팅하고; PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 300uL의 1% BSA를 첨가하여 실온에서 2시간 동안 차단하며; PBST로 5회 세척한 후, 각각 2μg/mL 원핵 발현 나노 항체(Nb6, Nb13, Nb20, Nb21, Nb25, Nb26, Nb50, Nb66, Nb71, Nb85, Nb92)를 100uL 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하고; 다시 PBST로 5회 세척한 후, 희석된 마우스 항-HA 항체(1:2000 희석) 100uL를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하며; PBST로 5회 세척한 후, 희석된 알칼리성 포스파타제 변형 항-마우스 항체(1:2000 희석) 100uL를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하고; 다시 PBST로 5회 세척한 후, 발색액을 첨가하며, 마이크로플레이트 리더로 405nm 파장에서 흡광도를 측정하하였다. 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이 11개의 나노 항체는 모두 인간과 게잡이 원숭이 IL5를 인식할 수 있지만, 마우스 IL5은 인식할 수 없었다.
실시예4: IL5 나노 항체의 친화도 측정
인간 IL5에 대한 실시예 2에서 얻은 11개의 나노 항체의 결합 동역학을 생물층 간섭 기술(Bio-layer interferometry BLI)에 의해 Fortebio Red96 기기를 사용하여 측정하였다. 동역학 측정을 위해, IL5 항원 단백질을 PBST 완충액으로 1.5μg/mL로 희석하고; 11개의 IL5 나노 항체를 PBST 완충액으로 6가지 농도 구배(30nM, 15nM, 7.5nM, 3.75nM, 1.88nM, 0.94nM)로 2배 구배 희석하며, 기기의 작동 조건은 온도 30℃, 진탕 속도(Shake speed) 1000rpm으로 설정하였다. 단백질 A로 코팅된 프로브를 사용하여 항체를 포획하고, 포획 시간은 180초이며; 구배 희석된 항원을 결합하고, 결합 시간은 300초이며; 해리 시간은 360초이고; 10mM의 글리신(PH1.7)으로 매회 5초씩 3회 재생시켰다. FortebioAnalysis 9.0 버전을 사용하여 분석하고, 1:1 결합 모델 글로벌 모드로 피팅하여, 결합 속도(Kon), 해리 속도(Kdis) 및 해리 상수 KD를 계산하였다. 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이 IL5에 대한 11개의 나노 항체의 친화도는 모두 1nM미만이었다.
실시예5: ELISA에 의한 IL5 나노 항체의 결합 활성 검출
ELISA 방법을 이용하여 서열이 다른 네 개의 나노 항체(Nb21, Nb25, Nb66 및 Nb92)와 IL5의 결합 활성을 검출하고 비교하였다. 모든 IL5 나노 항체를 1μg/mL로 희석하고, 각 웰에 100uL를 코팅하며, 4℃에서 밤새 두었다. PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 300uL의 1% BSA를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. PBST로 5회 세척한 후, 구배 희석된 IL5-biotin를 100uL 첨가하고, 농도 구배는 2μg/mL에서 시작하여 12개의 지점으로 2배 구배 희석하며, 샘플을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 5회 세척한 후, SA-HRP(PBS로 1:5000으로 희석하여 사용함) 100uL를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 TMB 발색액 100uL를 첨가하고, 실온의 암실에서 5분 동안 반응시킨 후, 2M 황산 50uL를 첨가하여 반응을 중지시키며, 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 5에 나타낸 바와 같이 네 개의 나노 항체의 결합 활성은 모두 대조군 항체 Nucala보다 우수하였다.
실시예6: 유세포 분석에 의한 IL5 항체의 차단 활성 검출
IL5R를 고도로 발현하는 HEK293F 안정적으로 형질감염된 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 5 mL의 PBS로 세포를 1회 세척한 후, 2mL의 PBS를 더 첨가하여 세포를 재현탁하고, 카운트 후 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 3Х105 개 세포씩 할당하였다. 네 개의 나노 항체(Nb21, Nb25, Nb66 및 Nb92) 및 대조군 항체 Nucala를 2배 구배 희석(20μg/ml, 10μg/ml, 5μg/ml, 2.5μg/ml, 1.25μg/ml, 0.625μg/ml, 0.31μg/ml, 0.16μg/ml, 0.08μg/ml, 0.04μg/ml, 0.02μg/ml, 0.01μg/ml)하고, 희석된 항체를 각각 2.5μg/mL의 IL5-biotin과 동일한 부피로 혼합한 후 96-웰 플레이트에 할당된 세포를 재현탁하여 4℃에서 20분 동안 배양하며; 3000rpm, 4℃에서 원심분리한 후 200uL의 PBS/웰을 첨가하고, 재현탁한 후 3000rpm, 4℃에서 4분 동안 원심분리하며; 희석된 SA-PE 항체(0.3:100으로 희석하여 사용함)를 첨가하고, 4℃에서 20분 동안 배양하며; 3000rpm, 4℃에서 4분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고, 200uL의 PBS/웰을 첨가하여 세포를 세척하며, 2회 세척한 후, 200uL의 PBS를 첨가하여 세포를 재현탁하고 유세포 분석 튜브로 옮긴 후, 유세포 분석기로 각 샘플의 PE 신호를 검출하였다. 결과는 도 6에 나타낸 바와 같이 네 개의 나노 항체는 모두 IL5/IL5R 차단 활성이 우수하였으며, 그 중 Nb21, Nb66의 차단 활성은 대조군 항체 Nucala보다 유의하게 우수하였다.
실시예7: IL5 나노 항체의 항원 인식 에피토프 분석
ELISA 방법을 사용하여 실시예 6에서 차단 활성이 좋은 두 개의 나노 항체(Nb21 및 Nb66)가 서로 다른 IL5 항원 에피토프를 인식하는지 여부를 검출하였다. 구체적으로, 4℃에서 1μg/mL의 IL5 항원 단백질을 밤새 코팅하고; PBST로 ELISA 플레이트를 5회 세척한 후 1% BSA를 첨가하여 실온에서 2시간 동안 차단하며; 다시 PBST로 ELISA 플레이트를 5회 세척한 후, 희석된 항체 혼합액을 100uL 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하고(나노 항체 작업 농도는 20μg/mL이고, 비오티닐화된 나노 항체의 작업 농도는 3μg/mL이며, 세 그룹의 샘플은 각각 3μg/mL Nb21-biotin, 20μg/mL Nb21+3μg/mL Nb21-biotin, 20μg/mL Nb66+3μg/mL Nb21-biotin임); 다시 PBST로 ELISA 플레이트를 5회 세척한 후, SA-HRP(1:5000으로 희석하여 사용함)를 100uL 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하며; 다시 PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 TMB 발색액을 100uL 첨가하여, 실온의 암실에서 5분 동안 반응시키고, 다시 2M 황산 50uL를 첨가하여 반응을 중지시키며, 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 7에 나타낸 바와 같이 Nb21은 Nb66과 서로 다른 항원 인식 에피토프를 가지고 있었다.
실시예8: 2가 인간화 나노 항체의 구축 및 발현
상기 실시예 6에서 우수한 차단 활성을 갖는 두 개의 나노 항체 Nb21, Nb66을 각각 프레임워크에서 인간화 변형하였으며, 변형 방안은 특허 CN110144010B의 실시예 3을 참조하였다. 인간화된 항체 서열은 표 2에 나타낸 바와 같다.
IL5 나노 항체 인간화 서열 목록
항체 번호 가변 영역 아미노산 서열 프레임워크 아미노산 서열 전장 아미노산서열 전장 염기 서열
CDR1 CDR2 CDR3 FR1 FR2 FR3 FR4
HuNb
21		 서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 37 서열번호 38 서열번호 39 서열번호 40 서열번호 41 서열번호 42
HuNb
66		 서열번호 19 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 43 서열번호 44 서열번호 45 서열번호 46 서열번호 47 서열번호 48
인간화된 항체를 각각 쌍으로 조합하여 Fc와 융합하여 발현하고, pCDNA3.1+ 벡터에 구축하였다. 융합된 서열은 표 3에 나타낸 바와 같다.
인간화 IL5 나노 항체 서열 목록
항체 구조 아미노산 서열 염기 서열
HuNb21-Fc 서열번호 49 서열번호 50
HuNb66-Fc 서열번호 51 서열번호 52
HuNb21-HuNb21-Fc 서열번호 53 서열번호 54
HuNb21-HuNb66-Fc 서열번호 55 서열번호 56
HuNb66-HuNb66-Fc 서열번호 57 서열번호 58
HuNb66-HuNb21-Fc 서열번호 59 서열번호 60
구축된 플라스미드를 HEK293F 세포에 형질감염시키고, 발현 방법은 특허 CN2018101517526 실시예 3을 참조하였다.
실시예9: 유세포 분석에 의한 2가 인간화 IL5 나노 항체의 차단 활성 검출
실시예 8에서 얻은 정제된 인간화 2가 항체를 1가 나노 항체 및 양성 대조군 Nucala와 세포 수준 차단 활성을 비교하였다. 구체적으로, IL5R를 고도로 발현하는 HEK293F 안정적으로 형질감염된 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 5 mL의 PBS로 세포를 1회 세척한 후, 2mL의 PBS를 더 첨가하여 세포를 재현탁하고, 카운트 후 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 3Х105개 세포씩 할당하였다. 테스트할 항체를 2배 구배 희석(80μg/ml, 40μg/ml, 20μg/ml, 10μg/ml, 5μg/ml, 2.5μg/ml, 1.25μg/ml, 0.625μg/ml, 0.31μg/ml, 0.16μg/ml, 0.08μg/ml, 0.04μg/ml)하고, 희석된 항체를 각각 IL5-biotin과 혼합한 후 96-웰 플레이트에 할당된 세포를 재현탁하여 4℃에서 20분 동안 배양하며; 3000rpm, 4℃에서 원심분리한 후 200uL의 PBS/웰을 첨가하고, 재현탁한 후 3000rpm, 4℃에서 4분 동안 원심분리하며; 희석된 SA-PE 항체(0.3:100으로 희석하여 사용함)를 첨가하고, 4℃에서 20분 동안 배양하며; 3000rpm, 4℃에서 4분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고, 200uL의 PBS/웰을 첨가하여 세포를 세척하며, 2회 세척한 후, 200uL의 PBS를 첨가하여 재현탁하고 유세포 분석 튜브로 옮긴 후, 유세포 분석기로 각 샘플의 PE 신호를 검출하였다.
결과는 도 8에 나타낸 바와 같이 인간화 2가 항체의 활성은 1가 항체의 활성보다 유의하게 높았고, 그 중 HuNb21-HuNb66-Fc 및 HuNb66-HuNb21-Fc 이종 2가 항체의 차단 활성이 더 우수했으며, 대조군 항체 Nucala보다 유의하게 우수하였다.
실시예10: 피치아 파스토리스에서 2가 이중 에피토프 IL5 나노 항체의 발현
바람직하게는 상기 인간화된 Nb66과 Nb21의 조합은 2가 이중 에피토프 나노 항체를 형성하고, 항체 아미노산 서열은 서열번호 61로 표시되며, 상기 서열에 대한 피치아 파스토리스의 코돈 최적화 후 염기 서열은 서열번호 62로 표시되고, pPICZaA 벡터에 클로닝한 후, 피치아 파스토리스로 발현하였다. 간략하게, 발현 방법은 다음과 같다. Sac I 제한 엔도뉴클레아제로 pPICZaA-HuNb66-HuNb21을 선형화한 후 X-33 컴피턴트 세포로 전기형질전환시키고; 전기형질전환된 샘플을 각각 다른 농도의 블레오마이신 내성을 포함하는 YPD 플레이트 배지에 도포하고, 30℃ 인큐베이터에서 3~4일 동안 배양하며, 구체적인 실시형태는 Invitrogen사에서 제공되는 pPICZaA 벡터 설명서를 참조할 수 있으며; 플레이트 배지에서 단클론이 성장한 후, 플레이트에서 다른 농도의 단클론을 선택하여 BMGY 배지에 넣고, BMGY 배지의 OD값이 약 20에 도달하면, 박테리아를 수집한 후 BMMY 배지로 교체하며, 28℃, 250rpm에서 배양하고; 그 후 24시간 마다 샘플을 채취하여, 최종 부피 1%의 메탄올을 첨가하여 샘플링하며; 샘플은 12000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 -20℃에서 보관하며; 5일 연속 유도하여 배양을 종료하고, 상층액을 취하여 표적 단백질의 함량을 측정하였다. 그런 다음 고수율 클론을 스크리닝하여 7L 발효조에서 배양하였으며, 발효 조건은 24℃에서 유도 배양, pH 6.5, 메탄올 공급 속도는 8.5mL/L/h로 하였다. 발효 과정의 상이한 시점에서 상층액을 취하여 표적 단백질 함량을 검출하고, 결과는 도 9에 나타낸 바와 같이 피치아 파스토리스에서 이중 에피토프 IL5 나노 항체 HuNb66-HuNb21의 발현 수율은 약 13g/L에 도달할 수 있다. 채취한 샘플을 13배 희석하여 SDS-PAGE 검출을 수행하고, 결과는 도 10에 나타낸 바와 같이 표적 단백질이 선명하고, 발현 상층액의 순도가 높다.
실시예11: 2가 이중 에피토프 IL5 나노 항체의 차단 활성 검출
상기 효모로 발현된 2가 이중 에피토프 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하여, 고순도 항체를 얻은 후 차단 활성을 검출하였으며, 검출 방법은 실시예 9와 동일하다. 결과는 도 11에 나타낸 바와 같이, 효모로 발현된 2가 이중 에피토프 항체 HuNb66-HuNb21의 차단 활성(IC50=0.841μg/mL)은 대조군 항체 Nucala(IC50=2.035μg/mL)보다 유의하게 우수하였다.
실시예12: TF1 세포에 대한 2가 이중 에피토프 IL5 나노 항체의 증식 억제 효과
소생 배양된 TF-1 세포(IL5 유도 처리)를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고; 5mL의 PBS로 재현탁한 후, 1000rpm에서 다시 5분 동안 원심분리하며; 20mL의 1640 배지에 세포를 재현탁하여 카운트하고, 세포 용액 농도를 6Х105/mL로 희석하여 60uL/웰을 96-웰 플레이트에 할당하며; 구배 희석된 IL5 항체 50uL를 25ng/mL의 IL5 단백질 50uL와 각각 혼합한 후, 혼합액 40uL를 취하여 세포 용액에 첨가하고; 동시에 모든 세포 주변 웰에 200uL의 PBS를 첨가하여 세포 웰 용액의 증발을 방지하며, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하고; 세포 배양 플레이트를 꺼내, CCK8 용액 10uL/웰을 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 발색하며; 발색이 완료된 후, 마이크로플레이트 리더로 각 웰의 OD450값을 판독하였다.
결과는 도 12에 나타낸 바와 같이 효모로 발현된 2가 이중 에피토프 항체는 IL5에 의해 유도된 TF-1 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이의 억제 활성(IC50 HuNb66-HuNb21=0.0512nM)은 TF-1 세포에 대한 대조군 항체의 증식 억제 효과(IC50 Nucala=0.1782nM)보다 우수하였다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 참조로서 인용된 것처럼 본 발명에 참조로서 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있으며, 이러한 등가 형태도 본 발명의 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위 내에 속함을 이해해야 한다.
<110> SHANGHAI NOVAMAB BIOPHARMACEUTICALS CO., LTD. <120> ANTI-IL5 NANOANTIBODY AND USE THEREOF <130> IPC230746CN <150> CN2020111896047 <151> 2020-10-30 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 1 Gly Tyr Pro Tyr Ser Gly Asp Tyr Cys Met Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 2 Phe Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 3 Ala Ala Asp Pro Trp Ser Val Tyr Gly Gly Ser Cys Gly Val Lys Asp 1 5 10 15 Pro Asn Pro Lys Ala Phe Asn Tyr 20 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser 20 25 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 5 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 6 <211> 38 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 6 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Gln Asp Asn 1 5 10 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ctggagggtc tctgaaactc 60 tcctgtgtag tctctggata cccctacagt ggcgattact gcatgggctg gttccgccag 120 gctccaggga aggagcgcga gggggtcgca gcgttttata ctggtggtgg tagcacatac 180 tatgccgact ccgtgaaggg ccgattcacc acctcccaag acaacgccac gagcacgttt 240 catctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacactgcca cgtactactg cgcggcagac 300 ccgtggagtg tgtacggtgg tagctgtggg gtaaaagatc ccaatccgaa ggcctttaat 360 tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcctca 396 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 10 Glu Tyr Thr Tyr Ser Arg Tyr Cys Met Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 11 Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 12 Ala Ala Arg Tyr Phe Tyr Ile Ala Thr Thr Gly Leu Arg Pro Cys Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Glu Tyr Asn Tyr 20 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 14 Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 38 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 15 Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 35 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 16 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 128 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Tyr Ser Arg Tyr 20 25 30 Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Tyr Ile Ala Thr Thr Gly Leu Arg 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bactrianus <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 23 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 24 <211> 38 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 24 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn 1 5 10 15 Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 35 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 25 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 122 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 35 40 45 Ala Ile Tyr Pro Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp 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ggacaccctg 960 atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc 1020 gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1080 agggaggagc agtacaacag cacctacagg gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag 1140 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgagca acaaggccct gcccgccccc 1200 atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagcccaggg agccccaggt gtacaccctg 1260 ccccccagca gggaggagat gaccaagaac caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc 1320 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1380 aagaccaccc cccccgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc 1440 gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1500 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc ccggcaag 1548 <210> 55 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HuNb21-HuNb66-Fc amino acid sequence <400> 55 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Gly Asp 20 25 30 Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg 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gttcaggcag gcccccggca aggagaggga gggcgtggcc 600 gccatctacc ccgacggcgc cacctactac gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc 660 agcagggaca acagcgagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac 720 accgccatgt actactgcgc cgccgacctg gccttcaacg gcctgggcac cctggccctg 780 cacggctact ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gcgagcccaa gagctgcgac 840 aagacccaca cctgcccccc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc cagcgtgttc 900 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 960 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 1020 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agggaggagc agtacaacag cacctacagg 1080 gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1140 aaggtgagca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc 1200 cagcccaggg agccccaggt gtacaccctg ccccccagca gggaggagat gaccaagaac 1260 caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1320 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggacagcgac 1380 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1440 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1500 agcctgagcc ccggcaag 1518 <210> 57 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HuNb66-HuNb66-Fc amino acid sequence <400> 57 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 35 40 45 Ala Ile Tyr Pro Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala 85 90 95 Asp Leu Ala Phe Asn Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu His Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg 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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 435 440 445 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 450 455 460 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 495 <210> 58 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HuNb66-HuNb66-Fc nucleotide sequence <400> 58 gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60 agctgcgccg ccagcggcta caccgtgagc agcaacatgg gctggttcag gcaggccccc 120 ggcaaggaga gggagggcgt ggccgccatc taccccgacg gcgccaccta ctacgccgac 180 agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacagcg agaacaccct gtacctgcag 240 atgaacagcc tgagggccga ggacaccgcc atgtactact gcgccgccga cctggccttc 300 aacggcctgg gcaccctggc cctgcacggc tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 360 agcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 420 ggcagcgagg tgcagctgca ggagagcggc ggcggcctgg tgcagcccgg cggcagcctg 480 aggctgagct gcgccgccag cggctacacc gtgagcagca acatgggctg gttcaggcag 540 gcccccggca aggagaggga gggcgtggcc gccatctacc ccgacggcgc cacctactac 600 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcgagaa caccctgtac 660 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccatgt actactgcgc cgccgacctg 720 gccttcaacg gcctgggcac cctggccctg cacggctact ggggccaggg caccctggtg 780 accgtgagca gcgagcccaa gagctgcgac aagacccaca cctgcccccc ctgccccgcc 840 cccgagctgc tgggcggccc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 900 atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc 960 gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020 agggaggagc agtacaacag cacctacagg gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag 1080 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgagca acaaggccct gcccgccccc 1140 atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagcccaggg agccccaggt gtacaccctg 1200 ccccccagca gggaggagat gaccaagaac caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc 1260 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320 aagaccaccc cccccgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc 1380 gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1440 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc ccggcaag 1488 <210> 59 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HuNb66-HuNb21-Fc amino acid sequence <400> 59 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 35 40 45 Ala Ile Tyr Pro Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met 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aggaccccaa ccccaaggcc 780 ttcaactact ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gcgagcccaa gagctgcgac 840 aagacccaca cctgcccccc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc cagcgtgttc 900 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 960 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 1020 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agggaggagc agtacaacag cacctacagg 1080 gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1140 aaggtgagca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc 1200 cagcccaggg agccccaggt gtacaccctg ccccccagca gggaggagat gaccaagaac 1260 caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1320 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggacagcgac 1380 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1440 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1500 agcctgagcc ccggcaag 1518 <210> 61 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of divalent double epitope nanoantibody <400> 61 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 35 40 45 Ala Ile Tyr Pro Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala 85 90 95 Asp Leu Ala Phe Asn Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu His Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Gly Asp Tyr Cys 165 170 175 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala 180 185 190 Ala Phe Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 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ttcaacctgg tggttctttg 480 agattgtctt gtgctgcttc tggttaccca tattcaggag attactgtat gggttggttt 540 agacaagctc ctggaaagga aagagaaggt gttgctgctt tctatactgg tggtggatct 600 acttactacg ctgattctgt taagggtaga ttcactattt ccagagataa ctctaagaac 660 actttgtact tgcaaatgaa ctctttgaga gctgaagata ctgctgttta ctactgtgct 720 gctgatccat ggtctgttta cggtggttct tgtggtgtta aggatccaaa cccaaaggct 780 ttcaactact ggggtcaagg tactttggtt actgtttctt cc 822 <210> 63 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc fragment <400> 63 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 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Claims (15)

  1. 항-IL5 나노 항체로서,
    상기 나노 항체는 IL5에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 나노 항체 중 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
    (1)서열번호 19로 표시되는 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 CDR2 및 서열번호 21로 표시되는 CDR3;
    (2)서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3;
    (3)서열번호 10으로 표시되는 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 CDR2 및 서열번호 12로 표시되는 CDR3; 및
    (4)서열번호 28로 표시되는 CDR1, 서열번호 29로 표시되는 CDR2 및 서열번호 30으로 표시되는 CDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항-IL5 나노 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항-IL5 나노 항체의 VHH 사슬은 프레임워크 영역(FR)을 더 포함하고, 상기 프레임워크 영역(FR)은，
    (1)서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3 및 서열번호 7로 표시되는 FR4;
    (2)서열번호 13으로 표시되는 FR1, 서열번호 14로 표시되는 FR2, 서열번호 15로 표시되는 FR3 및 서열번호 16으로 표시되는 FR4;
    (3)서열번호 22로 표시되는 FR1, 서열번호 23으로 표시되는 FR2, 서열번호 24로 표시되는 FR3 및 서열번호 25로 표시되는 FR4;
    (4)서열번호 31로 표시되는 FR1, 서열번호 32로 표시되는 FR2, 서열번호 33으로 표시되는 FR3 및 서열번호 34로 표시되는 FR4;
    (5)서열번호 37로 표시되는 FR1, 서열번호 38로 표시되는 FR2, 서열번호 39로 표시되는 FR3 및 서열번호 40으로 표시되는 FR4; 및
    (6)서열번호 43으로 표시되는 FR1, 서열번호 44로 표시되는 FR2, 서열번호 45로 표시되는 FR3 및 서열번호 46으로 표시되는 FR4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항-IL5 나노 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항-IL5 나노 항체의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 26, 서열번호 47, 서열번호 8, 서열번호 41, 서열번호 17, 서열번호 35 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항-IL5 나노 항체.
  4. 항-IL5 항체로서,
    상기 항체는 하나 이상의 제1항에 따른 항-IL5 나노 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-IL5 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체는 단량체, 2가 항체 및/또는 다가 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-IL5 항체.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 항-IL5 항체는 서열번호 26, 서열번호 47, 서열번호 8, 서열번호 41, 서열번호 17 또는 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VHH 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-IL5 항체.
  7. 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질로서,
    상기 융합 단백질의 N-말단에서 C-말단까지의 구조는 식 Ia 또는 Ib로 표시되고,
    A-L-B (Ia);
    B-L-A (Ib);
    상기 식에서,
    A는 하나 이상의 제1항에 따른 항-IL5 나노 항체이며;
    B는 IgG의 Fc 단편이고; 및
    L은 없거나 플렉서블 링커인 것을 특징으로 하는 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 또는 서열번호 59로 표시되는 것을 특징으로 하는 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질.
  9. 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 제1항에 따른 항-IL5 나노 항체, 제4항에 따른 항-IL5 항체, 또는 제7항에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제9항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  11. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제10항에 따른 발현 벡터를 포함하거나 이의 게놈에 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  12. 항-IL5 나노 항체, 항-IL5 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질의 생성 방법으로서,
    (a)나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질의 생성에 적합한 조건에서, 제11항에 따른 숙주 세포를 배양하여 상기 항-IL5 나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질을 포함하는 배양물을 얻는 단계;
    (b)상기 배양물로부터 상기 항-IL5 나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질을 분리 또는 회수하는 단계; 및
    (c)선택적으로, 단계(b)에서 얻은 항-IL5 나노 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질을 정제 및/또는 변형하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-IL5 나노 항체, 항-IL5 항체 또는 이의 Fc 융합 단백질의 생성 방법.
  13. 면역접합체로서,
    상기 면역접합체는,
    (a)제1항에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 제4항에 따른 항-IL5 항체, 또는 제7항에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질; 및
    (b)검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성핵종, 효소, 금 나노입자/나노로드, 자성 나노입자, 바이러스 코트 단백질 또는 VLP, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 접합 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  14. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은,
    (i)제1항에 따른 항-IL5 나노 항체, 또는 제4항에 따른 항-IL5 항체, 또는 제7항에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질, 또는 제13항에 따른 면역접합체; 및
    (ii)약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제1항에 따른 항-IL5 나노 항체, 제4항에 따른 항-IL5 항체, 제7항에 따른 항-IL5 나노 항체 Fc 융합 단백질, 또는 제13항에 따른 면역접합체의 용도로서,
    (a)IL5/IL5R 신호 전달과 관련된 질환 또는 병증의 예방 및/또는 치료를 위한 약물을 제조하기 위해 사용되고; (b)IL5 검출을 위한 시약, 검출 플레이트 또는 키트를 제조하기 위해 사용되는 용도.
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